WO2015114900A1 - 虚血性疾患を予防するための薬剤 - Google Patents

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retinal
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卓 石橋
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Definitions

  • the present invention relates to a retinal disorder preventive agent containing, for example, a carotenoid.
  • Atherosclerosis in which arteries thicken and harden has increased.
  • Atherosclerosis is considered to be caused by risk factors such as hyperlipidemia, diabetes, hypertension, and smoking, and a ridge-like bulge is generated inside the artery, resulting in occlusion and stenosis of the blood vessel.
  • risk factors such as hyperlipidemia, diabetes, hypertension, and smoking
  • a ridge-like bulge is generated inside the artery, resulting in occlusion and stenosis of the blood vessel.
  • If transport of oxygen and nutrients stops due to occlusion of blood vessels, stroke, cerebral thrombosis, subarachnoid hemorrhage, myocardial infarction, transient cataract, etc. develop.
  • blood supply is delayed due to stenosis or temporary occlusion of blood vessels, cerebral ischemia, angina pectoris, ocular ischemia, etc. develop.
  • carotenoids including astaxanthin are widely distributed in animals, plants and microorganisms and have various actions.
  • carotenoids such as astaxanthin have a protective effect against ocular ischemia such as ischemic retinopathy.
  • an object of the present invention is to provide a preventive agent for retinal disorders such as ischemic retinal disorders.
  • a carotenoid mixture containing astaxanthin as a main component has a retinal protective action, and the present invention has been completed.
  • the present invention includes the following. (1) A preventive agent for retinal disorders comprising a carotenoid mixture containing astaxanthin as a main component as an active ingredient. (2) The retinal disorder preventive agent according to (1), wherein the retinal disorder is ischemic retinal disorder.
  • a carotenoid mixture containing astaxanthin as a main component is 30% by mass to 70% by mass astaxanthin, 4% by mass to 22% by mass adonilbin, and 7% by mass to 13% by mass based on the total mass of the mixture.
  • FIG. 1 shows the test protocol of Examples 1 and 2.
  • FIG. 2 shows measurement results of electroretinogram (ERG) of an ocular ischemia model mouse fed with a carotenoid mixture containing astaxanthin as a main component.
  • FIG. 3 shows the histological evaluation results of the retina of an eye ischemia model mouse fed with a carotenoid mixture containing astaxanthin as a main component.
  • FIG. 4 shows the test protocol of Examples 3 and 4.
  • FIG. 5 is a graph showing the cytoprotective effect of a carotenoid mixture containing astaxanthin as a main component under OGD stress.
  • FIG. 6 is a graph showing the active oxygen (ROS) production inhibitory effect of a carotenoid mixture containing astaxanthin as a main component under OGD stress.
  • ROS active oxygen
  • the preventive agent for retinal disorders according to the present invention contains a carotenoid mixture containing astaxanthin as a main component as an active ingredient.
  • the retinal disorder preventive agent according to the present invention can also be called a retinal protective agent.
  • a carotenoid mixture containing astaxanthin as a main component is used as an active ingredient.
  • a carotenoid mixture containing astaxanthin as a main component means a carotenoid mixture containing astaxanthin, adonilbin, adonixanthin, canthaxanthin, echinenone, asteroidenone, 3-hydroxyechinenone and ⁇ -carotene, and the like. It means a mixture with a high proportion of astaxanthin compared to the carotenoids.
  • the carotenoid mixture containing astaxanthin as a main component may be a commercially available product, or produced by a conventional chemical synthesis method, a fermentation method using microorganisms, or an extraction and purification method from animals or plants (natural origin). Can be used.
  • carotenoid mixture containing astaxanthin as a main component a mixture produced by extraction and purification from a microorganism belonging to the genus Paracoccus (such as Paracoccus carotinifaciens) can be used.
  • a mixture produced by extraction and purification from a microorganism belonging to the genus Paracoccus such as Paracoccus carotinifaciens
  • carotenoid eluate is extracted from a dried product of microorganisms belonging to the genus Paracoccus with ethanol at 90 to 100 ° C. for 15 minutes or more. Is made.
  • the cell residue is removed from the carotenoid eluate by hot filtration (60 to 70 ° C.).
  • the filtrate (extract) is cooled to 30 ° C., the degree of vacuum is adjusted so that the can temperature is 30 ° C., and the filtrate is concentrated to 1/5. After concentration, the mixture is heated at 60 ° C. for 2 to 4 hours to re-isomerize the cis-form astaxanthin into the trans isomer, and then ripen at 30 ° C. After aging, a carotenoid mixture containing astaxanthin as a main component is recovered by filtration. The carotenoid mixture containing astaxanthin as a main component is dried by heating at 100 ° C. under vacuum.
  • the carotenoid mixture extracted from microorganisms belonging to the genus Paracoccus contains, for example, each carotenoid at the composition ratio shown in Table 1 below.
  • the carotenoid mixture containing astaxanthin as a main component obtained by the production method of the present embodiment is preferably 30% by mass or more, more preferably 35% by mass or more, most preferably as a lower limit value based on the mass of the total carotenoid mixture.
  • adnirubin is preferably 4% by mass or more, more preferably 4% by mass or more as a lower limit based on the mass of the total carotenoid mixture.
  • the retinopathy preventive agent according to the present invention can be produced.
