WO2014136519A1 - Ｅｇｆ受容体阻害剤を含む多能性幹細胞の心筋分化促進剤 - Google Patents

Ｅｇｆ受容体阻害剤を含む多能性幹細胞の心筋分化促進剤 Download PDF

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carbon atoms
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inhibitor
myocardial differentiation
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憲夫 中辻
南　一成
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国立大学法人京都大学
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    • C12N2506/45—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from artificially induced pluripotent stem cells

Definitions

  • the present invention relates to a pluripotent stem cell myocardial differentiation promoting agent comprising an EGF receptor inhibitor.
  • the present invention also provides a myocardial differentiation promoting kit containing an EGF receptor inhibitor and induction of myocardial differentiation of pluripotent stem cells, comprising culturing pluripotent stem cells in a medium containing an EGF receptor inhibitor. Regarding the method.
  • the method for inducing differentiation of pluripotent stem cells is the key to the realization of regenerative medicine and the establishment of in vitro drug efficacy evaluation tests or drug safety tests.
  • heart disease is currently the second leading cause of death among Japanese people, and is important for regenerative medicine and evaluation of heart disease efficacy.
  • drugs that cause serious side effects such as heart failure and arrhythmia to the heart, there is a demand for a stable supply of uniform cardiomyocytes that can be used in cardiotoxicity tests.
  • Non-Patent Document 1 which is included herein by reference.
  • Non-patent Documents 2 and 3 which are incorporated herein by reference.
  • a method for inducing cardiomyocytes using BMP4, FGF2, insulin and serum has been reported (Non-patent Document 4, which is included herein by reference).
  • these methods require a large amount of cytokines and thus increase costs and are not suitable for practical use.
  • Non-patent Document 5 a method for inducing cardiomyocytes from mouse ES cells using a tankyrase inhibitor XAV939 has been reported (Non-patent Document 5, which is included herein by reference).
  • the induction efficiency is as low as 10-60%, it is difficult to apply to regenerative medicine.
  • Patent Documents 1 and 2 have previously reported low molecular weight compounds that promote myocardial differentiation from pluripotent stem cells (Patent Documents 1 and 2, and Non-Patent Document 7, which are included herein by reference). ).
  • the epidermal growth factor (EGF) receptor is a tyrosine kinase type receptor having EGF as a ligand, and is important for regulation of cell proliferation, differentiation and maintenance. EGF signaling has been reported to have an important role in heart development (Non-patent document 6, incorporated herein by reference). In addition, EGF receptors are deeply involved in the proliferation and metastasis of cancer cells, and EGF receptor inhibitors such as gefitinib are used as anticancer agents. However, there have been no reports on the application of EGF receptor inhibitors such as gefitinib and AG1478 to myocardial differentiation of human pluripotent stem cells.
  • An object of the present invention is to provide a myocardial differentiation promoting agent and method that enable myocardial differentiation of pluripotent stem cells with high efficiency and low cost.
  • the present invention provides an agent for promoting myocardial differentiation of pluripotent stem cells, comprising an EGF receptor inhibitor.
  • the present invention also provides a kit for promoting myocardial differentiation including an EGF receptor inhibitor.
  • the present invention also provides a method for inducing myocardial differentiation of pluripotent stem cells, comprising culturing pluripotent stem cells in a medium containing an EGF receptor inhibitor.
  • cardiomyocytes can be produced by inducing myocardial differentiation of pluripotent stem cells with high efficiency and low cost.
  • EGF receptor inhibitor (AG1478) promotes myocardial differentiation.
  • EGF receptor inhibitor (gefitinib) promotes myocardial differentiation.
  • the myocardial differentiation promoting effect of an EGF receptor inhibitor (AG1478 or gefitinib) and the synergistic effect of an EGF receptor inhibitor (AG1478 or gefitinib) and a Wnt signal inhibitor (KY02111 and / or XAV939).
  • EGF receptor inhibitor (gefitinib) on myocardial differentiation under conditions free of cytokines and xenogeneic components in human ES cells (KhES-3). Effect of promoting myocardial differentiation of EGF receptor inhibitor (AG1478 or gefitinib) on myocardial differentiation of human ES cells (KhES-3) and iPS cells (IMR90-1) under cytokine and xenogene-free conditions. Synergistic effect of an EGF receptor inhibitor (AG1478 or gefitinib) and a Wnt signal inhibitor (XAV939). Direct myocardial differentiation from sphere culture system of human iPS cells (253G1). Synergistic effect of EGF receptor inhibitor (PP3) and Wnt signal inhibitor (KY02111).
  • the pluripotent stem cell myocardial differentiation promoter of the present invention contains an epidermal growth factor (EGF) receptor inhibitor.
  • EGF receptor inhibitor in the present invention means any substance that inhibits signal transduction from the EGF receptor and includes, but is not limited to, low molecular weight compounds, nucleic acids, peptides, antibodies and the like.
  • EGF receptor inhibitors examples include AG1478, Gefitinib, Afatinib, ARRY334543, AST1306, AZD8931, BIBU1361, BIBX1382, BPQ, BPIQ-I, BPIQ-II, Canertinib5, Canertinib78 CUDC101, Dacomitinib, Vandetanib, EGFR Inhibitor III (N- (4-((3,4-dichloro-6-fluorophenyl) amino) -quinazolin-6-yl) -2-chloroacetamide, CAS 733009-42-2), EGFR / ErbB-2 Inhibitor (4- (4-benzyloxyanilino) -6,7-dimethoxyquinazoline, CAS 179248-61-4), Erlotinib, GW583340, GW2974, HDS029, Lapatinib, W I-P154, OSI-420, PD153035,
  • the EGF receptor inhibitor is an EGF receptor inhibitor having a quinazoline-based skeleton, such as AG1478, gefitinib, afatinib, ARRY334543, AST1306, AZD8931, BIBU1361, BIBX1382, BPDQ, BPIQ-I, BPIQ-II, Caneltinib CL-387,785, CUDC101, dacomitinib, vandetanib, EGFR Inhibitor III (CAS 733009-42-2), EGFR / ErbB-2 Inhibitor (CAS 179248-61-4), erlotinib, GW58340, GW2974, HDS029, lapatinib, WHI-P154, OSI-420, PD153035, PD168393, PD174265, peritinib, Compound 56, XL657, or PP3.
  • Preferred EGF receptor inhibitors for the present invention are AG1478, gefitinib,
  • the term “pluripotent stem cell” means pluripotency capable of differentiating into all cells constituting an adult and self-replication capable of maintaining the pluripotency even after cell division. It means a cell having the ability.
  • the “pluripotent stem cell” includes embryonic stem cells (ES cells), embryonic germ cells (EG cells), and induced pluripotent stem cells (iPS cells).
  • the species of “pluripotent stem cells” is not particularly limited, but is preferably a mammal, more preferably a rodent or a primate.
  • the present invention is particularly suitable for monkey or human pluripotent stem cells.
  • ES cells are pluripotent stem cells derived from early embryos, and can be established from the inner cell mass of blastocysts or epiblasts of early embryos after implantation.
  • ES cells include humans (Thomson J. A. et al., Science 282: 1145-1147 (1998), Biochem Biophys Res Commun. 345 (3), 926-32 (2006); primates such as rhesus monkeys and marmosets (Thomson J. A. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 7844-7848 (1995); Thomson J. A. et al., Biol. Reprod.
  • EG cells are pluripotent stem cells derived from primordial germ cells, such as human EG cells (Shamblott, et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 95: 13726-13731 (1998)) Included in the specification).
  • iPS cell means a pluripotent stem cell derived from a cell other than a pluripotent stem cell such as a somatic cell or a tissue stem cell.
  • the method for producing iPS cells is, for example, WO2007 / 069666, WO2009 / 006930, WO2009 / 006997, WO2009 / 007852, WO2008 / 118820, Cell Stem Cell 3 (5): 568-574 (2008), Cell Stem Cell 4 (5 ): 381-384 (2009), Nature 454: 646-650 (2008), Cell 136 (3): 411-419 (2009), Nature Biotechnology 26: 1269-1275 (2008), Cell Stem Cell 3: 475- 479 (2008), Nature Cell Biology 11: 197-203 (2009), Cell 133 (2): 250-264 (2008), Cell 131 (5): 861-72 (2007), Science 318 (5858): 1917 -20 2007 (2007) (both included herein by reference).
  • cells produced by any method are included in the “iPS
  • the myocardial differentiation promoting agent of the present invention may be used in combination with another myocardial differentiation promoting factor such as a Wnt signal inhibitor, a Wnt signal activator, nitrobin, or a cytokine (a combination of bFGF, BMP4, VEGF, DKK1, and activin A).
  • a Wnt signal inhibitor such as a Wnt signal inhibitor, a Wnt signal activator, nitrobin, or a cytokine (a combination of bFGF, BMP4, VEGF, DKK1, and activin A).
  • a cytokine a combination of bFGF, BMP4, VEGF, DKK1, and activin A.
  • the “myocardial differentiation promoting factor” in the present invention includes all substances having a myocardial differentiation promoting effect.
  • the myocardial differentiation promoter of the present invention is used in combination with a Wnt signal inhibitor and / or a Wnt signal activator.
  • the “Wnt signal activator” in the present invention means a substance that activates the Wnt signal pathway.
  • Wnt signal activators include GSK3 ⁇ inhibitors such as BIO and CHIR99021.
  • GSK3 ⁇ inhibitors such as BIO and CHIR99021.
  • two or more, for example 2, 3, or 4 types of Wnt signal activators may be used in combination.
  • Wnt signal inhibitor in the present invention means a substance that inhibits the Wnt signal pathway.
  • Wnt signal inhibitors include, for example, the following compounds of formula (I) or salts thereof, compounds such as IWP2, XAV939, and IWR1, and proteins such as IGFBP4 and Dkk1.
  • the Wnt signal inhibitor in the present invention is a compound, for example, a compound of formula (I) or a salt thereof, IWP2, XAV939, and IWR1.
  • two or more, for example 2, 3, or 4 types of Wnt signal inhibitors may be used in combination.
  • the Wnt signal inhibitor is a compound of the following formula (I) or a salt thereof: Formula (I): [Where: R 1 to R 5 each independently represent a hydrogen atom; a halogen atom; a hydroxyl group; a straight or branched alkoxy group having 1 to 5 carbon atoms; a straight chain having 1 to 5 carbon atoms that is unsubstituted or substituted with a halogen atom.
  • R 12 and R 13 are each independently a straight chain of 1 to 5 carbon atoms substituted with a hydrogen atom, an oxygen atom, or an unsubstituted or halogen atom, or Where two adjacent R 1 —R 5 together form —O—CH 2 —O— or —O— (CH 2 ) 2 —O—.
  • R 6 to R 9 each independently represent a hydrogen atom; a halogen atom; a hydroxyl group; a linear or branched alkoxy group having 1 to 5 carbon atoms; and a 1 to 5 carbon atom substituted with a group —C (O) A.
  • a straight-chain or branched alkoxy group (A is a saturated or unsaturated 5- or 6-membered ring which is unsubstituted or substituted with a straight-chain or branched alkyl group having 1 to 5 carbon atoms, and the ring is a nitrogen atom, an oxygen atom, And 1 or 2 atoms independently selected from a sulfur atom); a straight-chain or branched alkyl group of 1 to 5 carbon atoms which is unsubstituted or substituted with a halogen atom; or a group —NR 12 R 13 (R 12 and R 13 each independently represents a hydrogen atom, an oxygen atom, or a linear or branched alkyl group having 1 to 5 carbon atoms which is unsubstituted or substituted with a halogen atom), Although in two adjacent of R 6 -R 9 together O-CH 2 -O- or -O- (CH 2) may form a 2 -O-, R 10 to R 11 are each independently
  • linear or branched alkoxy group having 1 to 5 carbon atoms examples include methoxy group, ethoxy group, propoxy group, isopropoxy group, butoxy group, isobutoxy group, sec-butoxy group, tert-butoxy group, and pentyloxy group. Can be mentioned.
