WO2014027864A1 - 노화 및 치매의 예방 및/또는 치료 활성을 갖는 유산균 - Google Patents

노화 및 치매의 예방 및/또는 치료 활성을 갖는 유산균 Download PDF

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정일훈
정명아
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    • C12R2001/25—Lactobacillus plantarum

Definitions

  • the present invention relates to a novel lactic acid bacteria isolated from kimchi, and more specifically, Lactobacillus pentosus var. Plantarum C29 and Lactobacillus ( Lactobacillus pentosus var. Plantarum ) having a preventive and / or therapeutic activity of aging and dementia Lactobacillus curvatus C3.
  • the process of aging is influenced by a combination of genetic, environmental, and lifestyle interactions, and is accompanied by a variety of morphological and biochemical changes.
  • increased oxidative stress and increased inflammatory response are involved in aging. It is considered to be the main cause.
  • Oxidative stress can be caused by increased production of reactive oxygen radicals (ROS) or decreased antioxidant defense mechanisms in the body, resulting in the destruction of biopolymers such as DNA, cell damage, aging, and dementia.
  • ROS reactive oxygen radicals
  • biopolymers such as DNA, cell damage, aging, and dementia.
  • Adler et al. (Adler AS, Sinha S, Kawahara TL, Zhang JY, Segal E, Chang HY.Motif module map reveals enforcement of aging by continual NF-kappaB activity.Genes Dev. 2007; 21: 3244-57)
  • the association of NF- ⁇ B activating motifs with the units regulating the aging process in tissues and experimental animal tissues demonstrates that the inflammatory process mediated by NF- ⁇ B is closely associated with the aging process.
  • aging activates PI3K / AKT, and it is known that phosphorylation of FOXO3 does not inhibit ROS production, resulting in genetic variation.
  • Dementia one of the aging diseases, is caused by chronic or progressive disease of the brain, degeneration of brain tissue, degeneration, and aging central nervous system infections (such as neurosyphilis, tuberculous meningitis, viral encephalitis), cerebral infarction, brain injury, and toxic metabolism.
  • Disorders, neurological diseases (Parkinson's disease), etc. are known to be the leading cause of dementia.
  • Dementia includes Alzheimer's disease, vascular dementia, and other types of dementia. 50-60% of dementia patients aged 65 or older in Korea are Alzheimer's dementia, 15-30% are vascular dementia, and the remaining 10-15% are dementia. It is a combination of these two diseases.
  • Beta-amyloid (Aß), a waste product in the brain, is known to be a major cause of Alzheimer's dementia. Many drugs have been tried to treat Alzheimer's dementia. Although acetylcholinesterease inhibitors that act on acetylcholine, one of the important neurotransmitters in the brain, lacked in Alzheimer's dementia patients, it is the only one used as a therapeutic agent, but the drug shows partial improvement in cognitive function. It is known to have no effect on the progression of Alzheimer's disease, and it is required to develop an effective dementia prevention or treatment.
  • lactic acid bacteria have been used for a long time, and beneficial effects such as intestinal action, anticancer effect, immune enhancing effect of lactic acid bacteria have been reported. Accordingly, the present inventors have studied to find lactic acid bacteria having a beneficial effect on aging and dementia, and confirmed that the new lactic acid bacteria isolated from kimchi have a prophylactic or therapeutic effect on aging and dementia.
  • An object of the present invention is to provide a lactic acid bacterium having a prophylactic or therapeutic effect on aging and dementia.
  • an object of the present invention is to provide an antioxidant and anti-aging composition comprising the lactic acid bacteria and a composition for preventing or treating dementia.
  • the present invention also provides an antioxidant and anti-aging fermentation composition fermented with the lactic acid bacteria and a fermentation composition for preventing or treating dementia.
  • the present invention provides Lactobacillus pentosus var. Plantarum C29 KCCM11291P isolated from kimchi.
  • the present invention also provides an antioxidant and anti-aging pharmaceutical composition comprising Lactobacillus pentosus mutant plantarium C29 as an active ingredient.
  • the present invention also provides a pharmaceutical composition for preventing or treating dementia, comprising Lactobacillus pentosus mutant plantarium C29 as an active ingredient.
  • the present invention provides a dietary supplement with antioxidant and anti-aging effects, comprising Lactobacillus pentosus mutant plantarium C29 as an active ingredient.
  • the present invention also provides a dietary supplement for preventing or improving dementia, comprising Lactobacillus pentosus mutant plantarium C29 as an active ingredient.
  • the present invention also provides an antioxidant and anti-aging composition
  • an antioxidant and anti-aging composition comprising a fermentation composition fermented with Lactobacillus pentosus mutant plantarium C29 as an active ingredient.
  • the present invention also provides a composition for the prevention or treatment of dementia, comprising a fermentation composition fermented with Lactobacillus pentosus variety plantarium C29 as an active ingredient.
  • the present invention also provides Lactobacillus curvatus C3 KCCM43009 isolated from kimchi.
  • the present invention also provides an antioxidant and anti-aging pharmaceutical composition comprising Lactobacillus curbatus C3 as an active ingredient.
  • the present invention also provides a pharmaceutical composition for preventing or treating dementia, comprising Lactobacillus curbatus C3 as an active ingredient.
  • the present invention also provides a dietary supplement with antioxidant and anti-aging effects, comprising Lactobacillus curbatus C3 as an active ingredient.
  • the present invention also provides a dietary supplement for preventing or improving dementia, comprising Lactobacillus curbatus C3 as an active ingredient.
  • the present invention also provides an antioxidant and anti-aging composition
  • an antioxidant and anti-aging composition comprising a fermentation composition fermented with Lactobacillus curbatus C3 as an active ingredient.
  • the present invention also provides a composition for preventing or treating dementia, comprising a fermentation composition fermented with Lactobacillus curbatus C3 as an active ingredient.
  • Lactobacillus pentosus mutant plantarium C29 and Lactobacillus curbatus C3 of the present invention are novel microorganisms isolated from Chinese cabbage kimchi.
  • the Lactobacillus pentosus mutant plantarium C29 of the present invention is a strain belonging to the Lactobacillus in molecular phylogenetic and biochemical characterization based on the 16s rDNA sequence, and has a high molecular system in both Lactobacillus pentosus and Lactobacillus plantarium. significant flexibility, but identified as a strain showing a relationship between the biochemical characteristics of Lactobacillus was the more similar the pento Saskatchewan named Lactobacillus pento suspension variants Planta volume C29, deposited on July 09, 2012, the international deposit agency, Korea Culture Center of microorganisms Deposited with the number KCCM11291P.
  • Lactobacillus curbatus C3 of the present invention was identified as a strain belonging to Lactobacillus curbatus as a strain belonging to Lactobacillus in molecular phylogenetic analysis based on 16s rDNA sequence and was named as Lactobacillus curbatus C3. , It was deposited on July 9, 2012 with the deposit number KCCM43009 to the Korea Microorganism Conservation Center.
  • Lactobacillus pentosus strain plantarium C29 (hereinafter also referred to as "C29") and Lactobacillus curbatus C3 (hereinafter referred to as "C3") of the present invention is a passive avoidance test using a mouse model of Alzheimer's disease
  • C29 Lactobacillus pentosus strain plantarium C29
  • C3 Lactobacillus curbatus C3
  • the effect of improving the memory of the mouse was confirmed by administration of the C29 strain or C3 strain in the C29 strain, Y-shaped maze test and aquatic maze test has been shown to improve the memory, proving the prevention and treatment of dementia ( See Example 2).
  • dementia refers to a state in which cognitive functions such as memory, language ability, and judgment are continuously and generally deteriorated as the brain function is impaired due to various causes, causing problems in daily life.
  • Alzheimer's disease vascular dementia, Lewy body dementia, anterior temporal lobe dementia, Parkinson's disease dementia, Huntington's disease dementia, dementia caused by normal pressure hydrocephalus, dementia caused by head trauma, substance-induced dementia, and the like.
  • Lactobacillus pentosus mutant plantarium C29 and Lactobacillus curbatus C3 of the present invention were strains having an excellent effect on the prevention and treatment of dementia and aging.
  • Lactobacillus pentosus varieties Planarium C29 of the present invention Morphological and physiological characteristics of the Lactobacillus pentosus varieties Planarium C29 of the present invention, sucrose fermentation assay results, and cellular fatty acid composition are known from Table 1, Table 2 and Table 3, respectively. Planta volume (L.plantarum) ATCC 14917 and L. appear with the characteristics of pento Saskatchewan (L.pentosus) DSM20314.
  • None of the three lactic acid bacteria is 2-keto-gluconate, 5-keto-gluconate, erythritol, D-arabinose, L-xylose, ⁇ -methyl-D-xyloxide, L-solvos, inositol , Did not ferment glycogen, xylitol, D-lysose, D-tagatose, D-fucose, L-fucose, L-arabitol.
  • Lactobacillus pentosus mutant plantarium C29 strain and Lactobacillus curbatus C3 strain of the present invention can be used for the prevention and treatment of aging and dementia, therefore, the present invention is Lactobacillus pentosus mutant plantarium C29
  • An antioxidant and anti-aging pharmaceutical composition comprising the strain or Lactobacillus curbatus C3 strain as an active ingredient, and a pharmaceutical composition for preventing or treating dementia.
  • compositions of the invention may be administered orally (eg, by taking or inhaling) or parenterally (eg, by injection, transdermal absorption, rectal administration), and the injection may be, for example, intravenous, subcutaneous. Injection, intramuscular injection or intraperitoneal injection.
  • the pharmaceutical compositions according to the invention can be formulated into tablets, capsules, granules, fine subtilae, powders, sublingual tablets, suppositories, ointments, injections, emulsions, suspensions, syrups, sprays and the like depending on the route of administration. Can be converted.
  • the pharmaceutical compositions according to the present invention in various forms can be prepared by known techniques using pharmaceutically acceptable carriers commonly used in each formulation.
  • Examples of pharmaceutically acceptable carriers include excipients, binders, disintegrating agents, lubricants, preservatives, antioxidants, isotonic agents, buffers, coatings, sweeteners, solubilizers, bases, dispersants, wetting agents , Suspending agents, stabilizers, coloring agents and the like.
  • the pharmaceutical composition according to the present invention comprises from about 0.01 to 100% by weight of the Lactobacillus pentosus mutant plantarium C29 strain or Lactobacillus curbatus C3 strain.
  • the specific dosage of the pharmaceutical composition of the present invention may vary depending on the type of mammal, including the person being treated, weight, sex, degree of disease, judgment of the doctor, and the like. It will be possible to determine the appropriate dosage according to.
