KR101732776B1

KR101732776B1 - 신규한 인데노 피리디니움 유도체 화합물 및 이의 제조방법

Info

Publication number: KR101732776B1
Application number: KR1020140135731A
Authority: KR
Inventors: 이응석; 김정애
Original assignee: 영남대학교 산학협력단
Priority date: 2014-10-08
Filing date: 2014-10-08
Publication date: 2017-05-04
Also published as: WO2016056725A1; KR20160041547A

Abstract

본 발명은 신규한 인데노 피리디니움 유도체 화합물 및 이의 제조방법에 관한 것으로서, 본 발명의 신규한 화합물은 소장의 두께 및 대장의 길이를 정상 상태와 같이 유지시키는 효과가 우수하고, 대장에 대한 염증을 억제하는 효과가 우수하여 염증성 장질환을 예방 또는 치료할 수 있는 약학적 조성물로 유용하게 사용할 수 있다.

Description

신규한 인데노 피리디니움 유도체 화합물 및 이의 제조방법{Novel Indeno Pyridinium chloride compound and a method for manufacturing the same}

본 발명은 신규한 인데노 피리디니움 유도체 화합물 및 이의 제조방법에 관한 것이다.

염증성 장 질환(IBD)은 위장 계통을 포함하는 기관의 원인 미상의 일단의 만성 염증성 질병에 통상적으로 사용되는 용어이다. IBD 는 크게 궤양성 대장염과 크론 질병으로 나뉜다. 이들은 모두 주기적으로 발발 및 진정되는 것을 특징으로 하는 희귀성을 가진다. 이들은 수술후에도 재발이 일어남으로써, 상기 질환의 특이한 합병증을 유발하거나 또는 치료하기가 어렵다.

류머티스성 관절염의 치료를 위해 1940 년대에 최초로 개발된 술파살라진은 현재 염증성 장 질환에 가장 널리 사용되고 있는 약제중 하나이다. 술파살라진은 아조 결합에 의해 술파피리딘에 결합된 살리실레이트 (5-아미노살리실레이트)로 이루어져 있다. 술파살라진은 결장 세균에 의해 분해되어, 5-아미노살리실산(5-ASA) 과 술파피리딘을 방출하는 것으로 알려져 있다. 술파피리딘은 결장으로부터 거의 완전히 흡수되어, 소변중에서 변형 및 배설되는 반면, 5-ASA 는 결장으로부터 잘 흡수되지 않는다. 술파살라진의 대부분의 부작용은 술파피리딘 부분에 기인한다 (문헌 [New Engl, J. Med. 1973 ; 289 : 491-495] (Das 등)). 1977년에, 아자드 크한 (Azad Khan) 등은 궤양성 대장염에 있어서, 활성 부분은 5-ASA 이고 (문헌 [Lancet, 1977 ; 2 : 892-5] (Azad Khan, A.K.등)), 술파피리딘은 단지 담체로서 작용하여 결장내에서 5-ASA 의 방출을 촉진한다고 주장하였다. 상기 발견후, 서서히 또는 지연되어 방출되는 5-ASA 제제 또는 기타 아조 화합물 (예 : 올살라진, 발살라진, 입살라진) 제제와 같은 여러가지 신규의 5-ASA-계 약제가 개발되었다. 그러나, 상기 증상들을 완전히 제거하며, 차후의 재발을 방지할 수 있는 약제는 현재 전혀 존재하지 않는다.

따라서 상기와 같은 단점을 극복하고 염증성 장질환을 효과적으로 치료할 수 있는 신규한 약제가 필요한 실정이다.

한국등록특허 제0335023호

본 발명의 목적은 신규한 인데노 피리디니움 유도체 화합물, 그 이성체 및 이의 약리학적으로 허용 가능한 염을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 신규한 인데노 피리디니움 유도체 화합물, 그 이성체 및 이의 약리학적으로 허용 가능한 염을 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 화합물은 하기 화학식 (2)의 구조를 갖는 4-((6-에톡시-1-옥소-1에이치-인덴-2(3에이치)-일리덴)메틸)피리딘-1-이움 클로라이드(6e) 화합물일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 화합물은 하기 화학식 (3)의 구조를 갖는 4-((6-이소프로폭시-1-옥소-1에이치-인덴-2(3에이치)-일리덴)메틸)피리딘-1-이움 클로라이드(6f) 화합물일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 화합물은 하기 화학식 (4)의 구조를 갖는 4-((4-에톡시-1-옥소-1에이치-인덴-2(3에이치)-일리덴)메틸)피리딘-1-이움 클로라이드(6h) 화합물일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 화합물은 하기 화학식 (5)의 구조를 갖는 4-((4-이소프로포시-1-옥소-1에이치-인덴-2(3에이치)-일리덴)메틸)피리딘-1-이움 클로라이드(6i) 화합물일 수 있다.

도 1은 본 발명의 신규한 인데노 피리디니움 유도체 화합물의 합성 방법을 나타낸 결과이다.
도 2는 염증성장질환 in vitro 모델에서 본 발명의 신규한 인데노 피리디니움 유도체 화합물의 염증 억제 정도를 확인한 결과이다.
도 3a 및 3b는 염증성 장질환 유도 동물 모델군, 염증성 장 질환 유도 동물 모델에 본 발명의 신규 화합물을 투여한 군으로 실험동물을 구분하여 소장의 두께 및 대장의 길이를 확인한 결과이다.
도 4a 및 4b는 염증성 장질환 유도 동물 모델군, 염증성 장 질환 유도 동물 모델에 본 발명의 신규 화합물을 투여한 군으로 실험동물을 구분하여 실험동물의 무게를 측정한 결과이다.
도 5a 및 5b는 염증성 장질환 유도 동물 모델군, 염증성 장 질환 유도 동물 모델에 본 발명의 신규 화합물을 투여한 군으로 실험동물을 구분하여 실험동물의 대장 무게를 측정한 결과이다.

