WO2015137500A1 - 抗肥満剤 - Google Patents

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WO2015137500A1
WO2015137500A1 PCT/JP2015/057559 JP2015057559W WO2015137500A1 WO 2015137500 A1 WO2015137500 A1 WO 2015137500A1 JP 2015057559 W JP2015057559 W JP 2015057559W WO 2015137500 A1 WO2015137500 A1 WO 2015137500A1
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WO
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astaxanthin
obesity
fucoxanthin
acid
agent
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PCT/JP2015/057559
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栄次 山下
雅史 細川
和夫 宮下
Original Assignee
富士化学工業 株式会社
国立大学法人北海道大学
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Publication date
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    • A61K31/12—Ketones
    • A61K31/122—Ketones having the oxygen directly attached to a ring, e.g. quinones, vitamin K1, anthralin
    • A—HUMAN NECESSITIES
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    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00

Definitions

  • the present invention relates to an anti-obesity agent that exhibits an excellent anti-obesity effect.
  • BMI body mass index
  • mazindol an appetite suppressant
  • mazindol an appetite suppressant
  • Use period is within 3 months ”. Therefore, development of drugs that can be used with low regulations for many patients is being promoted.
  • Patent Document 1 discloses an anti-obesity agent containing an extract of a Cucurbitaceae plant as a component derived from a natural product.
  • Patent Document 2 discloses an anti-obesity agent containing a legume extract as a component derived from a natural product.
  • An object of the present invention is to provide an anti-obesity agent that exhibits an excellent anti-obesity action.
  • the present invention has been made by finding that an excellent anti-obesity effect is exhibited by using astaxanthin and fucoxanthin together.
  • an antiobesity agent containing astaxanthin and fucoxanthin as active ingredients is provided.
  • a method for treating, improving or preventing obesity by administering a composition containing astaxanthin and fucoxanthin to a subject in need of treatment, improvement or prevention of obesity.
  • a method for suppressing or reducing white adipose tissue by administering a composition containing astaxanthin and fucoxanthin to a subject in need of improvement or prevention of obesity.
  • the mass ratio of the astaxanthin content to the fucoxanthin content is preferably 1: 4 to 1: 1.
  • Astaxanthin is preferably an ester with a fatty acid. Astaxanthin is preferably obtained from Haematococcus algae.
  • the anti-obesity agent is preferably applied as a white adipose tissue reducing agent.
  • an excellent anti-obesity action can be exhibited.
  • Astaxanthin which is one of the active ingredients of the anti-obesity agent of this embodiment, is a kind of carotenoid, similar to ⁇ -carotene and lycopene, and is classified into xanthophylls. Astaxanthin may be any of those derived from natural products or those obtained by synthesis.
  • Examples of those derived from natural products include crustacean shells such as shrimp, krill and crabs, eggs and organs, various seafood skins and eggs, algae such as Haematococcus algae, yeasts such as Phaffia yeast, paracoccus Mention may be made of marine bacteria such as bacteria, and those obtained from seed plants such as Fukujukusa and Kinso-hana.
  • crustacean shells such as shrimp, krill and crabs, eggs and organs, various seafood skins and eggs
  • algae such as Haematococcus algae
  • yeasts such as Phaffia yeast
  • paracoccus Mention may be made of marine bacteria such as bacteria, and those obtained from seed plants such as Fukujukusa and Kinso-hana.
  • Natural extracts and chemically synthesized products are commercially available and are readily available.
  • Astaxanthin can also be obtained, for example, by culturing Phaffia yeast, Haematococcus algae, Paracoccus bacteria, etc. in an appropriate medium according to a known method.
  • Haematococcus algae is most preferable because it is easy to culture and extract, contains astaxanthin at the highest concentration, and has high productivity.
  • Haematococcus algae is a green algae belonging to the Volboxic Chlamydomonas family, and since it is a green algae, it has a high chlorophyll content and is green, and it swims in water with two flagella. Under starvation conditions, dormant spores are formed, the astaxanthin content is increased, and red spheres are formed.
  • hematococcus algae in any state can be used, but it is preferable to use hematococcus algae that have become dormant spores containing a large amount of astaxanthin.
  • Haematococcus pluvialis is preferable.
  • a sealed culture method in which foreign microorganisms are not mixed or propagated and other contaminants are not mixed is preferable.
  • a method of culturing using a culture medium having a closed dome-shaped, conical or cylindrical culture apparatus and a gas discharge device movable within the apparatus see, for example, International Publication No. 99/50384 pamphlet
  • a method of culturing by irradiating light from the inside into a sealed culture apparatus and a method of culturing in a flat plate culture tank are suitable.
  • the method for extracting and purifying astaxanthin from the culture or the natural products such as the crustaceans can be purified using a known method such as a solvent extraction method and a chromatography method.
  • a solvent extraction method for example, since diester type astaxanthin is an oil-soluble substance, an astaxanthin-containing component can be extracted from a natural product containing astaxanthin with an oil-soluble organic solvent such as acetone, alcohol, ethyl acetate, benzene, or chloroform.
  • supercritical extraction can be performed using carbon dioxide, propane, water, or the like.
  • the solvent is removed according to a conventional method to obtain a mixed concentrate of monoester type astaxanthin and diester type astaxanthin.
  • the resulting concentrate may be further purified if desired.
  • these astaxanthin extraction and purification methods one kind may be used alone, or two or more kinds may be used in combination.
  • the extract of astaxanthin obtained by the above method and the powder or aqueous solution containing them, or dry products such as Phaffia yeast, hematococcus algae, paracoccus bacteria, and crushed products thereof can be used.
  • Astaxanthin is 3,3′-dihydroxy- ⁇ , ⁇ -carotene-4,4′-dione and has a stereoisomer.
  • three stereoisomers of (3R, 3′R) -astaxanthin, (3R, 3 ′S) -astaxanthin and (3S, 3 ′S) -astaxanthin are known. Any of them can be used.
  • astaxanthin includes astaxanthin and / or its ester unless otherwise specified.
  • the ester of astaxanthin includes a monoester form and / or a diester form. Astaxanthin is known to be a highly safe compound with no observed mutagenicity.
  • the anti-obesity agent containing astaxanthin as one of the active ingredients of this embodiment at least one of astaxanthin free form, monoester form and diester form described above can be used. Diesters are physically more stable than free and monoesters because the two hydroxyl groups are protected by ester bonds, and are less susceptible to oxidative degradation in anti-obesity agents. However, it is considered that when it is taken into the living body, it is rapidly hydrolyzed to astaxanthin by an in vivo enzyme and exhibits an effect.
  • Examples of monoesters of astaxanthin include esters esterified with lower, medium chain or higher saturated fatty acids, or lower, medium chain or higher unsaturated fatty acids.
  • Specific examples of the lower, medium chain or higher saturated fatty acid, or the lower, medium chain or higher unsaturated fatty acid include acetic acid, lauric acid, myristic acid, pentadecanoic acid, palmitic acid, palmitooleic acid, heptadecanoic acid and elaidin.
  • Acid ricinoleic acid, betroceric acid, vaccenic acid, eleostearic acid, punicic acid, licanoic acid, parinaric acid, gadolic acid, 5-eicosenoic acid, 5-docosenoic acid, cetoleic acid, erucic acid, 5,13-docosadienoic acid , Ceracolic acid, decenoic acid, steric acid, dodecenoic acid, oleic acid, stearic acid, eicosapentaenoic acid, docosahexaenoic acid, linoleic acid, linolenic acid, arachidonic acid and the like.
  • these fatty acids from the viewpoint of easy availability, an ester form with palmitic acid having 16 carbon atoms or stearic acid having 18 carbon atoms is preferable.
  • astaxanthin monoesters include, for example, amino acids such as glycine and alanine; monovalent or polyvalent carboxylic acids such as acetic acid and citric acid; inorganic acids such as phosphoric acid and sulfuric acid; sugars such as glucoside; glycerosugar fatty acids and sphingos.
  • sugar fatty acids such as sugar fatty acids
  • fatty acids such as glycero fatty acids
  • monoesters esterified with glycerophosphoric acid and the like the salt of the said monoester is also included when it can be considered.
  • the fatty acid derivatives include phospholipid type, alcohol type, ether type, sucrose ester type and polyglycerin ester type of the above fatty acid.
  • the diester of astaxanthin for example, the lower saturated fatty acid, medium chain saturated fatty acid, higher saturated fatty acid, lower unsaturated fatty acid, medium chain unsaturated fatty acid, higher unsaturated fatty acid, amino acid, monovalent or polyvalent carboxylic acid, inorganic acid
  • salts of the diesters are also included.
