WO2019172369A1 - 出血性血管障害の予防または抑制のための組成物 - Google Patents

出血性血管障害の予防または抑制のための組成物 Download PDF

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WO2019172369A1
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adonixanthin
disorder
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卓 石橋
雅浩 林
原　英彰
星菜 岩田
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    • A61P7/04—Antihaemorrhagics; Procoagulants; Haemostatic agents; Antifibrinolytic agents

Definitions

  • the present invention relates to a composition for the prevention or suppression of hemorrhagic vascular disorders, and more particularly comprises one or more carotenoids selected from adonilbin, adonixanthin, and pharmaceutically acceptable salts thereof.
  • the present invention relates to a composition for preventing or suppressing bleeding vascular disorders.
  • Hemorrhagic disorders due to vascular abnormalities are known, and there is a need for the development of preventive agents.
  • a hemorrhagic cerebrovascular disorder is known as one of the hemorrhagic vascular disorders. Hemorrhagic cerebrovascular disorders are caused by rupturing of blood vessels in the brain, and damage to brain tissue may occur. The above-mentioned hemorrhagic vascular disorder affects higher brain function, has a poor prognosis, and causes a decrease in patient's QOL (Ouality of Life). Also from this point, a prophylactic agent for hemorrhagic vascular disorders including hemorrhagic cerebrovascular disorders is required.
  • adonilbin and adonixanthin are types of carotenoids and are widely distributed in animals, plants and microorganisms. It is known that adonilvin or adonixanthin has an anxiolytic effect (Patent Document 1).
  • Patent Document 2 describes that a carotenoid mixture containing astaxanthin as a main component can be useful for preventing retinal disorders.
  • Patent Document 3 describes that astaxanthin suppresses or prevents LDL oxidation and prevents or suppresses arteriosclerosis, ischemic heart disease or ischemic brain injury.
  • Patent Document 4 describes that astaxanthin inhibits cyclooxygenase-2 activity.
  • Patent Document 5 describes that astaxanthin can be useful in various pharmaceutical applications and health foods including brain disorders.
  • Non-Patent Document 1 describes that astaxanthin can protect brain damage related to ischemia.
  • Patent Document 6 also describes that carotenoids such as lycopene can be useful for delivering cargo molecules such as whey protein to the bloodstream.
  • cargo molecules such as whey protein
  • the disease is recovered or alleviated depending on the nature of the cargo molecule, and that resveratrol or isoflavone can be useful for cardiovascular and cerebrovascular diseases as the cargo molecule.
  • JP 2012-025712 A JP2015-140346A JP-A-10-155559 JP 2006-008718 A JP2015-226550A Special table 2014-505068 gazette
  • adonilvin or adonixanthin can effectively prevent or suppress bleeding vascular disorders.
  • the present invention includes the following inventions.
  • a composition for preventing or suppressing hemorrhagic vascular disorders comprising one or more carotenoids selected from adonirubin, adonixanthin, and pharmaceutically acceptable salts thereof.
  • the hemorrhagic vascular disorder is at least one selected from the group consisting of hemorrhagic cerebrovascular disorder, hemorrhagic cystitis, hemorrhagic gastric ulcer, and hemorrhagic enteritis, [1] or [2] Composition.
  • composition according to [8], wherein the cranial nerve disorder is at least one selected from the group consisting of Alzheimer's disease, Parkinson's disease, Lewy microdementia, and Huntington's disease.
  • the composition according to any one of [1] to [10], wherein the composition is a food or drink or a food additive.
  • the composition according to any one of [1] to [11], wherein the composition is a functional food.
  • [14] comprising administering or ingesting to a subject in need thereof an effective amount of one or more carotenoids selected from adonilbin, adonixanthin, and pharmaceutically acceptable salts thereof, A method of preventing or suppressing a hemorrhagic vascular disorder in a subject.
  • the subject's hemorrhagic vascular disorder can be effectively prevented or suppressed.
  • the composition of the present invention can prevent or suppress at least one hemorrhagic vascular disorder selected from the group consisting of hemorrhagic cerebrovascular disorder, hemorrhagic cystitis, hemorrhagic gastric ulcer, and hemorrhagic enteritis. This is advantageous.
  • the composition of the present invention can be advantageously used in the prevention or suppression of neurological disorders, preferably cranial nerve disorders.
  • (A) It is a graph which shows the ratio of PI positive cell with respect to the total cell number of a human brain capillary endothelial cell (HBMVECs) in the adonixanthin containing medium group and control medium group with or without collagenase addition.
  • Con represents a control (control medium / collagenase-free group)
  • Veh represents a vehicle (control medium / collagenase-added group) as a negative control.
  • (B) It is a graph which shows the ratio of the PI positive cell with respect to the total cell number of a human brain capillary endothelial cell (HBMVECs) in the adnirubin containing medium group and control medium group with or without collagenase addition.
  • Con represents a control (control medium / collagenase-free group)
  • Veh represents a vehicle (control medium / collagenase-added group) as a negative control.
  • the upper row shows the results of Western blotting confirming the expression of various proteins in human brain capillary endothelial cells (HBMVECs) in adonixanthin-containing medium group or adonilvin-containing medium group and control medium group with or without collagenase added.
  • the lower graph is a graph showing the ratio of expression levels of various proteins.
  • the average value of the ratios of the expression levels in the control medium / collagenase-free group (hereinafter also referred to as control) is set to 1.
  • the upper panel shows the results of confirming the expression of pERK, tERK and ⁇ -actin by Western blotting.
  • the lower graph is a graph showing the ratio of pERK to tERK (pERK / tERK).
  • Con represents a control (control medium / collagenase-free group)
  • Veh represents a vehicle (control medium / collagenase-added group) as a negative control.
  • the upper panel shows the results of confirming the expression of VE-cadherin and ⁇ -actin by Western blotting.
  • the lower graph is a graph showing the ratio of VE-cadherin to ⁇ -actin (VE-cadherin / ⁇ -actin).
  • Con represents a control (control medium / collagenase-free group), and Veh represents a vehicle (control medium / collagenase-added group) as a negative control.
  • C The upper panel shows the results of confirming the expression of pERK, tERK and ⁇ -actin by Western blotting. The lower graph is a graph showing the ratio of pERK to tERK (pERK / tERK).
  • Con represents a control (control medium / collagenase-free group), and Veh represents a vehicle (control medium / collagenase-added group) as a negative control.
  • Con represents a control (control medium / hemoglobin non-added group)
  • Veh represents a vehicle (control medium / hemoglobin added group) as a negative control.
  • the upper row shows the results of confirming the expression of various proteins in human brain capillary endothelial cells (HBMVECs) in adonixanthin-containing medium group and control medium group with or without hemoglobin added by Western blotting.
  • the lower graph is a graph showing the ratio of expression levels of various proteins.
  • the average value of the ratios of the expression levels in the control medium / hemoglobin non-added group is 1.
  • the upper panel shows the results of confirming the expression of VE-cadherin and ⁇ -actin by Western blotting.
  • the lower graph is a graph showing the ratio of VE-cadherin to ⁇ -actin (VE-cadherin / ⁇ -actin).
  • Con represents a control (control medium / hemoglobin non-added group)
  • Veh represents a vehicle (control medium / hemoglobin added group) as a negative control.
  • the upper panel shows the results of confirming the expression of HO-1 and ⁇ -actin by Western blotting.
  • the lower graph is a graph showing the ratio of HO-1 to ⁇ -actin (HO-1 / ⁇ -actin).
  • Con represents a control (control medium / hemoglobin non-added group)
  • Veh represents a vehicle (control medium / hemoglobin added group) as a negative control.
  • It is a graph which shows the ratio of the PI positive cell with respect to the total cell number of a human brain capillary endothelial cell (HBMVECs) in the adonixanthin containing medium group with or without LPS addition, an adonilvin containing medium group, and a control medium group.
  • HBMVECs human brain capillary endothelial cell
  • Con represents a control (control medium / LPS non-added group), and Veh represents a vehicle (control medium / LPS added group) as a negative control.
  • It is a graph which shows the ratio of PI positive cell with respect to the total cell number of a human brain neuroblastoma (SH-SY5Y cell) in the adonixanthin containing culture medium group with and without LPS addition, and a control culture medium group.
  • Con represents a control (control medium / LPS non-added group)
  • Veh represents a vehicle (control medium / LPS added group) as a negative control.
  • composition of the present invention for preventing or suppressing hemorrhagic vascular injury is characterized by comprising one or more carotenoids selected from adonilvin and adonixanthin.
  • the carotenoid in the present invention is one or more selected from adonilbin, adonixanthin and pharmaceutically acceptable salts thereof, for example, adonilbin, adonixanthin and combinations of these two carotenoids.
  • carotenoids include free form and fatty acid ester form. From the viewpoint of absorbability, it is preferable to use a free form.
  • the carotenoid may be a stereoisomer such as an optical isomer or a cis-trans isomer. Furthermore, these carotenoids are preferably used as active ingredients.
  • the chemical formula of adonirubin is 3-hydroxy- ⁇ , ⁇ - carotene-4,4'-dione (C 40 H 52 0 3, molecular weight 580.853) and the structural formula is represented by the following formula.
  • the cis-trans isomer of adonilbin may be a cis isomer, a trans isomer or a combination thereof, and examples of the cis isomer include a 13-cis isomer.
  • adonixanthin is 3,3′-dihydroxy- ⁇ , ⁇ -carotene-4-one (C 40 H 54 0 3 , molecular weight 582.869), and the structural formula is represented by the following formula.
  • the optical isomers of adonixanthin include 3S, 3′R-adonixanthin, 3S, 3′S-adonixanthin, 3R, 3′S-adonixanthin and 3R, 3′R-adonixanthin, and There may be mentioned at least one selected from the group consisting of these pharmaceutically acceptable salts, and 3S, 3′R-adonixanthin is preferable.
  • the cis-trans isomer of adonixanthin may be a cis isomer, a trans isomer, or a combination thereof.
  • the cis-trans isomer of adonixanthin is preferably a combination of a cis isomer and a trans isomer.
  • the carotenoid may be in the form of a pharmaceutically acceptable salt, and these salts are also included in the carotenoid in the present invention.
  • carotenoids may form salts with acids or bases.
  • the pharmaceutically acceptable salt is not particularly limited as long as it forms a pharmaceutically acceptable salt with adonilvin and / or adonixanthin.
  • hydrohalide for example, hydrofluoride, hydrochloride, hydrobromide, hydroiodide, etc.
  • inorganic acid for example, sulfate, nitrate, perchloric acid
  • phosphate carbonate, bicarbonate, etc.
  • organic carboxylates eg acetate, oxalate, maleate, tartrate, fumarate, citrate, etc.
  • organic sulfonate For example, methanesulfonate, trifluoromethanesulfonate, ethanesulfonate, benzenesulfonate, toluenesulfonate, camphorsulfonate, etc.
  • amino acid salts eg aspartate, glutamate, etc.
  • quaternary amines examples thereof include, but are not limited to, salts, alkali metal salts (for example, sodium salts, potassium salts and the like), alkaline earth metal salts (for example
  • the carotenoid of the present invention may be a commercially available product, or a product synthesized by a chemical synthesis product produced by a conventional chemical synthesis method, a fermentation method using microorganisms, or an extraction and purification method from animals or plants.
  • (Naturally derived) also referred to as a microorganism, animal or plant-derived product
  • the microorganism, animal or plant-derived product is a product obtained from a microorganism, animal or plant, preferably a Paracoccus microorganism-derived product, more preferably a Paracoccus carotinifaciens-derived product. .
  • the following methods can be mentioned as methods for extracting and purifying adonilbin and adonixanthin from microorganisms.
  • the dried cells of Paracoccus carotinifaciens were subjected to room temperature extraction using acetone, and the extract was concentrated with an evaporator.
  • hexane-chloroform (1 1) After adding the mixed solution and mixing well, an organic solvent layer is obtained by liquid separation operation. The organic solvent layer is concentrated to dryness with an evaporator.
  • the concentrated dried product is dissolved in chloroform, and each carotenoid is separated with a silica gel column.
  • the fraction eluting with 300 mL of acetone: hexane (3: 7) is further purified by HPLC (Shim-pack PRC-SIL (Shimadzu Corporation), acetone: hexane (3: 7)) to obtain the adenylvin educt. Can be obtained. Further, the fraction eluted with acetone can be further purified by HPLC (Shim-pack PRC-SIL, acetone: hexane (4: 6)) to obtain adonixanthin educt.
  • a carotenoid mixture containing astaxanthin in addition to adonilbin and adonixanthin as the carotenoid of the present invention may be used.
  • the carotenoid mixture preferably further contains canthaxanthin, asteroidenone, ⁇ -carotene, echinenone and 3-hydroxyequenone.
  • a carotenoid mixture extracted from dry cells of Paracoccus carotinifaciens according to the methods described in JP 2007-261972 A and JP 2009-50237 A contains astaxanthin, adonilbin, and adonixanthin.
  • the carotenoid content in the composition of the present invention is not particularly limited as long as the effects of the present invention are not hindered.
  • the content of carotenoid is 0.01 to 50% by mass, preferably 0.05 to It is 40% by mass, more preferably 0.07 to 30% by mass, and still more preferably 0.1 to 20% by mass.
  • the measurement of the content of adonilvin and / or adonixanthin in the composition of the present invention is carried out by HPLC according to the description of Toxicol Rep. 2014 Aug 25; 1: 582-588.
  • composition of the present invention can be provided as a composition in which an orally acceptable or pharmaceutically acceptable additive is blended with the carotenoid as desired.
  • additives solvents, solubilizers, solubilizers, lubricants, emulsifiers, tonicity agents, stabilizers, preservatives, preservatives, surfactants, regulators, chelating agents, pH adjusters, buffers
  • examples include agents, excipients, thickeners, colorants, fragrances, and fragrances.