  • 0.001 to 500 mg of active ingredient per kg of body weight is administered per day
  • 0.01 to 200 mg of active ingredient is administered per kg of body weight per day.
  • 100 mg of active ingredient is administered per kg of body weight per day.
  • the total daily dose may be administered at one time or divided into several times depending on the extent of the disease, the judgment of the doctor.
  • the present invention also provides a health functional food having antioxidant and anti-aging effects and a health functional food for the prevention or improvement of dementia, comprising the C29 strain or C3 strain as an active ingredient.
  • dietary supplement of the present invention may be in the form of oral preparations such as powders, granules, tablets, capsules, suspensions, emulsions, and syrups, or candy, sweets, gum, ice cream, noodles, bread, beverages. And the like can be added to common foods.
  • the health functional food of the present invention may be prepared by appropriately using fillers, extenders, binders, wetting agents, disintegrants, sweeteners, fragrances, preservatives, surfactants, lubricants, excipients and the like in a conventional manner.
  • the content of the C29 strain or C3 strain in the manufacture of the health functional food depends on the form of the health functional food, but the concentration of about 0.01 to 100% by weight.
  • the present invention also provides a composition having an antioxidant and anti-aging effect and a composition for preventing or improving dementia, comprising a fermentation composition fermented with a C29 strain or a C3 strain as an active ingredient.
  • the fermentation composition includes soybean or skim fermentation composition, thaw skin fermentation composition, ginseng fermentation composition, and deodeok fermentation composition.
  • the water suspension of soybean or skim soybean powder is used to add 5 to 15 times the water by weight to the dry soybean or skim soybean powder, but is not limited thereto, but is not limited thereto.
  • Soy milk may be ground and used in soymilk form as long as it meets the requirements.
  • the thawed blood, ginseng, and deodeok may be an extract or extract form, preferably may be used in the form of an extract prepared by hot water extraction, alcohol extraction or mixed extraction method, but is not limited thereto.
  • the extract may be ground or powdered to increase the extraction efficiency, and may be performed according to conventional extraction methods known in the art. For example, a water extraction method, an alcohol extraction method, an organic solvent extraction method, a supercritical extraction method, or the like may be used. Preferably, the water extraction method is used, but is not limited thereto.
  • the extraction solvent used in the alcohol extraction method may be a lower alcohol having 1 to 6 carbon atoms, such as methanol, ethanol, propanol, isopropanol, butanol and the like.
  • Examples of the extraction solvent of the organic solvent extraction method include organic solvents such as acetone, ether, benzene, chloroform, ethyl acetate, methylene chloride, hexane, hydrochloric acid, acetic acid, formic acid, citric acid, cyclohexane and petroleum ether; Or mixtures thereof.
  • the ratio of the extraction solvent added during the extraction is not particularly limited, but the extraction solvent may be used 2 to 20 times (by weight) with respect to the dried weight of thawed skin, ginseng or deodeok. In order to increase the extraction efficiency, it may be repeated two or more times using the extraction solvent 5 times to 15 times (by weight) with respect to thawed skin, ginseng or deodeok.
  • the extraction temperature is preferably 50 to 110 °C, more preferably 70 to 100 °C.
  • the extraction time depends on the extraction temperature, but is extracted from 1 hour to 48 hours, preferably 2 hours to 8 hours.
  • the extraction efficiency can be further increased when stirring with a shaker (shaker) during extraction.
  • the extract can be prepared by vacuum distillation or thin film distillation.
  • the soybean or skim bean fermentation composition, thawed skin fermentation composition, ginseng fermentation composition, and deodeok fermentation composition fermented by inoculating C29 strain or C3 strain is fermentation in the passive avoidance test using a mouse of Alzheimer's disease animal model The effect of improving memory in mice by administration of the composition was confirmed, demonstrating the prophylactic and therapeutic effect of dementia (see Example 5).
  • the inoculation amount of the C29 strain or C3 strain depends on the type of extract used for the fermentation, but is 1 ⁇ 10 8 CFU / ml or more and the fermentation temperature is preferably 20 to 40 ° C.
  • Fermentation time is not particularly limited as long as it satisfies the purpose of the present invention, it can be fermented for 10 to 30 hours by inoculating C29 strain or C3 strain.
  • Lactobacillus pentosus strain plantarium C29 or Lactobacillus curbatus C3 strain of the present invention has been found to have an excellent prevention and improvement effect against aging and dementia can be usefully used for the prevention or treatment of aging and dementia have. Therefore, the pharmaceutical composition and the dietary supplement comprising the Lactobacillus pentosus mutant plantarium C29 strain or the Lactobacillus curbatus C3 strain of the present invention can be effectively used to prevent or treat aging and dementia, and daily intake. Since the strain present in kimchi is an active ingredient, it can be used without concern about side effects or toxicity.
  • Lactobacillus pentosus varieties Planarlium C29 or Lactobacillus Curbatus C3 strain of the present invention can be effectively used as a composition for preventing or treating aging and dementia.
  • FIG. 1 shows the 16S rDNA sequence (SEQ ID NO: 1) of C29 lactic acid bacteria.
  • FIG. 2 is a phylogenetic tree showing the location of the Lactobacillus pentosus strain plantarium C29.
  • Figure 3 is a graph showing the passive avoidance test results.
  • 5 is a gel photograph showing the memory improving effect of the C29 strain.
  • FIG. 6 is a graph showing the results of the Y-shaped maze test of Example 2.
  • FIG. 8 is a gel photograph showing the change in the expression level of aging-related gene phosphate according to the administration of the C29 strain.
  • FIG. 9 is a graph showing the results of the Y-shaped maze test of Example 3, where Y is a young mouse, O is an aging mouse, and O / C29 is C29 lactic acid bacteria (1 ⁇ 10 9 colony forming unit (CFU) / mouse) Is an aging mouse administered with O, C3 is an aging mouse administered with C3 lactic acid bacteria (1 ⁇ 10 9 colony forming unit (CFU) / mouse), and O / C24 is a C24 lactic acid bacterium (1 ⁇ 10 9 colony forming unit (CFU). ) / Mouse).
  • FIG. 10 is a graph showing the results of the underwater maze test of Example 3, where Y is a young mouse, O is an aging mouse, and O / C29 is a C29 lactic acid bacterium (1 ⁇ 10 9 colony forming unit (CFU) / mouse).
  • Aged mouse administered O / C3 is aged mouse administered C3 lactic acid bacteria (1 ⁇ 10 9 colony forming unit (CFU) / mouse)
  • FIG. 11 shows the 16S rDNA sequence (SEQ ID NO: 2) of C3 lactic acid bacteria.
  • Chinese cabbage was suspended in MRS broth, the supernatant was transplanted into MRS agar medium, and then cultured anaerobicly at 37 ° C. for 24 hours to select grown colonies and analyzed for Gram staining and 16S rDNA. Lactobacillus strains were isolated.
  • human feces were suspended in GAM broth (Nissui Pharmaceutical Company, Ltd., Japan), the supernatant was transplanted into BL agar medium (Nissui Pharmaceuticals), and then grown by anaerobic incubation at 37 ° C. for 48 hours. Lactobacillus and Bifidobacterium strains were isolated by gram staining and 16S rDNA analysis.
  • the isolated strains are as follows.
  • mice All animals used in the experiment were 28-30 g male ICR mice, and the experiment was conducted according to the guidelines for the use and care of experimental animals (NIH publication No. 85-23). Experimental animals were housed 5-6 per cage and left free to eat. The temperature in the kennel was 23 ⁇ 1 °C, the humidity was 60 ⁇ 10%, and the work was always maintained for 12 hours (07:30 ⁇ 19:30).
  • the experimental box (50 x 15 x 40cm, electrofiable frid floor) is divided into two compartments by using partitions, and the entrance is automatically closed when entering from one side to the other through a small entrance. Turn on the light on one side of the compartment divided into compartments, look around and enter the dark compartment with no lighting, and the entrance closes automatically, immediately flowing 0.25 mA of current for 1 second through the bottom stainless steel grid. Give a foot shock.
  • the passive evasion reaction time is determined to be 300 seconds. It was determined that the greater the time until the animals moved to the dark compartment and the entrance was closed, the better the memory of passive avoidance through learning was maintained.
  • C29 lactic acid bacteria which were found to be the most effective, were administered to mice twice daily with 1 ⁇ 10 9 and 1 ⁇ 10 10 CFU (dog). Scopolamine (0.9 mg / kg) was administered 1 hour after the last dose of lactic acid bacteria. As a result, as can be seen in Figure 4, C29 showed an effect depending on the concentration.
  • the hippocampus of the brain was isolated and homogenized by adding 100 ⁇ l of RIPA buffer (Gibco) containing a protease inhibitor cocktail. After centrifugation at 4 ° C. and 13000 rpm for 15 minutes, the supernatant was stored at ⁇ 80 ° C., and p-CREB, CREB, BDNF, and ⁇ -actin were measured by immunoblotting.
  • the supernatant was taken and subjected to electrophoresis for 1 hour and 30 minutes on SDS 10% (w / v) polyacrylamide gel (sample, 50 ⁇ g).
  • the electrophoresis was transferred to nitrocellulose paper at 100 V and 400 mA for 1 hour 10 minutes, the transferred nitrocellulose paper was blocked with 5% skim milk for 30 minutes, washed with PBS-Tween 3 times for 5 minutes, and the primary antibody (Santa Cruz Biotechnology, USA) was reacted 1: 100 overnight. After washing three times for 10 minutes, the secondary antibody (Santa Cruz Biotechnology, USA) was reacted with 1: 1000 for 1 hour and 20 minutes. Thereafter, the mixture was washed three times for 15 minutes, and developed by fluorescence.
  • the Y-shaped labyrinth measuring device extends three arms to form the letter Y, each branch 25 cm long, 14 cm high, 5 cm wide and positioned at the same angle. At the end of a passage in the Y-shaped labyrinth, the animal's head is pointed and free to wander about eight minutes. Record the movement of the animal and see it as an arm entry as it enters the passage to the animal's hind paw. The movement of an animal is expressed as alternation, which is defined as one crossing when the animal passes through three passages in a row. Voluntary crossover behavior is expressed as a percentage of the actual crossover and the maximum possible crossover (ie, the total crossover minus two).
  • the lactic acid bacterium C29 was administered 1x10 9 and 1x10 10 CFU (dog) once a day for 2 days. Scopolamine (0.9 mg / kg) was administered 1 hour after the last dose of lactic acid bacteria.
  • test group administered C29 compared to the test group administered only scopolamine showed a memory-improving effect in a concentration-dependent manner.
