WO2014175556A1 - 커큐민 대비 용해도와 기능을 향상시킨 커큐민-펩타이드의 설계 및 이의 제조방법 - Google Patents

커큐민 대비 용해도와 기능을 향상시킨 커큐민-펩타이드의 설계 및 이의 제조방법 Download PDF

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peptide
peptide complex
linker compound
complex
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김산호
박진순
반수호
박진석
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애니젠 주식회사
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    • A61K47/64—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent

Definitions

  • the present invention relates to a curcumin-peptide complex with improved solubility in water as compared to curcumin, a method for improving the solubility in curcumin in water, a method for preparing the complex, and a cosmetic composition and a health functional food comprising the complex.
  • Curcumin is the main active ingredient of turmeric (representative crops in Jindo-gun, Jeollanam-do) and is a natural pigment contained in curry and mustard. Curcumin has a strong antioxidant function, and formerly belongs to phenolic antioxidants, and as the anti-cancer effects have recently been revealed, scientific attention has been gathered. However, curcumin, despite its excellent biological activity, is insoluble in water, so its bioavailability and bioavailability are extremely low, making it difficult to develop into pharmaceuticals, cosmetics, and foods. The development of bio-active materials through the process is actively progressing. Peptides are next-generation human-friendly biomaterials that are involved in life signaling and biological function regulation as functional minimum units of proteins composed of amino acids.
  • Peptides have been used mainly in medicines, but they began to attract attention around the world in 2002 when papers were published showing that they have better physiological activity than vitamin C, which has been used at the World Congress of Dermatology 1 .
  • the peptide is a raw material despite the excellent functional cosmetic material Unlike other cosmetic raw materials, it is expensive, so it is prescribed under the effective effective concentration, so the immediate effect is not seen, and the market expansion is limited.
  • the present inventors have conducted research to improve the solubility of curcumin in order to increase the utilization of curcumin having excellent biological activity as a medicine, cosmetic and food. Furthermore, the present inventors have found that peptide is a material that has been proved to be biocompatible and safe. Curcumin is a natural resource material with excellent functional effect. Therefore, the commercialization using the peptide-curcumin complex maximizes the advantages of the two functional materials. It was deemed valuable as a fusion material that can overcome each other. In addition, if the product price is lowered through cost reduction by mass production of the peptide-curcumin complex, it is possible to expand the market and create a new market.
  • the present inventors have developed a new curcumin-peptide fusion material in which curcumin, a natural antioxidant component mainly present in Curcuma longa, and a functional peptide effective in improving skin condition, and the curcumin-peptide complex prepared in water It was confirmed that the complete dissolution, by optimizing the manufacturing protocol for mass production of the curcumin-peptide complex, the present invention was completed.
  • an object of the present invention is to provide a curcumin-peptide complex with improved solubility in water as compared to curcumin.
  • Another object of the present invention is to provide a method of improving the solubility of curcumin in water.
  • Another object of the present invention to provide a health functional food comprising the curcumin-peptide complex.
  • the invention is (i) curcumin; Provides a peptide complex - and (ii) the curcumin and includes a 2 to 30 amino acid peptide consisting of the combination through the linker compound, the solubility in water as compared to, characterized in that dissolved in water, curcumin "enhanced curcumin do.
  • the present inventors conducted a study to improve the solubility of curcumin in order to increase the utilization of curcumin as a medicine, cosmetics and food having excellent biological activity.
  • the present inventors believe that the peptide is a material that has proven biocompatibility and safety, and curcumin is a natural resource material with excellent functional effects, so that the commercialization using the tempide-curcumin complex maximizes the advantages of the two functional materials and mutually overcomes the disadvantages. We judged it as valuable as a fusion material that can be overcome. In addition, if the product cost is lowered through cost reduction by mass production of the peptide-curcumin complex, it would be possible to expand the market and create a new market.
  • the present inventors have developed a new curcumin-peptide fusion material in which curcumin, a natural antioxidant component mainly present in Curcuma longa, and a functional peptide effective in improving skin condition, and the curcumin-peptide complex prepared in water It was confirmed that it was completely dissolved and optimized the manufacturing protocol for mass production of the curcumin-peptide complex.
  • curcumin (l Z-bis- -hydroxy-S-methoxyphenyn-l, 6-heptadiene— 3,5-dione)] is included in bulbs of poultry. It means the main pigment component of turmeric. Curcumin. It can be obtained from a variety of sources, for example can be chemically synthesized and can be separated from plants. For the purposes of the present invention, the curcumin also includes derivatives thereof so long as they exhibit substantially the same activity (eg, antioxidant capacity) as curcumin.
  • the peptide has 2 to 20 amino acids. According to one specific example, the peptide has 2 to 18 amino acids, and in another specific example 2 to 15 amino acids. According to another embodiment of the present invention, the peptides are peptides having skin condition improving activity.
  • the peptide has a carboxyl group or acetamide at the C-terminus.
  • the peptide is selected from the group consisting of SEQ ID NO: 1 to 28.
  • Curcumin-peptide complexes of the present invention include the curcumin, peptides and linker compounds linking them.
  • the linker compound is a biodegradable linker compound.
  • the linker compound forms an ester bond with curcumin and may be hydrolyzed by esterase in the body.
  • the linker compound is glutarate.
  • the glutarate linker may be covalently bonded to the functional group of curcumin (eg, the 0H group) and the N-terminus of the peptide to form a curcumin-peptide complex.
  • the linker compound is bonded to curcumin and an ester bond, and the N-terminus of the peptide is bonded to a peptide bond.
  • the linker compound binds to the 0H group of curcumin by condensation reaction (ester bond), and also curcumin by conjugation reaction (peptide bond) to the N-terminus of the peptide.
  • -Peptide complex is formed. Examples of such curcumin-peptide complexes are shown in FIGS. 2 and 3 below.
  • the curcumin-peptide complex of the present invention is It simultaneously shows antioxidant and skin conditions improving activity.
  • the curcumin-peptide complexes of the present invention not only exhibit (i) increased solubility, but also (ii) a synergistic effect between curcumin and the peptide, leading to better antioxidant and skin conditions than the effect of curcumin and peptad alone. It can be active at the same time.
  • the skin condition improvement includes skin wrinkle improvement, skin elasticity improvement and skin aging prevention.
  • the curcumin-peptide complex does not exhibit cytotoxicity (see FIG. 8), exhibits strong antioxidant activity equivalent to vitamin C (see FIGS. 9 and 10), and inhibits lipid peroxidation in cells. Aging can be prevented (see FIG. 11), and collagen biosynthesis can be greatly promoted (see FIG. 12).
  • the cosmetic composition (skin external preparation) comprising the curcumin-peptide complex of the present invention is excellent in improving wrinkles.
  • One efficacy may be indicated (see Tables 10-13).
  • the present invention provides a method for improving the solubility of curcumin in water, comprising covalently binding a peptide consisting of 2 to 30 amino acids to curcumin through a linker compound.
  • the linker compound is glutarate.
  • the step of covalently attaching the linker compound to the 0H group of curcumin ester and the step of peptide-linking the linker compound at the N-terminus of the peptide; Or peptide linking the linker compound to the N-terminus of the peptide and ester linking the linker compound to the 0H group of curcumin.
  • the step of covalently comprises the following substeps:
  • step (b) reacting the linker compound with the peptide synthesized in step (a) to covalently link the linker compound to the N-terminus of the peptide; (c) reacting curcumin to the result of step (b) to form a curcumin-peptide complex in which the curcumin and the linker compound are covalently bound;
  • step (d) cleaving the curcumin-peptide complex formed in step (C) from the solid resin.
  • curcumin is not soluble in water, but is completely dissolved in water when the peptide is covalently linked to the curcumin through a linker compound (see FIGS. 4 to 7). Therefore, by covalently binding the peptide to the curcumin through the linker compound can improve the solubility of the curcumin in water, thereby increasing the utilization of curcumin as a medicine, cosmetics and food.
  • the present invention provides a method for preparing a curcumin-peptide complex comprising the following steps:
  • step (b) reacting the linker compound with the peptide synthesized in step (a) to covalently link the linker compound to the N-terminus of the peptide;
  • step (c) reacting curcumin to the result of step (b) to form a curcumin-peptide complex in which the curcumin and the linker compound are covalently bound;
  • step (d) cleaving the curcumin-peptide complex formed in step (c) from the solid resin.
  • the peculiarity of the production method of the present invention is to first synthesize a peptide to a solid resin, bind a linker compound thereto, and then bind curcumin to the linker compound.
  • a peptide is synthesized by sequential coupling of amino acids protected with a protecting group (eg, Fmoc) in a solid resin phase (eg, a resin in which an amide group is introduced).
  • a protecting group eg, Fmoc
  • a solid resin phase eg, a resin in which an amide group is introduced.
  • Such peptide synthesis reactions can use commonly known peptide synthesis methods (Synthetic Peptides: A User's Guide, GR Grant, ed., Freeman & Co., 1992, pp. 77-183).
  • Amino acid couplings include di isopropyl carbodi imide (DIC), hydroxybenzotriazole (HOBt), dimethylformamide (DMF), o-benzot ri azo 1 eN, N, ⁇ ', ⁇ '- tetramethyluronium hexa f 1 uor ophosphat e), and DIEA (N, N- And optionally used in coupling reagents such as diisopropylethylamine).