  • composition of the present invention can be prepared by a known technique such as mixing, dissolving, dispersing or suspending the carotenoid and optionally orally acceptable or pharmaceutically acceptable additives. Further, in the preparation of the composition of the present invention, unless the effects of the present invention are disturbed, the mixture, dissolved product, dispersion, suspension, etc. prepared by the above method are subjected to homogenization treatment and sterilization treatment. Also good.
  • composition of the present invention is not particularly limited as long as the effects of the present invention are not hindered, and may be solid, semi-solid (including paste and gel), or liquid (including oil and slurry). However, it is preferably solid or liquid.
  • the dosage form of the composition of the present invention is not particularly limited as long as the effects of the present invention are not hindered.
  • it is not limited to injections, tablets (for example, naked tablets, sugar-coated tablets, film-coated tablets, enteric tablets, sustained-release tablets, oral cavity) Disintegrating tablets, sublingual tablets, chewable tablets, etc.), capsules (eg, hard capsules, soft capsules), elixirs, pills, powders, powders, granules, solutions, troches, syrups, dry syrups, Emulsions, suspensions, solutions, inhalants, aerosols, powder inhalants, suppositories, ointments, creams, gels, patches, bops, lotions, drops, eye ointments, eye drops, nose drops Agents and the like.
  • the dosage form of the composition of the present invention is preferably a dosage form for oral ingestion or administration, and is a tablet, capsule, pill, powder, powder, granule, syrup, dry syrup, emulsion, liquid, suspension. Examples thereof include a turbid agent, a water agent, and a troche.
  • the method of administration or ingestion of the composition of the present invention is not particularly limited, but injection such as infusion, intravenous injection, intramuscular injection, subcutaneous injection, intradermal injection, oral, transmucosal, transdermal, intranasal, oral cavity
  • injection such as infusion, intravenous injection, intramuscular injection, subcutaneous injection, intradermal injection, oral, transmucosal, transdermal, intranasal, oral cavity
  • Examples include administration or ingestion, etc., preferably oral ingestion or administration.
  • composition of the present invention examples include foods and beverages such as foods and beverages, food and beverage additives, feeds, pharmaceuticals, quasi drugs, and cosmetics, and foods and beverages are preferable from the viewpoint of ease of ingestion.
  • the food and drink of the present invention are prepared by directly preparing the composition of the present invention as a food and drink, various proteins, sugars, fats, trace elements, vitamins, other active ingredients (for example, lactic acid bacteria, Bacillus, etc.) Or a fungus such as yeast, dietary fiber, DHA or EPA), and the composition of the present invention may be liquid, semi-liquid or solid such as solution, or the present invention.
  • the composition may be added to general food and drink.
  • the food and drink include instant noodles, retort foods, canned foods, microwave foods, instant soups and miso soups, freeze-dried foods, etc .; soft drinks, fruit juice drinks, vegetable drinks, soy milk Beverages such as beverages, coffee beverages, tea beverages, powdered beverages, concentrated beverages, alcoholic beverages; nutritional drinks; flour products such as bread, pasta, noodles, cake mixes and bread crumbs; rice cakes, gummy, jelly, caramel, chewing gum, chocolate Cookies, biscuits, cakes, pies, snacks, crackers, Japanese confectionery, dessert confectionery, etc .; nutrition bar; sauce, tomato processing seasoning, flavor seasoning, cooking mix, sauce, dressing, soup, curry Seasonings such as stew ingredients; processed fats and oils, butter, margarine, mayonnaise, etc .; milk drinks, yog Dairy products such as tomatoes, lactic acid bacteria beverages, ice creams, creams; processed agricultural products such as canned agricultural products, jams / marmalades, cereals; processed meat products such as ham, bacon, sausage, sausage
  • the foods and drinks of the present invention include health foods, supplements, functional foods (for example, foods for specified health use, nutritional functional foods or functional indication foods), nutritional supplements, special-purpose foods (for example, foods for the sick , Infant formulas, maternal and lactating infant formulas, or foods for those with difficulty swallowing and those with difficulty chewing) or infant formulas (also referred to as infant formula).
  • the composition of the present invention has a prophylactic or inhibitory effect on hemorrhagic vascular disorders and a prophylactic or inhibitory action on neurological disorders.
  • a food or drink for prevention or suppression is provided. That is, the food / beverage products of this invention can be provided as food / beverage products for humans who are concerned about blood pressure or arteriosclerosis.
  • foods and beverages such as functional foods “for those with higher blood pressure”, “for those with arteriosclerosis”, “to rejuvenate blood vessel age”, “to strengthen blood vessels”, “brain It may be provided with a display such as “for strengthening blood vessels”.
  • the intake or dose of the composition of the present invention is not particularly limited, and the formulation of the composition, carotenoid type, purity, subject type, subject age or weight, symptoms, intake or administration time, form of the composition , Depending on the method of ingestion or administration, other carotenoids or drug combinations, etc. Moreover, it is preferable that the composition of this invention is comprised from the form of a daily intake unit so that it may become an effective amount for the prevention or suppression of a hemorrhagic vascular disorder or a neuropathy.
  • one or more carotenoids selected from adonilvin, adonixanthin, and pharmaceutically acceptable salts thereof are 0.01 to 10000 mg per day for an adult weighing 60 kg.
  • the carotenoid can be formulated into the composition so that the intake or dose is preferably in the range of 0.1 to 1000 mg, more preferably 1 to 100 mg.
  • Other carotenoids or drugs used in combination with the carotenoid of the present invention can also be appropriately determined based on the clinically used intake or dose.
  • the daily intake or dose of the composition of the present invention is appropriately selected according to the formulation of the composition and the like, similar to the above-described intake or dose of the composition.
  • the daily intake or dose of the composition of the present invention may be ingested or administered to the subject, for example, once or a plurality of times, but is preferably ingested or administered to the subject at one time. . Therefore, the daily intake or administration frequency of the composition of the present invention is 1 to 5 times a day, preferably 1 to 3 times a day, more preferably once a day. is there.
  • the subject to which the composition of the present invention is applied is not particularly limited as long as the effect of the present invention is not hindered, but is preferably a mammal, more preferably a human, a dog, or a cat.
  • the subject may be a healthy person (healthy animal) or a patient (patient animal).
  • the composition of the present invention cell death of vascular endothelial cells, preferably cerebral vascular endothelial cells, can be suppressed, and the incidence of bleeding, preferably cerebral hemorrhage can be reduced. Therefore, according to the composition of the present invention, it is possible to prevent or suppress bleeding vascular disorders. Therefore, according to one embodiment of the present invention, the composition of the present invention is provided as a composition for preventing or suppressing hemorrhagic vascular disorders.
  • the “prevention of a failure” in the present specification means preparing for a possible deterioration in advance and preventing the occurrence of a failure.
  • “inhibition of a disorder” means to stop, alleviate or delay the progression of a disease state by suppressing the progress or worsening of the symptoms of the disorder.
  • the hemorrhagic vascular disorder is a hemorrhagic disorder based on vascular abnormality, and examples thereof include hemorrhagic cerebrovascular disorder, hemorrhagic cystitis, hemorrhagic gastric ulcer, hemorrhagic enteritis, preferably hemorrhagic cerebrovascular disorder It is. Furthermore, preferable examples of the hemorrhagic cerebrovascular disorder include cerebral hemorrhage, subarachnoid hemorrhage and hemorrhagic cerebral infarction. The hemorrhagic vascular disorder is preferably a disorder caused by cell death.
  • composition of the present invention is preferably used for suppressing or reducing the increase in the severity of bleeding vascular disorders.
  • Severity refers to the degree of symptoms based on the rating scale for each disorder.
  • Examples of the severity when the hemorrhagic vascular disorder is hemorrhagic cerebrovascular disorder include the following severity classifications: Japan Coma Scale (JCS) (Tomio Ohta, Shiro Waga, Handa, etc., acute phase) New grading of consciousness disorder and its expression method (so-called 3-3-9 degree method) 3rd Stroke Surgery Study Group Lecture 1975; pp61-69), Glasgow Coma Scale (GCS) (Teasdale G, Jennett B. Assessment of coma and impaired consciousness. A practical scale.
  • JCS Japan Coma Scale
  • GCS Glasgow Coma Scale
  • NIHSS NIH Stroke Scale
  • JSS Japan Stroke Scale
  • JSS-M stroke motor dysfunction severity scale
  • JSS-E Stroke Emotion Disorder Scale
  • JSS-D Stroke Depression Scale
  • JSS-D Joint Stroke Depression Scale
  • JSS-DE Stroke Emotion Disorder Scale
  • JSS-DE Simultaneous Evaluation Table
  • NIHSS NIH Stroke Scale
  • the hemorrhagic vascular disorder includes those caused by at least one of the following (a) to (e): (a) Increase in phosphorylation of extracellular signal-regulated kinase (ERK), preferably ERK1 / 2, or increase in expression level of phosphorylated ERK (preferably increase in expression level of phosphorylated ERK relative to total ERK expression level) ), (b) cell death from ERK signal, (c) reduction of heme oxygenase-1 (HO-1) (preferably reduction of the expression level of HO-1 protein), (d) reduction of vascular endothelial cadherin (VE-cadherin) (preferably, reduction of the expression level of VE-cadherin protein), (e) Cell death induced by collagenase.
  • ERK extracellular signal-regulated kinase
  • ERK1 / 2 preferably ERK1 / 2
  • increase in expression level of phosphorylated ERK preferably increase in expression level of phosphorylated
  • composition of the present invention can be used in at least one of the following (i) to (v) in bleeding vascular disorders as shown in the following examples: (i) reduction of phosphorylation of ERK or reduction of the expression level of phosphorylated ERK (preferably, reduction of the expression level of phosphorylated ERK relative to the total expression level of ERK), (ii) suppression of ERK signal-derived cell death, (iii) increase in HO-1 (preferably increase in the expression level of HO-1 protein), (iv) increase in VE-cadherin (preferably increase in the expression level of VE-cadherin protein), (v) Suppression of cell death induced by collagenase.
  • the composition of the present invention relates to a disease caused by at least one of the above (a) to (e), and is used in at least one of the above (i) to (v) be able to. Furthermore, the composition of the present invention can improve diseases caused by at least one of the above (a) to (e). “Improvement” in the present specification includes not only the meaning of “treatment” of improving an established disease state but also the meaning of “prevention”.
  • adonixanthin and / or adonilbin increases the expression level of HO-1 or decreases the expression level of phosphorylated ERK against cell death-induced damage in vascular endothelial cells. It is presumed that cadherin enhances cell-cell binding and reduces damage to vascular endothelial cells.
  • the composition of the present invention it is possible to prevent or suppress neuropathy. Therefore, according to one aspect of the present invention, the composition of the present invention is provided as a composition for the prevention or suppression of neuropathy.
  • cranial neuropathy is preferably exemplified.
  • preferable examples of cranial nerve disorders include Alzheimer's disease, Parkinson's disease, Lewy microdementia, and Huntington's disease.
  • the neurological disorder is preferably a disorder caused by cell death.
  • the neuropathy preferably cerebral nerve cell
  • nerve cells preferably cranial nerve cells.
  • the neurological disorder may be a disorder derived from the hemorrhagic vascular disorder, for example, a complication of the hemorrhagic vascular disorder, and further, the neurological disorder is a disorder caused by a blood component leaked due to the vascular disorder. Good.
  • the composition of the present invention is preferably used for suppressing or reducing an increase in the severity of neuropathy.
  • the severity of neurological disorder is cranial neuropathy, for example, the following severity classification: JapanCSComa ⁇ Scale (JCS) (Tomio Ohta, Shiro Waga, Handa, et al. New grading of acute consciousness disorder) And its expression (so-called 3-3-9 degree method), 3rd Stroke Surgery Study Group Lecture 1975; pp61-69), Glasgow Coma Scale (GCS) (Teasdale G, Jennett B. Assessment of coma and impaired consciousness. A practical scale.
  • JCSComa ⁇ Scale Tomio Ohta, Shiro Waga, Handa, et al. New grading of acute consciousness disorder
  • GCS Glasgow Coma Scale
  • NIHSS modified NIH Stroke Scale
  • JSS Japan Stroke Scale
  • JSS-M Cerebral Motor Disability Severity Scale
  • JSS-M Joint Stroke Society / Stroke Movement Disorder Severity Scale
  • Stroke 1999; 21: 352-356 Stroke Emotion Disorder Scale
  • JSS-E Stroke Emotion Disorder Scale
  • JSS-D Stroke Depression Scale
  • JSS-DE Joint Stroke Depression Scale
  • a subject is administered or ingested with a composition comprising an effective amount of one or more carotenoids selected from adonilvin, adonixanthin, and pharmaceutically acceptable salts thereof.
  • a method for preventing or inhibiting hemorrhagic vascular disorders in a subject is provided.
  • an effective amount of one or more carotenoids selected from adonilvin, adonixanthin and pharmaceutically acceptable salts thereof is administered to a subject in need thereof, or A method is provided for preventing or inhibiting a bleeding vascular disorder in a subject comprising ingesting.
  • the “effective amount” is set in the same manner as the content of one or more carotenoids selected from adonilbin, adonixanthin and pharmaceutically acceptable salts thereof in a daily intake unit.
  • the hemorrhagic vascular disorder include hemorrhagic cerebrovascular disorder, hemorrhagic cystitis, hemorrhagic gastric ulcer, or hemorrhagic enteritis, and hemorrhagic cerebrovascular disorder is preferable.
  • the hemorrhagic cerebrovascular disorder preferably includes cerebral hemorrhage, subarachnoid hemorrhage, or hemorrhagic cerebral infarction.
  • hemorrhagic vascular disorder examples include those caused by at least one of the following (a) to (e): (a) Increase in phosphorylation of ERK or increase in the expression level of phosphorylated ERK; ) Cell death from ERK signal, (c) Reduction of HO-1, (d) Reduction of VE-cadherin, (e) Cell death induced by collagenase.