  • a circular water tank (100 cm diameter, 35 cm high) was filled with powdered milk to a depth of 15 cm to make the platform installed in water at a temperature of 23 ° C. invisible.
  • the platform (platform, 4.5 cm in diameter, 14.5 cm in height) was placed in the center of one of the quarters of the entire water tank so that the top of the platform was located 0.5 cm below the water surface.
  • the device was installed in a laboratory with markings to identify the location. The training trial was conducted three times a day for five consecutive days. Once the mouse had found the platform, the next test was performed 5 minutes later, allowing the mouse to stay on the platform for about 10 seconds and return to the original cage.
  • the mouse does not find a platform within 120 seconds, it is left on the platform for 10 seconds before testing.
  • Probe test was performed 24 hours after the last training test in the trained animals. In this case, the platform was removed from the pool and the time spent in the quadrant where the platform was placed for 90 seconds was measured and expressed as a percentage.
  • mice 16-month-old mice were given three Lactobacillus C29, C3, and C24 (1x10 9 CFU each) for 5 days a week for 12 weeks. Effects and aging related genes AKT, FOXO3, NF-kB (p65) and mTor phosphorylation were measured. Beta-actin was measured as a comparative gene. In addition, the memory improvement effect was measured.
  • 100 ⁇ l of colon tissue of the test animal was homogenized by adding 250 ⁇ l of RIPA buffer containing a protease inhibitor cocktail. After centrifugation at 4 °C, 13000 rpm for 15 minutes, the supernatant was stored at -80 °C was used for lipid peroxidation analysis.
  • Lipid peroxidation in colon tissue was analyzed using the TBARS assay kit (Cayman chem., USA). 100 ⁇ l of colon homogenate was placed in a 5 ml polypropylene screwcap centrifuge tube, then 100 ⁇ l of SDS solution was added and gently shaken. 4 ml of color reagent was added to the tube and then quenched in water for 1 hour to stop the reaction. Thereafter, the mixture was centrifuged at 4 DEG C and 13000 rpm for 10 minutes, and then allowed to stand at room temperature for 30 minutes, and the absorbance was measured at 540 nm using an ELISA reader. A standard curve was prepared using malonaldehyde (MDA) as a standard and the amount of MDA generated therefrom was measured.
  • MDA malonaldehyde
  • Zn-SOD activity was measured using xanthine oxidase-cytochrome C system.
  • One unit of SOD was defined as the amount of SOD to inhibit a 50% reduction in cytochrome C.
  • the GSH concentration was measured by diluting the sample with phosphate buffer, adding o-phthalaldehyde, shaking for 15 minutes, and measuring fluorescence at an excitation wavelength of 345 nm and an emission wavelength of 425 nm.
  • 100 mg of colon tissue of the experimental animal was homogenized by adding 250 ⁇ l of RIPA buffer (Gibco) containing a protease inhibitor cocktail.
  • RIPA buffer Gibco
  • the supernatant was taken and subjected to electrophoresis for 1 h 30 min on SDS 10% (w / v) polyacrylamide gel (sample, 50 ⁇ g).
  • the electrophoresis was transferred to nitrocellulose paper at 100 V and 400 mA for 1 hour 10 minutes, the transferred nitrocellulose paper was blocked with 5% skim milk for 30 minutes, washed with PBS-Tween 3 times for 5 minutes, and the primary antibody (Santa Cruz Biotechnology, USA) was reacted 1: 100 overnight. After washing three times for 10 minutes, the secondary antibody (Santa Cruz Biotechnology, USA) was reacted with 1: 1000 for 1 hour and 20 minutes. Thereafter, the mixture was washed three times for 15 minutes, and developed by fluorescence.
  • the Y-shaped labyrinth measuring device extends three arms to form the letter Y, each branch 25 cm long, 14 cm high, 5 cm wide and positioned at the same angle. At the end of a passage in the Y-shaped labyrinth, the animal's head is pointed and free to wander about eight minutes. Record the movement of the animal and see it as an arm entry as it enters the passage to the animal's hind paw. The movement of an animal is expressed as alternation, which is defined as one crossing when the animal passes through three passages in a row. Voluntary crossover behavior is expressed as a percentage of the actual crossover and the maximum possible crossover (ie, the total crossover minus two).
  • C29 lactic acid bacteria, C3 lactic acid bacteria and C24 lactic acid bacteria were administered 1 ⁇ 10 9 CFU (dogs) once a day for 2 days to 16-month-old mice.
  • scopolamine was not administered because aging mice had less memory than young mice.
  • a circular water tank (100 cm diameter, 35 cm high) was filled with powdered milk to a depth of 15 cm to make the platform installed in water at a temperature of 23 ° C. invisible.
  • the platform (platform, 4.5 cm in diameter, 14.5 cm in height) was placed in the center of one of the quarters of the entire water tank so that the top of the platform was located 0.5 cm below the water surface.
  • the device was installed in a laboratory with markings to identify the location. The training trial was conducted three times a day for five consecutive days. Once the mouse had found the platform, the next test was performed 5 minutes later, allowing the mouse to stay on the platform for about 10 seconds and return to the original cage.
  • the mouse does not find a platform within 120 seconds, it is left on the platform for 10 seconds before testing.
  • Probe test was performed 24 hours after the last training test in the trained animals. In this case, the platform was removed from the pool and the time spent in the quadrant where the platform was placed for 90 seconds was measured and expressed as a percentage.
  • C29 lactic acid bacteria, C3 lactic acid bacteria, and C24 lactic acid bacteria were measured daily swimming time while administering 1 ⁇ 10 9 CFU (dog) once a day for 4 days each to 16-month-old mice.
  • scopolamine was not administered because aging mice had less memory than young mice.
  • the blast similarity survey program was used to compare the base sequences of rDNA, and to perform multiple sequence alignments with 16S rDNA gene sequences of various Lactobacillus spp. Strains. No. 999% homology with cerium strain BIM B-536 and Lactobacillus pentosus strain LS3 and named as Lactobacillus pentosus strain plantarium C29, dated July 9, 2012 to the Korea Microorganism Conservation Center (KCCM) Deposited with Accession No. KCCM11291P.
  • KCCM Microorganism Conservation Center
  • C3 lactobacillus was identified as Lactobacillus curbatus C3 with more than 99.9% homology with Lactobacillus curbatus, and was deposited with the deposit number KCCM43009 on July 9, 2012 to Korea Deposit Control Center (KCCM). .
  • soybean or skim bean fermentation composition 0.1 ml of the soybean or skim bean fermentation composition, thaw skin fermentation composition, ginseng fermentation composition, and deodeok fermentation composition prepared by the above method were administered to mice, which were dementia animal models, once a day for 2 days.
  • Scopolamine 0.9 mg / kg was administered 1 hour after the last dose of lactic acid bacteria.
  • the soybean fermentation composition fermented with C29 is best maintained the memory for passive avoidance and is superior to tacrine (Tacrin, TAC, 10 mg / kg), a treatment for dementia
  • ginseng fermentation composition fermented with C29, soybean fermentation composition fermented with C3, and deodeok fermentation composition fermented with C29 were followed. This shows that fermentation compositions fermented with C29 or C3 strains have a memory improving effect.

Abstract

본 발명은 항산화 및 항노화 기능 및 치매 개선 효과를 갖는 신규의 유산균을 제공하며, 보다 구체적으로 락토바실러스 펜토서스 변종 플란타륨(Lactobacillus pentosus var. plantarum) C29 KCCM11291P 및 락토바실러스 쿠르바투스(Lactobacillus curvatus) C3 KCCM430009를 제공한다. 또한 본 발명은 본 발명의 락토바실러스 펜토서스 변종 플란타륨 C29 또는 락토바실러스 쿠르바투스 C3를 유효성분으로 포함하는 항산화 및 항노화 약학 조성물 및 건강기능식품, 및 락토바실러스 펜토서스 변종 플란타륨 C29 또는 락토바실러스 쿠르바투스 C3를 유효성분으로 포함하는 치매 예방 또는 치료용 조성물 및 치매 예방 또는 개선용 건강기능식품을 제공한다. 또한, 본 발명은 락토바실러스 펜토서스 변종 플란타륨 C29 또는 락토바실러스 쿠르바투스 C3 균주로 발효한 발효 조성물을 유효 성분으로 포함하는 치매의 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.

Description

노화 및 치매의 예방 및/또는 치료 활성을 갖는 유산균
본 발명은 김치에서 분리된 신규의 유산균에 관한 것으로서, 보다 구체적으로는 노화 및 치매의 예방 및/또는 치료 활성을 가진 신규의 락토바실러스 펜토서스 변종 플란타륨(Lactobacillus pentosus var. plantarum) C29 및 락토바실러스 쿠르바투스(Lactobacillus curvatus) C3에 관한 것이다.
고령화 사회로 빠르게 진행되고 있는 현대 사회에서 노화 과정을 지연시키는 것은 중요한 보건 과제 중 하나이다. 우리나라의 경우 2010년에 65세 이상의 인구가 11.3%를 차지하였으며, 2050년에는 37.3%로 급증할 것으로 예상되고 있다. 이와 같은 고령화 사회에서는 질병 이환율의 상승 및 막대한 의료비 지출이 예상되며 치매 등의 노인성 질환의 급증이 사회적으로 문제가 될 것으로 예상된다.
노화가 진행되는 과정은 유전, 환경, 그리고 생활 방식의 복합적인 작용에 의해 영향을 받으며, 다양한 형태적, 생화학적 변화가 수반되는데, 특히, 산화스트레스의 증가와 염증 반응의 증가는 노화 촉진에 관여하는 주요 원인으로 여겨지고 있다. 산화스트레스는 반응성이 강한 산소 라디칼 (ROS, reactive oxygen species)의 생성 증가나 체내 항산화 방어 메커니즘의 감소로 일어나게 되는데, 그 결과 DNA 등의 생체 고분자가 파괴되고 세포 손상을 유발하여 노화를 촉진시키고, 치매를 비롯한 신경퇴행성 질환, 암, 심혈관계 질환 등의 노화 질병의 위험도를 높이게 된다.
Adler등 (Adler AS, Sinha S, Kawahara TL, Zhang JY, Segal E, Chang HY. Motif module map reveals enforcement of aging by continual NF-kappaB activity. Genes Dev. 2007;21:3244-57)은 다수의 인체 조직과 실험 동물 조직에서 NF-κB 활성화 모티프(motif)와 노화과정을 조절하는 단위의 관련성을 입증하여 NF-κB로 매개되는 염증 반응과 노화 과정이 매우 밀접하게 연관되어 있음을 입증하였다. 또한, 노화는 PI3K/AKT를 활성화시키고, 이는 FOXO3를 인산화하여 ROS 생성을 억제하지 못하여 유전자 변이 등이 일어나게 됨이 알려져 있다.
