WO2013137209A1 - 一粒子解析装置および解析方法 - Google Patents

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WO2013137209A1
WO2013137209A1 PCT/JP2013/056690 JP2013056690W WO2013137209A1 WO 2013137209 A1 WO2013137209 A1 WO 2013137209A1 JP 2013056690 W JP2013056690 W JP 2013056690W WO 2013137209 A1 WO2013137209 A1 WO 2013137209A1
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hole
electrode
diameter
particle
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本郷　禎人
川合　知二
真楠 筒井
正輝 谷口
奏 龍▲崎▼
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株式会社 東芝
国立大学法人大阪大学
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    • G01N33/487—Physical analysis of biological material of liquid biological material
    • G01N33/48707—Physical analysis of biological material of liquid biological material by electrical means
    • G01N33/48721—Investigating individual macromolecules, e.g. by translocation through nanopores

Definitions

  • Embodiments of the present invention relate to a single particle analysis apparatus and an analysis method.
  • a method for identifying viruses and bacteria As a method for identifying viruses and bacteria, a PCR method for identifying genes, a method using a DNA chip, an ELISA method using an antigen-antibody reaction, and the like are well known. Attempts have also been made to detect viruses and bacteria by determining the size of particles in a sample.
  • An object of the present invention is to provide a one-particle analysis apparatus and an analysis method that can more accurately identify differences in particle size and shape.
  • the measurement container, the first chamber and the second chamber in which the measurement container is partitioned by an insulating partition, the first chamber and the second chamber opened in the partition There is provided a one-particle analysis apparatus comprising a through-hole communicating with a chamber, a first electrode disposed in the first chamber, and a second electrode disposed in the second chamber.
  • the A current is passed between the first electrode and the second electrode through the through hole of the partition wall.
  • the electrical characteristics of the particulate measurement object in the first chamber passing through the through hole into the second chamber are measured, and the shape of the measurement object is measured.
  • a single particle analysis apparatus and analysis method capable of more accurately discriminating differences in particle size and shape are provided.
  • FIG. 1 is a schematic diagram illustrating a cross-sectional structure of the embodiment.
  • FIG. 2 is a plan view and a cross-sectional view showing a partition wall.
  • FIG. 3 is a plan view showing an example of the opening shape of the through hole.
  • FIG. 4 is a graph illustrating an example of a detection signal obtained by the embodiment.
  • FIG. 5 is a schematic diagram illustrating an example of a measurement object.
  • FIG. 6 is a schematic diagram illustrating a cross-sectional structure of the embodiment.
  • FIG. 7 is a graph illustrating an example of a detection signal obtained according to the embodiment.
  • FIG. 8 is a graph showing a change over time of an example of a detection signal obtained by the embodiment.
  • FIG. 1 is a schematic diagram illustrating a cross-sectional structure of the embodiment.
  • FIG. 2 is a plan view and a cross-sectional view showing a partition wall.
  • FIG. 3 is a plan view showing an example of the opening shape of the through hole.
  • FIG. 9 is a schematic diagram showing a step of forming a through hole in the partition wall.
  • FIG. 10 is a plan view and a cross-sectional view showing the embodiment.
  • FIG. 11 is an exploded view of the embodiment.
  • FIG. 12 is a graph showing the detection signal measured in the example.
  • FIG. 13 is a graph showing the detection signal measured in the example.
  • FIG. 14 is a graph showing the results of measuring two particles having different diameters.
  • FIG. 15 is a graph showing changes in ion current when a single bead passes through a 1 ⁇ m diameter pore.
  • FIG. 16 is a graph (a) showing a change in ion current, a diagram (b) showing a shape of a measurement object calculated from the change in ion current, and an electron micrograph (c) of the measurement object.
  • FIG. 17 is a graph showing changes in ion current when the dimer beads pass through a 1 ⁇ m pore.
  • FIG. 18 is a graph showing changes in ion current when the trimer beads pass through a 1 ⁇ m diameter pore.
  • FIG. 1 shows a cross-sectional configuration of a first embodiment which is an example of a single particle analysis apparatus.