  • DIC isopropyl carbodi imide
  • HOBt hydroxybenzotriazole
  • DMF dimethylformamide
  • o-benzot ri azo 1 eN, N, ⁇ ', ⁇ '- tetramethyluronium hexa f 1 uor ophosphat e dimethylformamide
  • DIEA N, N- And optionally used in coupling reagents such as diisopropylethylamine
  • the substitution rate of the resin is 0.8-1.0 dl / g.
  • step (a) reacts 2-4 equivalents of Fmoc-amino acid in the presence of a coupling reagent, and the coupling time between each Fmoc-amino acid and Fmoc-amino acid is 2-5 hours. to be.
  • the temperature of the coupling can be 28-32 ° C.
  • step (b) of the present invention the linker compound is reacted with the compound of step (a) to covalently link the linker compound to the N-terminus of the peptide.
  • / glutaric anhydride can be used as a linker compound, and thus, in step (b), a compound in which glutarate is covalently bonded to the N-terminus of the peptide.
  • a compound in which glutarate is covalently bonded to the N-terminus of the peptide In one particular embodiment, 2-4 equivalents of linker compound may be used.
  • step (b) is DIEA ( ⁇ , ⁇
  • step (c) may be carried out in the same manner as in step (b), in which case reaction may be performed using DMAP (4-Di methyl ami nopyri dine).
  • step (d) of the present invention the curcumin-peptide complex formed is cleaved from the resin. Separation can be carried out using TFA / DCM, TFA / TIS / water, TFA / TIS / DCM or TFA / water.
  • the method of the present invention is subjected to chromatography (eg, high performance liquid chromatography) with the product of step (d) (crude curcumin-peptide complex) to separate and purify the curcumin peptide peptide. It further comprises the step.
  • chromatography eg, high performance liquid chromatography
  • step (d) crude curcumin-peptide complex
  • purification using the chromatography is shown in the following table.
  • the production method of the present 'invention is carried out under ultrasonication.
  • the present invention provides a cosmetic composition for improving antioxidant or skin conditions (cur condition) comprising the curcumin-peptide complex as an active ingredient.
  • the skin condition improvement is skin wrinkle improvement, skin elasticity improvement or skin aging prevention.
  • Ingredients included in the cosmetic composition of the present invention include components commonly used in cosmetic compositions in addition to the curcumin-peptide complex as an active ingredient, for example, conventional adjuvants such as antioxidants, stabilizers, solubilizers, vitamins, pigments and flavorings. And a carrier.
  • Cosmetic compositions of the present invention may be prepared in any formulation conventionally prepared in the art, for example, solutions, suspensions, emulsions, pastes, gels, creams, lotions, powder soaps, surfactant-containing cleansing , Oil, powder foundation, emulsion foundation, wax foundation and spray, etc. may be formulated, but is not limited thereto. More specifically, it may be prepared in the form of a lotion (astringent lotion, flexible lotion, etc.), cream, lotion, serum, essence, nutrition gel or massage cream.
  • a lotion astringent lotion, flexible lotion, etc.
  • cream lotion, serum, essence, nutrition gel or massage cream.
  • the carrier components include animal oil, vegetable oil, wax, paraffin, starch, tracant, cellulose derivative, polyethylene glycol, silicone, bentonite, silica, talc or zinc oxide. Can be used.
  • lactose, talc, silica, aluminum hydroxide, chamo silicate or polyamide powder may be used, in particular, in the case of a spray, additionally chlorofluorohydrocarbon, propane Propellant such as butane or dimethyl ether.
  • a solvent, solubilizer or emulsifier is used as the carrier component, for example water, ethanol Isopropanol, ethyl carbonate, ethyl acetate, benzyl alcohol, benzyl benzoate, propylene glycol, 1,3-butylglycol oil, glycerol aliphatic esters, polyethylene glycols or fatty acid esters of sorbitan.
  • suspensions such as water, liquefied ethoxylated isostearyl alcohol polyoxyethylene sorbitol esters and polyoxyethylene sorbitan esters, such as water, ethanol or propylene glycol, as a carrier component St. salulose, aluminum meta hydroxide, bentonite, agar or tracant may be used.
  • the formulation of the present invention is a surfactant-containing cleansing agent
  • Ether sulfates, alkylamidobetaines, fatty alcohols, fatty acid glycerides, fatty acid diethanolamides, vegetable oils, lanolin derivatives or ethoxylated glycerol fatty acid esters and the like can be used.
  • the present invention provides a health functional food comprising the curcumin-peptide complex.
  • the health functional food is not particularly limited thereto, but may be any type of food, such as health functional food, nutritional supplements, nutritional supplements, pharmafood, health supplements, nutraceutical, designer food food additives, and the like.
  • food such as health functional food, nutritional supplements, nutritional supplements, pharmafood, health supplements, nutraceutical, designer food food additives, and the like.
  • the health functional food of the present invention includes ingredients that are commonly added in food production, and include, for example, proteins, carbohydrates, fats, nutrients, seasonings and flavoring agents.
  • carbohydrates include monosaccharides such as glucose, fructose, and the like; Disaccharides such as maltose, sucrose, oligosaccharides and the like; And sugars such as conventional sugars such as polysaccharides, eg, textine, cyclodextrin, and xyl, sorbitol, and erytri.
  • the flavoring agent natural flavoring agents [tautin, stevia extract (for example, rebaudioside A, glycyrrhizin, etc.) and synthetic flavoring agents (saccharin, aspartame, etc.) can be used.
  • the food of the present invention includes various nutrients, vitamins, minerals (electrolytes), dietary ingredients, flavors such as synthetic flavors and natural flavors, coloring and neutralizing agents (such as cheese, chocolate), pectic acid and salts thereof. , Alginic acid and salts thereof, organic acids, protective colloidal thickeners, pH adjusters, stabilizers, preservatives, glycerin, alcohols, carbonation agents used in carbonated drinks and the like. ⁇ Effects of the Invention ⁇
  • the present invention provides a curcumin-peptide complex in which a curcumin, a natural resource material with excellent functional effects and a curcumin-peptide complex, is combined with a linker compound, and the curcumin-peptide complex is completely in water. Dissolves.
  • the present invention can contribute to enhancing the utilization of curcumin as a medicine, cosmetic and food by providing a method for improving the solubility of curcumin in water.
  • the present invention relates to a fusion material capable of maximizing the advantages of two functional materials and overcoming the disadvantages as a skin multi function improving material having antioxidant and skin condition improving efficacy.
  • Figure 1 shows the chromatographic results of the curcumin-nucleopeptide complex produced through the purification process of the present invention.
  • FIG. 2 shows a schematic synthesis process of curcumin-azirelin complex.
  • Figure 3 is a schematic synthesis process of the curcumin-copper peptide complex
  • Figure 8 shows the skin cell safety test results of curcumin-peptide complex. Safety in skin cells was tested by the MTT assay, and the concentrations were diluted 2-fold at up to 100 LiM and treated down to 6.25 ⁇ . A: keratinocytes, ⁇ : fibroblasts.
  • Figure 11 shows the lipid peroxidation inhibitory activity of the curcumin-peptide complex
  • Figure 12 shows the collagen biosynthesis promoting effect of the curcumin-peptide complex.
  • Raw materials such as OH were purchased from GLS, curcumin was purchased from TCI, glutarate was purchased from Sigma, and general raw materials (DMF, DIEA, NMP, DCM) were purchased from large purified gold.
  • the reaction time was 4 hours or more, and the synthesis temperature was 30 ° C.
  • SPPS Solid Phase Peptide Synthesis
  • Fmoc was performed twice for 10 minutes using 20% piperidine, and washed twice for 6 minutes using DMF.
  • Fmoc-Xl- ⁇ for peptide synthesis in the resin was completely dissolved in DMF and then added to the resin.
  • the coupling reagent was added according to the equivalent of amino acid. Thereafter, synthesis was performed for 4 hours or more using an ultrasonic synthesizer.
  • the obtained peptide was purified by HPLC under gradient conditions of the following conditions and then lyophilized to obtain the desired peptide.
  • curcumin alone was not dissolved in water, but the curcumin-azitelin complex was well dissolved in water.
  • curcumin-Ghitarate-GHK—Cu solubility of the curcumin-copper peptide complex
  • various solvents were prepared as described in Table 4, and the prepared solvent was added to 1 mg of test substance and the degree of dissolution was observed.
  • the curcumin-copper peptide complex was not dissolved in DMS0 and acetonitrile, but was completely dissolved in tertiary distilled water.
  • keratinocytes and fibroblasts were tested.
  • human keratinocyte cell lines HaCaT cells and fibroblast CCD-986sk were counted in a 24-well plate using 5 x 10 3 cells / well and 5 X 10 4 cells / well in the same manner using a hemocytometer and then divided. After culturing for 48 hours in DMEM containing 10% FBS and incubated by 503 ⁇ 4 of the surface of the culture vessel, the culture was further incubated for 24 hours in a medium containing the curcumin-azitelin complex at an appropriate concentration.
  • DMSO Dimethyl sulfoxide
  • EL ISA Enzyme-Linked I ⁇ unosorbent Assay
  • the curcumin-azitelin complex was not cytotoxic up to a treatment concentration of 100 ⁇ .
  • fibroblasts showed about 20% more cell proliferation in the curcumin-azitelin complex 50 ⁇ compared to the control group.