노화 질병 중 하나인 치매는 뇌의 만성적인 혹은 진행성 질환으로 인해 발생하며, 뇌조직의 퇴행, 변성 및 노화 중추신경계 감염(신경매독, 결핵성 뇌막염, 바이러스성 뇌염 등), 뇌경색, 뇌손상, 독성대사장애, 신경계질환(파킨슨병) 등이 치매를 일으키는 주요 원인으로 알려져 있다. 치매에는 알츠하이머형 치매(Alzheimer's disease), 혈관성 치매, 및 기타 혼합형이 있으며, 우리나라 65세 이상의 노인 치매 환자중 50~60%가 알츠하이머형 치매이고 15~30%가 혈관성 치매이며 나머지 10~15%가 이 두 가지 질환의 혼합형이다. 뇌속 노폐물인 베타아밀로이드(Aß)가 알츠하이머형 치매의 주요 발병 원인으로 알려져 있으며, 알츠하이머형 치매의 치료를 위해 많은 약물들이 치료제로 시도되었으나 아직까지 뚜렷한 효과가 입증된 약물은 없다. 알츠하이머형 치매 환자들에게 부족한 뇌속 중요 신경전달물질 중 하나인 아세틸콜린(acetylcholine)에 작용하는 아세틸콜린에스테라아제(acetylcholinesterease) 제해제가 치료제로서 유일하게 사용되고 있으나, 이 약물은 부분적으로 인지기능의 호전은 보이지만 알츠하이머병의 진행에는 전혀 작용을 하지 못하는 것으로 알려져 있으며, 효과적인 치매 예방 또는 치료제의 개발이 요구되고 있다.
한편, 유산균은 오랫동안 이용되어 왔으며 유산균의 정장 작용, 항암 효과, 면역증강 효과 등의 유익한 효과가 보고되어 왔다. 이에 본 발명자들은 노화와 치매에 유익한 효과를 갖는 유산균을 찾기 위하여 연구한 결과, 김치로부터 분리된 신규의 유산균이 노화와 치매에 대해 예방 또는 치료 효과를 가짐을 확인하여 본 발명을 완성하였다.
본 발명은 노화와 치매에 대해 예방 또는 치료 효과를 갖는 유산균의 제공을 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 상기 유산균을 포함하는, 항산화 및 항노화 조성물 및 치매의 예방 또는 치료용 조성물의 제공을 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 상기 유산균으로 발효시킨, 항산화 및 항노화 발효 조성물 및 치매의 예방 또는 치료용 발효 조성물의 제공을 목적으로 한다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 김치에서 분리된 락토바실러스 펜토서스 변종 플란타륨(Lactobacillus pentosus var. plantarum) C29 KCCM11291P를 제공한다.
또한, 본 발명은 락토바실러스 펜토서스 변종 플란타륨 C29를 유효 성분으로 포함하는, 항산화 및 항노화 약학 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 락토바실러스 펜토서스 변종 플란타륨 C29를 유효 성분으로 포함하는, 치매의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 락토바실러스 펜토서스 변종 플란타륨 C29를 유효 성분으로 포함하는, 항산화 및 항노화 효과를 가진 건강기능식품을 제공한다.
또한, 본 발명은 락토바실러스 펜토서스 변종 플란타륨 C29를 유효 성분으로 포함하는, 치매의 예방 또는 개선용 건강기능식품을 제공한다.
또한, 본 발명은 락토바실러스 펜토서스 변종 플란타륨 C29로 발효된 발효 조성물을 유효 성분으로 포함하는, 항산화 및 항노화 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 락토바실러스 펜토서스 변종 플란타륨 C29로 발효된 발효 조성물을 유효 성분으로 포함하는, 치매의 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 김치에서 분리된 락토바실러스 쿠르바투스(Lactobacillus curvatus) C3 KCCM43009를 제공한다.
또한, 본 발명은 락토바실러스 쿠르바투스 C3을 유효 성분으로 포함하는, 항산화 및 항노화 약학 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 락토바실러스 쿠르바투스 C3을 유효 성분으로 포함하는, 치매의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 락토바실러스 쿠르바투스 C3을 유효 성분으로 포함하는, 항산화 및 항노화 효과를 가진 건강기능식품을 제공한다.
또한, 본 발명은 락토바실러스 쿠르바투스 C3을 유효 성분으로 포함하는, 치매의 예방 또는 개선용 건강기능식품을 제공한다.
또한, 본 발명은 락토바실러스 쿠르바투스 C3으로 발효된 발효 조성물을 유효 성분으로 포함하는, 항산화 및 항노화 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 락토바실러스 쿠르바투스 C3으로 발효된 발효 조성물을 유효 성분으로 포함하는, 치매의 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.
이하에서 본 발명을 보다 상세히 설명한다.
본 발명의 락토바실러스 펜토서스 변종 플란타륨 C29 및 락토바실러스 쿠르바투스 C3는 배추 김치로부터 분리된 신규의 미생물이다.
본 발명의 락토바실러스 펜토서스 변종 플란타륨 C29는 16s rDNA 염기서열에 기초한 분자계통분류학적 및 생화학적 특성 분석에서 락토바실러스에 속하는 균주로서 락토바실러스 펜토서스와 락토바실러스 플란타륨 모두에 높은 분자계통학적 유연관계를 나타내는 균주로 동정되었으나 생화학적 특성이 락토바실러스 펜토서스에 좀더 유사하여 락토바실러스 펜토서스 변종 플란타륨 C29로 명명하였으며, 국제기탁기관인 한국미생물보존센터에 2012년 7월 9일에 기탁 번호 KCCM11291P로 기탁되었다.
또한, 본 발명의 락토바실러스 쿠르바투스 C3는 16s rDNA 염기서열에 기초한 분자계통분류학적 분석에서 락토바실러스에 속하는 균주로서 락토바실러스 쿠르바투스에 속하는 균주로 동정되어 락토바실러스 쿠르바투스 C3으로 명명되었으며, 국제기탁기관인 한국미생물보존센터에 2012년 7월 9일에 기탁 번호 KCCM43009로 기탁되었다.
본 발명의 락토바실러스 펜토서스 변종 플란타륨 C29(이하에서는 "C29"라고도 함) 및 락토바실러스 쿠르바투스 C3(이하에서는 “C3"라고도 함)는 알츠하이머병 동물 모델인 마우스를 이용한 수동회피반응 시험에서 C29 균주 또는 C3 균주의 투여에 의해 마우스의 기억이 개선되는 효과가 확인되었으며, C29 균주는 Y자형 미로 시험과 수중미로 시험에서도 기억개선 효과가 확인되어, 치매의 예방 및 치료 효과가 입증되었다(실시예 2 참조).
본 발명에 있어서, 치매란 다양한 원인에 의해 뇌기능이 손상되면서 이전에 비해 기억력, 언어 능력, 판단력 등의 인지 기능이 지속적이고 전반적으로 저하되어 일상생활에 지장이 나타나고 있는 상태를 말하며, 노인성 치매, 알츠하이머병, 혈관성 치매, 루이체 치매, 전측두엽 치매, 파킨슨병 치매, 헌팅턴병 치매, 정상압 뇌수두증에 의한 치매, 두부 외상으로 인한 치매, 물질로 유발된 치매 등을 포함한다.
또한, 16개월령 마우스에 C29 균주 또는 C3 균주를 3개월간 투여한 후 지질 과산화물, 수퍼옥사이드 디스뮤타아제(Superoxide dismutase) 활성, 카탈라아제(Catalase) 활성, 및 글루타치온 농도를 측정한 결과, 생리식염수를 3개월간 투여한 16개월령 마우스에 비하여 현저하게 우수한 항산화 효과를 나타내었으며 노화관련 유전자들의 발현 감소를 나타내어, 항산화 및 항노화 효과가 입증되었다(표 6 및 실시예 3 참조).
이로써 본 발명의 락토바실러스 펜토서스 변종 플란타륨 C29와 락토바실러스 쿠르바투스 C3는 치매와 노화의 예방 및 치료에 우수한 효과를 갖는 균주임이 확인되었다.
본 발명의 락토바실러스 펜토서스 변종 플란타륨 C29의 형태적 특징과 생리학적 특징, 수크로스 발효 분석 결과, 및 세포 지방산 조성이 각각 하기 표 1, 표 2 및 표 3에서 공지의 엘. 플란타륨(L.plantarum) ATCC 14917 및 엘.펜토서스(L.pentosus) DSM20314의 특성과 함께 나타난다.
[표 1]
균주 C29, 엘. 플란타륨 ATCC 14917 및 엘.펜토서스 DSM20314의 형태적 특징 및 생리학적 특징
Figure PCTKR2013007410-appb-I000001
+ : 양성 반응; - : 음성 반응
a : Zanoni, P., Farrow, J.A.E., Phillips, B.A., Collins, M.D. (1987) Lactobacillus pentosus(fred, peterson, and anderson) sp. Nov., norn, rev. Int J Syst Bacteriol 37, 339-341으로부터 입수
[표 2]
API 20E 및 API 50CHL을 이용한 유산균의 수크로스 발효의 분석
Figure PCTKR2013007410-appb-I000002
+ : 양성 반응; - : 음성 반응; D : 가변적 반응
상기 세 가지 유산균 중 어느 것도 2-케토-글루코네이트, 5-케토-글루코네이트, 에리트리톨, D-아라비노스, L-자일로스, β-메틸-D-자일로시드, L-솔보스, 이노시톨, 글리코겐, 자일리톨, D-라이소스, D-타가토스, D-퓨코스, L-퓨코스, L-아라비톨을 발효하지 않았음.
a : Van Reenen, C.A., Dicks, L.M. (1996) Evaluation of numerical analysis of random amplified polymorphic DNA (rapd)-pcr as a method to differentiate lactobacillus plantarum and lactobacillus pentosus. Curr Microbiol 32, 183-187로부터 입수.
b : Zanoni, P., Farrow, J.A.E., Phillips, B.A., Collins, M.D. (1987) Lactobacillus pentosus(fred, peterson, and anderson) sp. Nov., norn, rev. Int J Syst Bacteriol 37, 339-341로부터 입수.
