JP6026148B2 - No産生促進組成物およびそれを含有する冷え性改善剤 - Google Patents
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Description
黒酢は、鹿児島県霧島市で古くから製造され、もっぱら調味料として用いられていた。近年、黒酢の脂質代謝改善作用、赤血球変形能改善作用、血圧調節作用、血糖調節作用、抗酸化作用など様々な作用が報告され、人々の健康志向の高まりとともに黒酢を希釈して飲用されるようになっている。特許文献1,2には、黒酢が血液流動性改善作用を有することが記載されている。
[1](1)アスペルギルス属菌由来のプロテアーゼおよび/またはバチルス属菌由来のプロテアーゼを用いて卵白を分解して得られる卵白加水分解物と、(2)ケイヒおよび/または黒酢を有効成分として含有することを特徴とするNO産生促進組成物。
[2]前記アスペルギルス属菌由来のプロテアーゼがアスペルギルス・ニガー由来の酸性プロテアーゼであり、前記バチルス属菌由来のプロテアーゼがバチルス・ズブチリス由来の中性プロテアーゼ、バチルス・ズブチリス由来のアルカリ性プロテアーゼ、バチルス・ステアロサーモフィラス由来の中性プロテアーゼから選ばれる少なくとも1種であることを特徴とする前記[1]に記載のNO産生促進組成物。
[3]前記卵白加水分解物100質量部に対して、ケイヒを5〜200質量部および/または黒酢を固形分として100〜2000質量部含有することを特徴とする前記[1]または[2]に記載のNO産生促進組成物。
[4]前記[1]〜[3]のいずれかに記載のNO産生促進組成物を含有することを特徴とする冷え性改善剤。
(1)アスペルギルス属菌由来のプロテアーゼおよび/またはバチルス属菌由来のプロテアーゼを用いて卵白を分解して得られる卵白加水分解物
(2)ケイヒおよび/または黒酢
また、液体製剤は、本発明のNO産生促進組成物の有効成分を、例えば、水、エタノール、グリセリン、単シロップ、またはこれらの混液などに、溶解または分散させることにより調製される。これらの製剤には、甘味料、防腐剤、粘滑剤、希釈剤、緩衝剤、着香剤、着色剤のような添加剤が添加されていてもよい。
(1)卵白加水分解物の調製
表1に示すプロテアーゼ(表中「酵素」)を用いて脱糖卵白液32g(固形分約2.4g)を酵素処理し、卵白加水分解物を調製した。表1に記載の各条件で酵素反応を行った後、反応液を加熱(90℃、10分間)して酵素を失活させ、濾過して液部を回収し、乾燥粉末化してサンプル1〜7を得た。
ウシ血管内皮細胞(BAEC、Cell Systems社)から常法にしたがってcDNAを調製し、これを鋳型としてウシ由来eNOS遺伝子(全長)をクローニングした。クローニングしたeNOS遺伝子(全長)を、プラスミドベクターpcDNA3.1(+)(invitrogen社)のマルチクローニングサイトのEcoRIサイトへ挿入した。このベクターをヒト胎児腎臓細胞(HEK293、理化学研究所)に、「FuGENE 6 Transfection Reagent」(商品名、Roche社製)を用いてトランスフェクションした後、薬剤(G418、ナカライテスク社)選抜を行い、eNOSを安定的に発現する細胞株(B36株)を取得した。このB36株において、抗ヒトeNOS抗体(R&D SYSTEMS, Inc.)を用いたウエスタンブロッティングおよび免疫染色を行い、ほぼすべての細胞で安定的にeNOSが発現していることを確認した。また、通常のヒト臍帯静脈内皮細胞(HUVEC)よりもeNOS発現量が増加していることも確認した。
上記(1)で得られたサンプル1〜7、または酵素処理していない脱糖卵白をPBS(−)にそれぞれ溶解し(濃度:1000μg/mL)サンプル溶液を調製した。コントロールにはPBS(−)を用いた。
上記(2)で作製したeNOS発現細胞(B36株)を24ウェルプレートに播種し、3日間前培養した後、アルギニン(100μM)を含むPBS(−)を用いて洗浄を行った。続いて、サンプル溶液またはPBS(−)を各ウェルに250μL添加して15分間反応させた。反応後、cell lysis bufferを加えて細胞を溶解し、培養上清および細胞を破砕して得られた細胞破砕液の混合液をNO産生量の測定に供した。NO産生量の測定には、「NO2/NO3 Assay Kit−FX」(商品名、株式会社同仁化学研究所製)を用いた。コントロール(PBS(−))のNO産生量を1として、各サンプルのNO産生量の相対比を算出した。