본 발명은 신규한 인데노 피리디니움 유도체 화합물, 그 이성체 및 이의 약리학적으로 허용 가능한 염에 관한 것이다.

본 발명자들은 염증성장질환을 치료할 수 있는 신규한 약제를 개발하기 위하여 다양한 연구를 진행하던 중 본 발명의 신규한 인데노 피리디니움 유도체 화합물에 소장의 두께 및 대장의 길이를 정상상태와 같이 유지 시키는 효과가 우수하고, 대장의 염증을 효과적으로 억제하는 효과가 있어 염증성장질환 및 크론병의 예방 또는 치료용 조성물로 사용하기 적합함을 규명하였다는 점에 그 특징이 있다.

본 발명의 화합물은 기존 발견되지 않은 신규 화합물로서, 하기 화학식 (1)의 구조를 갖는 신규한 인데노 피리디니움 유도체 화합물, 그 이성체 및 이의 약리학적으로 허용 가능한 염:

[화학식 1]

상기 식에서, R1 및 R2는 각각 독립적으로 수소원자, 히드록시기, 메톡시기, 에톡시기, 이소프로필옥시기, C₁-C₆ 저급 알킬기, 할로겐 원자 및 카르복실산으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 치환기이다.

본 발명에서, 상기 신규한 인데노 피리디니움 유도체 화합물은 4-((6-에톡시-1-옥소-1에이치-인덴-2(3에이치)-일리덴)메틸)피리딘-1-이움 클로라이드(6e), 4-((6-이소프로폭시-1-옥소-1에이치-인덴-2(3에이치)-일리덴)메틸)피리딘-1-이움 클로라이드(6f), 4-((4-에톡시-1-옥소-1에이치-인덴-2(3에이치)-일리덴)메틸)피리딘-1-이움 클로라이드(6h), 4-((4-이소프로포시-1-옥소-1에이치-인덴-2(3에이치)-일리덴)메틸)피리딘-1-이움 클로라이드(6i)에서 선택되는 1종일 수 있다.

본 발명에서 지칭하는“염증성 장질환”은 장에 발생하는 원인 불명의 만성적인 염증을 뜻하며, 통상적으로 특발성 염증성 장질환인 궤양성 대장염과 크론병을 지칭하지만 우리나라에 비교적 흔한 장형 베체트병도 이에 속한다고 할 수 있다. 넓은 의미로는 세균성, 바이러스성, 아메바성, 결핵성 장염 등의 감염성 장염과 허혈성 장질환, 방사선 장염 등의 모든 장에 발생하는 염증성 질환을 통칭한다.

본 발명의 화합물들은 당해 기술 분야에서 통상적인 방법에 따라 약학적으로 허용 가능한 염 및 용매화물로 제조될 수 있다.

염으로는 약학적으로 허용 가능한 유리산(free acid)에 의해 형성된 산 부가염이 유용하다. 산 부가 염은 통상의 방법, 예를 들면 화합물을 과량의 산 수용액에 용해시키고, 이 염을 수혼화성 유기 용매, 예를들면 메탄올, 에탄올, 아세톤 또는 아세토니트릴을 사용하여 침전시켜 제조한다. 동 몰량의 화합물 및 몰 중의 산 또는 알코올(예, 글리콜 모노메틸에테르)을 가열하고 이어서 상기 혼합물을 증발시켜서 건조시키거나, 또는 석출된 염을 흡인 여과시킬 수 있다.

이때, 유기산으로는 유기산과 무기산을 사용할 수 있으며, 무기산으로는 염산, 인산, 황산, 질산, 주석산 등을 사용할 수 있고 유기산으로는 메탄술폰산, p-톨루엔술폰산, 아세트산, 트리플루오로아세트산, 시트르산, 말레인산, 숙신산, 옥살산, 벤조산, 타르타르산, 푸마르산, 만데르산, 프로피온산, 구연산, 젖산, 글리콜산, 글루콘산, 갈락투론산, 글루탐산, 글루타르산, 글루쿠론산, 아스파르트산, 아스코르브산, 카본산, 바닐릭산, 히드로 아이오딕산 등을 사용할 수 있다.

또한, 염기를 사용하여 약학적으로 허용 가능한 금속염을 만들 수 있다. 알칼리 금속 또는 알카리토 금속염은, 예를들면 화합물을 과량의 알칼리 금속 수산화물 또는 알칼리토금속 수산화물 용액 중에 용해하고, 비용해 화합물염을 여과한 후 여액을 증발, 건조시켜 얻는다. 이 때 금속염으로서는 특히 나트륨, 칼륨 또는 칼슘염을 제조하는 것이 제약상 적합하며, 또한 이에 대응하는 은염은 알칼리 금속 또는 알칼리토 금속염을 적당한 은염(예, 질산은)과 반응시켜 얻는다.