  • Examples of the linear or branched alkyl group having 1 to 5 carbon atoms include a methyl group, an ethyl group, a propyl group, an isopropyl group, a butyl group, an isobutyl group, a sec-butyl group, a tert-butyl group, and a pentyl group. .
  • linear or branched acyl group having 1 to 5 carbon atoms examples include formyl group, acetyl group, propionyl group, butyryl group, isobutyryl group, valeryl group, and isovaleryl group.
  • each of R 1 to R 5 independently represents a hydrogen atom; a halogen atom; a hydroxyl group; a linear or branched alkoxy group having 1 to 5 carbon atoms; or an unsubstituted or substituted carbon atom having 1 carbon atom.
  • R 1 to R 5 independently represents a hydrogen atom; a halogen atom; a hydroxyl group; a linear or branched alkoxy group having 1 to 5 carbon atoms; or an unsubstituted or substituted carbon atom having 1 carbon atom.
  • R 2 and R 3 are preferably straight-chain or branched alkoxy groups having 1 to 5 carbon atoms, or together, —O—CH 2 —O— or —O— (CH 2 ) 2 —. O- is formed. More preferably, R 2 and R 3 are a methoxy group, an ethoxy group, or a propoxy group. Even more preferably, R 2 is a methoxy group and R 3 is a methoxy group, an ethoxy group, or a propoxy group.
  • R 1 , R 4 and R 5 are preferably hydrogen atoms.
  • R 6 to R 9 each independently represent a hydrogen atom; a halogen atom; a hydroxyl group; a linear or branched alkoxy group having 1 to 5 carbon atoms; an unsubstituted or substituted carbon atom having 1 to 5 carbon atoms; Or a group —NR 12 R 13 (wherein R 12 and R 13 each independently represents a hydrogen atom, an oxygen atom, or an unsubstituted or substituted carbon atom having 1 to 5 carbon atoms) Where two adjacent R 6 —R 9 together are —O—CH 2 —O— or —O— (CH 2 ) 2 —O - May be formed.
  • R 6 and R 9 are preferably each independently a hydrogen atom; a halogen atom; a hydroxyl group; a linear or branched alkoxy group having 1 to 5 carbon atoms; or an unsubstituted or substituted carbon atom having 1 to 5 carbon atoms.
  • 5 is a linear or branched alkyl group, and more preferably a hydrogen atom.
  • R 7 represents a hydrogen atom; a halogen atom; a hydroxyl group; a linear or branched alkoxy group having 1 to 5 carbon atoms; a linear or branched group having 1 to 5 carbon atoms substituted with a group —C (O) A.
  • An alkoxy group (A is a saturated or unsaturated 5- or 6-membered ring which is unsubstituted or substituted by a linear or branched alkyl group having 1 to 5 carbon atoms, and the ring is formed from a nitrogen atom, an oxygen atom, and a sulfur atom; 1 or 2 atoms independently selected); a linear or branched alkyl group of 1 to 5 carbon atoms which is unsubstituted or substituted with a halogen atom; or a group —NR 12 R 13 (R 12 and R 13 are each independently a hydrogen atom, an oxygen atom, or a linear or branched alkyl group having 1 to 5 carbon atoms which is unsubstituted or substituted with a halogen atom, and R 8 is Hydrogen atom; halogen atom; hydroxyl group; carbon number 1 5 straight or branched alkoxy group; or unsubstituted or a straight-chain or branched alkyl group of
  • R 7 is a halogen atom.
  • R 7 is a linear alkoxy group having 1 to 5 carbon atoms substituted with a group —C (O) A, and the group —C (O) A is bonded to the terminal carbon atom of the alkoxy group. is doing.
  • A contains at least one nitrogen atom, and such A includes pyrrolidinyl, imidazolidinyl, pyrazolidinyl, pyrrolyl, imidazolyl, which is unsubstituted or substituted with a linear or branched alkyl group having 1 to 5 carbon atoms.
  • Pyrazolyl, thiazolyl, isothiazolyl, oxazolyl, isoxazolyl, piperidinyl, piperazinyl, morpholinyl, pyridyl, pyrimidinyl, pyrazinyl, and pyridazinyl groups are examples of the group.
  • A is a piperidinyl group, piperazinyl group, or morpholinyl group that is unsubstituted or substituted with a linear or branched alkyl group having 1 to 5 carbon atoms.
  • A is a piperidin-1-yl group, piperazin-1-yl group, or morpholin-4-yl group which is unsubstituted or substituted with a linear or branched alkyl group having 1 to 5 carbon atoms. is there.
  • R 10 and R 11 are preferably a hydrogen atom.
  • X is an oxygen atom; a sulfur atom; a group —NR 15 (wherein R 15 is a hydrogen atom, a linear or branched alkyl group having 1 to 5 carbon atoms, a linear or branched acyl group having 1 to 5 carbon atoms). Is). X is preferably a sulfur atom.
  • n is an integer from 0 to 4. In a further preferred embodiment, n is an integer from 1 to 3, even more preferably 2 or 3.
  • Examples of the compound of the formula (I) or a salt thereof in the present invention include the following compounds or salts thereof: (1) Formula (I): [Where: R 1 to R 5 each independently represent a hydrogen atom; a halogen atom; a hydroxyl group; a straight or branched alkoxy group having 1 to 5 carbon atoms; a straight chain having 1 to 5 carbon atoms that is unsubstituted or substituted with a halogen atom.
  • R 12 and R 13 are each independently a straight chain of 1 to 5 carbon atoms substituted with a hydrogen atom, an oxygen atom, or an unsubstituted or halogen atom, or Where two adjacent R 1 —R 5 together form —O—CH 2 —O— or —O— (CH 2 ) 2 —O—.
  • R 6 to R 9 each independently represent a hydrogen atom; a halogen atom; a hydroxyl group; a linear or branched alkoxy group having 1 to 5 carbon atoms; and a 1 to 5 carbon atom substituted with a group —C (O) A.
  • a straight-chain or branched alkoxy group (A is a saturated or unsaturated 5- or 6-membered ring which is unsubstituted or substituted with a straight-chain or branched alkyl group having 1 to 5 carbon atoms, and the ring is a nitrogen atom, an oxygen atom, And 1 or 2 atoms independently selected from a sulfur atom); a straight-chain or branched alkyl group of 1 to 5 carbon atoms which is unsubstituted or substituted with a halogen atom; or a group —NR 12 R 13 (R 12 and R 13 each independently represents a hydrogen atom, an oxygen atom, or a linear or branched alkyl group having 1 to 5 carbon atoms which is unsubstituted or substituted with a halogen atom), Although in two adjacent of R 6 -R 9 together O-CH 2 -O- or -O- (CH 2) may form a 2 -O-, R 10 to R 11 are each independently
  • R 6 -R 9 each independently represents a hydrogen atom; a halogen atom; a hydroxyl group; a linear or branched alkoxy group having 1 to 5 carbon atoms; an unsubstituted or substituted carbon atom having 1 to 5 carbon atoms. Or a group —NR 12 R 13 (wherein R 12 and R 13 each independently represents a hydrogen atom, an oxygen atom, or an unsubstituted or substituted carbon atom having 1 to 5 carbon atoms) Wherein two adjacent R 6 —R 9 are taken together to form —O—CH 2 —O— or —O— (CH 2 ) 2 —O—.
  • R 1 to R 5 are each independently a hydrogen atom; a halogen atom; a hydroxyl group; a linear or branched alkoxy group having 1 to 5 carbon atoms; or an unsubstituted or substituted carbon atom having 1 to 5 carbon atoms. 5 linear or branched alkyl groups, wherein two adjacent R 1 —R 5 together form —O—CH 2 —O— or —O— (CH 2 ) 2 —O—.
  • X is an oxygen atom; a sulfur atom; a group —NR 15 (wherein R 15 is a hydrogen atom, a linear or branched alkyl group having 1 to 5 carbon atoms, or a linear chain having 1 to 5 carbon atoms) Or a branched acyl group) or the salt thereof according to (2).
  • R 2 and R 3 are linear or branched alkoxy groups having 1 to 5 carbon atoms, or R 2 and R 3 together are —O—CH 2 —O— or —O— ( CH 2 ) 2 —O— is formed, R 6 and R 9 are each independently a hydrogen atom; a halogen atom; a hydroxyl group; a straight-chain or branched alkoxy group having 1 to 5 carbon atoms; or an unsubstituted or straight chain having 1 to 5 carbon atoms substituted with a halogen atom.
  • a chain or branched alkyl group, and R 7 is a hydrogen atom; a halogen atom; a hydroxyl group; a straight-chain or branched alkoxy group having 1 to 5 carbon atoms; a straight chain having 1 to 5 carbon atoms that is unsubstituted or substituted with a halogen atom.
  • R 8 is a hydrogen atom; a halogen atom; a hydroxyl group; a linear or branched alkoxy group having 1 to 5 carbon atoms; or a linear or branched alkyl group having 1 to 5 carbon atoms that is unsubstituted or substituted with a halogen atom. Or the compound or a salt thereof according to (3), wherein R 7 and R 8 together form —O—CH 2 —O— or —O— (CH 2 ) 2 —O—.
  • R 1 , R 4 , R 5 , R 6 , R 9 , R 10 and R 11 are hydrogen atoms
  • R 2 and R 3 are a methoxy group, an ethoxy group, or a propoxy group
  • X is a sulfur atom
  • n is an integer of 0 to 4.
  • R 7 is a halogen atom
  • R 8 is a hydrogen atom.
  • R 2 is a methoxy group
  • R 3 is a methoxy group, an ethoxy group, or a propoxy group.
  • R 1 , R 4 , R 5 , R 6 , R 8 , and R 9 are each independently a hydrogen atom; a halogen atom; a hydroxyl group; a linear or branched alkoxy group having 1 to 5 carbon atoms; or A linear or branched alkyl group having 1 to 5 carbon atoms which is unsubstituted or substituted with a halogen atom, R 2 and R 3 are linear or branched alkoxy groups having 1 to 5 carbon atoms, or R 2 and R 3 together represent —O—CH 2 —O— or —O— (CH 2 ).
  • R 7 is a linear or branched alkoxy group having 1 to 5 carbon atoms substituted with a group —C (O) A (A is unsubstituted or substituted with a linear or branched alkyl group having 1 to 5 carbon atoms) A saturated or unsaturated 5- or 6-membered ring, which ring may contain 1 or 2 atoms independently selected from nitrogen, oxygen and sulfur atoms), and X is An oxygen atom; a sulfur atom; a group —NR 15 (wherein R 15 is a hydrogen atom, a linear or branched alkyl group having 1 to 5 carbon atoms, or a linear or branched acyl group having 1 to 5 carbon atoms).
  • R 1 , R 4 , R 5 , R 6 , R 8 , and R 9 are hydrogen atoms
  • R 2 and R 3 are a methoxy group, an ethoxy group, or a propoxy group
  • R 10 and R 11 are hydrogen atoms
  • X is a sulfur atom
  • A is a piperidinyl group, piperazinyl group, or morpholinyl group that is unsubstituted or substituted with a linear or branched alkyl group having 1 to 5 carbon atoms
  • n is an integer of 0 to 4, (11) Or a salt thereof.
  • the compound of formula (I) or salt thereof is the following compound or salt thereof: and, [Wherein R 7 represents a halogen atom. ].
  • a suitable Wnt signal inhibitor in the present invention is a compound selected from the following or a salt thereof: KY02111 KY010104 T61164 KY02114 KY01045 KY01040 KY02109 KY010104 KY01043 KY01046 PB2852 N11474 PB2572 PB2570 KY02104 SO087 SO102 SO096 SO094 SO3031 (KY01-I) SO2031 (KY02-I) SO3042 (KY03-I) SO2077
  • Particularly preferred compounds of the formula (I) or salts thereof according to the invention are compounds or salts thereof selected from: KY02111 KY010104 T61164 KY02114 KY01045 KY02104 SO087 SO102 SO3031 (KY01-I) SO2031 (KY02-I) SO3042 (KY03-I) SO2077
  • the myocardial differentiation promoter of the present invention can be used according to the cardiomyocyte induction method for pluripotent stem cells of the present invention described later.
  • the myocardial differentiation promotion kit of the present invention contains an EGF receptor inhibitor.
  • the kit for promoting myocardial differentiation of the present invention may further contain a Wnt signal inhibitor, a Wnt signal activator and other myocardial differentiation promoting factors.
  • the method for inducing cardiomyocytes of pluripotent stem cells of the present invention includes culturing pluripotent stem cells in a medium containing an EGF receptor inhibitor.
  • the present invention is practiced in vitro.
  • the medium used in the method of the present invention may be a medium generally used for myocardial differentiation of pluripotent stem cells (hereinafter also referred to as myocardial differentiation medium), and its composition is not particularly limited.
  • a myocardial differentiation medium based on IMDM medium for example, a medium used in Examples
  • a myocardial differentiation medium based on DMEM for example, DMEM / F12 medium (Sigma)
  • DMEM for example, DMEM / F12 medium (Sigma)
  • GEBCO fetal bovine serum
  • MEM non-essential amino acid solution Sigma
  • penicillin-streptomycin GBCO
  • StemPro A medium such as -34 SFM (GIBCO) + BMP4 (10 ng / ml) is exemplified.
  • the present invention provides a method for inducing cardiomyocyte pluripotent stem cells using a serum-free medium (hereinafter also referred to as a serum-free medium).
