WO2016056725A1 - 신규한 인데노 피리디니움 유도체 화합물 및 이의 제조방법 - Google Patents

신규한 인데노 피리디니움 유도체 화합물 및 이의 제조방법 Download PDF

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이응석
김정애
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영남대학교 산학협력단
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Definitions

  • the present invention relates to a novel indeno pyridinium derivative compound and a preparation method thereof.
  • IBD Inflammatory bowel disease
  • Sulfasalazine first developed in the 1940s for the treatment of rheumatoid arthritis, is one of the most widely used drugs for inflammatory bowel disease.
  • Sulphasalazines consist of salicylates (5-aminosalicylates) bound to sulfafiridine by azo bonds.
  • Sulphasalazine is known to be degraded by colon bacteria, releasing 5-aminosalicylic acid (5-ASA) and sulfyapyridine. Sulfapyridine is almost completely absorbed from the colon, modified and excreted in the urine, while 5-ASA is poorly absorbed from the colon.
  • the present invention provides a novel indeno pyridinium derivative compound, an isomer thereof and a pharmacologically acceptable salt thereof.
  • the compound is 4-((6-ethoxy-1-oxo-1H-indene-2 (3H) -ylidene) methyl) having a structure of formula (2) Pyridine-1-ium chloride (6e) compound.
  • the compound is 4-((6-isopropoxy-1-oxo-1H-indene-2 (3H) -ylidene) methyl having a structure of formula (3) ) Pyridine-1-ium chloride (6f) compound.
  • the compound is 4-((4-ethoxy-1-oxo-1H-indene-2 (3H) -ylidene) methyl) having a structure of formula (4) Pyridine-1-ium chloride (6h) compound.
  • the compound is 4-((4-isopropoxy-1-oxo-1H-indene-2 (3H) -ylidene) methyl having a structure of formula (5) ) Pyridine-1-ium chloride (6i) compound.
  • the present invention relates to a novel indeno pyridinium derivative compound and a preparation method thereof, the novel compound of the present invention is excellent in the effect of maintaining the thickness of the small intestine and the length of the large intestine as normal state, inflammation to the large intestine It is excellent in the effect of inhibiting can be usefully used as a pharmaceutical composition that can prevent or treat inflammatory bowel disease.
  • Figure 2 is a result confirming the degree of inflammation inhibition of the novel indeno pyridinium derivative compounds of the present invention in inflammatory growth disease in vitro model.
  • 3a and 3b is a result of confirming the thickness of the small intestine and the length of the large intestine by dividing the experimental animals into the group of the inflammatory bowel disease-induced animal model group, the inflammatory bowel disease-induced animal model group administered the new compound of the present invention.
  • Figures 4a and 4b is a result of measuring the weight of the experimental animals by dividing the experimental animals into groups of the inflammatory bowel disease-induced animal model group, inflammatory bowel disease-induced animal model group administered the new compound of the present invention.
  • Figures 5a and 5b is a result of measuring the colon weight of the experimental animals by dividing the experimental animals into groups of the inflammatory bowel disease-induced animal model group, inflammatory bowel disease-induced animal model group administered the new compound of the present invention.
  • the present invention relates to novel indeno pyridinium derivative compounds, isomers thereof and pharmacologically acceptable salts thereof.
  • the present inventors are conducting various researches to develop a novel drug for treating inflammatory growth disease, while maintaining the thickness of the small intestine and the length of the large intestine in a novel indeno pyridinium derivative compound of the present invention as normal. It is characterized by excellent effect and effective in inhibiting inflammation of the large intestine and suitable for use as a composition for the prevention or treatment of inflammatory growth disease and Crohn's disease.
  • R 1 and R 2 are each independently one or more substituents selected from the group consisting of a hydrogen atom, a hydroxy group, a methoxy group, an ethoxy group, an isopropyloxy group, a C 1 -C 6 lower alkyl group, a halogen atom and a carboxylic acid.
  • the novel indeno pyridinium derivative compound is 4-((6-ethoxy-1-oxo-1H-indene-2 (3H) -ylidene) methyl) pyridine-1-ium chloride (6e), 4-((6-isopropoxy-1-oxo-1H-indene-2 (3H) -ylidene) methyl) pyridine-1-ium chloride (6f), 4-((4- Ethoxy-1-oxo-1H-indene-2 (3H) -ylidene) methyl) pyridine-1-ium chloride (6h), 4-((4-isopropoxy-1-oxo-1H- It may be one kind selected from indene-2 (3 H) -ylidene) methyl) pyridine-1-ium chloride (6i).
  • Inflammatory bowel disease refers to chronic inflammation of unknown causes occurring in the intestine, and refers to ulcerative colitis and Crohn's disease, which are idiopathic inflammatory bowel diseases, but enteric Behcet's disease is relatively common in Korea. It can be said. In a broad sense, it refers to infectious enteritis such as bacterial, viral, amoeba, and tuberculosis enteritis, and inflammatory diseases occurring in all intestines such as ischemic enteritis and radiation enteritis.
  • the compounds of the present invention can be prepared with pharmaceutically acceptable salts and solvates according to methods conventional in the art.
  • salts are acid addition salts formed with pharmaceutically acceptable free acids.
  • Acid addition salts are prepared by conventional methods, for example, by dissolving a compound in an excess of aqueous acid solution and precipitating the salt using a water miscible organic solvent such as methanol, ethanol, acetone or acetonitrile. Equal molar amounts of the compound and the acid or alcohol (eg, glycol monomethyl ether) in the mole can be heated and the mixture can then be evaporated to dryness or the precipitated salts can be suction filtered.
  • a water miscible organic solvent such as methanol, ethanol, acetone or acetonitrile.
  • Equal molar amounts of the compound and the acid or alcohol (eg, glycol monomethyl ether) in the mole can be heated and the mixture can then be evaporated to dryness or the precipitated salts can be suction filtered.
  • organic acids and inorganic acids may be used as the organic acid, hydrochloric acid, phosphoric acid, sulfuric acid, nitric acid, tartaric acid, etc. may be used as the inorganic acid, and methanesulfonic acid, p-toluenesulfonic acid, acetic acid, trifluoroacetic acid, citric acid, Maleic acid, succinic acid, oxalic acid, benzoic acid, tartaric acid, fumaric acid, manderic acid, propionic acid, citric acid, lactic acid, glycolic acid, gluconic acid, galacturonic acid, glutamic acid, glutaric acid, glucuronic acid, aspartic acid, ascorbic acid, carboxylic acid , Vanic acid, hydroiodic acid and the like can be used.
  • Bases can also be used to make pharmaceutically acceptable metal salts.
  • Alkali metal or alkaline earth metal salts are obtained by, for example, dissolving a compound in an excess alkali metal hydroxide or alkaline earth metal hydroxide solution, filtering the insoluble compound salt, and then evaporating and drying the filtrate.
  • the metal salt it is particularly suitable to prepare sodium, potassium or calcium salts, and the corresponding silver salt is obtained by reacting an alkali metal or alkaline earth metal salt with a suitable silver salt (for example, silver nitrate).
  • Pharmaceutically acceptable salts of the compounds of this invention include salts of acidic or basic groups which may be present in the compound, unless otherwise indicated.