[표 3]
균주 C29, 엘. 플란타륨 ATCC 14917 및 엘.펜토서스 DSM20314의 세포 지방산 조성
Figure PCTKR2013007410-appb-I000003
T : 1% 미만의 미량의 산
a : 엘.플란타륨 :Van Reenen, C.A., Dicks, L.M. (1996) Evaluation of numerical analysis of random amplified polymorphic DNA (rapd)-pcr as a method to differentiate lactobacillus plantarum and lactobacillus pentosus. Curr Microbiol 32, 183-187로부터 입수.
엘.펜토서스: Zanoni, P., Farrow, J.A.E., Phillips, B.A., Collins, M.D. (1987) Lactobacillus pentosus(fred, peterson, and anderson) sp. Nov., norn, rev. Int J Syst Bacteriol 37, 339-341로부터 입수.
또한, 본 발명의 락토바실러스 쿠르바투스 C3의 형태적 특징과 생리학적 특징, 및 수크로스 발효 분석 결과가 각각 하기 표 4 및 표 5에서 공지의 엘. 쿠르바투스 ATCC25601의 특성과 함께 나타난다.
[표 4]
균주 C3, 엘. 쿠르바투스 ATCC25601의 형태적 특징 및 생리학적 특징
Figure PCTKR2013007410-appb-I000004
+ : 양성 반응; - : 음성 반응
[표 5]
API 20E 및 API 50CHL을 이용한 유산균의 수크로스 발효의 분석
Figure PCTKR2013007410-appb-I000005
+ : 양성 반응; - : 음성 반응;
상기 유산균 중 어느 것도 2-케토-글루코네이트, 5-케토-글루코네이트, 에리트리톨, D-아라비노스, L-자일로스, β-메틸-D-자일로시드, L-솔보스, 이노시톨, 글리코겐, 자일리톨, D-라이소스, D-타가토스, D-퓨코스, L-퓨코스, L-아라비톨을 발효하지 않았음.
본 발명의 락토바실러스 펜토서스 변종 플란타륨 C29 균주와 락토바실러스 쿠르바투스 C3 균주는 노화와 치매의 예방 및 치료를 위해 이용될 수 있으며, 따라서, 본 발명은 락토바실러스 펜토서스 변종 플란타륨 C29 균주 또는 락토바실러스 쿠르바투스 C3 균주를 유효 성분으로 포함하는 항산화 및 항노화 약학 조성물, 및 치매의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
본 발명의 약학 조성물은 경구적으로 (예를 들면, 복용 또는 흡입) 또는 비경구적으로 (예를 들면, 주사, 경피흡수, 직장투여) 투여될 수 있으며, 주사는 예를 들면, 정맥주사, 피하주사, 근육내주사 또는 복강내주사일 수 있다. 본 발명에 따른 약학 조성물은 투여 경로에 따라, 정제, 캡슐제, 과립제, 파인 서브틸래(fine subtilae), 분제, 설하 정제, 좌약, 연고, 주사제, 유탁액제, 현탁액제, 시럽제, 분무제 등으로 제형화될 수 있다. 상기 여러 가지 형태의 본 발명에 따른 약학 조성물은 각 제형에 통상적으로 사용되는 약학적으로 허용되는 담체(carrier)를 사용하여 공지기술에 의해 제조될 수 있다. 약학적으로 허용되는 담체의 예는 부형제, 결합제, 붕해제(disintegrating agent), 윤활제, 방부제, 항산화제, 등장제(isotonic agent), 완충제, 피막제, 감미제, 용해제, 기제(base), 분산제, 습윤제, 현탁화제, 안정제, 착색제 등을 포함한다.
본 발명에 따른 약학 조성물은 약제의 형태에 따라 다르지만, 본 발명의 락토바실러스 펜토서스 변종 플란타륨 C29 균주 또는 락토바실러스 쿠르바투스 C3 균주를 약 0.01 내지 100 중량%로 포함한다.
본 발명의 약학 조성물의 구체적인 투여량은 치료되는 사람을 포함한 포유동물의 종류, 체중, 성별, 질환의 정도, 의사의 판단 등에 따라 다를 수 있으며, 본 기술분야의 통상적인 지식을 가진 자라면 특정한 용도에 따른 적절한 투여량을 결정할 수 있을 것이다. 바람직하게는, 경구투여의 경우에는 하루에 체중 1kg당 활성성분 0.001 내지 500 ㎎이 투여되고, 비경구투여의 경우에는 하루에 체중 1kg당 활성성분 0.01 내지 200 ㎎이 투여된다. 보다 바람직하게는, 하루에 체중 1 kg 당 활성성분 100 ㎎이 투여된다. 상기 총 일일 투여량은 질환의 정도, 의사의 판단 등에 따라 한번에 또는 수회로 나누어 투여될 수 있다.
본 발명은 또한 C29 균주 또는 C3 균주를 유효 성분으로 포함하는, 항산화 및 항노화 효과를 가진 건강기능식품과 치매의 예방 또는 개선용 건강기능식품을 제공한다.
본 발명의 건강기능식품의 종류에는 특별한 제한이 없으며, 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액제, 에멀젼, 시럽제 등의 경구형 제제 형태이거나, 캔디, 과자, 껌, 아이스크림, 면류, 빵, 음료 등 일반적인 식품에 첨가될 수 있다.
본 발명의 건강기능식품은 형태에 따라 통상적인 방법으로 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 감미제, 방향제, 보존제, 계면활성제, 윤활제, 부형제 등을 적절히 사용하여 제조될 수 있다.
상기 건강기능식품의 제조에 있어서 C29 균주 또는 C3 균주의 함량은 건강기능식품의 형태에 따라 다르지만, 대략 0.01 내지 100 중량%의 농도이다.
또한, 본 발명은 C29 균주 또는 C3 균주로 발효한 발효 조성물을 유효 성분으로 포함하는, 항산화 및 항노화 효과를 가진 조성물과 치매의 예방 또는 개선용 조성물을 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 발효 조성물은 콩 또는 탈지콩 발효 조성물, 해동피 발효 조성물, 인삼 발효 조성물, 및 더덕 발효 조성물을 포함한다.
본 발명에 있어서, 콩 또는 탈지콩 분말의 물 현탁물은 건조한 콩 또는 탈지콩 분말에 중량대비 5 내지 15배의 물을 첨가하여 현탁하여 사용하는 것을 의미하나, 이에 한정되는 것은 아니며 본 발명의 목적에 부합하는 한 물에 불린 콩을 갈아서 두유 형태로 제조하여 사용할 수도 있다.
본 발명에 있어서, 상기 해동피, 인삼, 및 더덕은 추출물 또는 엑기스 형태일 수 있으며 바람직하게는 열수추출법, 주정(酒精)추출법 또는 혼합추출법에 의해 제조된 추출물 형태인 것을 사용할 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 추출물의 추출효율을 높이기 위하여 분쇄 또는 분말화할 수 있으며, 당업계에 공지된 통상적인 추출법에 따라 수행될 수 있다. 예를 들면 물 추출법, 알코올 추출법, 유기용매 추출법 및 초임계 추출법 등을 사용할 수 있으며, 바람직하게는 물 추출법을 이용하나 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 알코올 추출법에 있어 사용되는 추출용매는 메탄올, 에탄올, 프로판올,이소프로판올, 부탄올 등의 탄소수 1 내지 6의 저급 알코올 등을 사용할 수 있으며. 상기 유기용매 추출법의 추출용매로는 아세톤, 에테르, 벤젠, 클로로포름, 에틸아세테이트, 메틸렌클로라이드, 헥산, 염산, 초산, 포름산, 구연산, 시클로헥산 및 석유에테르 등의 유기용매; 또는 이들의 혼합물을 사용할 수 있다.
이때, 추출시 첨가되는 추출용매의 비율은 특별히 한정되지 않으나, 해동피, 인삼 또는 더덕 건조 중량에 대하여 추출용매를 2배 내지 20배(중량기준)로 사용할 수 있다. 추출효율을 증가시키기 위해서는 바람직하게는, 해동피, 인삼 또는 더덕에 대하여 추출용매 5배 내지 15배(중량기준)를 사용하여 2회 이상 수회 반복할 수 있다.
이때, 추출온도는 50 내지 110℃가 바람직하며, 더욱 바람직하게는 70 내지 100℃이다. 추출시간은 추출온도에 따라 다르지만, 1시간 내지 48시간, 바람직하게는 2시간 내지 8시간 추출한다. 또한, 추출시 교반기(shaker)로 교반할 경우에 더욱 추출효율을 증대시킬 수 있다.
상기 엑기스는 감압증류법이나 박막증류법으로 제조할 수 있다.
본 발명에 있어서, C29 균주 또는 C3 균주를 접종하여 발효시킨 콩 또는 탈지콩 발효 조성물, 해동피 발효 조성물, 인삼 발효 조성물, 및 더덕 발효 조성물은 알츠하이머병 동물 모델인 마우스를 이용한 수동회피반응 시험에서 상기 발효 조성물의 투여에 의해 마우스의 기억이 개선되는 효과가 확인되어, 치매의 예방 및 치료 효과가 입증되었다(실시예 5 참조).
본 발명에 있어서, 상기 추출물에 C29 균주 또는 C3 균주 접종시 잡균의 생장을 억제하기 위해 100℃ 이상에서 15분 내지 1시간 동안 가열하여 멸균하여 사용한다.
상기 C29 균주 또는 C3 균주의 접종량은 발효에 이용되는 추출물의 종류에 따라 다르지만 1× 108 CFU/ml 이상이 되게 하고 발효온도는 20 내지 40℃가 바람직하다. 본 발명의 목적에 부합되는 것이라면 발효 시간은 특별한 제한은 없으나, C29 균주 또는 C3 균주를 접종하여 10 내지 30시간 동안 발효할 수 있다. 여기서, 10시간 이하로 발효하면 발효 조성물이 충분히 만들어지지 않고, 30시간 이상으로 발효하면 유기산이 많이 만들어져 신맛이 강하여 식감이 떨어지기 때문에 상술한 발효 시간 범위 내에서 발효하는 것이 바람직하다.
또한, 본 발명에 있어서, 발효에 사용되는 재료에 따라 다양한 발효 식품을 제조할 수 있으며, 일례로 분유 또는 우유에 C29 균주 또는 C3 균주를 접종하고 상기와 같은 방법으로 발효시킴으로써 요쿠르트 등의 유산균 발효음료를 제조할 수 있다.