  • Reactive ive oxygen species also called toxic oxygen species, are toxic substances produced by cells by physiological actions such as hopps, which are produced and extinguished persistently and under normal conditions 3-53 ⁇ 4> It is present.
  • These free radicals are chemically paired with free radicals, such as superoxide radicals (0 2 " ) and hydroxy 1 radicals (H0 + ).
  • Free radicals have the advantage of biological defenses to sterilize bacteria in the physiological system, but in general, they cause oxidation in vivo to cause harmful effects that cause diseases.
  • This test method uses DPPH (l, l-Diphenyl-2-picryhydrazyl,
  • Sigma D9132-1G test the scavenging ability of free radicals generated by Sigma D9132-1G).
  • the compound DPPH generates free radicals in ethane. In total, the amount of free radicals was confirmed to decrease.
  • the ethane was added 0.4 to 0.1 niM of DPPH solution 0.5, and 0.1 m. £ of the diluted extract to a certain concentration, vigorously vortexed for 10 seconds, and reacted for 30 minutes in a cool dark place. The absorbance was measured at 517 nm by ELISA, and the degree of antioxidant activity was expressed as a percentage based on the hop light intensity of the control group (negative control group) using ethanol.
  • Lipid peroxidation is well known as a mechanism for causing cell damage in rats and plants. Therefore, to test this lipid peroxidation
  • Lipid peroxidation is an indicator of oxidative stress in cells, forming and breaking down more complex and highly reactive substances such as MDA and 4-HNE (4 ⁇ hydorxynonenal), two natural products of lipid peroxidation.
  • the TBA S kit is a technique for directly measuring MDA (Malondi aldehyde).
  • MDA Methydi aldehyde
  • an appropriate concentration of curcumin-azirelin complex was treated to a human keratinocyte cell line, and the culture medium was obtained.
  • the test method was as follows. 100 samples and MDA standard were dispensed into the E-tubing and 100 ⁇ L of SDS lysis solution was added.
  • Intracellular lipid peroxidation is a direct cause of cell damage.
  • inhibiting intracellular lipid peroxidation means reducing cellular damage and protecting against aging and disease.
  • Experimental results for lipid peroxidation of the curcumin-azitellin complex it was confirmed that the curcumin-azitellin reduced lipid peroxidation by more than about 20% compared to the control group (Fig. 11).
  • the various collagen secreted by the fibroblasts that make up human skin are closely related to the aging process and wrinkle formation.
  • the anti-wrinkle activity of the test substance can be verified by the degree of collagen synthesis using fibroblasts.
  • Procollagen type I C-peptide EIA Kit (Curcumin-peptide complex) was treated with 25 ⁇ in culture of human fibroblasts (CCD986-SK). Precoated, Takara Biomedical Co) was used.
  • retinol certified by Korea Food and Drug Administration (KFDA) for wrinkle improvement was evaluated for the effect of promoting collagen biosynthesis more than 30% over retinol.
  • ingredients 1, 11, 13 and 16 in Table 7 were mixed and heated at 80-85 ° C., and then emulsified in 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 and 12 were dissolved by heating and dissolving at 80-85 ° C, and then emulsified. After emulsification, the mixture was cooled to 50 ° C with stirring using a stirrer and 15 times, and then cooled to 45 ° C. After the 14 times added, 1 at 35 ° C. was cooled to 25 ° C. and aged.
  • the ingredients 12, 13, 14 and 16 in Table 8 were mixed and heated at 80-85 ° C., and then emulsified and then emulsified, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, and 11 were heated and dissolved at 80-85 ° C., and 15 times were added and stirred. After the emulsification, while stirring using a stirrer while stirring up to 35 ° C., 1 time was added and stirred up to 25 ° C. and aged.
  • components 2, 3, 4, 5 and 6 in Table 9 were homogenized at a constant temperature to obtain a nonionic amphiphilic lipid.
  • 1, 7, 8, and 14 are mixed with the non-eunic amphiphilic lipid, homogenized at a constant temperature, and passed through a microfluidizer, followed by the addition of 9 at a constant temperature, homogenized, and then again a microflu. Passed it through again. Then, 10, 11, 12 and 13 were added and dispersed to stabilize and mature.

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Abstract

본 발명은 커큐민에 비하여 물에 대한 용해도가 향상된 커큐민-펩타이드 복합체, 커큐민의 물에 대한 용해도를 향상시키는 방법, 상기 복합체의 제조방법, 및 상기 복합체를 포함하는 화장료 조성물 및 건강기능식품에 관한 것이다. 본 발명은 생체친화성과 안전성이 입증된 펩타이드 소재와 기능성 효과가 매우 우수한 천연자원 소재인 커큐민이 링커 화합물을 통하여 결합된 커큐민-펩타이드 복합체를 제공하며, 상기 커큐민-펩타이드 복합체는 물에 완전히 용해된다. 본 발명은 커큐민의 물에 대한 용해도를 향상시키는 방법을 제공함으로써 커큐민의 의약품, 화장품 및 식품으로서의 활용도를 높이는데 기여할 수 있다.

Description

【명세서】
【발명의 명칭】
커큐민 대비 용해도와 기능을 향상시킨 커큐민ᅳ펩타이드의 설계 및 이의 제조방법
【기술 분야】
본 발명은 커큐민에 비하여 물에 대한 용해도가 향상된 커큐민- 펩타이드 복합체， 커큐민의 물에 대한 용해도를 향상시키는 방법， 상기 복합체의 제조방법, 및 상기 복합체를 포함하는 화장료 조성물 및 건강기능식품에 관한 것이다.
【배경 기술】
커큐민 (curcumin)은 울금 (전라남도 진도군의 대표작물)의 주요 약효 성분으로서 카레, 겨자 등에 포함된 천연 색소이며, 고대로부터 향신료나 염증, 피부질환 등의 민간 치료제로 사용되어 왔다. 커큐민은 강력한 항산화 기능이 있으며, 구 S적으로 페놀계의 항산화제에 속하는데 최근 항암 효과가 밝혀지면서 과학계의 관심이 집증되고 있다 . 그러나， 커큐민은 우수한 생물학적 활성에도 불구하고, 물에 용해되지 않아 생체 흡수율과 생물학적 이용도 (bioavailability)가 극히 저조하여 의약품， 화장품 및 식품으로의 개발이 용이하지 않으며, 이를 극복하기 위하여 다양한 유도체의 개발을 통한 바이오 활성소재 개발이 활발히 진행 증이다. 펩타이드 (Peptide)는 아미노산으로 구성된 단백질의 기능적 최소 단위로서 생명 신호전달 및 생체 기능 조절에 관여하는 차세대 인체 친화성 생물소재이다.
주로 화학합성법으로 생산되어 생명과학 연구 및 의약품， 기능성 화장품 /식품 & 의료용 소재로 제품화 되어 광범위하게 사용되고 있는 생물소재이다.
펩타이드는 주로 의약품에서 활용되어 왔으나, 지난 2002년 '세계 피부 과학회 학술대회1에서 그동안 사용되어 오던 비타민 C보다 생리활성 효과가 뛰어나다는 논문들이 발표되면서 세계적으로 주목받기 시작하였다. 그러나, 펩타이드는 우수한 기능성 화장품 소재임에도 불구하고 원료 자체가 다른 화장품 원료와 달리 고가이므로 적정 유효농도 이하로 처방됨으로 인해 즉각적인 효능을 볼 수 없어 시장 확대가 제한받고 있는 실정이다.
본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.
【발명의 내용】
【해결하려는 과제】 "
이러한 배경 하에서， 본 발명자들은 우수한 생물학적 활성을 갖는 커큐민의 의약품, 화장품 및 식품으로서의 활용도를 높이기 위하여 커큐민의 용해도를 개선하기 위한 연구를 수행하였다. 나아가， 본 발명자들은 펩타이드는 생체친화성과 안전성이 입증된 소재이몌 커큐민은 기능성 효과가 매우 우수한 천연자원 소재이므로 펩타이드-커큐민 복합체를 이용한 제품화는， 두 기능성 소재가 가진 장점을 극대화하고一단점—을ᅳ상호 극복할 수 있는 융합소재로서 가치가 있는 것으로 판단하였다. 또한, 펩타이드-커큐민 복합체의 대량생산에 의한 원가쟐감을 통해 제품단가를 낮추면， 시장 확대 및 신규 시장 창출이 가능할 것으로 판단하였다.
이에, 본 발명자들은 울금 (Curcuma longa)에 주로 존재하는 천연 항산화 성분인 커큐민과 피부 상태 개선에 효과가 있는 기능성 펩타이드를 융합한 커큐민-펩타이드 융합 신소재를 개발하였으며， 제조한 커큐민- 펩타이드 복합체가 물에 완전히 용해됨을 확인하였고， 상기 커큐민- 펩타이드 복합체의 대량생산을 위한 제조 프로토콜을 최적화함으로써， 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서, 본 발명의 목적은 커큐민에 비하여 물에 '대한 용해도가 향상된 커큐민-펩타이드 복합체를 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 커큐민의 물에 대한 용해도를 향상시키는 방법을 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 커큐민-펩타이드 복합체의 제조방법을 제공하는 데 있다. 본 발명의 또 다른 목적은 상기 커큐민-펩타이드 복합체를 포함하는 항산화 또는 피부상태 개선용 화장료 조성물을 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 커큐민-펩타이드 복합체를 포함하는 건강기능식품을 제공하는 데 있다. 본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명， 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.
