WO2015037635A1 - インフルエンザウイルスの免疫測定における検体処理方法及び免疫測定法 - Google Patents
インフルエンザウイルスの免疫測定における検体処理方法及び免疫測定法 Download PDFInfo
- Publication number
- WO2015037635A1 WO2015037635A1 PCT/JP2014/073971 JP2014073971W WO2015037635A1 WO 2015037635 A1 WO2015037635 A1 WO 2015037635A1 JP 2014073971 W JP2014073971 W JP 2014073971W WO 2015037635 A1 WO2015037635 A1 WO 2015037635A1
- Authority
- WO
- WIPO (PCT)
- Prior art keywords
- antibody
- influenza virus
- immunoassay
- influenza
- virus
- Prior art date
Links
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
- G01N33/56983—Viruses
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
- G01N2333/005—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from viruses
- G01N2333/08—RNA viruses
- G01N2333/11—Orthomyxoviridae, e.g. influenza virus
Definitions
- the present invention relates to a specimen processing method and an immunoassay method for immunoassay of influenza virus using an influenza virus matrix 1 protein (hereinafter sometimes referred to as “M1”) as an antigen.
- M1 influenza virus matrix 1 protein
- influenza virus is a seasonal pathogen and is used in clinical practice. In the field, patients are concentrated in a short period of time, and a large amount of virus tests are performed in a short time. Therefore, in the medical field, the immunochromatography method which is excellent in quickness and simplicity is spreading rapidly in recent years.
- a method using a membrane such as nitrocellulose is known.
- a ligand that specifically binds to the substance to be detected is immobilized on the membrane, and this captures the complex of the labeled substance labeled with the ligand that specifically binds to the substance to be detected via the substance to be detected.
- This is a method for measuring the presence or absence of a substance to be detected.
- a labeling substance a colored polystyrene particle dyed with an enzyme such as alkaline phosphatase, a metal colloid such as gold colloid, and a dye is generally used as a ligand that specifically binds to an object to be detected. Polystyrene particles are often used.
- NP nucleoprotein
- M1 protein has the largest number per influenza virus particle, which is reported to be about 3 times the amount of NP protein (Non-patent Document 1).
- Patent Document 1 it is also known to treat a specimen to be subjected to immunoassay with a surfactant.
- An object of the present invention is to provide means capable of performing immunoassay with sufficient sensitivity in immunoassay for measuring influenza virus in a specimen using M1 protein of influenza virus as an antigen.
- the inventors of the present application have found that the measurement sensitivity of influenza M1 protein by immunoassay is improved by bringing a specimen containing influenza virus into contact with a specific surfactant, and the present invention has been completed. .
- a specimen containing influenza virus is treated with palmityl group, stearyl group and oleyl group.
- a sample processing method in immunoassay of influenza virus which comprises contacting with a sample processing solution containing a surfactant having at least one group selected from the group consisting of:
- the present invention provides a specimen treated by the above-described method of the present invention to an immunoassay using an antibody or antigen-binding fragment thereof that undergoes an antigen-antibody reaction with an influenza virus matrix 1 protein, An immunoassay for influenza virus is provided, including measuring.
- the sensitivity of the immunoassay is improved in the immunoassay for measuring the influenza virus in the sample using the M1 protein of the influenza virus as an antigen.
- the specimen to which the present invention can be applied is not particularly limited as long as the presence of influenza virus is suspected, but nasopharynx-derived specimens such as nasal wipes, nasal aspirate, nasal discharge, pharyngeal wipes, saliva, etc. Nasal pharynx-derived specimens) are preferred, and nasal wipes and nasal aspirates are particularly preferred.
- sample treatment solution As described above, in the method of the present invention, the specimen is brought into contact with the surfactant. This is usually performed by treating a sample treatment liquid containing the surfactant with the sample.
- the sample processing solution usually contains a surfactant in a buffer solution.
- the buffer solution include, but are not limited to, MES, HEPES, TES, ADA, ACES, bis-Tris, Tris, TES, CAPS, borate buffer solution, phosphate buffer solution, citrate buffer solution, and the like.
- the surfactant is a surfactant having at least one group selected from the group consisting of palmityl group, stearyl group and oleyl group. These alkyl groups may be linear or branched.
- a nonionic surfactant having at least one aliphatic group bonded to a polyoxyethylene chain is preferred.
- the chain length of the polyoxyethylene chain is not particularly limited, but usually the degree of polymerization of oxyethylene units is 5 to 40, preferably 10 to 20.
- Preferable examples of the surfactant having a polyoxyethylene chain include polyoxyethylene oleyl ether, polyoxyethylene stearyl ether, and polyoxyethylene cetyl ether. These surfactants can be used alone or in combination of two or more.
- the final concentration of the surfactant in the sample treatment liquid is preferably 0.005 (w / v)% to 8 (w / v)%, More preferably, it is 0.5 (w / v)% to 4 (w / v)%.
- Surfactants can be used alone or in combination of two or more.
- the surfactant is brought into contact with the specimen in the presence of chloride, and therefore the specimen treatment solution preferably further contains chloride.
- chloride alkali metal chlorides such as lithium chloride, sodium chloride and potassium chloride are preferable.
- the final concentration of chloride in the sample treatment solution is preferably 0.05M to 1.5M, particularly preferably 0.1M to 1.0M.
- a chloride can also be used independently and can also be used in combination of 2 or more type.
- the sample treatment liquid includes basic amino acids such as arginine, nonionic surfactants such as polyoxyethylene octylphenyl ether (for example, Triton (registered trademark) X-100), nonspecific reaction inhibitors such as BSA, Stabilizers such as sucrose, preservatives, preservatives such as Procrine (registered trademark), and the like may also be included.