  • the fatty acid include the fatty acids exemplified in the monoester column of the astaxanthin.
  • Examples of the diester of glycerophosphoric acid include saturated fatty acid esters of glycerophosphoric acid, or glycerophosphoric acid esters containing fatty acids selected from higher unsaturated fatty acids, unsaturated fatty acids or saturated fatty acids.
  • Vitamin Es can be blended with the anti-obesity agent of this embodiment.
  • Vitamin E includes vitamin E, tocotrienol and derivatives thereof.
  • oil containing at least one of them may be used.
  • Specific examples of vitamin E include dl- ⁇ -tocopherol, d- ⁇ -tocopherol, dl- ⁇ -tocopherol acetate, d- ⁇ -tocopherol acetate, dl- ⁇ -tocopherol succinate, and d- ⁇ -tocopherol succinate.
  • dl- ⁇ -tocopherol dl- ⁇ -tocopherol acetate, dl- ⁇ -tocopherol succinate, dl- ⁇ -tocopherol nicotinate, ⁇ -tocotrienol, ⁇ -tocotrienol, and ⁇ -tocotrienol are preferred.
  • One of these vitamin Es may be used alone, or two or more thereof may be used in combination.
  • Fucoxanthin which is one of the active ingredients of the anti-obesity agent of the present embodiment, is one of the non-provitamin A carotenoids, and among the naturally occurring carotenoids, carotenoids are the most abundant along with ⁇ -carotene. one of. Any fucoxanthin derived from a natural product or obtained by synthesis can be used. In natural products, fucoxanthin is abundant in seaweeds such as brown algae and other unequal hair algae. Examples of brown algae include kombu, wakame, and mozuku.
  • fucoxanthin includes fucoxanthin and / or a derivative thereof.
  • Derivatives of fucoxanthin include, for example, fucoxanthin isomer, fucoxanthin or deacetylated form of fucoxanthin isomer, fucoxanthin or fucoxanthinol oxabicyclohexane ring-opening derivative, fucoxanthin 19 ' -Alkaloyloxylated derivatives and substitutions of fucoxanthin with sulfo groups.
  • Examples of the deacetylated form of fucoxanthin or an isomer of fucoxanthin include fucoxanthinol.
  • fucoxanthin When fucoxanthin is taken orally, it is converted into fucoxanthinol by lipase or the like in the digestive tract and absorbed from the digestive tract.
  • fucoxanthin containing these derivatives 1 type may be used independently and 2 or more types may be used in combination.
  • fucoxanthins containing these derivatives fucoxanthin and fucoxanthinol are preferable from the viewpoint of excellent activity and availability.
  • the method for extracting and purifying fucoxanthin from the natural product various known methods can be adopted. For example, it can be purified using a solvent extraction method and a chromatography method.
  • a solvent extraction method for example, a fucoxanthin-containing component can be extracted from a natural product with an oil-soluble organic solvent such as acetone, alcohol, ethyl acetate, benzene, or chloroform. Further, supercritical extraction can be performed using carbon dioxide, propane, water, or the like.
  • Examples of the chromatography include column chromatography, high performance liquid chromatography (HPLC), and thin layer chromatography.
  • Examples of the carrier used for chromatography include a silica-based resin and a synthetic adsorbent.
  • Examples of the silica-based resin include octadecyl silylated silica gel (ODS), phenyl silylated silica gel, and octyl silylated silica gel.
  • ODS octadecyl silylated silica gel
  • phenyl silylated silica gel phenyl silylated silica gel
  • octyl silylated silica gel octyl silylated silica gel.
  • the mass ratio of the astaxanthin content to the fucoxanthin content is preferably 1: 4 to 1: 1, more preferably 1: 3 to 1: 1, and still more preferably 1: 2.5 to 1:
  • the range is 1.5. By defining within this range, the anti-obesity effect can be further improved.
  • the anti-obesity agent may contain components other than those described above as long as the anti-obesity action is not impaired. Examples of components other than the above include excipients, bases, emulsifiers, stabilizers, fragrances, solvents, and the like.
  • the anti-obesity agent may be liquid or solid. Although it does not specifically limit as a dosage form, For example, a powder, a powder, a granule, a tablet, a capsule, a pill, a liquid agent etc. are mentioned.
  • the anti-obesity agent of this embodiment exhibits an excellent obesity improvement or prevention action due to a synergistic effect with the active ingredients astaxanthin and fucoxanthin. More specifically, PGC1 ⁇ and a heat production factor UCP1 (mitochondrial uncoupling protein 1) that are factors related to mitochondrial activity in the living body are expressed more strongly by the interaction of astaxanthin and fucoxanthin which are active ingredients, and finally Mainly reduces the mass of white adipose tissue (WAT).
  • WAT white adipose tissue
  • the anti-obesity agent of this embodiment can be applied as a therapeutic or prophylactic agent for obesity aimed at improving obesity or exerting a preventive action.
  • the anti-obesity agent may be configured as a white adipose tissue reducing agent, PGC1 ⁇ expression increasing agent, or UCP1 expression increasing agent for the purpose of exhibiting the more specific effects described above.
  • anti-obesity agent of the present embodiment are not particularly limited, and include pharmaceuticals, quasi-drugs, foods and drinks, external preparations for skin, cosmetics and the like intended to obtain the above-described effects. It is done.
  • the application form of the anti-obesity agent of the present embodiment is not particularly limited.
  • an oral or enteral agent intended for oral or enteral administration an injection intended for intravascular or subtracheal administration,
  • a topical skin preparation for application to the skin.
  • An anti-obesity agent can be ingested mainly by blending an effective amount as an active ingredient such as pharmaceuticals and quasi-drugs for treating or preventing obesity. Ingestion for the purpose of treating or preventing obesity is particularly useful mainly for increasing fat such as subcutaneous fat or visceral fat. Further, the anti-obesity agent is applied to the skin by blending an effective amount in the topical skin preparation for the purpose of suppressing an increase in subcutaneous fat with a lot of white adipose tissue. In addition, anti-obesity agents are applied to the skin by adding an effective amount in cosmetics for the purpose of suppressing the increase in subcutaneous fat with a lot of white adipose tissue. Such application to the skin surface with an external preparation for skin or cosmetics is particularly useful for increasing subcutaneous fat.
  • any administration method such as intravascular administration or transdermal administration can be employed in addition to administration by ingestion (oral intake).
  • oral intake oral intake
  • a pharmaceutical dosage form For example, a powder, a powder agent, a granule, a tablet, a capsule, a pill, a suppository, a liquid agent, an injection, etc. are mentioned.
  • Foods and beverages containing the anti-obesity agent of the present invention can be used as dietary supplements, functional indication foods, health functional foods, special purpose foods, health foods, general foods, beverages, and the ease of intake and the amount of intake are determined.
  • Dietary supplements, functional foods, health foods, and special-purpose foods are preferred because they are easy to use, and solid dosage forms such as tablets, fast-disintegrating tablets, capsules, granules, fine granules, syrups and suspensions, etc. It can be taken in liquid dosage form.
  • the food and drink containing the anti-obesity agent may further contain milk protein, soy protein, egg albumin protein, or the like, or egg white oligopeptide, soy hydrolyzate, or a mixture of amino acids alone, which is a degradation product thereof.
  • nutritional additives such as amino acids, vitamins and minerals, sweeteners, spices, fragrances, and pigments may be added to improve the nutritional balance and flavor during intake. Good.
  • the form of the food or drink of the present invention is not limited to these.
  • the functional food is a food having anti-obesity efficacy that is permitted / designated by the government or a public organization, for example, health functional foods such as nutritional functional foods and foods for specified health use, functional display foods, Special foods.
  • health functional foods such as nutritional functional foods and foods for specified health use, functional display foods, Special foods.
  • a name and a rule change with situations and times what is essentially the same is included in the present invention.
  • Examples of forms of general foods, ie, foods and drinks include margarine, butter, butter sauce, cheese, fresh cream, shortening, lard, ice cream, yogurt, dairy products, sauce products, fish products, pickles, natto, boiled beans, fried beans , Tofu, mapo tofu, mixed nuts, french fries, potato chips, snacks, kakimochi, popcorn, sprinkle, chewing gum, chocolate, pudding, jelly, gummy candy, candy, drop, caramel, bread, castella, cake, donut, Biscuits, cookies, crackers, baked goods, macaroni, pasta, ramen, buckwheat, udon, salad oil, instant soup, dressing, eggs, mayonnaise, miso, etc.