  • a subject is administered or ingested with a composition comprising an effective amount of one or more carotenoids selected from adonilvin, adonixanthin, and pharmaceutically acceptable salts thereof.
  • (I) a method for reducing phosphorylation of ERK or a method for reducing the expression level of phosphorylated ERK in a subject comprising: ) A method of suppressing cell death derived from ERK signal, (iii) a method of increasing HO-1, (iv) a method of increasing VE-cadherin, and (v) a method of suppressing cell death induced by collagenase.
  • an effective amount of one or more carotenoids selected from adonilvin, adonixanthin and pharmaceutically acceptable salts thereof is administered to a subject in need thereof, or There is provided at least one method of (i)-(v) above in a subject comprising ingesting.
  • a subject is administered or ingested with a composition comprising an effective amount of one or more carotenoids selected from adonilvin, adonixanthin, and pharmaceutically acceptable salts thereof.
  • a method for preventing or suppressing a neurological disorder in a subject is provided.
  • an effective amount of one or more carotenoids selected from adonilvin, adonixanthin and pharmaceutically acceptable salts thereof is administered to a subject in need thereof, or
  • a method of preventing or inhibiting a subject's neurological disorder comprising ingesting is provided.
  • the neurological disorder include cranial neuropathy.
  • cranial nerve disorders include Alzheimer's disease, Parkinson's disease, Lewy microdementia, and Huntington's disease.
  • a subject is administered or ingested with a composition comprising an effective amount of one or more carotenoids selected from adonilvin, adonixanthin, and pharmaceutically acceptable salts thereof.
  • an effective amount of one or more carotenoids selected from adonilvin, adonixanthin and pharmaceutically acceptable salts thereof is administered to a subject in need thereof, or There is provided a method for ameliorating a disease caused by at least one of the above (a) to (e) in a subject comprising ingesting.
  • the method for ameliorating a disease caused by at least one of (a) to (e) is a non-therapeutic method excluding medical practice for humans when the subject is a healthy person.
  • the medical practice for humans means an act that requires a doctor or the like to ingest (administer) pharmaceuticals to humans.
  • the method of ameliorating the disease can be carried out according to the contents described herein for the composition of the present invention.
  • one or more carotenoids selected from adonilvin, adonixanthin and pharmaceutically acceptable salts thereof for the prevention or suppression of hemorrhagic vascular disorders.
  • one or more carotenoids selected from adonilvin, adonixanthin, and pharmaceutically acceptable salts thereof for at least one of the following (i) to (v): Uses are provided: (i) reduced phosphorylation of ERK or reduced expression of phosphorylated ERK, (ii) inhibition of cell death from ERK signal, (iii) increase in HO-1, (iv) VE -Increase of cadherin and (v) suppression of cell death induced by sputum collagenase.
  • one or more carotenoids selected from adonilbin, adonixanthin and their pharmaceutically acceptable salts for the prevention or suppression of neurological disorders.
  • Use of one or more carotenoids: (a) increased phosphorylation of ERK or increased expression of phosphorylated ERK, (b) cell death from ERK signal, (c) reduction of HO-1.
  • one or more selected from adonilvin, adonixanthin, and pharmaceutically acceptable salts thereof in the manufacture of a composition for preventing or suppressing bleeding vascular disorders Use of carotenoids is provided.
  • the use of one or more carotenoids selected from adonilbin, adonixanthin and their pharmaceutically acceptable salts in the manufacture of a composition for the prevention or suppression of neurological disorders is provided.
  • one or more carotenoids selected from adonilvin, adonixanthin, and pharmaceutically acceptable salts thereof for the prevention or suppression of bleeding vascular disorders are provided.
  • one or more carotenoids selected from adonilvin, adonixanthin and pharmaceutically acceptable salts thereof for the prevention or suppression of neurological disorders are provided.
  • Preparation Example 1 Preparation of adonixanthin, adonilvin, and astaxanthin Adonilvin educt and adonixanthin educt were prepared according to the method described in Japanese Patent Application Laid-Open No. 2012-1558569. Briefly described below.
  • the dried cells of Paracoccus carotinifaciens were subjected to room temperature extraction using acetone.
  • the obtained extract is concentrated with an evaporator, and when the concentrate is separated into two layers, a hexane-chloroform (1: 1) mixture is added to the concentrate and mixed well, and then an organic solvent layer is obtained by liquid separation operation. It was.
  • the obtained organic solvent layer was concentrated to dryness with an evaporator.
  • the concentrated dried product was dissolved in chloroform, and each carotenoid was separated with a silica gel column. Specifically, the fraction eluted with 300 mL of acetone: hexane (3: 7) was further purified by HPLC (Shim-pack PRC-SIL (Shimadzu Corporation), acetone: hexane (3: 7)), and adonirubin An educt (hereinafter also simply referred to as adonilbin) was obtained. Further, the fraction eluted with acetone: hexane (5: 5) was concentrated and allowed to stand at 4 ° C. to obtain an astaxanthin free form as crystals (hereinafter also simply referred to as astaxanthin).
  • adonixanthin educt (hereinafter also simply referred to as adonixanthin).
  • Preparation Example 2 Preparation of adonixanthin-containing medium, adonilvin-containing medium and astaxanthin-containing medium
  • Adonixanthin, adonilbin or astaxanthin obtained in Preparation Example 1 was dissolved in DMSO (dimethyl sulfoxide, Nacalai Tesque). Thereafter, the above-mentioned adonixanthin, adonilvin, or astaxanthin is 0.1 ⁇ M, 0.3 ⁇ M, or 1 ⁇ M in EBM-2 (LONZA) medium or 1% or 10% fetal calf serum (FBS, VALANT, Inc.).
  • DMEM Dulbecco's modified Eagle medium
  • FBS fetal bovine serum
  • Test Example 1 Examination of the inhibitory effect of adonixanthin and adonilbin on collagenase-induced cell death in human brain capillary endothelial cells (HBMVECs)
  • A Examination of inhibitory effect of adonixanthin Human brain capillary endothelial cells (HBMMVECs) (Primary Normal Human Brain Microvascular) to be 4950 cells / well in a 96-well plate (FALCON) containing 100 ⁇ L of EBM-2 medium Endothelial Cells, DS Pharma Biomedical) were seeded and cultured at 37 ° C. in a 5% CO 2 atmosphere until confluent.
  • HBMMVECs Human brain capillary endothelial cells
  • the evaluation results of cell death are shown in FIG. The measured value was expressed as an average value ⁇ standard error.
  • the adonixanthin-containing medium group significantly suppressed cell death at any concentration as compared to the control medium / collagenase-added group (**: p ⁇ 0.01 vs. control medium ⁇ Collagenase-free group (Welch's t-test), #: p ⁇ 0.05 vs. control medium / collagenase-added group (Dunnett's test), ##: p ⁇ 0.01 vs. control medium / collagenase-added group (Dunnett's test)).
  • Test Example 2 Examination of expression levels of various proteins by addition of adonixanthin and adonilbin in collagenase-treated human brain capillary endothelial cells (HBMVECs)
  • A Examination of expression levels of ERK, HO-1, VE-cadherin by addition of adonixanthin 50,000 cells / well in a 24-well plate (FALCON) containing 500 ⁇ L of EBM-2 (LONZA) medium
  • EBM-2 LONZA
  • Human brain capillary endothelial cells (HBMVECs) (Primary Normal Human Brain Microcellular Cells, DS Pharma Biomedical Co., Ltd.) were seeded and cultured at 37 ° C. in a 5% CO 2 atmosphere until confluent.
  • the medium was replaced with 500 ⁇ L of 1 ⁇ M adonixanthin-containing medium or control medium obtained in Preparation Example 2. After 24 hours, the medium was replaced with 1 ⁇ M adonixanthin-containing medium or control medium containing 30 U / mL collagenase (Sigma Aldrich). The amount of the medium was 500 ⁇ L per well. After exposure to collagenase for 4 hours, sampling was performed and the protein expression level was confirmed by Western blotting.
  • the cells obtained by sampling were subjected to radioimmunoprecipitation assay buffer (Sigma Aldrich, St. Co.) containing 1% protease inhibitor cocktail and 1% phosphatase inhibitor cocktail 2 and 3 (Sigma Aldrich). (Louis, MO, USA) and recovered. The dissolved sample was then centrifuged at 15,000 rpm and 4 ° C. for 20 minutes. The protein concentration was measured using a Protein assay kit (Thermo Fisher Scientific) using a bovine serum albumin standard.
  • the obtained cell extract was boiled in SDS sample buffer for 5 minutes according to a conventional method, subjected to 20% sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gradient gel electrophoresis, and then polyvinylidene difluoride (PVDF) membrane (Immobilon-P: Transcribed to Millipore Corporation.
  • PVDF polyvinylidene difluoride
  • the PVDF membrane to which the protein was transferred was blocked for 1 hour at room temperature using a blocking buffer (trisphosphate buffer containing 5% nonfat dry milk), and then incubated for 24 hours using a primary antibody.
  • the PVDF membrane was washed three times with a washing buffer (a trisphosphate buffer containing 0.1% Tween-20), and incubated for 1 hour with a peroxidase-labeled goat anti-mouse IgG antibody (KPL).
  • a washing buffer a trisphosphate buffer containing 0.1% Tween-20
  • KPL peroxidase-labeled goat anti-mouse IgG antibody
  • anti-total ERK (tERK) antibody p44 / 42 MAPK (Erk1 / 2) Activity, Cell Signaling Technology
  • anti-phosphorylated ERK (pERK) antibody Phospho-p44 / 42 MAPK (Erk1) / 2) (Thr202 / Tyr204) Antibody, Cell Signaling Technology
  • anti-VE-cadherin antibody Rabbit VE-cadherin antibody, Abcam
  • an anti- ⁇ -actin antibody (Mouse ⁇ -actin antibody, Sigma-Aldrich) was used as a control primary antibody. Thereafter, the detected signal concentration was corrected with tERK and ⁇ -actin (calculation of pERK / tERK and VE-cadherin / ⁇ -actin).
  • FIGS. 2 (a) to (c) Western blotting results are shown in FIGS. 2 (a) to (c).
  • adonixanthin significantly suppressed phosphorylation of ERK (*: p ⁇ 0.05 vs. control medium / collagenase-free group (Student's t-test), #: p ⁇ 0.05 vs. Control medium / collagenase added group (Student's t test)).
  • FIG. 2 (b) adonixanthine significantly increased the expression level of VE-cadherin (#: p ⁇ 0.05 vs. control medium / collagenase added group (Student's t test)).
  • Test Example 3 Examination of the inhibitory effect of adonixanthin and adonilvin on hemoglobin-induced cell death in human brain capillary endothelial cells (HBMVECs) 4950 in a 96-well plate (FALCON) containing 100 ⁇ L of EBM-2 (LONZA) medium Cells / well human brain capillary endothelial cells (HBMVECs) (Primary Normal Human Brain Microcellular Cells, DS Pharma Biomedical) at 37 ° C. under 5% CO 2 atmosphere until confluent. Cultured. Thereafter, the medium was replaced with 100 ⁇ L of 1 ⁇ M adonixanthin-containing medium, 1 ⁇ M adonilvin-containing medium or control medium obtained in Preparation Example 2.
  • FIG. 3 The results of cell death evaluation are shown in FIG. The measured value was expressed as an average value ⁇ standard error.
  • adonixanthin and adonilbin significantly suppressed cell death as compared with the control medium / hemoglobin added group (**: p ⁇ 0.01 ⁇ vs control medium / hemoglobin non-added group (Tukey's test)).
  • HBMMVECs hemoglobin-treated human brain capillary endothelial cells
  • Protein concentration was measured using a Protein assay kit with bovine serum albumin standards.
  • the obtained cell extract was boiled in SDS sample buffer for 5 minutes according to a conventional method, subjected to 20% sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gradient gel electrophoresis, and then polyvinylidene difluoride (PVDF) membrane (Immobilon-P: Transcribed to Millipore Corporation.
  • PVDF membrane to which the protein was transferred was blocked for 1 hour at room temperature using a blocking buffer (trisphosphate buffer containing 5% nonfat dry milk), and then incubated for 24 hours using a primary antibody.
  • PVDF polyvinylidene difluoride
  • FIGS. 4 (a) and 4 (b) Western blotting results are shown in FIGS. 4 (a) and 4 (b). The measured value was expressed as an average value ⁇ standard error.
  • adonixanthin significantly increased the expression level of VE-cadherin (*: p ⁇ 0.05 vs. control medium / hemoglobin added group (Student's t test)), #: p ⁇ 0.05 vs control medium / hemoglobin added group (Student's t-test)).
  • adonixanthine significantly increased the expression level of HO-1 (##: p ⁇ 0.01V vs. control medium / hemoglobin added group (Student's t test)).
  • Test Example 5 Examination of the inhibitory effect of adonixanthin and adnirubin on LPS-induced cell death in human brain capillary endothelial cells (HBMVECs) 4950 in a 96-well plate (FALCON) containing 100 ⁇ L of EBM-2 (LONZA) medium Human brain capillary endothelial cells (HBMVECs) were seeded in cells / well and cultured at 37 ° C. in a 5% CO 2 atmosphere until confluent. Thereafter, the medium was replaced with 100 ⁇ L of 1 ⁇ M adonixanthin-containing medium, 1 ⁇ M adonilvin-containing medium or control medium obtained in Preparation Example 2.
  • Test Example 6 Suppression effect of adonixanthin on LPS-induced cell death in human brain neuroblastoma: 10,000 cells / well in a 96-well plate containing 100 ⁇ L of Dulbecco's modified Eagle medium containing 10% fetal calf serum
  • human brain neuroblastoma SH-SY5Y cells, European Collection of Cell Culture
  • FBS DMEM 1% FBS DMEM containing 0.1 ⁇ M, 0.3 ⁇ M, or 1 ⁇ M adonixanthin obtained in Preparation Example 2.