본 발명 화합물의 약학적으로 허용 가능한 염은, 달리 지시되지 않는 한, 화합물에 존재할 수 있는 산성 또는 염기성기의 염을 포함한다. 예를들면, 약학적으로 허용 가능한 염으로는 히드록시기의 나트륨, 칼슘 및 칼륨염이 포함되며, 아미노기의 기타 약학적으로 허용 가능한 염으로는 히드로브로마이드, 황산염, 수소 황산염, 인산염, 수소 인산염, 이수소 인산염, 아세테이트 숙시네이트 시트레이트, 타르트레이트, 락테이트, 만델레이트 메탄설포네이트(메실레이트) 및 p-톨루엔설포네이트(토실레이트) 염이 있으며, 당업계에서 알려진 염의 제조방법이나 제조과정을 통하여 제조될 수 있다.

본 발명의 다른 목적은 본 발명의 화합물의 제조방법은, 당업계에 공지된 합성방법으로 제조가능하며, 하기의 반응식들에 도시된 방법에 의해 화학적으로 합성될 수 있지만, 이들 예로만 한정되는 것은 아니다.

[반응식 1]

상기와 같은 방법으로 수득한 본 발명의 화합물은 대장의 염증을 효과적으로 억제할 수 있음을 확인하였다.

이하 본 발명을 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 국한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

< 참고예 1>

<1-1> 시약 및 재료

화합물은 출발물질을 원료로 사용하였으며 시약을 회사(Aldrich Chemical Co., Junsei 또는 기타 화학 회사)로부터 구입하여 추가의 정제 단계 없이 사용하였다. 용매 (HPLC 급 acetonitrile (ACN) 및 메탄올)는 회사(Burdick 및 Jackson, USA)에서, 구입하였고 Thin-layer chromatography (TLC) 및 컬럼 크로마토그래피 (CC)는 제품(Kieselgel 60 F254 ;Merck) 및 실리카겔 (Kieselgel 60, 230-400 mesh, Merck)을 각각 사용하였으며, 합성 화합물들은 TLC 플레이트에서 UV 자외선 (단파장 및 장파장 모두). NMR 스펙트럼은 회사(Bruker AMX 250; 250 MHz, FT: 1H NMR 및 62.5 MHz: 13C NMR) 제품을 사용하고 화학이동(δ) 은 TMS로부터 계산되어 ppm 및 결합상수(coupling constants (J)hertz (Hz))로 표시하였다. 녹는 점은 기기(electrothermal 1A 9100 digital melting point apparatus)를 이용하여 튜브(open capillary tubes)로 기록하고 보정하지 않았다.

<1-2> HPLC 분석

HPLC 분석은 하기 조건(gradient-controlled HPLC system)으로 사용하였다.

- 펌프: Shimadzu LC-10AT pumps

-조절기: Shimadzu system controller (SCL-10A VP)

- 탐지기: photo diode array detector (SPD-M10A VP) (Shimadzu Class VP 프로그램 이용).

- 시료 주입: 시료용량(10㎕)을 컬럼(Waters X- TerraμM reverse-phase C18컬럼 (4.6 ⅹ50 mm)에 주입하여 (1) A중 B 100-60%로 15 분간 흘려 보내고 (2) A중 B 60-100%로 15분간 유속(1.0 mL/min)으로 경사희석으로 흘려 보냈다(254 nm UV 탐지) (이동상 A: 20 mM ammonium formate (AF)으로 이중 희석되고 B는 물 중 90% ACN에서 20 mM AF로 이중 희석됨). 화합물의 순도는 (%)로 표시함.

<1-3> ESILC / MS 분석

ESI LC/MS 분석은 프로그램(Xcalibur)을 이용하여 기기(Finnigan LCQ AdvantageLC/MS/MS spectrometry)로 수행하였다.

ESI LC/MS 분석은 LC는 시료용량(2㎕)을 컬럼(Waters AtlantisC18column (2.1ⅹ0 mm, 3 μM))에 주입하여 (1) 100% 증류수 (A) 및 (2) 100% ACN (B)로 이동상을 구성하여 유속(200 μL/min)으로 경사희석으로 흘려 보냈다 초기 이동상 조기 조성은 10% B로 하고 프로그램된 순서로 5분 후 선형으로 90% B 으로 변화시키고 15분 후에 10% B 로 흘려 보냈다. MS 이온화 조건은 하기와 같다: 시쓰 가스(Sheath gas) 유속: 70 arb, 옥스 가스(aux gas) 유속: 20 arb, I spray voltage: 4.5 KV, capillary 온도 215 ℃, 컬럼 온도 40 ℃, capillary voltage: 21 V, tube lens offset: 10 V.Retention time은 분(minutes)으로 함.

< 실시예 1>

화합물 (5)의 일반적 제조법

1-인다논(1-Indanone) 1(R= a-c) 또는 3 (R²=d-i)의 4 - 피리딘 카르복시알데하일(4-Pyridine carboxaldehyle carboxaldehyle)의 동량과 반응시키고, 메탄올 / 에탄올의 존재하에 5 %의 NaOH 수용액을 적가하였다. 반응 후 1-6 시간 동안 0 ℃에서 두었으며, 화합물 5f 및 5i 반응 혼합물을 48 내지 72 시간 동안 질소하에 둔 다음 산화 알루미늄 있는 곳에서 90 ~ 100℃ 온도로 환류시켰다.