  • a serum-free medium preferably contains albumin.
  • albumin include bovine serum albumin and human serum albumin.
  • serum, cytokines, feeder cells (feeder cells) and other proteins other than albumin and components derived from biological species different from the pluripotent stem cells used (ie, heterogeneous components) Can induce myocardial differentiation of pluripotent stem cells.
  • a culture method generally suitable for myocardial differentiation of pluripotent stem cells can be used.
  • the culture method include an adhesion culture method, a suspension culture method, and a suspension culture method.
  • the methods of the invention do not use feeder cells (feeder cells) such as END2 cells.
  • a period from the start of culture in a myocardial differentiation medium (hereinafter also referred to as myocardial differentiation culture) to the start of culture in a medium containing an EGF receptor inhibitor, and in the medium containing an EGF receptor inhibitor
  • the culture period in can be changed as appropriate.
  • two or more days from the second, third, or fourth to fourteenth days of myocardial differentiation culture (specifically, 2, 3, 4, 5 6, 7, 8, 9, 10, 11, or 12 days), preferably 3 to 10 days, more preferably 4 to 10 days, and even more preferably 4 to 8 days.
  • 4 to 8 days out of days 2, 3, or 4 to 10 of myocardial differentiation culture for example, 2 to 10 days (8 days) and 2 to 9 days (7 days) of myocardial differentiation culture Days 2-8 (6 days), 3-10 days (7 days), 3-9 days (6 days), 3-8 days (5 days), 4-10 days (6 days) It is preferably carried out on the 4th to 9th days (5 days) and on the 4th to 8th days (4 days).
  • the method of the present invention may further comprise culturing pluripotent stem cells in a medium containing a Wnt signal activator and / or culturing pluripotent stem cells in a medium containing a Wnt signal inhibitor. .
  • the method of the present invention includes the step of culturing pluripotent stem cells in a medium containing an EGF receptor inhibitor and a Wnt signal inhibitor.
  • the method in addition to the step of culturing pluripotent stem cells in a medium containing an EGF receptor inhibitor and a Wnt signal inhibitor, the method is carried out in a medium containing either an EGF receptor inhibitor or a Wnt signal inhibitor.
  • the step of culturing the cells may be included. For example, after culturing cells in a medium containing an EGF receptor inhibitor and not containing a Wnt signal inhibitor, or a medium containing a Wnt signal inhibitor and not containing an EGF receptor inhibitor, the medium is treated with EGF receptor.
  • the medium may be replaced with a medium containing both a body inhibitor and a Wnt signal inhibitor, and the culture may be continued.
  • a medium containing both an EGF receptor inhibitor and a Wnt signal inhibitor during the entire culture period may be used. Further, after culturing in a medium containing both an EGF receptor inhibitor and a Wnt signal inhibitor, there may be a period in which cells are cultured in a medium containing only one of them.
  • the methods of the invention include the following steps: (1) culturing pluripotent stem cells in a medium containing a Wnt signal activator; and (2) A step of culturing the cells in a medium containing an EGF receptor inhibitor after the step (1).
  • the period from the start of myocardial differentiation culture to the start of step (1), the period from the end of step (1) to the start of step (2), and the culture period of steps (1) and (2) It can be changed appropriately.
  • Step (2) may be started immediately after the end of step (1), or may be started after a certain period from the end of step (1).
  • the Wnt signal activator may be added to the initial stage of myocardial differentiation of pluripotent stem cells.
  • the initial stage of myocardial differentiation of pluripotent stem cells means a differentiation induction phase from pluripotent stem cells to mesoderm in which expression of a mesoderm marker gene occurs. Differentiation into mesoderm can be determined by examining the expression of a mesoderm marker gene. Examples of mesoderm marker genes include T, MIXL1, NODAL and the like.
  • step (1) is performed on days 0 to 2 or 0 to 3 of myocardial differentiation culture, that is, 2 or 3 days from the start of myocardial differentiation culture, , More than 2 days out of the 2nd, 3rd, or 4th to 14th days of myocardial differentiation culture (specifically 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, or 12 days), preferably 3 to 10 days, more preferably 4 to 10 days, and even more preferably 4 to 8 days.
  • Step (2) is, for example, 4 to 8 days from 2, 3, or 4 to 10 days of myocardial differentiation culture, for example, 2 to 10 days (8 days) of myocardial differentiation culture, 2 to 9 Day (7 days), 2-8 days (6 days), 3-10 days (7 days), 3-9 days (6 days), 3-8 days (5 days), 4-10 It is preferable to carry out the treatment on the day (6 days), the 4th to 9th days (5 days), or the 4th to 8th days (4 days).
  • the cells are cultured in a medium further containing a Wnt signal inhibitor in addition to the EGF receptor inhibitor.
  • the Wnt signal inhibitor may be added to the middle stage of myocardial differentiation of pluripotent stem cells.
  • the intermediate stage of myocardial differentiation of pluripotent stem cells means the stage of induction of differentiation from mesoderm to cardiomyocytes. Differentiation into cardiomyocytes can be confirmed by the number of beating cardiomyocytes, expression of myocardial markers, expression of ion channels, response to electrophysiological stimulation, and the like.
  • Myocardial markers include ⁇ MHC, ⁇ MHC, cTnT, ⁇ -actinin, and NKX2.5.
  • Examples of the ion channel include HCN4, Nav1.5, Cav1.2, Cav3.2, HERG1b, and KCNQ1.
  • the medium is a medium containing an EGF receptor inhibitor and a Wnt signal inhibitor. And continue the culture.
  • a medium containing both an EGF receptor inhibitor and a Wnt signal inhibitor may be used throughout the culture period of step (2).
  • the medium is replaced with a medium containing an EGF receptor inhibitor and a Wnt signal inhibitor, May be continued.
  • the concentration of the EGF receptor inhibitor in the present invention is not particularly limited.
  • gefitinib or AG1478 is used as an EGF receptor inhibitor, it may be used at a final concentration of 100 nM to 100 ⁇ M, preferably 1 ⁇ M to 20 ⁇ M.
  • PP3 is used as an EGF receptor inhibitor, it may be used at a final concentration of 1 ⁇ M to 1 mM, preferably 10 ⁇ M to 100 ⁇ M.
  • the concentration of the Wnt signal activator and the Wnt signal inhibitor in the present invention is not particularly limited.
  • BIO or CHIR99021 is used as the Wnt signal activator, it may be used at a final concentration of 100 nM to 100 ⁇ M, preferably 1 ⁇ M to 10 ⁇ M.
  • IWP2, XAV939, or IWR1 is used as the Wnt signal inhibitor, for example, it may be used at a final concentration of 0.5 to 20 ⁇ M, preferably 1 to 10 ⁇ M.
  • a final concentration of 0.1 to 20 ⁇ M, preferably 0.1 to 10 ⁇ M, more preferably 1 to What is necessary is just to use at 10 micromol.
  • the method of the present invention can be used for the production of cardiomyocytes.
  • Obtaining cardiomyocytes can be confirmed by the number of beating cardiomyocytes, expression of myocardial markers, expression of ion channels, response to electrophysiological stimulation, and the like.
  • the cardiomyocytes obtained by the method of the present invention can be used for in vitro drug safety tests or as transplanted cardiomyocytes for heart disease and the like.
  • the present invention provides a pluripotent stem cell myocardial differentiation promoter comprising the compound of formula (I) or a salt thereof, which is used in combination with an EGF receptor inhibitor.
  • the compound of the formula (I) or a salt thereof and the EGF receptor inhibitor in this embodiment are as described for the “promoting agent for myocardial differentiation of pluripotent stem cells, including an EGF receptor inhibitor”.
  • the present invention relates to the use of an EGF receptor inhibitor for promoting myocardial differentiation of pluripotent stem cells, and the use of an EGF receptor inhibitor for the manufacture of an agent for promoting myocardial differentiation of pluripotent stem cells.
  • an EGF receptor inhibitor for promoting myocardial differentiation of pluripotent stem cells and the use of an EGF receptor inhibitor for the manufacture of an agent for promoting myocardial differentiation of pluripotent stem cells.
  • Seed in 6-well plate (CORNING 3261) of Ultra-low culture dish, and mTeSR1 medium (Stem Cell Technology 05850) containing 3% methylcellulose (R & D, HSC001) will increase the size of iPS cell colonies to about 200-300 ⁇ m Until suspension culture.
  • IMDM IMDM (Sigma) (1% MEM non-essential amino acid solution ( Sigma), 1% penicillin-streptomycin (Gibco), 2 mM L-glutamine (Sigma), 0.5 mM L-carnitine (Sigma), 0.001% 2-mercaptoethanol (Gibco), and 0.4% human serum albumin (Sigma) )
  • IMDM IMDM (Sigma) (1% MEM non-essential amino acid solution ( Sigma), 1% penicillin-streptomycin (Gibco), 2 mM L-glutamine (Sigma), 0.5 mM L-carnitine (Sigma), 0.001% 2-mercaptoethanol (Gibco), and 0.4% human serum albumin (Sigma) )
  • CHIR99021 (4 ⁇ M) and BIO (1 ⁇ M) were added on days 0 to 2 (2 days) and cultured for 3 to 9 days.
  • EY02111 (10 ⁇ M) and XAV939 (1 ⁇ M) were added to the eyes (6 days)
  • EGF receptor inhibitor AG1478 or Gefiti Nibs were added at a concentration of 10 ⁇ M on days 3 to 9 (6 days)
  • Myocardial differentiation was effected on the 30th day of culture using an antibody against myocardial specific marker cardiac troponin T (cTnT). The ratio of cardiomyocytes was analyzed and evaluated.
  • the proportion of cardiomyocytes induced to increase increased from 34% to nearly 50% (FIG. 9). That is, it was found that the EGF receptor inhibitor has an effect of enhancing myocardial differentiation efficiency not only on human iPS cells on mouse feeder cells but also on iPS cells in a feeder-free sphere culture system.
  • PP3 is an EGFR inhibitor that has a different skeletal structure from AG1478 and gefitinib, and does not have an inhibitory effect on Src kinase that phosphorylates EGFR, so this result is a substance that inhibits signal transduction from the EGF receptor. Has an effect of promoting myocardial differentiation.
  • reaction mixture was diluted with ethyl acetate and washed with a saturated aqueous sodium hydrogen carbonate solution and a saturated aqueous sodium chloride solution.
  • the extract was dried over anhydrous sodium sulfate, and the solvent was distilled off under reduced pressure. The residue was recrystallized from ethanol to obtain 167 mg of 2- (2- (3,4-dimethoxyphenyl) acetamido) -6-iodobenzothiazole in a yield of 50%.
  • reaction mixture was diluted with ethyl acetate and washed with a saturated aqueous sodium hydrogen carbonate solution and a saturated aqueous sodium chloride solution.
  • the extract was dried over anhydrous sodium sulfate, and the solvent was distilled off under reduced pressure. The residue was recrystallized from ethanol to obtain 83 mg of 2- (3- (3,4-dimethoxyphenyl) propanamide) -6-iodobenzothiazole in a yield of 48%.
  • reaction mixture was diluted with ethyl acetate and washed with a saturated aqueous sodium hydrogen carbonate solution and a saturated aqueous sodium chloride solution.
  • the extract was dried over anhydrous sodium sulfate, and the solvent was distilled off under reduced pressure. The residue was recrystallized from ethanol to obtain 131 mg of 2- (4- (3,4-dimethoxyphenyl) butanamide) -6-iodobenzothiazole in a yield of 30%.
  • reaction mixture was diluted with ethyl acetate and washed with a saturated aqueous sodium hydrogen carbonate solution and a saturated aqueous sodium chloride solution.
  • the extract was dried over anhydrous sodium sulfate, and the solvent was distilled off under reduced pressure. The residue was recrystallized from ethanol to obtain 217 mg of 2- (3- (3-methoxy-4-propoxyphenyl) propanamide) -6-iodobenzothiazole in a yield of 60%.