  • pharmaceutically acceptable salts include sodium, calcium and potassium salts of the hydroxy group
  • other pharmaceutically acceptable salts of the amino group include hydrobromide, sulfate, hydrogen sulphate, phosphate, hydrogen phosphate, dihydrogen Phosphate, acetate succinate citrate, tartrate, lactate, mandelate methanesulfonate (mesylate) and p-toluenesulfonate (tosylate) salts, which are prepared by methods or processes for preparing salts known in the art. Can be.
  • Another object of the present invention is a method for preparing a compound of the present invention, can be prepared by a synthetic method known in the art, can be chemically synthesized by the method shown in the following schemes, but is not limited only to these examples no.
  • the compound was used as starting material and the reagent was purchased from the company (Aldrich Chemical Co., Junsei or other chemical company) and used without further purification step.
  • Solvents HPLC grade acetonitrile (ACN) and methanol
  • TLC thin-layer chromatography
  • CC column chromatography
  • NMR spectra were obtained from the company (Bruker AMX 250; 250 MHz, FT: 1H NMR and 62.5 MHz: 13C NMR) and the chemical shifts ( ⁇ ) were calculated from TMS in ppm and coupling constants (J) hertz (Hz). )). Melting points were recorded on open capillary tubes using an electrothermal 1A 9100 digital melting point apparatus and were not calibrated.
  • HPLC analysis was used under the following conditions (gradient-controlled HPLC system).
  • Detector photo diode array detector (SPD-M10A VP) (using Shimadzu Class VP program).
  • Sample injection Inject a sample volume (10 ⁇ l) into a column (Waters X-Terra ⁇ M reverse-phase C18 column (4.6 ⁇ 50 mm) and flow (1) into B 100-60% of A for 15 minutes (2) A Medium B was flowed by gradient dilution at a flow rate (1.0 mL / min) for 15 minutes (254 nm UV detection) (mobile phase A: double diluted with 20 mM ammonium formate (AF) and B was 90% ACN in water) Double diluted to 20 mM AF in.) Purity of the compound is expressed as (%).
  • ESI LC / MS analysis showed that LC was injected into a column (Waters Atlantis C18 column (2.1 ⁇ 0 mm, 3 ⁇ M)) with (1) 100% distilled water (A) and (2) 100% ACN (B).
  • the mobile phase was composed of 10% B and the linear composition was changed to 90% B after 5 minutes in the programmed sequence and 10% B after 15 minutes. Spent as spilled.
  • MS ionization conditions are as follows: Sheath gas flow rate: 70 arb, aux gas flow rate: 20 arb, I spray voltage: 4.5 KV, capillary temperature 215 ° C, column temperature 40 ° C, capillary voltage: 21 V, tube lens offset: 10 V. Retention time is in minutes.
  • TI-2-9 4-((4-hydroxy-1-oxo-1H-inden-2 (3H) -ylidene) methyl) pyridin-1-ium chloride (6c) is TI-2-11, 4-((6-methoxy- 1-oxo-1H-inden-2 (3H) -ylidene) methyl) pyridin-1-ium chloride (6d) is TI-2-45, 4-((6-ethoxy-1-oxo-1H-inden-2 (3H) -ylidene) methyl) pyridin-1-ium chloride (6e) is TI-2-46, 4-((6-isopropoxy-1-oxo-1H-inden-2 (3H) -ylidene) methyl) pyridin -1-ium chloride (6f) is TI-2-
  • the present inventors conducted the experiment as follows to find out whether the indenone compound has an inhibitory activity in the in vitro model of the inflammatory growth disease prepared by the compounds of the present invention.
  • the human colon cancer cell line HT-29 cells (American Type Culture Collections, Rockville, Mass., USA) were subjected to RPMI 1640 containing 10% fetal bovine serum (FBS), 1% penicillin / streptomycin and 2 mmol / L glutamine.
  • FBS fetal bovine serum
  • penicillin / streptomycin 1% penicillin / streptomycin
  • 2 mmol / L glutamine 2 mmol / L glutamine.
  • the cell lines were maintained at 37 ° C. under an environment of 95% air and 5% CO 2 .
  • the experiment below used cells of 36 passages or less.
  • D-PBS Dulbecco's phosphate buffered saline
  • Each cell was pretreated with each compound prepared in Example 1 hour before stimulation of TNF- ⁇ .
  • the stock solution of each compound was prepared with dimethyl sulfoxide (DMSO), where the final maximum concentration of DMSO used in the test medium was less than 0.1%.
  • DMSO dimethyl sulfoxide
  • 5-aminosalicylic acid 20 mM 5-aminosalicylic acid ( 5-ASA) was used as a positive control.
  • the 5-ASA is known to have an effect of inhibiting the inflammatory sequence activated in IBD.
  • In vitro model of Inflammatory Growth Disorders measured the inhibitory activity of Indenone Compounds and found that TNF- ⁇ showed significant inflammatory responses in HT-29 cells.
  • TI-2-9, TI-2-47 , TI-2-11, TI-2-49, TI-2-50 (10 ⁇ M each) was found to be superior to the positive control 5-ASA (20 mM) (see Figure 2).
  • the present inventors conducted the experiment as follows to determine whether the novel compound of the present invention prepared in the above example has a colitis inhibitory effect in vivo.
  • mice were purchased from Orient Bio Korea for 7-8 weeks old Sprague Dawley species and stabilized with general solid feed for 2 days and used for experiments. Feed and water were freely supplied during the experiment, and the room temperature was maintained at 25 ⁇ 1 °C and relative humidity at 50 ⁇ 10%. Lighting control was controlled by a 12-hour light-dark cycle by an automatic light controller.
  • the experimental group consisted of 6 animals in each group, and the average body weight was 180 ⁇ 10 g by means of randomized block design (5 groups (control group, TNBS alone group, TNBS + 5-ASA 100 mg / kg group, TNBS + indenon) 2 compounds 10 mg / kg administration group) was tested.
  • Rats fasted for 24 hours were anesthetized with diethyl ether and diluted with 50% (v / v) ethanol in the lumen of the large intestine through the anus using a 1 ml syringe connected to a polyethylene catheter. After slowly injecting 0.8 ml of 3% TNBS, the rats were left upside down for 60 seconds to prevent 3% TNBS from leaking into the anus. In the control group, vehicle (50% (v / v) ethanol) was injected in the same manner as the other experimental groups.
  • the comparative test substance was 5-ASA, an active metabolite of sulfasalazine, best known as an IBD treatment, as a positive control.
  • the positive control group 5-ASA 100 mg / kg treated group was gradually recovered from the 4th day, the weight was increased compared to the TNBS alone group.
  • Intraperitoneal administration of the new compound of the present invention at a dose of 1 mg / kg after TNBS treatment showed weight loss until day 3, and gradually recovered from day 4 to increase body weight compared to TNBS alone.
  • the novel compound of the present invention was found to show a greater weight recovery than the positive control 5-ASA (see Figs. 4a and 4b).
  • the present inventors examined the naked eye after extracting the colon after 5 days of drug administration, the colon of the TNBS-treated rats were observed edema and hyperemia compared to the control group, edema of the appendix and congestion and adhesion phenomenon It was found that this appeared.
  • the positive control group 5-ASA was administered in the amount of 100 mg / kg, and compared with the TNBS alone group, the visual symptom and adhesion between the other organs and colonic hyperemia were significantly suppressed.