  • FIG. 6 The results of cell death evaluation are shown in FIG. The measured value was expressed as an average value ⁇ standard error.
  • adonixanthin significantly suppressed cell death as compared with the control medium / LPS added group (**: p ⁇ 0.01 vs control medium / LPS non-added group (Student's t-test)), ##: p ⁇ 0.01V vs. control medium / LPS added group (Dunnett's test)).

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Abstract

本発明は、新規な出血性血管障害の予防または抑制のための組成物を提供する。より詳細には、アドニルビン、アドニキサンチンおよびそれらの薬学的に許容可能な塩から選択される一種以上のカロテノイドを含んでなる、出血性血管障害の予防または抑制のための組成物を提供する。

Description

出血性血管障害の予防または抑制のための組成物 関連出願の参照
　本特許出願は、２０１８年３月８日に出願された日本国特許出願２０１８－０４２２６９号に基づく優先権の主張を伴うものであり、かかる先の特許出願における全開示内容は、引用することにより本明細書の一部とされる。
　本発明は、出血性血管障害の予防または抑制のための組成物に関し、より詳しくは、アドニルビン、アドニキサンチンおよびそれらの薬学的に許容可能な塩から選択される一種以上のカロテノイドを含んでなる、出血性血管障害の予防または抑制のための組成物に関する。
　血管異常による出血性障害が知られており、その予防剤の開発の必要性が存在している。上記出血性血管障害の一つとして出血性脳血管障害が知られている。出血性脳血管障害は、脳の血管が破れることにより生じるものであり、脳組織への障害が生じることもある。上記出血性血管障害は脳高次機能に影響し、予後不良であり、患者のＱＯＬ（Ｏｕａｌｉｔｙ　ｏｆ　Ｌｉｆｅ）の低下を招くものである。この点からも、出血性脳血管障害をはじめとする出血性血管障害の予防剤が求められている。
　一方、アドニルビンおよびアドニキサンチンはカロテノイドの一種であり、動物、植物、微生物に広く分布している。アドニルビンまたはアドニキサンチンには抗不安の効果があることが知られている(特許文献１）。
　また、カロテノイドの一種であるアスタキサンチンには種々の効果があることが報告されている。例えば、特許文献２には、アスタキサンチンを主成分とするカロテノイド混合物が網膜障害予防に有用であり得ると記載されている。特許文献３には、アスタキサンチンが、ＬＤＬ酸化を抑制または防止し、動脈硬化、虚血性心疾患または虚血性脳障害を予防または抑制することが記載されている。特許文献４には、アスタキサンチンが、シクロオキシゲナーゼ－２活性を阻害することが記載されている。特許文献５には、アスタキサンチンが、脳障害を含む様々な医薬適用及び健康食品において有用であり得ることが記載されている。非特許文献１には、アスタキサンチンが虚血に関連した脳損傷を保護できることが記載されている。
　また、特許文献６には、リコペン等のカロテノイドが、乳清タンパク質等のカーゴ分子を血流へ送達するのに有用となり得ることが記載されている。ここで、カーゴ分子の性質に依存して疾患が回復または軽減され、カーゴ分子としてレスベラトロールやイソフラボンを用いた場合には、心血管および脳血管疾患に有用となり得ることが記載されている。
　しかしながら、アドニルビンおよび／またはアドニキサンチンと、出血性血管障害との関係については何ら報告されていない。
特開２０１２－０２５７１２号公報 特開２０１５－１４０３４６号公報 特開平１０－１５５４５９号公報 特開２００６－００８７１８号公報 特開２０１５－２２６５５０号公報 特表２０１４－５０５０６８号公報
Pan L et al., Brain research bulletin, 2017 Apr, 130, p.211-220
　本発明は、効果的に出血性血管障害を予防または抑制するための新たな技術的手段を提供することを目的としている。本発明は、効果的に神経障害を予防するかまたは抑制するための新たな技術的手段を提供することを別の目的としている。
　本発明者らは、今般、アドニルビンまたはアドニキサンチンが、出血性血管障害を効果的に予防または抑制しうることを見出した。
　本発明には、以下の発明が包含される。
［１］　アドニルビン、アドニキサンチンおよびそれらの薬学的に許容可能な塩から選択される一種以上のカロテノイドを含んでなる、出血性血管障害の予防または抑制のための組成物。
［２］　前記カロテノイドが、パラコッカス・カロティニファシエンス(Paracoccus carotinifaciens)由来である、請求項１に記載の組成物。
［３］　前記出血性血管障害が、出血性脳血管障害、出血性膀胱炎、出血性胃潰瘍、および出血性腸炎からなる群から選択される少なくとも一種である、［１］または［２］に記載の組成物。
［４］　前記出血性脳血管障害が、脳出血、くも膜下出血、および出血性脳梗塞からなる群から選択される少なくとも一種である、［１］～［３］のいずれか一つに記載の組成物。
［５］　前記出血性血管障害の重症度の上昇抑制または低減のための、［１］～［４］のいずれか一つに記載の組成物。
［６］　下記(i)～(v)の少なくともいずれか一つにおいて使用するための、［１］～［５］のいずれか一つ記載の組成物：
(i) ＥＲＫのリン酸化の低減またはリン酸化ＥＲＫの発現量の低減、
(ii) ＥＲＫシグナル由来の細胞死の抑制、
(iii) ＨＯ－１の増加、
(iv) ＶＥ－カドヘリンの増加、
(v) コラゲナーゼにより誘導される細胞死の抑制。
［７］　神経障害の予防または抑制のための、［１］～［６］のいずれか一つに記載の組成物。
［８］　前記神経障害が脳神経障害である、［７］に記載の組成物。
［９］　前記脳神経障害が、アルツハイマー病、パーキンソン病、レビー小型認知症、およびハンチントン病からなる群から選択される少なくとも一種である、［８］に記載の組成物。
［１０］　前記神経障害の重症度の上昇抑制または低減のための、［７］～［９］のいずれか一つに記載の組成物。
［１１］　前記組成物が飲食品または食品添加物である、［１］～［１０］のいずれか一つに記載の組成物。
［１２］　前記組成物が機能性食品である、［１］～［１１］のいずれか一つに記載の組成物。
［１３］　前記組成物が医薬品である、［１］～［１２］のいずれか一つに記載の組成物。
［１４］　アドニルビン、アドニキサンチンおよびそれらの薬学的に許容可能な塩から選択される一種以上のカロテノイドの有効量を、それを必要とする対象に投与することまたは摂取させることを含んでなる、対象の出血性血管障害を予防するかまたは抑制する方法。
［１５］　出血性血管障害の予防または抑制のための、アドニルビン、アドニキサンチンおよびそれらの薬学的に許容可能な塩から選択される一種以上のカロテノイドの使用。
　本発明によれば、効果的に対象の出血性血管障害を予防または抑制することができる。また、本発明の組成物は、出血性脳血管障害、出血性膀胱炎、出血性胃潰瘍、および出血性腸炎からなる群から選択される少なくとも一種の出血性血管障害を予防または抑制することができる上で有利である。さらに、本発明の組成物は、神経障害、好ましくは脳神経障害の予防または抑制において有利に利用することができる。
（ａ）コラゲナーゼ添加または非添加の、アドニキサンチン含有培地群および対照培地群における、ヒト脳毛細血管内皮細胞（ＨＢＭＶＥＣｓ）の総細胞数に対するＰＩ陽性細胞の割合を示すグラフである。図中、Ｃｏｎは対照（対照培地・コラゲナーゼ非添加群）、Ｖｅｈは陰性対照としてのビヒクル（対照培地・コラゲナーゼ添加群）を示す。（ｂ）コラゲナーゼ添加または非添加の、アドニルビン含有培地群および対照培地群における、ヒト脳毛細血管内皮細胞（ＨＢＭＶＥＣｓ）の総細胞数に対するＰＩ陽性細胞の割合を示すグラフである。図中、Ｃｏｎは対照（対照培地・コラゲナーゼ非添加群）、Ｖｅｈは陰性対照としてのビヒクル（対照培地・コラゲナーゼ添加群）を示す。 上段はコラゲナーゼ添加または非添加の、アドニキサンチン含有培地群またはアドニルビン含有培地群および対照培地群におけるヒト脳毛細血管内皮細胞（ＨＢＭＶＥＣｓ）における各種タンパク質の発現をウエスタンブロット法により確認した結果を示す。下段は各種タンパク質の発現量の比を示すグラフである。ここで、対照培地・コラゲナーゼ非添加群（以下、対照ともいう）における発現量の比の平均値を１とする。（ａ）上段はｐＥＲＫ、ｔＥＲＫおよびβ－アクチンの発現を、ウエスタンブロット法により確認した結果を示す。下段はｔＥＲＫに対するｐＥＲＫの比（ｐＥＲＫ／ｔＥＲＫ）を示すグラフである。図中、Ｃｏｎは対照（対照培地・コラゲナーゼ非添加群）、Ｖｅｈは陰性対照としてのビヒクル（対照培地・コラゲナーゼ添加群）を示す。（ｂ）上段はＶＥ－カドヘリンおよびβ－アクチンの発現を、ウエスタンブロット法により確認した結果を示す。下段はβ－アクチンに対するＶＥ－カドヘリンの比（ＶＥ－カドヘリン／β－アクチン）を示すグラフである。図中、Ｃｏｎは対照（対照培地・コラゲナーゼ非添加群）、Ｖｅｈは陰性対照としてのビヒクル（対照培地・コラゲナーゼ添加群）を示す。（ｃ）上段はｐＥＲＫ、ｔＥＲＫおよびβ－アクチンの発現を、ウエスタンブロット法により確認した結果を示す。下段はｔＥＲＫに対するｐＥＲＫの比（ｐＥＲＫ／ｔＥＲＫ）を示すグラフである。図中、Ｃｏｎは対照（対照培地・コラゲナーゼ非添加群）、Ｖｅｈは陰性対照としてのビヒクル（対照培地・コラゲナーゼ添加群）を示す。 ヘモグロビン添加または非添加の、アドニキサンチン含有培地群、アドニルビン含有培地群および対照培地群における、ヒト脳毛細血管内皮細胞（ＨＢＭＶＥＣｓ）の総細胞数に対するＰＩ陽性細胞の割合を示すグラフである。図中、Ｃｏｎは対照（対照培地・ヘモグロビン非添加群）、Ｖｅｈは陰性対照としてのビヒクル（対照培地・ヘモグロビン添加群）を示す。 上段はヘモグロビン添加または非添加の、アドニキサンチン含有培地群および対照培地群におけるヒト脳毛細血管内皮細胞（ＨＢＭＶＥＣｓ）における各種タンパク質の発現をウエスタンブロット法により確認した結果を示す図である。下段は各種タンパク質の発現量の比を示すグラフである。ここで、対照培地・ヘモグロビン非添加群における発現量の比の平均値を１とする。（ａ）上段はＶＥ－カドヘリンおよびβ－アクチンの発現を、ウエスタンブロット法により確認した結果を示す。下段はβ－アクチンに対するＶＥ－カドヘリンの比（ＶＥ－カドヘリン／β－アクチン）を示すグラフである。図中、Ｃｏｎは対照（対照培地・ヘモグロビン非添加群）、Ｖｅｈは陰性対照としてのビヒクル（対照培地・ヘモグロビン添加群）を示す。（ｂ）上段はＨＯ－１およびβ－アクチンの発現を、ウエスタンブロット法により確認した結果を示す図である。下段はβ－アクチンに対するＨＯ－１の比（ＨＯ－１／β－アクチン）を示すグラフである。図中、Ｃｏｎは対照（対照培地・ヘモグロビン非添加群）、Ｖｅｈは陰性対照としてのビヒクル（対照培地・ヘモグロビン添加群）を示す。 ＬＰＳ添加または非添加の、アドニキサンチン含有培地群、アドニルビン含有培地群および対照培地群における、ヒト脳毛細血管内皮細胞（ＨＢＭＶＥＣｓ）の総細胞数に対するＰＩ陽性細胞の割合を示すグラフである。図中、Ｃｏｎは対照（対照培地・ＬＰＳ非添加群）、Ｖｅｈは陰性対照としてのビヒクル（対照培地・ＬＰＳ添加群）を示す。 ＬＰＳ添加または非添加の、アドニキサンチン含有培地群および対照培地群における、ヒト脳神経芽細胞腫（ＳＨ－ＳＹ５Ｙ細胞）の総細胞数に対するＰＩ陽性細胞の割合を示すグラフである。図中、Ｃｏｎは対照（対照培地・ＬＰＳ非添加群）、Ｖｅｈは陰性対照としてのビヒクル（対照培地・ＬＰＳ添加群）を示す。
発明の具体的説明
　本発明の、出血性血管障害の予防または抑制のため組成物は、アドニルビンおよびアドニキサンチンから選択される一種以上のカロテノイドを含んでなることを特徴としている。
カロテノイド
　本発明におけるカロテノイドとしては、アドニルビン、アドニキサンチンおよびそれらの薬学的に許容可能な塩から選択される一種以上のものであり、例えば、アドニルビン、アドニキサンチンおよびこれら２種のカロテノイドの組み合わせが挙げられる。また、カロテノイドとしては、遊離体、脂肪酸エステル体が挙げられる。吸収性の観点から、遊離体を使用することが好ましい。カロテノイドは、光学異性体、シス-トランス異性体等の立体異性体であってもよい。さらに、これらカロテノイドは有効成分として用いることが好ましい。
　アドニルビンの化学式は3-hydroxy-β,β-carotene-4,4’-dione （C40H5203、分子量580.853）であり、構造式は下記式で表される。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
 　アドニルビンのシス-トランス異性体としては、シス体、トランス体またはそれらの組み合わせであってもよく、シス体としては１３－シス体を挙げることができる。
　アドニキサンチンの化学式は3,3’-dihydroxy-β,β-carotene-4-one （C40H5403、分子量582.869）であり、構造式は下記式で表される。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