【과제의 해결 수단】
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 (i) 커큐민; 및 (ii) 상기 커큐민과 링커 화합물을 통하여 결합된 2 내지 30개의 아미노산으로 이루어진 펩타이드를 포함하고, 물에 용해되는 것을 특징으로 하는， 커큐민에 비하여 물에 대한 용해도가' 향상된 커큐민-펩타이드 복합체를 제공한다. 본 발명자들은 우수한 생물학적 활성을 갖는 커큐민의 의약품， 화장품 및 식품으로서의 활용도를 높이기 위하여 커큐민의 용해도를 개선하기 위한 연구를 수행하였다. 나아가， 본 발명자들은 펩타이드는 생체친화성과 안전성이 입증된 소재이며， 커큐민은 기능성 효과가 매우 우수한 천연자원 소재이므로 템타이드-커큐민 복합체를 이용한 제품화는, 두 기능성 소재가 가진 장점을 극대화하고 단점을 상호 극복할 수 있는 융합소재로서 가치가 있는 것으로 판단하였다. 또한, 펩타이드-커큐민 복합체의 대량생산에 의한 원가절감을 통해 제품단가를 낮추면， 시장 확대 및 신규 시장 창출이 가능할 것으로 판단하였다. 이에， 본 발명자들은 울금 (Curcuma longa)에 주로 존재하는 천연 항산화 성분인 커큐민과 피부 상태 개선에 효과가 있는 기능성 펩타이드를 융합한 커큐민-펩타이드 융합 신소재를 개발하였으며, 제조한 커큐민-펩타이드 복합체가 물에 완전히 용해됨을 확인하였고， 상기 커큐민-펩타이드 복합체의 대량생산을 위한 제조 프로토콜을 최적화하였다.
본 명세서에서 용어, "커큐민 [(l Z-bis- -hydroxy-S- methoxyphenyn-l, 6-heptadiene— 3,5-dione)]"은 을금의 구근에 포함되어 있는 심황 (turmeric)의 주색소 성분올 의미한다. 커큐민은. 다양한 원천으로부터 얻을 수 있으며, 예를 들면 화학적으로 합성될 수 있고， 식물로부터 분리될 수도 있다. 본 발명의 목적상 상기 커큐민에는 커큐민과 실질적으로 동일한 활성 (예컨대， 항산화능)을 나타내는 한 이의 유도체도 포함된다.
본 발명의 일구현예에 따르면， 상기 펩타이드는 2 내지 20개의 아미노산을 갖는다. 일특정예에 따르면, 상기 펩타이드는 2 내지 18개의 아미노산을 가지며， 다른 특정예에서는 2 내지 15개의 아미노산을 갖는다. 본 발명의 다른 구현예에 따르면, 상기 펩타이드들은 피부상태 (skin conditions) 개선 활성을 갖는 펩타이드들이다.
본 발명의 또 다른 구현예에 따르면， 상기 펩타이드는 C-말단에 카복실기 또는 아세트아마이드를 갖는다. 일특정예에 따르면, 상기 펩타이드는 서열목록 제 1서열 내지 제 28서열로 구성된 군으로부터 선택된다. 본 발명의 커큐민-펩타이드 복합체는 상기의 커큐민， 펩타이드 및 이들올 연결하는 링커 화합물을 포함한다.
본 발명의 일구현예에 따르면, 상기 링커 화합물은 생분해성 링커 화합물이다. 일특정예에 따르면, 상기 링커 화합물은 커큐민과 에스터 (ester) 결합을 형성하며, 체내의 에스터라제 (esterase)에 의해 가수분해 될 수 있다.
본 발명의 일구현예에 따르면, 상기 링커 화합물은 글루타레이트 (glutarate)이다. 상기 글루타레이트 링커는 커큐민의 작용기 (예컨대， 0H 그룹) 및 펩타이드의 N-말단과 각각 공유결합 하여 커큐민-펩타이드 복합체를 형성할 수 있다.
본 발명의 일구현예에 따르면， 상기 링커 화합물은 커큐민과 에스터 결합으로 결합되고, 펩타이드의 N-말단과는 펩타이드 결합으로- 결합된다. 예를 들면, 상기 링커 화합물로서 글루타레이트를 이용하는 경우, 링커 화합물은 커큐민의 0H 그룹과 축합반웅 (에스터 결합)으로 결합하고， 펩타이드의 N-말단과도 축합반웅으로 결합 (펩타이드 결합)함으로써 커큐민- 펩타이드 복합체가 형성된다. 상기 커큐민-펩타이드 복합체의 예가 하기 도 2 및 3에 도시되어 있다.
본 발명의 일구현예에 따르면， 본 발명의 커큐민-펩타이드 복합체는 항산화 및 피부상태 (skin conditions) 개선 활성을 동시에 나타낸다. 특히, 본 발명의 커큐민-펩타이드 복합체는 (i) 용해도 증가 특성뿐만 아니라， (ii) 커큐민과 펩타이드 사이의 상승적 (synergistic) 효과로 인하여 커큐민과 펩타아드 단독이 나타내는 효과보다 더 우수한 항산화 및 피부상태 개선 활성을 동시에 나타낼 수 있다.
상기 피부상태 개선은 피부 주름 개선， 피부 탄력 개선 및 피부 노화 방지를 포함한다. 하기 실시예에서 확인한 바와 같이 , 커큐민-펩타이드 복합체는 세포 독성을 나타내지 않으며 (도 8 참조), 비타민 C와 동등한 정도의 강력한 항산화 활성을 나타내고 (도 9 및 10 참조)， 세포 내 지질과산화를 저해하여 노화를 방지할 수 있으며 (도 11 참조), 콜라겐 생합성을 매우 촉진시킬 수 있다 (도 12 참조), 특히, 본 발명의 커큐민- 펩타이드 복합체를 포함하는 화장료 조성물 (피부 외용제)은 주름 개선에 있어 월등한 효능올 나타낼 수 있다 (표 10내지 13 참조). 본 발명의 다른 양태에 따르면， 본 발명은 링커 화합물을 통하여 커큐민에 2 내지 30개의 아미노산으로 이루어진 펩타이드를 공유결합 시키는 단계를 포함하는 커큐민의 물에 대한 용해도를 향상시키는 방법을 제공한다.
본 발명의 일구현예에 따르면， 상기 링커 화합물은 글루타레이드 (glutarate)이다.
본 발명의 일구현예에 따르면， 상기 공유결합 시키는 단계는 커큐민의 0H기에 링커 화합물을 에스터 결합시키고， 펩타이드의 N-말단에 링커 화합물을 펩타이드 결합시키는 단계이거나; 또는 펩타이드의 N-말단에 링커 화합물을 펩타이드 결합시키고, 커큐민의 0H기에 링커 화합물을 에스터 결합시키는 단계이다.
본 발명의 일구현예에 따르면， 상기 공유결합 시키는 단계는 하기의 소단계를 포함한다:
(a) 고체상 합성법으로 고체수지 상에서 2 내지 30개의 아미노산으로 이루어진 펩타이드를 합성하는 단계 ;
(b) 단계 (a)에서 합성된 펩타이드에 링커 화합물을 반웅시켜 펩타이드의 N-말단에 링커 화합물을 공유결합 시키는 단계; (c) 단계 (b)의 결과물에 커큐민을 반웅시켜 커큐민과 링커 화합물이 공유결합 된 커큐민-펩타이드 복합체를 형성시키는 단계; 및
(d) 단계 (C)에서 형성된 커큐민-펩타이드 복합체를 상기 고체수지로부터 분리 (cleavage)하는 단계.
하기 실시예에 나타난 바와 같이, 커큐민은 물에 용해되지 않으나, 커큐민에 링커 화합물을 통하여 펩타이드를 공유결합 시키는 경우에는 물에 완전히 용해된다 (도 4 내지 7 참조). 따라서, 커큐민에 링커 화합물을 통하여 펩타이드를 공유결합 시키는 것으로 커큐민의 물에 대한 용해도를 향상시킬 수 있으며, 이로 인하여 커큐민의 의약품, 화장품 및 식품으로서의 활용도를 높일 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면， 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 커큐민-펩타이드 복합체의 제조방법을 제공한다:
(a) 고체상 합성법으로 고체수지 상에서 2 내지 30개의 아미노산으로 이루어진 펩타이드를 합성하는 단계 ;
(b) 단계 (a)에서 합성된 펩타이드에 링커 화합물을 반웅시켜 펩타이드의 N-말단에 링커 화합물을 공유결합 시키는 단계;
(c) 단계 (b)의 결과물에 커큐민을 반웅시켜 커큐민과 링커 화합물이 공유결합 된 커큐민-펩타이드 복합체를 형성시키는 단계; 및
(d) 단계 (c)에서 형성된 커큐민-펩타이드 복합체를 상기 고체수지로부터 분리 (cleavage)하는 단계.
본 발명의 제조방법의 특징은, 고체상 수지에 펩타이드를 먼저 합성하고， 여기에 링커 화합물을 결합시킨 다음 커큐민을 링커 화합물에 결합시키는 것이다.