- basic amino acids such as arginine
- nonionic surfactants such as polyoxyethylene octylphenyl ether (for example, Triton (registered trademark) X-100)
- nonspecific reaction inhibitors such as BSA
- Stabilizers such as sucrose
- preservatives preservatives
- preservatives such as Procrine (registered trademark)
- pH of buffer solutions such as sodium hydroxide and hydrogen chloride
- the sample processing method of the present invention is performed by bringing a sample derived from the nasopharynx or the like into contact with the sample processing solution of the present invention.
- the specimen is a nasal aspiration specimen
- extraction can be performed by immersing a cotton swab or the like in a nasal cavity aspiration liquid, and placing the cotton swab soaked in the specimen into the specimen treatment liquid of the present invention to dissolve the specimen.
- the sample is a nasal wipe
- the sample can be extracted by wiping the nasal cavity with a cotton swab and putting the swab soaked with the sample in the sample treatment solution of the present invention to dissolve the sample.
- This operation can be performed at room temperature, and the amount of the sample treatment solution for immersing the cotton swab is not particularly limited as long as it can immerse the entire cotton portion of the cotton swab, but it is usually 0.05 mL to 5 mL.
- immunoassay The specimen treated as described above is then subjected to an immunoassay using an antibody or antigen-binding fragment thereof that undergoes an antigen-antibody reaction with the M1 protein of influenza virus, and the influenza virus in the specimen is measured.
- this immunoassay will be described.
- Viruses measured in the immunoassay of the present invention are influenza viruses such as influenza A virus and influenza B virus.
- “measurement” includes detection, quantification, and semi-quantification.
- the immunoassay of the present invention uses the influenza virus M1 protein as an antigen. Therefore, an antibody or antigen-binding fragment thereof that reacts with the influenza virus M1 protein for an antigen-antibody reaction is used for the immunoassay.
- an antibody or antigen-binding fragment thereof that undergoes an antigen-antibody reaction with influenza A virus M1 (hereinafter sometimes abbreviated as A-M1) is used.
- A-M1 is a protein composed of 252 amino acid residues.
- “specific” means that in a liquid system in which a protein and the antibody are mixed, the antibody does not cause an antigen-antibody reaction at a level detectable with a protein component other than A-M1, or This means that even if a binding reaction or an association reaction is caused, the reaction is obviously weaker than the antigen-antibody reaction of the antibody with A-M1.
- the amino acid sequence of A-M1 is known and is described in, for example, GenBank: ACD37490.
- the anti-A-M1 antibody may be a monoclonal antibody or a polyclonal antibody, but a monoclonal antibody is preferable from the viewpoint of reproducibility.
- the anti-A-M1 monoclonal antibody can be easily immunized with A-M1 or a partial peptide thereof by the usual method of Keller et al. (Kohler et al., Nature, vol, 256, p495-497 (1975)). It is possible to create.
- the class of the monoclonal antibody is not limited to IgG, and may be IgM or IgY.
- An antigen-binding fragment obtained by separating only the antigen-binding site can also be used for immunoassay. That is, a fragment (antigen-binding fragment) having specific antigen-binding properties such as Fab, Fab ′, F (ab ′) 2, single-chain antibody (scFv) prepared by a known method may be used. it can.
- a fragment (antigen-binding fragment) having specific antigen-binding properties such as Fab, Fab ′, F (ab ′) 2, single-chain antibody (scFv) prepared by a known method may be used. it can.
- B-M1 For measurement of influenza B virus, an antibody or antigen-binding fragment thereof that undergoes an antigen-antibody reaction with influenza B virus M1 (hereinafter sometimes abbreviated as B-M1) is used.
- B-M1 is a protein composed of 248 amino acid residues. By using this antibody for detection by Western blotting, a specific signal due to an antigen-antibody reaction can be detected at a molecular weight of 20 to 35 kD.
- the amino acid sequence of B-M1 is known and described in, for example, GenBank: AEN79424.
- an antigen-binding fragment can be used as in the case of type A.
- Immunoassay itself is well known, and any of various well-known immunoassays such as sandwich method, agglutination method, and competition method can be adopted.
- the sandwich method is preferred, and the sandwich method is preferably an immunochromatography method or an ELISA method, and particularly preferably an immunochromatography method that is easy to operate.
- sandwich method two types of antibodies or antigen-binding fragments thereof that can simultaneously bind to the influenza virus M1 protein serving as an antigen are used.
- the immunochromatography method which is a preferred sandwich method will be further described.
- the immunochromatography method itself is well known and widely used. In the present invention, a well-known method can be used for the immunochromatography method itself.
- the method for detecting the detection of the present invention by immunochromatography is particularly limited as long as it is an immunological detection method using an antibody against the detection substance (hereinafter sometimes referred to as an anti-detection substance antibody).
- an anti-detection substance antibody an immunological detection method using an antibody against the detection substance
- a sandwich method using an anti-detection substance antibody and a labeled anti-detection substance antibody is more preferable.
- the anti-detection substance antibody may be either a polyclonal antibody or a monoclonal antibody, but a monoclonal antibody is more preferable.
- the immunochromatography method is performed by bringing a detected substance extracted by the sample processing method into contact with a strip or the like on which an anti-detected substance antibody is immobilized. Needless to say, the immunochromatography method in the present invention can be used for both qualitative detection and quantitative measurement.
- the color latex is prepared by polystyrene-free particles by soap-free polymerization without using an emulsifier, and the method described in [0025] to [0035]. It is also possible to use colored particles commercially available from Seradyn, Magsphere, and the like. In the following description, the case where color latex particles are used as the label will be described in detail.
- Immobilization of the antibody on the color latex is usually carried out by chemical bonding.
- the antibody concentration is preferably adjusted to 1 mg / mL to 5 mg / mL, and the buffer and pH are adjusted to 20 mM MES buffer ( pH 5.5 to 6.5) or 50 mM borate buffer (pH 8 to 9) is preferable, and 20 mM MES buffer (pH 6.5) is more preferable.
- the color latex labeled antibody thus prepared is dispersed and stored in a storage reagent for preventing denaturation.
- proteins such as BSA, glycerin, sugars and the like are used.