  • the single particle analyzer includes a measurement container 10.
  • the measurement container 10 includes a first chamber 12 and a second chamber 13 that are partitioned by an insulating partition wall 11.
  • a through hole 14 is opened in the partition wall 11 so as to communicate the first chamber 12 and the second chamber 13.
  • the partition wall 11 is supported by a substrate 15 having a sufficient thickness except for the vicinity of the through hole 14.
  • An electrode 16 and an electrode 17 are provided on the wall of the measurement container 10.
  • the electrode 16 is provided so that a part thereof is exposed in the first chamber 12.
  • the electrode 17 is provided so that a part thereof is exposed in the second chamber 13.
  • the electrode 16 is connected to the ground 19 through a lead 18.
  • the electrode 17 is connected to the earth 21 through the lead 20.
  • the ammeter 22 and the power source 23 are interposed in this order from the electrode 17 side to the lead 20.
  • the apparatus shown in FIG. 1 preferably further includes a noise removal circuit, a voltage stabilization circuit, and the like.
  • FIG. 2A is a plan view of the partition wall 11 as seen from the first chamber 12 side.
  • a through hole 14 having a circular opening shape is opened in the partition wall 11.
  • FIG. 2B is a cross section of the partition 11 taken along the line bb.
  • the position where the substrate 15 supporting the partition wall 11 is disposed is a region excluding the vicinity of the through hole 14 of the partition wall 11. That is, the substrate 15 is arranged such that when the measurement object passes through the through hole 14, only the partition wall 11 existing so that the electrical resistance related to the measurement object defines the through hole 14 is affected. The Therefore, the substrate 15 does not affect the electrical resistance related to the measurement target when the measurement target passes through the through hole 14, and is ignored in the calculation for obtaining the electrical resistance related to the measurement target. be able to.
  • the vicinity of the through hole 14 of the partition wall 11 is a range defined by the distance from the edge of the partition wall 11 defining the through hole 14 to the substrate 15 and is indicated by the symbol p in FIG.
  • the vicinity of the through hole 14 is a region that extends all around the through hole 14.
  • the relationship between the vicinity of the through hole 14 and the diameter d of the opening of the through hole 14 is preferably expressed by the following equation p ⁇ d And more preferably, the following formula p ⁇ 0.5d May be satisfied.
  • the measuring vessel 10 is electrically or chemically unaffected by the whole or inside of the first chamber 12, inside of the second chamber 13, contact portion with the first electrode 16, and contact portion with the second electrode. What is necessary is just to be comprised with the active well-known any material.
  • the active well-known any material for example, it may be formed of glass, sapphire, ceramic, resin, rubber, elastomer, SiO 2 , SiN, Al 2 O 3 or the like.
  • the partition wall 11 is itself electrically and chemically inert and formed of an insulating material such as glass, sapphire, ceramic, resin, rubber, elastomer, SiO 2 , SiN, Al 2 O 3 or the like. Good.
  • any material known per se such as an Ag / AgCl electrode, a Pt electrode, or an Au electrode, may be used.
  • An Ag / AgCl electrode is preferable.
  • the volume of the first chamber and the volume of the second chamber may be the same or different.
  • the volume of the first chamber may be, for example, 1 zL to 1 mL, and preferably 1 fL to 1 ⁇ L.
  • the volume of the second chamber may be, for example, 1 zL to 1 mL, and preferably 1 fL to 1 ⁇ L.
  • the volume of each chamber may be, for example, 1 zL to 1 mL, 1 zL to 10 mL, or the like.
  • the volume of each chamber may be, for example, 1 ⁇ L to 1 mL, 1 ⁇ L to 1 L.
  • the diameter of the through hole 14 and the thickness of the partition wall 11 near the through hole 14 may be determined depending on the size of the particle to be measured. Details will be described later.
  • the liquid is filled in the first chamber 12 and the second chamber 13. At this time, a liquid junction is formed between the inside of the first chamber 12 and the inside of the second chamber 13 through the through hole 14.
  • the first chamber 12 contains particles 24 that are measurement objects.