 　アドニキサンチンの光学異性体としては、３Ｓ，３’Ｒ－アドニキサンチン、３Ｓ，３’Ｓ－アドニキサンチン、３Ｒ，３’Ｓ－アドニキサンチンおよび３Ｒ，３’Ｒ－アドニキサンチンならびにこれらの薬学的に許容可能な塩からなる群から選ばれる少なくとも１つを挙げることができ、好ましくは、３Ｓ，３’Ｒ－アドニキサンチンである。また、アドニキサンチンのシス-トランス異性体としては、シス体、トランス体またはそれらの組み合わせであってもよい。アドニキサンチンのシス-トランス異性体として、好ましくは、シス体およびトランス体の組み合わせである。
　本発明において、カロテノイドは、薬学的に許容可能な塩の形態であってもよく、これらの塩も本発明におけるカロテノイドに含まれる。本発明において、カロテノイドは、酸または塩基と塩を形成する場合もある。本発明において、薬学的に許容可能な塩は、アドニルビンおよび／またはアドニキサンチンと薬学的に許容可能な塩を形成するものであれば特に限定されない。具体的には、例えば、ハロゲン化水素酸塩（例えばフッ化水素酸塩、塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩等）、無機酸塩（例えば硫酸塩、硝酸塩、過塩素酸塩、リン酸塩、炭酸塩、重炭酸塩等）、有機カルボン酸塩（例えば酢酸塩、シュウ酸塩、マレイン酸塩、酒石酸塩、フマル酸塩、クエン酸塩等）、有機スルホン酸塩（例えばメタンスルホン酸塩、トリフルオロメタンスルホン酸塩、エタンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、トルエンスルホン酸塩、カンファースルホン酸塩等）、アミノ酸塩（例えばアスパラギン酸塩、グルタミン酸塩等）、四級アミン塩、アルカリ金属塩（例えばナトリウム塩、カリウム塩等）、アルカリ土類金属塩（例えばマグネシウム塩、カルシウム塩等）等が挙げられるが、これに限定されない。
　本発明のカロテノイドは、市販品であってもよく、あるいは従来の化学合成法により製造された化学合成品、微生物による発酵法、または動物もしくは植物等からの抽出および精製方法等により製造されたもの（天然由来）（微生物、動物または植物由来物ともいう）を使用することができる。ここで、微生物、動物または植物由来物とは、微生物、動物または植物から得られる産生物であり、好ましくは、パラコッカス属微生物由来物、より好ましくはパラコッカス・カロティニファシエンス由来物であってよい。
　例えば、微生物からのアドニルビンおよびアドニキサンチンの抽出および精製方法として下記の方法が挙げられる。パラコッカス・カロティニファシエンス（Paracoccus carotinifaciens）の乾燥菌体を、アセトンを使用する室温抽出に供し、抽出液をエバポレーターで濃縮し、濃縮液が二層に分離したところで濃縮物にヘキサン－クロロホルム（１：１）混合液を加えて良く混和した後、分液操作により有機溶媒層を得る。前記有機溶媒層をエバポレーターで濃縮乾固する。濃縮乾固物をクロロホルムに溶解し、シリカゲルカラムにて各カロテノイドを分離する。例えばアセトン：ヘキサン（３：７）３００ｍＬで溶出する画分をさらにＨＰＬＣ（Ｓｈｉｍ－ｐａｃｋ　ＰＲＣ－ＳＩＬ（株式会社島津製作所）、アセトン：ヘキサン（３：７））で精製することでアドニルビン遊離体を得ることができる。また、アセトンで溶出する画分をさらにＨＰＬＣ（Ｓｈｉｍ－ｐａｃｋ　ＰＲＣ－ＳＩＬ、アセトン：ヘキサン（４：６））で精製することで、アドニキサンチン遊離体を得ることができる。
　さらに、本発明の組成物においては、本発明のカロテノイドとしてのアドニルビンおよびアドニキサンチンに加えてアスタキサンチンを含むカロテノイド混合物を使用してもよい。上記カロテノイド混合物は、カンタキサンチン、アステロイデノン、β－カロテン、エキネノンおよび３－ヒドロキシエキエノンをさらに含むことが好ましい。例えば、特開２００７－２６１９７２号公報、特開２００９－５０２３７号公報に記載の方法に準じてパラコッカス・カロティニファシエンスの乾燥菌体から抽出したカロテノイド混合物は、アスタキサンチン、アドニルビンおよびアドニキサンチンを含み、好ましくはカンタキサンチン、アステロイデノン、β－カロテン、エキネノンおよび３－ヒドロキシエキエノンをさらに含む。
　本発明の組成物におけるカロテノイドの含有量は、本発明の効果を妨げない限り特に限定されないが、組成物全体に対し、例えば、０．０１～５０質量％が挙げられ、好ましくは０．０５～４０質量％、より好ましくは０．０７～３０質量％、さらに好ましくは０．１～２０質量％である。本発明の組成物におけるアドニルビンおよび／またはアドニキサンチンの含有量の測定は、ＨＰＬＣ法により、Toxicol Rep. 2014 Aug 25;1:582-588.の記載に準じて実施される。
　本発明の組成物は、上記カロテノイドと共に、所望により経口上許容可能または薬学的に許容可能な添加剤を配合した組成物として提供することができる。上記添加剤として、溶剤、溶解補助剤、溶解剤、滑沢剤、乳化剤、等張化剤、安定化剤、保存剤、防腐剤、界面活性剤、調整剤、キレート剤、ｐＨ調整剤、緩衝剤、賦形剤、増粘剤、着色剤、芳香剤または香料等が挙げられる。
　本発明の組成物は、上記カロテノイドおよび所望により経口上許容可能または薬学的に許容可能な添加剤を混合、溶解、分散、懸濁するなどの公知の手法により、調製することができる。また、本発明の組成物の調製においては、本発明の効果を妨げない限り、上記手法により調製された混合物、溶解物、分散物、懸濁物などに、均質化処理や殺菌処理を施してもよい。
　また、本発明の組成物の形態は、本発明の効果を妨げない限り、特に制限されず、固形状、半固形状（ペースト、ゲルを含む）または液状（油状、スラリー状を含む）であってもよいが、固形状または液状であることが好ましい。
　また、本発明の組成物の剤形は、本発明の効果を妨げない限り特に限定されないが、注射剤、錠剤（例えば、裸錠、糖衣錠、フィルムコーティング錠、腸溶錠、徐放錠、口腔内崩壊錠、舌下錠、チュアブル錠等）、カプセル剤（例えば、硬カプセル、軟カプセル）、エリキシル剤、丸剤、粉剤、散剤、顆粒剤、水剤、トローチ剤、シロップ剤、ドライシロップ剤、乳剤、懸濁剤、液剤、吸入剤、エアロゾル剤、粉末吸入剤、坐剤、軟膏、クリーム剤、ゲル剤、貼付剤、バップ剤、ローション剤、点滴剤、眼軟膏剤、点眼剤、点鼻剤等が挙げられる。本発明の組成物の剤形は、経口摂取または投与用の剤形であることが好ましく、錠剤、カプセル剤、丸剤、粉剤、散剤、顆粒剤、シロップ剤、ドライシロップ剤、乳剤、液剤、懸濁剤、水剤、トローチ剤等が挙げられる。
　本発明の組成物の投与または摂取方法としては、特に限定されないが、点滴、静脈内注射、筋肉内注射、皮下注射、皮内注射等の注射、経口、経粘膜、経皮、鼻腔内、口腔内等による投与または摂取が挙げられ、好ましくは、経口摂取または投与である。
　本発明の組成物としては、食品もしくは飲料等の飲食品、飲食品添加物、飼料、医薬品、医薬部外品、または化粧料が挙げられ、摂取の簡便性の観点から飲食品が好ましい。
　本発明の飲食品は、本発明の組成物をそのまま飲食品として調製したもの、各種タンパク質、糖類、脂肪、微量元素、ビタミン類、他の有効成分（例えば、乳酸菌、バチルス属菌（Bacillus）等の細菌、酵母等の真菌、食物繊維、ＤＨＡまたはＥＰＡ）等を更に配合したもの、本発明の組成物を溶液状等の液状、半液体状または固体状にしたものでよく、また、本発明の組成物を一般の飲食品へ添加したものであってもよい。
　上記飲食品としては、具体的には、例えば、即席麺、レトルト食品、缶詰、電子レンジ食品、即席スープ・みそ汁類、フリーズドライ食品等の即席食品類；清涼飲料、果汁飲料、野菜飲料、豆乳飲料、コーヒー飲料、茶飲料、粉末飲料、濃縮飲料、アルコール飲料等の飲料類；栄養ドリンク；パン、パスタ、麺、ケーキミックス、パン粉等の小麦粉製品；飴、グミ、ゼリー、キャラメル、チューイングガム、チョコレート、クッキー、ビスケット、ケーキ、パイ、スナック、クラッカー、和菓子、デザート菓子等の菓子類；栄養バー；ソース、トマト加工調味料、風味調味料、調理ミックス、たれ類、ドレッシング類、つゆ類、カレー・シチューの素類等の調味料；加工油脂、バター、マーガリン、マヨネーズ等の油脂類；乳飲料、ヨーグルト類、乳酸菌飲料、アイスクリーム類、クリーム類等の乳製品；農産缶詰、ジャム・マーマレード類、シリアル等の農産加工品；ハム、ベーコン、ソーセージ、焼き豚等の畜肉加工食品：冷凍食品等を例示することができるが、これらに限定されない。
　本発明の飲食品には、健康食品、サプリメント、機能性食品（例えば、特定保健用食品、栄養機能食品または機能性表示食品を含む）、栄養補助食品、特別用途食品（例えば、病者用食品、乳児用調製粉乳、妊産婦、授乳婦用粉乳またはえん下困難者・咀嚼困難者用食品を含む）または乳児用液体調製乳（乳児用液体ミルクともいう）も包含される。後述のように、本発明の組成物は出血性血管障害の予防または抑制作用、神経障害の予防または抑制作用を有することから、出血性血管障害の予防または抑制のための飲食品、神経障害の予防または抑制のための飲食品が提供される。すなわち、本発明の飲食品は、血圧または動脈硬化が気になるヒトのための飲食品として提供できる。さらに、機能性食品等の飲食品において、「血圧が高めの方に」、「動脈硬化がある方に」、「血管年齢を若返らせるための」、「血管を強くするための」、「脳血管を強くするための」等の表示を付して提供してもよい。
　本発明の組成物の摂取量または投与量は、特に限定されず、組成物の処方、カロテノイドの種類、純度、対象の種類、対象の年齢または体重、症状、摂取または投与時間、組成物の形態、摂取または投与方法、他のカロテノイドまたは薬剤の組み合わせ等に依存して決定できる。また、本発明の組成物は、出血性血管障害または神経障害の予防または抑制のための有効量となるように、１日の摂取量単位の形態から構成されることが好ましい。例えば、本発明の組成物を経口摂取する場合、アドニルビン、アドニキサンチンおよびそれらの薬学的に許容可能な塩から選択される一種以上のカロテノイドが体重６０ｋｇの成人１人１日当たり０．０１～１００００ｍｇ、好ましくは０．１～１０００ｍｇ、より好ましくは１～１００ｍｇの範囲の摂取量または投与量となるように該カロテノイドを組成物に配合することができる。本発明のカロテノイドと組み合わせて用いる他のカロテノイドまたは薬剤も、それぞれ臨床上用いられる摂取量または投与量を基準として適宜決定できる。
　また、本発明の組成物の１日の摂取量または投与量は、上述の組成物の摂取量または投与量と同様、組成物の処方等に応じて適宜選択されるものである。本発明の組成物の１日の摂取量または投与量は、例えば１回または複数回で対象に摂取させるかまたは投与してもよいが、１回で対象に摂取させるかまたは投与することが好ましい。したがって、本発明の組成物の１日の摂取または投与回数は、１日に１～５回であり、好ましくは、１日に１～３回であり、より好ましくは、１日に１回である。
　一つの態様によれば、本発明の組成物を適用する対象は、本発明の効果を妨げない限り、特に限定されないが、好ましくは哺乳動物であり、より好ましくはヒト、犬、猫である。当該対象は健常者（健常動物）であっても患者（患者動物）であってもよい。
　本発明の組成物によれば、血管内皮細胞、好ましくは脳血管内皮細胞の細胞死を抑えることができ、出血、好ましくは脳出血の発症頻度を減らすことができる。したがって、本発明の組成物によれば、出血性血管障害を予防するかまたは抑制することが可能である。したがって、本発明の一つの態様によれば、本発明の組成物は、出血性血管障害の予防または抑制のための組成物として提供される。ここで、本明細書における「障害の予防」とは、想定される悪化に対して事前に備え、障害の発生を未然に防ぐことを意味する。本明細書における「障害の抑制」とは、障害の症状の進展または悪化を抑制して病態の進行を止める、緩和するまたは遅延させることを意味する。
　上記出血性血管障害とは、血管異常に基づく出血性障害であり、例えば、出血性脳血管障害、出血性膀胱炎、出血性胃潰瘍、出血性腸炎が挙げられ、好ましくは、出血性脳血管障害である。さらに、出血性脳血管障害としては、好適には脳出血、くも膜下出血、出血性脳梗塞が挙げられる。また、上記出血性血管障害は、細胞死に起因する障害であることが好ましい。