혼합물을 냉 메탄올로 세정하고, 여과하고, 30 분 동안 냉각하고, 밤새 건조시켰다. 침전이 발생하지 않은 경우는 상기 반응 혼합물을 에틸 아세테이트로 추출하고, 물 및 염수로 세척 하였다. 유기층을 황산 마그네슘으로 건조시키고 여과 하였다. 그리고 추가적으로 재결정이나 컬럼 크로마토 그래피를 수행하여 정제하여 67.8-99.4 % 수율로 고체의 화합물 5 (R³ = a-i)을 수득하였다.

< 실시예 2>

화합물 (6)의 일반적 제조법

상기 실시예 1의 방법으로 얻어진 화합물 5 (R³ = a-i)를 아세톤에 용해시키고, 침전이 발생할 때까지 염산을 적가하였다. 그 다음 침전이 될 때까지 여과하였다. 침전물이 발생하지 않은 경우, 용매는 순수한 고체 화합물을 얻을 수 있는 회전식 증발기 도움으로 증발 건조시켜 62.7-96.9 % 수율로 합성된 6의 9가지 화합물(R³ = a-i)을 수득하였다(도 1 참조).

<2-1> 4-((1-옥소- 1에이치 - 인덴 -2( 3에이치 )- 일리덴 ) 메틸 )피리딘-1- 이움 클로라이드(6a)

상기 일반적 합성법과 동일한 방법을 이용하여 5a (1.08 g, 4.9 mmol) 및 아세톤(30 mL)을 이용하여 하기 물성치를 갖는 0.79 g (3.07 mmol, 62.7%)의 하얀색 크리미한 고체상 4-((1-옥소-1에이치-인덴-2(3에이치)-일리덴)메틸)피리딘-1-이움 클로라이드(6a)를 수득하였다.

R _f (ethylacetate/n-hexane 2:1,v/v):0.25; mp 229.6-230.2°C, purity by HPLC:100%,MS(ESI):[MH⁺]: 222.1

¹H NMR (250 MHz, DMSO-d ₆ ) 8.93(d,J=6.37Hz, 2H, pyridine H-2,H-6), 8.24(d,J=6.30Hz,2H, pyridine H-3,H-5), 7.58-7.6(m,4H,=CH-,indenoH-4,H-5,H-7), 7.51(t,J=7.22,1H,indenoH-6),4.27(s,2H,indenoH-3).

¹³C NMR (62.5 MHz, DMSO-d ₆ )δ193.16, 150.51, 149.96, 144.02, 143.58, 136.68, 136.23, 128.38, 127.78, 127.00, 124.39, 32.04.

<2-2> 4-((6- 하이드록시 -1-옥소- 1에이치 - 인덴 -2( 3에이치 )- 일리덴 ) 메틸 )피리딘-1- 이움 클로라이드(6b)

상기 일반적 합성법과 동일한 방법을 이용하여 5b (0.4 g, 1.69 mmol) 및 아세톤(40 mL)을 이용하여 하기 물성치를 갖는 0.45 g (1.64 mmol, 96.9%)의 황색 고체상 4-((6-하이드록시-1-옥소-1에이치-인덴-2(3에이치)-일리덴)메틸)피리딘-1-이움 클로라이드(6b)를 수득하였다.

R _f (ethylacetate/n-hexane2:1,v/v):0.13; mp 265.8-266.9°C, purity by HPLC: 100%, MS (ESI): [MH⁺]:238.1

¹H NMR (250 MHz, DMSO-d ₆ )δ8.81(d,J=6.42Hz, 2H, pyridine H-2, H-6), 8.51(d,J=6.47Hz, 2H, pyridineH-3, H-5), 7.50-7.46(m,2H,=CH-,indenoH-4),7.18(dd,J=8.22,2.45Hz,1H,indenoH-5), 7.11-7.10(m,1H,indenoH-7), 4.07(s,2H,indenoH-3).

¹³C NMR (62.5 MHz, DMSO-d ₆ )δ193.08, 157.74, 149.40, 144.61, 144.19, 141.29, 137.97, 127.83, 127.62, 126.74, 124.84, 108.65, 31.27.

<2-3> 4-((4- 하이드록시 -1-옥소- 1에이치 - 인덴 -2( 3에이치 )- 일리덴 ) 메틸 )피리딘-1- 이움 클로라이드(6c)

상기 일반적 합성법과 동일한 방법을 이용하여 5c(0.4 g, 1.69 mmol) 및 아세톤(80 mL)을 이용하여 하기 물성치를 갖는 0.36 g (1.33 mmol, 79.2%)의 밝은 황색 고체상 4-((4-하이드록시-1-옥소-1에이치-인덴-2(3에이치)-일리덴)메틸)피리딘-1-이움 클로라이드(6c)를 수득하였다.

R _f (ethylacetate/n-hexane2:1,v/v): 0.13; mp 259.2-262.8 °C, purity by HPLC: 97.5%, MS (ESI): [MH⁺]: 238.1

¹H NMR (250 MHz, DMSO-d ₆ )δ10.26(s,1H,indeno4-OH), 8.88(d,J=5.27Hz,2H,pyridineH-2,H-6),8.12(d,J=5.40Hz,2H,pyridineH-3,H-5), 7.58(s,1H,=CH-),7.37-7.26(m,2H,indenoH-6,H-7),7.16(d,J=7.35Hz,1H,indenoH-5), 4.05(s,2H,indenoH-3).

