WO2015022883A1 - 光透過性に優れた生物材料を調製するための組成物およびその利用 - Google Patents

光透過性に優れた生物材料を調製するための組成物およびその利用 Download PDF

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urea
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悦生 洲▼崎▲
泰己 上田
一貴 田井中
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    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N1/00—Sampling; Preparing specimens for investigation
    • G01N1/28—Preparing specimens for investigation including physical details of (bio-)chemical methods covered elsewhere, e.g. G01N33/50, C12Q
    • G01N1/30—Staining; Impregnating ; Fixation; Dehydration; Multistep processes for preparing samples of tissue, cell or nucleic acid material and the like for analysis

Definitions

  • the present invention relates to a composition for preparing a biological material excellent in light transmittance and use thereof.
  • Non-Patent Documents 1 and 2 disclose a transparency treatment technique using benzylbenzoate / benzylalchol (benzyl group) (BABB method).
  • BABB method is a classic tissue clarification method using an organic solvent, and is applied as a method for producing a clarified sample to be applied to a sheet illumination macro zoom microscope (see, for example, Non-Patent Document 3).
  • Non-Patent Document 4 discloses a technique (SeeDB method) for adjusting the refractive index using fructose. Since the main purpose is to minimize the change in biological tissue that occurs during processing, the structure at the molecular level, the membrane structure, the shape of the axon, etc. are almost completely maintained. The whole brain level can be observed by using a two-photon microscope and an optimized lens.
  • Non-Patent Document 5 discloses a technique (CLARITY method) for performing transparency by a physicochemical method using an electrophoresis apparatus.
  • CLARITY method the brain tissue solidified with an acrylamide polymer is physicochemically processed using an electrophoresis apparatus to remove the lipid component, thereby realizing transparency.
  • a high degree of transparency can be achieved in about two weeks while maintaining the molecular structure in the tissue. It can be applied to both fluorescent protein labeling and immunostaining.
  • Non-Patent Document 6 discloses a technique (Scale method) that has succeeded in minimizing the disappearance of a fluorescent signal by using a water-soluble reagent.
  • the resulting clear sample has high transparency, but has a problem that the fluorescence signal rapidly disappears due to dehydration treatment and organic solvent treatment. Yes.
  • the BABB method is difficult to make transparent by performing immunostaining with a three-dimensional tissue, and there is a concern in terms of safety because an organic solvent is used.
  • Non-Patent Document 4 requires several days for scanning although it can observe the whole brain level.
  • the SeeDB method is assumed to use a two-photon microscope, the transparency of the treated tissue (particularly the adult brain) is not so high as to be applicable to a sheet illumination macro zoom microscope.
  • Non-Patent Document 5 The CLARITY method described in Non-Patent Document 5 is not suitable for multi-sample application because the process is complicated and a dedicated device is required.
  • Non-Patent Document 6 When the Scale method described in Non-Patent Document 6 is used, the transparency (especially the adult brain) is not high enough to be adapted to the sheet illumination system, and the Scale method requires a week to month unit to achieve transparency. Need a period.
  • the present invention has been made to solve the above-mentioned problems, and is intended to perform high-throughput observation of gene expression / localization and cell morphology in a tissue at the whole tissue level without using an organic solvent.
  • the purpose is to provide the technology.
  • the present inventors have intensively studied. As a result, it was newly found that by using a specific compound in a specific combination, the light transmittance of the tissue can be increased to a level that can be adapted to a high-throughput three-dimensional imaging system, and the present invention has been completed. It came to do.
  • the reagent composition according to the present invention is characterized by containing an amino alcohol in order to prepare a biological material excellent in light transmittance.
  • the reagent composition according to the present invention further comprises at least one compound selected from the group consisting of urea and urea derivatives, a nonionic surfactant, and at least one selected from the group consisting of sucrose. Also good.
  • the reagent kit according to the present invention comprises an amino alcohol, at least one compound selected from the group consisting of urea and a urea derivative, a nonionic surfactant, and a non-ionic surfactant, in order to prepare a biological material having excellent light transmittance. And a second solution containing amino alcohol, at least one compound selected from the group consisting of urea and urea derivatives, and sucrose.
  • the second solution may further contain a nonionic surfactant.
  • composition according to the present invention is characterized by containing an amino alcohol in order to produce the reagent composition or reagent kit described above.
  • the kit according to the present invention comprises at least one compound selected from the group consisting of amino alcohol, urea and urea derivatives, a nonionic surfactant, and sucrose. And at least one selected from the group consisting of:
  • a method for preparing a biological material with excellent light transmission includes amino alcohol, at least one compound selected from the group consisting of urea and urea derivatives, and a nonionic surfactant. It includes a first infiltration step for infiltrating the biological material with the first solution.
  • the method further includes a second infiltration step of infiltrating the biological material with a second solution containing amino alcohol, at least one compound selected from the group consisting of urea and urea derivatives, and sucrose. Also good.
  • the second solution may further contain a nonionic surfactant.
  • the biological material according to the present invention is characterized by being excellent in light transmittance by being prepared according to the above-described method.
  • the immunohistochemical assay according to the present invention is characterized by using a biological material prepared by any of the above methods.
  • the method for searching for a tissue site reactive with the autoantibody according to the present invention is characterized by using the above immunohistochemical assay.
  • the method for searching for an antigen against an autoantibody according to the present invention is characterized by using the above immunohistochemical assay.
  • the biochemical assay according to the present invention is characterized by using a biological material prepared by any of the above methods.
  • the present invention is a technology based on chemical processing, and does not involve the use of special devices or complicated procedures. Furthermore, according to the present invention, high transparency can be achieved by simple processing to a level that enables high-throughput analysis of a large number of samples.
  • FIG. 3 shows the results of a three-dimensional immunohistochemical assay of whole mouse brain treated with the present invention, for one example of the present invention.
  • FIG. 3 shows mouse blood treated with the present invention, for one embodiment of the present invention. It is a figure which shows the result of having confirmed the light transmittance of various mouse
  • the present inventors conducted a large-scale screening based on a unique viewpoint, and selected several amino alcohols, nonionic surfactants, and urea, and a first solution for realizing high-throughput tissue imaging. was completed. Moreover, the present inventors completed the 2nd solution containing sucrose based on another original viewpoint. And it confirmed that these solutions provide the effect superior to the effect of a conventionally well-known clearing reagent, and discovered that the effect at the time of using especially combining two types of solutions was very excellent. It was.
  • the present invention provides a reagent composition for preparing a biological material excellent in light transmittance.
  • the reagent composition according to the present invention is a solution containing an amino alcohol.
  • the reagent composition according to the present invention may contain urea or a urea derivative.
  • the reagent composition according to the present invention is a composition not containing sucrose (also referred to as a first solution or a first reagent) or a composition further including sucrose (also referred to as a second solution or a second reagent).
  • sucrose also referred to as a first solution or a first reagent
  • sucrose also referred to as a second solution or a second reagent
  • the present invention also provides a reagent kit for preparing a biological material having excellent light transmittance.
  • the reagent kit according to the present invention comprises a first solution containing amino alcohol and urea or urea derivative and a nonionic surfactant, and a second solution containing amino alcohol and urea or urea derivative and sucrose. It is characterized by having.
  • the second solution may further contain a nonionic surfactant as required.
  • the present invention further provides a composition for producing a reagent composition for preparing a biological material having excellent light transmittance.
  • the composition according to the present invention is characterized by containing an amino alcohol.
  • the present invention also provides a kit for producing a reagent composition for preparing a biological material excellent in light transmittance.
  • the kit according to the present invention comprises an amino alcohol, urea or a urea derivative, and, if necessary, a nonionic surfactant and / or sucrose. It may further include a solvent necessary for constituting.
  • kit is intended to include a package with a container (eg, bottle, plate, tube, dish, etc.) containing a particular material (eg, a component).
  • the kit preferably includes instructions for using each material.
  • “provided” is intended to mean a state in which the material is contained in any of the individual containers constituting the kit.
  • the kit according to the present invention may be a package in which a plurality of different compositions are packed together, and the composition may be contained in a plurality of different containers in the form of a solution.
  • the kit according to the present invention may be provided with a plurality of components mixed in the same container or in separate containers.
  • the “instructions” may be written or printed on paper or other media, or may be affixed to electronic media such as magnetic tape, computer readable disk or tape, CD-ROM, etc.
  • the procedure for realizing the use of the kit is described.
  • the kit according to the present invention may also include a container containing a diluent, a solvent, a washing solution or other reagent.
  • the kit concerning this invention may be equipped with the instrument and reagent required in order to perform the procedure for implement
  • the term “light transmission” refers to how much transmitted light passes through the incident light, or how much fluorescence by excitation light irradiation passes and the degree of scattering is low.
  • the expression “excellent in light transmission” means that the ratio of the light emitted from the observation target (that is, the transmitted light) to the light incident on the observation target is high.
  • the ratio of transmitted light to incident light is 0% in the case of a substance that blocks light (for example, black-thick plastic or metal), and in the case of a transparent liquid such as water. It can be expressed as a percentage as 100%.
  • the ratio of the transmitted light to the incident light is such that the light transmittance measured using a spectrocolorimeter is 40% or more, preferably 50% or more, It is 60% or more, 70% or more, 80% or more, 90% or more, 95% or more, 98% or more, or 99% or more.
  • the procedure for preparing the reagent composition or reagent kit of the present invention using the above-described composition or kit for producing a reagent composition is not particularly limited, and each constituent component may be dissolved in a solvent, and the order of dissolution is as follows. Is also not limited.
  • the type of biological material to which the present invention is applied is not particularly limited, but plant-derived materials or animal-derived materials are preferable, and materials derived from animals such as fish, amphibians, reptiles, birds or mammals (mammals) are more preferable.
  • a mammal-derived material is preferable.
  • the type of mammal is not particularly limited, but laboratory animals such as primates excluding mice, rats, rabbits, guinea pigs and humans; pets such as dogs and cats (pets); domestic animals such as cows and horses; humans; Is mentioned.
  • the biological material may be an individual itself (excluding a living human individual itself), an organ, tissue, or body fluid obtained from an individual of a multicellular organism (for example, blood, saliva, serum, plasma, urine, Synovial fluid, CSF, etc.) or cells.
  • the organism may be an adult or a fetus.
  • the biological material is a tissue or organ derived from a multicellular animal (for example, the whole or a part of the brain, heart, lung, liver or kidney), or The clearing treatment can be applied even to an individual (for example, an embryo) of a multicellular animal excluding a human.
  • the biological material described above may be a material that has been immobilized for microscopic observation, or may be a material that has not been immobilized.
  • an immobilized material it is preferable to perform a treatment of sufficiently immersing (for example, 24 hours or more) in a 20% (w / v) sucrose / PBS solution after the immobilization treatment.
  • the material is preferably embedded in an OCT compound, frozen in liquid nitrogen, thawed in PBS, and fixed again with a 4% (w / v) paraformaldehyde / PBS solution.
  • the unit% (w / v) is a percentage of the weight (w (gram)) of the solvent (sucrose or paraformaldehyde) to be used with respect to the volume of the solution (v (milliliter)).
  • the biological material is, for example, a biological tissue injected with a fluorescent chemical substance, a biological tissue stained with a fluorescent chemical substance, a biological tissue transplanted with cells expressing a fluorescent protein, or a fluorescent protein expressed It may be a living tissue of a genetically modified animal.
  • the light permeability of biological material can be remarkably enhanced, so that high-throughput tissue imaging is possible by combining with the latest microscope technology.
  • ⁇ Disappearance of fluorescent protein and fluorescent substance signals is minimized.
  • Multiple samples (tens to hundreds) can be processed simultaneously in parallel.
  • High transparency is achieved to the extent that it can be used in combination with a sheet illumination microscope. -Minimize the impact on organizational area construction.
  • the present invention if used, the light transmittance of the body fluid can be remarkably increased, so that the analysis can be performed while eliminating the influence of the pigment in the body fluid.
  • An amino alcohol is a compound having a hydroxyl group and an amino group.
  • Amino alcohols are well known to be used as neutralizing agents in water-based paints, but are also used as components of ink compositions or pharmaceutical compositions.
  • Japanese Unexamined Patent Application Publication No. 2011-12226 discloses an ink composition for ink jet recording in which amino alcohol is blended as a dispersion stabilizer
  • Japanese Unexamined Patent Application Publication No. 2009-212252 discloses an amino acid composition containing an amino alcohol. It is disclosed that the wiping property is improved by containing alcohol.
  • Amino alcohol is a water-soluble polymer compound (molecular weight of about 50,000 to 60,000 or more and does not substantially enter the cell), which is an optional component in the Scale reagent. It is not a dry inhibitory ingredient.
  • polyhydric alcohols such as glycerin (glycerol), together with amino alcohols, are provided from the viewpoint of preventing drying and imparting wetness. Contained. This indicates that both amino alcohol and glycerin are alcohols and have different functions that cannot be complemented, and even if they are used together, they cannot be said to be replaceable. . And those skilled in the art are fully aware of this.
  • amino alcohol is not described or suggested as a composition of the Scale reagent, and is not used in a known clearing reagent. Therefore, a reagent for preparing a biological material having excellent light transmittance.
  • the use of aminoalcohols is not easily conceivable by those skilled in the art.