- Solid phase examples of the solid phase material include polyethylene, polyethylene terephthalate, nylons, glass, polysaccharides such as cellulose and cellulose derivatives, and ceramics.
- glass fiber filter paper sold by Millipore, Toyo Roshi, Whatman, Leidel, etc.
- cellulose filter paper polystyrene plate
- glass fiber membrane nylon membrane
- nitrocellulose membrane etc.
- a nitrocellulose membrane is preferred.
- Immobilization of capture antibody on solid phase Immobilization of a capture antibody for detecting a complex of an antigen (for example, influenza virus) as a substance to be detected and a labeled antibody to a nitrocellulose membrane can be generally performed by a well-known method.
- an antigen for example, influenza virus
- a labeled antibody to a nitrocellulose membrane can be generally performed by a well-known method.
- the nitrocellulose film is formed in a line shape. This is performed by applying a capture antibody solution.
- the antibody concentration is preferably 0.1 mg / mL to 5 mg / mL, more preferably 0.5 mg / mL to 2 mg / mL.
- the above antibody solution can be usually prepared using a predetermined buffer solution.
- the buffer include normal buffers such as phosphate buffer, Tris buffer, and Good's buffer.
- the pH of the buffer is preferably in the range of pH 6.0 to 9.5, more preferably 6.5 to 8.5, and even more preferably pH 7.0 to 8.0.
- the buffer may further contain salts such as NaCl, stabilizers and preservatives such as sucrose, and preservatives such as Procrine (registered trademark).
- the salts include those that are present in the step of adjusting the pH of the buffer solution, such as sodium hydroxide, in addition to those that are included for adjusting the ionic strength, such as NaCl.
- blocking can also be performed by coating a commonly used blocking agent in the form of a solution or vapor.
- a commonly used blocking agent in the form of a solution or vapor.
- the sample treatment liquid of the present invention can be used together with a conventional immunochromatographic reagent, and both can be used together as an immunochromatographic reagent or an immunochromatographic reagent kit.
- the “immunochromatography reagent” includes reagent components necessary for measurement by the immunochromatography method and members such as a test strip.
- the presence of the specific surfactant described above in the immunochromatography system for detecting influenza virus, or the presence of a specific salt in addition to the specific surfactant is important for high-sensitivity detection. It can be said that there is. For this reason, the following description will be given with reference to examples prepared in a liquid state as a sample treatment solution as a method for treating influenza virus.
- the present invention is not limited to these, and an immunochromatography system for detecting influenza virus is used. Any form containing the above-mentioned specific surfactant or a specific surfactant and a specific salt is within the scope of this patent.
- the obtained two cell lines were each intraperitoneally administered to pristane-treated BALB / c mice, and about 2 weeks later, antibody-containing ascites was collected.
- IgG was purified from the obtained ascites by affinity chromatography using a protein A column to obtain two types of purified anti-type B influenza virus M1 antibodies.
- antibody-immobilized membrane Predetermined nitrocellulose membrane lined with PET film with purified anti-influenza B virus M1 antibody diluted with purified water to 1.0 mg / mL The membrane was applied linearly to the position and dried at 45 ° C. for 30 minutes to obtain an anti-B influenza virus M1 antibody-immobilized membrane (hereinafter referred to as antibody-immobilized membrane).
- antibody-immobilized membrane Predetermined nitrocellulose membrane lined with PET film with purified anti-influenza A virus M1 antibody diluted to 1.0 mg / mL with purified water The membrane was applied linearly to the position and dried at 45 ° C. for 30 minutes to obtain an anti-influenza A virus M1 antibody-immobilized membrane (hereinafter referred to as antibody-immobilized membrane).
- Example 1 Selection of the optimal surfactant type In order to search for the optimal surfactant in immunochromatography for detection of influenza A virus and M1 protein, the performance of the surfactant was compared. First, a sample treatment solution containing one of the surfactants shown in Table 1 at a concentration of 1 (w / v)% and containing 10 mM MES (pH 7.0) and 3% BSA as other components was prepared. In addition, what corresponds to the conventional specimen processing method includes polyoxyethylene octyl phenyl ether of No. 4 in Table 1. Table 1 also shows the number of carbon atoms of the polyoxyethylene (POE) chain of the surfactant used. In addition, numbers 1 to 7 in Table 1 were used for the influenza A virus test, and only numbers 2 to 4 in Table 1 were used for the influenza B virus test.
- POE polyoxyethylene
- Example 2 Concentration of polyoxyethylene cetyl ether The influence of the concentration of polyoxyethylene cetyl ether on immunochromatography for detection of influenza A virus M1 protein was investigated.
- Example 3 Effect of addition of chloride
- a salt component in immunochromatography for detection of influenza virus M1 protein of type A and type B contains 1 (w / v)% of polyoxyethylene cetyl ether, contains any one of sodium chloride, potassium chloride and lithium chloride at the concentrations shown in Table 7 as a salt component, and 10 mM MES (pH 7.0) as the other components. ), A sample treatment solution containing 3% BSA was prepared. As a control condition, a sample treatment solution containing no salt was prepared at the same time. Next, 30 ⁇ L of the inactivated influenza A or B virus was added to 400 ⁇ L of the prepared sample treatment solution and mixed.
- Example 4 Verification of high-sensitivity effect by M1 detection sample treatment method combining optimal surfactant and salt in A1 and B influenza virus M1 detection immunochromatography method 2% polyoxyethylene as sample treatment solution for M1 detection
- Sample treatment solution containing cetyl ether, 1% polyoxyethylene octyl phenyl ether, 0.25M potassium chloride and 0.25M lithium chloride as salt components, and 10 mM MES (pH 7.0), 3% BSA as other components did.
- a specimen treatment method containing 10 mM MES (pH 7.0), 3% BSA, and 1% polyoxyethylene octylphenyl ether was prepared.