본 발명의 단계 (a)에서는 고체수지상 (예컨대, 아마이드기가 도입된 수지)에서 보호기 (예컨대, Fmoc)로 보호된 아미노산들을 순착적으로 커플링 하여 펩타이드를 합성한다. 이러한 펩타이드 합성 반웅들은 일반적으로 알려진 펩타이드 합성법을 이용할 수 있다 (Synthetic Peptides: A User's Guide, G.R. Grant, ed. , Freeman & Co., 1992, pp.77- 183). 아미노산의 커플링은 DIC(di isopropyl carbodi imide) , HOBt(Hydroxybenzotriazole) , DMF(dimethylformamide), HBTU(o-benzot r i azo 1 e-N , N , Ν',Ν'- tetramethyluronium hexa f 1 uor ophosphat e ) 및 DIEA(N,N- Diisopropylethylamine) 등의 커플링 시약 증에서 선택적으로 사용하여 실시할 수 있다.
본 발명의 일구현예에 따르면， 상기 수지의 치환율은 0.8-1.0 麵 ole/g이다.
본 발명의 일구현예에 따르면， 단계 (a)는 2—4 당량의 Fmoc- 아미노산을 커플링 시약의 존재 하에서 반웅시키며， 각 Fmoc-아미노산과 Fmoc-아미노산 사이의 커플링 시간은 2-5 시간이다. 커플링의 온도는 28- 32°C일 수 있다.
본 발명의 단계 (b)에서는 단계 (a)의 합성물에 링커 화합물을 반웅시켜 펩타이드의 N-말단에 링커 화합물을 공유결합시킨다.
본 발명의 일구현예에 따르면 /링커 화합물로는 글루타릭 무수물을 사용할 수 있으며， 이에 따라 단계 (b)에서는 상기 펩타이드의 N-말단에 글루타레이트가 공유결합된 화합물이 형성된다. 일특정예에서는 링커 화합물을 2-4 당량 사용할 수 있다.
본 발명의 일구현예에 따르면, 단계 (b)의 반웅은 DIEA (Ν,Ν-
Diisopropylethylamine)의 존재 하에서 실시한다. 반웅 시간은 1- 3시간이 적당하며, 반웅온도는 32— 37°C가 적당하다.
본 발명의 단계 (c)에서는 핵사펩타이드와 링커 화합물의 결합물에 커큐민을 반응시켜 커큐민과 ' 링커 화합물이 공유결합 된 커큐민- 핵사펩타이드 복합체를 형성시킨다.
단계 (c)의 반웅은 단계 (b)와 동일하게 실시할 수 있으며， 이때 DMAP(4-Di methyl ami nopyri dine)를 사용하여 반웅을 실시할 수 있다.
본 발명의 단계 (d)에서는 형성된 커큐민-펩타이드 복합체를 수지로부터 분리 (cleavage)한다. 분리는 TFA/DCM, TFA/TIS/물, TFA/TIS/DCM또는 TFA/물을 사용하여 실시할 수 있다.
본 발명의 일구현예에 따르면, 본 발명의 방법은 상기 단계 (d)의 결과물 (조 커큐민-펩타이드 복합체)을 가지고 크로마토그래피 (예컨대, 고성능액체크로마토그래피)를 실시하여 커큐민ᅳ펩타이드 복합체를 분리 정제하는 단계를 더 포함한다.
일특정예에 따르면, 상기 크로마토그래피를 이용한 정제는 하기 표
2에 기재된 각 수치에 土 2(또는 士 1)를 한 수치범위의 조건으로 실시할 수 있다.
본 발명의 일구현예에 따르면 , 본 '발명의 제조방법은 초음파 처리 하에서 실시된다 . 본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 커큐민-펩타이드 복합체를 유효성분으로 포함하는 항산화 또는 피부상태 (skin conditions) 개선용 화장료 조성물을 제공한다.
본 발명의 일구현예에 따르면, 상기 피부상태 개선은 피부 주름 개선， 피부 탄력 개선 또는 피부 노화 방지이다.
본 발명의 화장료 조성물에 포함되는 성분은 유효성분으로서의 커큐민-펩타이드 복합체 이외에 화장품 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들을 포함하며, 예컨대 항산화제， 안정화제, 용해화제, 비타민， 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제， 그리고 담체를 포함한다.
본 발명의 화장료 조성물은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며， 예를 들어， 용액, 현탁액, 유탁액， 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우데 비누, 계면활성제 -함유 클린싱， 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 및 스프레이 등으로 제형화 될 수 있으나， 이에 한정되는 것은 아니다. 보다 상세하게는, 화장수 (수렴 화장수， 유연 화장수 등)， 크림， 로션， 세럼， 에센스， 영양젤 또는 마사지 크림의 제형으로 제조될 수 있다.
본 발명의 제형이 페이스트， 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물성유， 식물성유, 왁스， 파라핀， 전분， 트라칸트, 셀를로오스 유도체， 폴리에틸렌 글리콜， 실리콘， 벤토나이트, 실리카， 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다.
본 발명의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스， 탈크， 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슴 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고， 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판 /부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.
본 발명의 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는 담체 성분으로서 용매， 용해화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물， 에탄올 이소프로판올， 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올， 벤질 벤조에이트， 프로필렌글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일， 글리세를 지방족 에스테르， 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 있다. 본 발명의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌글리콜과 같은 액상의 회석제 에톡실화 이소스테아릴 알코올 폴리옥시에틸렌 소르비틀 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제， 미소결정성 샐를로오스， 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있다ᅳ
본 발명의 제형이 계면-활성제 함유 클린징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코을 설페이트， 지방족 알코올 에테르 설페이트, 설포숙신산 모노에스테르 , 이세티오네이트 , 이미다졸리늄 유도체 , 메틸타우레이트， 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인， 지방족 알코올, 지방산 글리세리드， 지방산 디에탄올아미드， 식물성 유, 라놀린 유도체 또는 에록실화 글리세를 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다. 본 발명의 또 다른 양태에 따르면， 본 발명은 상기 커큐민-펩타이드 복합체를 포함하는 건강기능식품올 제공한다.
상기 건강기능식품은 특별히 이에 제한되지 않으나， 건강 기능성 식품, 영양 보조제, 영양제， 파머푸드 (pharmafood), 건강보조식품, 뉴트라슈티칼 (nutraceutical), 디자이너 푸드 식품 첨가제 등의 모든 형태의 식품이 될 수 있는데, 바람직하게는 육류， 소세지, 빵， 쵸코렛, 캔디류， 스넥류, 과자류， 피자， 라면， 기타 면류， 껌류， 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차， 드링크제， 알콜 음료 및 비타민 복합제 등이 될 수 있다.
본 발명의 건강기능식품은 식품제조 시에 통상적으로 첨가되는 성분을 포함하며, 예를 들어， 단백질, 탄수화물, 지방, 영양소， 조미제 및 향미제를 포함한다. 상술한 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당， 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토 스， 슈크로스, 올리고당 등; 및 폴리사카라이드， 예를 들어 텍스트린， 사이클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당 및 자일리를， 소르비를， 에리트리를 등의 당알콜이다. 향미제로서 천연 향미제 [타우마틴， 스테비아 추출물 (예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등]) 및 합성 향미제 (사카린， 아스파르탐 등)를 사용할 수 있다. 상기 외에 본 발명의 식품은 여러 가지 영양제， 비타민류, 광물 (전해질), 식이성분, 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제， 착색제 및 중진제 (치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제， 안정화제， 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 【발명의 효과】
본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:
(i) 본 발명은 생체친화성과 안전성이 입증된 펩타이드 소재와 기능성 효과가 매우 우수한 천연자원 소재인 커큐민이 링커 화합물을 통하여 결합된 커큐민-펩타이드 복합체를 제공하며， 상기 커큐민-펩타이드 복합체는 물에 완전히 용해된다.
(ii) 본 발명은 커큐민의 물에 대한 용해도를 향상시키는 방법을 제공함으로써 커큐민의 의약품， 화장품 및 식품으로서의 활용도를 높이는데 기여할 수 있다.
(iii) 본 발명은 항산화 및 피부상태 개선 효능을 지닌 피부 멀티 기능 개선 소재로서, 두 기능성 소재가 가진 장점을 극대화하고, 단점을 상호 극복할 수 있는 융합소재에 관한 것이다.
(iv) 본 발명은 커큐민 -펩타이드의 분리 정제방법을 통해 상업적 대량 생산이 가능하다. 【도면의 간단한 설명】
도 1은 본 발명의 정제공정을 통하여 생산된 커큐민-핵사펩타이드 복 합체의 크로마토그래피 결과를 보여준다.
도 2는 커큐민-아지렐린 복합체의 개략적인 합성과정을 보여준다. 도 3은 커큐민 -구리 펩타이드 복합체의 개략적인 합성과정을
보여준다.
도 4는 커큐민이 물에 용해되지 않음을 보여준다. 도 5는 커큐민-아지렐린 복합체가 물에 완전히 용해되었음을
보여준다.
도 6은 커큐민 -구리 펩타이드 복합체가 물에 완전히 용해되었음을 보여준다.
도 7은 다양한 커큐민-펩타이드 복합체가 물에 완전히 용해되었음을 보여준다.
도 8은 커큐민 -펩타이드 복합체의 피부세포 안전성 시험결과를 보여준다. 피부세포에서의 안전성을 MTT 시험법으로 시험하였으며， 농도는 최고 100 LiM에서 2배씩 희석하여 최저 6.25 μΜ까지 처리하였다. Α: 각질형성세포, Β: 섬유아세포.