  • the preventive agent for retinal disorders according to the present invention includes pharmaceutically acceptable carriers (excipients, diluents, etc.), binders, extenders, lubricants, disintegrants in addition to carotenoid mixtures mainly composed of astaxanthin. , Wetting agents, emulsifying agents, buffering agents, suspending agents, preservatives, coloring agents, flavoring agents, sweetening agents and the like may be added as appropriate. Carriers and additives that are generally used for formulation can be used for the preparation of the preventive agent for retinal disorders according to the present invention.
  • the binder include starch, polyvinyl pyrrolidone, hydroxypropyl methylcellulose and the like.
  • Examples of the bulking agent include lactose and microcrystalline cellulose.
  • examples of lubricants include talc, silica, magnesium stearate and the like.
  • examples of the disintegrant include starch and sodium starch glycolate.
  • examples of the wetting agent include sodium lauryl sulfate.
  • examples of emulsifiers include cellulose derivatives and sorbitol.
  • preservatives include methyl-p-hydroxybenzoate and sorbic acid.
  • the additives that can be used in the present invention are not limited to the examples of these additives.
  • the agent for preventing retinal dysfunction is a pharmaceutical product such as oral administration or parenteral administration (intravenous, intraarterial, intraperitoneal, intrarectal, subcutaneous, intramuscular, sublingual, intranasal, intravaginal, etc. ) Can be formulated.
  • parenteral administration intravenous, intraarterial, intraperitoneal, intrarectal, subcutaneous, intramuscular, sublingual, intranasal, intravaginal, etc.
  • parenteral administration intravenous, intraarterial, intraperitoneal, intrarectal, subcutaneous, intramuscular, sublingual, intranasal, intravaginal, etc.
  • parenteral administration intravenous, intraarterial, intraperitoneal, intrarectal, subcutaneous, intramuscular, sublingual, intranasal, intravaginal, etc.
  • a solution agent for example, a solution agent, a tablet, a powder agent, a granule, a capsule, a suppository,
  • the dose of the carotenoid mixture mainly composed of astaxanthin contained in the preventive agent for retinopathy according to the present invention varies depending on factors such as the age, weight, sex, and condition of the patient.
  • the daily dose of the retinopathy preventive agent according to the present invention is 0.01 to 400 mg / kg body weight, preferably 0.1 to 40 mg / kg body weight in terms of a carotenoid mixture mainly composed of astaxanthin. It is not limited to this range. If necessary, the dose may be divided and administered in several times, for example, 2 to 3 times.
  • the retinopathy preventive agent which concerns on this invention can also be administered to a patient in combination with another retinopathy preventive agent.
  • the retinal disorder preventive agent according to the present invention in order to improve diseases such as diabetic retinopathy, glaucoma, ocular hypertension and ocular ischemia and related diseases by the retinal disorder preventing effect of the retinal disorder preventive agent according to the present invention, the retinal disorder preventive agent according to the present invention. Can also be used.
  • an effective amount of the agent for preventing retinal disorders according to the present invention is added or enclosed in any form such as tablets, capsules, granules, drinks, PET bottles, etc., or in any food or beverage substantially free of carotenoids.
  • the retinal disorder preventive agent according to the present invention can be made into a functional food, a health food or a food or drink.
  • Functional foods, health foods and foods and drinks include, but are not limited to, confectionery, retort foods, juices, teas, dairy products, and the like.
  • preservative, etc. can be added to a functional food, a health food, and food-drinks as needed.
  • the retinopathy preventive agent which concerns on this invention can also be used as a food additive.
  • the pharmacological evaluation of the retinal disorder preventive agent according to the present invention can be performed in vivo using, for example, an ocular ischemia model mouse described in the Examples below.
  • the mouse is subjected to ocular ischemia treatment.
  • the retinal disorder preventive agent according to the present invention has a retinal disorder preventive action (retinal protective action).
  • the retinal ganglion cell line (RGC-5 cells) described in the Examples below can be used for in vitro pharmacological evaluation of the retinopathy preventive agent according to the present invention.
  • the retinal ganglion cell line is cultured in the presence of the preventive agent for retinal disorders according to the present invention and under OGD stress (a state in which supply of oxygen and glucose is restricted).
  • OGD stress induces cell death and production of reactive oxygen (ROS).
  • ROS reactive oxygen
  • the present invention It can be determined that such a retinal disorder preventive agent has a retinal disorder preventive action (retinal protective action).
  • the present invention includes administration of a carotenoid mixture containing astaxanthin as a main component to a patient or a subject (human) (for example, retinal disorder (for example, It also relates to a method for preventing (ischemic retinal damage) or a method for improving a disease selected from the group consisting of diabetic retinopathy, glaucoma, ocular hypertension and ocular ischemia.
  • a carotenoid mixture containing astaxanthin as a main component to a patient or a subject (human)
  • retinal disorder for example, It also relates to a method for preventing (ischemic retinal damage) or a method for improving a disease selected from the group consisting of diabetic retinopathy, glaucoma, ocular hypertension and ocular ischemia.
  • carotenoid mixture containing astaxanthin as a main component According to the method described in JP-A-2009-50237, it was extracted from a dried product of microorganisms belonging to the genus Paracoccus with ethanol at 90 ° C. for 20 minutes. Thus, a carotenoid eluate was prepared. The cell residue was removed from the carotenoid eluate by filtration at 65 ° C. while hot. The filtrate (extract) was cooled to 30 ° C., the degree of vacuum was adjusted so that the can temperature was 30 ° C., and the filtrate was concentrated to 1/5. After concentration, the mixture was heated at 60 ° C.