- control sample treatment solution can barely detect the inactivated type B virus stock solution, whereas the sample treatment solution for M1 detection uses the inactivated type B influenza virus stock solution. Diluted sample diluted 512 times could be detected (Table 6-2).
- a surfactant component contains a surfactant having a palmityl group, a stearyl group or an oleyl group, and potassium salt, lithium chloride or sodium chloride is used as a salt component. It was found that the contained specimen processing method is effective.
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Hematology (AREA)
- Virology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Pathology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Abstract
Description
本発明が適用可能な検体は、インフルエンザウイルスの存在が疑われるものであれば特に限定されないが、鼻腔拭い液、鼻腔吸引液、鼻かみ液、咽頭拭い液、唾液等の鼻咽頭由来検体(以下、鼻咽頭由来検体という)が好ましく、このうち鼻腔拭い液、鼻腔吸引液が特に好ましい。
上記の通り、本発明の方法では、検体と、界面活性剤とを接触させる。これは、通常、該界面活性剤を含む検体処理液を、上記検体で処理することにより行われる。検体処理液は、通常、緩衝液中に界面活性剤を含むものである。緩衝液としては、特に限定されないが、MES、HEPES、TES、ADA、ACES、bis-Tris、Tris、TES、CAPS、ホウ酸緩衝液、リン酸緩衝液、クエン酸緩衝液等を挙げることができる。界面活性剤は、パルミチル基、ステアリル基およびオレイル基から成る群より選ばれる少なくとも1つの基を持つ界面活性剤である。これらのアルキル基は、直鎖状でも分枝状でもよい。好ましくは、ポリオキシエチレン鎖に少なくとも1個の上記脂肪族基が結合した非イオン界面活性剤である。ポリオキシエチレン鎖の鎖長は、特に限定されないが、通常、オキシエチレン単位の重合度が5~40、好ましくは10~20である。ポリオキシエチレン鎖を有する界面活性剤の好ましい例として、ポリオキシエチレンオレイルエーテル、ポリオキシエチレンステアリルエーテル及びポリオキシエチレンセチルエーテルを挙げることができる。これらの界面活性剤は単独でも2種以上を組み合わせても用いることができる。検体処理液中の該界面活性剤の終濃度(複数の該界面活性剤が含まれる場合にはその合計終濃度)は、0.005(w/v)%~8(w/v)%が好ましく、さらに好ましくは0.5(w/v)%~4(w/v)%である。界面活性剤は、単独で用いることも2種以上を組み合わせて用いることもできる。
前記検体処理液には、アルギニンなどの塩基性アミノ酸、ポリオキシエチレンオクチルフェニルエーテル(例えば、Triton(登録商標)X-100)等の非イオン性界面活性剤、BSAなどの非特異反応抑制剤、スクロースなどの安定化剤や保存剤、プロクリン(登録商標)などの防腐剤等を含んでもよい。水酸化ナトリウム、塩化水素など緩衝液のpHを調整する工程で使用するものも含んでもよい。
本発明の検体処理方法は、鼻咽頭由来等の検体と本発明の前記検体処理液を接触させることにより行われる。例えば、検体が鼻腔吸引検体の場合は、鼻腔吸引液に綿棒等を浸し、検体を浸み込ませた綿棒を本発明の検体処理液に入れて検体を溶解させることで抽出することができる。また、検体が鼻腔拭い検体の場合は、綿棒で鼻腔を拭い、検体を浸み込ませた綿棒を本発明の検体処理液に入れて検体を溶解させることで抽出することができる。この操作は室温で行うことができ、綿棒を浸す検体処理液の量は、綿棒の綿部分の全体を浸漬できる量であれば特に限定されないが、通常、0.05mL~5mLでよい。
上記のように処理した検体を、次に、インフルエンザウイルスのM1タンパク質と抗原抗体反応する抗体又はその抗原結合性断片を用いた免疫測定法に供し、検体中のインフルエンザウイルスを測定する。以下、この免疫測定について説明する。
本発明の免疫測定において測定されるウイルスは、A型インフルエンザウイルスやB型インフルエンザウイルス等のインフルエンザウイルスである。なお、本発明において、「測定」には、検出、定量、半定量のいずれもが包含される。
本発明の免疫測定は、インフルエンザウイルスM1タンパク質を抗原とするものであり、従って、免疫測定には、インフルエンザウイルスのM1タンパク質と抗原抗体反応する抗体又はその抗原結合性断片が用いられる。
本発明の被検出をイムノクロマトグラフィーにより検出する方法(イムノクロマト法)は、被検出物質に対する抗体(以下、抗被検出物質抗体ということがある。)を用いた免疫学的検出方法であれば特に限定されないが、抗被検出物質抗体と標識抗被検出物質抗体を用いたサンドイッチ法がより好ましい。さらに、抗被検出物質抗体としては、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体いずれでもよいが、モノクローナル抗体がより好ましい。上記イムノクロマト法は、上記検体処理方法により抽出された被検出物質と抗被検出物質抗体を固定化したストリップ等を接触させることにより行われる。なお、本発明におけるイムノクロマト法は、定性的な検出、定量的な測定のいずれにも用いることができることはいうまでもない。
これらの抗体に標識する標識物としては、金コロイド粒子、白金コロイド粒子、カラーラテックス粒子、磁性粒子などが好ましく、特にカラーラテックスが好ましい。
カラーラテックスは、例えば特開平6-306108号公報の〔0022〕記載の方法に従い、乳化剤を使用しないソープフリー重合によりポリスチレン系粒子を作製し、同〔0025〕から〔0035〕までに記載された方法に準じて作製可能であり、Seradyn社やMagsphere社などから市販されている着色粒子を用いることも出来る。
以下の説明では、標識物としてカラーラテックス粒子を用いた場合について詳述する。
上記抗体のカラーラテックスへの固定化は、通常化学結合によって行うが、この際、抗体濃度は1mg/mL~5mg/mLに調製されるのが好ましく、緩衝液及びpHは、20mM MES緩衝液(pH5.5~6.5)または50mMホウ酸緩衝液(pH8~9)が好ましく、さらに好ましくは20mMMES緩衝液(pH6.5)である。また、カラーラテックス上の抗体が結合していない領域は、BSAなどを結合させブロッキングするのが好適である。このようにして作製されたカラーラテックス標識抗体は、変性を阻止するための保存試薬中に分散され保存される。この変性阻止剤としては、BSAなどの蛋白質、グリセリン、糖などが用いられる。