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Abstract

　本発明は、ＥＧＦ受容体阻害剤を含む多能性幹細胞の心筋分化促進剤を提供する。また、本発明は、ＥＧＦ受容体阻害剤を含む、心筋分化促進用キット、およびＥＧＦ受容体阻害剤を含む培地中で多能性幹細胞を培養することを含む、多能性幹細胞の心筋分化誘導方法を提供する。

Description

ＥＧＦ受容体阻害剤を含む多能性幹細胞の心筋分化促進剤
　本発明は、ＥＧＦ受容体阻害剤を含む多能性幹細胞の心筋分化促進剤に関する。また、本発明は、ＥＧＦ受容体阻害剤を含む、心筋分化促進用キット、およびＥＧＦ受容体阻害剤を含む培地中で多能性幹細胞を培養することを含む、多能性幹細胞の心筋分化誘導方法に関する。
　多能性幹細胞の分化誘導方法は、再生医療の実現やインビトロでの薬効評価試験、あるいは薬剤安全性試験の確立の鍵を握るものである。特に、心疾患は現在日本人の死亡原因の第二位であり、再生医療や心疾患薬効評価については重要である。また心臓に対して心不全や不整脈など重篤な副作用を引き起こす薬物が多いことから、心毒性試験に用いることのできる均一な心筋細胞の安定的な供給が求められている。
　ヒトＥＳ／ｉＰＳ細胞を心筋へ分化させる手法として、マウス由来の支持細胞であるＥＮＤ２細胞とヒトＥＳ細胞を共培養する方法が報告されている（非特許文献１、参照により本明細書に含まれる）。しかしながら、その分化効率は低く、そのマウス由来のＥＮＤ２細胞がヒト心筋細胞に混入するため、純粋なヒト心筋細胞が得られないという問題がある。
　ヒトＥＳ／ｉＰＳ細胞を心筋へ分化させる他の手法として、ＥＳ細胞から胚葉体を形成し、そこにいくつかのサイトカイン（維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、骨形態形成タンパク４（ＢＭＰ４）、血管内皮細胞増殖因子、ＤＫＫ１、アクチビンＡ）を添加して心筋細胞を誘導する方法が報告されている（非特許文献２および３、参照により本明細書に含まれる）。また、ＢＭＰ４、ＦＧＦ２、インスリンと血清とを用いて心筋細胞を誘導する方法が報告されている（非特許文献４、参照により本明細書に含まれる）。しかしながら、これらの方法は大量のサイトカインが必要なためコストが上昇し実用化には適さない。他に、タンキラーゼ阻害剤ＸＡＶ９３９を用いてマウスＥＳ細胞から心筋細胞を誘導する方法も報告されているが（非特許文献５、参照により本明細書に含まれる）、血清を必要とする問題点に加え、誘導効率も１０～６０％と低いため、再生医療への適用が難しい。
　本発明者らは、これまでに、多能性幹細胞からの心筋分化を促進する低分子化合物を報告している（特許文献１および２、並びに非特許文献７、参照により本明細書に含まれる）。
　上皮成長因子（ＥＧＦ）受容体は、ＥＧＦをリガンドとするチロシンキナーゼ型受容体であり、細胞増殖、分化、維持などの調節に重要である。ＥＧＦシグナリングは心臓発生においても重要な役割を持つことが報告されている（非特許文献６、参照により本明細書に含まれる）。また、ＥＧＦ受容体は癌細胞の増殖や転移などにも深く関わっており、ゲフィチニブなどのＥＧＦ受容体阻害剤が抗癌剤として使用されている。しかしながら、ゲフィチニブやＡＧ１４７８などのＥＧＦ受容体阻害剤をヒト多能性幹細胞の心筋分化に応用した報告はこれまでにない。
国際公開第２０１１／０７１１１８号パンフレット 国際公開第２０１２／０２６４９１号パンフレット
Mummery, C., et al., Differentiation of human embryonic stem cells to cardiomyocytes: role of coculture with visceral endoderm-like cells. Circulation. 107(21),  2733-40 (2003). Yang, L., et al., Human cardiovascular progenitor cells develop from a KDR+ embryonic-stem-cell-derived population. Nature. 453(7194),  524-8 (2008). Leschik, J., et al., Cardiac commitment of primate embryonic stem cells. Nat Protoc. 3(9),  1381-7 (2008). Paul, W B., et al., A Universal System for Highly Efficient Cardiac Differentiation of Human Induced Pluripotent Stem Cells That Eliminates Interline Variability. PLoSone. 6(4),  e18293 (2011). Wang, H., et al., Cardiac induction of embryonic stem cells by a small molecule inhibitor of Wnt/β-catenin signaling. ACS Chem Biol. 6(2), 192-7 (2011). Iwamoto, R., et al., Heparin-binding EGF-like growth factor and ErbB signaling is essential for heart function. Proc Natl Acad Sci U S A. 100(6), 3221-6 (2003). Minami, I., et al., A Small Molecule that Promotes Cardiac Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells under Defined, Cytokine- and Xeno-free Conditions. Cell Rep. 2012 Nov 29;2(5):1448-60. doi: 10.1016/j.celrep.2012.09.015. Epub 2012 Oct 25.
　本発明は、高効率かつ低コストな多能性幹細胞の心筋分化を可能とする心筋分化促進剤および方法を提供することを目的とする。
　本発明は、ＥＧＦ受容体阻害剤を含む、多能性幹細胞の心筋分化促進剤を提供する。
　本発明はまた、ＥＧＦ受容体阻害剤を含む、心筋分化促進用キットを提供する。
　本発明はまた、ＥＧＦ受容体阻害剤を含む培地中で多能性幹細胞を培養することを含む、多能性幹細胞の心筋分化誘導方法を提供する。
　本発明により、高効率かつ低コストに多能性幹細胞の心筋分化を誘導し、心筋細胞を製造することが可能となる。
各種阻害剤の心筋分化促進効果。ＫＹ：ＫＹ０２１１１、ＳＢ：ＳＢ２０３５８０、ＢＩＲＢ：ＢＩＲＢ７９６、Ｕ：Ｕ０１２６、ＪＡＫＩ：チロホスチンＡＧ４９０、ＡＧ：ＡＧ１４７８。 ＥＧＦ受容体阻害剤（ＡＧ１４７８）の心筋分化促進効果。 ＥＧＦ受容体阻害剤（ゲフィチニブ）の心筋分化促進効果。 ＥＧＦ受容体阻害剤（ＡＧ１４７８またはゲフィチニブ）の心筋分化促進効果およびＥＧＦ受容体阻害剤（ＡＧ１４７８またはゲフィチニブ）とＷｎｔシグナル阻害剤（ＫＹ０２１１１および／またはＸＡＶ９３９）との相乗効果。 実施例で用いた心筋培養系。 ヒトＥＳ細胞（ＫｈＥＳ－３）でのサイトカインおよび異種成分不含条件下における心筋分化に対するＥＧＦ受容体阻害剤（ゲフィチニブ）の分化促進効果。 ヒトＥＳ細胞（ＫｈＥＳ－３）およびｉＰＳ細胞（ＩＭＲ９０－１）でのサイトカインおよび異種成分不含条件下における心筋分化に対するＥＧＦ受容体阻害剤（ＡＧ１４７８またはゲフィチニブ）の心筋分化促進効果。 ＥＧＦ受容体阻害剤（ＡＧ１４７８またはゲフィチニブ）とＷｎｔシグナル阻害剤（ＸＡＶ９３９）との相乗効果。 ヒトｉＰＳ細胞（２５３Ｇ１）のスフェア培養系からの直接心筋分化。 ＥＧＦ受容体阻害剤（ＰＰ３）とＷｎｔシグナル阻害剤（ＫＹ０２１１１）との相乗効果。
　本発明の多能性幹細胞の心筋分化促進剤は、上皮成長因子（ＥＧＦ）受容体阻害剤を含む。本発明における「ＥＧＦ受容体阻害剤」とは、ＥＧＦ受容体からのシグナル伝達を阻害するあらゆる物質を意味し、低分子化合物、核酸、ペプチド、抗体などが含まれるがこれらに限定されない。ＥＧＦ受容体阻害剤としては、ＡＧ１４７８、ゲフィチニブ（Gefitinib）、アファチニブ（Afatinib）、ＡＲＲＹ３３４５４３、ＡＳＴ１３０６、ＡＺＤ８９３１、ＢＩＢＵ１３６１、ＢＩＢＸ１３８２、ＢＰＤＱ、ＢＰＩＱ－Ｉ、ＢＰＩＱ－ＩＩ、カネルチニブ（Canertinib）、ＣＬ－３８７，７８５、ＣＵＤＣ１０１、ダコミチニブ（Dacomitinib）、バンデタニブ（Vandetanib）、EGFR Inhibitor III（Ｎ－（４－（（３，４－ジクロロ－６－フルオロフェニル）アミノ）－キナゾリン－６－イル）－２－クロロアセトアミド、CAS 733009-42-2）、EGFR/ErbB-2 Inhibitor（４－（４－ベンジルオキシアニリノ）－６，７－ジメトキシキナゾリン、CAS 179248-61-4）、エルロチニブ（Erlotinib）、ＧＷ５８３３４０、ＧＷ２９７４、ＨＤＳ０２９、ラパチニブ（Lapatinib）、ＷＨＩ－Ｐ１５４、ＯＳＩ－４２０、ＰＤ１５３０３５、ＰＤ１６８３９３、ＰＤ１７４２６５、ペリチニブ（Pelitinib）、Ｃｏｍｐｏｕｎｄ　５６、ＸＬ６５７、ＰＰ３、ＡＧ－４９０、ＡＧ５５５、チロホスチン（Tyrphostin）Ｂ４２、チロホスチンＢ４４、ＡＧ５５６、ＡＧ４９４、ＡＧ８２５、ＲＧ－１３０２２、ＤＡＰＨ、EGFR Inhibitor（シクロプロパンカルボン酸－（３－（６－（３－トリフルオロメチル－フェニルアミノ）－ピリミジン－４－イルアミノ）－フェニル）－アミド、CAS 879127-07-8）、エルブスタチンアナログ（Erbstatin Analog）（メチル　２，５－ジヒドロキシシナマート、CAS 63177-57-1）、ＪＮＪ２８８７１０６３、チロホスチン４７、ラベンダスチン（Lavendustin）Ａ、ラベンダスチンＣ、ラベンダスチンＣメチルエステル、ＬＦＭ－Ａ１２、ＴＡＫ１６５、ＴＡＫ２８５、チロホスチン５１、チロホスチンＡＧ１８３、チロホスチンＡＧ５２８、チロホスチンＡＧ９９、チロホスチンＲＧ１４６２０、ＷＺ３１４６、ＷＺ４００２、ＷＺ８０４０、ブテイン、チロホスチンＡＧ１１２などが例示される。ある態様において、ＥＧＦ受容体阻害剤は、キナゾリン系骨格を有するＥＧＦ受容体阻害剤、例えばＡＧ１４７８、ゲフィチニブ、アファチニブ、ＡＲＲＹ３３４５４３、ＡＳＴ１３０６、ＡＺＤ８９３１、ＢＩＢＵ１３６１、ＢＩＢＸ１３８２、ＢＰＤＱ、ＢＰＩＱ－Ｉ、ＢＰＩＱ－ＩＩ、カネルチニブ、ＣＬ－３８７，７８５、ＣＵＤＣ１０１、ダコミチニブ、バンデタニブ、EGFR Inhibitor III（CAS 733009-42-2）、EGFR/ErbB-2 Inhibitor（CAS 179248-61-4）、エルロチニブ、ＧＷ５８３３４０、ＧＷ２９７４、ＨＤＳ０２９、ラパチニブ、ＷＨＩ－Ｐ１５４、ＯＳＩ－４２０、ＰＤ１５３０３５、ＰＤ１６８３９３、ＰＤ１７４２６５、ペリチニブ、Ｃｏｍｐｏｕｎｄ　５６、もしくはＸＬ６５７であるか、または、ＰＰ３である。本発明に好適なＥＧＦ受容体阻害剤は、ＡＧ１４７８、ゲフィチニブ、およびＰＰ３である。ＥＧＦ受容体阻害剤は、Santa Cruz Biotechなどから入手可能である。
　本発明において「多能性幹細胞」とは、成体を構成する全ての細胞に分化することができる多分化能（ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｃｙ）と、細胞分裂を経てもその多分化能を維持することができる自己複製能を有する細胞を意味する。「多能性幹細胞」には、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、胚性生殖細胞（ＥＧ細胞）、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）が含まれる。「多能性幹細胞」の生物種は特に限定はされないが、好ましくは哺乳類であり、より好ましくは齧歯類または霊長類である。本発明は、サルまたはヒト多能性幹細胞に特に好適である。
　ＥＳ細胞は、初期胚に由来する多能性幹細胞であり、胚盤胞の内部細胞塊または着床後の初期胚のエピブラストから樹立することができる。ＥＳ細胞としては、ヒト（Thomson J. A. et al., Science 282: 1145-1147 (1998) 、Biochem Biophys Res Commun. 345(3),  926-32 (2006)；アカゲザルおよびマーモセット等の霊長類（Thomson J. A. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 7844-7848 (1995）；Thomson J. A. et al., Biol. Reprod. 55: 254-259 (1996)）；ウサギ（特表２０００－５０８９１９号）；ハムスター（Doetshman T. et al., Dev. Biol. 127: 224-227 (1988)）、ブタ（Evans M. J. et al., Theriogenology 33: 125128 (1990); Piedrahita J.A. et al., Theriogenology 34: 879-891 (1990); Notarianni E. et al., J. Reprod. Fert. 40: 51-56 (1990); Talbot N. C. et al., Cell. Dev. Biol. 29A: 546-554 (1993)）、ヒツジ（Notarianni E. et al., J. Reprod. Fert. Suppl. 43: 255-260 (1991)）、ウシ（Evans M. J. et al., Theriogenology 33: 125-128 (1990); Saito S. et al., Roux. Arch. Dev. Biol. 201: 134-141 (1992)）、ミンク（Sukoyan M. A. et al., Mol. Reorod. Dev. 33: 418-431 (1993)） （いずれも参照により本明細書に含まれる）などのＥＳ細胞が挙げられる。
　ＥＧ細胞は、始原生殖細胞に由来する多能性幹細胞であり、例えば、ヒトＥＧ細胞（Shamblott, et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 95: 13726-13731 (1998)) （参照により本明細書に含まれる）が挙げられる。
　本発明において「ｉＰＳ細胞」とは、体細胞や組織幹細胞などの多能性幹細胞以外の細胞から誘導された多能性幹細胞を意味する。ｉＰＳ細胞の作製方法は、例えば、ＷＯ２００７／０６９６６６、ＷＯ２００９／００６９３０、ＷＯ２００９／００６９９７、ＷＯ２００９／００７８５２、ＷＯ２００８／１１８８２０、Cell Stem Cell 3(5): 568-574 (2008) 、Cell Stem Cell 4(5): 381-384 (2009)、Nature 454: 646-650 (2008) 、Cell 136(3) :411-419 (2009) 、Nature Biotechnology 26: 1269-1275 (2008) 、Cell Stem Cell 3: 475-479 (2008) 、Nature Cell Biology 11: 197-203 (2009) 、Cell 133(2): 250-264 (2008)、Cell 131(5): 861-72 (2007)、Science 318 (5858): 1917-20 (2007) （いずれも参照により本明細書に含まれる）に記載される。しかしながら、人工的に誘導された多能性幹細胞であれば、いかなる方法で作製された細胞も本発明の「ｉＰＳ細胞」に含まれる。
　本発明の心筋分化促進剤は、Ｗｎｔシグナル阻害剤、Ｗｎｔシグナル活性化剤、ニトロビン、サイトカイン（bＦＧＦ、ＢＭＰ４、ＶＥＧＦ、ＤＫＫ１およびアクチビンＡの組み合わせ）などの別の心筋分化促進因子と併用してもよい。本発明における「心筋分化促進因子」には、心筋分化促進効果を有するあらゆる物質が含まれる。好ましい態様において、本発明の心筋分化促進剤は、Ｗｎｔシグナル阻害剤および／またはＷｎｔシグナル活性化剤と併用される。