　また、本発明の組成物は、好ましくは、出血性血管障害の重症度の上昇抑制または低減のために用いられる。重症度とは、各障害の評価尺度に基づく症状の程度をいう。出血性血管障害が出血性脳血管障害である場合の重症度としては、例えば、以下の重症度分類が挙げられる：Japan Coma Scale（JCS）（太田富雄，和賀志郎，半田肇，他．急性期意識障害の新しいgradingとその表現法．（いわゆる3-3-9度方式）　第3 回脳卒中の外科研究会講演集1975；pp61-69）、Glasgow Coma Scale（GCS）（Teasdale G, Jennett B. Assessment of coma and impaired consciousness. A practical scale. Lancet 1974；2：81-84）、modified NIH Stroke Scale（NIHSS）（2001）（Lyden PD, Lu M, Levine SR, Brott TG, Broderick J：NINDS rtPA Stroke Study Group. A modified National Institutes of Health Stroke Scale for use in stroke clinical trials:preliminary reliability and validity. Stroke 2001；32：1310-1317）、Japan Stroke Scale（JSS）（第5版）（日本脳卒中学会・脳卒中重症度スケール（急性期）の発表にあたって. 脳卒中1997；19：1-5）、脳卒中運動機能障害重症度スケール（JSS-M）（日本脳卒中学会・脳卒中運動障害重症度スケール（JSS-M）の発表にあたって. 脳卒中1999；21：352-356）、脳卒中情動障害スケール（JSS-E）（日本脳卒中学会・脳卒中感情障害（うつ・情動障害）スケール. 脳卒中2003；25：205-214）、脳卒中うつスケール（JSS-D）（日本脳卒中学会・脳卒中感情障害（うつ・情動障害）スケール. 脳卒中2003；25：205-214）、脳卒中感情障害（うつ・情動障害）スケール同時評価表（JSS-DE）（日本脳卒中学会・脳卒中感情障害（うつ・情動障害）スケール. 脳卒中2003；25：205-214）、日本版modified Rankin Scale（mRS）判定基準書（van Swieten JC, Koudstaal PJ, Visser MC, Schouten HJ, van Gijn J. Interobserver agreement for the assessment of handicap in stroke patients.Stroke 1988；19：604-607、篠原幸人，峰松一夫，天野隆弘，大橋靖雄：mRS信頼性研究グループ．modified Rankin Scaleの信頼性に関する研究－日本語版判定基準書および問診表の紹介．脳卒中2007；29：6-13、Shinohara Y, Minematsu K, Amano T, Ohashi Y. Modified Rankin Scale with expanded guidance scheme and interview questionnaire: Interrater agreement and reproducibility of assessment. Cerevrovasc Dis 2006；21：271-278）、Stroke Impairment Assessment Set（SIAS）（里宇明元, 園田茂, 道免和久；千野直一編著. 脳卒中患者の機能評価－SIASとFIMの実際. Springer；1997）、Brunnstromの運動検査による回復段階（Brunnstrom S. Moter testing procedures in hemiplegia：based on sequential recovery stages. Phys Ther 1966；46：357-375、石田暉. 脳卒中後遺症の評価スケール. 脳と循環1999；4：151-159）、Barthel Indexおよびその判定基準（Mahoney FI, Barthel DW. Functional evaluation: the Barthel Index. Md St Med J 1965；14：61-65、石田暉. 脳卒中後遺症の評価スケール. 脳と循環1999；4：151-159）。ここで、本発明における出血性脳血管障害の重症度分類としては、modified NIH Stroke Scale（NIHSS）（2001）とされる。
　さらに、上記出血性血管障害としては、下記 (a)～(e)の少なくとも一種に起因するものが挙げられる：
(a) 細胞外シグナル調節キナーゼ（ＥＲＫ）、好ましくはＥＲＫ１／２、のリン酸化の増大またはリン酸化ＥＲＫの発現量の増加（好ましくは、総ＥＲＫの発現量に対するリン酸化ＥＲＫの発現量の増加）、
(b) ＥＲＫシグナル由来の細胞死、
(c) ヘムオキシゲナーゼ－１（ＨＯ－１）の低減（好ましくは、ＨＯ－１タンパク質の発現量の低減）、
(d) 血管内皮カドヘリン（ＶＥ－カドヘリン）の低減（好ましくは、ＶＥ－カドヘリンタンパク質の発現量の低減）、
(e) コラゲナーゼにより誘導される細胞死。
　本発明の組成物は、下記実施例に示すように、出血性血管障害における下記(i)～(v) の少なくとも一種において使用することができる：
(i) ＥＲＫのリン酸化の低減またはリン酸化ＥＲＫの発現量の低減（好ましくは、総ＥＲＫの発現量に対するリン酸化ＥＲＫの発現量の低減）、
(ii) ＥＲＫシグナル由来の細胞死の抑制、
(iii) ＨＯ－１の増加（好ましくは、ＨＯ－１タンパク質の発現量の増加）、
(iv) ＶＥ－カドヘリンの増加（好ましくは、ＶＥ－カドヘリンタンパク質の発現量の増加）、
(v) コラゲナーゼにより誘導される細胞死の抑制。
　したがって、本発明の別の態様によれば、本発明の組成物は、上記（a）～（e）の少なくとも一種に起因する疾患に関し、上記(i)～(v)の少なくとも一種において使用することができる。さらに、本発明の組成物は、上記（a）～（e）の少なくとも一種に起因する疾患を改善することができる。本明細書における「改善」とは、確立された病態の改善という「治療」の意味を含むだけでなく、「予防」の意味も含む。
　アドニキサンチンおよび／またはアドニルビンのメカニズムの詳細は現時点では明らかでない。しかしながら、アドニキサンチンおよび／またはアドニルビンは、血管内皮細胞における細胞死誘発性の障害に対して、ＨＯ－１の発現量を増加させるかまたはリン酸化ＥＲＫの発現量を減少させることにより、ＶＥ－カドヘリンによる細胞間結合を強化させ、血管内皮細胞へのダメージを軽減しているものと推定される。
　また、本発明の組成物によれば、神経障害を予防するかまたは抑制することが可能である。したがって、本発明の一つの態様によれば、本発明の組成物は、神経障害の予防または抑制のための組成物として提供される。
　上記神経障害としては、好適には脳神経障害が挙げられる。さらに、脳神経障害としては、好適にはアルツハイマー病、パーキンソン病、レビー小型認知症、ハンチントン病が挙げられる。また、上記神経障害は、細胞死に起因する障害であることが好ましい。
　さらに、本発明の組成物によれば、対象が出血性血管障害（好ましくは出血性脳血管障害）に罹患した場合においても、神経細胞（好ましくは脳神経細胞）の保護効果により、神経障害（好ましくは脳神経障害）を予防または抑制することが可能である。
　したがって、上記神経障害は、上記出血性血管障害に由来する障害、例えば、上記出血性血管障害の合併症であってよく、さらに、上記神経障害は血管障害により漏出した血液成分による障害であってよい。
　また、本発明の組成物は、好ましくは、神経障害の重症度の上昇抑制または低減のために用いられる。神経障害が脳神経障害である場合の重症度としては、例えば、以下の重症度分類が挙げられる：Japan Coma Scale（JCS）（太田富雄，和賀志郎，半田肇，他．急性期意識障害の新しいgradingとその表現法．（いわゆる3-3-9度方式）　第3 回脳卒中の外科研究会講演集1975；pp61-69）、Glasgow Coma Scale（GCS）（Teasdale G, Jennett B. Assessment of coma and impaired consciousness. A practical scale. Lancet 1974；2：81-84）、modified NIH Stroke Scale（NIHSS）（2001）（Lyden PD, Lu M, Levine SR, Brott TG, Broderick J：NINDS rtPA Stroke Study Group. A modified National Institutes of Health Stroke Scale for use in stroke clinical trials:preliminary reliability and validity. Stroke 2001；32：1310-1317）、Japan Stroke Scale（JSS）（第5版）（日本脳卒中学会・脳卒中重症度スケール（急性期）の発表にあたって. 脳卒中1997；19：1-5）、脳卒中運動機能障害重症度スケール（JSS-M）（日本脳卒中学会・脳卒中運動障害重症度スケール（JSS-M）の発表にあたって. 脳卒中1999；21：352-356）、脳卒中情動障害スケール（JSS-E）（日本脳卒中学会・脳卒中感情障害（うつ・情動障害）スケール. 脳卒中2003；25：205-214）、脳卒中うつスケール（JSS-D）（日本脳卒中学会・脳卒中感情障害（うつ・情動障害）スケール. 脳卒中2003；25：205-214）、脳卒中感情障害（うつ・情動障害）スケール同時評価表（JSS-DE）（日本脳卒中学会・脳卒中感情障害（うつ・情動障害）スケール. 脳卒中2003；25：205-214）、日本版modified Rankin Scale（mRS）判定基準書（van Swieten JC, Koudstaal PJ, Visser MC, Schouten HJ, van Gijn J. Interobserver agreement for the assessment of handicap in stroke patients.Stroke 1988；19：604-607、篠原幸人，峰松一夫，天野隆弘，大橋靖雄：mRS信頼性研究グループ．modified Rankin Scaleの信頼性に関する研究－日本語版判定基準書および問診表の紹介．脳卒中2007；29：6-13、Shinohara Y, Minematsu K, Amano T, Ohashi Y. Modified Rankin Scale with expanded guidance scheme and interview questionnaire: Interrater agreement and reproducibility of assessment. Cerevrovasc Dis 2006；21：271-278）、Stroke Impairment Assessment Set（SIAS）（里宇明元, 園田茂, 道免和久；千野直一編著. 脳卒中患者の機能評価－SIASとFIMの実際. Springer；1997）、Brunnstromの運動検査による回復段階（Brunnstrom S. Moter testing procedures in hemiplegia：based on sequential recovery stages. Phys Ther 1966；46：357-375、石田暉. 脳卒中後遺症の評価スケール. 脳と循環1999；4：151-159）、Barthel Indexおよびその判定基準（Mahoney FI, Barthel DW. Functional evaluation: the Barthel Index. Md St Med J 1965；14：61-65、石田暉. 脳卒中後遺症の評価スケール. 脳と循環1999；4：151-159）。ここで、本発明における脳神経障害の重症度分類としては、modified NIH Stroke Scale（NIHSS）（2001）とされる。
　本発明の別の態様によれば、アドニルビン、アドニキサンチンおよびそれらの薬学的に許容可能な塩から選択される一種以上のカロテノイドを有効量含んでなる組成物を対象に投与することまたは摂取させることを含んでなる、対象の出血性血管障害を予防するかまたは抑制する方法が提供される。本発明のさらに別の態様によれば、アドニルビン、アドニキサンチンおよびそれらの薬学的に許容可能な塩から選択される一種以上のカロテノイドの有効量を、それを必要とする対象に投与することまたは摂取させることを含んでなる、対象の出血性血管障害を予防するかまたは抑制する方法が提供される。ここで、「有効量」とは、１日の摂取量単位における、アドニルビン、アドニキサンチンおよびそれらの薬学的に許容可能な塩から選択される一種以上のカロテノイドの含有量等と同様に設定することができる。上記出血性血管障害としては、出血性脳血管障害、出血性膀胱炎、出血性胃潰瘍、または出血性腸炎が挙げられ、出血性脳血管障害が好ましい。さらに、出血性脳血管障害としては、好適には脳出血、くも膜下出血、または出血性脳梗塞が挙げられる。また、上記出血性血管障害としては、下記(a)～(e)の少なくとも一種に起因するものが挙げられる：(a) ＥＲＫのリン酸化の増大またはリン酸化ＥＲＫの発現量の増加、(b) ＥＲＫシグナル由来の細胞死、(c) ＨＯ－１の低減、(d) ＶＥ－カドヘリンの低減、(e) コラゲナーゼにより誘導される細胞死。本発明のさらに別の態様によれば、アドニルビン、アドニキサンチンおよびそれらの薬学的に許容可能な塩から選択される一種以上のカロテノイドを有効量含んでなる組成物を対象に投与することまたは摂取させることを含んでなる、対象における、下記(i)～(v)の少なくとも一種の方法が提供される： (i) ＥＲＫのリン酸化の低減またはリン酸化ＥＲＫの発現量の低減方法、(ii) ＥＲＫシグナル由来の細胞死の抑制方法、(iii) ＨＯ－１の増加方法、(iv) ＶＥ－カドヘリンの増加方法、および(v) コラゲナーゼにより誘導される細胞死の抑制方法。本発明のさらに別の態様によれば、アドニルビン、アドニキサンチンおよびそれらの薬学的に許容可能な塩から選択される一種以上のカロテノイドの有効量を、それを必要とする対象に投与することまたは摂取させることを含んでなる、対象における、上記(i)～(v)の少なくとも一種の方法が提供される。本発明のさらに別の態様によれば、アドニルビン、アドニキサンチンおよびそれらの薬学的に許容可能な塩から選択される一種以上のカロテノイドを有効量含んでなる組成物を対象に投与することまたは摂取させることを含んでなる、対象の神経障害を予防または抑制する方法が提供される。本発明のさらに別の態様によれば、アドニルビン、アドニキサンチンおよびそれらの薬学的に許容可能な塩から選択される一種以上のカロテノイドの有効量を、それを必要とする対象に投与することまたは摂取させることを含んでなる、対象の神経障害を予防または抑制する方法が提供される。上記神経障害としては、好適には、脳神経障害が挙げられる。さらに、脳神経障害としては、アルツハイマー病、パーキンソン病、レビー小型認知症、ハンチントン病が挙げられる。本発明のさらに別の態様によれば、アドニルビン、アドニキサンチンおよびそれらの薬学的に許容可能な塩から選択される一種以上のカロテノイドを有効量含んでなる組成物を対象に投与することまたは摂取させることを含んでなる、上記（a）～（e）の少なくとも一種に起因する疾患を改善する方法が提供される。本発明のさらに別の態様によれば、アドニルビン、アドニキサンチンおよびそれらの薬学的に許容可能な塩から選択される一種以上のカロテノイドの有効量を、それを必要とする対象に投与することまたは摂取させることを含んでなる、対象における、上記（a）～（e）の少なくとも一種に起因する疾患を改善する方法が提供される。本発明のさらに別の態様によれば、上述の、出血性血管障害を予防または抑制する方法、(i)～(v)の少なくとも一種の方法、神経障害を予防または抑制する方法、上記（a）～（e）の少なくとも一種に起因する疾患を改善する方法は、対象が健常者である場合、ヒトに対する医療行為を除く非治療的方法とされる。ここで、ヒトに対する医療行為とは、医師等の処方を必要として、ヒトに対して医薬品を摂取させる（投与する）行為等を意味する。本発明の、出血性血管障害を予防または抑制する方法、(i)～(v)の少なくとも一種の方法、神経障害を予防または抑制する方法、上記（a）～（e）の少なくとも一種に起因する疾患を改善する方法は、本発明の組成物について、本明細書に記載された内容に従って実施することができる。