また、固相の素材としては、ポリエチレン、ポリエチレンテレフタレート、ナイロン類、ガラス、セルロースやセルロース誘導体などの多糖類、あるいはセラミックス等が挙げられる。具体的には、ミリポア社、東洋濾紙社、ワットマン社、ライデル社などより販売されているガラス繊維ろ紙や、セルロースろ紙などの他、ポリスチレンプレート、ガラス繊維膜、ナイロン膜、ニトロセルロース膜などが好ましく、特にニトロセルロース膜が好ましい。以下、固相の素材としてニトロセルロース膜を用いた場合について詳述する。
被検出物質としての抗原(例えば、インフルエンザウイルス)と標識抗体との複合体を検出するための捕捉用抗体のニトロセルロース膜への固定化は、一般に周知の方法で実施することができる。例えば、ラテラルフロー式の場合には、ノズルから捕捉用抗体を含む液を一定の速度で吐出しながら水平方向に移動させることのできる機構を有する装置などを用いて、ライン状にニトロセルロース膜に捕捉用抗体液を塗布することにより行われる。この際、抗体の濃度は0.1mg/mL~5mg/mLが好ましく、0.5mg/mL~2mg/mLがさらに好適である。また、上記の抗体液は、通常、所定の緩衝液を用いて調製され得る。前記緩衝液の種類としては、リン酸緩衝液、トリス緩衝液、グッド緩衝液など通常使用される緩衝液をあげることができる。緩衝液のpHはpH6.0~9.5の範囲が好ましく、pH6.5~8.5がより好ましく、pH7.0~8.0がさらに好ましい。緩衝液には、さらにNaClなどの塩類、スクロースなどの安定剤や保存剤、プロクリン(登録商標)などの防腐剤等を含んでもよい。塩類はNaClなどのようにイオン強度の調整のために含ませるもののほか、水酸化ナトリウムなど緩衝液のpHを調整する工程で存在するようになるものも含まれる。
ニトロセルロース膜に抗体を固定化した後、さらに、通常使用されるブロッキング剤を溶液あるいは蒸気状にして被覆し、ブロッキングを行うこともできる。
ニトロセルロース膜の孔径を適宜選択することにより、カラーラテックス標識抗体と被検出物質である抗原(例えば、インフルエンザウイルス)との免疫複合体が膜中を流れる速度を制御することが可能である。この流れる速度により、膜に固定化された上記抗体に結合する標識抗体量を調節することができるため、適切な孔径を有する膜を選択することが好ましい。好適には、ミリポア社、Hi Flow Plus HF180などが用いられる。
本発明の検体処理液は、従来のイムノクロマト試薬とともに用いることができ、両者を併せてイムノクロマト試薬またはイムノクロマト試薬キットとして用いることもできる。
尚、「イムノクロマト試薬」とは、イムノクロマト法による測定に必要な試薬成分や、テストストリップ等の部材をも含めたものである。
B型インフルエンザウイルス抗原をBALB/cマウスに免疫し、一定期間飼育したマウスから脾臓を摘出し、ケラーらの方法(Kohler et al., Nature, vol, 256, p495-497(1975))によりマウスミエローマ細胞(P3×63)と融合した。得られた融合細胞(ハイブリドーマ)を、37℃インキュベーター中で維持し、B型インフルエンザウイルスM1抗原を固相したプレートを用いたELISAにより上清の抗体活性を確認しながら細胞の純化(単クローン化)を行った。取得した該細胞2株をそれぞれプリスタン処理したBALB/cマウスに腹腔投与し、約2週間後、抗体含有腹水を採取した。得られた腹水からプロテインAカラムを用いたアフィニティークロマトグラフィー法により、それぞれIgGを精製し、2種類の精製抗B型インフルエンザウイルスM1抗体を得た。
精製した抗B型インフルエンザウイルスM1抗体を1.0mg/mLになるように精製水で希釈した液をPETフィルムで裏打ちされたニトロセルロースメンブレンの所定の位置に線状に塗布し、45℃、30分間乾燥させ、抗B型インフルエンザウイルスM1抗体固定化メンブレンを得た(以下抗体固定化メンブレンとする)。
ニトロセルロースメンブレンへの固定化に使用しなかったもう一つの精製した抗B型インフルエンザウイルスM1抗体を1.0mg/mLになるように精製水で希釈し、これに着色ポリスチレン粒子を0.1%になるように加え、攪拌後、カルボジイミドを1%になるように加え、さらに攪拌する。遠心操作により上清を除き、50mM Tris(pH9.0)、3%BSAに再浮遊し、抗B型インフルエンザウイルスM1抗体結合着色ポリスチレン粒子を得た。
3.で得た抗B型インフルエンザウイルスM1抗体結合着色ポリスチレン粒子をグラスファイバー不織布に所定量1.0μgを塗布し、45℃、30分間乾燥させた。
2.4.で調製した抗体固定化メンブレンと乾燥パッドを他部材(バッキングシート、吸収帯、サンプルパッド)と貼り合せて5mm幅に切断し、B型インフルエンザウイルス試験片とした。
A型インフルエンザウイルス抗原をBALB/cマウスに免疫し、一定期間飼育したマウスから脾臓を摘出し、ケラーらの方法(Kohler et al., Nature, vol, 256, p495-497(1975))によりマウスミエローマ細胞(P3×63)と融合した。得られた融合細胞(ハイブリドーマ)を、37℃インキュベーター中で維持し、A型インフルエンザウイルスM1抗原を固相したプレートを用いたELISAにより上清の抗体活性を確認しながら細胞の純化(単クローン化)を行った。取得した該細胞2株をそれぞれプリスタン処理したBALB/cマウスに腹腔投与し、約2週間後、抗体含有腹水を採取した。得られた腹水からプロティンAカラムを用いたアフィニティークロマトグラフィー法により、それぞれIgGを精製し、2種類の精製抗A型インフルエンザウイルスM1抗体を得た。
精製した抗A型インフルエンザウイルスM1抗体を1.0mg/mLになるように精製水で希釈した液をPETフィルムで裏打ちされたニトロセルロースメンブレンの所定の位置に線状に塗布し、45℃、30分間乾燥させ、抗A型インフルエンザウイルスM1抗体固定化メンブレンを得た(以下抗体固定化メンブレンとする)。
ニトロセルロースメンブレンへの固定化に使用しなかったもう一つの精製した抗B型インフルエンザウイルスM1抗体を1.0mg/mLになるように精製水で希釈し、これに着色ポリスチレン粒子を0.1%になるように加え、攪拌後、カルボジイミドを1%になるように加え、さらに攪拌する。遠心操作により上清を除き、50mM Tris(pH9.0)、3%BSAに再浮遊し、抗A型インフルエンザウイルスM1抗体結合着色ポリスチレン粒子を得た。
8.で得た抗A型インフルエンザウイルスM1抗体結合着色ポリスチレン粒子をグラスファイバー不織布に所定量1.0μgを塗布し、45℃、30分間乾燥させた。
7.および9.で調製した抗体固定化メンブレンと乾燥パッドを他部材、バッキングシート、吸収帯、サンプルパッドと貼り合せて5mm幅に切断しA型インフルエンザウイルス試験片とした。