  • the inhibitory effect of edema and hyperemia was greater than that of the positive control group 5-ASA, indicating that the novel compounds of the present invention effectively inhibit inflammatory bowel disease. It was found (see FIGS. 3A and 3B).
  • the weight of the intestinal edema was significantly increased in the TNBS-only group compared to the vehicle-treated control group.
  • the positive control group in the amount of 100 mg / kg, the intestinal weight was significantly reduced compared to the TNBS-treated group, and the group treated with the novel compound of the present invention was similar in weight to the control group. It can be seen that the decrease (see Figs. 5a and 5b).

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Abstract

본 발명은 신규한 인데노 피리디니움 유도체 화합물 및 이의 제조방법에 관한 것으로서, 본 발명의 신규한 화합물은 소장의 두께 및 대장의 길이를 정상 상태와 같이 유지시키는 효과가 우수하고, 대장에 대한 염증을 억제하는 효과가 우수하여 염증성 장질환을 예방 또는 치료할 수 있는 약학적 조성물로 유용하게 사용할 수 있다.

Description

신규한 인데노 피리디니움 유도체 화합물 및 이의 제조방법
본 발명은 신규한 인데노 피리디니움 유도체 화합물 및 이의 제조방법에 관한 것이다.
염증성 장 질환(IBD)은 위장 계통을 포함하는 기관의 원인 미상의 일단의 만성 염증성 질병에 통상적으로 사용되는 용어이다. IBD 는 크게 궤양성 대장염과 크론 질병으로 나뉜다. 이들은 모두 주기적으로 발발 및 진정되는 것을 특징으로 하는 희귀성을 가진다. 이들은 수술후에도 재발이 일어남으로써, 상기 질환의 특이한 합병증을 유발하거나 또는 치료하기가 어렵다.
류머티스성 관절염의 치료를 위해 1940 년대에 최초로 개발된 술파살라진은 현재 염증성 장 질환에 가장 널리 사용되고 있는 약제중 하나이다. 술파살라진은 아조 결합에 의해 술파피리딘에 결합된 살리실레이트 (5-아미노살리실레이트)로 이루어져 있다. 술파살라진은 결장 세균에 의해 분해되어, 5-아미노살리실산(5-ASA) 과 술파피리딘을 방출하는 것으로 알려져 있다. 술파피리딘은 결장으로부터 거의 완전히 흡수되어, 소변중에서 변형 및 배설되는 반면, 5-ASA 는 결장으로부터 잘 흡수되지 않는다. 술파살라진의 대부분의 부작용은 술파피리딘 부분에 기인한다 (문헌 [New Engl, J. Med. 1973 ; 289 : 491-495] (Das 등)). 1977년에, 아자드 크한 (Azad Khan) 등은 궤양성 대장염에 있어서, 활성 부분은 5-ASA 이고 (문헌 [Lancet, 1977 ; 2 : 892-5] (Azad Khan, A.K.등)), 술파피리딘은 단지 담체로서 작용하여 결장내에서 5-ASA 의 방출을 촉진한다고 주장하였다. 상기 발견후, 서서히 또는 지연되어 방출되는 5-ASA 제제 또는 기타 아조 화합물 (예 : 올살라진, 발살라진, 입살라진) 제제와 같은 여러가지 신규의 5-ASA-계 약제가 개발되었다. 그러나, 상기 증상들을 완전히 제거하며, 차후의 재발을 방지할 수 있는 약제는 현재 전혀 존재하지 않는다.
따라서 상기와 같은 단점을 극복하고 염증성 장질환을 효과적으로 치료할 수 있는 신규한 약제가 필요한 실정이다.
본 발명의 목적은 신규한 인데노 피리디니움 유도체 화합물, 그 이성체 및 이의 약리학적으로 허용 가능한 염을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 신규한 인데노 피리디니움 유도체 화합물, 그 이성체 및 이의 약리학적으로 허용 가능한 염을 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 화합물은 하기 화학식 (2)의 구조를 갖는 4-((6-에톡시-1-옥소-1에이치-인덴-2(3에이치)-일리덴)메틸)피리딘-1-이움 클로라이드(6e) 화합물일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 화합물은 하기 화학식 (3)의 구조를 갖는 4-((6-이소프로폭시-1-옥소-1에이치-인덴-2(3에이치)-일리덴)메틸)피리딘-1-이움 클로라이드(6f) 화합물일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 화합물은 하기 화학식 (4)의 구조를 갖는 4-((4-에톡시-1-옥소-1에이치-인덴-2(3에이치)-일리덴)메틸)피리딘-1-이움 클로라이드(6h) 화합물일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 화합물은 하기 화학식 (5)의 구조를 갖는 4-((4-이소프로포시-1-옥소-1에이치-인덴-2(3에이치)-일리덴)메틸)피리딘-1-이움 클로라이드(6i) 화합물일 수 있다.
본 발명은 신규한 인데노 피리디니움 유도체 화합물 및 이의 제조방법에 관한 것으로서, 본 발명의 신규한 화합물은 소장의 두께 및 대장의 길이를 정상 상태와 같이 유지시키는 효과가 우수하고, 대장에 대한 염증을 억제하는 효과가 우수하여 염증성 장질환을 예방 또는 치료할 수 있는 약학적 조성물로 유용하게 사용할 수 있다.
도 1은 본 발명의 신규한 인데노 피리디니움 유도체 화합물의 합성 방법을 나타낸 결과이다.
도 2는 염증성장질환 in vitro 모델에서 본 발명의 신규한 인데노 피리디니움 유도체 화합물의 염증 억제 정도를 확인한 결과이다.
도 3a 및 3b는 염증성 장질환 유도 동물 모델군, 염증성 장 질환 유도 동물 모델에 본 발명의 신규 화합물을 투여한 군으로 실험동물을 구분하여 소장의 두께 및 대장의 길이를 확인한 결과이다.
도 4a 및 4b는 염증성 장질환 유도 동물 모델군, 염증성 장 질환 유도 동물 모델에 본 발명의 신규 화합물을 투여한 군으로 실험동물을 구분하여 실험동물의 무게를 측정한 결과이다.
도 5a 및 5b는 염증성 장질환 유도 동물 모델군, 염증성 장 질환 유도 동물 모델에 본 발명의 신규 화합물을 투여한 군으로 실험동물을 구분하여 실험동물의 대장 무게를 측정한 결과이다.
본 발명은 신규한 인데노 피리디니움 유도체 화합물, 그 이성체 및 이의 약리학적으로 허용 가능한 염에 관한 것이다.
본 발명자들은 염증성장질환을 치료할 수 있는 신규한 약제를 개발하기 위하여 다양한 연구를 진행하던 중 본 발명의 신규한 인데노 피리디니움 유도체 화합물에 소장의 두께 및 대장의 길이를 정상상태와 같이 유지 시키는 효과가 우수하고, 대장의 염증을 효과적으로 억제하는 효과가 있어 염증성장질환 및 크론병의 예방 또는 치료용 조성물로 사용하기 적합함을 규명하였다는 점에 그 특징이 있다.