  • the first electrode 16 and the second electrode 17 are respectively filled in the first chamber 12 and the second chamber 13 and immersed in the liquid.
  • the liquid contained in the first chamber and the second chamber may be a liquid that can be energized between the first electrode 16 and the second electrode 17.
  • the liquid that can be energized may be, for example, an electrolyte solution such as an aqueous KCl solution, or a buffer solution such as a TE buffer solution and a PBS buffer solution.
  • a current is supplied between the first electrode 16 and the second electrode 17 by the power source 23.
  • the current value generated by this energization is measured with the ammeter 22 over time.
  • the particles 24 in the first chamber move through the through hole 14 and into the second chamber by diffusion.
  • the current value measured by the ammeter 22 when the particle 24 passes through the through hole 14 decreases depending on the size and shape of the particle 24.
  • FIG. 4 shows an example of a change in current value as a detection signal to be measured.
  • the vertical axis represents the current value
  • the horizontal axis represents the measurement time.
  • the movement of the particles 24 from the first chamber into the second chamber is due to diffusion.
  • this movement is not limited to diffusion.
  • the movement of the particles may be facilitated by electrophoresis or liquid flow that moves the particles from within the first chamber into the second chamber.
  • electrophoresis for example, it may be performed by energization between the first electrode 16 and the second electrode 17, and an electrode other than the first electrode 16 and the second electrode 17.
  • Electrophoresis may be performed by using
  • electrophoresis from the first chamber to the second chamber is performed by setting the voltage of the second electrode 17 to be positive.
  • a first opening is provided for the liquid to flow into the measurement chamber wall surface on the first chamber side.
  • a second opening for discharging the liquid is provided on the measurement vessel wall surface on the second chamber side. Movement of the particles 24 is facilitated by flowing liquid from the first opening and / or discharging liquid from the second opening.
  • a first inflow port for the liquid to flow into the measurement container wall surface on the first chamber side and a first outflow port for the liquid to flow out are provided.
  • a second inflow port for allowing the liquid to flow into the measurement container wall surface on the second chamber side and a second outflow port for allowing the liquid to flow out are provided.
  • a liquid flow from the first chamber to the second chamber may be generated by electroosmotic flow. Further, a liquid flow from the first chamber to the second chamber may be caused by a pressure difference between the first chamber and the second chamber. Any means known per se may be used as the means for obtaining the electroosmotic flow and the pressure difference.
  • the detection signal may be a voltage value or a resistance value when a constant current is applied.
  • the current value and the resistance value may be measured using any method known per se.
  • the power source 23 and the ammeter 22 may not be interposed in the electrode 17 by the lead 20 in the second electrode. That is, the ammeter 22 and the power source 23 may be interposed in this order from the first electrode 16 side to the lead 18.
  • the first electrode 16 and the second electrode 17 may be disposed in the first chamber and the second chamber, respectively. Therefore, the first electrode 16 may be disposed on the partition wall in contact with the solution in the first chamber, and the second electrode 17 may be disposed on the partition wall in contact with the solution in the second chamber or on the substrate 15. .
  • the first electrode 16 is disposed in the solution in the first chamber connected to the first lead or the like, and the second electrode is connected to the second lead or the like in the solution in the second chamber.
  • An electrode 17 may be disposed.
  • the through-hole 14 having a circular opening shape has been described as shown in FIGS. 2 (a) and 2 (b).
  • the opening shape of the through hole is not limited to a circle.
  • an elliptical through hole 31 as shown in FIG. A compound circular through-hole 32 of an ellipse and a circle as shown in FIG.
  • the opening shape of the through hole may be selected.
  • the through hole having an elliptical opening shape in FIG. 3A may be preferable in terms of shape recognition.
  • a through hole in which the shape of the opening in FIG. 3B is a composite circle may be preferable in terms of shape recognition.
  • a rectangular or polygonal shape or a combination of a rectangular or polygonal shape and an elliptical or circular shape may be used.
  • the first electrode 16 and the second electrode 17 are the liquid in the first chamber 12, the through hole 14, and the second chamber 13. It is energized through the liquid.