  • non-carbonated beverages such as fruit juice drinks, soft drinks, sports drinks, etc.
  • non-carbonated beverages may be mentioned tea, coffee, non-alcoholic or liqueurs such as cocoa, alcoholic beverages such as medicinal liquor, energy drinks, milk, added to general foods such as soy milk.
  • astaxanthin and fucoxanthin are blended together with raw materials for general foods, and are manufactured by processing according to conventional methods.
  • the amount of astaxanthin and fucoxanthin varies depending on the form of the food and is not particularly limited. In general, the amount of astaxanthin and fucoxanthin used can be appropriately selected by those skilled in the art depending on the type of food and drink.
  • the dosage of this anti-obesity agent is appropriately determined in consideration of BMI, body weight, usage, application age, sex, and other conditions.
  • the amount of the active ingredient in the anti-obesity agent is preferably 0.0001 to 10% by mass, more preferably 0.001 to 1% by mass of the dietary amount.
  • the intake amount of the active ingredient is 0.0001% by mass or more, the anti-obesity action by the active ingredient can be more effectively enhanced.
  • the intake amount of the active ingredient is 10% by mass or less, it can be taken more economically.
  • an effective amount of the anti-obesity agent of the present embodiment is added to the external skin preparation, it is applied to the living body by applying the external skin preparation to the skin.
  • a dosage form of the external preparation for skin a known dosage form can be appropriately employed depending on the purpose of anti-obesity.
  • the dosage form include ointments, liquids, sprays, sheets, powders, and powders.
  • additives for example, excipients, bases, stabilizers and the like may be blended.
  • the anti-obesity agent of this embodiment is added to cosmetics in an effective amount, it is used by adding active ingredients to various cosmetic materials.
  • cosmetics include skin lotion, emulsion, foundation, face powder, blusher, lipstick, mascara, eyeliner, eye shadow, cleansing, nail polish, hair cosmetic and the like.
  • the anti-obesity agent of this embodiment contains astaxanthin and fucoxanthin as active ingredients. Therefore, an excellent anti-obesity action can be exhibited by the synergistic effect of the active ingredients.
  • the anti-obesity agent of this embodiment exhibits an excellent white adipose tissue reducing action. Therefore, the anti-obesity agent can be preferably applied as a white adipose tissue reducing agent. Therefore, it is expected that the white adipose tissue present in large amounts around the skin or the viscera will be reduced depending on the application.
  • the antiobesity agent of this embodiment contains astaxanthin and fucoxanthin as active ingredients. Therefore, there is no possibility of causing side effects, and it can be safely applied to various uses. Moreover, when a natural origin raw material is used as astaxanthin or fucoxanthin, the safety
  • the anti-obesity agent of the said embodiment can be applied not only to the pharmaceutical etc. which are applied to a human but to the medicine etc. with respect to domestic animals, such as domestic animals.
  • the anti-obesity agent of the above embodiment is preferably applied to the treatment or improvement of obesity.
  • the anti-obesity agent may be taken not only for treatment or amelioration but also for healthy people to prevent obesity.
  • the anti-obesity agent of this embodiment can be preferably applied as an arteriosclerosis improving agent or an arteriosclerosis preventing agent. Since arteriosclerosis is a symptom caused by cardiovascular diseases such as myocardial infarction, angina pectoris, cerebral infarction, renal failure, obstructive arteriosclerosis, etc., the anti-obesity agent of this embodiment is used for those cardiovascular diseases. It can be further applied as a disease ameliorating agent or prophylactic agent.
  • the anti-obesity agent of the present invention was tested for anti-obesity action using obese mice.
  • the astaxanthin 0.05 mass% group of Comparative Example 2 (6 animals), the fucoxanthin 0.1 mass% group of Comparative Example 3 (6 animals), and Example 1 Astaxanthin 0.05 mass% + fucoxanthin 0.1 mass% group (6 animals) was applied.
  • the fucoxanthin used in this study was extracted and separated from seaweed, and the purity was 96% as a result of HPLC analysis. Astaxanthin was extracted and separated from Haematococcus algae, and astaxanthin oil containing 5% astaxanthin in terms of astaxanthin free form was used.
  • Example 1 in which 0.05% by mass of astaxanthin + 0.1% by mass of fucoxanthin was added to the feed, it was confirmed that the body weight showed a tendency to suppress increase for each comparative example. It was.
  • Total WAT mass is the electronic balance of the mass of peritoneal WAT, perinephric retroperitoneal WAT, inguinal WAT, and peri-intestinal WAT extracted at the time of dissection. And totaled as the total WAT mass.
  • the WAT mass (mg) per 1 g body weight was determined. The results are shown in Table 2.
  • RNA from WAT was measured by an ordinary method using RNeasy Mini Kit (manufactured by Qiagen). First, about 50 mg of tissue infiltrated with RNA later was weighed, and 800 ⁇ L of QIAzol Lysis Reagent and 2 zirconia beads were added. The mixture was crushed with Micro Smash (TOMY) at 3,000 rpm for 20 seconds. Further, 200 ⁇ L of chloroform was added, stirred with a vortex mixer, allowed to stand for 5 minutes, and then centrifuged at 15,000 rpm for 15 minutes at 4 ° C. To the upper layer, 600 ⁇ L of 70% EtOH was added and pipetting was performed.
  • TOMY Micro Smash
  • the mRNA expression level was measured by a 2-step RT-PCR method using a quantitative PCR device ABI-PRISM-7500.
  • TagMan Gene Assays ID used in the PCR reaction was PGC1 ⁇ (Ppargc1: Mm01208835_m1) and GAPDH (Gapdh: Mm99999915_g1).
  • the mRNA expression level of PGC1 ⁇ (inguinal WAT) was determined as PGC1 ⁇ / gapdh, and the relative value when the control (Comparative Example 1) value was 1 was determined. Table 3 shows the measurement results.
  • the protein concentration was measured using a DC Protein assay Kit (Bio-Rad Laboratories) modified from the Lowry method according to the method in the attached instruction manual. Specifically, 5 ⁇ L of each protein solution was taken on a 96-well microplate, 25 ⁇ L of Reagent A ′ (SDS-containing alkaline copper tartrate solution) and 200 ⁇ L of Reagent B (Folin reagent) were added, and the mixture was stirred for 15 minutes at room temperature. Thereafter, the absorbance at 650 nm was measured using a microplate reader. The protein concentration in each sample was calculated from a standard line prepared from the absorbance of bovine serum albumin (BSA) standard solution.
  • BSA bovine serum albumin
  • protein separation by SDS-PAGE was performed by partially modifying the Laemmli method. That is, 2 ⁇ sample buffer (0.1 M Tris-HCl, 2.5% SDS, 12% 2-mercaptoethanol, 20% glycerol, 0.025 so that the electrophoresis sample is 25 ⁇ g / 20 ⁇ L ⁇ lane. % BPB, pH 6.8) and incubated at 95 ° C. for 5 minutes.
  • this SDS-PAGE sample and molecular weight marker were added to a polyacrylamide gel (concentrated gel: 4.5% acrylamide / bis, 125 mM Tris-HCl, 0.1 % SDS, 0.03% APS, 11 mM TEMED, pH 6.8, separation gel: 10% acrylamide / bis, 375 mM Tris-HCl, 0.1% SDS, 0.04% APS, 3. 7 mM TEMED, pH 8.8), and electrophoresis was performed for 90 minutes at a constant current of 20 mA per gel.
  • Laemmli buffer 25 mM Tris, 192 mM glycine, 0.1% SDS was used as the buffer. Thereafter, using a semi-dry blotting apparatus, the protein in the separated gel was transferred to the PVDF membrane by energizing for 40 minutes with a constant current of 32 mA / cm 2 per separated gel.
  • the PVDF membrane after blotting was washed with TBS (20 mM Tris-HCl, 137 mM NaCl, pH 7.6) for 10 minutes. Subsequently, in order to prevent nonspecific adsorption of the antibody to the PVDF membrane, a blotting solution (0.5% skim milk, 0.1% polyoxyethylene (20) sorbitan (equivalent to Tween-20)), 20 mM Tris-HCl, 137 mM Blocking was performed using NaCl, pH 7.6) while shaking at room temperature for 1 hour.