본 발명의 화합물은 기존 발견되지 않은 신규 화합물로서, 하기 화학식 (1)의 구조를 갖는 신규한 인데노 피리디니움 유도체 화합물, 그 이성체 및 이의 약리학적으로 허용 가능한 염:
Figure PCTKR2015005352-appb-I000001
상기 식에서, R1 및 R2는 각각 독립적으로 수소원자, 히드록시기, 메톡시기, 에톡시기, 이소프로필옥시기, C1-C6 저급 알킬기, 할로겐 원자 및 카르복실산으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 치환기이다.
본 발명에서, 상기 신규한 인데노 피리디니움 유도체 화합물은 4-((6-에톡시-1-옥소-1에이치-인덴-2(3에이치)-일리덴)메틸)피리딘-1-이움 클로라이드(6e), 4-((6-이소프로폭시-1-옥소-1에이치-인덴-2(3에이치)-일리덴)메틸)피리딘-1-이움 클로라이드(6f), 4-((4-에톡시-1-옥소-1에이치-인덴-2(3에이치)-일리덴)메틸)피리딘-1-이움 클로라이드(6h), 4-((4-이소프로포시-1-옥소-1에이치-인덴-2(3에이치)-일리덴)메틸)피리딘-1-이움 클로라이드(6i)에서 선택되는 1종일 수 있다.
본 발명에서 지칭하는“염증성 장질환”은 장에 발생하는 원인 불명의 만성적인 염증을 뜻하며, 통상적으로 특발성 염증성 장질환인 궤양성 대장염과 크론병을 지칭하지만 우리나라에 비교적 흔한 장형 베체트병도 이에 속한다고 할 수 있다. 넓은 의미로는 세균성, 바이러스성, 아메바성, 결핵성 장염 등의 감염성 장염과 허혈성 장질환, 방사선 장염 등의 모든 장에 발생하는 염증성 질환을 통칭한다.
본 발명의 화합물들은 당해 기술 분야에서 통상적인 방법에 따라 약학적으로 허용 가능한 염 및 용매화물로 제조될 수 있다.
염으로는 약학적으로 허용 가능한 유리산(free acid)에 의해 형성된 산 부가염이 유용하다. 산 부가 염은 통상의 방법, 예를 들면 화합물을 과량의 산 수용액에 용해시키고, 이 염을 수혼화성 유기 용매, 예를들면 메탄올, 에탄올, 아세톤 또는 아세토니트릴을 사용하여 침전시켜 제조한다. 동 몰량의 화합물 및 몰 중의 산 또는 알코올(예, 글리콜 모노메틸에테르)을 가열하고 이어서 상기 혼합물을 증발시켜서 건조시키거나, 또는 석출된 염을 흡인 여과시킬 수 있다.
이때, 유기산으로는 유기산과 무기산을 사용할 수 있으며, 무기산으로는 염산, 인산, 황산, 질산, 주석산 등을 사용할 수 있고 유기산으로는 메탄술폰산, p-톨루엔술폰산, 아세트산, 트리플루오로아세트산, 시트르산, 말레인산, 숙신산, 옥살산, 벤조산, 타르타르산, 푸마르산, 만데르산, 프로피온산, 구연산, 젖산, 글리콜산, 글루콘산, 갈락투론산, 글루탐산, 글루타르산, 글루쿠론산, 아스파르트산, 아스코르브산, 카본산, 바닐릭산, 히드로 아이오딕산 등을 사용할 수 있다.
또한, 염기를 사용하여 약학적으로 허용 가능한 금속염을 만들 수 있다. 알칼리 금속 또는 알카리토 금속염은, 예를들면 화합물을 과량의 알칼리 금속 수산화물 또는 알칼리토금속 수산화물 용액 중에 용해하고, 비용해 화합물염을 여과한 후 여액을 증발, 건조시켜 얻는다. 이 때 금속염으로서는 특히 나트륨, 칼륨 또는 칼슘염을 제조하는 것이 제약상 적합하며, 또한 이에 대응하는 은염은 알칼리 금속 또는 알칼리토 금속염을 적당한 은염(예, 질산은)과 반응시켜 얻는다.
본 발명 화합물의 약학적으로 허용 가능한 염은, 달리 지시되지 않는 한, 화합물에 존재할 수 있는 산성 또는 염기성기의 염을 포함한다. 예를들면, 약학적으로 허용 가능한 염으로는 히드록시기의 나트륨, 칼슘 및 칼륨염이 포함되며, 아미노기의 기타 약학적으로 허용 가능한 염으로는 히드로브로마이드, 황산염, 수소 황산염, 인산염, 수소 인산염, 이수소 인산염, 아세테이트 숙시네이트 시트레이트, 타르트레이트, 락테이트, 만델레이트 메탄설포네이트(메실레이트) 및 p-톨루엔설포네이트(토실레이트) 염이 있으며, 당업계에서 알려진 염의 제조방법이나 제조과정을 통하여 제조될 수 있다.
본 발명의 다른 목적은 본 발명의 화합물의 제조방법은, 당업계에 공지된 합성방법으로 제조가능하며, 하기의 반응식들에 도시된 방법에 의해 화학적으로 합성될 수 있지만, 이들 예로만 한정되는 것은 아니다.
Figure PCTKR2015005352-appb-I000002
상기와 같은 방법으로 수득한 본 발명의 화합물은 대장의 염증을 효과적으로 억제할 수 있음을 확인하였다.
이하 본 발명을 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 국한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
<참고예 1>
<1-1> 시약 및 재료
화합물은 출발물질을 원료로 사용하였으며 시약을 회사(Aldrich Chemical Co., Junsei 또는 기타 화학 회사)로부터 구입하여 추가의 정제 단계 없이 사용하였다. 용매 (HPLC 급 acetonitrile (ACN) 및 메탄올)는 회사(Burdick 및 Jackson, USA)에서, 구입하였고 Thin-layer chromatography (TLC) 및 컬럼 크로마토그래피 (CC)는 제품(Kieselgel 60 F254 ;Merck) 및 실리카겔 (Kieselgel 60, 230-400 mesh, Merck)을 각각 사용하였으며, 합성 화합물들은 TLC 플레이트에서 UV 자외선 (단파장 및 장파장 모두). NMR 스펙트럼은 회사(Bruker AMX 250; 250 MHz, FT: 1H NMR 및 62.5 MHz: 13C NMR) 제품을 사용하고 화학이동(δ) 은 TMS로부터 계산되어 ppm 및 결합상수(coupling constants (J)hertz (Hz))로 표시하였다. 녹는 점은 기기(electrothermal 1A 9100 digital melting point apparatus)를 이용하여 튜브(open capillary tubes)로 기록하고 보정하지 않았다.
<1-2> HPLC 분석
HPLC 분석은 하기 조건(gradient-controlled HPLC system)으로 사용하였다.
- 펌프: Shimadzu LC-10AT pumps
-조절기: Shimadzu system controller (SCL-10A VP)
- 탐지기: photo diode array detector (SPD-M10A VP) (Shimadzu Class VP 프로그램 이용).
- 시료 주입: 시료용량(10㎕)을 컬럼(Waters X- TerraμM reverse-phase C18컬럼 (4.6 ×50 mm)에 주입하여 (1) A중 B 100-60%로 15 분간 흘려 보내고 (2) A중 B 60-100%로 15분간 유속(1.0 mL/min)으로 경사희석으로 흘려 보냈다(254 nm UV 탐지) (이동상 A: 20 mM ammonium formate (AF)으로 이중 희석되고 B는 물 중 90% ACN에서 20 mM AF로 이중 희석됨). 화합물의 순도는 (%)로 표시함.