도 9는 비타민과 커큐민의 항산화 효과를 보여준다. Α: 비타민， Β: 커큐민.
도 10은 커큐민-펩타이드 복합체의 항산화 효과를 보여준다.
도 11은 커큐민-펩타이드 복합체의 지질과산화 저해 활성을 보여준다/ 도 12는 커큐민-펩타이드 복합체의 콜라겐 생합성 촉진 효과를 보여준다.
【발명을 실시하기 위한 구체적인 내용】
이하， 실시예를 통하여 본 발명올 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서， 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다. 본 명세서 전체에 걸쳐ᅳ 특정 물질의 농도를 나타내기 이하여 사용되는 "V는 별도의 언급이 없는 경우, 고체 /고체는 (중량 /중량) %， 고체 /액체는 (중량 /부피) %, 액체 /액체는 (부피 /부피) ¾이다. 실시예
제조예. 초음파 합성기를 이용한 커큐민-펩타이드 복합체 제조
사용원료
Fmoc-Glu(tbu)-OH, Fmoc-Met-OH, Fmoc-Gln(Trt)-0H, Fmoc-Arg(Pbf )- OH등의 원료는 GLS로부터 구매하였고 커큐민은 TCI에서 구매하였으몌 글 루타레이트는 Sigma에서 구입하였으며, 일반 원료 (DMF, DIEA, NMP, DCM)는 대정화금으로부터 구매하여 사용하였다. Fmoc 탈보호
Fmoc의 탈보호는 20%피페리딘 /DMF을 사용하였으며, 세척은
DCM(Dichloromethane), DMFCdimethyl formamide) 등을 사용하여 5분씩 수행하였다. 아미노산 결합
커플링 시약 (coupling reagent)으로 HOBt /DIC(Hydroxybenzot r i azo 1 e/ diisopropylcarbocUimide)를 사용하여 서열목톡 제 1서열의 아미노산 서열로 아미노산들을 순서대로 고체상 합성법에 의하여 순서대로 결합하였다.
반웅시간은 4시간 이상, 합성 온도는 30°C로 하였다. 분리 (Cieavage)
반웅완료 후 전체 분리는 70% TFA/DCM 용액을 사용하여 2 시간 동안 분리하고, 에테르 중에서 추출하고 건조하여 비-정제된 펩타이드를 얻었다. 커큐민-펩타이드 복합체 합성
N-말단의 특성에 따른 레진 (아마이드 레진 등)을 선별한 후 합성 스케일에 따라 초음파 합성기 (Sonicator, 애니젠 제작)를 선택하여
반웅기에 넣고, 0.5-1시간 동안 DMF 용매에서 레진을 스웰링하였다.
펩타이드는 SPPS(Solid Phase Peptide Synthesis)를 이용하였다.
구체적으로， 스웰링 한 후 Fmoc을 20%피페리딘을 이용하여 10분간 2회 실시하고， DMF를 아용하여 2분간 6회에 걸쳐 깨끗하게 세척하였다. 상기 레진에 펩타이드 합성용 Fmoc-Xl-ΟΗ를 DMF에 완벽히 녹인 다음 레진에 넣어주었다. 커플링 시약올 아미노산의 당량에 따라 넣어주었다. 이후， 초음파 합성기 이용하여 4시간 이상 합성을 실시하였다.
반웅이 종료되면 용매를 벤트 (Vent)시킨 후 깨끗한 DMF로 2분씩
6회에 걸쳐 세척하였다. 이후， 상기의 방법과 같은 방법으로 Fmoc-X2-0H, Fmoc-X3-0H, Fmoc-X4-0H ᅳ.. 등의 아미노산으로 커플링을 실시하였다. 세척 후， 합성한 레진 상태에서 글루타릭 무수물 (Glutaric anhydride)을 3당량， DIEA를 사용하여 자체 제작한 대용량 초음파 합성기로 2시간 실시하였으며， 온도는 35°C를 유지하며 반웅시켰다. 이후， 커큐민을 위와 같은 방법으로 3당량， DMAP를 사용하여 위의 물질에 합성을 실시하였다. 합성 완료 후 TFA/DCM 용액을 이용하여 2시간 동안 분리를 실시한 후 얻은 조 (Crude) 제품을 HPLC를 이용하여 정제한 후 커큐민-펩타이드 복합체 물질을 확보하였다. 구체적인 합성공정은 다음과 같았다. 【표 1】
'： «； : ta 餐';： ：:
： ^ 纖, '腦 雷，、 ：：
i Tl DIEA ：
^^謹纖翁 ¾ ;：画 ]
:i L ! Jfi ᅳᅭ
힙성시긴 ¾약 ¾ 수율 상승 J
정제
수득된 펩타이드는 하기 조건의 그래디언트 (gradient) 조건하에서 HPLC로 정제 후 동결 건조하여 목적 펩타이드를 수득하였다.
A. 기기: Shimadzu 8A (5 cm * 25 cm)/8A (prep(dia 5 cm))
B. 용매의 조성: 버퍼 A=0.1¾) TFA/아세토나이트릴, 버퍼 B=0.1
TFA/H20
C. 흐름속도 (Flow rate): 50-140 m£/분
D. 컬럼: Si 1 icagel C18 reverse phase
E. 그래디언트 테이블
【표 2]
Figure imgf000016_0001
증간 규모 (10隱 ole) 펩타이드 합성에서 얻어진 결과를 바탕으로 펩타이드 의약품 원료에 대한 대규모 (100睡 ole) 합성을 수행하여 스케일 상승 (scale— up)을 실시하였다. 합성된 조펩타이드는 HPLC 정제조건을 확립하여 정제를 하여 최종목적물을 생산하였다 (도 1). 커큐민-펩타이드 복합체 증에서, 커큐민-아지렐린 복합체 및 커큐민 -구리 펩타이드 복합체의 개략적인 합성과정 및 이들의 화학식을 각각 도 2 및 3에 나타내었다. 실시예 1. 커큐민-펩타이드 복합체의 용해도 측정
<1-1> 커큐민의 용해도 측정
하기 표 3에 표시된 바와 같이 다양한 농도의 DMS0 용액을
준비하였다. 1 mg이 담긴 E. 튜브에 준비한 용액 90 峰 넣고 용해 여부를 확인하였다 (E. 튜브에 100 를 만들어 두었으나， 전체를 옮길 시 오차가 발생함을 고려하여 90 ^만을 취하여 녹였다).
【표 3】
Figure imgf000016_0002
그 결과， 도 4에 나타난 바와 같이, 커큐민 단독은 70% 이상의 DMS0에서만 용해되었으며， 물에는 용해되지 않았다. <1-2> 커큐민-아지텔린 복합체의 용해도 확인
시험물질 1 mg이 담긴 E. 튜브에 표 3에 계산되어있는 양의 물 (3차 증류수)을 넣고 용해 여부를 확인하였다.
그 결과， 도 5에 나타난 바와 같이， 커큐민 단독은 물에 용해되지 않았으나 커큐민-아지텔린 복합체는 물에 잘 용해되었음을 확인할 수 있었다.
<1-3> 커큐민 -구리 펩타이드 복합체의 용해도 확인
커큐민 -구리 펩타이드 복합체 (curcumin-Ghitarate-GHK—Cu)의 용해도가 용매에 따라 어떻게 달라지는지를 확인하였다. 이를 위하여， 표 4에 기재된 바와 같이 다양한 종류의 용매를 준비하고， 1 mg의 시험물질에 준비한 용매를 넣고 용해 정도를 관찰하였다.
【표 4]
Figure imgf000017_0001
그 결과， 도 6에 나타난 바와 같이， 커큐민 -구리 펩타이드 복합체는 DMS0 및 아세토나이트릴에는 용해되지 않았으나， 3차 증류수에는 완전히 용해되었음을 확인할 수 있었다.
<1-4>다양한 커큐민-펩타이드 복합체의 용해도 확인
물에 대한 용해도가 낮은 커큐민에 펩타이드를 결합시켜 그 용해도가 달라짐을 확인하기 위하여， E. 튜브에 커큐민 또는 커큐민-펩타이드 복합체 (표 5)를 1 mg씩 넣은 후 3차 증류수 700 ^를 첨가하였다. 1분간 볼텍싱 한 다음 용해도를 확인하였다.
그 결과， 표 5 및 도 7에 나타난 바와 같이, 커큐민의 경우 3차 증류수와 흔합하고 볼텍싱을 하여도 녹지 않고 바닥에 가라앉았으나， 27종의 커큐민- 펩타이드 복합체는 모두 물에 잘 녹음을 확인할 수 있었다. 【표 5】
Figure imgf000018_0001
DMSO를 물과 흔합한 상태에서 녹이는 방법과， 커큐민을 DMS0에 먼저 녹인 뒤 물을 첨가하는 방법에 따른 용해도에서의 큰 차이를 관찰하기는 힘들다. 두 방법 모두에서 커큐민은 70%의 DMS0에서는 용해되나, 100% 물에는 용해되지 않는다. 그러나 상기 실시예 1에서 확인된 바와 같이 커큐민-펩타이드 복합체는 모두 물에 잘 용해되었다.