  • the amino alcohol used in the present invention may be an alkanolamine (methanolamine, ethanolamine, propanolamine, butanolamine, etc.) or an aromatic aminoalcohol, which are a primary alcohol, secondary alcohol, 3 It is not limited to any grade alcohol.
  • alkanolamine methanolamine, ethanolamine, propanolamine, butanolamine, etc.
  • aromatic aminoalcohol which are a primary alcohol, secondary alcohol, 3 It is not limited to any grade alcohol.
  • Examples of the amino alcohol suitably used in the present invention include monoethanolamine, diethanolamine, triethanolamine, monopropanolamine, dipropanolamine, tripropanolamine, monoisopropanolamine, diisopropanolamine, triisopropanolamine, and methylethanol.
  • N, N, N ′, N′-tetrakis (1-hydroxyethyl) ethylenediamine, N, N, N ′, N′-tetrakis (2-hydroxyethyl) ethylenediamine, N, N, N ′, N′— Tetrakis (1-hydroxypropyl) ethylenediamine, N, N, N ′, N′-tetrakis (2-hydroxyprotyl) ethylenediamine and the like are also preferably used in the present invention.
  • the amino alcohol is N, N, N ′, N′-tetrakis (2-hydroxypropyl) ethylenediamine, triethanolamine, triisopropanolamine, 2-amino-1,3-propanediol, 3-methyl
  • it is amino-1,2-propanediol, 3-amino-1,2-propanediol, or N, N, N ′, N′-tetrakis (2-hydroxyethyl) ethylenediamine, and a fluorescent protein such as GFP Is preferably N, N, N ′, N′-tetrakis (2-hydroxypropyl) ethylenediamine, triethanolamine, triisopropanolamine, or 2-amino-1,3-propanediol.
  • N, N, ', N'-tetrakis (2-hydroxypropyl) ethylenediamine, triethanolamine or triisopropanolamine is preferred, and N, N, N', N'-tetrakis (2-hydroxypropyl) ethylenediamine or triethanolamine ( That is, 2,2 ′, 2 ′′ -nitrilotriethanol) is more preferable.
  • urea or urea derivative is intended to be at least one of urea and various urea derivatives, and “at least one compound selected from the group consisting of urea and urea derivatives” Is used interchangeably.
  • the type of the urea derivative is not particularly limited, but specifically, for example, various ureins or compounds represented by the following general formula (1).
  • various ureins or compounds represented by the following general formula (1) In addition, a part of uraine is contained in the compound shown in General formula (1).
  • R 1, R 2, R 3 and R 4 are independently hydrogen atoms (however, when all of R 1 to R 4 are hydrogen atoms, they are excluded because they correspond to urea itself).
  • a halogen atom or a hydrocarbon group and when there are a plurality of carbon atoms constituting the hydrocarbon group, a part of the carbon atoms is substituted with a heteroatom such as a nitrogen atom, an oxygen atom or a sulfur atom. Also good.
  • the hydrocarbon group include a chain hydrocarbon group and a cyclic hydrocarbon group.
  • Examples of the chain hydrocarbon group include a chain alkyl group, a chain alkenyl group, and a chain alkynyl group.
  • the number of carbon atoms constituting the chain hydrocarbon group is not particularly limited, and examples thereof include a straight chain or branched chain having 6 or less, and preferably an alkyl group having 1 to 3 carbon atoms.
  • the chain hydrocarbon group may have a substituent such as a halogen atom, for example.
  • Examples of chain alkyl groups include methyl, ethyl, propyl, isopropyl, butyl, iso-butyl, sec-butyl, tert-butyl, hexyl, octyl and the like.
  • Examples of the cyclic hydrocarbon group include a cycloalkyl group and a cycloalkenyl group.
  • the cyclic hydrocarbon group may have a substituent such as a halogen atom.
  • Examples of the cycloalkyl group include those having 3 or more carbon atoms, preferably 6 or less, such as cyclopropyl group, cyclobutyl group, cyclopentyl group, cyclohexyl group, and the like.
  • Examples of the cycloalkenyl group include those having 3 or more, preferably 6 or less carbon atoms, such as a cyclohexenyl group.
  • halogen atom examples include a fluorine atom, a chlorine atom, a bromine atom, and an iodine atom.
  • urea derivative represented by the general formula (1) are as shown in the following 1) to 2).
  • Any three groups selected from R1 to R4 are hydrogen atoms, and the remaining one group is a halogen atom or a chain hydrocarbon group having 1 to 6 carbon atoms. More preferably, the remaining one group is an alkyl group having 1 to 3 carbon atoms or 1 to 2 carbon atoms.
  • Any two groups selected from R1 to R4 are hydrogen atoms, and the remaining two groups are each independently a halogen atom or a chain hydrocarbon group having 1 to 6 carbon atoms. More preferably, the remaining two groups are each an alkyl group having 1 to 3 carbon atoms or 1 to 2 carbon atoms.
  • it is more preferable that one of the two groups to be a hydrogen atom is selected from any of R1 and R2, and the other is selected from any of R3 and R4.
  • Urea is a biologically derived component with extremely low toxicity. Therefore, the reagent composition according to the present invention can be used not only for immobilizing biological materials but also for clarifying non-immobilized (living) biological materials, like the Scale reagent.
  • the reagent composition according to the present invention is also applicable to observation of biological materials using fluorescent protein, similar to the Scale reagent. Can do.
  • urea is extremely inexpensive and easily available, and is excellent in handleability, it is possible to provide a clearing treatment with a very low cost and simple procedure.
  • the reagent composition according to the present invention in addition to the above-described advantages, greatly improves the transparency of opaque biological materials with high light scattering properties compared to conventional clearing reagents. Therefore, it is possible to observe various fluorescent proteins and fluorescent substances existing in the ultra deep tissue. Particularly in the brain tissue, the white matter layer, which has been a barrier for deep observation until now, can be made transparent, and the region located deeper than the white matter layer (for example, the corpus callosum) can be observed. Furthermore, the clearing treatment using the reagent composition according to the present invention is reversible to a certain extent as in the case of using the Scale reagent.
  • the cleared biological material can be released by simply immersing it in a balanced salt solution and used for storage, immunohistochemical assay, biochemical assay, etc.
  • the balanced salt solution is, for example, a balanced salt solution buffered with a phosphate such as PBS or HBSS; a balanced salt solution (TBS) buffered with Tris hydrochloride; an artificial cerebrospinal fluid (ACSF) Basal media for cell culture such as MEM, DMEM, and Ham's F-12; and the like. Since the antigenicity of the protein or the like is preserved before and after the clearing treatment, analysis using ordinary tissue staining and immunostaining techniques is possible.
  • the content of “urea” in the reagent composition according to the present invention is not particularly limited as long as the biological material clearing treatment advances, as in the case of the Scale reagent.
  • the upper limit of the content of “urea” is determined by the solubility of urea in the solvent used.
  • the concentration is preferably in the range of 1M or more and 8.5M or less, and in the range of 3.5M or more and 8.5M or less.
  • a concentration is more preferable, and a concentration within a range of 4M or more and 8M or less is particularly preferable.
  • a urea derivative or a mixture of urea and a urea derivative instead of urea, it can be set to the same content as urea.
  • Nonionic surfactants may also be used in the manufacture of a reagent composition for preparing a biological material with excellent light transmission properties, and the resulting reagent composition can be used to produce light scattering substances in the biological material. Very useful for removal.
  • Nonionic surfactants include fatty acid systems such as polyoxyethylene sorbitan monolaurate, polyoxyethylene sorbitan monopalmitate, polyoxyethylene sorbitan monostearate, and polyoxyethylene sorbitan monooleate; polyvinyl alcohol, etc. Higher alcohol type; alkylphenol type surfactants such as polyoxyethylene octylphenyl ether.
  • Triton X-100 such as Triton X-100, Triton X-140 series
  • Tween such as Tween-20, Tween-40, Tween-60, and Tween-80.
  • At least one selected from the group consisting of a series; NP-40 (trade name); may be mentioned, and two or more types may be mixed and used as necessary.
  • the content of the nonionic surfactant used in the reagent composition (also referred to as the first reagent) according to the present invention that does not contain sucrose is not particularly limited as long as it is 5% by weight or more, but 6% by weight or more, It is preferably in the range of 25% by weight or less, more preferably in the range of 8% by weight or more and 20% by weight or less, and further preferably in the range of 10% by weight or more and 20% by weight or less. It is particularly preferable that the content be in the range of 12 wt% or more and 20 wt% or less.
  • unit weight% is a percentage of the weight (w (gram)) of surfactant to be used with respect to the weight (w (gram)) of a reagent composition.
  • the Scale reagent preferably contains a surfactant when clarifying a biological material that is relatively difficult to clear, and also because it gradually improves the penetration of the Scale reagent into the biological tissue.
  • the reagent may contain a nonionic surfactant as required. However, the content thereof is mainly used within the range of 0.05 wt% or more and 0.2 wt% or less, and the content of the nonionic surfactant used in the reagent composition according to the present invention is It is very different.
  • a nonionic surfactant improves the penetration
  • the content of the nonionic surfactant used in the reagent composition according to the present invention is preferably in the range of 0.025 wt% or more and 5 wt% or less, 0.05 wt% or more, and 0.0. More preferably, it is in the range of 5% by weight or less, and particularly preferably in the range of 0.05% by weight or more and 0.2% by weight or less.
  • sucrose ⁇ Sucrose may also be used in the manufacture of reagent compositions for preparing biological materials with excellent light transmission properties, and is very useful in obtaining reagents with a refractive index that matches the refractive index of the biological material to be applied. It is. In the present specification, only sucrose is referred to, but any substance exhibiting the same refractive index adjusting effect as sucrose can be used.
  • sucrose is generally used to prevent damage to fixed tissue by replacing it with a tissue fixative (eg, paraformaldehyde solution), and its concentration is usually in the range of 10 wt% or more and 30 wt% or less. Is within.
  • tissue fixative eg, paraformaldehyde solution
  • concentration is usually in the range of 10 wt% or more and 30 wt% or less.
  • the reagent composition according to the present invention containing sucrose is preferably used after the fixed tissue is replaced by sucrose, rather than being used to replace the tissue fixing solution. More preferably, the fixed tissue is replaced by sucrose and then used as the second solution after the first solution according to the invention is applied.
  • the content of sucrose used in the reagent composition containing sucrose according to the present invention is not particularly limited as long as it is 30% by weight or more, but it is in the range of 30% by weight or more and 80% by weight or less. Is preferably within the range of 30% by weight or more and 70% by weight or less, more preferably within the range of 40% by weight or more and 70% by weight or less, 40% by weight or more, It is particularly preferable that the amount be in the range of 60% by weight or less.
  • the unit weight% is a percentage of the weight (w (gram)) of the sucrose used relative to the weight (w (gram)) of the second reagent.
  • the type of solvent used in the reagent composition according to the present invention is not particularly limited as long as it can dissolve the above-mentioned active ingredient, but it is preferable to use water as the main solvent, and particularly preferably to use only water as the solvent. .
  • “use water as the main solvent” means that the proportion of the volume of water in the total solvent used is the largest compared to other solvents, and preferably the total solvent used. The amount of water used is more than 50% and not more than 100% of the total volume.
  • the reagent composition concerning this invention prepared using water as a main solvent is called the reagent as aqueous solution.
  • DMSO dimethyl sulfoxide
  • water for example, dimethyl sulfoxide (DMSO)
  • DMSO dimethyl sulfoxide
  • effects such as improvement of the permeability of the reagent to the biological material and promotion of the clearing treatment of the tissue having a keratinous surface are expected.
  • the main advantages of using water as the solvent are as follows: 1) Since the active ingredient of the reagent composition according to the present invention is excellent in solubility in water, the preparation of the reagent composition according to the present invention is easy and inexpensive; 2) Compared with the case where an organic solvent is used as the main solvent, the biological material to be treated is not dehydrated during the clarification treatment. Therefore, it is possible to suppress the problem that the biological material contracts; 3) The possibility of damaging the fluorescent protein is significantly reduced compared to the case where an organic solvent is used as the main solvent.
  • the biological material that has undergone the clearing treatment can be observed using a fluorescent protein; 4) It is not limited to a fixed material, but can be applied to a transparent treatment of a raw material; 5) As will be described later, the clearing treatment becomes reversible, and the biological sample after the clearing treatment can be returned to the state before the clearing treatment as necessary; 6) The handling safety is higher than when an organic solvent is used as the main solvent.
  • the reagent composition according to the present invention may be a buffer solution capable of maintaining a pH suitable for a biological material to be clarified. Furthermore, the reagent composition according to the present invention has its osmotic pressure adjusted to such an extent that the biological material to be transparentized is not deformed and the active ingredient sufficiently penetrates into the biological material. Also good.
  • the reagent composition according to the present invention contains at least one compound selected from glycerol, carboxyvinyl polymer, hydroxypropylmethylcellulose, propylene glycol, and macrogol as needed, as necessary.
  • the drying inhibitory component prevents the drying of the biological material to be subjected to the clearing treatment.
  • the reagent composition according to the present invention includes the above-described reagent composition. It is preferable to include a drying inhibiting component.
  • the content is not particularly limited, but it is preferably contained at a concentration in the range of 2.5 wt% or more and 20 wt% or less, and 5 wt% or more. More preferably, it is contained at a concentration within the range of 15% by weight or less, and particularly preferably at a concentration within the range of 8% by weight or more and 12% by weight or less.