A型およびB型インフルエンザウイルスM1タンパク質検出イムノクロマトにおける最適な界面活性剤を探索するために、界面活性剤の性能を比較した。まず、表1に示す界面活性剤のうち1種類を1(w/v)%の濃度で含み、その他の成分として10mM MES(pH7.0)、3%BSAを含む検体処理液を作製した。なお従来の検体処理方法に相当するのは表1の番号4のポリオキシエチレンオクチルフェニルエーテルを含むものである。表1には、用いた界面活性剤のポリオキシエチレン(POE)鎖の炭素数も併せて示す。なおA型インフルエンザウイルスの試験には表1の番号1~7を使用し、B型インフルエンザウイルスの試験には、表1の番号2~4のみを使用した。
A型およびB型インフルエンザウイルスM1タンパク質検出イムノクロマトにおける、ポリオキシエチレンセチルエーテルの濃度の影響について調査した。ポリオキシエチレンセチルエーテルを表3-1に示す濃度で含み、その他の成分として10mM MES(pH6.5)、3%BSAを含む検体処理液を作製した。なお対照としてポリオキシエチレンセチルエーテルを含まないサンプルを用意した(表3-1、表3-2の番号1)。
A型およびB型インフルエンザウイルスM1タンパク質検出イムノクロマトにおける、塩成分の添加効果を調査した。まず、ポリオキシエチレンセチルエーテルを1(w/v)%含み、塩成分として表7に示す濃度の塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化リチウムのいずれかを含み、その他の成分として10mM MES(pH7.0)、3%BSAを含む検体処理液を作製した。対照条件として上記の検体処理液のうち塩を含まない検体処理液も同時に作製した。次に、作製した検体処理液400μLに不活化したA型またはB型インフルエンザウイルスを30μL加えて、混合した。混合液50μLをB型インフルエンザウイルス試験片のサンプルパッド部分に滴下し、10分後に目視判定を行った。テストライン上にシグナルを確認できたものを+とし、シグナルが強くなるに従い2+、3+、4+、5+と相対的に数値を大きくした(A型は表4-1から表4-3、B型は表5-1から5-3に結果を記載した)。
M1検出用検体処理液として、2%ポリオキシエチレンセチルエーテル、1%ポリオキシエチレンオクチルフェニルエーテルを含み、塩成分として0.25M塩化カリウムと0.25M塩化リチウムを、その他の成分として10mM MES(pH7.0)、3%BSAを含む検体処理液を作製した。なお対照条件として10mM MES(pH7.0)、3%BSA、1%ポリオキシエチレンオクチルフェニルエーテルを含む検体処理方法を作製した。上記の2種の検体処理方法を使用して、イムノクロマト法でのインフルエンザウイルスA型、B型の希釈系列(原液~1024倍希釈まで)を使用して性能試験を行なった。同時に従来のNP検出イムノクロマト法との比較も行った。
Claims (10)
- インフルエンザウイルスのマトリックス1タンパク質と抗原抗体反応する抗体又はその抗原結合性断片を用いてインフルエンザウイルスを免疫測定する際、インフルエンザウイルスを含む検体を、パルミチル基、ステアリル基およびオレイル基から成る群より選ばれる少なくとも1つの基を持つ界面活性剤を含む検体処理液と接触させることを含む、インフルエンザウイルスの免疫測定における検体処理方法。
- 前記界面活性剤が、ポリオキシエチレン鎖を持つ界面活性剤である請求項1記載の方法。
- 前記界面活性剤が、ポリオキシエチレンオレイルエーテル、ポリオキシエチレンステアリルエーテル及びポリオキシエチレンセチルエーテルから成る群より選ばれる少なくとも1種である請求項2記載の方法。
- 前記検体処理液中の界面活性剤の終濃度が0.005(w/v)%~8(w/v)%である請求項1~3のいずれか1項に記載の方法。
- 前記終濃度が0.5(w/v)%~4(w/v)%である請求項4記載の方法。
- 前記検体処理液が、塩化物をさらに含む請求項1~5のいずれか1項に記載の方法。
- 前記塩化物が、アルカリ金属塩化物である請求項6記載の方法。
- 前記検体処理液中の前記塩化物の終濃度が0.05M~1.5Mである請求項6又は7記載の方法。
- 請求項1~8のいずれか1項に記載の方法により処理した検体を、インフルエンザウイルスのマトリックス1タンパク質と抗原抗体反応する抗体又はその抗原結合性断片を用いた免疫測定法に供し、検体中のインフルエンザウイルスを測定することを含む、インフルエンザウイルスの免疫測定法。
- イムノクロマト法である請求項9記載の免疫測定法。
Priority Applications (5)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2015536605A JP6429781B2 (ja) | 2013-09-10 | 2014-09-10 | インフルエンザウイルスの免疫測定における検体処理方法及び免疫測定法 |
US14/917,632 US10527618B2 (en) | 2013-09-10 | 2014-09-10 | Sample processing method for influenza virus immunoassay, and immunoassay method |
CN201480049931.9A CN105745541B (zh) | 2013-09-10 | 2014-09-10 | 流感病毒免疫测定中的检样处理方法和免疫测定方法 |
EP14843481.4A EP3045913B1 (en) | 2013-09-10 | 2014-09-10 | Immunoassay for influenza virus |
KR1020167008109A KR102301851B1 (ko) | 2013-09-10 | 2014-09-10 | 인플루엔자 바이러스의 면역 측정에 있어서의 검체 처리 방법 및 면역 측정법 |
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2013-187355 | 2013-09-10 | ||
JP2013187355 | 2013-09-10 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
WO2015037635A1 true WO2015037635A1 (ja) | 2015-03-19 |
Family
ID=52665737
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
PCT/JP2014/073971 WO2015037635A1 (ja) | 2013-09-10 | 2014-09-10 | インフルエンザウイルスの免疫測定における検体処理方法及び免疫測定法 |
Country Status (6)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US10527618B2 (ja) |
EP (1) | EP3045913B1 (ja) |
JP (1) | JP6429781B2 (ja) |