본 발명의 락토바실러스 펜토서스 변종 플란타륨 C29 또는 락토바실러스 쿠르바투스 C3 균주는 노화와 치매에 대해 우수한 예방 및 개선 효과를 가짐이 확인되어 노화와 치매의 예방 또는 치료를 위해 유용하게 이용될 수 있다. 따라서 본 발명의 락토바실러스 펜토서스 변종 플란타륨 C29 균주 또는 락토바실러스 쿠르바투스 C3 균주를 포함하는 약학 조성물과 건강기능식품은 노화와 치매를 예방하거나 치료하기 위하여 효과적으로 이용될 수 있으며, 일상적으로 섭취하는 김치에 존재하는 균주가 유효 성분이므로 부작용이나 독성 등의 염려없이 이용될 수 있을 것이다. 또한, 본 발명의 락토바실러스 펜토서스 변종 플란타륨 C29 또는 락토바실러스 쿠르바투스 C3 균주를 접종하여 발효 조성물을 제조함으로써 노화와 치매를 예방하거나 치료하기 위한 조성물로 효과적으로 이용될 수 있다.
도 1은 C29 유산균의 16S rDNA 서열(서열 번호 1)을 보여준다.
도 2는 락토바실러스 펜토서스 변종 플란타륨 C29의 위치를 보여주는 계통수이다.
도 3은 수동회피반응 시험 결과를 보여주는 그래프이다.
도 4는 C29 균주의 기억 개선 효과가 농도의존적으로 커짐을 보여주는 그래프이다.
도 5는 C29 균주의 기억 개선 효과를 보여주는 젤 사진이다.
도 6은 실시예 2의 Y자형 미로 시험의 결과를 보여주는 그래프이다.
도 7은 실시예 2의 수중미로 시험의 결과를 보여주는 그래프로서, 검은 사각형은 스코폴아민 + (1× 109 콜로니 형성 유닛 (CFU)/마우스 C29)이고, 흰색 사각형은 스코폴아민 + (1× 1010 CFU/마우스 C29)이고, 검은 삼각형은 스코폴아민 + (10 mg/kg 타크린 양성대조약물)이고, 흰색 원은 스코폴아민 단독이고, 검은 원은 정상 대조 마우스이다. 값은 평균 ± SEM (n=6)이다.
#p<0.05 vs. 정상 대조군이며, *p<0.05 vs. 스코폴아민 단독처리 대조군이다.
도 8은 C29 균주의 투여에 따른 노화관련 유전자 인산체의 발현량 변화를 보여주는 젤 사진이다.
도 9는 실시예 3의 Y자형 미로 시험의 결과를 보여주는 그래프로서, Y는 어린 마우스이고, O는 노화 마우스이고, O/C29는 C29 유산균(1× 109 콜로니 형성 유닛 (CFU)/마우스)을 투여한 노화 마우스이고, O/C3은 C3 유산균(1× 109 콜로니 형성 유닛 (CFU)/마우스)을 투여한 노화 마우스이고, O/C24는 C24 유산균(1× 109 콜로니 형성 유닛 (CFU)/마우스)을 투여한 노화 마우스이다.
도 10은 실시예 3의 수중미로 시험의 결과를 보여주는 그래프로서, Y는 어린 마우스이고, O는 노화 마우스이고, O/C29는 C29 유산균(1× 109 콜로니 형성 유닛 (CFU)/마우스)을 투여한 노화 마우스이고, O/C3은 C3 유산균(1× 109 콜로니 형성 유닛 (CFU)/마우스)을 투여한 노화 마우스이고, O/C24는 C24 유산균(1× 109 콜로니 형성 유닛 (CFU)/마우스)을 투여한 노화 마우스이다. 값은 평균 ± SEM (n=6)이다.
도 11은 C3 유산균의 16S rDNA 서열(서열 번호 2)을 보여준다.
도 12는 C29 또는 C3 균주로 발효된 발효 조성물의 인지 기능 개선효과를 보여주는 그래프이다.
이하, 실시예에 의해 본 발명을 보다 구체적으로 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오직 본 발명을 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 국한되지 않는다는 것은 당업자에게 있어서 자명하다.
실시예 1. 유산균 분리
배추김치를 MRS 브로쓰(broth)에 현탁하고, 상등액을 MRS 한천(agar) 배지에 이식한 다음, 24시간 동안 37℃에서 혐기적으로 배양하여 자라나온 콜로니를 선별하여 그람 염색과 16S rDNA를 분석하여 락토바실러스 균주를 분리하였다.
또한, 사람의 분변을 GAM 브로쓰(Nissui Pharmaceutical Company, Ltd., 일본)에 현탁하고, 상등액을 BL 한천 배지(Nissui 제약)에 이식한 다음, 48시간 동안 37℃에서 혐기적으로 배양하여 자라나온 콜로니를 선별하여 그람 염색과 16S rDNA를 분석하여 락토바실러스와 비피도박테리움 균주를 분리하였다.
분리된 균주는 다음과 같다.
1) 김치에서 분리하여 사용한 유산균
류코노스톡 메센테로이드(Leuconostoc mesenteroides) C1
류코노스톡 김치(Leuconostoc kimchii) C2
락토바실러스 쿠르바투스(Lactobacillus curvatus) C3
락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis) C4
락토바실러스 브레비스 C5
락토코커스 플란타륨(Lactococcus plantarum) C6
류코노스톡 시트레움(Leuconostoc citreum) C7
페디오코커스 펜토사세우스(Pediococcus pentosaceus) C8
락토바실러스 애시도필러스(Lactobacillus acidophilus) C9
락토바실러스 락티스(Lactobacillus lactis) C10
락토바실러스 헬베티쿠스(Lactobacillus helveticus) C11
락토바실러스 플란타륨(Lactobacillus plantarum) C12
락토바실러스 카세이(Lactobacillus casei) C13
락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei) C14
락토바실러스 펜토서스(Lactobacillus pentosus) C15
락토바실러스 사케이 C21
락토바실러스 사케이 C22
락토바실러스 사케이 C23
락토바실러스 플란타륨 C24
락토바실러스 플란타륨 C25
락토바실러스 플란타륨 C26
락토바실러스 펜토서스 C27
락토바실러스 펜토서스 C28
락토바실러스 펜토서스 변종 플란타륨 C29
락토바실러스 사케이 C30
2) 사람소화관에서 분리하여 사용한 유산균
비피도박테리움 브레비(Bifidobacterium breve) C16
비피도박테리움 론검(Bifidobacterium longum) C17
비피도박테리움 애돌레센티스(Bifidobacterium adolescentis) C18
비피도박테리움 비피둠(Bifidobacterium bifidum) C19
락토바실러스 애시도필러스(Lactobacillus acidophilus) C20
실시예 2. 항치매 효과의 확인
김치와 분변에서 분리된 30가지 유산균 중에서 항치매 효과를 갖는 유산균을 확인하기 위하여 상기한 C1 내지 C30 균주와 실험 동물을 이용하여 실험을 실시하였다.
실험에 사용된 모든 동물은 28~30 g의 수컷 ICR계 마우스로 실험동물 사용 및 관리에 관한 지침 (NIH publication No. 85-23)에 의거하여 실험을 수행하였다. 실험동물들을 우리(cage) 당 5~6 마리 유치하고 먹이 섭취는 자유롭게 방치하였다. 사육장내 온도는 23 ± 1 ℃, 습도는 60 ± 10 %이고, 12 시간 (07:30 ~ 19:30) 일장을 항상 유지하였다.
2-1. 수동회피반응 시험(Passive avoidance task test)
실험기구로 실험상자(50 x 15 x 40cm, electrofiable frid floor)는 칸막이를 이용하여 두 구획으로 구분하는데 작은 입구를 통해 한쪽에서 건너편 구획으로 들어가면 자동적으로 입구가 닫히도록 되어있다. 칸막이로 나누어진 구획의 한쪽에 조명을 켜고 동물을 넣으면 주변을 살피다가 조명이 없는 어두운 구획으로 들어가게 되면, 자동적으로 입구가 닫히고, 즉시 0.25 mA의 전류를 바닥의 스테인레스 그리드를 통해 1초 동안 흘려 전기충격(foot shock)을 준다. 익일 조명이 켜진 구획에 실험동물을 넣은 후부터 이 동물이 어두운 구획으로 넘어가 입구가 닫힐 때까지의 시간(latency)을 측정한다. 대조군과 시험군에게 이와 같이 어두운 구획으로 들어가기까지의 시간을 측정, 비교한다. 최대 제한시간은 300초로 하는데, 300초가 넘도록 어두운 구획으로 들어가지 않으면 수동회피반응 시간을 300초로 결정한다. 동물이 어두운 구획으로 넘어가 입구가 닫힐 때까지의 시간이 클수록 학습을 통한 수동 회피에 대한 기억이 잘 유지되는 것으로 판단하였다.
실험에 사용한 C1 내지 C30의 유산균 30종을 각각 1x1010 CFU(개)를 1일 1회씩 2일간 치매 동물 모델인 마우스에 투여하였다. 스코폴아민(Scopolamine) (0.9 mg/kg)은 유산균 마지막 투여 1시간 후에 투여하였다. 그 결과, 도 3에서 확인할 수 있는 바와 같이, 실험에 사용한 유산균중 C29가 수동 회피에 대한 기억이 가장 잘 유지되며 치매 치료제인 타크린(Tacrin, TAC, 10 mg/kg)보다 효과가 우수한 것으로 나타났으며, 다음으로 C3, C24 순이었다.
가장 효과가 우수한 것으로 확인된 C29 유산균을 1 X 109 및 1 X 1010 CFU(개)를 1일 1회씩 2일간 마우스에 투여하였다. 스코폴아민 (0.9 mg/kg)은 유산균 마지막 투여 1시간 후에 투여하였다. 그 결과, 도 4에서 확인할 수 있는 바와 같이, C29는 농도의존적으로 효과를 나타냈다.
또한, 이 동물에서 치매개선 효과를 확인하기 위해 뇌의 히포캠퍼스를 분리하여 프로테아제 억제제 칵테일(protease inhibitor cocktail)이 함유된 100 ㎕의 RIPA buffer (Gibco사)를 첨가하여 균질화시켰다. 4℃, 13000 rpm에서 15분간 원심분리한 후 상등액을 -80℃에서 보관하면서 p-CREB, CREB, BDNF 및 β-액틴을 면역블롯팅(immunoblotting) 방법으로 측정하였다.