  • the unit weight% is a percentage of the weight (w (gram)) of the “drying inhibiting component” to be used with respect to the weight (w (gram)) of the reagent composition.
  • the reagent composition according to the present invention may contain additives such as a pH adjuster and an osmotic pressure adjuster, if necessary, in addition to the components described above, similarly to the Scale reagent.
  • a first solution containing urea or a urea derivative, an amino alcohol, and a nonionic surfactant is prepared.
  • the first solution is infiltrated into the biological material by placing the biological material in the prepared first solution.
  • the biological material to be infiltrated with the first solution is preferably fixed in advance with a paraformaldehyde solution and then replaced with a sucrose solution.
  • the first solution may be prepared using a kit for producing the reagent composition according to the present invention, or may be provided as it is as the reagent composition according to the present invention. That is, in the method according to the present invention, in order to prepare a biological material excellent in light transmittance, a first solution containing urea or a urea derivative, an amino alcohol, and a nonionic surfactant is added to the biological solution. It includes a step of infiltrating the material (that is, a first infiltration step). The biological material infiltrated with the first solution exhibits light transmittance superior to the effect of a conventionally known clearing reagent. This shows that the light scattering material (mainly lipid) in the biological material was removed by the first solution. Thus, the first solution exhibits an excellent effect of realizing transparency of an organ or tissue containing a large amount of lipid.
  • the light permeability of the blood mixed with the first solution is remarkably improved. This shows that the pigment (mainly hemoglobin) in the blood was removed by the first solution. As described above, the first solution exhibits an unpredictable excellent effect of realizing the transparency of blood and the transparency of an organ or tissue containing a lot of blood.
  • infiltration of the second solution into the biological material is preferably performed.
  • a second solution containing urea or a urea derivative, amino alcohol, and sucrose is prepared.
  • the biological material is infiltrated into the second solution by placing the biological material in the prepared second solution.
  • the biological material to be infiltrated with the second solution is preferably fixed in advance with a paraformaldehyde solution and then replaced with a sucrose solution, and the first solution is sufficiently washed after the first infiltration step is performed. Is more preferable.
  • the biological material infiltrated with the second solution exhibits light permeability comparable to that of a conventionally known clearing reagent, and the biological material subjected to both the first infiltration step and the second infiltration step is a conventionally known clearing reagent.
  • the light transmittance is much better than the above effect.
  • there was a light scattering material that could not be removed by the first solution and the light scattering material was removed by the second solution, or the light scattering in the biological material after the first infiltration process was attenuated. I understand.
  • the size of the biological material swollen by performing the 1st infiltration process can be returned to the 2nd infiltration process.
  • the second solution remarkably enhances the excellent effect of the first solution to achieve transparency of organs or tissues containing a large amount of lipid.
  • the method according to the invention is preferably carried out according to the following procedure: 1) The brain is removed from a mouse perfused and fixed with a 4% paraformaldehyde solution, and the removed brain is fixed with a paraformaldehyde solution for 12 to 24 hours. 2) The fixed brain is replaced with a 20% sucrose / PBS solution. 4) Replace the replaced brain with the first solution 4) Wash the brain infiltrated with the first solution several times for several hours with PBS 5) Replace the washed brain with the second solution 6) The second solution Observe the infiltrated brain. Alternatively, store after washing with PBS.
  • the light transmittance of the biological material prepared using N, N, N ′, N′-tetrakis (2-hydroxypropyl) ethylenediamine as the first solution was very excellent.
  • the second solution using triethanolamine that is, 2,2 ′, 2 ′′ -nitrilotriethanol
  • the light transmittance was further improved.
  • these amino alcohols are used, the disappearance of the fluorescence signal of a fluorescent protein such as GFP is very small, and thus it is suitably used for whole brain imaging.
  • an immunohistochemical assay is performed using the method according to the present invention, it is preferably performed between 4 and 5, but the present invention is not limited thereto.
  • the temperature at the time of performing the above procedure is not particularly limited, but is preferably in the range of 15 ° C. or higher and 45 ° C. or lower.
  • the processing time for performing the transparentizing treatment is not particularly limited, but is preferably in the range of 2 hours or more and 6 months or less, and more preferably in the range of 12 hours or more and 7 days or less.
  • the present invention provides a biological material excellent in light transmission prepared according to the method of the present invention.
  • a mouse brain section having a thickness of 100 ⁇ m or less is used to provide excellent light transmittance that can be observed with a two-photon microscope.
  • the biological material prepared in accordance with the method of the present invention (whole brain) As shown in the examples described later, the transmittance of light having a wavelength of 520 nm or more is 60% or more, and the transmittance of light having a wavelength of 560 nm or more is 70% or more even in the first infiltration step.
  • the transmissivity of light having a wavelength of 640 nm or longer is 80% or higher.
  • the present invention can impart such excellent light transmittance to a biological material that is not a slice, and as a result, the obtained biological material can be observed with a one-photon confocal microscope. it can.
  • light having a wavelength of 520 nm or more is preferably used for observing a biological material excellent in light transmittance prepared according to the method of the present invention.
  • red wavelength region 740 to 625 nm
  • the present invention provides a biological material having excellent transparency to light having a color of orange (wavelength region 625 to 590 nm), yellow (wavelength region 590 to 565 nm), and green (wavelength region 565 to 520 nm).
  • the biological material that has been subjected to the clearing treatment is then subjected to an observation step using, for example, an optical microscope. If necessary, the biological material to be subjected to the observation process may be subjected to a visualization process such as staining or marking in advance of the above-described transparency treatment process or after the transparency treatment process and before the observation process. .
  • the fluorescent protein gene is introduced into a living biological material before the transparentization processing step to express the fluorescent protein.
  • a visualization process step when performing injection of fluorescent chemical substances (excluding fluorescent proteins) into biological materials or staining biological materials using fluorescent chemical substances, although it is preferable to carry out during the said process, it can also carry out after the said transparentization process process. Furthermore, as a visualization process step, staining using a chemical substance other than the fluorescent chemical substance can be performed.
  • the observation process can be performed using any kind of optical microscope.
  • the observation step can be performed by applying a three-dimensional super-decomposing microscope technique (for example, STED, 3D PALM, FPALM, 3D STORM, and SIM).
  • the observation process may be performed by applying a multiphoton excitation type (generally, a two-photon excitation type) optical microscope technique, but it is more preferable to use a one-photon confocal microscope or a sheet illumination macro zoom microscope. preferable.
  • the organism providing the biological material may be an adult or a fetus, and is preferably a mammal (mammal).
  • Preferred mammals include primates other than humans.
  • Class for example, marmoset
  • the biological material may be an individual itself (excluding a living human individual itself), but a tissue or organ derived from a multicellular animal (for example, the entire brain or a part thereof) is preferably used in the present invention. Used.
  • An autoimmune disease is a disease caused by the immune system producing an antibody (autoantibody) against self (endogenous antigen) and reacting to eliminate the endogenous antigen recognized as non-self.
  • autoantibody an antibody against self
  • endogenous antigen an antigen recognized as non-self.
  • Many autoimmune diseases have been found and many studies have been made so far, but it is difficult to know what part of the tissue within the patient's autoantibody actually reacts, It is difficult to identify the responsible lesion for the disease. In addition, it is difficult to know the specific antigen of the produced autoantibody.
  • the present invention provides a method of searching for a tissue site that is reactive with an autoantibody using the immunohistochemical assay.
  • the tissue site may be a responsible lesion for diseases caused by autoantibodies.
  • the present invention provides a method of searching for an antigen against an autoantibody using the immunohistochemical assay described above.
  • the present invention it is possible to confirm the antigen-antibody reaction in a state where the complex structure of the living tissue is maintained, so it is possible to determine what part of the tissue in the patient body the autoantibody actually reacts with. It is possible to search for antigens of the autoantibodies produced. For example, by subjecting a fluorescently labeled autoantibody collected from a patient with an autoimmune disease to the visualization treatment step and subsequently performing the observation step, a site where the autoantibody reacts can be found, and the antigen of the autoantibody Can be found.
  • the cleared biological material may then be subjected to, for example, a biochemical assay.
  • the biochemical assay is an assay for chemically analyzing proteins, lipids, low-molecular compounds and the like contained in biological materials such as cells and tissues. Biochemical assays are used, for example, as the simplest and most useful information collection means in clinical settings, and the results of analysis are used for various diseases (eg, liver disease, kidney disease, diabetes, hypertension, heart disease, It is used for diagnosis or prognosis determination of hyperuricemia.
  • biochemical assays are performed by separating proteins, lipids, low-molecular compounds, etc. contained in biomaterials by chromatography, electrophoresis, etc., and using antigen-antibody reactions and special detectors (mass analyzers, etc.). Accomplished by detecting.
  • the biological material to which the present invention is applied is preferably subjected to a biochemical assay.
  • the biological material to be subjected to the biochemical assay may be subjected to a desired staining or fluorescent label in advance, if necessary.
  • the present invention provides a complex analysis environment in combination with a method for biochemically analyzing components in biological materials using the biochemical assay.
  • Biological materials suitably used in the present invention include organs and tissues (eg, brain, heart, lung, kidney or liver) obtained from an individual, body fluids (eg, blood, saliva, serum, plasma, urine, synovial fluid, medulla) Liquid etc.).
  • body fluids eg, blood, saliva, serum, plasma, urine, synovial fluid, medulla
  • the present invention may be used for various known biochemical analyses. For example, when a site requiring further analysis is found by imaging analysis after clearing, proteomic analysis of the site is performed. For example, proteins, nucleic acids, lipids, sugars, in vivo low molecular weight compounds, and the like can be used, but the measurement targets are not limited to these.
  • the mouse skull was removed and the whole brain was carefully removed.
  • the removed whole brain was immersed in an ice-cold fixative (4% paraformaldehyde / PBS, pH 7-8) overnight at 4 ° C.
  • the fixed whole brain was transferred into a 20% sucrose / PBS solution and infiltrated in a 4 ° C environment.
  • An optical microscope image of a brain sample (sample a) infiltrated with a 20% sucrose / PBS solution is shown in FIG.
  • the light transmittance of the sample a (sample central portion) was measured using a Konica Minolta CM-5 spectrocolorimeter ((d) of FIG. 1).
  • the brain replaced with 20% sucrose / PBS solution was treated with 25% N, N, N ′, N′-tetrakis (2-hydroxypropyl) ethylenediamine, 15% Triton X-100 (Nacalai Tesque Cat No. 25987-85), The solution was transferred to a first solution (Sol. PE) containing 25% urea and allowed to infiltrate for 7 days with gentle shaking in an environment of 37 ° C., thereby replacing the first solution.
  • An optical microscope image of the brain sample (sample b) infiltrated with the first solution is shown in FIG.
  • the light transmittance of the sample b was measured using a Konica Minolta CM-5 spectrocolorimeter ((d) of FIG. 1).
  • the brain replaced with the first solution was transferred into PBS and washed by gently shaking 2 to 3 times for 3 to 12 hours at room temperature.
  • the washed brain was transferred into a second solution (Sol. CL) containing 10% triethanolamine, 0.1% Triton X-100, 25% urea, 50% sucrose, and gently over 4 days at room temperature.
  • the second solution was replaced by shaking.
  • An optical microscope image of the brain sample (sample c) infiltrated with the second solution is shown in FIG.
  • the light transmittance of sample c was measured using a Konica Minolta CM-5 spectrocolorimeter ((d) of FIG. 1).
  • Sample a has a low light transmission in any wavelength region, but sample b greatly improves the light transmission of the sample, and by comparing sample b and sample c, the displacement to the second solution can be reduced. It can be seen that the transparency of white matter was promoted.
  • the mouse skull was removed and the whole brain was carefully removed.
  • the removed whole brain was immersed in an ice-cold fixative (4% paraformaldehyde / PBS, pH 7-8) overnight at 4 ° C.
  • the fixed whole brain was transferred into a 20% sucrose / PBS solution and infiltrated in a 4 ° C environment.
  • the brain replaced with 20% sucrose / PBS solution was treated with 25% N, N, N ′, N′-tetrakis (2-hydroxypropyl) ethylenediamine, 15% Triton X-100 (Nacalai Tesque Cat No. 25987-85), And replaced with the first solution by infiltration in a 37 ° C environment for 10 days in a first solution (Sol. PE) containing 25% urea.
  • the brain replaced with the first solution was transferred into PBS and washed by gently shaking 2 to 3 times for 3 to 12 hours at room temperature.
  • the washed brain was transferred into a second solution (Sol. CL) containing 10% triethanolamine, 0.1% Triton X-100, 25% urea, 50% sucrose, and gently over 4 days at room temperature.
  • the second solution was replaced by shaking.
  • the brain replaced with the second solution was used as an observation sample.
  • the observation sample was immersed in a mixed oil of TSF4300 / mineral oil (1: 1) and subjected to whole-brain scanning using a sheet illumination macro zoom microscope (LaVision, Ultramicroscope).
  • the acquired data was reconstructed in three dimensions using Imaris (Bitplane) (FIG. 2).
  • 2A shows a three-dimensional reconstructed image from the brain bottom side of the sample
  • FIG. 2B shows an observation surface observed with a microscope
  • FIG. 2C shows a three-dimensional reconstructed image.
  • the coronal section of the sample is shown, and (d) shows the sagittal section of the three-dimensionally reconstructed sample.
  • the tissue processed using the present invention has been found to be so light transmissive that it can be adapted to a sheet illumination macro zoom microscope.