¹³C NMR (62.5 MHz, DMSO-d ₆ )δ193.03, 154.83, 146.24, 141.94, 138.15, 136.48, 129.25, 128.43, 125.54, 121.09, 114.34, 28.80

<2-4> 4-((6- 메톡시 -1-옥소- 1에이치 - 인덴 -2( 3에이치 )- 일리덴 ) 메틸 )피리딘-1- 이움 클로라이드(6d)

상기 일반적 합성법과 동일한 방법을 이용하여 5d(0.24 g, 0.96 mmol) 및 아세톤(20 mL)을 이용하여 하기 물성치를 갖는 0.22 g (0.78 mmol, 81.2%)의 황색 고체상 4-((6-메톡시-1-옥소-1에이치-인덴-2(3에이치)-일리덴)메틸)피리딘-1-이움 클로라이드(6d)를 수득하였다.

R _f (ethylacetate/n-hexane2:1,v/v):0.22;mp259.8-261.2°C,puritybyHPLC:99.3%,MS(ESI):[MH⁺]:252.1

¹H NMR (250 MHz, DMSO-d ₆ )δ8.87(d,J=6.30Hz,2H,pyridineH-2,H-6),8.14(d,J=6.37Hz,2H,pyridineH-3,H-5),7.61-7.57(m,2H,=CH-,indenoH-4),7.35(dd,J=8.35,2.55Hz,1H,indenoH-5),7.27(s,1H,indenoH-7),4.15(s,2H,indenoH-3),3.82(s,3H,indeno-6-OCH₃).

¹³C NMR (62.5 MHz, DMSO-d ₆ )δ193.13,160.18,145.05,144.14,143.30,138.11,128.21,128.05,126.63,125.01,106.23,55.96,31.39.

<2-5> 4-((6- 에톡시 -1-옥소- 1에이치 - 인덴 -2( 3에이치 )- 일리덴 ) 메틸 )피리딘-1- 이움 클로라이드(6e)

상기 일반적 합성법과 동일한 방법을 이용하여 5e(0.75 g, 2.8 mmol) 및 아세톤(25 mL)을 이용하여 하기 물성치를 갖는 0.65 g (2.12 mmol, 76.9%)의 황색 고체상 4-((6-에톡시-1-옥소-1에이치-인덴-2(3에이치)-일리덴)메틸)피리딘-1-이움 클로라이드(6e)를 수득하였다.

R _f (ethylacetate/n-hexane 2:1,v/v): 0.26; mp 234.4 - 235.7°C, purity by HPLC:98.3%, MS(ESI):[MH⁺]:266.1

¹H NMR (250 MHz, DMSO-d ₆ )δ8.90(d,J=5.92Hz,2H,pyridineH-2,H-6), 8.19(d,J=5.95Hz,2H,pyridineH-3,H-5), 7.59-7.56(m,2H,=CH-,indenoH-4), 7.32(d,J=8.32Hz,1H,indenoH-5), 7.23(s,1H,indenoH-7), 4.14(s,2H,indenoH-3), 4.09(q,J=6.97Hz,2H,indeno-6-OCH2CH₃), 1.33(t,J=6.90Hz,3H,indeno-6-OCH₂CH ₃).

¹³C NMR (62.5 MHz, DMSO-d ₆ )δ192.96, 158.85, 148.91, 144.67, 144.15, 143.04, 138.00, 127.98, 127.94, 126.58, 125.15, 106.68, 63.92, 31.29, 14.73.

<2-6> 4-((6- 이소프로폭시 -1-옥소- 1에이치 - 인덴 -2( 3에이치 )- 일리덴 ) 메틸 )피리딘-1- 이움 클로라이드(6f)

상기 일반적 합성법과 동일한 방법을 이용하여 5f(0.34 g, 1.1 mmol) 및 아세톤(15 mL)을 이용하여 하기 물성치를 갖는 0.28 g (0.9 mmol, 82%)의 황색 고체상 4-((6-이소프로폭시-1-옥소-1에이치-인덴-2(3에이치)-일리덴)메틸)피리딘-1-이움 클로라이드(6f)를 수득하였다.

R _f (ethylacetate/n-hexane 2:1, v/v): 0.28; mp212.9 - 213.7°C, puritybyHPLC: 100%, MS(ESI):[MH⁺]:280.1

¹H NMR (250 MHz, DMSO-d ₆ )δ8.87(d,J=6.50Hz,2H,pyridineH-2,H-6), 8.12(d,J=6.60Hz, 2H, pyridineH-3, H-5), 7.59-7.56(m,2H,=CH-,indenoH-4), 7.31(dd, J=8.30, 2.52Hz, 1H, indenoH-5), 7.25(s, 1H, indenoH-7), 4.71(sep, J=6.02Hz, 1H, indeno-6-OCH(CH₃)₂), 4.14(s, 2H, indenoH-3), 1.27(d,J=5.97Hz, 6H,indeno-6-OCH(CH3)₂).

¹³C NMR (62.5 MHz, DMSO-d ₆ )δ192.52, 157.28, 149.88, 144.88, 142.84, 142.48, 137.51, 127.67, 127.12, 126.67, 125.76, 107.48, 69.62, 30.90, 21.43.

<2-7> 4-((4- 메톡시 -1-옥소- 1에이치 - 인덴 -2( 3에이치 )- 일리덴 ) 메틸 )피리딘-1- 이움 클로라이드(6g)

상기 일반적 합성법과 동일한 방법을 이용하여 5g(0.41 g, 1.63 mmol) 및 아세톤(110 mL)을 이용하여 하기 물성치를 갖는 0.34 g (1.17 mmol, 71.6%)의 밝은 황색 고체상 4-((4-메톡시-1-옥소-1에이치-인덴-2(3에이치)-일리덴)메틸)피리딘-1-이움 클로라이드(6g)를 수득하였다.