먼저, 상등액을 취해 SDS 10%(w/v) 폴리아크릴아미드 젤에서 1시간 30분간 전기영동을 하였다 (샘플, 50 ㎍). 전기영동한 것을 니트로셀룰로스지에 100V, 400mA에서 1시간 10분간 트랜스퍼하고, 이 트랜스퍼된 니트로셀룰로스지를 30분간 5% 탈지유로 블로킹한 후 5분씩 3회 PBS-Tween으로 세척하고, 1차 항체(Santa Cruz Biotechnology, 미국)를 1:100으로 밤새 반응시켰다. 그 후 10분씩 3회 세척한 후, 2차 항체(Santa Cruz Biotechnology, 미국)를 1:1000으로 1시간 20분간 반응시켰다. 그 후 15분씩 3회 세척하고, 형광발색시켜 현상하였다. 그 결과, 도 5에서 확인할 수 있는 바와 같이, 스코폴아민 만을 투여한 치매모델 동물군에 비해 C29를 스코폴아민과 동시에 투여한 군에서 스코폴아민 투여에 의해 감소한 p-CREB 및 BDNF가 회복되는 것을 관찰할 수 있었다. 이는 C29 유산균이 기억 개선 효과를 가짐을 보여주는 것이다.
상기와 같은 실험 결과는 C29와 C3 유산균이 기억력 개선을 통해 치매 개선 효과를 나타냄을 잘 보여준다.
2-2. Y자형 미로 실험 (Y-maze task)
Y자형 미로 측정장치는 3개의 통로 (arm)를 뻗어 알파벳 Y자 모양을 하고 있으며 각 가지는 길이 25 cm, 높이 14 cm, 폭 5 cm 이고 동일한 각도로 위치한다. Y자형 미로의 한 통로의 끝에 실험동물의 머리 부분이 향하도록 두고 8 분 동안 자유롭게 통로를 돌아다니도록 한다. 동물의 움직임을 기록하고 동물의 뒷발까지 통로로 들어간 경우를 통과한 것 (arm entry)으로 본다. 동물의 움직임을 교차횟수 (alternation)로 나타내는데, 교차횟수란 동물이 연속적으로 3개의 통로를 통과하였을 때 한 번 교차한 것으로 정의된다. 자발적인 교차행동량은 실제 교차횟수와 최대 가능한 교차횟수 (즉, 총 교차횟수에서 2를 뺀 값)의 백분비로 표시한다.
실험에 사용한 유산균 중 가장 우수했던 유산균인 C29를 1x109 및 1x1010 CFU(개)를 1일 1회씩 2일간 투여하였다. 스코폴아민 (0.9 mg/kg)은 유산균 마지막 투여 1시간 후에 투여하였다.
그 결과, 도 6에서 확인할 수 있는 바와 같이, 스코폴아민만을 투여한 시험군에 비하여 C29를 투여한 시험군은 농도의존적으로 기억 개선 효과를 나타냈다.
2-3. 수중미로 시험(Water maze task)
원형의 물탱크(지름 100cm, 높이 35cm)에 온도 23℃의 물 속에 장치한 플랫폼이 보이지 않도록 분유를 넣어 부옇게 만든 물을 15cm 깊이로 채웠다. 마우스를 이용하는 경우, 플랫폼(platform, 지름 4.5cm, 높이 14.5cm)을 전체 물 탱크를 4등분한 중 하나의 부채꼴 중앙에 놓아 플랫폼 상단이 수면 0.5cm 밑에 위치하도록 하였다. 이 장치를 위치를 확인할 만한 표식이 있는 실험실에 설치하였다. 훈련 시험(Training trial)은 1일 3회씩 5일간 연속적으로 실시하였다. 일단 마우스가 플랫폼을 찾으면 약 10초간 플랫폼에 머무르도록 두었다가 원래의 우리로 돌아가 있도록 한 5분 후에 다음 시험을 실시하였다. 만일 마우스가 120초 이내에 플랫폼을 찾지 못하면 이를 플랫폼에 10초간 두었다가 시험을 끝냈다. 훈련이 끝난 동물을 대상으로 마지막 훈련 시험 24시간 후에 프로브 시험(probe test)을 실시하였다. 이때는 풀에서 플랫폼을 제거하고 90초 동안에 플랫폼이 놓여 있던 4분원에 머무는 시간을 측정하여 백분율로 나타냈다.
실험에 사용한 유산균 중 가장 우수했던 C29 유산균을 1x109 및 1x1010 CFU(개)를 1일 1회씩 4일간 투여하면서 매일 수영 시간을 측정하였다. 스코폴아민 (0.9 mg/kg)은 유산균 첫 투여 1시간 후에 투여하였다.
그 결과, 도 7에서 확인할 수 있는 바와 같이, C29 유산균은 농도의존적으로 기억 개선 효과를 나타냈다.
실시예 3. 항산화, 항노화, 및 항치매 효과의 확인
항산화, 항노화 및 항치매 효과의 확인을 위하여, 16개월령 마우스에 3가지 유산균 C29, C3, C24(각각 1x109 CFU)를 주 5일씩 12주간 투여하고 산화반응의 진행이 빠른 대장에서 유산균의 항산화 효과와 노화관련 유전자 AKT, FOXO3, NF-kB(p65), mTor 인산화체를 측정하였다. 비교 유전자로 베타-액틴을 측정하였다. 또한, 기억력 개선 효과를 측정하였다.
1) 지질 과산화물 분석
실험동물의 대장조직 100 mg에 프로테아제 억제제 칵테일이 함유된 250 ㎕의 RIPA buffer를 첨가하여 균질화시켰다. 그 후 4℃, 13000 rpm에서 15분간 원심분리한 후 상등액을 -80℃에서 보관하면서 지질 과산화 분석에 사용하였다.
대장조직 내 지질 과산화 정도는 TBARS 분석 키트(Cayman chem., USA)를 사용하여 분석하였다. 대장조직의 균질액 100 ㎕를 5 ㎖의 폴리프로필렌 스크류캡 원심분리 튜브에 넣은 다음, 100 ㎕의 SDS 용액을 첨가하고 가볍게 흔들었다. 4 ㎖의 컬러 시약을 튜브에 첨가한 다음, 1시간 동안 끊는 물에 넣어 반응을 중지시켰다. 그 후, 4℃, 13000 rpm에서 10분간 원심분리한 후, 실온에서 30분간 정치하고 ELISA 판독기를 이용하여 540 nm에서 흡광도를 측정하였다. 표준물질로 말론알데히드(MDA)를 사용하여 표준곡선을 작성하고 이것으로부터 생성된 MDA의 양을 측정하였다.
2) 수퍼옥사이드 디스뮤타아제(Superoxide dismutase)(SOD) 활성
Cu, Zn-SOD 활성은 잔틴 옥시다아제-사이토크롬(xanthine oxidase-cytochrome) C 시스템을 사용하여 측정하였다. 50 mM 인산칼륨 버퍼(pH 7.8, 0.1 mM EDTA 함유) 2.4 ㎖, 0.1 mM 페리사이토크롬 C 0.3 ㎖, 1% 데옥시콜레이트 0.2 ㎖, 1.5 mM 시안화칼륨 0.1 ㎖, 0.5 mM 잔틴 0.3 ㎖ 및 희석 잔틴 옥시다아제 20 ㎖를 잘 혼합하여, 페리사이토크롬 C의 감소율을 25 ℃, 550 nm에서 측정하였다. SOD의 1 unit는 사이토크롬 C의 50% 감소를 저해하기 위한 SOD의 양으로 정의하였다.
3) 카탈라아제(Catalase) 활성
50 mM 인산염 버퍼(pH 7.0) 2 ㎖에 효소원 100 ㎕를 가하고 10 mM H2O2 용액을 1 ㎖ 가하여 240 nm에서 2분간 흡광도 감소를 측정하였다. 1 unit는 1분 동안 H2O2 1 mol을 분해하는 효소의 양으로 정의하였다.
4) 글루타치온(GSH)
GSH 농도는 샘플을 인산염 버퍼로 희석하여 o-프탈알데히드를 가하고, 15분 진탕 후, 여기 파장 345 nm, 방사 파장 425 nm에서 형광을 측정하였다.
상기한 바와 같은 4가지의 실험 결과, 하기 표 6에 나타난 바와 같이, 실험에 사용한 3가지의 균주 모두 우수한 항산화 및 항노화 결과를 나타냈다. 가장 우수한 균주는 C29였고, 이어서 C24, C3 순이였다.
[표 6]
Figure PCTKR2013007410-appb-I000006
또한, 실험동물의 대장조직 100 ㎎에 프로테아제 억제제 칵테일이 함유된 250 ㎕의 RIPA buffer (Gibco사)를 첨가하여 균질화시켰다. 4℃, 13000 rpm에서 15분간 원심분리한 후 상등액을 -80℃에서 보관하면서 포스포르-FOXO3, 포스포르-p65, p65, 포스포르-mTor, 포스포르-AKT 및 β-액틴을 면역블롯팅 방법으로 측정하였다.
상등액을 취해 SDS 10%(w/v) 폴리아크릴아미드 젤에서 1시간 30분간 전기영동을 하였다 (샘플, 50 ㎍). 전기영동한 것을 니트로셀룰로스지에 100V, 400mA에서 1시간 10분간 트랜스퍼하고, 이 트랜스퍼된 니트로셀룰로스지를 30분간 5% 탈지유로 블로킹한 후 5분씩 3회 PBS-Tween으로 세척하고, 1차 항체(Santa Cruz Biotechnology, 미국)를 1:100으로 밤새 반응시켰다. 그 후 10분씩 3회 세척한 후, 2차 항체(Santa Cruz Biotechnology, 미국)를 1:1000으로 1시간 20분간 반응시켰다. 그 후 15분씩 3회 세척하고, 형광발색시켜 현상하였다.
유효성분과 LPS 처리하지 않은 것을 제외하고, 동일하게 처리한 세포를 대조군으로 하였다. 그 결과, 도 8에 나타난 바와 같이, C29 또는 C3로 처리한 시험군의 경우, 비처리군에 비하여 p-p65, p-FOXO3, p-mTor, p-AKT 등이 현저하게 줄어드는 것을 볼 수 있으며, 이는 C29 또는 C3에 의한 항산화 및 항노화 효과를 잘 보여주는 것이다.
5) Y자형 미로 실험 (Y-maze task)
Y자형 미로 측정장치는 3개의 통로 (arm)를 뻗어 알파벳 Y자 모양을 하고 있으며 각 가지는 길이 25 cm, 높이 14 cm, 폭 5 cm 이고 동일한 각도로 위치한다. Y자형 미로의 한 통로의 끝에 실험동물의 머리 부분이 향하도록 두고 8 분 동안 자유롭게 통로를 돌아다니도록 한다. 동물의 움직임을 기록하고 동물의 뒷발까지 통로로 들어간 경우를 통과한 것 (arm entry)으로 본다. 동물의 움직임을 교차횟수 (alternation)로 나타내는데, 교차횟수란 동물이 연속적으로 3개의 통로를 통과하였을 때 한 번 교차한 것으로 정의된다. 자발적인 교차행동량은 실제 교차횟수와 최대 가능한 교차횟수 (즉, 총 교차횟수에서 2를 뺀 값)의 백분비로 표시한다.