  • the excised brain region tissue was immersed in an ice-cold fixative (4% paraformaldehyde / PBS, pH 7-8) overnight at 4 ° C.
  • the fixed tissue was transferred into a 20% sucrose / PBS solution and allowed to invade in a 4 ° C environment.
  • the tissue replaced with a 20% sucrose / PBS solution was treated with 25% N, N, N ′, N′-tetrakis (2-hydroxypropyl) ethylenediamine, 15% Triton X-100 (Nacalai Tesque Cat No. 25987-85), And replaced with the first solution by gently shaking for 24 hours in a 4 ° C. environment.
  • the tissue replaced with the first solution was transferred into PBS and washed by gently shaking 2 to 3 times for 3 to 12 hours in an environment at room temperature.
  • the washed tissue was transferred to a diluted solution (1: 100 and 1: 300, respectively) of anti-Ceptin antibody (Santacruz) and anti-VIP antibody (Immunostar) and reacted for 3 days. After removing the diluted solution, the tissue reacted with the antibody was transferred into 0.1% Triton X-100 / PBS, and gently shaken 2 to 3 times for 3 to 12 hours at room temperature or 37 ° C. And washed.
  • a diluted solution (1: 100 and 1: 300, respectively) of anti-Ceptin antibody (Santacruz) and anti-VIP antibody (Immunostar)
  • the washed tissue was transferred into a diluted solution (1: 1000) of a secondary antibody bound with Alexa fluorescent dye and allowed to react for 3 days. After removing the diluted solution, the tissue reacted with the secondary antibody is transferred into 0.1% Triton X-100 / PBS, and gently 2-3 hours at room temperature or 37 ° C for 2-3 hours. The mixture was washed by shaking, transferred to PBS, and gently shaken 1-2 times at room temperature for 1-2 hours.
  • the washed tissue is transferred into 1% paraformaldehyde / PBS, shaken at room temperature for about 30 minutes to crosslink the antibody, then transferred into PBS, and gently 1 to 3-12 hours at room temperature. Washed by shaking twice. Next, transfer to a second solution (Sol. CL) containing 10% triethanolamine, 0.1% Triton X-100, 25% urea, and 50% sucrose, and gently shake for 2 days or more at room temperature. By replacing with the second solution. The tissue replaced with the second solution was used as an observation sample.
  • Sol. CL 10% triethanolamine, 0.1% Triton X-100, 25% urea, and 50% sucrose
  • the observational sample was observed with a confocal laser microscope (Carl Zeiss, LSM700) in the suprachiasmatic nucleus region to a depth of about 500 ⁇ m from the bottom of the brain.
  • the acquired data was reconstructed in three dimensions using Imaris (Bitplane) (FIG. 2).
  • FIG. 3A shows an image obtained by observing the three-dimensionally reconstructed sample from obliquely above
  • FIG. 3B shows an image obtained by observing the three-dimensionally reconstructed sample almost from the side.
  • the fluorescence image of EGFP but also the immunostained image of Coppin and VIP could be successfully observed in three dimensions.
  • the extracted tissue was immersed in the first solution for 5 days and then immersed in the second solution for 4 days to be transparent.
  • the transparency according to the present invention can be applied to various tissues other than the brain as a biological material, and can be applied to a sheet illumination microscope.
  • the present invention has the following advantages: [1] A level of transparency equivalent to the method using an organic solvent was realized with a water-soluble reagent, which enabled observation with a sheet illumination microscope. [2] Compared with the method using an organic solvent, the disappearance of the fluorescence signal was suppressed to a minimum and the safety was dramatically improved. [3] It can be used not only for detection of fluorescent proteins but also for immunohistochemical assays such as antibodies or counterstaining. This enabled immunohistochemistry in three dimensions.

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Abstract

　本発明は、アミノアルコールを、必要に応じて、尿素および尿素誘導体からなる群より選択される少なくとも一種の化合物、非イオン性界面活性剤、ならびにスクロースからなる群より選択される少なくとも１つとともに用いることによって光透過性に優れた生物材料を提供する。本発明は、組織内での遺伝子の発現／局在や細胞形態のハイスループットな観察を全組織レベルで行うことができる技術を提供する。

Description

光透過性に優れた生物材料を調製するための組成物およびその利用
　本発明は、光透過性に優れた生物材料を調製するための組成物およびその利用に関する。
　近年、組織内遺伝子発現、細胞内局在、細胞形態の高度な観察を行うために、透明化試薬を用いて組織の光透過性を高める前処理（透明化処理）が行われており、種々の透明化試薬および前処理方法が開発されている。
　非特許文献１および２には、ベンジルベンゾエート／ベンジルアルコール（benzylbenzoate/benzylalchol(ＢＡＢＢ法)）を用いた透明化処理技術が開示されている。ＢＡＢＢ法は、有機溶媒を用いた古典的な組織透明化方法であり、シート照明マクロズーム顕微鏡（例えば、非特許文献３参照）に適用する透明化サンプルを作製する方法として応用されている。
　非特許文献４には、フルクトースを用いて屈折率の調整を行う技術（ＳｅｅＤＢ法）が開示されている。処理の間に生じる生体組織の変化を最小限に抑えることを主目的としているため、分子レベルの構造、膜構造、軸索の形状等がほぼ完全に保たれている。そして、２光子顕微鏡および最適化したレンズを用いることによって全脳レベルの観察が可能である。
　非特許文献５には、電気泳動装置を用いた物理化学的な方法によって透明化を行う技術（ＣＬＡＲＩＴＹ法）が開示されている。ＣＬＡＲＩＴＹ法は、アクリルアミドポリマーを用いて固めた脳組織を、電気泳動装置を用いて物理化学的に処理して脂質成分を除去することによって透明化を実現する。組織内の分子レベルの構造が保たれた状態で、高度な透明化が約２週間で実現する。蛍光タンパク質ラベリング、免疫染色のいずれにも適応可能である。
　非特許文献６には、水溶性試薬を用いることによって蛍光シグナルの消失を最小限に抑えることに成功した技術（Ｓｃａｌｅ法）が開示されている。
Hans-Ulrich Dodt et al. "Ultramicroscopy: three-dimensional visualization of neuronal networks in the whole mouse brain" Nature Methods vol.4 no.4: 331-336 (2007) Klaus Becker et al. "Chemical Clearing and Dehydration of GFP Expressing Mouse Brains" PLoS ONE vol.7 issue 3: e33916 (2012) Philipp J. Keller et al. "Reconstruction of Zebrafish Early Embryonic Development by Scanned Light Sheet Microscopy" Science vol.322: 1065-1069 (2008) Meng-Tsen Ke et al. "SeeDB: a simple and morphology-preserving optical clearing agent for neuronal circuit reconstruction" advance online publication (published online 23 June 2013) Kwanghun Chung et al. "Structural andmolecularinterrogation of intact biological systems" Nature vol.497: 332-339 (2013) Hiroshi Hama et al. "Scale: a chemical approach for fluorescence imaging and reconstruction of transparent mouse brain" Nature Neuroscience vol.14 no.11: 1481-1490 (2011)
　非特許文献１および２に記載のＢＡＢＢ法を用いれば、得られる透明化サンプルの透明度は高いものの、脱水処理および有機溶剤処理に起因して蛍光シグナルが急速に消失するという問題点を有している。また、ＢＡＢＢ法は、三次元組織のままで免疫染色を行って透明化することは困難であり、しかも、有機溶媒を用いる点から、安全面で懸念される。
　非特許文献４に記載のＳｅｅＤＢ法は、全脳レベルの観察が可能であるもののスキャンニングに数日間を要する。また、ＳｅｅＤＢ法は、２光子顕微鏡を用いることが想定されているため、処理された組織（特に成体脳）の透明度は、シート照明マクロズーム顕微鏡に適応し得るほど高くない。
　非特許文献５に記載のＣＬＡＲＩＴＹ法は、工程が煩雑でありかつ専用のデバイスを必要とするため、多サンプルの適応に向いていない。
　非特許文献６に記載のＳｃａｌｅ法を用いた場合、透明度（特に成体脳）はシート照明系に適応し得るほど高くなく、また、Ｓｃａｌｅ法は、透明化を達成するまでに週～月単位の期間を必要とする。
　本発明は、上記の課題を解決するためになされたものであり、組織内での遺伝子の発現／局在や細胞形態のハイスループットな観察を、有機溶媒を用いることなく全組織レベルで行うための技術を提供することを目的とする。