  • TBS 20 mM Tris-HCl, 137 mM NaCl, pH 7.6
  • TBS-T (0.1% polyoxyethylene® (20) sorbitan (equivalent to Tween-20)
  • Primary antibody (rabbit polyclonal IgG PGC1 ⁇ antibody (diluted 4000 times), mouse monoclonal IgM Actin antibody (diluted 10,000 times)) diluted with blocking solution on PVDF membrane was dropped onto the membrane and gently shaken at room temperature for 1 hour. Incubated. Then, it was rinsed 4 times with TBS, and further washed with TBS-T for 15 minutes, once, 5 minutes and twice.
  • a secondary antibody anti-rabbit IgG-HRP (diluted 3000 times) or anti-mouse IgM-HRP (4000 times)
  • a blocking solution was dropped onto the membrane and incubated at room temperature with gentle shaking. .
  • it was rinsed 4 times with TBS, and further washed with TBS-T for 15 minutes, once, 5 minutes and twice.
  • a detection reagent was dropped onto the PVDF membrane after the antigen-antibody reaction.
  • detection reagent A detection reagent B (1: 1, v / v) of ECL Western Blotting Analysis ⁇ ⁇ System was used by mixing at room temperature. After incubating for 5 minutes, the luminescence signal of the target protein was detected using ATTO Cooled CCD camera ⁇ system, and the relative expression level relative to the Actin expression level was calculated.
  • the PVDF membrane after luminescence detection was incubated in Stripping buffer (100 mM 2-mercaptoethanol, 2% SDS, 62.5 mM Tris-HCl, pH 6.7) at 50 ° C. for 30 minutes with gentle shaking. did. Then, it rinsed 3 times with TBS, and also it wash
  • the protein expression level of PGC1 ⁇ (inguinal WAT) was determined as PGC1 ⁇ / actin, and the relative value when the control (Comparative Example 1) value was 1 was determined. Table 4 shows the measurement results.
  • the expression level of UCP1 protein was measured in the same manner as the measurement of the expression level of PGC1 ⁇ protein in column (3) above. Table 5 shows the measurement results.
  • the antibody was subjected to an antigen-antibody reaction using rabbit polyclonal IgG UCP1 (1000 times) and anti-rabbit IgG-HRP (2000 times diluted).
  • UCP1 is expressed in brown adipocytes, and functions to suppress obesity by directly converting (burning) excess fat accumulated in the cells into thermal energy. Ingestion of astaxanthin and fucoxanthin expressed UCP1 in WAT, indicating that obesity can be prevented by more efficient energy consumption.

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Abstract

　本発明は、優れた抗肥満作用を発揮する抗肥満剤を提供することを課題とする。本発明の抗肥満剤は、アスタキサンチン及びフコキサンチンを有効成分として含有することを特徴とする。好ましくは、前記アスタキサンチンの含有量とフコキサンチンの含有量の質量比は、１：４～１：１である。本発明の抗肥満剤は、好ましくは、医薬品、健康食品、特定保健用食品等の分野において適用される。

Description

抗肥満剤
　本発明は、優れた抗肥満作用を発揮する抗肥満剤に関する。
　一般に、正常な状態に比べ体重が多い状況又は体脂肪が過剰に蓄積した状態を肥満という。最近では、肥満は、体格指数（ＢＭＩ）を指標として定量的に把握することが可能となった。肥満となる原因は、様々であるが、例えば高カロリ食、飲酒・喫煙、運動不足、ストレス等の生活習慣が原因で生ずることが多い。肥満は、心筋梗塞、脳梗塞等の成人病の原因とされる動脈硬化症の危険因子として知られ、社会的に重大な問題となっている。
　肥満の症状は、食生活の改善、適度な運動以外に根本的な治療法が確立されていないのが現状である。肥満に該当する人は、健常者に比べ、心筋梗塞や脳梗塞を発症するリスクが高いため、現在、肥満の予防剤や治療剤の開発が急務となっている。
　肥満改善剤に関して、肥満症という病名で日本国（厚生労働省）から承認されている薬としては、マジンドール（食欲抑制薬）が挙げられるが、その薬の使用には高い規制（「ＢＭＩが３５以上等の重症の患者への使用」、「使用期間は３ヶ月以内」等）がかけられている。よって、多くの患者向けに低い規制で利用可能な薬の開発が進められつつある。
　従来より、特許文献１，２に開示されるような安全性の高い天然成分を含有する抗肥満剤が知られている。特許文献１は、天然物由来の成分としてウリ科植物の抽出物を含有する抗肥満剤について開示する。特許文献２は、天然物由来の成分としてマメ科植物の抽出物を含有する抗肥満剤について開示する。
特開２００７－５１５４０７号公報 特開２０１０－２０２６０２号公報
　本発明の目的とするところは、優れた抗肥満作用を発揮する抗肥満剤を提供することにある。
　本発明は、アスタキサンチン及びフコキサンチンを併用することにより、優れた抗肥満作用を発揮することを見出したことによりなされたものである。
　上記の目的を達成するために、本発明の一態様では、アスタキサンチン及びフコキサンチンを有効成分として含有する抗肥満剤が提供される。
　本発明の別の態様では、アスタキサンチン及びフコキサンチンを含有する組成物を、肥満の治療、改善又は予防を必要とする対象に投与して肥満を治療、改善又は予防する方法が提供される。
　本発明のさらに別の態様では、アスタキサンチン及びフコキサンチンを含有する組成物を、肥満の改善又は予防を必要とする対象に投与して白色脂肪組織を減少又は増加抑制する方法が提供される。
　上記の各態様において、前記アスタキサンチンの含有量とフコキサンチンの含有量の質量比は、１：４～１：１であることが好ましい。アスタキサンチンは、脂肪酸とのエステル体であることが好ましい。アスタキサンチンは、ヘマトコッカス藻から得られたものであることが好ましい。前記抗肥満剤は、白色脂肪組織の減少剤として適用されることが好ましい。