  • the size and shape of the measurement object passing through the through-hole 14, that is, the particle 24, is measured.
  • the following relationship is important: That is, if the diameter of the opening of the through hole 14 opening in the partition wall 11 (hereinafter referred to as “the diameter of the through hole”) is d and the thickness of the partition wall 11 near the through hole 14 is t, the through hole The diameter d of the hole is larger than the thickness t.
  • the diameter of the spherical particle 24 to be measured is a
  • the diameter d of the through hole 14 is larger than the diameter a of the spherical particle 24.
  • the thickness t of the partition wall 11 in the vicinity of the through hole 14 is smaller than the diameter a of the spherical particle 24. Further, this relationship will be described.
  • FIG. 5 shows spherical particles 51 and elongated particles 52 as examples of particles to be measured.
  • the granular particle 51 has a diameter a.
  • “major axis” is “L”
  • “minor axis” is “s” in “diameter”.
  • the opening shape when the opening shape is circular, the diameter of the through hole 14 is d, and the thickness of the partition wall 11 near the through hole is t.
  • the opening may have a shape other than a circle, for example, an ellipse or an elongated shape.
  • the minor axis of the ellipse is referred to as the through hole diameter d.
  • the opening may have a shape in which, for example, a part of an ellipse and a part of a circle are combined.
  • the diameter d of the opening is the smallest diameter and is referred to as d.
  • the relationship between the short diameter s, the long diameter L, the diameter d of the through hole 14 and the thickness t near the through hole 14 satisfies the following formula; s ⁇ d ⁇ 100 s and t ⁇ L.
  • the relationship between the diameter a of the spherical particle 51 and the thickness t of the partition wall in the vicinity of the through hole 14 may be t to 100t ⁇ a, for example, 2t ⁇ a, 5t ⁇ a, 10t ⁇ a, 100t ⁇ a. May be.
  • the relationship between the diameter a of the spherical particles 51 and the diameter d of the through holes 14 may be 1 to 2 ⁇ d / a ⁇ 5 to 100.
  • the relationship between the long diameter L of the long fine particle 52 and the thickness t of the partition wall in the vicinity of the through-hole 14 may be t to 100t ⁇ L, for example, 2t ⁇ L, 5t ⁇ L, 10t ⁇ L, 100t ⁇ L. There may be.
  • the relationship between the short diameter s of the long fine particle 52 and the diameter d of the through hole 14 may be 1 to 2 ⁇ d / s ⁇ 5 to 100, for example, 1 ⁇ d / s ⁇ 75, 1 ⁇ d / It may be s ⁇ 50, 1 ⁇ d / s ⁇ 25, 1 ⁇ d / s ⁇ 10 and 1 ⁇ d / s ⁇ 5.
  • the vicinity of the through hole may be a region where the thickness of the partition wall required to enable measurement of the shape and size of the particle to be measured should be t. If the partition wall thickness should be t, that is, the diameter in the vicinity of the through hole is A, then A may satisfy the following formula for the through hole d; 2d ⁇ A ⁇ 15000t, preferably 3d ⁇ A ⁇ 10000t.
  • the measurement object may be a particle of 1 mm or less.
  • the measurement object may be pollen, bacteria, and virus.
  • Pollen is a spherical particle with a particle size of about 50 ⁇ m to about 100 ⁇ m.
  • pollen examples include cypress pollen (particle size of about 30 ⁇ m to about 45 ⁇ m), cedar pollen (particle size of about 30 ⁇ m to about 40 ⁇ m), and pine pollen (particle size of about 45 ⁇ m to about 55 ⁇ m).
  • bacteria examples include, for example, anthrax, plague and botulinum.
  • Anthrax has a minor axis of about 1.0 ⁇ m to about 1.2 ⁇ m and a particle length of about 5.0 ⁇ m to about 2.0 ⁇ m.
  • Plasmodium has a minor axis of about 0.5 ⁇ m to about 0.8 ⁇ m and a particle length of about 1.5 ⁇ m to 2.0 ⁇ m.