　上記の課題を解決するために、本発明者らは鋭意検討を行なった。その結果、特定の化合物を特定の組合せにて用いることによって、ハイスループットな三次元イメージング系への適応が可能なレベルまで組織の光透過性を高めることができることを新たに見出し、本発明を完成するに至った。
　すなわち、本発明にかかる試薬組成物は、光透過性に優れた生物材料を調製するために、アミノアルコールを含んでいることを特徴としている。本発明にかかる試薬組成物は、尿素および尿素誘導体からなる群より選択される少なくとも一種の化合物、非イオン性界面活性剤、ならびにスクロースとからなる群より選択される少なくとも１つをさらに含んでいてもよい。
　本発明にかかる試薬キットは、光透過性に優れた生物材料を調製するために、アミノアルコールと、尿素および尿素誘導体からなる群より選択される少なくとも一種の化合物と、非イオン性界面活性剤とを含んでいる第一溶液、アミノアルコールと、尿素および尿素誘導体からなる群より選択される少なくとも一種の化合物と、スクロースとを含んでいる第二溶液を備えていることを特徴としている。本発明にかかる試薬キットにおいて、第二溶液は、非イオン性界面活性剤をさらに含んでいてもよい。
　本発明にかかる組成物は、上述した試薬組成物または試薬キットを製造するために、アミノアルコールを含んでいることを特徴としている。
　本発明にかかるキットは、上述した試薬組成物または試薬キットを製造するために、アミノアルコールと、尿素および尿素誘導体からなる群より選択される少なくとも一種の化合物、非イオン性界面活性剤、ならびにスクロースとからなる群より選択される少なくとも１つとを備えていることを特徴としている。
　本発明にかかる光透過性に優れた生物材料を調製する方法は、アミノアルコールと、尿素および尿素誘導体からなる群より選択される少なくとも一種の化合物と、非イオン性界面活性剤とを含んでいる第一溶液を、生物材料に浸潤させる第一浸潤工程を包含することを特徴としている。
　上記方法は、アミノアルコールと、尿素および尿素誘導体からなる群より選択される少なくとも一種の化合物と、スクロースとを含んでいる第二溶液を、生物材料に浸潤させる第二浸潤工程をさらに包含してもよい。第二溶液は、非イオン性界面活性剤をさらに含んでいてもよい。
　本発明にかかる生物材料は、上述した方法に従って調製されることによって光透過性に優れていることを特徴としている。
　本発明にかかる免疫組織化学的アッセイは、上記いずれかの方法によって調製した生物材料を用いることを特徴としている。
　本発明にかかる自己抗体と反応性のある組織部位を探索する方法は、上記免疫組織化学的アッセイを用いることを特徴としている。
　本発明にかかる自己抗体に対する抗原を探索する方法は、上記免疫組織化学的アッセイを用いることを特徴としている。
　本発明にかかる生化学的アッセイは、上記いずれかの方法によって調製した生物材料を用いることを特徴としている。
　本発明は、化学的な処理をベースにした技術であり、特殊なデバイスの使用および手技の煩雑さがない。さらに、本発明は、多サンプルのハイスループットな解析を可能とするレベルにまで高度な透明化を簡便な処理にて実現することができる。
本発明の一実施例に関し、本発明を用いて処理したマウス全脳の光透過性を確認した結果を示す図である。 本発明の一実施例に関し、本発明を用いて処理してマウス全脳をスキャンニングした結果を示す図である。 本発明の一実施例に関し、本発明を用いて処理したマウス全脳の三次元での免疫組織化学的アッセイの結果を示す図である。 本発明の一実施例に関し、本発明を用いて処理したマウス血液を示す図である。 本発明の一実施例に関し、本発明を用いて処理したマウス各種組織の光透過性を確認した結果、および三次元での蛍光イメージングの結果を示す図である。
　本発明者らは独自の観点に基づいた大規模なスクリーニングを行い、数種のアミノアルコール、非イオン性界面活性剤、および尿素を選択し、ハイスループットな組織イメージングを実現するための第一溶液を完成した。また、本発明者らは別の独自の観点に基づいて、スクロースを含む第二溶液を完成した。そして、これらの溶液が、従来公知の透明化試薬の効果よりも優れた効果を提供することを確認し、特に、二種類の溶液を組み合わせて用いた際の効果が極めて優れていることを見出した。
　以下、本発明の実施の形態について詳細に説明する。
　〔１．組成物およびキット〕
　本発明は、光透過性に優れた生物材料を調製するための試薬組成物を提供する。本発明にかかる試薬組成物は、アミノアルコールを含んでいる溶液であることを特徴としている。本発明にかかる試薬組成物は、尿素または尿素誘導体を含んでいてもよい。本発明にかかる試薬組成物は、スクロースを含まない組成物（第一溶液または第一試薬ともいう。）であっても、スクロースをさらに含む組成物（第二溶液または第二試薬ともいう。）であってもよく、前者の場合、非イオン性界面活性剤をさらに含むことが好ましく、後者の場合、非イオン性界面活性剤をさらに含んでいてもよい。
　本発明はまた、光透過性に優れた生物材料を調製するための試薬キットを提供する。本発明にかかる試薬キットは、アミノアルコールと尿素または尿素誘導体と、非イオン性界面活性剤とを含んでいる第一溶液、アミノアルコールと尿素または尿素誘導体とスクロースとを含んでいる第二溶液を備えていることを特徴としている。第二溶液は必要に応じて非イオン性界面活性剤をさらに含んでいてもよい。
　本発明はさらに、光透過性に優れた生物材料を調製するための試薬組成物を製造するための組成物を提供する。この態様において、本発明にかかる組成物は、アミノアルコールを含んでいることを特徴としている。
　本発明はまた、光透過性に優れた生物材料を調製するための試薬組成物を製造するためのキットを提供する。この態様において、本発明にかかるキットは、アミノアルコールと、尿素または尿素誘導体と、必要に応じて非イオン性界面活性剤および／またはスクロースとを備えていることを特徴としており、上記試薬組成物を構成するに必要な溶媒をさらに備えていてもよい。
　本明細書中において使用される場合、用語「キット」は、特定の材料（例えば構成成分）を内包する容器（例えば、ボトル、プレート、チューブ、ディッシュなど）を備えた包装が意図される。キットは、各材料を使用するための指示書を備えていることが好ましい。本明細書中においてキットの局面において使用される場合、「備えた（備えている）」は、キットを構成する個々の容器のいずれかの中に上記材料が内包されている状態が意図される。また、本発明にかかるキットは、複数の異なる組成物を１つに梱包した包装であってもよく、上記組成物は、溶液形態の場合、複数の異なる容器中に内包されていてもよい。本発明にかかるキットは、その複数の構成要素を同一の容器に混合して備えていても別々の容器に備えていてもよい。「指示書」は、紙またはその他の媒体に書かれていても印刷されていてもよく、あるいは磁気テープ、コンピューター読み取り可能ディスクまたはテープ、ＣＤ－ＲＯＭなどのような電子媒体に付されてもよく、キットの用途を実現するための手順が記載されている。本発明にかかるキットはまた、希釈剤、溶媒、洗浄液またはその他の試薬を内包した容器を備えていてもよい。さらに、本発明にかかるキットは、キットの用途を実現するための手順を実行するために必要な器具および試薬を備えていてもよい。
　本発明において使用される場合、用語「光透過性」は、入射光に対して透過光がどの程度通過するか、または励起光照射による蛍光がどの程度通過し、また散乱が低いかの程度をいい、「光透過性に優れた」という表現は、一例として、観察対象への入射光に対する観察対象からの出射光（すなわち透過光）の割合が高いことをいう。光透過性は、例えば、入射光に対する透過光の割合について、光を遮断する物質（例えば黒色の厚みのあるプラスチックや金属など）の場合を０％とし、水のような透明な液体の場合を１００％として、百分率で表わすことができる。一実施形態にかかる光透過性に優れた生物材料において、入射光に対する透過光の割合は、分光測色計を用いて測定した光透過率が４０％以上であり、好ましくは、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、９５％以上、９８％以上、または９９％以上である。
　試薬組成物を製造するための上記の組成物またはキットを用いて本発明の試薬組成物または試薬キットを調製する手順は特に限定されず、各構成成分を溶媒に溶解すればよく、溶解する順序もまた限定されない。
　本発明の適用対象となる生物材料の種類は特に限定されないが、植物由来の材料または動物由来の材料が好ましく、魚類、両生類、爬虫類、鳥類または哺乳類（哺乳動物）等の動物由来の材料がより好ましく、哺乳動物由来の材料が特に好ましい。また、哺乳動物の種類は特に限定されないが、マウス、ラット、ウサギ、モルモット、ヒトを除く霊長類等の実験動物；イヌ、ネコ等の愛玩動物（ペット）；ウシ、ウマ等の家畜；ヒト；が挙げられる。
　また、生物材料は、個体そのものであってもよく（生きているヒト個体そのものは除く）、多細胞生物の個体から取得した器官、組織、体液（例えば、血液、唾液、血清、血漿、尿、滑液、髄液等）あるいは細胞であってもよい。生物は成体であってもよく胎仔であってもよい。本発明にかかる組成物は優れた透明化処理能力を有するので、生物材料が、多細胞動物由来の組織または器官（例えば、脳、心臓、肺、肝臓または腎臓の全体またはその一部）、あるいはヒトを除く多細胞動物の個体（例えば、胚等）そのものであっても透明化処理を適用可能である。
　また、上記の生物材料は、顕微鏡観察用に固定化処理された材料であってもよく、固定化されていない材料であってもよい。なお、固定化された材料を用いる場合には、固定化処理後に、例えば２０％（ｗ／ｖ）スクロース／ＰＢＳ溶液に、充分に（例えば、２４時間以上）浸漬する処理を行うことが好ましい。さらに、当該材料をＯＣＴ　ｃｏｍｐｕｎｄに包埋して液体窒素で凍結後、ＰＢＳ中で解凍し、４％（ｗ／ｖ）パラホルムアルデヒド／ＰＢＳ溶液で再度固定する処理を行うことが好ましい。なお、単位％（ｗ／ｖ）とは、溶液の体積（ｖ（ミリリットル））に対する、使用する溶媒（スクロースまたはパラホルムアルデヒド）の重量（ｗ（グラム））の百分率である。
　上記生物材料は、具体的には例えば、蛍光性化学物質を注入した生体組織、蛍光性化学物質で染色を行った生体組織、蛍光タンパク質を発現した細胞を移植した生体組織、または蛍光タンパク質を発現した遺伝子改変動物の生体組織等であってもよい。
　本発明を用いれば、生物材料の光透過性を顕著に高めることができるので、最新の顕微鏡技術と組み合わせることによってハイスループットな組織イメージングを可能とする。具体的には、
・蛍光タンパク質、蛍光物質のシグナルの消失が最小限に抑制される。
・多サンプル（数十個～数百個）を同時に並行して処理することができる。
・シート照明顕微鏡との併用が実現する程度に高度な透明化が実現する。
・組織領域の構築に対する影響を最小限に抑制することができる。
　また、本発明を用いれば、体液の光透過性を顕著に高めることができるので、体液中の色素の影響を排除した解析を行うことができる。
　〔ａ．アミノアルコール〕
　アミノアルコールは、水酸基とアミノ基を有する化合物である。アミノアルコールは、水性系ペイントにおける中和剤として使用されることがよく知られているが、それ以外に、インク組成物または医薬組成物の含有成分として用いられている。例えば、特開２０１１－１２２２６号公報には、分散安定剤としてアミノアルコールを配合してなるインクジェット記録用インク組成物が開示されており、特開２００９－２２１２５２号公報には、インク組成物にアミノアルコールを含有することで拭き取り性が向上することが開示されている。
　Ｓｃａｌｅ試薬にはアミノアルコールが用いられていない。また、アミノアルコールは、Ｓｃａｌｅ試薬における任意成分である水溶性の高分子化合物（分子量が例えば５万～６万程度以上の大きさであって、細胞内に実質的に侵入しないもの）でもグリセロール等の乾燥抑制成分でもない。上述した特開２０１１－１２２２６号公報および特開２００９－２２１２５２号公報に開示された組成物には、乾燥防止や湿潤の付与の観点からグリセリン（グリセロール）等の多価アルコール類が、アミノアルコールとともに含有されている。このことは、アミノアルコールおよびグリセリンがどちらもアルコールであるといえ、相補し得ない異なる機能を有しており、両者が併用されることがあったとしても置換可能といえないことを示している。そして、当業者はこのことを十分に認識している。
　このように、アミノアルコールは、Ｓｃａｌｅ試薬の組成として記載も示唆もされていないだけでなく公知の透明化試薬にも用いられていないので、光透過性に優れた生物材料を調製するための試薬にアミノアルコールを利用することは、当業者が容易に想到し得ることでない。
　本発明に用いられるアミノアルコールは、アルカノールアミン（メタノールアミン、エタノールアミン、プロパノールアミン、ブタノールアミン等）であっても芳香族アミノアルコールであってもよく、これらは１級アルコール、２級アルコール、３級アルコールのいずれにも限定されない。本発明に好適に用いられるアミノアルコールとしては、例えば、モノエタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、モノプロパノールアミン、ジプロパノールアミン、トリプロパノールアミン、モノイソプロパノールアミン、ジイソプロパノールアミン、トリイソプロパノールアミン、メチルエタノールアミン、ジメチルエタノールアミン、トリメチルエタノールアミン、エチルエタノールアミン、ジエチルエタノールアミン、トリエチルエタノールアミン、プロピルエタノールアミン、ジプロピルエタノールアミン、トリプロピルエタノールアミン、ブチルエタノールアミン、ジブチルエタノールアミン、トリブチルエタノールアミン、メチルジエタノールアミン、エチルジエタノールアミン、プロピルジエタノールアミン、ブチルジエタノールアミン、２－アミノ－１－プロパノール、２－アミノ－２－メチル－１－プロパノール、２－アミノ－１，３－プロパンジオール、２－アミノ－２－エチル－１，３－プロパンジオール、３－アミノ－１，２－プロパンジオール、３－メチルアミノ－１，２－プロパンジオールが挙げられる。また、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトラキス（１－ヒドロキシエチル）エチレンジアミン、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトラキス（２－ヒドロキシエチル）エチレンジアミン、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトラキス（１－ヒドロキシプロピル）エチレンジアミン、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトラキス（２－ヒドロキシプロチル）エチレンジアミンなどもまた、本発明に好適に用いられる。