<1-3> ESILC/MS 분석
ESI LC/MS 분석은 프로그램(Xcalibur)을 이용하여 기기(Finnigan LCQ AdvantageLC/MS/MS spectrometry)로 수행하였다.
ESI LC/MS 분석은 LC는 시료용량(2㎕)을 컬럼(Waters AtlantisC18column (2.1×0 mm, 3 μM))에 주입하여 (1) 100% 증류수 (A) 및 (2) 100% ACN (B)로 이동상을 구성하여 유속(200 μL/min)으로 경사희석으로 흘려 보냈다 초기 이동상 조기 조성은 10% B로 하고 프로그램된 순서로 5분 후 선형으로 90% B 으로 변화시키고 15분 후에 10% B 로 흘려 보냈다. MS 이온화 조건은 하기와 같다: 시쓰 가스(Sheath gas) 유속: 70 arb, 옥스 가스(aux gas) 유속: 20 arb, I spray voltage: 4.5 KV, capillary 온도 215 ℃, 컬럼 온도 40 ℃, capillary voltage: 21 V, tube lens offset: 10 V.Retention time은 분(minutes)으로 함.
<실시예 1>
화합물 (5)의 일반적 제조법
1-인다논(1-Indanone) 1(R= a-c) 또는 3 (R2=d-i)의 4 - 피리딘 카르복시알데하일(4-Pyridine carboxaldehyle carboxaldehyle)의 동량과 반응시키고, 메탄올 / 에탄올의 존재하에 5 %의 NaOH 수용액을 적가하였다. 반응 후 1-6 시간 동안 0 ℃에서 두었으며, 화합물 5f 및 5i 반응 혼합물을 48 내지 72 시간 동안 질소하에 둔 다음 산화 알루미늄 있는 곳에서 90 ~ 100℃ 온도로 환류시켰다.
혼합물을 냉 메탄올로 세정하고, 여과하고, 30 분 동안 냉각하고, 밤새 건조시켰다. 침전이 발생하지 않은 경우는 상기 반응 혼합물을 에틸 아세테이트로 추출하고, 물 및 염수로 세척 하였다. 유기층을 황산 마그네슘으로 건조시키고 여과 하였다. 그리고 추가적으로 재결정이나 컬럼 크로마토 그래피를 수행하여 정제하여 67.8-99.4 % 수율로 고체의 화합물 5 (R3 = a-i)을 수득하였다.
<실시예 2>
화합물 (6)의 일반적 제조법
상기 실시예 1의 방법으로 얻어진 화합물 5 (R3 = a-i)를 아세톤에 용해시키고, 침전이 발생할 때까지 염산을 적가하였다. 그 다음 침전이 될 때까지 여과하였다. 침전물이 발생하지 않은 경우, 용매는 순수한 고체 화합물을 얻을 수 있는 회전식 증발기 도움으로 증발 건조시켜 62.7-96.9 % 수율로 합성된 6의 9가지 화합물(R3 = a-i)을 수득하였다(도 1 참조).
<2-1> 4-((1-옥소-1에이치-인덴-2(3에이치)-일리덴)메틸)피리딘-1-이움 클로 라이드(6a)
상기 일반적 합성법과 동일한 방법을 이용하여 5a (1.08 g, 4.9 mmol) 및 아세톤(30 mL)을 이용하여 하기 물성치를 갖는 0.79 g (3.07 mmol, 62.7%)의 하얀색 크리미한 고체상 4-((1-옥소-1에이치-인덴-2(3에이치)-일리덴)메틸)피리딘-1-이움 클로라이드(6a)를 수득하였다.
R f (ethylacetate/n-hexane 2:1,v/v):0.25; mp 229.6-230.2°C, purity by HPLC:100%,MS(ESI):[MH+]: 222.1
1H NMR (250 MHz, DMSO-d 6 ) 8.93(d,J=6.37Hz, 2H, pyridine H-2,H-6), 8.24(d,J=6.30Hz,2H, pyridine H-3,H-5), 7.58-7.6(m,4H,=CH-,indenoH-4,H-5,H-7), 7.51(t,J=7.22,1H,indenoH-6),4.27(s,2H,indenoH-3).
13C NMR (62.5 MHz, DMSO-d 6 )δ193.16, 150.51, 149.96, 144.02, 143.58, 136.68, 136.23, 128.38, 127.78, 127.00, 124.39, 32.04.
<2-2> 4-((6-하이드록시-1-옥소-1에이치-인덴-2(3에이치)-일리덴)메틸)피리 딘-1-이움 클로라이드(6b)
상기 일반적 합성법과 동일한 방법을 이용하여 5b (0.4 g, 1.69 mmol) 및 아세톤(40 mL)을 이용하여 하기 물성치를 갖는 0.45 g (1.64 mmol, 96.9%)의 황색 고체상 4-((6-하이드록시-1-옥소-1에이치-인덴-2(3에이치)-일리덴)메틸)피리딘-1-이움 클로라이드(6b)를 수득하였다.
R f (ethylacetate/n-hexane2:1,v/v):0.13; mp 265.8-266.9°C, purity by HPLC: 100%, MS (ESI): [MH+]:238.1
1H NMR (250 MHz, DMSO-d 6 )δ8.81(d,J=6.42Hz, 2H, pyridine H-2, H-6), 8.51(d,J=6.47Hz, 2H, pyridineH-3, H-5), 7.50-7.46(m,2H,=CH-,indenoH-4),7.18(dd,J=8.22,2.45Hz,1H,indenoH-5), 7.11-7.10(m,1H,indenoH-7), 4.07(s,2H,indenoH-3).
13C NMR (62.5 MHz, DMSO-d 6 )δ193.08, 157.74, 149.40, 144.61, 144.19, 141.29, 137.97, 127.83, 127.62, 126.74, 124.84, 108.65, 31.27.
<2-3> 4-((4-하이드록시-1-옥소-1에이치-인덴-2(3에이치)-일리덴)메틸)피리 딘-1-이움 클로라이드(6c)
상기 일반적 합성법과 동일한 방법을 이용하여 5c(0.4 g, 1.69 mmol) 및 아세톤(80 mL)을 이용하여 하기 물성치를 갖는 0.36 g (1.33 mmol, 79.2%)의 밝은 황색 고체상 4-((4-하이드록시-1-옥소-1에이치-인덴-2(3에이치)-일리덴)메틸)피리딘-1-이움 클로라이드(6c)를 수득하였다.
R f (ethylacetate/n-hexane2:1,v/v): 0.13; mp 259.2-262.8 °C, purity by HPLC: 97.5%, MS (ESI): [MH+]: 238.1
1H NMR (250 MHz, DMSO-d 6 )δ10.26(s,1H,indeno4-OH), 8.88(d,J=5.27Hz,2H,pyridineH-2,H-6),8.12(d,J=5.40Hz,2H,pyridineH-3,H-5), 7.58(s,1H,=CH-),7.37-7.26(m,2H,indenoH-6,H-7),7.16(d,J=7.35Hz,1H,indenoH-5), 4.05(s,2H,indenoH-3).