  • Clostridium botulinum has a minor axis of about 0.5 ⁇ m to about 2.0 ⁇ m and a particle length of about 2.0 to about 10 ⁇ m.
  • viruses include, for example, smallpox virus, avian influenza virus, SARS virus, foot-and-mouth disease virus, and Ebola virus.
  • Smallpox virus has a particle size of about 200 nm.
  • Avian influenza virus has a particle size of about 80 nm to about 130 nm.
  • SARS virus has a particle size of about 60 nm to about 220 nm.
  • the foot-and-mouth disease virus has a particle size of about 21 to about 25 nm.
  • Ebola virus is a string-like virus having a particle length of about 80 nm to about 800 nm.
  • the diameter d of the through hole 14 may be 10 nm to 1 mm, or 50 nm to 1 mm.
  • the diameter d of the through hole 14 is 10 nm or more, 30 nm or more, 50 nm or more, 75 nm or more, 100 nm or more, 150 nm or more, 200 nm or more, 500 nm or more, 800 nm or more, 1 ⁇ m or more, 2 ⁇ m or more, 3 ⁇ m or more, 5 ⁇ m or more, 10 ⁇ m.
  • the diameter d of the through hole 14 is 1 mm or less, 800 ⁇ m or less, 750 ⁇ m or less, 500 ⁇ m or less, 250 ⁇ m or less, 100 ⁇ m or less, 75 ⁇ m or less, 50 ⁇ or less, 20 ⁇ or less, 10 ⁇ m or less, 5 ⁇ m or less, 3 ⁇ m or less, 2 ⁇ m or less.
  • It may be 1 ⁇ m or less, 800 nm or less, 500 nm or less, 200 nm or less, 150 nm or less, 100 nm or less, 75 nm or less, or 50 nm or less. Moreover, the range which combines the said minimum and upper limit is also preferable.
  • the thickness of the partition wall 11 may be determined according to the size of the measurement object, that is, the diameter.
  • the thickness of the partition wall 11 may be 10 nm to 500 nm, 20 nm to 450 nm, or the like.
  • the thickness of the partition wall 11 is more preferably 35 nm to 50 nm.
  • the thickness of the partition wall 11 is not limited to such a range, and the relationship between the diameter a of the measurement object, the diameter d of the through hole 14, and the thickness t of the partition wall in the vicinity of the through hole 14 is as follows. Just fill it.
  • the first chamber 12 contains two different particles having different shapes, a particle A61 and a particle B62.
  • the particles A61 are long and thin particles having a substantially constant cross section along the longitudinal direction.
  • the particle B62 is a long and narrow particle having a narrowed portion at the center of the longitudinal axis.
  • a power source 23 energizes between the first electrode 16 and the second electrode 17. The current value generated by this energization is measured with the ammeter 22 over time.
  • FIG. 7 shows an example of a change in current value as a detection signal to be measured.
  • the current value shows a constant base value (71).
  • FIG. 7 shows a current signal when the particle A61 and the particle B62 sequentially pass through the through hole 14 in this order.
  • the current value decreases depending on the size and shape (72). After the particle A61 completely adds the through-hole 14, the current value is restored to the base value (73). Furthermore, when the particle B62 passes through the through hole 14, the current value decreases depending on the size and shape (74). After the particle B62 completely adds the through hole 14, the current value is restored to the base value (75). In the case of the particle B62, the current value when the throttle portion at the center of the longitudinal axis passes through the through hole 14 increases depending on the shape of the throttle portion. Based on such a change in current value over time, the particles A61 and B62 are present in the particle group existing in the first chamber, and the first particle that has passed through the through hole 14 is the particle A61. It is possible to determine that the particles that have passed through the through hole 14 are particles B62. Therefore, it is possible to determine the size and shape of the particles in the sample by measuring the change over time of the electrical signal thus detected.
  • FIG. 8A schematically shows the positional relationship between the particle B62 and the through hole 14 when the particle B62 passes through the through hole 14.
  • FIG. 8B shows the change in current value detected over time when the particles B62 and the through-holes 14 are in the respective positional relationships shown in FIG. 8A.