  • an eye ischemia model mouse was prepared by ligating the wing palatal artery (PPA) and the external carotid artery (ECA).
  • PPA wing palatal artery
  • ECA external carotid artery
  • Feeding was orally administered 12 times in total, 1 hour before PPA / ECA ligation, immediately after reperfusion, 6 hours, 12 hours, and the next day to 4 days. Dark adaptation was performed 4 days after ischemia-reperfusion, and OGISHIMA H. et al. , Ligation of the Pterogopalatine and External Carrotid Arts Industries Ischemic Damage in the Murine Retina, Investigative Ophthalmology & Viscal. 52, no. 13, pp. According to the method described in 9710-9720, electroretinogram (ERG) measurement and paraffin sections of the eyeball were prepared after 5 days, and histological evaluation was performed by hematoxylin and eosin staining.
  • ERP electroretinogram
  • a solvent olive oil
  • the test group was composed of 10 groups each, ie, a non-ligating group, a healthy food aster administration + ischemic reperfusion group, and a solvent + ischemic reperfusion group.
  • An electroretinogram is an electric potential obtained by collecting the electrical activity of the sensory retina and retinal pigment epithelium caused by light stimulation from a wide range of the fundus.
  • the a-wave (a-WAVE) is a corneal negative potential fluctuation that occurs at a latency of 1.5 msec after flash stimulation to the eyeball, and is considered to be a potential originating from the retinal surface layer (photocell layer).
  • a-wave abnormalities are ocular artery occlusion, retinal detachment, and the like.
  • b-wave is a large corneal positive potential fluctuation that occurs after a-wave, and is considered to be a potential originating from Mueller tissue (intermediate layer to inner layer) of the retina.
  • b-WAVE b-WAVE
  • the ocular ischemia model mouse fed with the healthy food aster showed the same a wave and b wave as the non-ligated group (control), and the solvent ( The a-wave and b-wave potentials were significantly reduced compared to the ocular ischemia model mice fed only with olive oil), indicating that the healthy food aster has a protective action on the retina. became. Therefore, it is presumed that edible asters prevent the onset of cerebral ischemia, angina pectoris, eye ischemia and the like.
  • the retina of an ocular ischemia model mouse fed with an edible aster showed a normal structure as in a non-ligated mouse, but only the solvent was fed. Structural disorder was observed in the retina of a model mouse with eye ischemia.
  • the group fed with the edible aster had significantly more cells than the group fed with the solvent alone, It was equivalent to the number of cells.
  • the group fed with the edible aster was significantly thicker than the group fed with only the solvent, and was not ligated. It was equivalent to the cell thickness of the group. From the above results, it was revealed that the healthy food aster has a protective action on the retina. Therefore, since the healthy food aster prevents the damage of the cells whose blood flow is stagnant, it is presumed that the occurrence of cerebral ischemia, angina pectoris, ocular ischemia and the like is prevented.
  • the materials and methods in Examples 3 and 4 are as follows.
  • the RGC-5 cell line is a cell line derived from rat retinal ganglion cells, and is used for in vitro tests for evaluating cell damage.
  • the RGC-5 cell line is NAKAJIMA Y. et al. , Zeaxanthin, a Retinal Carotenoid, Protects Retinal Cells against Oxidative Stress, Current Eye Research, 2009, Vol. 34, pp. It can culture according to the method as described in 311-318.
  • OGD stress is a state where supply of oxygen and glucose is restricted.
  • ROS reactive oxygen species
  • Cytoprotective effect under OGD stress In nuclear staining, only dead cells are stained (PI positive cells). As shown in FIG. 5, RGC-5 cells added with edible asters had significantly fewer dead cells than RGC-5 cells added with a solvent (DMSO), and edible asters were added at 10 ⁇ M. In some cases, it had a cytoprotective effect comparable to that of Edaravone, a pharmaceutical product. In addition, when no OGD stress was applied, cell death due to edible asters and Edaravone was not observed.
  • ROS Reactive Oxygen
  • ROS Reactive oxygen
  • unsaturated fatty acids are oxidatively denatured by ROS (hydroxy radicals and singlet oxygen), causing damage to vascular endothelial cells and causing arteriosclerosis, resulting in a constitution that facilitates the formation of stenosis and blood clots. Therefore, arteriosclerosis can be prevented if the occurrence of ROS can be suppressed.
  • the state in which the blood flow was stagnated was reproduced by OGD stress, and the ROS production inhibitory effect of the healthy food aster was examined. As shown in FIG.
  • RGC-5 cells supplemented with healthy food asters produced significantly less ROS than RGC-5 cells supplemented with solvent (DMSO), compared to Edaravone, a pharmaceutical product.
  • the generation of ROS was suppressed at a low concentration.
  • OGD stress was not added, the ROS production
  • a preventive agent for retinal disorders useful for eye health is provided. All publications, patents and patent applications cited herein are incorporated herein by reference in their entirety.