　本発明によれば、優れた抗肥満作用を発揮することができる。
　以下、本発明の抗肥満剤を具体化した一実施形態を説明する。
　本実施形態の抗肥満剤の有効成分の一つであるアスタキサンチンは、β－カロテンやリコピンと同じくカロテノイドの一種でキサントフィル類に分類される。アスタキサンチンは、天然物由来のもの又は合成により得られるものいずれも使用することができる。天然物由来のものとしては、例えば、エビ、オキアミ、カニなどの甲殻類の甲殻、卵及び臓器、種々の魚介類の皮及び卵、ヘマトコッカス藻などの藻類、ファフィア酵母などの酵母類、パラコッカス細菌などの海洋性細菌、福寿草及び金鳳花などの種子植物から得られるものを挙げることができる。これらの天然物のうち、一種を単独で用いてもよいし、二種以上を組み合わせて用いてもよい。天然からの抽出物及び化学合成品は市販されており、入手は容易である。
　アスタキサンチンは、例えば、ファフィア酵母、ヘマトコッカス藻、パラコッカス細菌等を、公知の方法に準拠して、適宜な培地で培養することにより得ることもできる。培養や抽出のしやすさ、アスタキサンチンを最も高濃度で含有することや生産性の高さからヘマトコッカス藻が最も好適である。
　ヘマトコッカス藻は、ボルボックス目クラミドモナス科に属する緑藻類であり、通常は緑藻であるためクロロフィル含量が高く緑色であり、２本の鞭毛によって水中を遊泳しているが、栄養源欠乏や温度変化等の飢餓条件では休眠胞子を形成し、アスタキサンチン含量が高くなり赤い球形となる。本実施形態においては、いずれの状態でのヘマトコッカス藻を用いることができるが、アスタキサンチンを多く含有した休眠胞子となったヘマトコッカス藻を用いるのが好ましい。また、ヘマトコッカス属に属する緑藻類では、例えば、ヘマトコッカス・プルビイアリス（Haematococcus pluvialis）が好ましい。
　ヘマトコッカス藻のアスタキサンチン含量の高いものを得る培養方法としては、異種微生物の混入・繁殖がなく、その他の夾雑物の混入が少ない密閉型の培養方法が好ましい。例えば、密閉型のドーム形状、円錐形状又は円筒形状の培養装置と装置内で移動自在のガス吐出装置を有する培養基を用いて培養する方法（例えば、国際公開第９９／５０３８４号パンフレット参照）や、密閉型の培養装置に光源を入れ内部から光を照射して培養する方法、平板状の培養槽で培養する方法が適している。
　前記培養物、又は前記甲殻類等の天然物からアスタキサンチンを抽出及び精製する方法については公知の方法、例えば溶媒抽出法及びクロマトグラフィー法を用いて、精製することができる。例えば、ジエステル型アスタキサンチンの場合、油溶性物質であることから、アスタキサンチンを含有する天然物からアセトン、アルコール、酢酸エチル、ベンゼン、クロロホルムなどの油溶性有機溶媒でアスタキサンチン含有成分を抽出することができる。また、二酸化炭素、プロパン及び水などを用い超臨界抽出を行うこともできる。抽出後、常法に従って溶媒を除去してモノエステル型のアスタキサンチンとジエステル型のアスタキサンチンの混合濃縮物を得ることができる。得られた濃縮物は、所望によりさらに精製してもよい。これらのアスタキサンチンの抽出及び精製方法のうち、一種を単独で用いてもよいし、二種以上を組み合わせて用いてもよい。
　アスタキサンチンの使用形態としては、前記方法で得たアスタキサンチンの抽出物及びそれらを含有した粉末や水溶液、又はファフィア酵母、ヘマトコッカス藻、パラコッカス細菌などの乾燥品及びそれらの破砕品を用いることができる。
　アスタキサンチンは、３，３′－ジヒドロキシ－β，β－カロテン－４，４′－ジオンであり、立体異性体を有する。具体的には、（３Ｒ，３′Ｒ）－アスタキサンチン、（３Ｒ，３′Ｓ）－アスタキサンチン及び（３Ｓ，３′Ｓ）－アスタキサンチンの３種の立体異性体が知られているが、本発明では、そのいずれも用いることができる。本発明では、特に記載がない限り、アスタキサンチンはアスタキサンチン及び／又はそのエステルを含む。さらに、アスタキサンチンのエステルにはモノエステル体及び／又はジエステル体を含む。アスタキサンチンは突然変異原性が観察されず、安全性が高い化合物であることが知られている。
　本実施形態のアスタキサンチンを有効成分の一つとする抗肥満剤には、アスタキサンチンの遊離体、上述したモノエステル体、ジエステル体の少なくとも一種を用いることができる。ジエステル体は２つの水酸基がエステル結合により保護されているため物理的に遊離体やモノエステル体よりも安定性が高く抗肥満剤中で酸化分解されにくい。しかし、生体中に取り込まれると生体内酵素により速やかにアスタキサンチンに加水分解され、効果を示すものと考えられている。
　アスタキサンチンのモノエステルとしては、例えば低級、中鎖又は高級飽和脂肪酸、あるいは低級、中鎖又は高級不飽和脂肪酸によりエステル化されたエステル類を挙げることができる。前記低級、中鎖又は高級飽和脂肪酸、あるいは低級、中鎖又は高級不飽和脂肪酸の具体例としては、酢酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、ペンタデカン酸、パルミチン酸、パルミトオレイン酸、へプタデカン酸、エライジン酸、リシノール酸、ベトロセリン酸、バクセン酸、エレオステアリン酸、プニシン酸、リカン酸、パリナリン酸、ガドール酸、５－エイコセン酸、５－ドコセン酸、セトール酸、エルシン酸、５，１３－ドコサジエン酸、セラコール酸、デセン酸、ステリング酸、ドデセン酸、オレイン酸、ステアリン酸、エイコサペンタエン酸、ドコサヘキサエン酸、リノール酸、リノレン酸、アラキドン酸などを挙げることができる。これらの脂肪酸の中で入手容易性の観点から炭素数１６のパルミチン酸又は炭素数１８のステアリン酸とのエステル体が好ましい。
　さらに、アスタキサンチンのモノエステルとしては、例えばグリシン、アラニンなどのアミノ酸；酢酸、クエン酸などの一価又は多価カルボン酸；リン酸、硫酸などの無機酸；グルコシドなどの糖；グリセロ糖脂肪酸、スフィンゴ糖脂肪酸などの糖脂肪酸；グリセロ脂肪酸などの脂肪酸；グリセロリン酸などによりエステル化されたモノエステル類を挙げることができる。尚、考えられ得る場合は前記モノエステル類の塩も含む。脂肪酸の誘導体としては、例えば上記脂肪酸のリン脂質型、アルコール型、エーテル型、ショ糖エステル型、ポリグリセリンエステル型が挙げられる。
　アスタキサンチンのジエステルとしては、例えば前記低級飽和脂肪酸、中鎖飽和脂肪酸、高級飽和脂肪酸、低級不飽和脂肪酸、中鎖不飽和脂肪酸、高級不飽和脂肪酸、アミノ酸、一価又は多価カルボン酸、無機酸、糖、糖脂肪酸、脂肪酸及びグリセロリン酸からなる群から選択される同一又は異種の酸によりエステル化されたジエステル類を挙げることができる。尚、考えられ得る場合は前記ジエステル類の塩も含む。脂肪酸としては、例えば上記アスタキサンチンのモノエステル欄において例示した脂肪酸を挙げることができる。グリセロリン酸のジエステルとしては、例えばグリセロリン酸の飽和脂肪酸エステル類、又は高級不飽和脂肪酸、不飽和脂肪酸又は飽和脂肪酸から選択される脂肪酸類を含有するグリセロリン酸エステル類などを挙げることができる。
　これらのアスタキサンチンのエステル体としては、一種を単独で用いてもよいし、二種以上を組み合わせて用いてもよい。
　本実施形態の抗肥満剤にビタミンＥ類（トコフェロール類）を配合することができる。ビタミンＥ類は、ビタミンＥ、トコトリエノール及びそれらの誘導体を包含する。ビタミンＥ類としてはそれらのうちの１種以上が含まれているオイルが用いられてもよい。ビタミンＥ類の具体例としては、ｄｌ－α－トコフェロール、ｄ－α－トコフェロール、酢酸ｄｌ－α－トコフェロール、酢酸ｄ－α－トコフェロール、コハク酸ｄｌ－α－トコフェロール、コハク酸ｄ－α－トコフェロール、ニコチン酸ｄｌ－α－トコフェロール、ニコチン酸ｄ－α－トコフェロール、ｄｌ－β－トコフェロール、ｄ－β－トコフェロール、酢酸ｄｌ－β－トコフェロール、酢酸ｄ－β－トコフェロール、コハク酸ｄｌ－β－トコフェロール、コハク酸ｄ－β－トコフェロール、ニコチン酸ｄｌ－β－トコフェロール、ニコチン酸ｄ－β－トコフェロール、ｄｌ－γ－トコフェロール、ｄ－γ－トコフェロール、酢酸ｄｌ－γ－トコフェロール、酢酸ｄ－γ－トコフェロール、コハク酸ｄｌ－γ－トコフェロール、コハク酸ｄ－γ－トコフェロール、ニコチン酸ｄｌ－γ－トコフェロール、ニコチン酸ｄ－γ－トコフェロール、ｄｌ－δ－トコフェロール、ｄ－δ－トコフェロール、酢酸ｄｌ－δ－トコフェロール、酢酸ｄ－δ－トコフェロール、コハク酸ｄｌ－δ－トコフェロール、コハク酸ｄ－δ－トコフェロール、ニコチン酸ｄｌ－δ－トコフェロール、ニコチン酸ｄ－δ－トコフェロール、α－トコトリエノール、β－トコトリエノール、γ－トコトリエノール、δ－トコトリエノール等が挙げられる。特に、ｄｌ－α－トコフェロール、酢酸ｄｌ－α－トコフェロール、コハク酸ｄｌ－α－トコフェロール、ニコチン酸ｄｌ－α－トコフェロール、α－トコトリエノール、β－トコトリエノール、γ－トコトリエノールが好ましい。これらのビタミンＥ類としては、一種を単独で用いてもよいし、二種以上を組み合わせて用いてもよい。