  • 8 (a-1) to (a-5) describe the positional relationship between the particles B62 and the partition walls in chronological order from the upper stage to the lower stage.
  • FIG. 8B includes (b-1) to (b-5).
  • FIGS. 8 (b-1) to (b-5) correspond to FIGS. 8 (a-1) to (a-5), respectively, and describe the change in current value in chronological order from the upper level to the lower level.
  • the current signal remains at the base value and no change is observed (b-1).
  • the current value decreases according to the shape of the region where the particle B62 crosses the through hole 14 (b-2). Further, when the narrowed portion at the center of the longitudinal axis of the particle B62 passes through the through hole 14 (a-3), the current value increases (b-3). Further, according to the change in the shape of the particle B62 (a-4), when a portion thicker than the throttle portion again passes through the through hole 14 (a-4), the current value decreases again (b-4). After the particle B62 completely passes through the through hole 14 (a-5), the current value is restored to the base value (b-5).
  • This phenomenon is a phenomenon that can be observed for the first time when the thickness of the partition wall 11 is set sufficiently thinner than the length of the particle B. Needless to say, according to the present invention, it is possible to identify whether the particles are present in a single particle state or whether two or more particles are aggregated.
  • the SiO 2 film 92 is laminated on the Si substrate 91 (FIG. 9A).
  • the SiO 2 film 92 may be a thermal oxide film, a thermal CVD (Chemical Vapor Deposition) method, or a plasma CVD method.
  • a resist 93 is applied on the SiO 2 film 92.
  • an opening pattern is formed in the resist 93 by exposing and developing the region where the through hole is to be formed (FIG. 9b).
  • the exposure may be performed using a photolithography method using light or an electron beam drawing method.
  • photolithography is often used to form a pattern larger than 1 ⁇ m.
  • an electron beam drawing method is often used.
  • the present invention is not necessarily limited thereto.
  • the SiO 2 film 92 is etched using the formed resist 93 pattern as a mask (FIG. 9c).
  • the etching may be wet etching using NH 4 F or HF, or may be anisotropic dry etching such as RIE (Reactive Ion Etching) using CF 4 gas. In order to obtain pattern accuracy, dry etching is preferable.
  • the resist pattern may be transferred to the metal layer, and then the SiO 2 film 92 may be etched using the metal film as a mask.
  • the resist is removed after the etching (FIG. 9d).
  • a resist 94 is applied to the back surface of the Si substrate 91.
  • a pattern is formed so as to open a region including a region where a through hole is to be formed (FIG. 9e).
  • the Si substrate 91 is etched to expose the SiO 2 film 82 in the through hole (FIG. 9F).
  • the resist 94 used as a mask is removed (FIG. 9g).
  • the back surface etching may be performed after transferring the pattern to the metal film in the same manner as the front surface.
  • the film used as the partition is not limited to the SiO 2 film, and may be a SiN film, an Al 2 O 3 film, or another insulating film.
  • the substrate material is not limited to Si, and may be glass, sapphire, ceramic, or resin.
  • a publicly known etching technique can be used. Such techniques include, but are not limited to, vertical deep etching with SF 6 and C 4 F 8 gas, isotropic etching with wet etching with KOH, dry etching with CF 4 gas, and the like. It is not a thing.
  • the method for forming the through hole 95 is not limited to the method for forming the through hole in the thin film on the substrate.
  • a partition wall having a through hole may be formed by adhering a thin film having a through hole on a support substrate.
  • Example 1 Manufacture of a partition
  • a Si substrate having a size of 10 mm square and a thickness of 0.2 mm was prepared.
  • a TEOS film having a thickness of 400 nm was stacked as the SiO 2 film.
  • a resist is applied, and a circular pattern having a diameter of 1.5 ⁇ m for the through hole is formed on the first surface of the substrate by exposing and developing by photolithography, and then the SiO 2 film is formed with CF 4 gas.
  • Etching was performed. Vertical deep etching was performed on the second surface of the substrate by switching between SF 6 and C 4 F 8 gases. Thereby, a region having a diameter of 200 ⁇ m was etched.