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Abstract

本発明は、虚血性網膜障害等の網膜障害の予防剤を提供することを目的とし、具体的には、アスタキサンチンを主成分とするカロテノイド混合物を有効成分として含有する網膜障害予防剤に関する。

Description

虚血性疾患を予防するための薬剤
　本発明は、例えばカロテノイドを含有する網膜障害予防剤に関する。
　近年、生活習慣病の増加に伴い、動脈が肥厚して硬化したアテローム性動脈硬化症が増えている。アテローム性動脈硬化症は、高脂血症、糖尿病、高血圧、喫煙等の危険因子により生じると考えられ、動脈内部に粥状の隆起が発生して血管の閉塞や狭窄が起こる。血管の閉塞により酸素や栄養成分の輸送が止まれば、脳卒中、脳血栓、クモ膜下出血、心筋梗塞、一過性黒内障等を発症する。また、血管の狭窄や一時的な閉塞により、血液供給が滞れば、脳虚血症、狭心症、眼虚血症等を発症する。
　従って、従来において、動脈硬化に起因した各種疾患を予防することが望まれている。
　ところで、アスタキサンチンをはじめとするカロテノイドは、動物、植物、微生物に広く分布し、様々な作用を有することが知られている。
　しかしながら、アスタキサンチン等のカロテノイドが虚血性網膜障害等の眼虚血症に対して保護効果を有することは知られていなかった。
　上述した実情に鑑み、本発明は、虚血性網膜障害等の網膜障害の予防剤を提供することを目的とする。
　上記課題を解決するため鋭意研究を行った結果、アスタキサンチンを主成分とするカロテノイド混合物が網膜保護作用を有することを見出し、本発明を完成するに至った。
　本発明は、以下を包含する。
　（１）アスタキサンチンを主成分とするカロテノイド混合物を有効成分として含有する網膜障害予防剤。
　（２）網膜障害が虚血性網膜障害である、（１）記載の網膜障害予防剤。
　（３）アスタキサンチンを主成分とするカロテノイド混合物がパラコッカス属（Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ）に属する微生物に由来するものである、（１）又は（２）記載の網膜障害予防剤。
　（４）アスタキサンチンを主成分とするカロテノイド混合物が、該混合物全体の質量を基準として、３０質量％~７０質量％のアスタキサンチン、４質量％~２２質量％のアドニルビン及び７質量％~１３質量％のアドニキサンチンを含む、（１）~（３）のいずれか１記載の網膜障害予防剤。
　（５）アスタキサンチンを主成分とするカロテノイド混合物の１日当たりの投与量が０．０１~４００ｍｇ／ｋｇ体重となるように投与される、（１）~（４）のいずれか１記載の網膜障害予防剤。
　（６）糖尿病性網膜症、緑内障、眼高血圧及び眼虚血から成る群より選択される疾患を改善するための、（１）~（５）のいずれか１記載の網膜障害予防剤。
　（７）（１）~（６）のいずれか１記載の網膜障害予防剤を含有する、医薬品、機能性食品、健康食品又は飲食品。
　本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願２０１４−１６１１８号の明細書および／または図面に記載される内容を包含する。
　図１は、実施例１及び２の試験プロトコールを示す。
　図２は、アスタキサンチンを主成分とするカロテノイド混合物を摂餌させた眼虚血症モデルマウスの網膜電図（ＥＲＧ）の測定結果を示す。
　図３は、アスタキサンチンを主成分とするカロテノイド混合物を摂餌させた眼虚血症モデルマウスの網膜の組織学的評価結果を示す。
　図４は、実施例３及び４の試験プロトコールを示す。
　図５は、ＯＧＤストレス下におけるアスタキサンチンを主成分とするカロテノイド混合物の細胞保護効果を示すグラフである。
　図６は、ＯＧＤストレス下におけるアスタキサンチンを主成分とするカロテノイド混合物の活性酸素（ＲＯＳ）生成抑制効果を示すグラフである。
　以下、本発明を詳細に説明する。
　本発明に係る網膜障害予防剤は、アスタキサンチンを主成分とするカロテノイド混合物を有効成分として含有するものである。本発明に係る網膜障害予防剤をヒトに投与することで、副作用なく網膜障害（特に、虚血性網膜障害）から網膜を予防し、且つ保護することができる。従って、本発明に係る網膜障害予防剤は、網膜保護剤ということもできる。
　本発明においては、有効成分としてアスタキサンチンを主成分とするカロテノイド混合物を用いる。ここで、「アスタキサンチンを主成分とするカロテノイド混合物」とは、アスタキサンチン、アドニルビン、アドニキサンチン、カンタキサンチン、エキネノン、アステロイデノン、３−ハイドロキシエキネノン及びβ−カロテンを含むカロテノイド混合物において、他のカロテノイドと比べてアスタキサンチンの割合が高い混合物を意味する。