KR (1) | KR102301851B1 (ja) |
CN (1) | CN105745541B (ja) |
WO (1) | WO2015037635A1 (ja) |
Cited By (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2020159827A (ja) * | 2019-03-26 | 2020-10-01 | 田中貴金属工業株式会社 | ヒトメタニューモウイルス検出用試薬 |
WO2020196295A1 (ja) | 2019-03-25 | 2020-10-01 | 積水メディカル株式会社 | 呼吸器感染ウイルスの免疫学的分析方法及び検出キット |
JP2020180834A (ja) * | 2019-04-24 | 2020-11-05 | 日本製粉株式会社 | トマト黄化葉巻ウイルス(tylcv)の免疫学的診断法 |
Families Citing this family (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN109900913A (zh) * | 2019-04-26 | 2019-06-18 | 江苏硕世生物科技股份有限公司 | 一种甲型和乙型流感病毒抗原胶体金法联合检测试剂盒及其制备方法 |
CN116298277A (zh) * | 2020-09-03 | 2023-06-23 | 菲鹏生物股份有限公司 | 一种样本处理液及其应用 |
WO2022075503A1 (ko) * | 2020-10-08 | 2022-04-14 | 전민재 | 블록킹제, 이를 사용하는 분석 재료의 검출 방법 및 이를 포함하는 분석 재료의 검출 키트 |
CN115951043A (zh) * | 2023-03-09 | 2023-04-11 | 天津博奥赛斯生物科技股份有限公司 | 一种用于新冠抗原胶体金检测的样本处理液 |
Citations (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPH06306108A (ja) | 1993-04-27 | 1994-11-01 | Sekisui Chem Co Ltd | 着色ラテックス粒子の製造方法 |
JP2006084351A (ja) * | 2004-09-16 | 2006-03-30 | Denka Seiken Co Ltd | 検体浮遊液組成物、キット及び検査方法 |
WO2012018057A1 (ja) * | 2010-08-03 | 2012-02-09 | 田中貴金属工業株式会社 | イムノクロマトグラフィー用試薬組成物およびそれを用いた測定方法 |
JP2012073270A (ja) | 2010-02-26 | 2012-04-12 | Sekisui Medical Co Ltd | 偽陽性反応を抑制する検体抽出液 |
JP4976068B2 (ja) | 2006-07-05 | 2012-07-18 | デンカ生研株式会社 | 簡易イムノアッセイ用検体浮遊液およびアッセイ方法 |
JP2013140035A (ja) * | 2011-12-28 | 2013-07-18 | Denka Seiken Co Ltd | 気泡吸着抑制方法 |
Family Cites Families (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4810630A (en) * | 1987-03-30 | 1989-03-07 | E. I. Du Pont De Nemours And Company | Use of polyoxyethylene ethers to improve the performance of immunoassays employing peroxidase conjugates |
TW201346040A (zh) * | 2012-03-30 | 2013-11-16 | Tanaka Precious Metal Ind | 流行性感冒a型病毒檢驗用套組 |
-
2014
- 2014-09-10 KR KR1020167008109A patent/KR102301851B1/ko active IP Right Grant
- 2014-09-10 US US14/917,632 patent/US10527618B2/en active Active
- 2014-09-10 EP EP14843481.4A patent/EP3045913B1/en active Active
- 2014-09-10 CN CN201480049931.9A patent/CN105745541B/zh active Active
- 2014-09-10 WO PCT/JP2014/073971 patent/WO2015037635A1/ja active Application Filing
- 2014-09-10 JP JP2015536605A patent/JP6429781B2/ja active Active
Patent Citations (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPH06306108A (ja) | 1993-04-27 | 1994-11-01 | Sekisui Chem Co Ltd | 着色ラテックス粒子の製造方法 |
JP2006084351A (ja) * | 2004-09-16 | 2006-03-30 | Denka Seiken Co Ltd | 検体浮遊液組成物、キット及び検査方法 |
JP4976068B2 (ja) | 2006-07-05 | 2012-07-18 | デンカ生研株式会社 | 簡易イムノアッセイ用検体浮遊液およびアッセイ方法 |
JP2012073270A (ja) | 2010-02-26 | 2012-04-12 | Sekisui Medical Co Ltd | 偽陽性反応を抑制する検体抽出液 |
WO2012018057A1 (ja) * | 2010-08-03 | 2012-02-09 | 田中貴金属工業株式会社 | イムノクロマトグラフィー用試薬組成物およびそれを用いた測定方法 |
JP2013140035A (ja) * | 2011-12-28 | 2013-07-18 | Denka Seiken Co Ltd | 気泡吸着抑制方法 |
Non-Patent Citations (4)
Title |
---|
.: "Standard Microbiology 10th Edition,", IGAKU-SHOIN LTD |
BUCHER D ET AL.: "M protein (M1) of influenza virus: antigenic analysis and intracellular localization with monoclonal antibodies", J. VIROL., vol. 63, no. 9, September 1989 (1989-09-01), pages 3622 - 3633, XP055221518 * |