R _f (ethylacetate/n-hexane2:1,v/v): 0.29; mp239.5-240.3°C,purity by HPLC:98%,MS(ESI):[MH⁺]:252.1

¹H NMR (250 MHz, DMSO-d ₆ )δ8.88(d,J=6.42Hz,2H,pyridineH-2,H-6), 8.20(d, J=6.07Hz, 2H, pyridineH-3, H-5), 7.60(s, 1H, =CH-), 7.49(t, J=7.67Hz, 1H,indenoH-6), 7.41-7.33(m, 2H, indenoH-5, H-7), 4.07(s, 2H, indenoH-3), 3.91(s, 3H, indeno-4-OCH₃),

¹³C NMR (62.5 MHz, DMSO-d ₆ )δ193.06, 156.64, 149.30, 144.05, 143.22, 138.44, 137.96, 130.04, 128.14, 126.75, 117.08, 115.71, 55.81, 28.91.

<2-8> 4-((4- 에톡시 -1-옥소- 1에이치 - 인덴 -2( 3에이치 )- 일리덴 ) 메틸 )피리딘-1- 이움 클로라이드(6h)

상기 일반적 합성법과 동일한 방법을 이용하여 5h(0.97 g, 3.67 mmol) 및 아세톤(25 mL)을 이용하여 하기 물성치를 갖는 0.83 g (2.75 mmol, 74.9%)의 황색 고체상 4-((4-에톡시-1-옥소-1에이치-인덴-2(3에이치)-일리덴)메틸)피리딘-1-이움 클로라이드(6h)를 수득하였다.

R _f (ethylacetate/n-hexane2:1,v/v):0.34;mp224.2-225.4°C,puritybyHPLC:100%,MS(ESI):[MH⁺]:266.1

¹H NMR (250 MHz, DMSO-d ₆ )δ8.90(d, J=6.50Hz, 2H, pyridineH-2, H-6),8.21(d, J=6.50Hz, 2H, pyridineH-3, H-5),7.60(s,1H,=CH-),7.47(t, J=7.65Hz, 1H, indenoH-6),7.39-7.32(m,2H, indenoH-5, H-7),4.18(q, J=6.95Hz, 2H, indeno-4-OCH2CH₃), 4.06(s, 2H, indenoH-3), 1.39(t, J=6.95Hz, 3H, indeno-4-OCH₂CH ₃),

¹³C NMR (62.5 MHz, DMSO-d ₆ )δ193.28, 156.11, 149.77, 144.14, 144.02, 143.55, 138.72, 138.21, 130.19, 128.30, 127.00, 126.95, 118.08, 115.80, 64.17, 29.00, 14.97

<2-9> 4-((4- 이소프로포시 -1-옥소- 1에이치 - 인덴 -2( 3에이치 )- 일리덴 ) 메틸 )피리딘-1- 이움 클로라이드(6i)

상기 일반적 합성법과 동일한 방법을 이용하여 5i(0.61 g, 1.95 mmol) 및 아세톤(20 mL)을 이용하여 하기 물성치를 갖는 0.51 g (1.83 mmol, 82.9%)의 황색 고체상 4-((4-이소프로포시-1-옥소-1에이치-인덴-2(3에이치)-일리덴)메틸)피리딘-1-이움 클로라이드(6i)를 수득하였다.

R _f (ethylacetate/n-hexane2:1,v/v): 0.41; mp164.9-165.8°C, purity by HPLC:100%,MS(ESI):[MH⁺]:280.0

^a1H NMR (250 MHz, DMSO-d ₆ )δ8.90(d, J=6.37Hz, 2H, pyridineH-2,H-6), 8.17(d, J=6.42Hz, 2H, pyridineH-3,H-5), 7.60(s,1H,=CH-), 7.46(t, J=7.70Hz, 1H, indenoH-6), 7.38-7.36(m, 2H, indenoH-5,H-7), 4.78(sep, J=6.02Hz, 1H, indeno-4-OCH(CH₃)₂), 4.03(s, 2H, indenoH-3), 1.34(d, J=6.04Hz, 6H, indeno-4-OCH(CH3)₂),

¹³C NMR (62.5 MHz, DMSO-d ₆ )δ193.16, 155.15, 150.08, 143.77, 143.34, 139.35, 138.32, 130.02, 128.01, 127.11, 119.33, 115.65, 70.47, 28.96, 22.11.

참고로, 본 발명의 4-((6-hydroxy-1-oxo-1H-inden-2(3H)-ylidene)methyl)pyridin-1-ium chloride (6b)는 TI-2-9로 명명하였고, 4-((4-hydroxy-1-oxo-1H-inden-2(3H)-ylidene)methyl)pyridin-1-ium chloride (6c)는 TI-2-11로, 4-((6-methoxy-1-oxo-1H-inden-2(3H)-ylidene)methyl)pyridin-1-ium chloride(6d)는 TI-2-45, 4-((6-ethoxy-1-oxo-1H-inden-2(3H)-ylidene)methyl)pyridin-1-ium chloride (6e)는 TI-2-46, 4-((6-isopropoxy-1-oxo-1H-inden-2(3H)-ylidene)methyl)pyridin-1-ium chloride (6f)는 TI-2-47, 4-((4-methoxy-1-oxo-1H-inden-2(3H)-ylidene)methyl)pyridin-1-ium chloride (6g)는 TI-2-48, 4-((4-ethoxy-1-oxo-1H-inden-2(3H)-ylidene)methyl)pyridin-1-ium chloride (6h)는 TI-2-49, 4-((4-isopropoxy-1-oxo-1H-inden-2(3H)-ylidene)methyl)pyridin-1-ium chloride (6i)는 TI-2-50로 명명하였다.