　本発明における「Ｗｎｔシグナル活性化剤」とは、Ｗｎｔシグナル経路を活性化する物質を意味する。Ｗｎｔシグナル活性化剤としては、例えばＢＩＯおよびＣＨＩＲ９９０２１などのＧＳＫ３β阻害剤が例示される。本発明においては、２以上、例えば２、３、または４種類のＷｎｔシグナル活性化剤を併用してもよい。
　本発明における「Ｗｎｔシグナル阻害剤」とは、Ｗｎｔシグナル経路を阻害する物質を意味する。Ｗｎｔシグナル阻害剤には、例えば、以下の式（Ｉ）の化合物またはその塩、ＩＷＰ２、ＸＡＶ９３９、およびＩＷＲ１などの化合物、並びにＩＧＦＢＰ４、およびＤｋｋ１などのタンパク質が含まれる。好ましくは、本発明におけるＷｎｔシグナル阻害剤は化合物であり、例えば、式（Ｉ）の化合物またはその塩、ＩＷＰ２、ＸＡＶ９３９、およびＩＷＲ１である。本発明においては、２以上、例えば２、３、または４種類のＷｎｔシグナル阻害剤を併用してもよい。
　ある態様において、Ｗｎｔシグナル阻害剤は、以下の式（Ｉ）の化合物またはその塩である：
　式（Ｉ）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000025
 ［式中、
　Ｒ１－Ｒ５は、各々独立して、水素原子；ハロゲン原子；水酸基；炭素数１～５の直鎖又は分岐アルコキシ基；非置換又はハロゲン原子で置換された炭素数１～５の直鎖又は分岐アルキル基；又は基－ＮＲ１２Ｒ１３（Ｒ１２及びＲ１３は、各々独立して、水素原子、酸素原子、又は非置換又はハロゲン原子で置換された炭素数１～５の直鎖または分岐アルキル基である）である、ここでＲ１－Ｒ５のうち隣接する２つが一緒になって－Ｏ－ＣＨ２－Ｏ－または－Ｏ－（ＣＨ２）２－Ｏ－を形成していてもよい、
　Ｒ６－Ｒ９は、各々独立して、水素原子；ハロゲン原子；水酸基；炭素数１～５の直鎖又は分岐アルコキシ基；基－Ｃ（Ｏ）Ａで置換された炭素数１～５の直鎖又は分岐アルコキシ基（Ａは、非置換又は炭素数１～５の直鎖または分岐アルキル基で置換された飽和または不飽和５または６員環であり、該環は窒素原子、酸素原子、及び硫黄原子から独立に選択される１または２個の原子を含んでいてもよい）；非置換又はハロゲン原子で置換された炭素数１～５の直鎖又は分岐アルキル基；又は基－ＮＲ１２Ｒ１３（Ｒ１２及びＲ１３は、各々独立して、水素原子、酸素原子、又は非置換又はハロゲン原子で置換された炭素数１～５の直鎖または分岐アルキル基である）である、ここでＲ６－Ｒ９のうち隣接する２つが一緒になって－Ｏ－ＣＨ２－Ｏ－または－Ｏ－（ＣＨ２）２－Ｏ－を形成していてもよい、
　Ｒ１０－Ｒ１１は、各々独立して、水素原子；又は炭素数１～５の直鎖又は分岐アルキル基である、
　Ｘは、－ＣＲ１４（Ｒ１４は、水素原子、ハロゲン原子、水酸基、炭素数１～５の直鎖又は分岐アルコキシ基、非置換又はハロゲン原子で置換された炭素数１～５の直鎖又は分岐アルキル基である）；酸素原子；硫黄原子；セレン原子；又は基－ＮＲ１５（Ｒ１５は、水素原子、炭素数１～５の直鎖又は分岐アルキル基、又は炭素数１～５の直鎖又は分岐アシル基である）である、および
　ｎは、０から６の整数である］。
　炭素数１～５の直鎖又は分岐アルコキシ基としては、例えば、メトキシ基、エトキシ基、プロポキシ基、イソプロポキシ基、ブトキシ基、イソブトキシ基、ｓｅｃ－ブトキシ基、ｔｅｒｔ－ブトキシ基、ペンチルオキシ基が挙げられる。
　炭素数１～５の直鎖又は分岐アルキル基としては、例えば、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、イソブチル基、ｓｅｃ－ブチル基、ｔｅｒｔ－ブチル基、ペンチル基が挙げられる。
　炭素数１～５の直鎖又は分岐アシル基としては、例えば、ホルミル基、アセチル基、プロピオニル基、ブチリル基、イソブチリル基、バレリル基、イソバレリル基が挙げられる。
　ハロゲン原子としては、Ｃｌ、Ｂｒ、ＩまたはＦが挙げられる。
　好ましい態様において、Ｒ１－Ｒ５は、各々独立して、水素原子；ハロゲン原子；水酸基；炭素数１～５の直鎖又は分岐アルコキシ基；又は非置換又はハロゲン原子で置換された炭素数１～５の直鎖又は分岐アルキル基であり、ここでＲ１－Ｒ５のうち隣接する２つが一緒になって－Ｏ－ＣＨ２－Ｏ－または－Ｏ－（ＣＨ２）２－Ｏ－を形成していてもよい。
　Ｒ２及びＲ３は、好ましくは、炭素数１～５の直鎖又は分岐アルコキシ基であるか、又は、一緒になって－Ｏ－ＣＨ２－Ｏ－または－Ｏ－（ＣＨ２）２－Ｏ－を形成している。さらに好ましくは、Ｒ２及びＲ３は、メトキシ基、エトキシ基、又はプロポキシ基である。さらにより好ましくは、Ｒ２はメトキシ基であり、Ｒ３はメトキシ基、エトキシ基、又はプロポキシ基である。
　Ｒ１、Ｒ４及びＲ５は、好ましくは、水素原子である。
　ある態様において、Ｒ６－Ｒ９は、各々独立して、水素原子；ハロゲン原子；水酸基；炭素数１～５の直鎖又は分岐アルコキシ基；非置換又はハロゲン原子で置換された炭素数１～５の直鎖又は分岐アルキル基；又は基－ＮＲ１２Ｒ１３（Ｒ１２及びＲ１３は、各々独立して、水素原子、酸素原子、又は非置換又はハロゲン原子で置換された炭素数１～５の直鎖または分岐のアルキル基である）であり、ここでＲ６－Ｒ９のうち隣接する２つが一緒になって－Ｏ－ＣＨ２－Ｏ－または－Ｏ－（ＣＨ２）２－Ｏ－を形成していてもよい。
　Ｒ６及びＲ９は、好ましくは、各々独立して、水素原子；ハロゲン原子；水酸基；炭素数１～５の直鎖又は分岐アルコキシ基；又は非置換又はハロゲン原子で置換された炭素数１～５の直鎖又は分岐アルキル基であり、より好ましくは、水素原子である。
　好ましい態様において、Ｒ７は、水素原子；ハロゲン原子；水酸基；炭素数１～５の直鎖又は分岐アルコキシ基；基－Ｃ（Ｏ）Ａで置換された炭素数１～５の直鎖又は分岐アルコキシ基（Ａは、非置換又は炭素数１～５の直鎖または分岐アルキル基で置換された飽和または不飽和５または６員環であり、該環は窒素原子、酸素原子、及び硫黄原子から独立に選択される１または２個の原子を含んでいてもよい）；非置換又はハロゲン原子で置換された炭素数１～５の直鎖又は分岐アルキル基；又は基－ＮＲ１２Ｒ１３（Ｒ１２及びＲ１３は、各々独立して、水素原子、酸素原子、又は非置換又はハロゲン原子で置換された炭素数１～５の直鎖又は分岐アルキル基である）であって、Ｒ８は、水素原子；ハロゲン原子；水酸基；炭素数１～５の直鎖又は分岐アルコキシ基；又は非置換又はハロゲン原子で置換された炭素数１～５の直鎖又は分岐アルキル基であるか、又は、Ｒ７及びＲ８は、一緒になって－Ｏ－ＣＨ２－Ｏ－または－Ｏ－（ＣＨ２）２－Ｏ－を形成している。
　ある態様において、Ｒ７は、ハロゲン原子である。
　ある態様において、Ｒ７は、基－Ｃ（Ｏ）Ａで置換された炭素数１～５の直鎖アルコキシ基であり、基－Ｃ（Ｏ）Ａは前記アルコキシ基の末端の炭素原子に結合している。
　好ましい態様において、Ａは窒素原子を少なくとも１つ含み、そのようなＡとしては、非置換又は炭素数１～５の直鎖または分岐アルキル基で置換された、ピロリジニル、イミダゾリジニル、ピラゾリジニル、ピロリル、イミダゾリル、ピラゾリル、チアゾリル、イソチアゾリル、オキサゾリル、イソオキサゾリル、ピペリジニル、ピペラジニル、モルホリニル、ピリジル、ピリミジニル、ピラジニル、及びピリダジニル基が例示される。より好ましい態様において、Ａは、非置換又は炭素数１～５の直鎖または分岐アルキル基で置換された、ピペリジニル基、ピペラジニル基、又はモルホリニル基である。さらに好ましい態様において、Ａは、非置換又は炭素数１～５の直鎖または分岐アルキル基で置換された、ピペリジン－１－イル基、ピペラジン－１－イル基、又はモルホリン－４－イル基である。
　Ｒ１０及びＲ１１は、好ましくは、水素原子である。
　好ましい態様において、Ｘは、酸素原子；硫黄原子；基－ＮＲ１５（Ｒ１５は、水素原子、炭素数１～５の直鎖又は分岐アルキル基、炭素数１～５の直鎖又は分岐アシル基である）である。Ｘは、好ましくは、硫黄原子である。
　好ましい態様において、ｎは、０から４の整数である。さらに好ましい態様において、ｎは、１から３の整数であり、さらにより好ましくは２又は３である。
　本発明における式（Ｉ）の化合物またはその塩としては、以下の化合物またはその塩が例示される：
（１）式（Ｉ）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000026
 ［式中、
　Ｒ１－Ｒ５は、各々独立して、水素原子；ハロゲン原子；水酸基；炭素数１～５の直鎖又は分岐アルコキシ基；非置換又はハロゲン原子で置換された炭素数１～５の直鎖又は分岐アルキル基；又は基－ＮＲ１２Ｒ１３（Ｒ１２及びＲ１３は、各々独立して、水素原子、酸素原子、又は非置換又はハロゲン原子で置換された炭素数１～５の直鎖または分岐アルキル基である）である、ここでＲ１－Ｒ５のうち隣接する２つが一緒になって－Ｏ－ＣＨ２－Ｏ－または－Ｏ－（ＣＨ２）２－Ｏ－を形成していてもよい、
　Ｒ６－Ｒ９は、各々独立して、水素原子；ハロゲン原子；水酸基；炭素数１～５の直鎖又は分岐アルコキシ基；基－Ｃ（Ｏ）Ａで置換された炭素数１～５の直鎖又は分岐アルコキシ基（Ａは、非置換又は炭素数１～５の直鎖または分岐アルキル基で置換された飽和または不飽和５または６員環であり、該環は窒素原子、酸素原子、及び硫黄原子から独立に選択される１または２個の原子を含んでいてもよい）；非置換又はハロゲン原子で置換された炭素数１～５の直鎖又は分岐アルキル基；又は基－ＮＲ１２Ｒ１３（Ｒ１２及びＲ１３は、各々独立して、水素原子、酸素原子、又は非置換又はハロゲン原子で置換された炭素数１～５の直鎖または分岐アルキル基である）である、ここでＲ６－Ｒ９のうち隣接する２つが一緒になって－Ｏ－ＣＨ２－Ｏ－または－Ｏ－（ＣＨ２）２－Ｏ－を形成していてもよい、
　Ｒ１０－Ｒ１１は、各々独立して、水素原子；又は炭素数１～５の直鎖又は分岐アルキル基である、
　Ｘは、－ＣＲ１４（Ｒ１４は、水素原子、ハロゲン原子、水酸基、炭素数１～５の直鎖又は分岐アルコキシ基、非置換又はハロゲン原子で置換された炭素数１～５の直鎖又は分岐アルキル基である）；酸素原子；硫黄原子；セレン原子；又は基－ＮＲ１５（Ｒ１５は、水素原子、炭素数１～５の直鎖又は分岐アルキル基、又は炭素数１～５の直鎖又は分岐アシル基である）である、および
　ｎは、０から６の整数である］の化合物またはその塩。
（２）Ｒ６－Ｒ９が、各々独立して、水素原子；ハロゲン原子；水酸基；炭素数１～５の直鎖又は分岐アルコキシ基；非置換又はハロゲン原子で置換された炭素数１～５の直鎖又は分岐アルキル基；又は基－ＮＲ１２Ｒ１３（Ｒ１２及びＲ１３は、各々独立して、水素原子、酸素原子、又は非置換又はハロゲン原子で置換された炭素数１～５の直鎖または分岐アルキル基である）である、ここでＲ６－Ｒ９のうち隣接する２つが一緒になって－Ｏ－ＣＨ２－Ｏ－または－Ｏ－（ＣＨ２）２－Ｏ－を形成していてもよい、（１）に記載の化合物またはその塩。
（３）Ｒ１－Ｒ５が、各々独立して、水素原子；ハロゲン原子；水酸基；炭素数１～５の直鎖又は分岐アルコキシ基；又は非置換又はハロゲン原子で置換された炭素数１～５の直鎖又は分岐アルキル基である、ここでＲ１－Ｒ５のうち隣接する２つが一緒になって－Ｏ－ＣＨ２－Ｏ－または－Ｏ－（ＣＨ２）２－Ｏ－を形成していてもよい、および
　Ｘが、酸素原子；硫黄原子；基－ＮＲ１５（Ｒ１５は、水素原子、炭素数１～５の直鎖又は分岐アルキル基、又は炭素数１～５の直鎖又は分岐アシル基である）である、（２）に記載の化合物またはその塩。
（４）Ｒ２及びＲ３が、炭素数１～５の直鎖又は分岐アルコキシ基である、又はＲ２及びＲ３が、一緒になって－Ｏ－ＣＨ２－Ｏ－または－Ｏ－（ＣＨ２）２－Ｏ－を形成している、
　Ｒ６及びＲ９が、各々独立して、水素原子；ハロゲン原子；水酸基；炭素数１～５の直鎖又は分岐アルコキシ基；又は非置換又はハロゲン原子で置換された炭素数１～５の直鎖又は分岐アルキル基である、および
　Ｒ７が、水素原子；ハロゲン原子；水酸基；炭素数１～５の直鎖又は分岐アルコキシ基；非置換又はハロゲン原子で置換された炭素数１～５の直鎖又は分岐アルキル基；又は基－ＮＲ１２Ｒ１３（Ｒ１２及びＲ１３は、各々独立して、水素原子、酸素原子、又は非置換又はハロゲン原子で置換された炭素数１～５の直鎖又は分岐アルキル基である）である、
　Ｒ８が、水素原子；ハロゲン原子；水酸基；炭素数１～５の直鎖又は分岐アルコキシ基；又は非置換又はハロゲン原子で置換された炭素数１～５の直鎖又は分岐アルキル基である、
　又は、Ｒ７及びＲ８が、一緒になって－Ｏ－ＣＨ２－Ｏ－または－Ｏ－（ＣＨ２）２－Ｏ－を形成している、（３）に記載の化合物またはその塩。
（５）Ｒ１、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ９、Ｒ１０及びＲ１１が、水素原子である、
　Ｒ２及びＲ３が、メトキシ基、エトキシ基、又はプロポキシ基である、
　Ｘが、硫黄原子である、および
　ｎが、０から４の整数である、（４）に記載の化合物またはその塩。
（６）Ｒ７が、ハロゲン原子であり、Ｒ８が、水素原子である、（５）に記載の化合物またはその塩。
（７）Ｒ２が、メトキシ基である、および
　Ｒ３が、メトキシ基、エトキシ基、又はプロポキシ基である、（５）または（６）に記載の化合物またはその塩。
（８）ｎが、１から３の整数である、（５）～（７）のいずれかに記載の化合物またはその塩。
（９）Ｒ１、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ８、及びＲ９が、各々独立して、水素原子；ハロゲン原子；水酸基；炭素数１～５の直鎖又は分岐アルコキシ基；又は非置換又はハロゲン原子で置換された炭素数１～５の直鎖又は分岐アルキル基である、
　Ｒ２及びＲ３が、炭素数１～５の直鎖又は分岐アルコキシ基である、又はＲ２及びＲ３が、一緒になって－Ｏ－ＣＨ２－Ｏ－または－Ｏ－（ＣＨ２）２－Ｏ－を形成している、
　Ｒ７が、基－Ｃ（Ｏ）Ａで置換された炭素数１～５の直鎖又は分岐アルコキシ基（Ａは、非置換又は炭素数１～５の直鎖または分岐アルキル基で置換された飽和または不飽和５または６員環であり、該環は窒素原子、酸素原子、及び硫黄原子から独立に選択される１または２個の原子を含んでいてもよい）である、および
　Ｘが、酸素原子；硫黄原子；基－ＮＲ１５（Ｒ１５は、水素原子、炭素数１～５の直鎖又は分岐アルキル基、又は炭素数１～５の直鎖又は分岐アシル基である）である、（１）に記載の化合物またはその塩。
（１０）Ｒ１、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ８、及びＲ９が、水素原子である、
　Ｒ２及びＲ３が、メトキシ基、エトキシ基、又はプロポキシ基である、
　Ｒ１０及びＲ１１が、水素原子である、
　Ｘが、硫黄原子である、
　Ａが、非置換又は炭素数１～５の直鎖または分岐アルキル基で置換された、ピペリジニル基、ピペラジニル基、又はモルホリニル基である、および
　ｎが、０から４の整数である、（１１）に記載の化合物またはその塩。
　ある態様において、式（Ｉ）の化合物またはその塩は、以下の化合物またはその塩である：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000027
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000028
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000029
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000030
 および、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000031
 ［式中、Ｒ７は、ハロゲン原子である。］。
　本発明における好適なＷｎｔシグナル阻害剤は、以下から選択される化合物またはその塩である：
　ＫＹ０２１１１
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000032
 　ＫＹ０１０４１
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000033
 　Ｔ６１１６４
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000034
 　ＫＹ０２１１４
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000035
 　ＫＹ０１０４５
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000036
 　ＫＹ０１０４０
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000037