이러한 결과는 커큐민에 펩타이드를 결합시켜 복합체를 형성시키는 경우 커큐민의 용해도가 현저히 증가될 수 있음을 보여준다. 실시예 2. 커큐민-펩타이드 복합체의 인간 피부세포 안전성 시험
커큐민-아지텔린 복합체에 대하여 인간 피부구성 세포들 즉 각질형성세포 (keratinocyte)와 섬유아세포 (fibroblast)에 세포주인 HaCaT 세포주와 CCD-986sk에 대하여 안전성 혹은 세포 독성 존재 여부를 검사하기 위해 ΜΠ시험을 실시하였다. 이를 위하여 인간 각질형성 세포주 HaCaT 세포와 섬유아세포인 CCD-986sk를 24웰 플레이트에 5 X 103 세포 /웰과 5 X 104 세포 /웰씩 동일하게 혈구계수기 (heamacytometer)를 이용하여 계수한 후 분주해 배양하였다ᅳ 10% FBS를 함유하는 DMEM에서 48시간 동안 배양하여 배양용기 표면적의 50¾만큼 배양되면, 커큐민-아지텔린 복합체가 적절한 농도로 함유되어 있는 배지에서 24시간 동안 더 배양하였다. 배양 후 MTT(3-(4,5-dimethyl thiazol-2-yl ) -2 ,5-di henyl tetrazol ium bromide, Sigma M5655) 용액 (2.5 /|11«을 50 μΐ 첨가하고 3시간 동안 추가로 배양하였다. 이후, 세포 배양액을 전부 버리고 200 ^의
디메틸설폭사이드 (DMSO, Sigma D2650)를 각 웰 당 200 처리하여 교반한 후, 100 씩을 96 웰로 취하여 EL ISA (Enzyme-Linked I瞧 unosorbent Assay)로 570 nm에서 흡광도를 측정하였다. 세포에 대한 독성 혹은 증식을 촉진하는 정도는 순수한 물을 사용한 대조군의 흡광 강도를 기준으로 백분율로 표시하였다.
도 8에 나타난 바와 같이， 커큐민-아지텔린 복합체는 처리 농도 100 μΜ까지 세포독성이 없었다. 특히， 섬유아세포에서 커큐민-아지텔린 복합체 50 μΜ에서 대조군 대비 약 20%이상 세포 증식능을 보였으몌 이는 화장품 원료로서 세포독성이 없으면서, 피부교원질을 생산하는
섬유아세포의 증식을 촉진시킴으로써 주름개선에도 효과가 있음을
의미한다 (도 8의 Β). 실시예 3. 커큐민-펩타이드 복합체의 항산화 시험
유해산소 (toxic oxygen species)라고도 하는 활성산소종 (react ive oxygen species, R0S)은 호홉 등과 같은 생리작용에 의해 세포에서 생성되 는 독성물질로 끈임없이 생산되고 소멸하며， 정상적인 상태에서는 3-5¾>정 도로 존재한다. 이런 활성산소종은 수퍼옥시드 라디칼 (Superoxide radical, 02"), 하이드특시라디칼 (hydroxy 1 radical, H0+)과 같은 자유라디 칼 (free radical ： 화학적으로 최외각 전자궤도에 쌍을 이루고 있지 않은 원자나 분자로 매우 불안정하여 높은 반웅성을 가짐)의 형태로 존재하거나 혹은 과산화수소 (hydorgen peroxide, H202)나 일중항산소 (Singlet radical , ^s)와 같이 쌍을 이룬 전자를 가진 화합물의 형태로 존재한다. 활성산소는 생리계 내에서 세균을 살균하는 생체 방어 작용을 하는 장점도 있지만, 일 반적으로 생체 내에서 산화를 일으켜 질병의 원인이 되는 유해한 작용을 한 다. 이 활성산소는 생물분자를 공격하여 세포나 조직에 피해를 주며, 노화 나 각종 성인병질환에 관여하는 여러 종류의 질병을 야기한다는 보고도 있 다. 이러한 활성산소에 의한 산화작용을 억제 할 수 있는 항산화제에 관 한 연구가 미용업계에서도 활발하게 진행 되고 있으며， 항산화력이 강력한 천연물이나 물질들의 연구개발은 항노화 물질로서 각광받고 있다.
본 시험방법은 에탄올상에서 DPPH(l,l-Diphenyl-2-picryhydrazyl,
Sigma D9132-1G)가 발생시키는 자유라디칼에 대한 소거능을 시험함으로써 항산화 효과의 직접적인 작용 정도를 파악할 수 있는 시험법이다ᅳ 화합물 DPPH는 에탄을 내에서 자유라디칼을 발생하는데, 이에 일정 농도의 시료와 흔합하여 자유라디칼의 양이 어느 정도 감소하는지 확인하였다. 구체적으 로, 에탄을 0.4 에 0.1 niM의 DPPH용액 0.5 , 그리고 일정농도로 희석된 추출물 0.1 m.£를 첨가하고， 10초간 강하게 볼텍싱한 후 냉암소에서 30분간 반웅시켰다. ELISA를 이용하여 517 nm에서 흡광도를 측정하며 , 항산화능 의 정도는 에탄올을 사용한 대조군 (음성대조군)의 홉광강도를 기준으로 백 분율로 표시하였다.
[수학식 1]
자유라디칼 활성 저해을 = 100 - { (각 시료액의 반웅흡광도 /공시 료액의 반웅흡광도) X 100} 커큐민-아지텔린 복합체의 항산화 시험을 DPPH 시험법을 통하여 확인 한 결과， 커큐민을 비타민과 비교하였을 때 커큐민은 비타민과 유사한 항산 화 효과가 있음을 확인하였다 (도 9). 커큐민-아지렐린 복합체 역시 항산 화 효과가 대조군 대비 매우 우수한 항산화력을 가지며 (도 10). 커큐민-아 지렐린 복합체의 경우 50 μΜ에서 이미 고점에 도달하였으며， 시너지 효과 가 있음을 확인하였다 (도 10). 이러한 결과는 비타민 C와 유사한 항산화 력을 가지면서도 피부세포에 안정하여 항노화 화장품 원료로서 매우 가치가 높음을 의미한다 . 실시예 4. 지질과산화 (Lipid peroxidation) 시험방법
지질과산화는 등물이나 식물에서 세포 손상을 일으키는 메커니즘으로 잘 알려져 있다 . 따라서， 이러한 지질과산화를 시험하기 위하여
TBARSCThiobarbituric Acid Reactive Substance) 키트를 이용하여 시험하였 다. 지질과산화는 세포에서 산화적 스트레스의 지시자로서 지질과산화의 자연적인 두 가지 산물인 MDA나 4-HNE(4ᅳ hydorxynonenal)와 같은 더욱 복잡 하고 반웅성이 높은 물질을 형성하며 분해된다. TBA S 키트는 직접적으로 MDA(Malondi aldehyde)를 측정하는 기법으로， 구체적인 실험방법으로는 적정 농도의 커큐민—아지렐린 복합체를 인간 각질형성 세포주에 처리한 후 그 배 양액을 수득하여 사용하였다. 시험방법은 다음과 같았다. 100 의 시 료와 MDA스탠다드를 E-튜부에 분주하고， SDS용해 용액을 100 μΐ 추가하였 다. 가볍게 믹스한 후 상온에서 5분 동안 반웅시키고, 250 의 ΤΒΑ시약 올 각 웰에 추가한 다음, Ε-튜브의 뚜껑을 닫은 후 95°C서 45-60분간 반웅 시켰다. 반응이 끝나면 얼음에서 5분간 추가 반웅시킨 후, 3,000 rpm으로 15분 동안 원심분리 후 상등액을 취하여 분석하였다. 200 씩 96 웰에 옮긴 후 532 nm로 읽었다.
세포 내 지질과산화는 세포 손상의 직접적인 원인이 된다. 그렇기 때문에 세포 내 지질과산화를 저해한다는 것은 세포 손상을 줄이고, 노화나 질병으로부터 보호할 수 있다는 의미가 된다. 커큐민-아지텔린 복합체의 지질과산화에 대한 실험 결과, 대조군에 비하여 커큐민 -아지텔린을 100 yM 처리 시 지질과산화를 약 20% 이상 줄여주는 것을 확인하였다 (도 11). 실시예 5. 커큐민-펩타이드 복합체의 콜라겐 생합성 개선 확인
사람 피부를 구성하는 섬유아세포에서 분비되는 다양한 콜라겐은 노 화 과정 및 주름형성과 밀접한 관련이 있다. 섬유아세포를 이용한 콜라겐 합성 정도를 통해 시험물질의 항주름 활성을 검증할 수 있다. 콜라겐의 합성 정도를 확인하기 위하여 인간섬유아세포 (CCD986-SK) 배양 시 커큐민- 펩타이드 복합체를 25 μΜ로 처리하여 세포 내 콜라겐의 생성 증가 정도를 비교 시험하는 방법으로 Procollagen type I C-peptide EIA 키트 (Precoated, Takara Biomedical Co)를 사용하여 측정하였다. 주름개선 생리활성에 대 한 양성 대조군으로 한국식품의약품안전청 (KFDA)으로부터 주름개선 기능성 으로 인증받은 레티놀을 사용하여 레티놀 보다 30% 이상의 콜라겐 생합성 촉진 효과가 있는지 여부를 평가하였다.