13C NMR (62.5 MHz, DMSO-d 6 )δ193.03, 154.83, 146.24, 141.94, 138.15, 136.48, 129.25, 128.43, 125.54, 121.09, 114.34, 28.80
<2-4> 4-((6-메톡시-1-옥소-1에이치-인덴-2(3에이치)-일리덴)메틸)피리딘-1- 이움 클로라이드(6d)
상기 일반적 합성법과 동일한 방법을 이용하여 5d(0.24 g, 0.96 mmol) 및 아세톤(20 mL)을 이용하여 하기 물성치를 갖는 0.22 g (0.78 mmol, 81.2%)의 황색 고체상 4-((6-메톡시-1-옥소-1에이치-인덴-2(3에이치)-일리덴)메틸)피리딘-1-이움 클로라이드(6d)를 수득하였다.
R f (ethylacetate/n-hexane2:1,v/v):0.22;mp259.8-261.2°C,puritybyHPLC:99.3%,MS(ESI):[MH+]:252.1
1H NMR (250 MHz, DMSO-d 6 )δ8.87(d,J=6.30Hz,2H,pyridineH-2,H-6),8.14(d,J=6.37Hz,2H,pyridineH-3,H-5),7.61-7.57(m,2H,=CH-,indenoH-4),7.35(dd,J=8.35,2.55Hz,1H,indenoH-5),7.27(s,1H,indenoH-7),4.15(s,2H,indenoH-3),3.82(s,3H,indeno-6-OCH3).
13C NMR (62.5 MHz, DMSO-d 6 )δ193.13,160.18,145.05,144.14,143.30,138.11,128.21,128.05,126.63,125.01,106.23,55.96,31.39.
<2-5> 4-((6-에톡시-1-옥소-1에이치-인덴-2(3에이치)-일리덴)메틸)피리딘-1- 이움 클로라이드(6e)
상기 일반적 합성법과 동일한 방법을 이용하여 5e(0.75 g, 2.8 mmol) 및 아세톤(25 mL)을 이용하여 하기 물성치를 갖는 0.65 g (2.12 mmol, 76.9%)의 황색 고체상 4-((6-에톡시-1-옥소-1에이치-인덴-2(3에이치)-일리덴)메틸)피리딘-1-이움 클로라이드(6e)를 수득하였다.
R f (ethylacetate/n-hexane 2:1,v/v): 0.26; mp 234.4 - 235.7°C, purity by HPLC:98.3%, MS(ESI):[MH+]:266.1
1H NMR (250 MHz, DMSO-d 6 )δ8.90(d,J=5.92Hz,2H,pyridineH-2,H-6), 8.19(d,J=5.95Hz,2H,pyridineH-3,H-5), 7.59-7.56(m,2H,=CH-,indenoH-4), 7.32(d,J=8.32Hz,1H,indenoH-5), 7.23(s,1H,indenoH-7), 4.14(s,2H,indenoH-3), 4.09(q,J=6.97Hz,2H,indeno-6-OCH2CH3), 1.33(t,J=6.90Hz,3H,indeno-6-OCH2CH 3).
13C NMR (62.5 MHz, DMSO-d 6 )δ192.96, 158.85, 148.91, 144.67, 144.15, 143.04, 138.00, 127.98, 127.94, 126.58, 125.15, 106.68, 63.92, 31.29, 14.73.
<2-6> 4-((6-이소프로폭시-1-옥소-1에이치-인덴-2(3에이치)-일리덴)메틸)피 리딘-1-이움 클로라이드(6f)
상기 일반적 합성법과 동일한 방법을 이용하여 5f(0.34 g, 1.1 mmol) 및 아세톤(15 mL)을 이용하여 하기 물성치를 갖는 0.28 g (0.9 mmol, 82%)의 황색 고체상 4-((6-이소프로폭시-1-옥소-1에이치-인덴-2(3에이치)-일리덴)메틸)피리딘-1-이움 클로라이드(6f)를 수득하였다.
R f (ethylacetate/n-hexane 2:1, v/v): 0.28; mp212.9 - 213.7°C, puritybyHPLC: 100%, MS(ESI):[MH+]:280.1
1H NMR (250 MHz, DMSO-d 6 )δ8.87(d,J=6.50Hz,2H,pyridineH-2,H-6), 8.12(d,J=6.60Hz, 2H, pyridineH-3, H-5), 7.59-7.56(m,2H,=CH-,indenoH-4), 7.31(dd, J=8.30, 2.52Hz, 1H, indenoH-5), 7.25(s, 1H, indenoH-7), 4.71(sep, J=6.02Hz, 1H, indeno-6-OCH(CH3)2), 4.14(s, 2H, indenoH-3), 1.27(d,J=5.97Hz, 6H,indeno-6-OCH(CH3)2).
13C NMR (62.5 MHz, DMSO-d 6 )δ192.52, 157.28, 149.88, 144.88, 142.84, 142.48, 137.51, 127.67, 127.12, 126.67, 125.76, 107.48, 69.62, 30.90, 21.43.
<2-7> 4-((4-메톡시-1-옥소-1에이치-인덴-2(3에이치)-일리덴)메틸)피리딘-1- 이움 클로라이드(6g)
상기 일반적 합성법과 동일한 방법을 이용하여 5g(0.41 g, 1.63 mmol) 및 아세톤(110 mL)을 이용하여 하기 물성치를 갖는 0.34 g (1.17 mmol, 71.6%)의 밝은 황색 고체상 4-((4-메톡시-1-옥소-1에이치-인덴-2(3에이치)-일리덴)메틸)피리딘-1-이움 클로라이드(6g)를 수득하였다.
R f (ethylacetate/n-hexane2:1,v/v): 0.29; mp239.5-240.3°C,purity by HPLC:98%,MS(ESI):[MH+]:252.1
1H NMR (250 MHz, DMSO-d 6 )δ8.88(d,J=6.42Hz,2H,pyridineH-2,H-6), 8.20(d, J=6.07Hz, 2H, pyridineH-3, H-5), 7.60(s, 1H, =CH-), 7.49(t, J=7.67Hz, 1H,indenoH-6), 7.41-7.33(m, 2H, indenoH-5, H-7), 4.07(s, 2H, indenoH-3), 3.91(s, 3H, indeno-4-OCH3),
13C NMR (62.5 MHz, DMSO-d 6 )δ193.06, 156.64, 149.30, 144.05, 143.22, 138.44, 137.96, 130.04, 128.14, 126.75, 117.08, 115.71, 55.81, 28.91.
<2-8> 4-((4-에톡시-1-옥소-1에이치-인덴-2(3에이치)-일리덴)메틸)피리딘-1- 이움 클로라이드(6h)
상기 일반적 합성법과 동일한 방법을 이용하여 5h(0.97 g, 3.67 mmol) 및 아세톤(25 mL)을 이용하여 하기 물성치를 갖는 0.83 g (2.75 mmol, 74.9%)의 황색 고체상 4-((4-에톡시-1-옥소-1에이치-인덴-2(3에이치)-일리덴)메틸)피리딘-1-이움 클로라이드(6h)를 수득하였다.