　本実施形態の抗肥満剤の有効成分の一つであるフコキサンチンは、非プロビタミンＡ類のカロテノイドの一つであり、天然に存在するカロテノイドの中でβカロテンと並んで最も多く存在するカロテノイドの一つである。フコキサンチンは、天然物由来のもの又は合成により得られるものいずれも使用することができる。天然物中においてフコキサンチンは、海藻、例えば褐藻類、及びその他の不等毛藻類中に多く存在している。褐藻類としては、例えばコンブ、ワカメ、及びモズクを挙げることができる。
　本実施形態の記載で、特に記載がない限り、フコキサンチンはフコキサンチン及び／又はその誘導体を含む。フコキサンチンの誘導体としては、例えばフコキサンチンの異性体、フコキサンチン又はフコキサンチンの異性体の脱アセチル化体、フコキサンチン又はフコキサンチノールのオキサビシクロヘキサン環の開環誘導体、フコキサンチンの１９’－アルカロイルオキシ化誘導体、及びフコキサンチンのスルホ基による置換体を挙げることができる。フコキサンチン又はフコキサンチンの異性体の脱アセチル化体としては、例えばフコキサンチノールが挙げられる。フコキサンチンが経口摂取された場合、消化管内でリパーゼ等によってフコキサンチノールに変換されて、消化管から吸収される。これらの誘導体を含むフコキサンチンとしては、一種を単独で用いてもよいし、二種以上を組み合わせて用いてもよい。これらの誘導体を含むフコキサンチンのうち、優れた活性及び入手容易性の観点からフコキサンチン及びフコキサンチノールが好ましい。
　前記天然物からフコキサンチンを抽出及び精製する方法については種々の公知の方法を採用することができる。例えば溶媒抽出法及びクロマトグラフィー法を用いて、精製することができる。溶媒抽出法としては、例えば、天然物からアセトン、アルコール、酢酸エチル、ベンゼン、クロロホルムなどの油溶性有機溶媒でフコキサンチン含有成分を抽出することができる。また、二酸化炭素、プロパン及び水などを用い超臨界抽出を行うこともできる。
　クロマトグラフィーとしては、例えばカラムクロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、及び薄層クロマトグラフィーが挙げられる。クロマトグラフィーに用いられる担体としては、例えばシリカ系樹脂、及び合成吸着剤が挙げられる。シリカ系樹脂としては、例えばオクタデシルシリル化シリカゲル（ＯＤＳ）、フェニルシリル化シリカゲル、及びオクチルシリル化シリカゲル等が挙げられる。これらのアスタキサンチンの抽出及び精製方法のうち、一種を単独で用いてもよいし、二種以上を組み合わせて用いてもよい。
　前記アスタキサンチンの含有量と前記フコキサンチンの含有量の質量比は、好ましくは１：４～１：１、より好ましくは１：３～１：１、さらに好ましくは、１：２．５～１：１．５の範囲である。かかる範囲内に規定することにより、抗肥満作用をより向上させることができる。
　抗肥満剤には、その抗肥満作用を損なわない範囲で上記以外の成分を含有させてもよい。上記以外の成分としては、例えば賦形剤、基剤、乳化剤、安定剤、香料、溶媒等が挙げられる。抗肥満剤は、液状であってもよいし、固体状であってもよい。剤形としては、特に限定されないが、例えば散剤、粉剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、丸剤、液剤等が挙げられる。
　次に、上記のように構成された抗肥満剤の作用を説明する。
　本実施形態の抗肥満剤は、有効成分であるアスタキサンチン及びフコキサンチンとの相乗効果により優れた肥満の改善又は予防作用を発揮する。より具体的には、有効成分であるアスタキサンチン及びフコキサンチンの相互作用により、生体内のミトコンドリア活性に関わる因子であるＰＧＣ１α及び熱産生因子ＵＣＰ１（ミトコンドリア脱共役タンパク質１）をより強く発現させ、最終的には主に白色脂肪組織（ＷＡＴ）の質量を減少させる。
　したがって、本実施形態の抗肥満剤は、肥満の改善又は予防作用の発揮を目的とした肥満の治療剤又は予防剤として適用することができる。また、抗肥満剤は、上述したより具体的な作用効果の発揮を目的として、白色脂肪組織の減少剤、ＰＧＣ１α発現増加剤、ＵＣＰ１発現増加剤として構成してもよい。
　本実施形態の抗肥満剤の具体的な適用形態としては、特に限定されないが、上記の作用効果を得ることを目的とした医薬品、医薬部外品、飲食物、皮膚外用剤、化粧品等が挙げられる。本実施形態の抗肥満剤の適用剤型としては、特に限定されず、例えば経口又は経腸摂取を目的とした経口又は経腸剤、血管内又は経下への投与を目的とした注射剤、皮膚へ塗布を目的とした皮膚外用剤等が挙げられる。
　抗肥満剤は、主に肥満の治療又は予防の効果・効能とする医薬品、医薬部外品等の有効成分として有効量配合されることにより摂取することができる。肥満の治療剤又は予防を目的とした摂取により、主に皮下脂肪又は内臓脂肪等の脂肪増加に対して特に有用である。また、抗肥満剤は、皮膚外用剤において、白色脂肪組織の多い皮下脂肪の増加抑制を目的として有効量配合することにより皮膚に適用される。また、抗肥満剤は、化粧品において、白色脂肪組織の多い皮下脂肪の増加抑制を目的として有効量添加することにより皮膚に適用される。このような皮膚外用剤又は化粧品による皮膚表面への塗布は、皮下脂肪の増加に対して特に有用である。
　本実施形態の抗肥満剤を医薬品に有効量配合する場合は、服用（経口摂取）により投与する場合の他、血管内投与、経皮投与等のあらゆる投与方法を採用することが可能である。医薬品の剤形としては、特に限定されないが、例えば、散剤、粉剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、丸剤、坐剤、液剤、注射剤等が挙げられる。また、添加剤として賦形剤、基剤、乳化剤、溶剤、安定剤等を配合してもよい。
　本発明の抗肥満剤を含む飲食物は、ダイエタリー・サプリメント、機能表示食品、保健機能食、特別用途食品、健康食品、一般食品、飲料として用いることができ、摂取のしやすさや摂取量が決めやすいことから、ダイエタリー・サプリメント、機能表示食品、保健機能食、特別用途食品が好ましく、錠剤、口腔内速崩壊錠、カプセル、顆粒、細粒などの固形投与形態、シロップ及び懸濁液のような液体投与形態で摂取することができる。抗肥満剤を含む飲食物は、乳蛋白質、大豆蛋白質、卵アルブミン蛋白質など、又は、これらの分解物である卵白オリゴペプチド、大豆加水分解物、アミノ酸単体の混合物をさらに含んでもよい。また、ドリンク形態で提供する場合は、栄養バランス、摂取時の風味を良くするためにアミノ酸、ビタミン類、ミネラル類などの栄養的添加物、甘味料、香辛料、香料及び色素などを配合してもよい。本発明の飲食物の形態は、これらに限定されるものではない。
　本発明において、機能性食品とは、国や公共団体が許可・指定している抗肥満効能を有する食品であり、例えば、栄養機能食品や特定保健用食品などの保健機能食品、機能表示食品、特別用途食品などである。なお、状況や時代により名称や規程が変化するが、本質的に同じであるものは本発明に含まれる。
　一般食品、すなわち飲食物の形態例としては、マーガリン、バター、バターソース、チーズ、生クリーム、ショートニング、ラード、アイスクリーム、ヨーグルト、乳製品、ソース肉製品、魚製品、漬け物、納豆、煮豆、炒り豆、豆腐、麻婆豆腐、ミックスナッツ、フライドポテト、ポテトチップス、スナック菓子、かきもち、ポップコーン、ふりかけ、チューインガム、チョコレート、プリン、ゼリー、グミキャンディー、キャンディー、ドロップ、キャラメル、パン、カステラ、ケーキ、ドーナッツ、ビスケット、クッキー、クラッカー、焼き菓子、マカロニ、パスタ、ラーメン、蕎麦、うどん、サラダ油、インスタントスープ、ドレッシング、卵、マヨネーズ、みそなど、又は果汁飲料、清涼飲料、スポーツ飲料などの炭酸系飲料又は非炭酸系飲料など、茶、コーヒー、ココアなどの非アルコール又はリキュール、薬用酒などのアルコール飲料、栄養ドリンク、牛乳、豆乳などの一般食品への添加を挙げることができる。
　飲食物では、アスタキサンチン及びフコキサンチンを一般食品の原料と共に配合し、常法に従って加工製造することにより製造される。アスタキサンチン及びフコキサンチンの配合量は食品の形態などにより異なり特に限定されるものではないが、一般にはアスタキサンチン及びフコキサンチンの使用量は当業者が飲食物の種類に応じて適宜選択できる。