　アスタキサンチンを主成分とするカロテノイド混合物は、市販品であってもよく、あるいは従来の化学合成法、微生物による発酵法又は動物や植物等からの抽出及び精製方法等により製造されたもの（天然由来）を使用することができる。例えば、アスタキサンチンを主成分とするカロテノイド混合物として、パラコッカス属（Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ）に属する微生物（パラコッカス・カロティニファシエンス（Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ　ｃａｒｏｔｉｎｉｆａｃｉｅｎｓ）等）から抽出及び精製により製造したものを使用することができる。
　具体的には、特開２００９−５０２３７号公報に記載の方法に準じて、パラコッカス属（Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ）に属する微生物の乾燥物から、９０~１００℃のエタノールで１５分以上抽出して、カロテノイド溶出液を作製する。カロテノイド溶出液から熱時濾過（６０~７０℃）により、菌体残渣を除去する。濾液（抽出液）を、３０℃に冷却し、缶温が３０℃になるよう減圧度を調整し、液量１／５まで濃縮する。濃縮後、６０℃で２~４時間加温して、シス体のアスタキサンチンをトランス体に再異性化後、さらに３０℃で熟成する。熟成後、濾過によりアスタキサンチンを主成分とするカロテノイド混合物を回収する。アスタキサンチンを主成分とするカロテノイド混合物は、真空下１００℃で加熱乾燥する。このように、パラコッカス属に属する微生物（パラコッカス・カロティニファシエンス等）から抽出したカロテノイド混合物は、例えば、以下の表１に示す組成比で各カロテノイドを含む。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
 　本実施形態の製造方法によって得られるアスタキサンチンを主成分とするカロテノイド混合物は、アスタキサンチンを、全カロテノイド混合物の質量を基準として、下限値として好ましくは３０質量％以上、より好ましくは３５質量％以上、最も好ましくは４０質量％以上、上限値として好ましくは７０質量％以下、より好ましくは６５質量％以下含み、アドニルビンを、全カロテノイド混合物の質量を基準として、下限値として好ましくは４質量％以上、より好ましくは８質量％以上、最も好ましくは１６質量％以上、上限値として好ましくは２２質量％以下、より好ましくは２０質量％以下含み、アドニキサンチンを、全カロテノイド混合物の質量を基準として、下限値として好ましくは７質量％以上、より好ましくは８質量％以上、最も好ましくは９質量％以上、上限値として好ましくは１３質量％以下、より好ましくは１２質量％以下含む。
　以上に説明したアスタキサンチンを主成分とするカロテノイド混合物を有効成分として用いることで、本発明に係る網膜障害予防剤を製造することができる。
　本発明に係る網膜障害予防剤には、アスタキサンチンを主成分とするカロテノイド混合物以外に、製薬上許容可能な担体（賦形剤、希釈剤等）並びに結合剤、増量剤、滑沢剤、崩壊剤、湿潤剤、乳化剤、緩衝剤、懸濁化剤、保存剤、着色剤、風味剤及び甘味剤等から適宜選択される添加剤を含有させることができる。担体及び添加剤は、製剤化のために一般的に使用されるものを、本発明に係る網膜障害予防剤の製造に使用することができる。例えば、結合剤の例としては、デンプン、ポリビニルピロリドン、ヒドロキシプロピルメチルセルロース等が挙げられる。増量剤の例としては、ラクトース、微結晶セルロース等が挙げられる。滑沢剤の例としては、タルク、シリカ、ステアリン酸マグネシウム等が挙げられる。崩壊剤の例としては、デンプン、デンプングリコール酸ナトリウム等が挙げられる。湿潤剤の例としては、ラウリル硫酸ナトリウム等が挙げられる。乳化剤の例としては、セルロース誘導体、ソルビトール等が挙げられる。また、保存剤の例としては、メチル−ｐ−ヒドロキシベンゾエート、ソルビン酸等が挙げられる。ただし、本発明に使用できる添加剤は、これら添加剤の例に限定されない。
　本発明に係る網膜障害予防剤は、医薬品として、例えば経口投与又は非経口投与（静脈内、動脈内、腹腔内、経直腸内、皮下、筋肉内、舌下、経鼻腔内、経膣内等）用に製剤化することができる。製剤の形態としては、特に限定されないが、例えば溶液剤、錠剤、粉末剤、顆粒剤、カプセル剤、座剤、噴霧剤、制御放出剤、懸濁剤、ドリンク剤等が挙げられる。
　本発明に係る網膜障害予防剤に含まれるアスタキサンチンを主成分とするカロテノイド混合物の用量は、患者の年齢、体重、性別、状態等の要因によって変化する。例えば、本発明に係る網膜障害予防剤の１日当たりの投与量は、アスタキサンチンを主成分とするカロテノイド混合物換算で０．０１~４００ｍｇ／ｋｇ体重、好ましくは０．１~４０ｍｇ／ｋｇ体重であるが、この範囲に限定されない。必要に応じて、用量を数回、例えば２~３回に分けて分割投与してもよい。また、本発明に係る網膜障害予防剤を他の網膜障害予防剤と併用して患者に投与することもできる。
　さらに、本発明に係る網膜障害予防剤の網膜障害予防効果により、糖尿病性網膜症、緑内障、眼高血圧及び眼虚血並びに関連疾病等の疾患を改善するために、本発明に係る網膜障害予防剤を使用することもできる。