　一実施形態において、アミノアルコールは、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトラキス（２－ヒドロキシプロピル）エチレンジアミン、トリエタノールアミン、トリイソプロパノールアミン、２－アミノ－１，３－プロパンジオール、３－メチルアミノ－１，２－プロパンジオール、３－アミノ－１，２－プロパンジオール、またはＮ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトラキス（２－ヒドロキシエチル）エチレンジアミンであることが好ましく、ＧＦＰ等の蛍光タンパク質の観察に用いられる場合、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトラキス（２－ヒドロキシプロピル）エチレンジアミン、トリエタノールアミン、トリイソプロパノールアミン、または２－アミノ－１，３－プロパンジオールであることが好ましく、さらに、価格および安全性を考慮すると、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトラキス（２－ヒドロキシプロピル）エチレンジアミン、トリエタノールアミンまたはトリイソプロパノールアミンであることが好ましく、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトラキス（２－ヒドロキシプロピル）エチレンジアミンまたはトリエタノールアミン（すなわち、２，２’，２’’－ニトリロトリエタノール）がより好ましい。
　〔ｂ．尿素または尿素誘導体〕
　本明細書中で使用される場合、「尿素または尿素誘導体」は尿素および種々の尿素誘導体の少なくとも１つであることが意図され、「尿素および尿素誘導体からなる群より選択される少なくとも一種の化合物」と置換可能に用いられる。
　上記尿素誘導体の種類は特に限定されないが具体的には例えば、各種のウレイン、または、下記の一般式（１）に示す化合物である。なお、一般式（１）に示す化合物には一部のウレインが含まれる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
　一般式（１）に示す尿素誘導体において、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４は、互いに独立に水素原子（但し、Ｒ１～Ｒ４の全てが水素原子の場合は尿素自体に相当するので除かれる。）、ハロゲン原子、または炭化水素基であり、炭化水素基を構成する炭素原子が複数個ある場合には当該炭素原子の一部が、窒素原子、酸素原子、硫黄原子等のヘテロ原子により置換されていてもよい。炭化水素基としては、鎖状炭化水素基、および環状炭化水素基が含まれる。
　上記鎖状炭化水素基として、例えば、鎖状アルキル基、鎖状アルケニル基、および鎖状アルキニル基等が例示される。鎖状炭化水素基を構成する炭素数は特に限定されないが、例えば、６以下の直鎖状または分岐状のものが挙げられ、好ましくは炭素数が１～３のアルキル基である。鎖状炭化水素基は、例えば、ハロゲン原子等の置換基を有していてもよい。鎖状アルキル基の例としては、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、ｉｓｏ－ブチル基、ｓｅｃ－ブチル基、ｔｅｒｔ－ブチル基、ヘキシル基、オクチル基等が挙げられる。
　上記環状炭化水素基として、例えば、シクロアルキル基、およびシクロアルケニル基等が例示される。環状炭化水素基は、例えばハロゲン原子等の置換基を有していてもよい。シクロアルキル基の例としては、シクロプロピル基、シクロブチル基、シクロペンチル基、シクロヘキシル基、等の、炭素数が３以上、好ましくは６以下のものが挙げられる。シクロアルケニル基の例としては、シクロヘキセニル基等の、炭素数が３以上、好ましくは６以下のものが挙げられる。
　上記ハロゲン原子としては、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子等が挙げられる。
　また、一般式（１）に示す尿素誘導体のより好ましい具体例は、以下の１）～２）に示す通りである。
１）Ｒ１～Ｒ４より選択される任意の３つの基が水素原子であり、残りの１つの基がハロゲン原子、または炭素数１～６以下の鎖状炭化水素基である。より好ましくは残りの１つの基が、炭素数１～３、または炭素数が１～２のアルキル基である。
２）Ｒ１～Ｒ４より選択される任意の２つの基が水素原子であり、残りの２つの基が互いに独立にハロゲン原子、または炭素数１～６以下の鎖状炭化水素基である。より好ましくは残りの２つの基が何れも、炭素数１～３、または炭素数が１～２のアルキル基である。なお、水素原子となる２つの基の一方はＲ１、Ｒ２の何れかから選ばれ、他方はＲ３、Ｒ４の何れかから選ばれることがより好ましい。
　尿素は、毒性が極めて低い生体由来の成分である。そのため、本発明にかかる試薬組成物は、Ｓｃａｌｅ試薬と同様に、固定化された生物材料はもとより、固定化されていない（生きた）生物材料の透明化にも用い得る。また、尿素は、蛍光タンパク質へのダメージ、およびその蛍光シグナルの消失が比較的少ないため、本発明にかかる試薬組成物は、Ｓｃａｌｅ試薬と同様に、蛍光タンパク質を用いた生物材料の観察にも適用し得る。さらに、尿素は、極めて安価で入手容易でもあり、かつ取扱い性に優れるため、極めて低コストかつ簡単な手順での透明化処理を提供し得る。
　また、本発明にかかる試薬組成物は、Ｓｃａｌｅ試薬と同様に、上記の利点に加えて、光散乱性が高い不透明な生物材料の透明性を、従来の透明化試薬と比較して格段に向上させることができ、超深部組織に存在する種々の蛍光タンパク質および蛍光物質の観察が可能となる。特に脳組織では、これまで深部観察のバリアーであった白質層を透明化することが可能となり、白質層より深部に位置する領域（例えば脳梁）の観察が可能となる。さらに、本発明にかかる試薬組成物を用いる透明化処理は、Ｓｃａｌｅ試薬を用いる場合と同様にある程度まで可逆的である。具体的には、透明化処理後の生物材料を、平衡塩類溶液に浸漬するだけで、透明化状態を解除し、保存や免疫組織化学的アッセイ、生化学的アッセイ等の用途に使用することが可能である。平衡塩類溶液とは、具体的には例えば、ＰＢＳ、ＨＢＳＳなどリン酸塩によって緩衝液化された平衡塩類溶液；トリス塩酸塩によって緩衝液化された平衡塩類溶液（ＴＢＳ）；人口脳脊髄液（ＡＣＳＦ）；ＭＥＭ，ＤＭＥＭ，及びＨａｍ’ｓ　Ｆ－１２などの細胞培養用の基礎培地；等が挙げられる。透明化処理の前後においてタンパク質等の抗原性が変化されることなく保存されるため、通常の組織染色、および免疫染色の手法を用いた分析が可能である。
　なお、尿素に代えて上記した尿素誘導体を用いる場合も、同様の利点が得られる。
　本発明にかかる試薬組成物における「尿素」の含有量は、Ｓｃａｌｅ試薬と同様に、生物材料の透明化処理が進展する限りにおいて特に限定されない。なお、「尿素」の含有量の上限は、使用する溶媒に対する尿素の溶解度により決定される。対象とする生物材料の種類にも依存するが、例えば、本発明にかかる試薬組成物における尿素の含有量が比較的少ない場合には処理時間を長くし、尿素の含有量が比較的多い場合には処理時間を短くすることで必要な透明化処理を行うことができる。透明化処理を様々な程度にて実現することができるという観点からは、１Ｍ以上、８.５Ｍ以下の範囲内の濃度であることが好ましく、３．５Ｍ以上、８．５Ｍ以下の範囲内の濃度であることがより好ましく、４Ｍ以上、８Ｍ以下の範囲内の濃度であることが特に好ましい。また、尿素に代えて尿素誘導体（または尿素と尿素誘導体との混合物）を用いる場合にも、尿素と同じ含有量に設定することができる。
　〔ｃ．非イオン性界面活性剤〕
　非イオン性界面活性剤もまた、光透過性に優れた生物材料を調製するための試薬組成物の製造に使用されてもよく、得られた試薬組成物は、生物材料中の光散乱物質の除去に非常に有用である。
　非イオン性界面活性剤としては、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート、ポリオキシエチレンソルビタンモノパルミテート、ポリオキシエチレンソルビタンモノステアレート、およびポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート等の脂肪酸系；ポリビニルアルコール等の高級アルコール系；ポリオキシエチレンオクチルフェニルエーテル等のアルキルフェノール系の界面活性剤が挙げられる。具体的には、例えば、Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ－１００、およびＴｒｉｔｏｎ　Ｘ－１４０等のＴｒｉｔｏｎ　Ｘ（登録商標）シリーズ；Ｔｗｅｅｎ－２０、Ｔｗｅｅｎ－４０、Ｔｗｅｅｎ－６０、およびＴｗｅｅｎ－８０等のＴｗｅｅｎ（登録商標）シリーズ；ＮＰ－４０（商品名）；からなる群より選択される少なくとも一種が挙げられ、必要に応じて、二種以上を混合して使用されてもよい。
　スクロースを含まない本発明にかかる試薬組成物（第一試薬ともいう。）に用いられる非イオン性界面活性剤の含有量は、５重量％以上であれば特に限定されないが、６重量％以上、２５重量％以下の範囲内であることが好ましく、８重量％以上、２０重量％以下の範囲内であることがより好ましく、１０重量％以上、２０重量％以下の範囲内であることがさらに好ましく、１２重量％以上、２０重量％以下の範囲内であることが特に好ましい。なお、単位重量％とは、試薬組成物の重量（ｗ（グラム））に対する、使用する界面活性剤の重量（ｗ（グラム））の百分率である。
　界面活性剤は、Ｓｃａｌｅ試薬における任意成分である。Ｓｃａｌｅ試薬は、透明化処理が比較的困難な生物材料の透明化を行う場合に界面活性剤を含んでいることが好ましく、また、生物組織へのＳｃａｌｅ試薬の侵入を緩やかに向上させるという理由から、試薬中に必要に応じて非イオン性界面活性剤が含まれていてもよい。ただし、その含有量は主に０．０５重量％以上、０．２重量％以下の範囲内で用いられており、本発明にかかる試薬組成物に用いられる非イオン性界面活性剤の含有量と大きく異なっている。
　なお、非イオン性界面活性剤は、生物組織への本試薬の侵入を緩やかに向上させるので、スクロースを含む本発明にかかる試薬組成物（第二溶液ともいう。）に任意成分として含まれてもよい。本発明にかかる試薬組成物に用いられる非イオン性界面活性剤の含有量は、０．０２５重量％以上、５重量％以下の範囲内であることが好ましく、０．０５重量％以上、０．５重量％以下の範囲内であることがより好ましく、０．０５重量％以上、０．２重量％以下の範囲内であることが特に好ましい。
　〔ｄ．スクロース〕
　スクロースもまた、光透過性に優れた生物材料を調製するための試薬組成物の製造に使用されてもよく、適用すべき生物材料の屈折率に合った屈折率の試薬を得るに非常に有用である。本明細書においてはスクロースについてのみ言及するが、スクロースと同様の屈折率調整効果を示す任意の物質を使用することができる。
　当該分野において、スクロースは、一般に、組織固定液（例えばパラホルムアルデヒド溶液）と置換することによって固定された組織の損傷を防ぐために用いられ、その濃度は通常１０重量％以上、３０重量％以下の範囲内である。スクロースを含む本発明にかかる試薬組成物（第二溶液ともいう。）は、組織固定液と置換するために用いられるのでなく、好ましくは、固定された組織がスクロースによって置換された後に用いられ、より好ましくは、固定された組織がスクロースによって置換され、次いで、本発明にかかる第一溶液が適用された後に第二溶液として用いられる。
　スクロースを含む本発明にかかる試薬組成物（第二試薬ともいう。）に用いられるスクロースの含有量は、３０重量％以上であれば特に限定されないが、３０重量％以上、８０重量％以下の範囲内であることが好ましく、３０重量％以上、７０重量％以下の範囲内であることがより好ましく、４０重量％以上、７０重量％以下の範囲内であることがさらに好ましく、４０重量％以上、６０重量％以下の範囲内であることが特に好ましい。なお、単位重量％とは、第２の試薬の重量（ｗ（グラム））に対する、使用するスクロースの重量（ｗ（グラム））の百分率である。
　〔ｅ．溶媒〕
　本発明にかかる試薬組成物に使用される溶媒の種類は、上述した有効成分を溶解し得る限り特に限定されないが、水を主溶媒として用いることが好ましく、水のみを溶媒として用いることが特に好ましい。なお、本発明において、「水を主溶媒として用いる」とは、使用される全溶媒に占める水の体積の割合が他の溶媒と比較して最も多いことを指し、好ましくは使用される全溶媒の体積の合計の５０％を超え１００％以下の量の水を用いることを指す。また、水を主溶媒として用いて調製された本発明にかかる試薬組成物を、水溶液としての試薬と称する。
　なお、水を主溶媒として用いた場合には、例えば、固定化した標本にはジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を水と混合し用いてもよい。例えば固定化した標本にＤＭＳＯを混合して用いれば、生物材料に対する試薬の浸透性の向上、および角質表面を有する組織の透明化処理促進等の効果が期待される。
　溶媒として水を用いる主な利点は、以下の通りである：
１）本発明にかかる試薬組成物の有効成分は水への溶解性に優れているため、本発明にかかる試薬組成物の調製が容易かつ低コストとなる；
２）有機溶媒を主溶媒として用いる場合と比較して、透明化処理時に処理対象となる生物材料の脱水を伴わない。そのため、生物材料が収縮するという問題を抑制可能となる；
３）有機溶媒を主溶媒として用いる場合と比較して、蛍光タンパク質に損傷を与える可能性が著しく低減される。そのため、透明化処理を受けた生物材料を、蛍光タンパク質を用いて観察可能となる；
４）固定化された材料に限定されず、生材料の透明化処理に適用可能となる；
５）後述するように透明化処理が可逆的となり、透明化処理後の生体試料を必要に応じて透明化処理前の状態に戻すことができる；
６）有機溶媒を主溶剤として用いる場合と比較して、取り扱いの安全性がより高くなる。
　また、本発明にかかる試薬組成物は、透明化処理の対象となる生物材料に好適なｐＨの維持が可能な緩衝液であってもよい。さらに、本発明にかかる試薬組成物は、透明化処理の対象となる生物材料の変形を招来せず、かつ生物材料内に有効成分が充分に浸透する程度に、その浸透圧が調整されていてもよい。
　〔ｆ．さらなる任意成分〕