 　ＫＹ０２１０９
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000038
 　ＫＹ０１０４２
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000039
 　ＫＹ０１０４３
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000040
 　ＫＹ０１０４６
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000041
 　ＰＢ２８５２
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000042
 　Ｎ１１４７４
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000043
 　ＰＢ２５７２
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000044
 　ＰＢ２５７０
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000045
 　ＫＹ０２１０４
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000046
 　ＳＯ０８７
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000047
 　ＳＯ１０２
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000048
 　ＳＯ０９６
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000049
 　ＳＯ０９４
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000050
 　ＳＯ３０３１（ＫＹ０１－Ｉ）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000051
 　ＳＯ２０３１（ＫＹ０２－Ｉ）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000052
 　ＳＯ３０４２（ＫＹ０３－Ｉ）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000053
 　ＳＯ２０７７
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000054
　本発明における特に好適な式（Ｉ）の化合物またはその塩は、以下から選択される化合物またはその塩である：
　ＫＹ０２１１１
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000055
 　ＫＹ０１０４１
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000056
 　Ｔ６１１６４
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000057
 　ＫＹ０２１１４
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000058
 　ＫＹ０１０４５
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000059
 　ＫＹ０２１０４
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000060
 　ＳＯ０８７
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000061
 　ＳＯ１０２
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000062
 ＳＯ３０３１（ＫＹ０１－Ｉ）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000063
 ＳＯ２０３１（ＫＹ０２－Ｉ）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000064
 ＳＯ３０４２（ＫＹ０３－Ｉ）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000065
 ＳＯ２０７７
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000066
　式（Ｉ）の化合物は、公知の方法（J. Med. Chem., 1965, 8 (5), pp 734-735）（参照により本明細書に含まれる）により、あるいは国際公開第２０１２／０２６４９１号パンフレットに記載の方法に準じて、合成することができる。
　上記化合物は、例えば、J. Med. Chem., 1965, 8 (5), pp 734-735 （参照により本明細書に含まれる）に記載されている（Ｎ１１４７４、Ｔ６１１６４)。また、UkrOrgSynthesis社（ＰＢ２８５２、ＰＢ２５７２、ＰＢ２５７０）やENAMINE社（Ｔ６１１６４）などから入手可能である。
　本発明の心筋分化促進剤は、後述する本発明の多能性幹細胞の心筋細胞誘導方法にしたがい使用することができる。
　本発明の心筋分化促進用キットは、ＥＧＦ受容体阻害剤を含む。本発明の心筋分化促進用キットはさらに、Ｗｎｔシグナル阻害剤、Ｗｎｔシグナル活性化剤その他の心筋分化促進因子を含んでいてもよい。
　本発明の多能性幹細胞の心筋細胞誘導方法は、ＥＧＦ受容体阻害剤を含む培地中で多能性幹細胞を培養することを含む。本発明は、インビトロで実施される。本発明の方法に用いる培地は、一般的に多能性幹細胞の心筋分化に使用される培地（以下、心筋分化培地ともいう）であればよく、その組成は特に限定はされない。本発明の方法に用いる培地としては、ＩＭＤＭ培地を基本とした心筋分化培地（例えば、実施例で使用している培地)、ＤＭＥＭを基本とした心筋分化培地（例えば、ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地（Sigma）２００ｍｌ、ウシ胎児血清（GIBCO）５０ｍｌ、MEM non-essential amino acid solution （Sigma）２．５ｍｌ、ペニシリン－ストレプトマイシン（GIBCO）２．５ｍｌ、２００ｍＭ　Ｌ－グルタミン　２．５ｍｌ、２－メルカプトエタノール）、またはStemPro-34SFM（GIBCO）＋ＢＭＰ４（１０ｎｇ／ｍｌ）のような培地が例示される。
　ある態様において本発明は、血清を含まない培地（以下、血清不含培地ともいう）を用いる多能性幹細胞の心筋細胞誘導方法を提供する。血清不含培地を用いる場合、培地はアルブミンを含むことが好ましい。アルブミンとしては、ウシ血清アルブミン、ヒト血清アルブミンが挙げられる。アルブミンを含む血清不含培地を用いた場合、血清、サイトカイン、支持細胞（フィーダー細胞）等、アルブミン以外のタンパク質や、使用する多能性幹細胞とは異なる生物種に由来する成分（すなわち、異種成分）の非存在下で多能性幹細胞の心筋分化を誘導することができる。
　本発明の方法においては、一般的に多能性幹細胞の心筋分化に適した培養方法を用いることができる。培養方法としては、例えば、接着培養法、浮遊培養法、懸濁培養法等が挙げられる。ある態様において、本発明の方法は、ＥＮＤ２細胞のような支持細胞（フィーダー細胞）を使用しない。
　本発明の方法において、心筋分化培地における培養（以下、心筋分化培養ともいう）の開始からＥＧＦ受容体阻害剤を含む培地中での培養開始までの期間、およびＥＧＦ受容体阻害剤を含む培地中での培養期間は、適宜変更されうる。好適には、サルまたはヒトＥＳ細胞またはｉＰＳ細胞の場合、心筋分化培養の２、３、または４日目から１４日目までのうち２日間以上（具体的には、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、または１２日間）、好ましくは３～１０日間、より好ましくは４～１０日間、さらに好ましくは４～８日間、培養すればよい。例えば、心筋分化培養の２、３、または４日目から１０日目までのうち４～８日間、例えば心筋分化培養の２～１０日目（８日間）、２～９日目（７日間）、２～８日目（６日間）、３～１０日目（７日間）、３～９日目（６日間）、３～８日目（５日間）、４～１０日目（６日間）、４～９日目（５日間）、４～８日目（４日間）に実施することが好ましい。
　本発明の方法は、Ｗｎｔシグナル活性化剤を含む培地中で多能性幹細胞を培養すること、および／またはＷｎｔシグナル阻害剤を含む培地中で多能性幹細胞を培養することをさらに含んでもよい。
　ある態様において、本発明の方法は、ＥＧＦ受容体阻害剤とＷｎｔシグナル阻害剤とを含む培地中で多能性幹細胞を培養する工程を含む。本方法は、ＥＧＦ受容体阻害剤とＷｎｔシグナル阻害剤とを含む培地中で多能性幹細胞を培養する工程に加えて、ＥＧＦ受容体阻害剤またはＷｎｔシグナル阻害剤のいずれか一方を含む培地中で細胞を培養する工程を含んでもよい。例えば、ＥＧＦ受容体阻害剤を含みＷｎｔシグナル阻害剤を含まない培地、またはＷｎｔシグナル阻害剤を含みＥＧＦ受容体阻害剤を含まない培地中で細胞を１～２日間培養した後、培地をＥＧＦ受容体阻害剤とＷｎｔシグナル阻害剤の両方を含む培地に交換し、培養を継続してもよい。あるいは、培養期間全体においてＥＧＦ受容体阻害剤とＷｎｔシグナル阻害剤との両方を含む培地を使用してもよい。また、ＥＧＦ受容体阻害剤とＷｎｔシグナル阻害剤との両方を含む培地中での培養後、いずれか一方のみを含む培地中で細胞を培養する期間があってもよい。
　ある態様において、本発明の方法は、以下の工程を含む：
（１）多能性幹細胞をＷｎｔシグナル活性化剤を含む培地中で培養する工程、および；
（２）工程（１）の後、前記細胞をＥＧＦ受容体阻害剤を含む培地中で培養する工程。
　前記方法において、心筋分化培養の開始から工程（１）の開始までの期間、工程（１）の終了から工程（２）の開始までの期間、および工程（１）および（２）の培養期間は適宜変更されうる。工程（２）は、工程（１）の終了直後から開始してもよいし、工程（１）の終了から一定期間後に開始してもよい。Ｗｎｔシグナル活性化剤は、多能性幹細胞の心筋分化の初期段階に添加すればよい。ここで、多能性幹細胞の心筋分化の初期段階とは、中胚葉マーカー遺伝子の発現上昇が起こる、多能性幹細胞から中胚葉への分化誘導期を意味する。中胚葉への分化は、中胚葉マーカー遺伝子の発現を調べることにより決定することができる。中胚葉マーカー遺伝子としては、Ｔ、ＭＩＸＬ１、ＮＯＤＡＬ等が挙げられる。
　例えば、サルまたはヒトＥＳ細胞またはｉＰＳ細胞の場合、心筋分化培養の０～２日目または０～３日目に、すなわち心筋分化培養開始から２または３日間、工程（１）を実施し、次いで、心筋分化培養の２、３、または４日目から１４日目までのうち２日間以上（具体的には、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、または１２日間）、好ましくは３～１０日間、より好ましくは４～１０日間、さらに好ましくは４～８日間、工程（２）を実施すればよい。工程（２）は、例えば、心筋分化培養の２、３、または４日目から１０日目までのうち４～８日間、例えば心筋分化培養の２～１０日目（８日間）、２～９日目（７日間）、２～８日目（６日間）、３～１０日目（７日間）、３～９日目（６日間）、３～８日目（５日間）、４～１０日目（６日間）、４～９日目（５日間）、または４～８日目（４日間）に実施することが好ましい。
　前記方法において、好ましくは、工程（２）の培養期間の全体または一部において、ＥＧＦ受容体阻害剤に加えてＷｎｔシグナル阻害剤をさらに含む培地中で細胞を培養する。Ｗｎｔシグナル阻害剤は、多能性幹細胞の心筋分化の中期段階に添加すればよい。ここで、多能性幹細胞の心筋分化の中期段階とは、中胚葉から心筋細胞への分化誘導期を意味する。心筋細胞への分化は、拍動心筋細胞の数、心筋マーカーの発現、イオンチャネルの発現、電気生理学的刺激に対する反応等により確認することができる。心筋マーカーとしては、αＭＨＣ、βＭＨＣ、ｃＴｎＴ、αアクチニン、およびＮＫＸ２．５が挙げられる。また、イオンチャネルとしては、ＨＣＮ４、Ｎａｖ１．５、Ｃａｖ１．２、Ｃａｖ３．２、ＨＥＲＧ１ｂ、およびＫＣＮＱ１が挙げられる。
　例えば、ＥＧＦ受容体阻害剤を含みＷｎｔシグナル阻害剤を含まない培地中で細胞を１～２日間、好ましくは１日間培養した後、培地をＥＧＦ受容体阻害剤とＷｎｔシグナル阻害剤とを含む培地に交換し、培養を継続する。あるいは、工程（２）の培養期間全体においてＥＧＦ受容体阻害剤とＷｎｔシグナル阻害剤の両方を含む培地を使用してもよい。また、Ｗｎｔシグナル阻害剤を含みＥＧＦ受容体阻害剤を含まない培地中で細胞を１～２日間培養した後、培地をＥＧＦ受容体阻害剤とＷｎｔシグナル阻害剤とを含む培地に交換し、培養を継続してもよい。さらに、ＥＧＦ受容体阻害剤とＷｎｔシグナル阻害剤との両方を含む培地中での培養後、いずれか一方のみを含む培地中で細胞を培養する期間があってもよい。本方法によれば、浮遊培養法によっても効率的に多能性幹細胞の心筋分化を誘導することができる。
　本発明におけるＥＧＦ受容体阻害剤の濃度は、特に限定はされない。ＥＧＦ受容体阻害剤としてゲフィチニブまたはＡＧ１４７８を使用する場合、最終濃度１００ｎＭ～１００μＭ、好ましくは１μＭ～２０μＭで使用すればよい。ＥＧＦ受容体阻害剤としてＰＰ３を使用する場合、最終濃度１μＭ～１ｍＭ、好ましくは１０μＭ～１００μＭで使用すればよい。
　本発明におけるＷｎｔシグナル活性化剤およびＷｎｔシグナル阻害剤の濃度は、特に限定はされない。Ｗｎｔシグナル活性化剤としてＢＩＯまたはＣＨＩＲ９９０２１を使用する場合、最終濃度１００ｎＭ～１００μＭ、好ましくは１μＭ～１０μＭで使用すればよい。Ｗｎｔシグナル阻害剤としてＩＷＰ２、ＸＡＶ９３９、またはＩＷＲ１を用いる場合、例えば最終濃度０.５～２０μＭ、好ましくは１～１０μＭで使用すればよい。Ｗｎｔシグナル阻害剤として式（Ｉ）の化合物またはその塩を用いる場合、使用する化合物またはその塩に応じて、例えば最終濃度０.１～２０μＭ、好ましくは０．１～１０μＭ、より好ましくは１～１０μＭで使用すればよい。
　本発明の方法は、心筋細胞の製造に用いることができる。心筋細胞が得られたことは、拍動心筋細胞の数、心筋マーカーの発現、イオンチャネルの発現、電気生理学的刺激に対する反応等により確認することができる。本発明の方法により得られた心筋細胞は、インビトロにおける薬剤安全性試験に、あるいは心臓疾患などに対する移植用心筋細胞として、使用することができる。
　さらなる態様において、本発明は、前記式（Ｉ）の化合物またはその塩を含む多能性幹細胞の心筋分化促進剤であって、ＥＧＦ受容体阻害剤と併用される心筋分化促進剤を提供する。本態様における式（Ｉ）の化合物またはその塩およびＥＧＦ受容体阻害剤は、「ＥＧＦ受容体阻害剤を含む、多能性幹細胞の心筋分化促進剤」について説明のとおりである。
　さらなる態様において、本発明は、多能性幹細胞の心筋分化促進のためのＥＧＦ受容体阻害剤の使用、および多能性幹細胞の心筋分化促進剤の製造のためのＥＧＦ受容体阻害剤の使用を提供する。かかる態様は、本発明の心筋分化促進剤および心筋分化誘導方法に関する記載に準じて実施することができる。
　以下、実施例によりさらに本発明を説明するが、本発明は如何なる意味においても本実施例により限定されない。
１．サルＥＳ細胞の接着培養系におけるＥＧＦ受容体阻害剤の心筋分化促進効果（１）
　心筋分化マーカーであるα－ＭＨＣ遺伝子のプロモータを持つＧＦＰ遺伝子を導入したサルＥＳ細胞を６ウェルプレート（旭硝子/ 5816-006 ：Ezviewカルチャープレート）上に播種（２．０×１０５細胞／ウェル）し、ＩＭＤＭ培地を基本とした２０％ＦＢＳ（GIBCO 10099-141）含有心筋分化培地（IMDM (Sigma) （20% FBS (Gibco)、1% MEM 非必須アミノ酸溶液 (Sigma)、1% ペニシリン-ストレプトマイシン (Gibco)、2 mM L-グルタミン (Sigma)、0.001% 2-メルカプトエタノール (Gibco)、および0.005N NaOH含有））で培養した。培養４～８日目に、ＫＹ０２１１１（１０μＭ）と、ＥＧＦ受容体阻害剤であるＡＧ１４７８または下記のキナーゼ阻害剤のいずれかを投与した。