　この抗肥満剤の投与量は、ＢＭＩ、体重、用法、適用者の年齢、性別、及びその他の条件を考慮し、適宜決定される。例えば経口摂取する場合、抗肥満剤中の有効成分の添加量として、好ましくは食事量の０．０００１～１０質量％、より好ましくは０．００１～１質量％配合して摂取することができる。有効成分の摂取量が０．０００１質量％以上の場合には前記有効成分による抗肥満作用をより効果的に高めることができる。一方、有効成分の摂取量が１０質量％以下の場合にはより経済的に摂取することができる。
　本実施形態の抗肥満剤を皮膚外用剤に有効量配合する場合、皮膚外用剤の皮膚への塗布により生体へ適用される。皮膚外用剤の剤形としては、抗肥満の目的等に応じ公知の剤形を適宜採用することができる。例えば、軟膏、液剤、スプレー剤、シート剤、散剤、粉剤等の剤形が挙げられる。また、添加剤として、例えば賦形剤、基剤、安定剤等を配合してもよい。
　本実施形態の抗肥満剤が化粧品に有効量添加される場合、種々の化粧品素材に有効成分を添加することにより使用される。化粧品としては、例えば化粧水、乳液、ファンデーション、フェイスパウダー、頬紅、口紅、マスカラ、アイライナー、アイシャドー、クレンジング、マニキュア、毛髪化粧料等が挙げられる。
　本実施形態の抗肥満剤によれば、以下のような効果を得ることができる。
　（１）本実施形態の抗肥満剤は、有効成分としてアスタキサンチン及びフコキサンチンを含有する。したがって、有効成分の相乗効果により、優れた抗肥満作用を発揮することができる。
　（２）本実施形態の抗肥満剤は、優れた白色脂肪組織の減少作用を発揮する。したがって、抗肥満剤は、好ましくは白色脂肪組織の減少剤として適用することができる。よって、適用により特に皮下又は内臓の周囲に多量に存在する白色脂肪組織の減少が期待される。
　（３）本実施形態の抗肥満剤は、有効成分としてアスタキサンチン及びフコキサンチンを含有する。したがって、副作用を生ずるおそれがなく、安全に各種用途に適用することができる。また、アスタキサンチン又はフコキサンチンとして、天然由来の原料が用いられる場合、生体に対する安全性をより向上させることができる。
　なお、上記実施形態は以下のように変更してもよい。
　・上記実施形態の抗肥満剤は、ヒトに適用される医薬品等に使用することができるのみならず、家畜等の飼養動物に対する薬剤等に適用してもよい。
　・上記実施形態の抗肥満剤は、好ましくは肥満の治療又は改善に適用される。しかしながら、抗肥満剤は、治療又は改善の用途のみならず、健常者が肥満の予防のために摂取してもよい。
　・肥満は、心筋梗塞、脳梗塞等の成人病の原因とされる動脈硬化症の危険因子として知られる。したがって、本実施形態の抗肥満剤は、動脈硬化症改善剤又は動脈硬化症予防剤として好ましく適用することができる。動脈硬化症は、心筋梗塞、狭心症、脳梗塞、腎不全、閉塞型動脈硬化症等の循環器病の原因とされる症状であるため、本実施形態の抗肥満剤をそれらの循環器病の改善剤又は予防剤としてさらに適用することができる。
　次に、実施例及び比較例を挙げて前記実施形態を更に具体的に説明する。
　本発明の抗肥満剤について、肥満発症のマウスを用いて、抗肥満作用について試験した。
　（１）マウスの飼育及び体重の測定
　肥満・２型糖尿病発症モデルのKK- Ayマウス（４週齢、雌）４３匹を、１週間、高脂肪食であるウエスタンダイエット（脂肪２１質量％）（リサーチダイエット社製）を用いて予備飼育した。その後、比較例１としてコントロール群（ウエスタンダイエット（脂肪２１質量％））（７匹）、及びその脂質の一部をカロテノイド（アスタキサンチン及び／又はフコキサンチン）に置換した各例の群で４週間自由摂取させ、飼育を行った。その脂質の一部をカロテノイドで置換した群として、比較例２のアスタキサンチン０．０５質量％群（６匹）、比較例３のフコキサンチン０．１質量％群（６匹）、実施例１のアスタキサンチン０．０５質量％＋フコキサンチン０．１質量％群（６匹）を適用した。
　その後、非絶食でのジエチルエーテルを用いた麻酔下で採血した後、安楽死処置を行った。直ちに、各種臓器を摘出し、mRNA分析に用いるサンプルはRNA laterに浸漬し－３０℃で保存し、タンパク質発現量解析（ウェスタンブロッディング）に用いるサンプルは－８０℃で凍結保存した。
　尚、本研究で用いたフコキサンチンは、ワカメより抽出、分離したものであり、純度はＨＰＬＣ分析の結果９６％であった。また、アスタキサンチンは、ヘマトコッカス藻より抽出、分離したものであり、アスタキサンチン遊離体換算で５％のアスタキサンチンを含有するアスタキサンチンオイルを使用した。
　体重は、実験飼料の投与を始めてから解剖前日まで、各例のマウスの体重を電子天秤で測定した。結果を表１に示す。尚、統計計算の方法として、得られた数値から各群の平均値及び標準誤差（S.E.）を算出し、（平均値）±（S.E.）として示した。有意差検定には対象－処理群比較のダネットを用いて行った。その際有意水準は＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、ｖｓ コントロール群とした（以下同様）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
 　表１に示されるように、飼料にアスタキサンチン０．０５質量％＋フコキサンチン０．１質量％を添加した実施例１の場合、各比較例に対し、体重は増加抑制傾向を示すことが確認された。
　（２）総白色脂肪組織（WAT）の質量測定
　総WAT質量は、上記解剖時に摘出した子宮周囲WAT、腎周囲後腹膜WAT、鼠径（そけい）WAT、腸管周囲WATのそれぞれの質量を電子天秤で測定し、総WAT質量として合計した。体重１ｇ当たりのWAT質量（ｍｇ）を求めた。結果を表２に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
 　表２に示されるように、飼料中にアスタキサンチン０．０５質量％＋フコキサンチン０．１質量％を添加した実施例１の場合、単位体重当たりの総WAT質量が有意に低下していることが確認された。
　（３）鼠径WATのPGC1α（RT-PCR）と鼠径WATのPGC1α（western blotting）の測定
　生体内のミトコンドリア活性に関わる因子であるPGC1αが、アスタキサンチンとフコキサンチンの摂取により影響を受けるかについて評価した。
　（イ）PGC1αmRNA発現量の測定
　WATからのtotal RNAは、常法によってRNeasy Mini Kit（Qiagen社製）を用いて行った。まず、RNA laterに浸透させた組織を５０ｍｇ前後秤量し、８００μＬのQIAzol Lysis Reagentとジルコニアビーズ２粒を加えた。Micro Smash（TOMY社製）で、３，０００ｒｐｍ、２０秒間破砕した。更にクロロホルム２００μＬを加えてボルテックスミキサーで撹拌し、５分間静置させたのち、１５，０００ｒｐｍ、１５分間、４℃で遠心分離した。上層に７０％EtOHを６００μＬを加え、ピペッティングをした。それをRNeasy mini columnに移し、１０，０００ｒｐｍ、２５秒間、２５℃、続いてRW1を６５０μＬ加えて１０，０００ｒｐｍ、２５秒間、２５℃、更にbuffer RPEを４５０μＬ加えて１０，０００ｒｐｍ、２５秒間、２５℃、再び同量のbuffer RPEを加えて１０，０００ｒｐｍ、２５秒間、２５℃遠心分離を行った。Collection tubes（１．５ｍＬ）を新しいものに取り替えて、RNase free waterを４０μＬ加えて１０，０００ｒｐｍ、１分間、２５℃、再びRNase free waterを４０μＬ加えて１０，０００ｒｐｍ、１分間、２５℃遠心分離をし、８０μＬのtotal RNAを得た。得られたtotal RNAは－８０℃で保存した。
　mRNA発現量の測定は、定量PCR装置ABI PRISM 7500を用いて2 step RT-PCR法にて行った。最初に、cDNAを調製するため、High Capacity cDNA Reverse Transcription kitを用いて、キットのプロトコールに従って逆転写反応を行い、cDNAを得た。更にPCR反応液を調製し、得られたcDNAと共に96-well Optical Plateを用いて、定量PCR装置ABI PRISM7500にてPCR反応を行った。PCR反応に用いたTagMan Gene Expression Assays IDは、PGC1α(Ppargc1：Mｍ01208835_m1)及びGAPDH (Gapdh：Mm99999915_g1)であった。PGC1α(鼠径WAT)のmRNA発現量をPGC1α/gapdhとして求め、コントロール（比較例１）の値を１とした場合の相対値を求めた。測定結果を表３に示す。
　（ロ）PGC1αタンパク質の発現量測定