　本発明にかかる試薬組成物は、Ｓｃａｌｅ試薬と同様に、必要に応じて、グリセロール、カルボキシビニルポリマー、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、プロピレングリコール、ならびにマクロゴールから選択される少なくとも一種の化合物を「乾燥抑制成分」として含むことができる。乾燥抑制成分は、透明化処理の対象となる生物材料の乾燥を防止する。とりわけ、透明化処理後に光学顕微鏡による観察に供されるまでの時間が比較的長い場合、あるいは、光学顕微鏡による長時間観察に供される場合には、本発明にかかる試薬組成物は、上記の乾燥抑制成分を含むことが好ましい。
　また、グリセロール等の「乾燥抑制成分」を使用する場合、その含有量は特に限定されないが、２．５重量％以上、２０重量％以下の範囲内の濃度で含むことが好ましく、５重量％以上、１５重量％以下の範囲内の濃度で含むことがより好ましく、８重量％以上、１２重量％以下の範囲内の濃度で含むことが特に好ましい。なお、単位重量％とは、試薬組成物の重量（ｗ（グラム））に対する、使用する「乾燥抑制成分」の重量（ｗ（グラム））の百分率である。
　また、本発明にかかる試薬組成物は、Ｓｃａｌｅ試薬と同様に、上述した成分以外に、例えば、ｐＨ調整剤、および浸透圧調整剤等の添加剤を必要に応じて含んでいてもよい。
　〔２．本発明にかかる方法〕
　光透過性に優れた生物材料を調製するために、尿素または尿素誘導体と、アミノアルコールと、非イオン性界面活性剤とを含んでいる第一溶液を調製する。調製した第一溶液中に生物材料を配置することによって、第一溶液を生物材料に浸潤させる。第一溶液を浸潤させるべき生物材料は、予めパラホルムアルデヒド溶液で固定し、次いでスクロース溶液で置換していることが好ましい。
　第一溶液は、本発明にかかる試薬組成物を製造するためのキットを用いて調製されてもよく、本発明にかかる試薬組成物としてそのまま提供されてもよい。すなわち、本発明にかかる方法は、光透過性に優れた生物材料を調製するために、尿素または尿素誘導体と、アミノアルコールと、非イオン性界面活性剤とを含んでいる第一溶液を、生物材料に浸潤させる工程（すなわち第一浸潤工程）を包含することを特徴としている。第一溶液を浸潤させた生物材料は、従来公知の透明化試薬の効果よりも優れた光透過性を示す。このことにより、第一溶液によって生物材料中の光散乱物質（主に脂質）が除去されたことがわかる。このように、第一溶液は、脂質を多く含有している器官または組織の透明化を実現するという優れた効果を発揮する。
　また、第一溶液と混合された血液は、その光透過性が顕著に向上する。このことにより、第一溶液によって血液中の色素（主にヘモグロビン）が除去されたことがわかる。このように、第一溶液は、血液の透明化、ならびに血液を多く含有している臓器または組織の透明化を実現するという、予測し得ない優れた効果を発揮する。
　本発明にかかる方法は、第一浸潤工程に加えて、生物材料への第二溶液の浸潤（すなわち第二浸潤工程）が行われることが好ましい。この場合、尿素または尿素誘導体と、アミノアルコールと、スクロースとを含んでいる第二溶液を調製する。調製した第二溶液中に生物材料を配置することによって、第二溶液を生物材料に浸潤させる。第二溶液を浸潤させるべき生物材料は、予めパラホルムアルデヒド溶液で固定し、次いでスクロース溶液で置換していることが好ましく、第一浸潤工程を行った後に第一溶液を十分に洗浄していることがより好ましい。第二溶液を浸潤させた生物材料は、従来公知の透明化試薬に匹敵する光透過性を示し、第一浸潤工程および第二浸潤工程の両方を施した生物材料は、従来公知の透明化試薬の効果よりも極めて優れた光透過性を示す。このことにより、第一溶液によって除去しきれなかった光散乱物質が存在し、第二溶液によってその光散乱物質が除去されたか、または第一浸潤工程後の生物材料における光散乱が減弱されたことがわかる。また、第二浸潤工程は、第一浸潤工程を行ったことによって膨らんだ生物材料のサイズを元に戻すことができる。このように、第二溶液は、脂質を多く含有している器官または組織の透明化を実現するという第一溶液の優れた効果を、顕著に増強する。
　一実施形態において、本発明にかかる方法は、以下の手順に従って行われることが好ましい：
１）４％パラホルムアルデヒド溶液で潅流固定したマウスから脳を摘出し、摘出した脳をパラホルムアルデヒド溶液で１２～２４時間固定する
２）固定後の脳を、２０％スクロース／ＰＢＳ溶液で置換する
３）置換した脳を第一溶液でさらに置換する
４）第一溶液を浸潤させた脳を、ＰＢＳで数時間ずつ数回洗浄する
５）洗浄した脳を第二溶液で置換する
６）第二溶液を浸潤させた脳を観察する。あるいは、ＰＢＳで洗浄した後に保存する。
　Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトラキス（２－ヒドロキシプロピル）エチレンジアミンを第一溶液に用いて調製された生物材料の光透過性は非常に優れていた。また、トリエタノールアミン（すなわち、２，２’，２’’－ニトリロトリエタノール）を用いた第二溶液を組み合わせた場合に、その光透過性がさらに向上した。これらのアミノアルコールを用いた場合、ＧＦＰ等の蛍光タンパク質の蛍光シグナルの消失が非常に少ないので、全脳イメージングに好適に用いられる。
　また、本発明にかかる方法を利用して免疫組織化学アッセイを行う場合、上記４と５との間に行うことが好ましいがこれに限定されない。
　上記手順（透明化処理）を実行する際の温度は特に限定されないが、１５℃以上、４５℃以下の範囲内であることが好ましい。また、透明化処理を実行する処理時間は、特に限定されないが、２時間以上、６ヶ月以内の範囲内であることが好ましく、１２時間以上、７日以内の範囲内であることがより好ましい。
　さらに、本発明により、本発明の方法に従って調製した光透過性に優れた生物材料が提供される。Ｓｃａｌｅ法では、厚さ１００μｍ以下のマウス脳切片を用いて、２光子顕微鏡による観察が可能な優れた光の透過率を提供しているが、本発明の方法に従って調製した生物材料（脳全体）は、後述する実施例に示すように、第１浸潤工程だけであっても、５２０ｎｍ以上の波長を有する光の透過率が６０％以上、５６０ｎｍ以上の波長を有する光の透過率が７０％以上、６４０ｎｍ以上の波長を有する光の透過率が８０％以上という格別優れた効果を奏する。しかも、これに第２浸潤工程を組み合わせることによって、散乱の大きな部位の上記透過率がさらに向上する。このように、本発明は、切片でない生物材料に対してこのように優れた光透過性を付与することができ、その結果、得られた生物材料を１光子共焦点顕微鏡にて観察することができる。
　また、本発明の方法に従って調製した光透過性に優れた生物材料の観察には、５２０ｎｍ以上の波長を有する光が好適に用いられ、例えば、可視光領域中、赤（波長領域７４０～６２５ｎｍ）、オレンジ（波長領域６２５～５９０ｎｍ）、黄（波長領域５９０～５６５ｎｍ）、緑（波長領域５６５～５２０ｎｍ）の色を呈する光に対する透過性に優れた生物材料が、本発明によって提供される。
　〔３．本発明のさらなる利用〕
　透明化処理された生物材料は、次いで、例えば、光学顕微鏡による観察工程に供される。観察工程に供される生物材料は、必要に応じて、上記透明化処理工程の事前に、または透明化処理工程後で観察工程前に、染色あるいはマーキング等の可視化処理工程が施されてもよい。
　例えば、可視化処理工程に蛍光タンパク質を用いる場合には、透明化処理工程の事前に、生きた生物材料に対して蛍光タンパク質遺伝子を導入して、蛍光タンパク質を発現させる。
　また、可視化処理工程として、蛍光性化学物質（蛍光タンパク質は除く）の生物材料への注入、または蛍光性化学物質を用いた生物材料の染色を行う場合には、上記透明化処理工程の事前または当該工程の最中に行うことが好ましいが、上記透明化処理工程後に行うこともできる。さらに、可視化処理工程として、蛍光性化学物質以外の化学物質を用いた染色を行うこともできる。
　観察工程は、あらゆる種類の光学顕微鏡を用いて行うことができる。例えば、観察工程は、三次元超分解顕微鏡技術（例えば、ＳＴＥＤ、３Ｄ　ＰＡＬＭ、ＦＰＡＬＭ、３Ｄ　ＳＴＯＲＭ、およびＳＩＭ）を適用して行うこともできる。また、観察工程は、多光子励起型（一般的には２光子励起型）の光学顕微鏡技術を適用して行ってもよいが、１光子共焦点顕微鏡またはシート照明マクロズーム顕微鏡を用いることがより好ましい。
　後述する実施例に示すように、本発明を用いれば、三次元にて免疫組織化学を行うことが可能である。このような利点を有する本発明は、自己免疫疾患の解析ツールとして極めて有用である。自己免疫疾患の解析に用いられる場合、生物材料を提供する生物は成体であってもよく胎仔であってもよく、哺乳類（哺乳動物）であることが好ましく、好ましい哺乳類としては、ヒトを除く霊長類（例えば、マーモセット）、ヒトが挙げられる。また、生物材料は、個体そのもの（生きているヒト個体そのものは除く。）であってもよいが、多細胞動物由来の組織または器官（例えば、脳全体またはその一部）が本発明に好適に用いられる。
　自己免疫疾患は、免疫系が自己（内因性抗原）に対する抗体（自己抗体）を産生し、非自己と認識された上記内因性抗原を排除しようと反応することによって生じる疾患である。これまでに数多くの自己免疫疾患が見出され、多くの研究がなされているが、自己抗体が患者体内の組織のどのような部位と実際に反応しているのかを知ることは困難であり、疾患の責任病巣を同定することは困難である。また、産生された自己抗体の具体的な抗原を知ることは困難である。
　一実施形態において、本発明は、上記免疫組織化学的アッセイを用いて自己抗体と反応性である組織部位を探索する方法を提供する。上記組織部位は、自己抗体に起因する疾患の責任病巣であり得る。別の実施形態において、本発明は、上記免疫組織化学的アッセイを用いて自己抗体に対する抗原を探索する方法を提供する。
　本発明を用いれば、生体組織の複雑な構造を維持した状態にて抗原抗体反応を確認することができるので、自己抗体が患者体内の組織のどのような部位と実際に反応しているのかを探索することが可能であり、産生された自己抗体の抗原を探索することが可能である。例えば、自己免疫疾患患者から採取した自己抗体を蛍光標識したものを上記可視化処理工程に供し、引き続いて上記観察工程を行うことによって、自己抗体が反応する部位を見出すことができ、自己抗体の抗原を見出すことができる。
　疾患責任病巣を同定することによって、種々の脳神経疾患（精神疾患、睡眠障害、神経変性疾患を含む。）との関連性を見出す可能性がある。例えば、種々の脳神経疾患のモデル動物に由来する生物材料を用いて自己抗体の反応性を確認することによって、種々の病態を自己免疫疾患の観点から解明するためのデータが取得される可能性がある。
　透明化処理された生物材料は、次いで、例えば、生化学的アッセイに供されてもよい。生化学的アッセイは、細胞、組織等の生体材料中に含まれるタンパク質、脂質、低分子化合物等を化学的に解析するためのアッセイである。生化学的アッセイは、例えば、臨床の現場において最も簡便かつ有用な情報収集手段として用いられており、その解析結果は、種々の疾患（例えば、肝臓病、腎臓病、糖尿病、高血圧、心臓病、高尿酸血症など）の診断または予後の判定などに用いられる。
　一般的に、生化学的アッセイは、生体材料中に含まれるタンパク質、脂質、低分子化合物等をクロマトグラフィー、電気泳動等によって分離し、抗原抗体反応や特殊な検出器（質量分析器等）によって検出することによって達成される。このような生化学的アッセイを組み合わせることにより、透明化に使用したサンプルの複合的な解析が可能となるので、本発明が適用された生物材料は、生化学的アッセイに供されることが好ましい。生化学的アッセイに供される生物材料は、必要に応じて、事前に所望の染色または蛍光標識が施されてもよい。
　一実施形態において、本発明は、上記生化学的アッセイを用いて生物材料中の成分を生化学的に解析する方法と組み合わせた複合的な解析環境を提供する。本発明に好適に用いられる生物材料は、個体から取得した器官や組織（例えば、脳、心臓、肺、腎臓または肝臓）、体液（例えば、血液、唾液、血清、血漿、尿、滑液、髄液等）であり得る。本発明は、公知の種々の生化学的解析に用いられればよく、例えば、透明化後のイメージング解析によってさらなる解析を必要とする部位が見出された場合には、その部位についてのプロテオミクス的解析（例えば質量分析計を用いた解析）等に好適に利用され、その測定対象としては、タンパク質、核酸、脂質、糖、生体内低分子化合物等が挙げられるがこれらに限定されない。
　本発明を、以下の実施例に基づいてより具体的に説明するが、本発明はこれに限定されない。
　〔１：透明化処理後のマウス全脳の光透過性〕
　生後６ヶ月齢の個体に対して、ペリスタポンプを用いて左心室より室温ＰＢＳを灌流した後、室温固定液（４％パラホルムアルデヒド／ＰＢＳ，ｐＨ７～８）を灌流することによって、マウスの全身を完全に固定した。
　次いで、マウスの頭蓋骨を除去して、全脳を注意深く摘出した。摘出した全脳を氷冷固定液（４％パラホルムアルデヒド／ＰＢＳ，ｐＨ７～８）に４℃の環境下で一晩浸漬した。固定した全脳を２０％スクロース／ＰＢＳ溶液中へ移し、４℃の環境下で浸潤させた。２０％スクロース／ＰＢＳ溶液を浸潤させた脳サンプル（サンプルａ）の光学顕微鏡像を、図１の（ａ）に示す。サンプルａの光透過率（サンプル中央部分）を、コニカミノルタＣＭ－５分光測色計を用いて測定した（図１の（ｄ））。
　２０％スクロース／ＰＢＳ溶液で置換した脳を、２５％　Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトラキス（２－ヒドロキシプロピル）エチレンジアミン、１５％　Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ－１００（ナカライテスク　Ｃａｔ　Ｎｏ．２５９８７－８５）、および２５％尿素を含む第一溶液（Ｓｏｌ．ＰＥ）中へ移し、３７℃の環境下でゆるやかに振盪しながら７日間浸潤させることによって、第一溶液で置換した。第一溶液を浸潤させた脳サンプル（サンプルｂ）の光学顕微鏡像を、図１の（ｂ）に示す。サンプルｂの光透過率（サンプル中央部分）を、コニカミノルタＣＭ－５分光測色計を用いて測定した（図１の（ｄ））。次いで、第一溶液で置換した脳を、ＰＢＳ中へ移し、室温環境下で緩やかに３～１２時間ずつ２～３回振盪して洗浄した。洗浄した脳を、１０％トリエタノールアミン、０．１％　Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ－１００、２５％尿素、５０％スクロースを含む第二溶液（Ｓｏｌ．ＣＬ）中へ移し、室温環境下で緩やかに４日以上振盪することによって、第二溶液で置換した。第二溶液を浸潤させた脳サンプル（サンプルｃ）の光学顕微鏡像を、図１の（ｃ）に示す。サンプルｃの光透過率（サンプル中央部分）を、コニカミノルタＣＭ－５分光測色計を用いて測定した（図１の（ｄ））。