R f (ethylacetate/n-hexane2:1,v/v):0.34;mp224.2-225.4°C,puritybyHPLC:100%,MS(ESI):[MH+]:266.1
1H NMR (250 MHz, DMSO-d 6 )δ8.90(d, J=6.50Hz, 2H, pyridineH-2, H-6),8.21(d, J=6.50Hz, 2H, pyridineH-3, H-5),7.60(s,1H,=CH-),7.47(t, J=7.65Hz, 1H, indenoH-6),7.39-7.32(m,2H, indenoH-5, H-7),4.18(q, J=6.95Hz, 2H, indeno-4-OCH2CH3), 4.06(s, 2H, indenoH-3), 1.39(t, J=6.95Hz, 3H, indeno-4-OCH2CH 3),
13C NMR (62.5 MHz, DMSO-d 6 )δ193.28, 156.11, 149.77, 144.14, 144.02, 143.55, 138.72, 138.21, 130.19, 128.30, 127.00, 126.95, 118.08, 115.80, 64.17, 29.00, 14.97
<2-9> 4-((4-이소프로포시-1-옥소-1에이치-인덴-2(3에이치)-일리덴)메틸)피 리딘-1-이움 클로라이드(6i)
상기 일반적 합성법과 동일한 방법을 이용하여 5i(0.61 g, 1.95 mmol) 및 아세톤(20 mL)을 이용하여 하기 물성치를 갖는 0.51 g (1.83 mmol, 82.9%)의 황색 고체상 4-((4-이소프로포시-1-옥소-1에이치-인덴-2(3에이치)-일리덴)메틸)피리딘-1-이움 클로라이드(6i)를 수득하였다.
R f (ethylacetate/n-hexane2:1,v/v): 0.41; mp164.9-165.8°C, purity by HPLC:100%,MS(ESI):[MH+]:280.0
a1H NMR (250 MHz, DMSO-d 6 )δ8.90(d, J=6.37Hz, 2H, pyridineH-2,H-6), 8.17(d, J=6.42Hz, 2H, pyridineH-3,H-5), 7.60(s,1H,=CH-), 7.46(t, J=7.70Hz, 1H, indenoH-6), 7.38-7.36(m, 2H, indenoH-5,H-7), 4.78(sep, J=6.02Hz, 1H, indeno-4-OCH(CH3)2), 4.03(s, 2H, indenoH-3), 1.34(d, J=6.04Hz, 6H, indeno-4-OCH(CH3)2),
13C NMR (62.5 MHz, DMSO-d 6 )δ193.16, 155.15, 150.08, 143.77, 143.34, 139.35, 138.32, 130.02, 128.01, 127.11, 119.33, 115.65, 70.47, 28.96, 22.11.
참고로, 본 발명의 4-((6-hydroxy-1-oxo-1H-inden-2(3H)-ylidene)methyl)pyridin-1-ium chloride (6b)는 TI-2-9로 명명하였고, 4-((4-hydroxy-1-oxo-1H-inden-2(3H)-ylidene)methyl)pyridin-1-ium chloride (6c)는 TI-2-11로, 4-((6-methoxy-1-oxo-1H-inden-2(3H)-ylidene)methyl)pyridin-1-ium chloride(6d)는 TI-2-45, 4-((6-ethoxy-1-oxo-1H-inden-2(3H)-ylidene)methyl)pyridin-1-ium chloride (6e)는 TI-2-46, 4-((6-isopropoxy-1-oxo-1H-inden-2(3H)-ylidene)methyl)pyridin-1-ium chloride (6f)는 TI-2-47, 4-((4-methoxy-1-oxo-1H-inden-2(3H)-ylidene)methyl)pyridin-1-ium chloride (6g)는 TI-2-48, 4-((4-ethoxy-1-oxo-1H-inden-2(3H)-ylidene)methyl)pyridin-1-ium chloride (6h)는 TI-2-49, 4-((4-isopropoxy-1-oxo-1H-inden-2(3H)-ylidene)methyl)pyridin-1-ium chloride (6i)는 TI-2-50로 명명하였다.
<실험예 1>
염증성장질환의 in vitro 모델에서 본 발명의 신규 화합물의 염증 억제 활성
본 발명자들은 상기 실시예에서 준비된 본 발명의 신규 화합물들의 염증성장질환 in vitro 모델에서 인데논 화합물의 염증 억제 활성 여부를 알아보기 위하여 하기와 같이 실험을 진행하였다.
먼저, 인간대장암 세포주 HT-29 세포(American Type Culture Collections, Rockville, MA, USA)를 10% 태아소혈청(FBS), 1% 페니실린/스트렙토마이신 및 2 mmol/L 글루타민을 함유한 RPMI 1640에서 배양하고, 95% 공기 및 5% CO2의 환경 하 37℃에서 상기 세포주를 유지하였다. 이하 실험은 36계대 이하인 세포를 사용하였다.
세포들은 0.25% 트립신 및 1% EDTA를 함유한 D-PBS(Dulbecco's phosphate buffered saline)를 이용하여 주단위로 계대배양 하였다. 배양 배지는 이틀마다 교체하였다. 컨플루언트하게 자란 후, 1:5 비율로 분할하여 서브컬쳐(subculture) 하였다.
실험을 위하여, 혈청 함유 배지를 포함하는 플라스틱 세포배양 웰에 세포를 분주하고, 24시간 동안 부착시켰다. 그후, 모든 실험은 혈청 없는 조건에서 수행되었다.
각 세포는 TNF-α의 자극 1시간 전에 실시예에서 제조한 각 화합물들로 전처리되었다. 각 화합물들의 스탁 용액은 디메틸설폭사이드(DMSO)로 준비되었고, 이때 실험 배지에 사용된 DMSO의 최종 최대농도는 0.1% 이하였다. 대조군과 TNF-α만으로 처리된 세포는 0.1% DMSO를 함유한 실험 배지로 전처리되었다.
이때 양성 대조군으로, 20mM의 5-아미노살리실산(5-ASA)을 사용하였다. 상기 5-ASA는 IBD에서 활성화된 염증성 서열을 저해하는 효과가 있는 것으로 알려져 있다.
염증성장질환의 in vitro 모델에서 인데논 화합물의 염증 억제 활성을 측정한 결과, TNF-α에 의해 HT-29 세포의 염증성 반응이 유의성 있게 나타나는 것을 확인하였으며 TI-2-9, TI-2-47, TI-2-11, TI-2-49, TI-2-50 (각 10μM)이 양성대조군인 5-ASA (20 mM)보다 효능이 우수함을 알 수 있었다(도 2 참조).
<실험예 2>
TNBS로 유도된 염증성장질환 동물모델에서 본 발명의 신규 화합물 대장염 억제 in vivo 효능 평가 확인
본 발명자들은 상기 실시예에서 준비된 본 발명의 신규 화합물에 in vivo 상에서 대장염 억제 효과가 있는지 하기와 같이 실험을 진행하였다.
먼저, 동물은 7 ~ 8 주령 된 Sprague Dawley 종을 Orient Bio Korea로부터 구입하여 2일간 일반 고형사료로 안정화 시킨 후 실험에 이용하였다. 실험 기간 중 사료와 물을 자유로이 공급하였고, 사육실의 온도는 25 ± 1℃, 상대습도는 50 ± 10%로 유지시켰다. 점등관리는 자동조명조절기에 의해 12시간 명암주기(light-dark cycle)로 조절하였다. 실험군은 각 군당 6 마리로 하여 평균체중이 180 ± 10 g이 되도록 난괴법(randomized block design)에 의하여 5군 (대조군, TNBS 단독 투여군, TNBS + 5-ASA 100 ㎎/㎏ 투여군, TNBS + 인데논화합물 2종 10 ㎎/㎏ 투여군)으로 나누어 실험하였다.