　－８０℃にて保存した脂肪組織を適量採取し、１／１００容量のprotease inhibitor cocktail、phosphatase inhibitor cocktailを予め加えた５ｍＭ Hepesタンパク質抽出bufferを３００μＬ加えて３０秒間ペレットペッスルのコードレスホモジナイザーにてホモジナイズした。その後、更に５０μＬのbufferを加え、ピペッティングした。その後４℃で１３，０００ｒｐｍ、２０分間遠心分離し、脂肪成分以外の上清をタンパク質溶液とした。タンパク質濃度の測定にはLowry法を改良したDC Protein assay Kit（Bio-Rad Laboratories社製）を用い、添付使用説明書の方法に従って測定した。すなわち、96-wellマイクロプレートに各タンパク質溶液を５μＬとり、Reagent A'（SDS含有アルカリ性酒石酸銅溶液）２５μＬとReagent B（Folin試薬）２００μＬを加えて１５分間室温にて撹拌した。その後、マイクロプレートリーダーを用いて６５０ｎｍにおける吸光度を測定した。各サンプル中のタンパク質濃度は、ウシ血清アルブミン（BSA）標準液の吸光度から作成した標準直線から算出した。
　次いで、SDS-PAGEによるタンパク質の分離は、Laemmliの方法を一部改変して行った。すなわち、電気泳動サンプルが２５μｇ／２０μＬ・laneとなるように２×sample buffer（０．１ＭのTris-HCl、２．５％のSDS、１２％の２－メルカプトエタノール、２０％グリセロール、０．０２５％のBPB、ｐＨ６．８）を混合し、９５℃で５分間インキュベートした。氷冷後、このSDS-PAGEサンプル及び分子量マーカー（Precision Plus Protein Standards Dual Color、Bio-Rad Laboratories）をポリアクリルアミドゲル（濃縮ゲル：４．５％アクリルアミド／ビス、１２５ｍＭのTris-HCl、０．１％のSDS、０．０３％のAPS、１１ｍＭのTEMED、ｐＨ６．８、分離ゲル：１０％アクリルアミド／ビス、３７５ｍＭのTris-HCl、０．１％のSDS、０．０４％のAPS、３．７ｍＭのTEMED、ｐＨ８．８）に負荷し、ゲル１枚あたり２０ｍＡの定電流で９０分間泳動を行った。この際bufferにはLaemmli buffer（２５ｍＭのTris、１９２ｍＭグリシン、０．１％のSDS）を用いた。その後、セミドライ式ブロッティング装置を用いて、分離ゲル１枚当たり３２ｍＡ／ｃｍ２の定電流で、４０分間通電することにより、分離ゲル中のタンパク質をPVDFメンブレンにトランスファした。
　ブロッティング後のPVDFメンブレンをTBS（２０ｍＭのTris-HCl、１３７ｍＭのNaCl、ｐＨ７．６）で１０分間洗浄した。次いでPVDFメンブレンへの抗体の非特異的吸着を防ぐため、ブロッティング溶液（０．５％スキムミルク、０．１％のpolyoxyethylene (20) sorbitan（Tween-20相当））、２０ｍＭのTris-HCl、１３７ｍＭのNaCl、ｐＨ７．６）を用いて室温で１時間振とうしながらブロッキングを行った。ブロッキング後のPVDFメンブレンをTBSで２回リンスした後、TBS-T（０．１％のpolyoxyethylene (20) sorbitan（Tween-20相当））、２０ｍＭのTris-HCl、１３７ｍＭのNaCl、ｐＨ７．６）を用いて１５分・１回、５分・２回洗浄した。PVDFメンブレンにブロッキング溶液で希釈した一次抗体（ラビットポリクローナルIgG PGC1α抗体（４０００倍希釈）、マウスモノクローナルIgM Actin抗体（１００００倍希釈））をメンブレンに滴下し、室温で１時間、穏やかに振とうしながらインキュベートした。その後、TBSで４回リンスし、さらにTBS-Tで１５分・１回、５分・２回洗浄した。続いて、ブロッキング溶液で希釈した二次抗体（抗ラビットIgG-HRP（３０００倍希釈）、または抗マウスIgM-HRP（４０００倍））をメンブレンに滴下し、室温で穏やかに振とうしながらインキュベートした。次いで、TBSで４回リンスし、さらにTBS-Tで１５分・１回、５分・２回洗浄した。抗原抗体反応後のPVDFメンブレンに、検出試薬を滴下した。その際、検出試薬として、ECL Western Blotting Analysis Systemの検出試薬Ａ：検出試薬Ｂ（１：１、ｖ／ｖ）を室温で混合して用いた。５分間インキュベート後、ATTO Cooled CCD camera systemを用いて目的タンパク質の発光シグナルを検出し、Actin発現量に対する相対発現量を算出した。
　尚、発光検出後のPVDFメンブレンをStripping buffer（１００ｍＭの２－メルカプトエタノール、２％のSDS、６２．５ｍＭのTris-HCl、ｐＨ６．７）中で５０℃、３０分穏やかに振とうしながらインキュベートした。続いて、TBSで３回リンスし、さらにTBS-Tを用いて室温で１０分間洗浄し、TBSで３回リンスした。その後、上記のブロッディング操作を繰り返し、リプロービングを行いそれぞれのタンパク質の検出を行った。PGC1α(鼠径WAT)のタンパク発現量をPGC1α/actinとして求め、コントロール（比較例１）の値を１とした場合の相対値を求めた。測定結果を表４に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
 　表３，４に示されるように、アスタキサンチン及びフコキサンチンを投与した実施例１の場合、アスタキサンチンのみ又はフコキサンチンのみを投与した比較例２又は比較例３に対し、生体内のミトコンドリア活性に関わる因子であるPGC1αがより活性化することが確認された。
　（４）鼠径WATのUCP1（western blotting）の測定
　エネルギー消費に関連するミトコンドリア脱共役タンパク質１（UCP1）が、アスタキサンチンとフコキサンチンの摂取により活性化するかについて評価した。
　上記（３）欄のPGC1αタンパク質の発現量測定と同様の方法でUCP1タンパク質の発現量を測定した。測定結果を表５に示す。
　尚、抗体は、ラビットポリクローナルIgG UCP1（１０００倍）、抗ラビットIgG-HRP（２０００倍希釈）を用いて、抗原抗体反応を行った。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
 　表５に示されるように、アスタキサンチン及びフコキサンチンを投与した実施例１の場合、アスタキサンチンのみ又はフコキサンチンのみを投与した比較例２又は比較例３に対し、UCP1が著しく活性化することが確認された。
　本来UCP1は、褐色脂肪細胞内で発現し、細胞内に過剰に蓄積された脂肪を直接熱エネルギーに変換（燃焼）し、肥満を抑える働きをする。アスタキサンチン及びフコキサンチンの摂取により、WAT内においてもUCP1が発現され、より効率的なエネルギー消費による肥満の防止が図られることが示された。
　次に、上記実施形態及び別例から把握できる技術的思想について、それらの効果とともに以下に追記する。
　（ａ）ＰＧＣ１α発現増加剤又はＵＣＰ１発現増加剤として用いられる前記抗肥満剤。従って、この（ａ）に記載の発明によれば、ＰＧＣ１α又はＵＣＰ１の発現を増加させ、エネルギー消費を増加させることができる。

Claims (10)

  1. 　アスタキサンチン及びフコキサンチンを有効成分として含有することを特徴とする抗肥満剤。
  2. 　前記アスタキサンチンの含有量とフコキサンチンの含有量の質量比は、１：４～１：１であることを特徴とする請求項１に記載の抗肥満剤。
  3. 　前記アスタキサンチンは、脂肪酸とのエステル体であることを特徴とする請求項１又は請求項２に記載の抗肥満剤。
  4. 　前記アスタキサンチンは、ヘマトコッカス藻から得られたものであることを特徴とする請求項１から請求項３のいずれか一項に記載の抗肥満剤。
  5. 　前記抗肥満剤は、白色脂肪組織の減少剤として適用されることを特徴とする請求項１から請求項４のいずれか一項に記載の抗肥満剤。
  6. 　アスタキサンチン及びフコキサンチンを含有する組成物を、肥満の治療、改善又は予防を必要とする対象に投与して肥満を治療、改善又は予防する方法。
  7. 　アスタキサンチン及びフコキサンチンを含有する組成物を、肥満の改善又は予防を必要とする対象に投与して白色脂肪組織を減少又は増加抑制する方法。
  8. 　前記アスタキサンチンの含有量とフコキサンチンの含有量の質量比は、１：４～１：１であることを特徴とする請求項６又は請求項７に記載の方法。
  9. 　前記アスタキサンチンは、脂肪酸とのエステル体であることを特徴とする請求項６から請求項８のいずれか一項に記載の方法。
  10. 　前記アスタキサンチンは、ヘマトコッカス藻から得られたものであることを特徴とする請求項６から請求項９のいずれか一項に記載の方法。
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