(1)卵白加水分解物の調製
表2に示す複数のプロテアーゼ(表中「酵素」)を併用して酵素処理を行い、卵白加水分解物を調製した。なお、パパイン処理後にpHを8に調整し、その後はpHを調整せずに酵素処理を行った。表2に記載の各条件で酵素反応を行った後、反応液を加熱(90℃、10分間)して酵素を失活させ、濾過して液部を回収し、乾燥粉末化してサンプル8〜10を得た。得られたサンプル8〜10のNO産生量を実施例1と同様の方法で測定し、コントロール(PBS(−))に対する相対比を算出した。
(1)卵白加水分解物の調製
脱糖卵白液1000g(固形分約100g)に、表3に示す5種類のプロテアーゼ(表中「酵素」)を順次添加して酵素処理を行い、卵白加水分解物を調製した。なお、パパイン処理後に反応液のpHを8に調整し、その後はpH調整を行わず酵素処理を行った。酵素反応終了後、酵素を失活させ、濾過して液部を回収した。得られた液部を活性炭で脱色処理し、噴霧乾燥して卵白加水分解物52gを得た。この卵白加水分解物を100、500、または1000μg/mLとなるようにPBS(−)に溶解して卵白加水分解物溶液を調製し、実施例1と同様の方法で各サンプルのNO産生量を測定し、コントロール(PBS(−))に対する相対比を算出した。
ケイヒは日本粉末薬品株式会社製「ケイヒエキスパウダーV」を購入して使用した。卵白加水分解物は実施例3で調製した卵白加水分解物を使用した。NO産生量の測定は、実施例1と同様の方法で行った。卵白加水分解物は、卵白加水分解物のPBS(−)溶液を終濃度1000μg/mLとなるように添加した。ケイヒは、「ケイヒエキスパウダーV」をPBS(−)に溶解した後ろ過してケイヒ溶液を調製し、終濃度100、500、または1000μg/mLとなるように添加した。コントロールにはPBS(−)を用いた。有意差検定にはt検定を用いた。
黒酢はサントレック株式会社製「濃縮黒酢粉末」を購入して使用した。「濃縮黒酢粉末」は、液体の黒酢を約10倍濃縮し、乾燥させたものである。卵白加水分解物は実施例3で調製した卵白加水分解物を使用した。NO産生量の測定は、実施例1と同様の方法で行った。卵白加水分解物は、卵白加水分解物のPBS(−)溶液を終濃度1000μg/mLとなるように添加した。黒酢は、「濃縮黒酢粉末」をPBS(−)に溶解した後ろ過して黒酢溶液を調製し、濃縮黒酢粉末濃度として終濃度が100、500、または1000μg/mLとなるように添加した。コントロールにはPBS(−)を用いた。有意差検定にはt検定を用いた。
Claims (4)
- (1)アスペルギルス属菌由来のプロテアーゼおよび/またはバチルス属菌由来のプロ
テアーゼを用いて卵白を分解して得られる卵白加水分解物と、(2)ケイヒおよび/また
は黒酢を有効成分として含有することを特徴とするNO産生促進用組成物(但し、冷え性改善用組成物である場合を除く)。 - 前記アスペルギルス属菌由来のプロテアーゼがアスペルギルス・ニガー由来の酸性プロ
テアーゼであり、前記バチルス属菌由来のプロテアーゼがバチルス・ズブチリス由来の中
性プロテアーゼ、バチルス・ズブチリス由来のアルカリ性プロテアーゼ、バチルス・ステ
アロサーモフィラス由来の中性プロテアーゼから選ばれる少なくとも1種であることを特
徴とする請求項1に記載のNO産生促進用組成物。 - 前記卵白加水分解物100質量部に対して、ケイヒを5〜200質量部および/または
黒酢を固形分として100〜2000質量部含有することを特徴とする請求項1または2
に記載のNO産生促進用組成物。 - 前記卵白加水分解物100質量部に対して、黒酢を固形分として500〜1000質量部含有することを特徴とする請求項1〜3のいずれかに記載のNO産生促進用組成物。
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2012
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