　また、本発明の別の態様によれば、出血性血管障害の予防または抑制のための、アドニルビン、アドニキサンチンおよびそれらの薬学的に許容可能な塩から選択される一種以上のカロテノイドの使用が提供される。本発明のさらに別の態様によれば、下記(i)～(v)の少なくとも一種のための、アドニルビン、アドニキサンチンおよびそれらの薬学的に許容可能な塩から選択される一種以上のカロテノイドの使用が提供される： (i) ＥＲＫのリン酸化の低減またはリン酸化ＥＲＫの発現量の低減、(ii) ＥＲＫシグナル由来の細胞死の抑制、(iii) ＨＯ－１の増加、(iv) ＶＥ－カドヘリンの増加、および(v) コラゲナーゼにより誘導される細胞死の抑制。本発明のさらに別の態様によれば、神経障害の予防または抑制のための、アドニルビン、アドニキサンチンおよびそれらの薬学的に許容可能な塩から選択される一種以上のカロテノイドの使用が提供される。本発明のさらに別の態様によれば、下記（a）～（e）の少なくとも一種に起因する疾患を改善するための、アドニルビン、アドニキサンチンおよびそれらの薬学的に許容可能な塩から選択される一種以上のカロテノイドの使用が提供される： (a) ＥＲＫのリン酸化の増大またはリン酸化ＥＲＫの発現量の増加、(b) ＥＲＫシグナル由来の細胞死、(c) ＨＯ－１の低減、(d) ＶＥ－カドヘリンの低減、(e) コラゲナーゼにより誘導される細胞死。
　また、本発明の別の態様によれば、出血性血管障害の予防または抑制のための組成物の製造における、アドニルビン、アドニキサンチンおよびそれらの薬学的に許容可能な塩から選択される一種以上のカロテノイドの使用が提供される。本発明の別の態様によれば、神経障害の予防または抑制のための組成物の製造における、アドニルビン、アドニキサンチンおよびそれらの薬学的に許容可能な塩から選択される一種以上のカロテノイドの使用が提供される。
　また、本発明の別の態様によれば、出血性血管障害の予防または抑制のための、アドニルビン、アドニキサンチンおよびそれらの薬学的に許容可能な塩から選択される一種以上のカロテノイドが提供される。本発明の別の態様によれば、神経障害の予防または抑制のための、アドニルビン、アドニキサンチンおよびそれらの薬学的に許容可能な塩から選択される一種以上のカロテノイドが提供される。
　上記の使用、化合物（カロテノイド）の態様は何れも、本発明の組成物または方法に関する記載に準じて実施することができる。
　以下、調製例、試験例により、本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術範囲は、これらの例示に限定されるものではない。なお、特に記載しない限り、本発明で用いられる全部のパーセンテージや比率は質量による。また、特に記載しない限り、本明細書に記載の単位や測定方法はJIS規格による。
調製例１：アドニキサンチン、アドニルビンおよびアスタキサンチンの調製
　特開２０１２－１５８５６９号公報に記載の方法に準じて、アドニルビン遊離体およびアドニキサンチン遊離体の調製を行った。以下に簡単に記載する。
　パラコッカス・カロティニファシエンス(Paracoccus carotinifaciens)の乾燥菌体を、アセトンを使用する室温抽出に供した。得られた抽出液をエバポレーターで濃縮し、濃縮液が二層に分離したところで濃縮物にヘキサン-クロロホルム（１：１）混合液を加えて良く混和した後、分液操作により有機溶媒層を得た。
　得られた有機溶媒層をエバポレーターで濃縮乾固した。濃縮乾固物をクロロホルムに溶解し、シリカゲルカラムにて各カロテノイドを分離した。具体的には、アセトン：ヘキサン（３：７）３００ｍＬで溶出する画分をさらにＨＰＬＣ（Ｓｈｉｍ－ｐａｃｋ　ＰＲＣ－ＳＩＬ（株式会社島津製作所）、アセトン：ヘキサン（３：７））で精製し、アドニルビン遊離体（以下、単にアドニルビンともいう）を得た。また、アセトン：ヘキサン（５：５）で溶出する画分を濃縮し、４℃で放置することで、アスタキサンチン遊離体を結晶として得た（以下、単にアスタキサンチンともいう）。アセトンで溶出する画分をさらにＨＰＬＣ（Ｓｈｉｍ－ｐａｃｋ　ＰＲＣ－ＳＩＬ、アセトン：ヘキサン（４：６））で精製し、アドニキサンチン遊離体（以下、単にアドニキサンチンともいう）を得た。
調製例２：アドニキサンチン含有培地、アドニルビン含有培地およびアスタキサンチン含有培地の調製
　調製例１で得られたアドニキサンチン、アドニルビンまたはアスタキサンチンをＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド、ナカライテスク社）に溶解させた。その後、上記アドニキサンチン、アドニルビンまたはアスタキサンチンをそれぞれ０．１μＭ、０．３μＭ、または１μＭとなるように、ＥＢＭ－２（ＬＯＮＺＡ社）培地中または１％もしくは１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ、ＶＡＬＥＡＮＴ社）含有ダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ、ナカライテスク社）中に添加し、アドニキサンチン含有培地、アドニルビン含有培地またはアスタキサンチン含有培地を得た。対照培地としてはアドニキサンチン、アドニルビンおよびアスタキサンチンを含まないＥＢＭ－２培地または１％もしくは１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）含有ダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）を用いた。なお、ヒト脳毛細血管内皮細胞の培養にはＥＢＭ－２培地を、ヒト脳神経芽細胞腫の培養には１％または１０％ウシ胎仔血清含有ダルベッコ変法イーグル培地を用いた。
試験例１：ヒト脳毛細血管内皮細胞（ＨＢＭＶＥＣｓ）におけるアドニキサンチン、アドニルビンのコラゲナーゼ誘発細胞死の抑制効果の検討
（ａ）アドニキサンチンの抑制効果の検討
　ＥＢＭ－２培地　１００μＬを入れた９６ウェルプレート（ＦＡＬＣＯＮ社）に４９５０細胞／ウェルとなるようにヒト脳毛細血管内皮細胞（ＨＢＭＶＥＣｓ）（Ｐｒｉｍａｒｙ　Ｎｏｒｍａｌ　Ｈｕｍａｎ　Ｂｒａｉｎ　Ｍｉｃｒｏｖａｓｃｕｌａｒ　Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ　Ｃｅｌｌｓ、ＤＳファーマバイオメディカル社）を播種し、コンフルエントになるまで、５％ＣＯ２雰囲気下、３７℃で培養した。その後、上記培地を調製例２で得た０．１μＭ、０．３μＭ、もしくは１μＭのアドニキサンチン含有培地または対照培地　１００μＬに交換した。２４時間後に、培地を、３０Ｕ／ｍＬのコラゲナーゼ（シグマアルドリッチ社）を含む０．１μＭ、０．３μＭ、もしくは１μＭのアドニキサンチン含有培地または対照培地に交換した。前記培地の量は１ウェルあたり１００μＬであった。４時間コラゲナーゼに暴露した後、ヘキスト３３３４２（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｐｒｏｂｅｓ社）／ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｐｒｏｂｅｓ社）染色による細胞死評価を行った（ｎ＝６）。具体的には、８μＭのヘキスト３３３４２と２μＭのＰＩとの存在下で３７℃にて１５分間培養した。その後、ヘキスト陽性細胞およびＰＩ陽性細胞をオリンパスＩＸ７０倒立落射蛍光顕微鏡（オリンパス社）を用いて撮影した。その後、解析ソフトＩｍａｇｅＪを用いて総細胞およびＰＩ陽性細胞数を計測した。視野中の総細胞数に対するＰＩ陽性細胞数の割合を死細胞の割合として表した。１ウェルあたり２枚の代表的視野を記録した。
　細胞死の評価結果を図１（ａ）に示す。測定値は平均値±標準誤差で表した。図１（ａ）に示される通り、アドニキサンチン含有培地群はいずれの濃度においても対照培地・コラゲナーゼ添加群と比較して有意に細胞死を抑制した（＊＊：p<0.01 vs 対照培地・コラゲナーゼ非添加群（Ｗｅｌｃｈのｔ検定）、＃：p<0.05 vs 対照培地・コラゲナーゼ添加群（ダネットの検定）、＃＃：p<0.01 vs 対照培地・コラゲナーゼ添加群（ダネットの検定））。
（ｂ）アドニルビンの抑制効果の検討
　アドニキサンチンをアドニルビンとする以外は試験例１（ａ）と同様に行った。
　細胞死の評価結果を図１（ｂ）に示す。測定値は平均値±標準誤差で表した。図１（ｂ）に示される通り、アドニルビンはいずれの濃度においても対照培地・コラゲナーゼ添加群と比較して有意に細胞死を抑制した（＊＊：p<0.01 vs 対照培地・コラゲナーゼ非添加群（Ｗｅｌｃｈのｔ検定）、＃：p<0.05 vs 対照培地・コラゲナーゼ添加群（ダネットの検定）、＃＃：p<0.01 vs 対照培地・コラゲナーゼ添加群（ダネットの検定））。
（ｃ）アスタキサンチンの抑制効果の検討
　アドニキサンチンをアスタキサンチンとし、アスタキサンチンの濃度を０．１μＭ、０．３μＭとする以外は試験例１（ａ）と同様に行った。細胞死を評価した結果、アスタキサンチンはいずれの濃度においても対照培地・コラゲナーゼ添加群と比較して有意な差を示さないものであった。
試験例２：コラゲナーゼ処理したヒト脳毛細血管内皮細胞（ＨＢＭＶＥＣｓ）におけるアドニキサンチン、アドニルビン添加による各種タンパク質発現量の検討
（ａ）アドニキサンチン添加によるＥＲＫ、ＨＯ－１、ＶＥ－カドヘリンの発現量の検討
　ＥＢＭ－２（ＬＯＮＺＡ社）培地５００μＬを入れた２４ウェルプレート（ＦＡＬＣＯＮ社）に５０，０００細胞／ウェルとなるようにヒト脳毛細血管内皮細胞（ＨＢＭＶＥＣｓ）（Ｐｒｉｍａｒｙ　Ｎｏｒｍａｌ　Ｈｕｍａｎ　Ｂｒａｉｎ　Ｍｉｃｒｏｖａｓｃｕｌａｒ　Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ　Ｃｅｌｌｓ、ＤＳファーマバイオメディカル社）を播種し、コンフルエントになるまで、５％ＣＯ２雰囲気下３７℃で培養した。その後、培地を調製例２で得た１μＭのアドニキサンチン含有培地または対照培地５００μＬに交換した。２４時間後に、培地を、３０Ｕ／ｍＬのコラゲナーゼ（シグマアルドリッチ社）を含む１μＭのアドニキサンチン含有培地または対照培地に交換した。前記培地の量は１ウェルあたり５００μＬであった。４時間コラゲナーゼに暴露した後、サンプリングを行い、ウエスタンブロット法によりタンパク質発現量を確認した。