　また、本発明に係る網膜障害予防剤の有効量を、錠剤、カプセル、顆粒、ドリンク、ペットボトル等の任意の形態に添加又は封入するか、あるいは実質的にカロテノイドを含まない任意の飲食品に添加することで、本発明に係る網膜障害予防剤を機能性食品、健康食品又は飲食品とすることができる。機能性食品、健康食品及び飲食品には、例えば、菓子類、レトルト食品、ジュース類、お茶類、乳製品等が含まれるが、これらに限定されない。また、機能性食品、健康食品及び飲食品には、必要に応じて甘味剤、調味料、乳化剤、懸濁化剤、防腐剤等を添加することができる。さらに、本発明に係る網膜障害予防剤を食品添加物として使用することもできる。
　本発明に係る網膜障害予防剤の薬理評価は、例えば、下記の実施例に記載の眼虚血症モデルマウスを使用して、ｉｎ　ｖｉｖｏで行うことができる。例えば、本発明に係る網膜障害予防剤を投与した後、マウスを眼虚血処置に供する。網膜電図や網膜の組織学的評価において、本発明に係る網膜障害予防剤を投与していない眼虚血症モデルマウスと比較して、網膜が正常なマウスの網膜の状態と同様である場合に、本発明に係る網膜障害予防剤は、網膜障害予防作用（網膜保護作用）を有すると判断することができる。
　あるいは、下記の実施例に記載の網膜神経節細胞株（ＲＧＣ−５細胞）を使用して、ｉｎ　ｖｉｔｒｏで本発明に係る網膜障害予防剤の薬理評価を行うことができる。例えば、本発明に係る網膜障害予防剤存在下で、且つＯＧＤストレス（酸素とグルコースの供給を制限した状態）下で、網膜神経節細胞株を培養する。ＯＧＤストレスによれば、細胞死及び活性酸素（ＲＯＳ）の生成が誘導される。本発明に係る網膜障害予防剤非存在下でＯＧＤストレスに供された網膜神経節細胞株と比較して、細胞死又は活性酸素（ＲＯＳ）の生成が有意に抑制された場合に、本発明に係る網膜障害予防剤は、網膜障害予防作用（網膜保護作用）を有すると判断することができる。
　一方、上述の本発明に係る網膜障害予防剤の記載に準じて、本発明は、アスタキサンチンを主成分とするカロテノイド混合物を患者又は被験体（ヒト）に投与することを含む、網膜障害（例えば、虚血性網膜障害）の予防方法、又は糖尿病性網膜症、緑内障、眼高血圧及び眼虚血から成る群より選択される疾患の改善方法にも関する。
　以下、実施例を用いて本発明をより詳細に説明するが、本発明の技術的範囲はこれら実施例に限定されるものではない。
　実施例１及び２における材料及び方法は、以下の通りである。
（１）アスタキサンチンを主成分とするカロテノイド混合物の作製
　特開２００９−５０２３７号公報に記載の方法に準じて、パラコッカス属（Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ）に属する微生物の乾燥物から、９０℃のエタノールで２０分抽出して、カロテノイド溶出液を作製した。カロテノイド溶出液から６５℃熱時濾過により、菌体残渣を除去した。濾液（抽出液）を、３０℃に冷却し、缶温が３０℃になるよう減圧度を調整し、液量１／５まで濃縮した。濃縮後、６０℃で３時間加温して、シス体のアスタキサンチンをトランス体に再異性化後、さらに３０℃で１２時間熟成した。熟成後、濾過によりアスタキサンチンを主成分とするカロテノイド混合物を回収した。アスタキサンチンを主成分とするカロテノイド混合物は、真空下１００℃で加熱乾燥させた。得られたアスタキサンチンを主成分とするカロテノイド混合物の組成を以下の表２に示す。また、以下では、得られたアスタキサンチンを主成分とするカロテノイド混合物を、「健食用アスタ」と称する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000003
（２）眼虚血症モデルマウスの作製
　ＯＧＩＳＨＩＭＡ　Ｈ．ｅｔ　ａｌ．，Ｌｉｇａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｐｔｅｒｙｇｏｐａｌａｔｉｎｅ　ａｎｄ　Ｅｘｔｅｒｎａｌ　Ｃａｒｏｔｉｄ　Ａｒｔｅｒｉｅｓ　Ｉｎｄｕｃｅｓ　Ｉｓｃｈｅｍｉｃ　Ｄａｍａｇｅ　ｉｎ　ｔｈｅ　Ｍｕｒｉｎｅ　Ｒｅｔｉｎａ，Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｖｅ　Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ　＆　Ｖｉｓｕａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅ，２０１１年，Ｖｏｌ．５２，Ｎｏ．１３，ｐｐ．９７１０−９７２０に記載の方法に準じて、翼口蓋動脈（ＰＰＡ）と外頸動脈（ＥＣＡ）を結紮することで、眼虚血症モデルマウスを作製した。
（３）試験方法
　図１に示すように、眼虚血症モデルマウスのＰＰＡ及びＥＣＡの結紮を行い、虚血５時間後に再灌流を行った。健食用アスタをオリーブ油に懸濁して１００ｍｇ／ｋｇ体重となるように眼虚血症モデルマウスへ摂餌した。摂餌は、ＰＰＡ／ＥＣＡ結紮の１時間前、再灌流の直後、６時間後、１２時間後、翌日から４日後まで１日２回の計１２回経口投与した。