실험에서 C29 유산균, C3 유산균 및 C24 유산균을 16개월령 마우스에 각각 1x109 CFU(개)를 1일 1회씩 2일간 투여하였다. 본 시험에서는 어린 마우스에 비하여 노화 마우스는 기억력이 떨어지기 때문에 스코폴아민은 투여하지 않았다.
그 결과, 도 9에서 확인할 수 있는 바와 같이, 노화된 마우스의 기억력 개선효과는 C29 유산균이 가장 우수했으며 그 다음으로 C3 유산균, C24 유산균 순이었다.
6) 수중미로 시험(Morris water maze test)
원형의 물탱크(지름 100cm, 높이 35cm)에 온도 23℃의 물 속에 장치한 플랫폼이 보이지 않도록 분유를 넣어 부옇게 만든 물을 15cm 깊이로 채웠다. 마우스를 이용하는 경우, 플랫폼(platform, 지름 4.5cm, 높이 14.5cm)을 전체 물 탱크를 4등분한 중 하나의 부채꼴 중앙에 놓아 플랫폼 상단이 수면 0.5cm 밑에 위치하도록 하였다. 이 장치를 위치를 확인할 만한 표식이 있는 실험실에 설치하였다. 훈련 시험(Training trial)은 1일 3회씩 5일간 연속적으로 실시하였다. 일단 마우스가 플랫폼을 찾으면 약 10초간 플랫폼에 머무르도록 두었다가 원래의 우리로 돌아가 있도록 한 5분 후에 다음 시험을 실시하였다. 만일 마우스가 120초 이내에 플랫폼을 찾지 못하면 이를 플랫폼에 10초간 두었다가 시험을 끝냈다. 훈련이 끝난 동물을 대상으로 마지막 훈련 시험 24시간 후에 프로브 시험(probe test)을 실시하였다. 이때는 풀에서 플랫폼을 제거하고 90초 동안에 플랫폼이 놓여 있던 4분원에 머무는 시간을 측정하여 백분율로 나타냈다.
실험에서 C29 유산균, C3 유산균 및 C24 유산균을 16개월령 마우스에 각각 1x109 CFU(개)를 1일 1회씩 4일간 투여하면서 매일 수영 시간을 측정하였다. 본 시험에서는 어린 마우스에 비하여 노화 마우스는 기억력이 떨어지기 때문에 스코폴아민은 투여하지 않았다.
그 결과, 도 10에서 확인할 수 있는 바와 같이, 노화된 마우스의 기억력 개선효과는 C29 유산균이 가장 우수했으며 그 다음으로 C3 유산균, C24 유산균 순이었다.
실시예 4. C29 및 C3 유산균의 동정
상기 실험들에서 우수한 항산화 및 항노화 효과 및 치매 개선 효과를 가진 것으로 확인된 C29 균주와 C3 균주를 동정하기 위하여, 16S rDNA 유전자 서열 비교를 통한 계통유전학적 분석을 실시하였다.
블라스트 유사성 조사 프로그램을 이용하여 rDNA의 염기 서열을 비교하고, 다양한 락토바실러스 종 균주들의 16S rDNA 유전자 서열과 함께 다중 서열 정렬을 진행한 후 계통수에서의 위치를 판별한 결과, C29 유산균은 락토바실러스 플란타륨 균주 BIM B-536과 락토바실러스 펜토서스 균주 LS3과 99.9% 이상의 상동성을 나타내어 락토바실러스 펜토서스 변종 플란타륨 C29로 명명하고, 기탁 기관인 한국미생물보존센터(KCCM)에 2012년 7월 9일자로 기탁 번호 KCCM11291P로 기탁하였다. 또한, C3 유산균은 락토바실러스 쿠르바투스와 99.9% 이상의 상동성을 나타내어 락토바실러스 쿠르바투스 C3으로 명명하고, 기탁 기관인 한국미생물보존센터(KCCM)에 2012년 7월 9일자로 기탁 번호 KCCM43009로 기탁하였다.
실시예 5. C29 또는 C3 균주 발효 조성물의 항치매 효과 확인
C29 또는 C3 균주로 발효된 콩 또는 탈지콩 발효 조성물, 해동피 발효 조성물, 인삼 발효 조성물, 및 더덕 발효 조성물의 항치매 효과를 확인하기 위하여, 상기 실시예 2와 동일한 방법으로 실험 동물을 이용하여 수동회피반응 시험(Passive avoidance task test)을 실시하였다.
5-1. 발효 조성물 제조
콩 또는 탈지콩 분말 10g을 물 90ml에 현탁하고 멸균하여 1x108CFU(개)/0.1ml의 C29 또는 C3 균주 10ml를 넣어 24시간 동안 배양하였다.
해동피 물 추출물, 인삼 물 추출물 및 더덕 물 추출물 각각 10g을 물 90ml에 현탁하고 멸균하여 1x108/0.1ml의 C29 또는 C3 균주 10ml를 넣어 24시간 동안 배양하였다.
5-2. 수동회피반응 시험(Passive avoidance task test)
상기 방법에 의해 제조된 콩 또는 탈지콩 발효 조성물, 해동피 발효 조성물, 인삼 발효 조성물, 및 더덕 발효 조성물 각각 0.1ml를 1일 1회씩 2일간 치매 동물 모델인 마우스에 투여하였다. 스코폴아민(Scopolamine) (0.9 mg/kg)은 유산균 마지막 투여 1시간 후에 투여하였다. 그 결과, 도 12에서 확인할 수 있는 바와 같이, C29로 발효시킨 콩 발효 조성물이 수동 회피에 대한 기억이 가장 잘 유지되며 치매 치료제인 타크린(Tacrin, TAC, 10 mg/kg)보다 효과가 우수한 것으로 나타났으며, 다음으로 C29로 발효시킨 인삼 발효 조성물, C3으로 발효시킨 콩 발효 조성물, C29로 발효시킨 더덕 발효 조성물 순이었다. 이는 C29 또는 C3 균주로 발효시킨 발효 조성물이 기억 개선 효과를 가짐을 보여주는 것이다.
상기와 같은 실험 결과는 C29 또는 C3 균주로 발효시킨 발효 조성물이 기억력 개선을 통해 치매 개선 효과를 나타냄을 잘 보여준다.

Claims (16)

  1. 락토바실러스 펜토서스 변종 플란타륨(Lactobacillus pentosus var. plantarum) C29 KCCM11291P.
  2. 락토바실러스 펜토서스 변종 플란타륨 C29 KCCM11291P 균주를 유효 성분으로 포함하는 항산화 및 항노화 약학 조성물.
  3. 락토바실러스 펜토서스 변종 플란타륨 C29 KCCM11291P 균주를 유효 성분으로 포함하는 치매의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  4. 락토바실러스 펜토서스 변종 플란타륨 C29 KCCM11291P 균주를 유효 성분으로 포함하는 항산화 및 항노화 효과를 가진 건강기능식품.
  5. 락토바실러스 펜토서스 변종 플란타륨 C29 KCCM11291P 균주를 유효 성분으로 포함하는 치매의 예방 또는 개선용 건강기능식품.
  6. 제3항에 있어서, 치매는 노인성 치매, 알츠하이머병, 혈관성 치매, 루이체 치매, 전측두엽 치매, 파킨슨병 치매, 헌팅턴병 치매, 정상압 뇌수두증에 의한 치매, 두부 외상으로 인한 치매, 및 물질로 유발된 치매로 이루어진 군으로부터 선택되는 약학 조성물.
  7. 제5항에 있어서, 치매는 노인성 치매, 알츠하이머병, 혈관성 치매, 루이체 치매, 전측두엽 치매, 파킨슨병 치매, 헌팅턴병 치매, 정상압 뇌수두증에 의한 치매, 두부 외상으로 인한 치매, 및 물질로 유발된 치매로 이루어진 군으로부터 선택되는 건강기능식품.
  8. 락토바실러스 쿠르바투스(Lactobacillus curvatus) C3 KCCM43009 균주를 유효 성분으로 포함하는 항산화 및 항노화 약학 조성물.
  9. 락토바실러스 쿠르바투스 C3 KCCM43009 균주를 유효 성분으로 포함하는 치매의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  10. 락토바실러스 쿠르바투스 C3 KCCM43009 균주를 유효 성분으로 포함하는 항산화 및 항노화 효과를 가진 건강기능식품.
  11. 락토바실러스 쿠르바투스 C3 KCCM43009 균주를 유효 성분으로 포함하는 치매의 예방 또는 개선용 건강기능식품.
  12. 제9항에 있어서, 치매는 노인성 치매, 알츠하이머병, 혈관성 치매, 루이체 치매, 전측두엽 치매, 파킨슨병 치매, 헌팅턴병 치매, 정상압 뇌수두증에 의한 치매, 두부 외상으로 인한 치매, 및 물질로 유발된 치매로 이루어진 군으로부터 선택되는 약학 조성물.
  13. 제11항에 있어서, 치매는 노인성 치매, 알츠하이머병, 혈관성 치매, 루이체 치매, 전측두엽 치매, 파킨슨병 치매, 헌팅턴병 치매, 정상압 뇌수두증에 의한 치매, 두부 외상으로 인한 치매, 및 물질로 유발된 치매로 이루어진 군으로부터 선택되는 건강기능식품.
  14. 락토바실러스 펜토서스 변종 플란타륨 C29 KCCM11291P 균주 또는 락토바실러스 쿠르바투스 C3 KCCM43009 균주로 발효된 발효 조성물을 유효 성분으로 포함하는 치매의 예방 또는 치료용 조성물.
  15. 제14항에 있어서, 상기 발효 조성물은 콩 또는 탈지콩 발효 조성물, 해동피 발효 조성물, 인삼 발효 조성물, 및 더덕 발효 조성물로 이루어진 군으로부터 선택되는 치매의 예방 또는 치료용 조성물.
  16. 제14항 또는 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 치매는 노인성 치매, 알츠하이머병, 혈관성 치매, 루이체 치매, 전측두엽 치매, 파킨슨병 치매, 헌팅턴병 치매, 정상압 뇌수두증에 의한 치매, 두부 외상으로 인한 치매, 및 물질로 유발된 치매로 이루어진 군으로부터 선택되는 치매의 예방 또는 치료용 조성물.
    Figure PCTKR2013007410-appb-I000007
    Figure PCTKR2013007410-appb-I000008
    Figure PCTKR2013007410-appb-I000009
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