커큐민-아지텔린 복합체의 콜라겐 생합성을 ELISA 키트로 측정한 결 과， 커큐민ᅳ아지렐린 복합체의 경우 대조군 대비 약 30% 이상 콜라겐 생합 성을 촉진함을 확인하였다 (도 12). 실시예 6. 커큐민ᅳ펩타이드 복합체를 함유하는 화장료 조성물의 효능 평가 상기의 실험들로 피부생리 활성이 확인된 커큐민—아지렐린 복합체를 함유하는 조성물의 효능을 확인하기 위하여 일반적으로 많이 사용되는 화장 품 제형인 화장수 (표 6), 로션 (표 7), 크림 (표 8) 및 에센스 (표 9)의 제형 에 커큐민-아지렐란 복합체를 0.5% (5g/kg) 적용하여 화장품들을 제조하였 다. 각 제형의 제조 방법은 다음과 같았다.
화장수를 제조하기 위하여， 표 6의 성분 11번에 2, 3, 4 및 8번을 순 서대로 투입하고 교반하여 용해시켰다 (용해물 1). 5번을 60°C 정도로 가 열하여 용해시킨 후， 여기에 10번을 투입하예용해시켰다 (용해물 2). 상 기 용해물 2를 용해물 1에 투입하였다. 마지막으로 1, 6， 7 및 9번을 투 입하여 층분히 교반한 뒤 숙성시켰다.
로션을 제조하기 위하여, 표 7의 성분 1으 11, 13 및 16번을 흔합 교 반하면서 80-85°C에서 가열하여 제조부에 투입한 후 유화시키고, 2, 3， 4, 5, 6, 7, 8， 9 및 12번을 80-85°C에서 가열 용해한 후 투입시켜 유화시켰다 유화가 끝나면 교반기를 이용하여 교반하면서 50°C까지 냉각한 뒤 15번을 투입하고, 45°C까지 냉각한 뒤 14번을 투입하고, 35°C에서 1번을 투입하여 25°C까지 냉각한 뒤 숙성시켰다.
크림을 제조하기 위하여， 표 8의 성분 12， 13， 14 및 16번을 흔합 교 반하면서 80-85°C에서 가열하여 제조부에 투입한 후 유화시키고， 2, 3, 4, 5， 6， 7， 8， 9， 10 및 11번을 80-85°C에서 가열하여 용해한 후 15번을 투입 하고 교반한 다음， 그 결과물올 제조부에 투입하고 유화시켰다. 유화가 끝나면 교반기를 이용하여 교반하면서 35°C까지 넁각하고, 1번을 투입하여 25°C까지 넁각한 뒤 숙성시켰다. 에센스를 제조하기 위하여， 표 9의 성분 2， 3, 4， 5 및 6번을 일정한 온도에서 균질화하여， 비이온계 양친매성 지질을 얻었다. 상기 비이은계 양친매성 지질과 1, 7， 8 및 14번을 흔합하고， 일정한 온도에서 균질화하여 마이크로플루이다이져를 통과시키고, 이어 9번을 일정한 온도에서 서서히 첨가하여 균질화한 후 다시 마이크로플루이다이져에 재차 통과시켰다. 그 리고, 10, 11， 12 및 13번을 투입하여 분산시켜 안정화시키고 숙성시켰다. 제조된 조성물들을 가지고 인체 피부 적용 시 주름개선 효과를 시험 하기 위하여 50세 이상의 건강한 성인 남녀 16명을 대상으로 14일간 커큐민 -아지렐린 복합체 2종을 함유하는 조성물들과 대조군으로 함유하지 않은 조 성물들을 1일 2회 lg (혹은 ) 씩 눈가 주름에 바르는 방법으로 시험하였 다. 14일간도포 후 개선 효과는 눈가 주름의 개선 정도에 대한 만족도 조사를 통해 매우 효과， 약간 효과, 무 효과 및 주름 악화의 4단계로 수치 화 하였다. 【표 6】
Figure imgf000023_0001
【표 7】
번호 원료 함량 (중량 )
Figure imgf000024_0001
Figure imgf000025_0001
실험결과， 하기 표 10 내자 13에 나타난 바와 같이 , 커큐민-아지텔린 복합체가 들어 있는 조성물 사용군들에서 높은 주름 개선효과를 확인할 수 있었다. 구체적으로， 대조군으로 사용된 조성물에서는 주목할 만한 주름 개선효과가 나타나지 않은 반면, 커큐민-아지렐린 복합체를 0.5% 함유하는 조성물들에서는 일관되게 주름개선에 대한 효과가 나타났다. 특히， 크림 과 에센스 제형에서는 매우 효과라고 웅답한 비율이 전체 사용의 50%를 넘 었다.
【표 10】
Figure imgf000026_0001
혹합체:' 하 의피^주¾
Figure imgf000026_0002
【표 11】
»¾-#Β)¾ΐ£복 체 s¾:의피부주 과'
Figure imgf000026_0003
【표 12】
翻 3혹 #체' 3 피부 ψ§ MM
Figure imgf000027_0002
【표 13】
Figure imgf000027_0001
피부 m
Figure imgf000027_0003
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바， 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims

【특허청구범위】
【청구항 1】
(i) 커큐민; 및 (ii) 상기 커큐민과 링커 화합물을 통하여 결합된 2 내지 30 개의 아미노산으로 이루어진 펩타이드를 포함하고, 물에 용해되는 것을 특징으로 하는， 커큐민에 비하여 물에 대한 용해도가 향상된 커큐민- 펩타이드 복합체 .
[청구항 2】
제 1 항에 있어서, 상기 링커 화합물은 글루타레이드 (glutarate)인 것을 특징으로 하는 커큐민-펩타이드 복합체.
【청구항 3】
제 1 항에 있어서, 상기 링커 화합물은 커큐민과 에스터 결합하고, 펩타이드의 N-말단과는 펩타이드 결합하는 것을 특징으로 하는 커큐민- 펩타이드 복합체 .
【청구항 4]
제 1 항에 있어서, 상기 펩타이드는 2 내지 15 개의 아미노산으로 이루어진 것을 특징으로 하는 커큐민-펩타이드 복합체.
【청구항 5]
제 1 항에 있어서, 상기 펩타이드는 서열목록 제 1 서열 내지 제 28 서열로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 커큐민- 펩타이드 복합체.
【청구항 6]
제 1 항에 있어서, 상기 커큐민-펩타이드 복합체는 항산화 및 피부상태 (skin conditions) 개선 활성을 동시에 나타내는 것을 특징으로 하는 커큐민-펩타이드 복합체 .
【청구항 7] 링커 화합물을 통하여 커큐민에 2 내지 30 개의 아미노산으로 이루어진 펩타이드를 공유결합 시키는 단계를 포함하는 커큐민의 물에 대한 용해도를 향상시키는 방법 .
【청구항 8】
제 7 항에 있어서, 상기 링커 화합물은 루타레이드 (glutarate)인 것을 특징으로 하는 방법 .
【청구항 9】
제 7 항에 있어서, 상기 공유결합 시키는 단계는 커큐민의 아 ί 기에 링커 화합물을 에스터 결합시키고， 펩타이드의 Ν-말단에 링커 화합물을 펩타이드 결합시키는 단계; 또는 펩타이드의 Ν-말단에 링커 화합물을 펩타이드 결합시키고, 커큐민의 0Η 기에 링커 화합물을 에스터 결합시키는 단계인 것을 특징으로 하는 방법 .
【청구항 10]
제 7 항에 있어서， 상기 펩타이드는 서열목록 제 1 서열 내지 제 28서열로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법 .
【청구항 11】
다음의 단계를 포함하는 커큐민-펩타이드 복합체의 제조방법:
(a) 고체상 합성법으로 고체수지 상에서 2 내지 30개의 아미노산으로 이루어진 펩타이드를 합성하는 단계;
(b) 단계 (a)에서 합성된 펩타이드에 링커 화합물을 반웅시켜 펩타이드의 N-말단에 링커 화합물을 공유결합 시키는 단계;
(c) 단계 (b)의 결과물에 커큐민을 반웅시켜 커큐민과 링커 화합물이 공유결합 된 커큐민-펩타이드 복합체를 형성시키는 단계; 및
(d) 단계 (c)에서 형성된 커큐민-펩타이드 복합체를 상기 고체수지로부터 분리 (cleavage)하는 단계 .
【청구항 12】 제 11 항에 있어서, 상기 제조방법은 초음파 처리 하에서 실시되는 것을 특징으로 하는 제조방법 .
【청구항 13]
제 11 항에 있어서, 상기 단계 (a)는 2-4 당량의 Fmoc—아미노산을 커플링 시약의 존재 하에서 반웅시키며， 각 Fmoc-아미노산과 Fmoc-아미노산 사이의 커플링 시간은 2-5 시간인 것을 특징으로 하는 제조방법.
【청구항 14】
제 11 항에 있어서， 상기 단계 (b)의 링커 화합물은 글루타릭 무수물 (glutaric anhydride)인 것을 특징으로 하는 제조방법.
【청구항 15】
제 11 항에 있어서， 상기 방법은 단계 (d) 이후에, 크로마토그래피를 통하여 단계 (d)의 결과물로부터 커큐민-펩타이드 복합체를 분리 정제하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 제조방법.
[청구항 16】
제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항의 커큐민-펩타이드 복합체를 유효성분으로 i함하는 항산화 또는 피부상태 (skin conditions) 개선용 화장료 조성물.
【청구항 17]
제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항의 커큐민-펩타이드 복합체를 포함하는 건강기능식품.
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