< 실험예 1>

염증성장질환의 in vitro 모델에서 본 발명의 신규 화합물의 염증 억제 활성

본 발명자들은 상기 실시예에서 준비된 본 발명의 신규 화합물들의 염증성장질환 in vitro 모델에서 인데논 화합물의 염증 억제 활성 여부를 알아보기 위하여 하기와 같이 실험을 진행하였다.

먼저, 인간대장암 세포주 HT-29 세포(American Type Culture Collections, Rockville, MA, USA)를 10% 태아소혈청(FBS), 1% 페니실린/스트렙토마이신 및 2 mmol/L 글루타민을 함유한 RPMI 1640에서 배양하고, 95% 공기 및 5% CO₂의 환경 하 37℃에서 상기 세포주를 유지하였다. 이하 실험은 36계대 이하인 세포를 사용하였다.

세포들은 0.25% 트립신 및 1% EDTA를 함유한 D-PBS(Dulbecco's phosphate buffered saline)를 이용하여 주단위로 계대배양 하였다. 배양 배지는 이틀마다 교체하였다. 컨플루언트하게 자란 후, 1:5 비율로 분할하여 서브컬쳐(subculture) 하였다.

실험을 위하여, 혈청 함유 배지를 포함하는 플라스틱 세포배양 웰에 세포를 분주하고, 24시간 동안 부착시켰다. 그후, 모든 실험은 혈청 없는 조건에서 수행되었다.

각 세포는 TNF-α의 자극 1시간 전에 실시예에서 제조한 각 화합물들로 전처리되었다. 각 화합물들의 스탁 용액은 디메틸설폭사이드(DMSO)로 준비되었고, 이때 실험 배지에 사용된 DMSO의 최종 최대농도는 0.1% 이하였다. 대조군과 TNF-α만으로 처리된 세포는 0.1% DMSO를 함유한 실험 배지로 전처리되었다.

이때 양성 대조군으로, 20mM의 5-아미노살리실산(5-ASA)을 사용하였다. 상기 5-ASA는 IBD에서 활성화된 염증성 서열을 저해하는 효과가 있는 것으로 알려져 있다.

염증성장질환의 in vitro 모델에서 인데논 화합물의 염증 억제 활성을 측정한 결과, TNF-α에 의해 HT-29 세포의 염증성 반응이 유의성 있게 나타나는 것을 확인하였으며 TI-2-9, TI-2-47, TI-2-11, TI-2-49, TI-2-50 (각 10μM)이 양성대조군인 5-ASA (20 mM)보다 효능이 우수함을 알 수 있었다(도 2 참조).

< 실험예 2>

TNBS 로 유도된 염증성장질환 동물모델에서 본 발명의 신규 화합물 대장염 억제 in vivo 효능 평가 확인

본 발명자들은 상기 실시예에서 준비된 본 발명의 신규 화합물에 in vivo 상에서 대장염 억제 효과가 있는지 하기와 같이 실험을 진행하였다.

먼저, 동물은 7 ~ 8 주령 된 Sprague Dawley 종을 Orient Bio Korea로부터 구입하여 2일간 일반 고형사료로 안정화 시킨 후 실험에 이용하였다. 실험 기간 중 사료와 물을 자유로이 공급하였고, 사육실의 온도는 25 ± 1℃, 상대습도는 50 ± 10%로 유지시켰다. 점등관리는 자동조명조절기에 의해 12시간 명암주기(light-dark cycle)로 조절하였다. 실험군은 각 군당 6 마리로 하여 평균체중이 180 ± 10 g이 되도록 난괴법(randomized block design)에 의하여 5군 (대조군, TNBS 단독 투여군, TNBS + 5-ASA 100 ㎎/㎏ 투여군, TNBS + 인데논화합물 2종 10 ㎎/㎏ 투여군)으로 나누어 실험하였다.

24 시간 절식한 랫드를 디에틸 에테르(diethyl ether)로 마취하고, 폴리에틸렌 카테터(polyethylene catheter)를 연결한 1㎖ 주사기를 이용하여 항문을 통하여 대장의 관강내에 50% (v/v) 에탄올로 희석한 3% TNBS 0.8 ㎖을 천천히 주입한 후, 항문으로 3% TNBS가 새어 나오는 것을 방지하기 위하여 랫드를 거꾸로 세운 상태에서 60 초 동안 정치시켰다. 대조군은 vehicle (50% (v/v) ethanol)만을 다른 실험군과 마찬가지 방법으로 주입하였다.

약물의 효과를 조사하기 위하여 절식 24 시간 후에 TNBS 처치 후 다음날부터 5 일 동안 약물을 10 ㎎/㎏을 경구투여로 매일 일정한 시간에 일회 투여하였다. 비교 시험물질은 염증성장질환(IBD) 치료제로 가장 잘 알려진 설파살라진(sulfasalazine)의 활성 대사체인 5-ASA를 양성 대조군으로 사용하였다.