　虚血再灌流の４日後から暗順応を行い、ＯＧＩＳＨＩＭＡ　Ｈ．ｅｔ　ａｌ．，Ｌｉｇａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｐｔｅｒｙｇｏｐａｌａｔｉｎｅ　ａｎｄ　Ｅｘｔｅｒｎａｌ　Ｃａｒｏｔｉｄ　Ａｒｔｅｒｉｅｓ　Ｉｎｄｕｃｅｓ　Ｉｓｃｈｅｍｉｃ　Ｄａｍａｇｅ　ｉｎ　ｔｈｅ　Ｍｕｒｉｎｅ　Ｒｅｔｉｎａ，Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｖｅ　Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ　＆　Ｖｉｓｕａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅ，２０１１年，Ｖｏｌ．５２，Ｎｏ．１３，ｐｐ．９７１０−９７２０に記載の方法に準じて、５日後に網膜電図（ＥＲＧ）の測定と眼球のパラフィン切片を作製してヘマトキシリン・エオジン染色による組織学的評価を行った。
　また、健食用アスタの非投与区として、溶媒（オリーブ油）を眼虚血症モデルマウスに摂餌した。試験区は各１０例として、非結紮群、健食用アスタ投与＋虚血再灌流群及び溶媒＋虚血再灌流群の３群構成とした。
網膜電図（ＥＲＧ）の測定
　網膜電図は、光刺激に伴って生じる感覚網膜及び網膜色素上皮の電気的活動を眼底の広い範囲から集めて得られる電位である。ａ波（ａ−ＷＡＶＥ）は、眼球へのフラッシュ刺激後に１．５ｍｓｅｃの潜時で生じる角膜側陰性の電位変動であり、網膜表層（視細胞層）起源の電位と考えられる。臨床的に、ａ波の異常は眼動脈閉塞、網膜剥離等である。一方、ｂ波（ｂ−ＷＡＶＥ）は、ａ波の次に生じる大きな角膜陽性の電位変動であり、網膜のミューラー組織（中間層から内層）起源の電位と考えられる。臨床的に、ｂ波の振幅が小さいことは網膜中心動脈の閉塞、先天網膜分離症、先天停在夜盲等が疑われる。
　本実施例では、図２に示すように、健食用アスタを摂餌させた眼虚血症モデルマウスが、非結紮群（コントロール）と同様のａ波及びｂ波を示したこと、及び溶媒（オリーブ油）だけを摂餌させた眼虚血症モデルマウスに比較して有意にａ波及びｂ波の電位が低下したことから、健食用アスタは網膜の保護作用を有していることが明らかとなった。従って、健食用アスタは、脳虚血症、狭心症、眼虚血症等の発症を予防することも推察される。
網膜の組織学的評価
　網膜電図測定後、眼球のパラフィン切片を作製してヘマトキシリン・エオジン染色により組織学的評価を行った。
　本実施例では、図３に示すように、健食用アスタを摂餌させた眼虚血症モデルマウスの網膜は非結紮のマウスと同様に正常な構造を示したが、溶媒だけを摂餌させた眼虚血症モデルマウスの網膜には構造の乱れが見られた。
　また、網膜の神経節細胞層（ＧＣＬ）の細胞数を比較したところ、健食用アスタを摂餌させた群は溶媒だけを摂餌させた群よりも有意に細胞数が多く、非結紮群の細胞数と同等であった。
　さらに、内網状層（ＩＰＬ）及び内顆粒層（ＩＮＬ）の厚みを比較したところ、健食用アスタを摂餌させた群は溶媒だけを摂餌させた群よりも有意に細胞が厚く、非結紮群の細胞の厚みと同等であった。
　以上の結果から、健食用アスタは網膜の保護作用を有していることが明らかとなった。従って、健食用アスタは、血流供給が滞った細胞の障害を防ぐことから、脳虚血症、狭心症、眼虚血症等の発症を予防することも推察される。
　実施例３及び４における材料及び方法は、以下の通りである。
（１）ＲＧＣ−５細胞株
　ＲＧＣ−５細胞株は、ラット網膜神経節細胞由来の細胞株であり、細胞障害を評価するｉｎ　ｖｉｔｒｏ試験に用いられる。ＲＧＣ−５細胞株は、ＮＡＫＡＪＩＭＡ　Ｙ．ｅｔ　ａｌ．，Ｚｅａｘａｎｔｈｉｎ，ａ　Ｒｅｔｉｎａｌ　Ｃａｒｏｔｅｎｏｉｄ，Ｐｒｏｔｅｃｔｓ　Ｒｅｔｉｎａｌ　Ｃｅｌｌｓ　ａｇａｉｎｓｔ　Ｏｘｉｄａｔｉｖｅ　Ｓｔｒｅｓｓ，Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｅｙｅ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２００９年，Ｖｏｌ．３４，ｐｐ．３１１−３１８に記載の方法に準じて培養することができる。
（２）試験方法
　図４に示すように、血流が滞った状態を再現するため、ＯＧＤストレス下でＲＧＣ−５細胞株を培養した。ここで、ＯＧＤストレスとは、酸素とグルコースの供給を制限した状態のことである。
　通常濃度の４．５倍に高めたグルコース（４．５％）及び通常濃度の１０倍に高めたオセアニア産ウシ胎児血清（ＦＢＳ：１０％）を含むＤＭＥＭ培地に１×１０３ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ濃度のＲＧＣ−５細胞を加えて、２４時間の培養を行った。
　次いで、ＦＢＳ無添加の通常培地で２回洗浄後、グルコースとＦＢＳを除いて、実施例１及び２に記載の健食用アスタ、溶媒（ＤＭＳＯ）、Ｅｄａｒａｖｏｎｅ（医薬品、フリーラジカルスカベンジャー）を別々に添加して、１時間の培養を行った。