　サンプルａは、どの波長領域であっても光透過性が低いが、サンプルｂはサンプルの光透過性を大いに改善し、サンプルｂとサンプルｃとを比較することによって、第二溶液への置換が白質の透明化を促進したことがわかる。
　〔２：全脳の透明化およびスキャンニング〕
　ROSA26部位にH2B-mCherry（蛍光タンパク質ｍＣｈｅｒｒｙを融合したヒストンＨ２Ｂタンパク質）をノックインしたマウス（Takaya Abe et al., "Establishment of Conditional Reporter Mouse Lines at ROSA26 Locus For Live Cell Imaging" Genesis vol.49: 579-590 (2011)）の生後７ヶ月齢の個体に対して、ペリスタポンプを用いて左心室より室温ＰＢＳを灌流した後、室温固定液（４％パラホルムアルデヒド／ＰＢＳ，ｐＨ７～８）を灌流することによって、マウスの全身を完全に固定した。
　次いで、マウスの頭蓋骨を除去して、全脳を注意深く摘出した。摘出した全脳を氷冷固定液（４％パラホルムアルデヒド／ＰＢＳ，ｐＨ７～８）に４℃の環境下で一晩浸漬した。固定した全脳を２０％スクロース／ＰＢＳ溶液中へ移し、４℃の環境下で浸潤させた。
　２０％スクロース／ＰＢＳ溶液で置換した脳を、２５％　Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトラキス（２－ヒドロキシプロピル）エチレンジアミン、１５％　Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ－１００（ナカライテスク　Ｃａｔ　Ｎｏ．２５９８７－８５）、および２５％尿素を含む第一溶液（Ｓｏｌ．ＰＥ）中へ移し、３７℃の環境下で１０日間浸潤させることによって、第一溶液で置換した。第一溶液で置換した脳を、ＰＢＳ中へ移し、室温環境下で緩やかに３～１２時間ずつ２～３回振盪して洗浄した。
　洗浄した脳を、１０％トリエタノールアミン、０．１％　Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ－１００、２５％尿素、５０％スクロースを含む第二溶液（Ｓｏｌ．ＣＬ）中へ移し、室温環境下で緩やかに４日以上振盪することによって、第二溶液で置換した。第二溶液で置換した脳を、観察用サンプルとして用いた。
　観察用サンプルを、ＴＳＦ４３００／ミネラルオイル（１：１）の混合オイルに浸し、シート照明マクロズーム顕微鏡（LaVision社、Ultramicroscope）を用いた全脳スキャンニングに供した。取得したデータを、Imaris（Bitplane社）を用いて三次元に再構成した（図２）。図２の（ａ）は、サンプルの脳底部側からの三次元再構成画像を示し、（ｂ）は、顕微鏡にて観察された観察面を示し、（ｃ）は、三次元再構成されたサンプルの冠状断を示し、（ｄ）は、三次元再構成されたサンプルの矢状断を示す。示されるように、本発明を用いて処理された組織は、シート照明マクロズーム顕微鏡に適応し得る程度にその光透過性が高いということがわかった。
　〔３：三次元での免疫組織化学的アッセイ〕
　ROSA26部位にH2B-EGFP（蛍光タンパク質ＥＧＦＰを融合したヒストンＨ２Ｂタンパク質）をノックインしたマウス（Takaya Abe et al.　前出）の生後４ヶ月齢の個体に対して、ペリスタポンプを用いて左心室より室温ＰＢＳを灌流した後、室温固定液（４％パラホルムアルデヒド／ＰＢＳ，ｐＨ７～８）を灌流することによって、マウスの全身を完全に固定した。
　次いで、マウスの頭蓋骨を除去して、全脳を注意深く摘出し、視床下部を含む脳領域を注意深く切り出した。切り出した脳領域組織を氷冷固定液（４％パラホルムアルデヒド／ＰＢＳ，ｐＨ７～８）に４℃の環境下で一晩浸漬した。固定した組織を２０％スクロース／ＰＢＳ溶液中へ移し、４℃の環境下で浸潤させた。
　２０％スクロース／ＰＢＳ溶液で置換した組織を、２５％　Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトラキス（２－ヒドロキシプロピル）エチレンジアミン、１５％　Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ－１００（ナカライテスク　Ｃａｔ　Ｎｏ．２５９８７－８５）、および２５％尿素を含む第一溶液（Ｓｏｌ．ＰＥ）中へ移し、４℃の環境下で緩やかに２４時間振盪することによって、第一溶液で置換した。第一溶液で置換した組織を、ＰＢＳ中へ移し、室温の環境下で緩やかに３～１２時間ずつ２～３回振盪して洗浄した。
　洗浄した組織を、抗Ｃｏｐｅｐｔｉｎ抗体（Santacruz社）および抗ＶＩＰ抗体（Immunostar社）の希釈液（それぞれ１：１００および１：３００）中へ移して３日間反応させた。上記希釈液を除去した後、抗体と反応させた組織を、０．１％　Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ－１００／ＰＢＳ中へ移し、室温または３７℃の環境下で緩やかに３～１２時間ずつ２～３回振盪して洗浄した。
　洗浄した組織を、Ａｌｅｘａ蛍光色素を結合した二次抗体の希釈液（１：１０００）中へ移して３日間反応させた。上記希釈液を除去した後、二次抗体と反応させた組織を、０．１％　Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ－１００／ＰＢＳ中へ移し、室温または３７℃の環境下で緩やかに３～１２時間ずつ２～３回振盪して洗浄し、さらにＰＢＳ中へ移し、室温環境下で緩やかに３～１２時間ずつ１～２回振盪して洗浄した。
　洗浄した組織を、１％パラホルムアルデヒド／ＰＢＳ中へ移し、室温で約３０分間振盪することによって、抗体をクロスリンクさせ、さらにＰＢＳ中へ移し、室温環境下で緩やかに３～１２時間ずつ１～２回振盪して洗浄した。次いで、１０％トリエタノールアミン、０．１％　Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ－１００、２５％尿素、および５０％スクロースを含む第二溶液（Ｓｏｌ．ＣＬ）中へ移し、室温環境下で緩やかに２日間以上振盪することによって、第二溶液で置換した。第二溶液で置換した組織を、観察用サンプルとして用いた。
　観察用サンプルを、共焦点レーザー顕微鏡（カールツァイス社、ＬＳＭ７００）を用いて、視交叉上核領域を、脳底部から約５００μｍ程度の深さまで観察した。取得したデータを、Imaris（Bitplane社）を用いて三次元に再構成した（図２）。
　図３の（ａ）は、三次元再構成されたサンプルを斜め上方から観察した画像を示し、（ｂ）は、三次元再構成されたサンプルをほぼ真横から観察した画像を示す。示されるように、ＥＧＦＰの蛍光像だけでなく、ＣｏｐｅｐｔｉｎおよびＶＩＰの免疫染色像を首尾よく三次元にて観察することができた。
　〔４：血液に対する効果〕
　パラホルムアルデヒド固定したマウス血液０．１ｍＬに、０．４ｍＬの処理溶液（ＰＢＳ溶液、２５％尿素を含む第一溶液（Ｓｏｌ．ＰＥ）、またはアミノアルコール溶液（Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトラキス（２－ヒドロキシプロピル）エチレンジアミンの２５％水溶液））を添加した。混合液を室温で混合した直後に、１５０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。上清を分離した後の沈殿に上記処理溶液を０．５ｍＬ加え、再び同様に遠心分離し、再度沈殿を上清と分離した。このような沈殿の洗浄操作を３回繰り返した後に、沈殿に上記処理溶液０．５ｍＬを混合した。
　結果を図４に示す。図中カラム１～３はそれぞれ、血液とＰＢＳ溶液との混合液、血液と第一溶液との混合液、および血液とアミノアルコール溶液との混合液を遠心分離して得られた上清および沈殿（血球沈渣）を示す。
　第一溶液を用いて血液を処理することによって沈渣の脱色が確認された（カラム２）。この効果は、第一溶液中に含まれているアミノアルコールによるものであることがわかった（カラム３）。
　〔５：各種組織の透明化〕
　蛍光タンパク質mKate2を発現するマウスの生後４ヶ月齢の個体に対して、ペリスタポンプを用いて左心室より室温にてヘパリンＰＢＳ溶液１０ｍＬを灌流した後、室温固定液（４％パラホルムアルデヒド／ＰＢＳ，ｐＨ７～８）１５０ｍＬを灌流することによって、マウスの全身を完全に固定し、次いで、２０ｍＬのＰＢＳ溶液で洗浄し、第一溶液を２倍希釈した溶液２０ｍＬでさらに灌流した。
　次いで、固定したマウスから、心臓、肺、腎臓および肝臓を摘出した。摘出した組織を、第一溶液に５日間浸漬し、次いで第二溶液に４日間浸漬して透明化した。
　透明化前後の各組織サンプルの光学顕微鏡像を、図５のカラム１および２に示す。また、透明化処理時に細胞核染色試薬SYTO16で染色した各組織サンプルを用いて、シート照明顕微鏡による３次元イメージングを行い、mKate2の蛍光（赤）とSYTO16の蛍光（緑）とを同時に画像化した（カラム３）。
　図示されるように、本発明による透明化は、生物材料として脳以外の各種組織に対してもまた適用可能であり、シート照明顕微鏡に適応し得るレベルであることがわかった。
　このように、本発明は以下のような利点を有する：
［１］有機溶媒を用いた手法と同等の透明化レベルを水溶性試薬によって実現し、シート照明顕微鏡での観察を可能にした。
［２］有機溶媒を用いた手法と比較して、蛍光シグナルの消失を最小限に抑制するとともに安全性を飛躍的に向上させた。
［３］蛍光タンパク質の検出だけでなく、抗体または対比染色などの免疫組織化学的アッセイに使用可能である。これにより、三次元での免疫組織化学が可能となった。
［４］化合物スクリーニングによる試薬組成の改変および最適化によって、Ｓｃａｌｅ法と比較して処理時間を明らかに短縮させ（月単位から日～週単位へ）、２光子顕微鏡が必要なレベルからシート照明マクロ顕微鏡に適応可能なレベルにまで透明度を向上させた。
［５］スクリーニングした化合物はいずれも安価であったため、低コストにて実用化することが可能である。
［６］特殊なデバイスおよび煩雑な操作を必要としない、簡便なプロトコルを確立したことにより、多サンプルの並行処理を可能とした。
［７］シート照明マクロ顕微鏡に適応した際に、全脳のスキャニングを１色あたり１時間程度で完了することができるので、タイムラグがほとんどない状態でマルチカラーでの画像を取得することが可能であり、三次元で再構成された全脳をデータ化することが可能である。
［８］生体組織の複雑な構造を三次元にて維持した状態で免疫組織化学を行うことが可能なため、自己抗体が被験体内の実際の組織にてどのような部位と反応しているのかを探索することができ、自己抗体の抗原を探索することができる。
　本発明は上述した各実施形態および実施例に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。
　２光子励起型の光学顕微鏡を用いることなく、汎用型の１光子共焦点顕微鏡であっても高精度のイメージングが実現し、さらに、シート照明マクロズーム顕微鏡のような最新の顕微鏡技術と組み合わせることによってハイスループットな組織イメージングが可能となる。このことは、医学の進歩だけでなく新薬の開発等にも大いに貢献する。

Claims (16)

  1. 　アミノアルコールを含んでいる溶液であることを特徴とする光透過性に優れた生物材料を調製するための試薬組成物。
  2. 　尿素および尿素誘導体からなる群より選択される少なくとも一種の化合物をさらに含んでいることを特徴とする請求項１に記載の試薬組成物。
  3. 　非イオン性界面活性剤をさらに含んでいることを特徴とする請求項１または２に記載の試薬組成物。
  4. 　スクロースをさらに含んでいることを特徴とする請求項１～３のいずれか１項に記載の試薬組成物。
  5. 　アミノアルコールと、尿素および尿素誘導体からなる群より選択される少なくとも一種の化合物と、非イオン性界面活性剤とを含んでいる第一溶液、
    　アミノアルコールと、尿素および尿素誘導体からなる群より選択される少なくとも一種の化合物と、スクロースとを含んでいる第二溶液
    を備えていることを特徴とする光透過性に優れた生物材料を調製するための試薬キット。
  6. 　第二溶液が非イオン性界面活性剤をさらに含んでいることを特徴とする請求項５に記載の試薬キット。
  7. 　アミノアルコールを含んでいることを特徴とする、光透過性に優れた生物材料を調製するための試薬組成物を製造するための組成物。
  8. 　（１）アミノアルコール、ならびに
    　（２）尿素および尿素誘導体からなる群より選択される少なくとも一種の化合物、非イオン性界面活性剤、ならびにスクロースからなる群より選択される少なくとも１つ
    を備えていることを特徴とする、光透過性に優れた生物材料を調製するための試薬組成物を製造するためのキット。
  9. 　光透過性に優れた生物材料を調製する方法であって、
    　アミノアルコールと、尿素および尿素誘導体からなる群より選択される少なくとも一種の化合物と、非イオン性界面活性剤とを含んでいる第一溶液を、生物材料に浸潤させる第一浸潤工程
    を包含することを特徴とする方法。
  10. 　アミノアルコールと、尿素および尿素誘導体からなる群より選択される少なくとも一種の化合物と、スクロースとを含んでいる第二溶液を、生物材料に浸潤させる第二浸潤工程をさらに包含することを特徴とする請求項９に記載の方法。
  11. 　第二溶液が非イオン性界面活性剤をさらに含んでいることを特徴とする請求項１０に記載の方法。
  12. 　請求項９～１１のいずれか１項に記載の方法に従って調製した光透過性に優れた生物材料。
  13. 　請求項９～１１のいずれか１項に記載の方法に従って調製した生物材料を用いることを特徴とする免疫組織化学的アッセイ。
  14. 　請求項１３に記載の免疫組織化学的アッセイを用いることを特徴とする自己抗体と反応性である組織部位を探索する方法。
  15. 　請求項１３に記載の免疫組織化学的アッセイを用いることを特徴とする自己抗体に対する抗原を探索する方法。
  16. 　請求項９～１１のいずれか１項に記載の方法に従って調製した生物材料を用いることを特徴とする生化学的アッセイ。
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