KOHLER ET AL., NATURE, vol. 256, 1975, pages 495 - 497 |
See also references of EP3045913A4 * |
Cited By (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2020196295A1 (ja) | 2019-03-25 | 2020-10-01 | 積水メディカル株式会社 | 呼吸器感染ウイルスの免疫学的分析方法及び検出キット |
JP2020159827A (ja) * | 2019-03-26 | 2020-10-01 | 田中貴金属工業株式会社 | ヒトメタニューモウイルス検出用試薬 |
WO2020194285A1 (ja) * | 2019-03-26 | 2020-10-01 | 田中貴金属工業株式会社 | ヒトメタニューモウイルス検出用試薬 |
JP7274904B2 (ja) | 2019-03-26 | 2023-05-17 | 田中貴金属工業株式会社 | ヒトメタニューモウイルス検出用試薬 |
JP2020180834A (ja) * | 2019-04-24 | 2020-11-05 | 日本製粉株式会社 | トマト黄化葉巻ウイルス(tylcv)の免疫学的診断法 |
JP7267548B2 (ja) | 2019-04-24 | 2023-05-02 | 株式会社ニップン | トマト黄化葉巻ウイルス(tylcv)の免疫学的診断法 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
EP3045913B1 (en) | 2019-01-16 |
EP3045913A1 (en) | 2016-07-20 |
KR20160051817A (ko) | 2016-05-11 |
CN105745541A (zh) | 2016-07-06 |
JPWO2015037635A1 (ja) | 2017-03-02 |
JP6429781B2 (ja) | 2018-11-28 |
US20160223540A1 (en) | 2016-08-04 |
EP3045913A4 (en) | 2017-05-31 |
CN105745541B (zh) | 2019-09-13 |
US10527618B2 (en) | 2020-01-07 |
KR102301851B1 (ko) | 2021-09-14 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP6429781B2 (ja) | インフルエンザウイルスの免疫測定における検体処理方法及び免疫測定法 | |
JP6116268B2 (ja) | 生体粘膜由来検体測定イムノアッセイにおいて偽陰性を抑制する方法 | |
JP4918627B2 (ja) | 偽陽性反応を抑制する検体抽出液 | |
KR101919330B1 (ko) | 고감도의 면역크로마토그래프 방법 및 면역크로마토그래프용 키트 | |
JP2015210237A (ja) | 免疫クロマト分析キット及び免疫クロマト分析方法 | |
JPWO2013147307A1 (ja) | 赤血球含有サンプル中の対象物を検出するためのイムノクロマトグラフィー用テストストリップおよびイムノクロマトグラフィーを利用した検出方法 | |
CN114062670A (zh) | 对试样中的病毒抗原进行测定的方法、抗体组及试剂盒 | |
JP6399632B2 (ja) | 赤血球含有サンプル中の対象物を検出するためのイムノクロマトグラフィー用テストストリップ、および該テストストリップを使用するイムノクロマトグラフィー | |
JP7455947B2 (ja) | アデノウイルスの免疫測定方法及び免疫測定器具 | |
WO2013147308A1 (ja) | 赤血球含有サンプル中の対象物を検出するためのイムノクロマトグラフィー用テストストリップおよびイムノクロマトグラフィーを利用した検出方法 | |
WO2022054821A1 (ja) | 偽陰性の抑制により特異性を改善した検査試薬 | |
WO2022024925A1 (ja) | シグナルの低下を改善した検査試薬 | |
JP7216949B1 (ja) | 等電点9.5以上のタンパク質の免疫測定方法及びそれに用いる検体希釈液、並びにイムノクロマトグラフィーキット | |
JP6703354B2 (ja) | 非特異反応抑制剤および前処理方法 | |
WO2022054822A1 (ja) | 偽陽性の抑制により特異性を改善した検査キット | |
JP7436274B2 (ja) | アデノウイルスの免疫測定方法及び免疫測定器具 | |
WO2019163922A1 (ja) | モノクローナル抗体および非特異反応抑制剤 | |
WO2019163923A1 (ja) | モノクローナル抗体および非特異反応抑制剤 | |
JP5788303B2 (ja) | IgG抗体を含有する動物腹水のスクリーニング方法 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
121 | Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application |
Ref document number: 14843481 Country of ref document: EP Kind code of ref document: A1 |
|
ENP | Entry into the national phase |
Ref document number: 2015536605 Country of ref document: JP Kind code of ref document: A |
|
WWE | Wipo information: entry into national phase |
Ref document number: 14917632 Country of ref document: US |
|
NENP | Non-entry into the national phase |
Ref country code: DE |
|
ENP | Entry into the national phase |
Ref document number: 20167008109 Country of ref document: KR Kind code of ref document: A |
|
REEP | Request for entry into the european phase |
Ref document number: 2014843481 Country of ref document: EP |
|
WWE | Wipo information: entry into national phase |
Ref document number: 2014843481 Country of ref document: EP |