　その後、通気条件をＡｉｒ　９５％＋ＣＯ２　５％からＮ２　９４％＋Ｏ２　１％＋ＣＯ２　５％の低酸素条件に変更して、さらに６時間の培養を行った。
　次いで、ＦＢＳ無添加の通常培地で２回洗浄後、高濃度グルコース（４．５％）及び通常濃度のＦＢＳ（１％）を含むＤＭＥＭ培地を用いて１８時間の培養を行い、核染色による死細胞率と活性酸素種（ＲＯＳ）の生成状況を測定した。核染色は、ＯＴＳＵＫＡ　Ｔ．ｅｔ　ａｌ．，Ｔｈｅ　Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ　Ｅｆｆｅｃｔｓ　ｏｆ　ａ　Ｄｉｅｔａｒｙ　Ｃａｒｏｔｅｎｏｉｄ，Ａｓｔａｘａｎｔｈｉｎ，Ａｇａｉｎｓｔ　Ｌｉｇｈｔ−Ｉｎｄｕｃｅｄ　Ｒｅｔｉｎａｌ　Ｄａｍａｇｅ，Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，２０１３年，Ｖｏｌ．１２３，Ｎｏ．３，ｐｐ．２０９−２１８に記載の方法に準じて行った。一方、活性酸素種（ＲＯＳ）の生成状況は、ＮＡＫＡＪＩＭＡ　Ｙ．ｅｔ　ａｌ．，Ｚｅａｘａｎｔｈｉｎ，ａ　Ｒｅｔｉｎａｌ　Ｃａｒｏｔｅｎｏｉｄ，Ｐｒｏｔｅｃｔｓ　Ｒｅｔｉｎａｌ　Ｃｅｌｌｓ　ａｇａｉｎｓｔ　Ｏｘｉｄａｔｉｖｅ　Ｓｔｒｅｓｓ，Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｅｙｅ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２００９年，Ｖｏｌ．３４，ｐｐ．３１１−３１８に記載の方法に準じて測定した。
ＯＧＤストレス下における細胞保護効果
　核染色は死細胞だけが染色（ＰＩ　ｐｏｓｉｔｉｖｅ　ｃｅｌｌｓ）される。
　図５に示すように、健食用アスタを添加したＲＧＣ−５細胞は、溶媒（ＤＭＳＯ）を添加したＲＧＣ−５細胞に比較して、有意に死細胞数が少なく、健食用アスタを１０μＭ添加した場合、医薬品であるＥｄａｒａｖｏｎｅと同程度の細胞保護作用があった。
　また、ＯＧＤストレスを加えない場合は、健食用アスタ及びＥｄａｒａｖｏｎｅによる細胞死は見られなかった。
ＯＧＤストレス下における活性酸素（ＲＯＳ）の生成抑制効果
　活性酸素（ＲＯＳ）とは、普通の酸素分子よりも活性化された状態の酸素分子とその関連物質を指す。
　ＲＯＳ（ヒドロキシラジカルや一重項酸素）により不飽和脂肪酸が酸化変性され、血管内皮細胞に障害を生じて動脈硬化を起こし、血管の狭窄や血栓を作りやすい体質になることが知られている。従って、ＲＯＳの発生を抑制できれば、動脈硬化等が予防できる。
　本実施例では、血流が滞った状態をＯＧＤストレスにより再現して、健食用アスタのＲＯＳ生成抑制効果を調べた。
　図６に示すように、健食用アスタを添加したＲＧＣ−５細胞は、溶媒（ＤＭＳＯ）を添加したＲＧＣ−５細胞に比較して、有意にＲＯＳの生成量が少なく、医薬品であるＥｄａｒａｖｏｎｅよりも低濃度でＲＯＳの発生を抑制した。
　また、ＯＧＤストレスを加えない場合は、健食用アスタのＲＯＳ生成抑制効果は見られなかった。
　本実施例から、健食用アスタはＯＧＤストレス下での網膜の保護作用を有していることが明らかとなった。
　健食用アスタは細胞に障害を与えるＲＯＳの発生を抑制することから、脳虚血症、狭心症、眼虚血症等の発症を予防することも推察される。
　本発明によれば、目の健康に有用な網膜障害予防剤が提供される。
　本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。

Claims (7)

  1. 　アスタキサンチンを主成分とするカロテノイド混合物を有効成分として含有する網膜障害予防剤。
  2. 　網膜障害が虚血性網膜障害である、請求項１記載の網膜障害予防剤。
  3. 　アスタキサンチンを主成分とするカロテノイド混合物がパラコッカス属（Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ）に属する微生物に由来するものである、請求項１又は２記載の網膜障害予防剤。
  4. 　アスタキサンチンを主成分とするカロテノイド混合物が、該混合物全体の質量を基準として、３０質量％~７０質量％のアスタキサンチン、４質量％~２２質量％のアドニルビン及び７質量％~１３質量％のアドニキサンチンを含む、請求項１~３のいずれか１項記載の網膜障害予防剤。
  5. 　アスタキサンチンを主成分とするカロテノイド混合物の１日当たりの投与量が０．０１~４００ｍｇ／ｋｇ体重となるように投与される、請求項１~４のいずれか１項記載の網膜障害予防剤。
  6. 　糖尿病性網膜症、緑内障、眼高血圧及び眼虚血から成る群より選択される疾患を改善するための、請求項１~５のいずれか１項記載の網膜障害予防剤。
  7. 　請求項１~６のいずれか１項記載の網膜障害予防剤を含有する、医薬品、機能性食品、健康食品又は飲食品。
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