　具体的には、サンプリングにより得られた細胞を、１％プロテアーゼ阻害剤カクテルおよび１％のホスファターゼ阻害剤カクテル２および３（Ｓｉｇｍａ　Ａｌｄｒｉｃｈ社）を含む放射免疫沈降アッセイ緩衝液（Ｓｉｇｍａ　Ａｌｄｒｉｃｈ社、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、ＵＳＡ）で溶解し、回収した。その後、溶解したサンプルを１５，０００ｒｐｍ、４℃で２０分間遠心分離した。タンパク質濃度は、ウシ血清アルブミン標準を用いたＰｒｏｔｅｉｎアッセイキット（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を用いて測定した。得られた細胞抽出液は、常法に従ってＳＤＳサンプルバッファー中で５分間煮沸し、２０％ドデシル硫酸ナトリウム－ポリアクリルアミドグラジエントゲル電気泳動にかけ、次いでポリビニリデンジフルオライド（ＰＶＤＦ）膜（Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ－Ｐ：Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）に転写した。タンパク質を転写したＰＶＤＦ膜は、ブロッキングバッファー（５％脱脂粉乳を含むトリスリン酸緩衝液）を用いて室温で１時間ブロッキングし、その後、一次抗体を用いて２４時間インキュベートした。その後、ＰＶＤＦ膜を、洗浄バッファー（０．１％　Ｔｗｅｅｎ－２０を含むトリスリン酸緩衝液）で３回洗浄し、ペルオキシダーゼ－ラベルしたヤギ抗マウスＩｇＧ抗体（ＫＰＬ社）を用いて１時間インキュベートした。最後に、ＬＡＳ－４０００　ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ　ｉｍａｇｅ　ａｎａｌｙｚｅｒ　（Ｆｕｊｉ　Ｆｉｌｍ社）およびＭｕｌｔｉ　ｇａｕｇｅ　ｖｅｒ．　３．０．（Ｆｕｊｉ　Ｆｉｌｍ社）を用いて化学発光法によりシグナルの検出および解析を行った。ここで、一次抗体には、抗総ＥＲＫ（ｔＥＲＫ）抗体（ｐ４４／４２　ＭＡＰＫ　（Ｅｒｋ１／２）　Ａｎｉｔｂｏｄｙ、Ｃｅｌｌ　Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）、抗リン酸化ＥＲＫ（ｐＥＲＫ）抗体（Ｐｈｏｓｐｈｏ－ｐ４４／４２　ＭＡＰＫ　（Ｅｒｋ１／２）　（Ｔｈｒ２０２／Ｔｙｒ２０４）　Ａｎｔｉｂｏｄｙ、Ｃｅｌｌ　Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）、抗ＶＥ－カドヘリン抗体（Ｒａｂｂｉｔ　ＶＥ－ｃａｄｈｅｒｉｎ　ａｎｔｉｂｏｄｙ、Ａｂｃａｍ社）を使用した。また、対照の一次抗体として抗β－アクチン抗体（Mouseβ-actin antibody、シグマアルドリッチ社）を使用した。その後、検出したシグナルの濃度を、ｔＥＲＫ、βアクチンにより補正した（ｐＥＲＫ／ｔＥＲＫ、ＶＥ－カドヘリン／βアクチンの算出）。
　ウェスタンブロッティングの結果を図２（ａ）～（ｃ）に示す。図２（ａ）に示される通り、アドニキサンチンはＥＲＫのリン酸化を有意に抑制した（＊：p<0.05 vs 対照培地・コラゲナーゼ非添加群（Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定）、＃：p<0.05 vs 対照培地・コラゲナーゼ添加群（Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定））。図２（ｂ）に示される通り、アドニキサンチンはＶＥ－カドヘリンの発現量を有意に増加させた（＃：p<0.05 vs 対照培地・コラゲナーゼ添加群（Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定））。
（ｂ）アドニルビン添加によるＥＲＫの発現量の検討
　アドニキサンチンをアドニルビンとする以外は試験例２（ａ）と同様に行った。
　細胞死の評価結果を図２（ｃ）に示す。測定値は平均値±標準誤差で表した。図２（ｃ）に示される通り、アドニルビンはＥＲＫのリン酸化を有意に抑制した。（＊：p<0.05 vs 対照培地・コラゲナーゼ非添加群（Ｗｅｌｃｈのｔ検定）、＃：p<0.05 vs 対照培地・コラゲナーゼ添加群（Ｗｅｌｃｈのｔ検定））。
試験例３：ヒト脳毛細血管内皮細胞（ＨＢＭＶＥＣｓ）におけるアドニキサンチン、アドニルビンのヘモグロビン誘発細胞死の抑制効果の検討
　ＥＢＭ－２（ＬＯＮＺＡ社）培地１００μＬを入れた９６ウェルプレート（ＦＡＬＣＯＮ社）に４９５０細胞／ウェルとなるようにヒト脳毛細血管内皮細胞（ＨＢＭＶＥＣｓ）（Ｐｒｉｍａｒｙ　Ｎｏｒｍａｌ　Ｈｕｍａｎ　Ｂｒａｉｎ　Ｍｉｃｒｏｖａｓｃｕｌａｒ　Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ　Ｃｅｌｌｓ、ＤＳファーマバイオメディカル社）を播種し、コンフルエントになるまで、５％ＣＯ２雰囲気下、３７℃で培養した。その後、上記培地を調製例２で得た１μＭアドニキサンチン含有培地、１μＭアドニルビン含有培地または対照培地１００μＬに交換した。２４時間後に、培地を、１０μＭのヘモグロビン（シグマアルドリッチ社）を含む、１μＭアドニキサンチン含有培地、１μＭアドニルビン含有培地または対照培地に交換した。前記培地の量は１ウェルあたり１００μＬであった。４時間ヘモグロビンに暴露した後、試験例１と同様にヘキスト３３３４２／ＰＩ染色による細胞死評価を行った（ｎ＝６）。
　細胞死の評価結果を図３に示す。測定値は平均値±標準誤差で表した。図３に示される通り、アドニキサンチンおよびアドニルビンは対照培地・ヘモグロビン添加群と比較して有意に細胞死を抑制した（＊＊：p<0.01 vs 対照培地・ヘモグロビン非添加群（チューキーの検定）、＃：p<0.05 vs 対照培地・ヘモグロビン添加群（チューキーの検定）、＃＃：p<0.01 vs 対照培地・ヘモグロビン添加群（チューキーの検定））。
試験例４：ヘモグロビン処理したヒト脳毛細血管内皮細胞（ＨＢＭＶＥＣｓ）におけるアドニキサンチン添加によるＨＯ－１、ＶＥ－カドヘリンの発現量の検討
　ヘモグロビンの添加を１μＭアドニキサンチン含有培地または対照培地に交換してから６時間後とする以外は試験例３と同様に行った。その後、試験例２と同様にサンプリングを行い、ウエスタンブロット法によりタンパク質発現量を確認した（ｎ＝４）。具体的には、サンプリングにより得られた細胞を１％プロテアーゼ阻害剤カクテルおよび１％のホスファターゼ阻害剤カクテル２および３を含む放射免疫沈降アッセイ緩衝液で溶解し、回収した。その後、溶解したサンプルを１５，０００ｒｐｍ、４℃で２０分間遠心分離した。タンパク質濃度は、ウシ血清アルブミン標準を用いたＰｒｏｔｅｉｎアッセイキットを用いて測定した。得られた細胞抽出液は、常法に従ってＳＤＳサンプルバッファー中で５分間煮沸し、２０％ドデシル硫酸ナトリウム－ポリアクリルアミドグラジエントゲル電気泳動にかけ、次いでポリビニリデンジフルオライド（ＰＶＤＦ）膜（Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ－Ｐ：Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）に転写した。タンパク質を転写したＰＶＤＦ膜は、ブロッキングバッファー（５％脱脂粉乳を含むトリスリン酸緩衝液）を用いて室温で１時間ブロッキングし、その後、一次抗体を用いて２４時間インキュベートした。その後、ＰＶＤＦ膜は、洗浄バッファー（０．１％　Ｔｗｅｅｎ－２０を含むトリスリン酸緩衝液）で３回洗浄し、ペルオキシダーゼ－ラベルしたヤギ抗ラビットＩｇＧ抗体（ＫＰＬ社）を用いて１時間インキュベートした。最後に、ＬＡＳ－４０００　ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ　ｉｍａｇｅ　ａｎａｌｙｚｅｒ　（Ｆｕｊｉ　Ｆｉｌｍ社）およびＭｕｌｔｉ　ｇａｕｇｅ　ｖｅｒ．　３．０．（Ｆｕｊｉ　Ｆｉｌｍ社）を用いて製造者マニュアルに従ってシグナルの検出および解析を行った。ここで、一次抗体には、抗ＨＯ－１抗体（Ｒａｂｂｉｔ　ＨＯ－１　ａｎｔｉｂｏｄｙ、Ｓａｎｔａ　Ｃｒｕｚ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）、抗ＶＥ－カドヘリン抗体（Ｒａｂｂｉｔ　ＶＥ－ｃａｄｈｅｒｉｎ　ａｎｔｉｂｏｄｙ、Ａｂｃａｍ社）を使用した。また、対照として抗β－アクチン抗体を用いた。その後、検出したシグナルの濃度をβアクチンにより補正した（ＨＯ－１／βアクチン、ＶＥ－カドヘリン／βアクチンの算出）。
　ウェスタンブロッティングの結果を図４（ａ）、（ｂ）に示す。測定値は平均値±標準誤差で表した。図４（ａ）に示される通り、アドニキサンチンはＶＥ－カドヘリンの発現量を有意に増加させた（＊：p<0.05 vs 対照培地・ヘモグロビン添加群（Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定）、＃：p<0.05 vs 対照培地・ヘモグロビン添加群（Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定））。図４（ｂ）に示される通り、アドニキサンチンはＨＯ－１の発現量を有意に増加させた（＃＃：p<0.01 vs 対照培地・ヘモグロビン添加群（Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定））。
試験例５：ヒト脳毛細血管内皮細胞（ＨＢＭＶＥＣｓ）におけるアドニキサンチン、アドニルビンのＬＰＳ誘発細胞死の抑制効果の検討
　ＥＢＭ－２（ＬＯＮＺＡ社）培地１００μＬを入れた９６ウェルプレート（ＦＡＬＣＯＮ社）に４９５０細胞／ウェルとなるようにヒト脳毛細血管内皮細胞（ＨＢＭＶＥＣｓ）を播種し、コンフルエントになるまで、５％ＣＯ２雰囲気下、３７℃で培養した。その後、上記培地を調製例２で得た１μＭアドニキサンチン含有培地、１μＭアドニルビン含有培地または対照培地１００μＬに交換した。２４時間後に、培地を、１μＭのリポポリサッカライド（ＬＰＳ、シグマアルドリッチ社）を含む、１μＭアドニキサンチン含有培地、１μＭアドニルビン含有培地または対照培地に交換した。前記培地の量は１ウェルあたり１００μＬであった。８時間ＬＰＳに暴露した後、試験例１と同様にヘキスト３３３４２／ＰＩ染色による細胞死評価を行った（ｎ＝６）。
　細胞死の評価結果を図５に示す。測定値は平均値±標準誤差で表した。図５に示される通り、アドニキサンチンおよびアドニルビンは対照培地・ＬＰＳ添加群と比較して有意に細胞死を抑制した（＊＊：p<0.01 vs 対照培地・ＬＰＳ非添加群（チューキーの検定）、＃＃：p<0.01 vs 対照培地・ＬＰＳ添加群（チューキーの検定））。
試験例６：ヒト脳神経芽細胞腫におけるアドニキサンチンのＬＰＳ誘発細胞死の抑制効果の検討
　１０％ウシ胎仔血清含有ダルベッコ変法イーグル培地１００μＬを入れた９６ウェルプレートに１０，０００細胞／ウェルとなるようにヒト脳神経芽細胞腫（ＳＨ－ＳＹ５Ｙ細胞、Ｅｕｒｏｐｅａｎ　Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｃｅｌｌ　Ｃｕｌｔｕｒｅ）を播種し、５％ＣＯ２雰囲気下、３７℃で２４時間培養した。その後、培地を調製例２で得た０．１μＭ、０．３μＭ、または１μＭのアドニキサンチンを含有する１％ＦＢＳ　ＤＭＥＭに交換した。１時間後に、培地を、１μＭのＬＰＳ（シグマアルドリッチ社）を含む、０．１μＭ、０．３μＭ、または１μＭのアドニキサンチンを含有する１％ＦＢＳ　ＤＭＥＭまたは対照培地に交換した。前記培地の量は１ウェルあたり１００μＬであった。２４時間ＬＰＳに暴露した後、試験例１と同様にヘキスト３３３４２／ＰＩ染色による細胞死評価を行った（ｎ＝６）。
　細胞死の評価結果を図６に示す。測定値は平均値±標準誤差で表した。図６に示される通り、アドニキサンチンは対照培地・ＬＰＳ添加群と比較して有意に細胞死を抑制した（＊＊：p<0.01 vs 対照培地・ＬＰＳ非添加群（Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定）、＃＃：p<0.01 vs 対照培地・ＬＰＳ添加群（ダネットの検定））。

Claims (15)

  1. 　アドニルビン、アドニキサンチンおよびそれらの薬学的に許容可能な塩から選択される一種以上のカロテノイドを含んでなる、出血性血管障害の予防または抑制のための組成物。
  2. 　前記カロテノイドが、パラコッカス・カロティニファシエンス(Paracoccus carotinifaciens)由来である、請求項１に記載の組成物。
  3. 　前記出血性血管障害が、出血性脳血管障害、出血性膀胱炎、出血性胃潰瘍、および出血性腸炎からなる群から選択される少なくとも一種である、請求項１または２に記載の組成物。
  4. 　前記出血性脳血管障害が、脳出血、くも膜下出血、および出血性脳梗塞からなる群から選択される少なくとも一種である、請求項１～３のいずれか一項に記載の組成物。
  5. 　前記出血性血管障害の重症度の上昇抑制または低減のための、請求項１～４のいずれか一項に記載の組成物。
  6. 　下記(i)～(v)の少なくともいずれか一つにおいて使用するための、請求項１～５のいずれか一項に記載の組成物：
    (i) ＥＲＫのリン酸化の低減またはリン酸化ＥＲＫの発現量の低減、
    (ii) ＥＲＫシグナル由来の細胞死の抑制、
    (iii) ＨＯ－１の増加、
    (iv) ＶＥ－カドヘリンの増加、
    (v) コラゲナーゼにより誘導される細胞死の抑制。
  7. 　神経障害の予防または抑制のための、請求項１～６のいずれか一項に記載の組成物。
  8. 　前記神経障害が脳神経障害である、請求項７に記載の組成物。
  9. 　前記脳神経障害が、アルツハイマー病、パーキンソン病、レビー小型認知症、およびハンチントン病からなる群から選択される少なくとも一種である、請求項８に記載の組成物。
  10. 　前記神経障害の重症度の上昇抑制または低減のための、請求項７～９のいずれか一項に記載の組成物。
  11. 　前記組成物が飲食品または食品添加物である、請求項１～１０のいずれか一項に記載の組成物。
  12. 　前記組成物が機能性食品である、請求項１～１１のいずれか一項に記載の組成物。
  13. 　前記組成物が医薬品である、請求項１～１２のいずれか一項に記載の組成物。
  14. 　アドニルビン、アドニキサンチンおよびそれらの薬学的に許容可能な塩から選択される一種以上のカロテノイドの有効量を、それを必要とする対象に投与することまたは摂取させることを含んでなる、対象の出血性血管障害を予防するかまたは抑制する方法。
  15. 　出血性血管障害の予防または抑制のための、アドニルビン、アドニキサンチンおよびそれらの薬学的に許容可能な塩から選択される一種以上のカロテノイドの使用。
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