ＳＢ２０３５８０（２０μＭ）：ｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤
ＢＩＲＢ７９６（１０μＭ）：ｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤（ＳＢよりもｐ３８阻害活性が強い。）
Ｕ０１２６（１０μＭ）：ＥＲＫ／ＭＡＰＫＫ（ＭＥＫＫ）阻害剤
ＯＤＱ（２０μＭ）：ＮＯ感受性グアニル酸シクラーゼ阻害剤（ＮＯによるｃＧＭＰ産生を阻害する。）
チロホスチンＡＧ４９０（５μＭ）：ＪＡＫ２／３阻害剤
ＡＧ１４７８（２０μＭ）：ＥＧＦ受容体チロシンキナーゼおよびＥｒｂ－Ｂ２受容体阻害剤

　培養１０日目にＧＦＰ蛍光量が増加している化合物を、ＨＣＳ（high contents screening）システム（オリンパスIX81倒立顕微鏡およびモレキュラーデバイス/MetaMorph イメージングシステム）を用いてＧＦＰ蛍光量を測定することで検出した。
　その結果、ＥＧＦ受容体阻害剤であるＡＧ１４７８が心筋分化促進効果を有することが見出された（図１、２）。また、他のＥＧＦ受容体阻害剤であるゲフィチニブも、心筋分化促進効果を有することが分かった（図３）。さらに、ＡＧ１４７８やゲフィチニブは、Ｗｎｔシグナル阻害剤であるＫＹ０２１１１やＸＡＶ９３９（ＷＡＫＯ）の同時添加により、相乗的に心筋分化を促進することが分かった（図４）。
２．ヒトＥＳ細胞およびｉＰＳ細胞の浮遊培養系におけるＥＧＦ受容体阻害剤の心筋分化促進効果
　マウスフィーダー細胞で継代維持したヒトＥＳ細胞またはｉＰＳ細胞を回収し、そのヒトＥＳ細胞またはｉＰＳ細胞コロニー（３－１０×１０６細胞／ウェル）を、Ultra-lowカルチャーディッシュの６ウェルプレート（CORNING 3261）に播種し、ＩＭＤＭを基本とした既知組成培地（IMDM (Sigma)（1% MEM 非必須アミノ酸溶液 (Sigma)、1% ペニシリン-ストレプトマイシン (Gibco)、2 mM L-グルタミン (Sigma)、0.5 mM L-カルニチン (Sigma)、0.001% 2-メルカプトエタノール (Gibco)、および0.4% ヒト血清アルブミン (Sigma)含有））を用いて浮遊培養で３０日間培養した（図５）。培養０～２日目に（２日間）ＣＨＩＲ９９０２１（Ａｘｏｎ）（４μＭ）とＢＩＯ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）（１μＭ）を添加し、培養３～９日目に（６日間）ＫＹ０２１１１（１０μＭ）とＸＡＶ９３９（１μＭ）を添加した。また、ＫＹ０２１１１とＸＡＶ９３９に加えて、ＥＧＦ受容体阻害剤であるＡＧ１４７８あるいはゲフィチニブを、５～２０μＭの濃度で、培養０～２日目（２日間）、２～５日目（３日間）、３～７日目（４日間）、あるいは２～９日目（７日間）添加した。心筋分化効果は、培養３０日目に、心筋特異的マーカーである心筋トロポニンＴ（ｃＴｎＴ）に対する抗体を用いたフローサイトメトリーにより心筋細胞の割合を解析して評価した。
　その結果、ヒトＥＳ細胞（ＫｈＥＳ－３）において、ゲフィチニブ（１０μＭ）の０～２日目の添加では心筋分化促進効果は見られなかったが、２～５日目および３～７日目の添加では顕著な分化効率の増加が見られた（図６）。さらに、ヒトＥＳ細胞（ＫｈＥＳ－３）とヒトｉＰＳ細胞（ＩＭＲ９０－１）について、ＡＧ１４７８またはゲフィチニブを培養２～９日目に５～２０μＭ添加したところ、ヒトＥＳ細胞とｉＰＳ細胞の両方について心筋分化効率の増加が見られ、特にＡＧ１４７８の２０μＭ添加では心筋細胞の割合が９２～９５％まで顕著に上昇した（図７）。また、ＡＧ１４７８とゲフィチニブは、それぞれ単独（ＫＹ０２１１１およびＸＡＶ９３９の添加なし）でも心筋分化促進効果を示し、ＸＡＶ９３９のみとの組み合わせ（ＸＡＶ＋ＡＧ１４７８またはゲフィチニブ）においても分化促進効果が確認された（図８）。これらの結果は、ＥＧＦ受容体阻害剤とＷｎｔシグナル活性化剤および／またはＷｎｔシグナル阻害剤とを組み合わせることで相乗的な強い心筋分化促進効果が得られることを示す。
３．フィーダーフリーのヒトｉＰＳ細胞スフェア培養系におけるＥＧＦ受容体阻害剤の心筋分化促進効果
　ヒトｉＰＳ細胞株（２５３Ｇ１）に対して支持細胞なし（フィーダーフリー）のスフェア培養を行った。具体的には、マウスフィーダー細胞で継代維持した２５３Ｇ１細胞を回収し、その細胞塊を５０μｍのメッシュ（CellTrics, PARTEC04004-2327）に通して均一な細胞塊（８０－１２０μｍ）を得た後、Ultra-lowカルチャーディッシュの６ウェルプレート（CORNING 3261）に播種し、３％メチルセルロース（R＆D, HSC001）を含んだｍＴｅＳＲ１培地（Stem Cell Technology 05850）でｉＰＳ細胞コロニーの大きさが約２００－３００μｍになるまで浮遊培養した。このフィーダーフリーのスフェア培養法を用いて上記の手順を繰り返すことで２０継代以上培養維持した細胞に対し、ＩＭＤＭを基本とした既知組成培地（IMDM (Sigma)（1% MEM 非必須アミノ酸溶液 (Sigma)、1% ペニシリン-ストレプトマイシン (Gibco)、2 mM L-グルタミン (Sigma)、0.5 mM L-カルニチン (Sigma)、0.001% 2-メルカプトエタノール (Gibco)、および0.4% ヒト血清アルブミン (Sigma)含有）を培地交換によりそのまま添加し、浮遊培養で３０日間培養した（図５）。培養０～２日目に（２日間）ＣＨＩＲ９９０２１（４μＭ）とＢＩＯ（１μＭ）を添加し、培養３～９日目に（６日間）ＫＹ０２１１１（１０μＭ）とＸＡＶ９３９（１μＭ）を添加した。また、ＫＹ０２１１１とＸＡＶ９３９に加えて、ＥＧＦ受容体阻害剤であるＡＧ１４７８あるいはゲフィチニブを、１０μＭの濃度で、３～９日目（６日間）添加した。心筋分化効果は、培養３０日目に、心筋特異的マーカーである心筋トロポニンＴ（ｃＴｎＴ）に対する抗体を用いたフローサイトメトリーにより心筋細胞の割合を解析して評価した。
　その結果、ＡＧ１４７８あるいはゲフィチニブの添加により、分化誘導された心筋細胞の割合が３４％から５０％近くにまで増加した（図９）。すなわち、マウスフィーダー細胞上のヒトｉＰＳ細胞だけではなく、フィーダーフリーのスフェア培養系におけるｉＰＳ細胞に対しても、ＥＧＦ受容体阻害剤が心筋分化効率を高める効果が持つことが分かった。
４．サルＥＳ細胞の接着培養系におけるＥＧＦ受容体阻害剤の心筋分化促進効果（２）
　上記１と同様にして、サルＥＳ細胞においてＥＧＦ受容体阻害剤であるＰＰ３のの心筋分化促進効果を検討した。培養４～８日目に、ＫＹ０２１１１（１０μＭ）と、ＰＰ３（３μＭ、１０μＭ、３０μＭ、または１００μＭ）を投与した。その結果、ＰＰ３はＫＹ０２１１１の心筋分化促進効果を増強することが分かった（図１０）。ＰＰ３は、ＡＧ１４７８やゲフィチニブと骨格構造が異なること、またＥＧＦＲをリン酸化するＳｒｃキナーゼに対する阻害作用を有さないＥＧＦＲ阻害剤であることから、この結果はＥＧＦ受容体からのシグナル伝達を阻害する物質が心筋分化促進効果を有することを示す。
製造例
ＳＯ３０３１（ＫＹ０１－Ｉ）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000067
 　２－アミノ－６－ヨードベンゾチアゾール（２００ｍｇ，０．７２３ｍｍｏｌ）、３，４－ジメトキシフェニル酢酸（１５７ｍｇ，０．７９５ｍｍｏｌ）のＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（３ｍｌ）溶液に、Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（１３９μｌ，０．８０３ｍｍｏｌ）、Ｏ－（６－クロロベンゾトリアゾール－１－イル）－Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスファート（３６０ｍｇ，０．８７０ｍｍｏｌ）を加えて終夜、室温にて攪拌した。反応終了後、酢酸エチルにて希釈し、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液、飽和塩化ナトリウム水溶液にて洗浄した。無水硫酸ナトリウムで乾燥し、減圧下で溶媒を留去した。残渣をエタノールにて再結晶し、２－（２－（３，４－ジメトキシフェニル）アセトアミド）－６－ヨードベンゾチアゾールを１６７ｍｇ、収率５０％で得た。

1H NMR (DMSO-d6): δ 12.61 (s, 1H), 8.37 (s, 1H), 7.73-7.69 (m ,1H), 7.54 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 6.97-6.84 (m, 3H), 3.75-3.72 (m, 8H).
MS (ESI) Found; 455 [M+H]+
ＳＯ２０３１（ＫＹ０２－Ｉ）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000068
 　４－ヨードアニリン（１．００ｇ，４．５７ｍｍｏｌ）のジクロロメタン（３ｍｌ）溶液に、チオカルボニルジイミダゾール（９７６ｍｇ，５．４７ｍｍｏｌ）を加えて１．５時間、室温にて攪拌した。２５％アンモニア水（３ｍｌ）を加えて終夜、室温にて攪拌した。反応終了後、溶媒を減圧下で留去し、析出物を濾過して１－（４－ヨードフェニル）チオウレアを８８９ｍｇ、収率５９％で得た。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000069
 　１－（４－ヨードフェニル）チオウレア（８８９ｍｇ，３．１９ｍｍｏｌ）のクロロホルム（７ｍｌ）懸濁液に、臭素（３２８μｌ，６．４０ｍｍｏｌ）を加えて加熱還流し、６時間攪拌した。反応終了後、溶媒を留去し、ジクロロメタンを加えて、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液、飽和塩化ナトリウム水溶液にて洗浄した。無水硫酸ナトリウムで乾燥し、減圧下で溶媒を留去後、析出物を濾過して２－アミノ－６－ヨードベンゾチアゾールを６５０ｍｇ、収率７３％で得た。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000070
 　２－アミノ－６－ヨードベンゾチアゾール（１００ｍｇ，０．３６２ｍｍｏｌ）、３－（３，４－ジメトキシフェニル）プロピオン酸（９１．４ｍｇ，０．４３５ｍｍｏｌ）のＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（２ｍｌ）溶液に、Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（６９．４μｌ，０．３９８ｍｍｏｌ）、Ｏ－（６－クロロベンゾトリアゾール－１－イル）－Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスファート（１８０ｍｇ，０．４３５ｍｍｏｌ）を加えて終夜、室温にて攪拌した。反応終了後、酢酸エチルにて希釈し、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液、飽和塩化ナトリウム水溶液にて洗浄した。無水硫酸ナトリウムで乾燥し、減圧下で溶媒を留去した。残渣をエタノールにて再結晶し、２－（３－（３，４－ジメトキシフェニル）プロパンアミド）－６－ヨードベンゾチアゾールを８３ｍｇ、収率４８％で得た。