24 시간 절식한 랫드를 디에틸 에테르(diethyl ether)로 마취하고, 폴리에틸렌 카테터(polyethylene catheter)를 연결한 1㎖ 주사기를 이용하여 항문을 통하여 대장의 관강내에 50% (v/v) 에탄올로 희석한 3% TNBS 0.8 ㎖을 천천히 주입한 후, 항문으로 3% TNBS가 새어 나오는 것을 방지하기 위하여 랫드를 거꾸로 세운 상태에서 60 초 동안 정치시켰다. 대조군은 vehicle (50% (v/v) ethanol)만을 다른 실험군과 마찬가지 방법으로 주입하였다.
약물의 효과를 조사하기 위하여 절식 24 시간 후에 TNBS 처치 후 다음날부터 5 일 동안 약물을 10 ㎎/㎏을 경구투여로 매일 일정한 시간에 일회 투여하였다. 비교 시험물질은 염증성장질환(IBD) 치료제로 가장 잘 알려진 설파살라진(sulfasalazine)의 활성 대사체인 5-ASA를 양성 대조군으로 사용하였다.
모든 랫드들은 TNBS 투여 후 7일째 희생되었다. 육안으로 보이는 궤양과 대장염의 심각성은 실험에 참가하지 않은 두 명의 조사자에 의해 평가하였다. 랫드의 대장을 적출하여 항문으로부터 5 ~ 6 ㎝ 사이의 조직을 1 ㎝ 길이로 잘라서 조직의 장 무게 및 MPO 활성을 측정하고 조직검사를 실시하는데 사용하였다. 또한, 모든 실험동물은 Digital mass meter를 이용하여 절식단계부터 TNBS 투여 및 약물 투여과정 동안 각 랫드의 체중 변화를 관찰하였으며, 동물실험은 실험동물의 관리와 사용을 위해 영남대학교 실험동물센타에 제도화된 지침에 따라 수행되었다.
체중 180 ~ 190 g인 랫드에 3% TNBS를 이용하여 장내에 염증을 유발한 대장염 모델에서 TNBS 처리 전의 몸무게를 기준으로 5 일 간 매일 일정시간에 몸무게의 변화를 관찰한 결과, 도면 3에서 보는 바와 같이 vehicle 처리 대조군은 계속해서 몸무게가 증가함을 보이고 TNBS 군은 계속하여 몸무게가 감소하며 5 일째부터 몸무게가 약간 회복되었으나, 정상군과 비교했을 때 몸무게가 현저히 감소되었다.
양성대조군 5-ASA 100 ㎎/㎏을 처리한 군은 4 일째부터 몸무게가 서서히 회복되어 TNBS 단독 투여군에 비해 몸무게가 증가하였다. TNBS 처리 후 본 발명의 신규 화합물을 1 ㎎/㎏의 용량으로 복강 투여한 경우는 3 일째까지 몸무게 감소현상이 나타났으며, 4 일째부터 서서히 회복되어 TNBS 단독 처리군에 비하여 몸무게가 증가하였다.
본 발명의 신규 화합물은 양성 대조군인 5-ASA 보다 몸무게 회복이 더 크게 나타남을 알 수 있었다(도 4a 및 4b 참조).
또한, 본 발명자들은 5일간의 약물투여가 끝난 후에 대장을 적출하여 육안으로 살펴 본 결과, TNBS를 처리한 랫드의 대장은 대조군에 비하여 부종과 충혈이 관찰되었으며, 충수돌기의 부종과 울혈 및 유착현상이 나타남을 알 수 있었다. 양성대조군 5-ASA를 100 ㎎/㎏의 양으로 투여한 군에서는 TNBS 단독 투여군과 비교하여 육안적 증상과 다른 기관들 사이의 유착이나 대장의 충혈도 현저히 억제됨을 알 수 있었다. 그러나, 본 발명의 신규 화합물을 10 ㎎/㎏의 양으로 처리한 군에서 부종과 충혈의 억제 효과는 상기 양성 대조군인 5-ASA보다 크게 나타나 본 발명의 신규 화합물들은 염증성 장질환을 효과적으로 억제함을 알 수 있었다(도 3a 및 3b 참조).
나아가, 랫드의 대장을 적출하여 조직 무게를 측정한 결과, vehicle 처리 대조군에 비해 TNBS 단독 처리군의 경우 부종이 있는 장의 무게가 유의적으로 증가하였다. 양성 대조군인 5-ASA를 100 ㎎/㎏의 양으로 처리한 군에서는 장의 무게가 TNBS 처리군에 비해 유의적으로 감소하였고 본 발명의 신규한 화합물을 처리한 군도 양성대준과 비슷하게 대조군보다 장의 무게가 감소하였음을 알 수 있었다(도 5a 및 5b 참조).
따라서, 상기의 결과로 본 발명의 방법으로 제조된 신규한 화합물은 염증성장질환의 치료에 효과적임을 알 수 있었다.
이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

Claims (5)

  1. 하기 화학식 (1)의 구조를 갖는 신규한 인데노 피리디니움 유도체 화합물, 그 이성체 또는 이의 약리학적으로 허용 가능한 염:
    Figure PCTKR2015005352-appb-I000003
    상기 식에서, R1 및 R2는 각각 독립적으로 수소원자, 히드록시기, 메톡시기, 에톡시기, 이소프로필옥시기, C1-C6 저급 알킬기, 할로겐 원자 및 카르복실산으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 치환기이다.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 화합물은 하기 화학식 (2)의 구조를 갖는 4-((6-에톡시-1-옥소-1에이치-인덴-2(3에이치)-일리덴)메틸)피리딘-1-이움 클로라이드(6e) 화합물인 것을 특징으로 하는 화합물;
    Figure PCTKR2015005352-appb-I000004
    .
  3. 제1항에 있어서,
    상기 화합물은 하기 화학식 (3)의 구조를 갖는 4-((6-이소프로폭시-1-옥소-1에이치-인덴-2(3에이치)-일리덴)메틸)피리딘-1-이움 클로라이드(6f) 화합물인 것을 특징으로 하는 화합물;
    Figure PCTKR2015005352-appb-I000005
    .
  4. 제1항에 있어서,
    상기 화합물은 하기 화학식 (4)의 구조를 갖는 4-((4-에톡시-1-옥소-1에이치-인덴-2(3에이치)-일리덴)메틸)피리딘-1-이움 클로라이드(6h) 화합물인 것을 특징으로 하는 화합물;
    Figure PCTKR2015005352-appb-I000006
    .
  5. 제1항에 있어서,
    상기 화합물은 하기 화학식 (5)의 구조를 갖는 4-((4-이소프로포시-1-옥소-1에이치-인덴-2(3에이치)-일리덴)메틸)피리딘-1-이움 클로라이드(6i) 화합물인 것을 특징으로 하는 화합물;
    Figure PCTKR2015005352-appb-I000007
    .
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