모든 랫드들은 TNBS 투여 후 7일째 희생되었다. 육안으로 보이는 궤양과 대장염의 심각성은 실험에 참가하지 않은 두 명의 조사자에 의해 평가하였다. 랫드의 대장을 적출하여 항문으로부터 5 ~ 6 ㎝ 사이의 조직을 1 ㎝ 길이로 잘라서 조직의 장 무게 및 MPO 활성을 측정하고 조직검사를 실시하는데 사용하였다. 또한, 모든 실험동물은 Digital mass meter를 이용하여 절식단계부터 TNBS 투여 및 약물 투여과정 동안 각 랫드의 체중 변화를 관찰하였으며, 동물실험은 실험동물의 관리와 사용을 위해 영남대학교 실험동물센타에 제도화된 지침에 따라 수행되었다.

체중 180 ~ 190 g인 랫드에 3% TNBS를 이용하여 장내에 염증을 유발한 대장염 모델에서 TNBS 처리 전의 몸무게를 기준으로 5 일 간 매일 일정시간에 몸무게의 변화를 관찰한 결과, 도면 3에서 보는 바와 같이 vehicle 처리 대조군은 계속해서 몸무게가 증가함을 보이고 TNBS 군은 계속하여 몸무게가 감소하며 5 일째부터 몸무게가 약간 회복되었으나, 정상군과 비교했을 때 몸무게가 현저히 감소되었다.

양성대조군 5-ASA 100 ㎎/㎏을 처리한 군은 4 일째부터 몸무게가 서서히 회복되어 TNBS 단독 투여군에 비해 몸무게가 증가하였다. TNBS 처리 후 본 발명의 신규 화합물을 1 ㎎/㎏의 용량으로 복강 투여한 경우는 3 일째까지 몸무게 감소현상이 나타났으며, 4 일째부터 서서히 회복되어 TNBS 단독 처리군에 비하여 몸무게가 증가하였다.

본 발명의 신규 화합물은 양성 대조군인 5-ASA 보다 몸무게 회복이 더 크게 나타남을 알 수 있었다(도 4a 및 4b 참조).

또한, 본 발명자들은 5일간의 약물투여가 끝난 후에 대장을 적출하여 육안으로 살펴 본 결과, TNBS를 처리한 랫드의 대장은 대조군에 비하여 부종과 충혈이 관찰되었으며, 충수돌기의 부종과 울혈 및 유착현상이 나타남을 알 수 있었다. 양성대조군 5-ASA를 100 ㎎/㎏의 양으로 투여한 군에서는 TNBS 단독 투여군과 비교하여 육안적 증상과 다른 기관들 사이의 유착이나 대장의 충혈도 현저히 억제됨을 알 수 있었다. 그러나, 본 발명의 신규 화합물을 10 ㎎/㎏의 양으로 처리한 군에서 부종과 충혈의 억제 효과는 상기 양성 대조군인 5-ASA보다 크게 나타나 본 발명의 신규 화합물들은 염증성 장질환을 효과적으로 억제함을 알 수 있었다(도 3a 및 3b 참조).

나아가, 랫드의 대장을 적출하여 조직 무게를 측정한 결과, vehicle 처리 대조군에 비해 TNBS 단독 처리군의 경우 부종이 있는 장의 무게가 유의적으로 증가하였다. 양성 대조군인 5-ASA를 100 ㎎/㎏의 양으로 처리한 군에서는 장의 무게가 TNBS 처리군에 비해 유의적으로 감소하였고 본 발명의 신규한 화합물을 처리한 군도 양성대준과 비슷하게 대조군보다 장의 무게가 감소하였음을 알 수 있었다(도 5a 및 5b 참조).

따라서, 상기의 결과로 본 발명의 방법으로 제조된 신규한 화합물은 염증성장질환의 치료에 효과적임을 알 수 있었다.

이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

Claims

하기 화학식 (1)의 구조를 갖는 신규한 인데노 피리디니움 유도체 화합물, 또는 이의 약리학적으로 허용 가능한 염:
[화학식 1]

상기 화학식 1에서, R1 및 R2는 독립적으로 수소, 에톡시, 또는 이소프로필옥시이고, 여기서 상기 R1 및 R2는 동시에 수소는 아니다.
제1항에 있어서,
상기 화합물은 하기 화학식 (2)의 구조를 갖는 4-((6-에톡시-1-옥소-1에이치-인덴-2(3에이치)-일리덴)메틸)피리딘-1-이움 클로라이드(6e) 화합물인 것을 특징으로 하는 화합물;
[화학식 2]

.
제1항에 있어서,
상기 화합물은 하기 화학식 (3)의 구조를 갖는 4-((6-이소프로폭시-1-옥소-1에이치-인덴-2(3에이치)-일리덴)메틸)피리딘-1-이움 클로라이드(6f) 화합물인 것을 특징으로 하는 화합물;
[화학식 3]

.
제1항에 있어서,
상기 화합물은 하기 화학식 (4)의 구조를 갖는 4-((4-에톡시-1-옥소-1에이치-인덴-2(3에이치)-일리덴)메틸)피리딘-1-이움 클로라이드(6h) 화합물인 것을 특징으로 하는 화합물;
[화학식 4]

.
제1항에 있어서,
상기 화합물은 하기 화학식 (5)의 구조를 갖는 4-((4-이소프로포시-1-옥소-1에이치-인덴-2(3에이치)-일리덴)메틸)피리딘-1-이움 클로라이드(6i) 화합물인 것을 특징으로 하는 화합물;
[화학식 5]

.