1H NMR (DMSO-d6): δ 12.42 (s, 1H), 8.37 (s, 1H), 7.72-7.69 (m, 1H), 7.52 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 6.85-6.83 (m, 2H), 6.75-6.72 (m, 1H), 3.71 (s, 3H), 3.69 (s, 3H), 2.90-2.76 (m, 4H).
MS (ESI) Found; 469 [M+H]+
ＳＯ３０４２（ＫＹ０３－Ｉ）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000071
 　２－アミノ－６－ヨードベンゾチアゾール（２５０ｍｇ，０．９０５ｍｍｏｌ），４－（３，４－ジメトキシフェニル）ブタン酸（２２４ｍｇ，０．９９５ｍｍｏｌ）のＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（３ｍｌ）溶液に、Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（１７４μｌ，０．９９５ｍｍｏｌ）、Ｏ－（６－クロロベンゾトリアゾール－１－イル）－Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスファート（４５０ｍｇ，１．０９ｍｍｏｌ）を加えて終夜、室温にて攪拌した。反応終了後、酢酸エチルにて希釈し、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液、飽和塩化ナトリウム水溶液にて洗浄した。無水硫酸ナトリウムで乾燥し、減圧下で溶媒を留去した。残渣をエタノールにて再結晶し、２－（４－（３，４－ジメトキシフェニル）ブタンアミド）－６－ヨードベンゾチアゾールを１３１ｍｇ、収率３０％で得た。

1H NMR (DMSO-d6): δ 12.37 (s, 1H), 8.37 (s, 1H), 7.72-7.69 (m, 1H), 7.52 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 6.86-6.79 (m, 2H), 6.70 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 3.73 (s, 3H), 3.70 (s, 3H), 2.58-2.48 (m, 4H), 1.96-1.86 (m, 2H).
MS (ESI) Found; 483 [M+H]+
ＳＯ２０７７
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000072
 　４－ヒドロキシ－３－メトキシフェニルプロピオン酸（５００ｍｇ，２．５４ｍｍｏｌ）のＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（５ｍｌ）溶液に、炭酸カリウム（８８１ｍｇ，６．３７ｍｍｏｌ）、１－ブロモプロパン（６９２μｌ，７．６５ｍｍｏｌ）を加えて、室温にて終夜攪拌した。反応終了後、酢酸エチルにて希釈し、水、飽和塩化ナトリウム水溶液にて洗浄した。無水硫酸ナトリウムで乾燥し、減圧下で溶媒を留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ｎ－ヘキサン／酢酸エチル＝４／１）にて精製し、プロピル　３－（３－メトキシ－４－プロポキシフェニル）プロパノエートを５９０ｍｇ、収率８２％で得た。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000073
 　プロピル　３－（３－メトキシ－４－プロポキシフェニル）プロパノエート（５９０ｍｇ，２．１０ｍｍｏｌ）を１，４－ジオキサンに溶かし、５ｍｏｌ／ｌ水酸化ナトリウム水溶液（１．６８ｍｌ）を加えて室温にて終夜攪拌した。反応終了後、６ｍｏｌ／ｌ塩酸を加えて、酢酸エチルにて抽出した。有機層を飽和塩化ナトリウム水溶液で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。減圧下で溶媒を留去し、３－（３－メトキシ－４－プロポキシフェニル）プロピオン酸を４３８ｍｇ、収率８７％で得た。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000074
 　２－アミノ－６－ヨードベンゾチアゾール（２００ｍｇ，０．７２３ｍｍｏｌ）、３－（３－メトキシ－４－プロポキシフェニル）プロピオン酸（２００ｍｇ，０．８３９ｍｍｏｌ）のＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（３ｍｌ）溶液に、Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（１４０μｌ，０．８０３ｍｍｏｌ）、Ｏ－（６－クロロベンゾトリアゾール－１－イル）－Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスファート（３６０ｍｇ，０．８７０ｍｍｏｌ）を加えて終夜、室温にて攪拌した。反応終了後、酢酸エチルにて希釈し、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液、飽和塩化ナトリウム水溶液にて洗浄した。無水硫酸ナトリウムで乾燥し、減圧下で溶媒を留去した。残渣をエタノールにて再結晶し、２－（３－（３－メトキシ－４－プロポキシフェニル）プロパンアミド）－６－ヨードベンゾチアゾールを２１７ｍｇ、収率６０％で得た。

1H NMR (DMSO-d6): δ 12.42 (s, 1H), 8.38-8.37 (m, 1H), 7.72-7.69 (m, 1H), 7.54-7.51 (m, 1H), 6.85-6.82 (m, 2H), 6.72 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 3.86-3.82 (m, 2H), 3.72 (s, 3H), 2.87-2.78 (m, 4H), 1.72-1.65 (m, 2H), 094 (t, J = 7.3 Hz, 3H).
MS (ESI) Found; 497 [M+H]+
　ＳＯ３０３１（ＫＹ０１－Ｉ）、ＳＯ２０３１（ＫＹ０２－Ｉ）、ＳＯ３０４２（ＫＹ０３－Ｉ）、およびＳＯ２０７７が心筋分化促進効果を有することを、国際公開第２０１２／０２６４９１号に記載の実施例と同様の方法により確認した。

Claims (19)

  1. 　ＥＧＦ受容体阻害剤を含む、多能性幹細胞の心筋分化促進剤。
  2. 　ＥＧＦ受容体阻害剤が、ＡＧ１４７８、ゲフィチニブ、アファチニブ、ＡＲＲＹ３３４５４３、ＡＳＴ１３０６、ＡＺＤ８９３１、ＢＩＢＵ１３６１、ＢＩＢＸ１３８２、ＢＰＤＱ、ＢＰＩＱ－Ｉ、ＢＰＩＱ－ＩＩ、カネルチニブ、ＣＬ－３８７，７８５、ＣＵＤＣ１０１、ダコミチニブ、バンデタニブ、EGFR Inhibitor III（CAS 733009-42-2）、EGFR/ErbB-2 Inhibitor（CAS 179248-61-4）、エルロチニブ、ＧＷ５８３３４０、ＧＷ２９７４、ＨＤＳ０２９、ラパチニブ、ＷＨＩ－Ｐ１５４、ＯＳＩ－４２０、ＰＤ１５３０３５、ＰＤ１６８３９３、ＰＤ１７４２６５、ペリチニブ、Ｃｏｍｐｏｕｎｄ　５６、ＸＬ６５７、ＰＰ３、ＡＧ－４９０、ＡＧ５５５、チロホスチンＢ４２、チロホスチンＢ４４、ＡＧ５５６、ＡＧ４９４、ＡＧ８２５、ＲＧ－１３０２２、ＤＡＰＨ、EGFR Inhibitor（CAS 879127-07-8）、エルブスタチンアナログ（CAS 63177-57-1）、ＪＮＪ２８８７１０６３、チロホスチン４７、ラベンダスチンＡ、ラベンダスチンＣ、ラベンダスチンＣメチルエステル、ＬＦＭ－Ａ１２、ＴＡＫ１６５、ＴＡＫ２８５、チロホスチン５１、チロホスチンＡＧ１８３、チロホスチンＡＧ５２８、チロホスチンＡＧ９９、チロホスチンＲＧ１４６２０、ＷＺ３１４６、ＷＺ４００２、ＷＺ８０４０、ブテイン、およびチロホスチンＡＧ１１２から選択される、請求項１記載の心筋分化促進剤。
  3. 　ＥＧＦ受容体阻害剤が、ＡＧ１４７８、ゲフィチニブ、およびＰＰ３から選択される、請求項２記載の心筋分化促進剤。
  4. 　１以上のＷｎｔシグナル阻害剤と併用される、請求項１～３のいずれかに記載の心筋分化促進剤。
  5. 　Ｗｎｔシグナル阻害剤が以下の式（Ｉ）の化合物またはその塩である、請求項４記載の心筋分化促進剤：
    　式（Ｉ）：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
     ［式中、
    　Ｒ１－Ｒ５は、各々独立して、水素原子；ハロゲン原子；水酸基；炭素数１～５の直鎖又は分岐アルコキシ基；非置換又はハロゲン原子で置換された炭素数１～５の直鎖又は分岐アルキル基；又は基－ＮＲ１２Ｒ１３（Ｒ１２及びＲ１３は、各々独立して、水素原子、酸素原子、又は非置換又はハロゲン原子で置換された炭素数１～５の直鎖または分岐アルキル基である）である、ここでＲ１－Ｒ５のうち隣接する２つが一緒になって－Ｏ－ＣＨ２－Ｏ－または－Ｏ－（ＣＨ２）２－Ｏ－を形成していてもよい、
    　Ｒ６－Ｒ９は、各々独立して、水素原子；ハロゲン原子；水酸基；炭素数１～５の直鎖又は分岐アルコキシ基；基－Ｃ（Ｏ）Ａで置換された炭素数１～５の直鎖又は分岐アルコキシ基（Ａは、非置換又は炭素数１～５の直鎖または分岐アルキル基で置換された飽和または不飽和５または６員環であり、該環は窒素原子、酸素原子、及び硫黄原子から独立に選択される１または２個の原子を含んでいてもよい）；非置換又はハロゲン原子で置換された炭素数１～５の直鎖又は分岐アルキル基；又は基－ＮＲ１２Ｒ１３（Ｒ１２及びＲ１３は、各々独立して、水素原子、酸素原子、又は非置換又はハロゲン原子で置換された炭素数１～５の直鎖または分岐アルキル基である）である、ここでＲ６－Ｒ９のうち隣接する２つが一緒になって－Ｏ－ＣＨ２－Ｏ－または－Ｏ－（ＣＨ２）２－Ｏ－を形成していてもよい、
    　Ｒ１０－Ｒ１１は、各々独立して、水素原子；又は炭素数１～５の直鎖又は分岐アルキル基である、
    　Ｘは、－ＣＲ１４（Ｒ１４は、水素原子、ハロゲン原子、水酸基、炭素数１～５の直鎖又は分岐アルコキシ基、又は非置換又はハロゲン原子で置換された炭素数１～５の直鎖又は分岐アルキル基である）；酸素原子；硫黄原子；セレン原子；又は基－ＮＲ１５（Ｒ１５は、水素原子、炭素数１～５の直鎖又は分岐アルキル基、又は炭素数１～５の直鎖又は分岐アシル基である）である、および
    　ｎは、０から６の整数である］。
  6. 　式（Ｉ）の化合物またはその塩において、
    　Ｒ１、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ８、Ｒ９、Ｒ１０及びＲ１１が水素原子である、
    　Ｒ２及びＲ３が、メトキシ基、エトキシ基、又はプロポキシ基である、
    　Ｒ７が、ハロゲン原子である
    　Ｘが、硫黄原子である、および
    　ｎが、０から４の整数である、請求項５記載の心筋分化促進剤。
  7. 　式（Ｉ）の化合物またはその塩において、
    　Ｒ２が、メトキシ基である、および
    　Ｒ３が、メトキシ基、エトキシ基、又はプロポキシ基である、請求項６記載の心筋分化促進剤。
  8. 　Ｗｎｔシグナル阻害剤が以下からなる群から選択される化合物またはその塩である、請求項４記載の心筋分化促進剤：
    　ＫＹ０２１１１
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
     　ＫＹ０１０４１
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
     　Ｔ６１１６４
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
     　ＫＹ０２１１４
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
     　ＫＹ０１０４５
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000006
     　ＫＹ０１０４０
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000007
     　ＫＹ０２１０９
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000008
     　ＫＹ０１０４２
    　ＫＹ０１０４３
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000010
     　ＫＹ０１０４６
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000011
     　ＰＢ２８５２
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000012
     　Ｎ１１４７４
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000013
     　ＰＢ２５７２
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000014
     　ＰＢ２５７０
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000015
     　ＫＹ０２１０４
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000016
     　ＳＯ０８７
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000017
     　ＳＯ１０２
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000018
     　ＳＯ０９６
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000019
     　ＳＯ０９４
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000020
     ＳＯ３０３１（ＫＹ０１－Ｉ）
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000021
     ＳＯ２０３１（ＫＹ０２－Ｉ）
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000022
     ＳＯ３０４２（ＫＹ０３－Ｉ）
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000023
     ＳＯ２０７７
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000024
     。
  9. 　Ｗｎｔシグナル阻害剤がＩＷＰ２、ＸＡＶ９３９、およびＩＷＲ１からなる群から選択される、請求項４に記載の心筋分化促進剤。
  10. 　１以上のＷｎｔシグナル活性化剤と併用される、請求項１～９のいずれかに記載の心筋分化促進剤。
  11. 　Ｗｎｔシグナル活性化剤がＢＩＯおよびＣＨＩＲ９９０２１からなる群から選択される、請求項１０記載の心筋分化促進剤。
  12. 　ＥＧＦ受容体阻害剤を含む、心筋分化促進用キット。
  13. 　ＥＧＦ受容体阻害剤を含む培地中で多能性幹細胞を培養することを含む、インビトロにおける多能性幹細胞の心筋分化誘導方法。
  14. 　Ｗｎｔシグナル活性化剤を含む培地中で多能性幹細胞を培養すること、および／またはＷｎｔシグナル阻害剤を含む培地中で多能性幹細胞を培養することをさらに含む、請求項１３記載の方法。
  15. 　以下の工程を含む、請求項１３記載の方法：
    （１）多能性幹細胞をＷｎｔシグナル活性化剤を含む培地中で培養する工程、および；
    （２）工程（１）の後、前記細胞をＥＧＦ受容体阻害剤を含む培地中で培養する工程。
  16. 　工程（２）の培養期間の全体または一部において、ＥＧＦ受容体阻害剤およびＷｎｔシグナル阻害剤を含む培地中で細胞を培養する、請求項１５記載の方法。
  17. 　培地がアルブミン以外のタンパク質を含まない、請求項１３～１６のいずれかに記載の方法。
  18. 　浮遊培養により行われる、請求項１３～１７のいずれかに記載の方法。
  19. 　心筋細胞の製造方法である、請求項１３～１８のいずれかに記載の方法。
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