  • the resist on both sides of the substrate ie, the first side and the second side
  • a partition wall having a through hole having a circular opening shape with a diameter of 1.5 ⁇ m was formed.
  • Example 2 Manufacture of a partition wall
  • a 20 nm SiN film was laminated on a Si substrate having a size of 10 mm square and a thickness of 0.6 mm. Further, a resist was applied, and a circular opening pattern with a diameter of 75 nm was formed by an electron beam drawing method. The SiN film was etched with CF 4 gas using the formed resist pattern as a mask. Further, a resist was applied to the back surface, and a pattern was formed by photolithography. Next, wet etching with KOH was performed to form a 50 ⁇ m square opening. Thereafter, the resist was removed. Thereby, the partition which has a 75 nm diameter circular opening-shaped through-hole was formed. The thickness of the partition wall in the vicinity of the through hole was 20 nm.
  • Example 3 Single Particle Analysis Device Using the partition wall formed in Example 1, a single particle analysis device 1 as an example of the embodiment was manufactured. This single particle analyzing apparatus 1 will be described with reference to FIGS.
  • FIG. 10A is a plan view of the single particle analyzing apparatus 1.
  • FIG. 10B is a cross-sectional view of the single particle analyzing apparatus 1 cut along the line BB.
  • FIG. 11 is an exploded view of the single particle analysis device 1.
  • the size of the single particle analyzer 1 is 2.5 cm ⁇ 2.5 cm, and the thickness is 1 cm.
  • this device is a device in which nine members are stacked and fixed with screws 116.
  • the partition wall in which the through hole formed in Example 2 was opened was fixed to the center of the silicon rubber plate 101 having a thickness of 0.6 mm.
  • a concave portion having a size of 10 mm square and a depth of 0.6 mm was formed in the fixed portion.
  • an opening was formed in the center of the silicon rubber plate 101, and the through hole portion and the peripheral portion of the partition wall were exposed from the silicon rubber plate 101.
  • a first chamber 12 is formed in the Z-axis direction from the silicon rubber plate 101.
  • the first chamber is configured by laminating three plate-like members and cassette members each having an opening for defining the internal space. That is, the first chamber 12 includes a silicon rubber plate 102, an acrylic plate 103, a silicon rubber plate 104, and an acrylic cassette member 105 stacked in this order from the silicon rubber plate 101 side in the Z-axis direction ( FIG. 10B).
  • the thicknesses of the silicon rubber plate 102, the acrylic plate 103, and the silicon rubber plate 104 are 0.5 mm each.
  • a second chamber 13 is formed in the direction opposite to the Z-axis direction from the silicon rubber plate 101.
  • the second chamber is configured by laminating three plate-like members having an opening for defining the internal space and a cassette member. That is, the second chamber 13 is formed by laminating the silicon rubber plate 106, the acrylic plate 107, the silicon rubber plate 108, and the acrylic cassette member 109 in this order from the silicon rubber plate 101 side in the direction opposite to the Z-axis direction. (FIG. 10B).
  • the thicknesses of the silicon rubber plate 106, the acrylic plate 107, and the silicon rubber plate 108 are each 0.5 mm.
  • Silicon rubber plates 102, 104, 106 and 108 have linear openings 12A, 12C, 13A and 13C, respectively (FIG. 11). Each opening 12A, 12C, 13A and 13C extends linearly in the X-axis direction along the plane of each plate. The major axis of each opening 12A, 12C, 13A and 13C is 7 mm, and the minor axis is 2 mm.
  • the acrylic plates 103 and 107 have L-shaped openings 12B and 13B.
  • Each opening 12B extends linearly in the X-axis direction along the plane of the acrylic plate 103 and then bends and extends in the Y-axis direction.
  • Each opening 13B extends linearly in the opposite direction in the X-axis direction along the plane of the acrylic plate 107, and then bends and extends in the opposite direction in the Y-axis direction.
  • the major axis in the X-axis direction of each of the openings 12B and 13B is 20 mm
  • the major axis in the Y-axis direction is 9 mm
  • the minor axis is 2 mm.
  • the volumes of the first chamber and the second chamber thus defined are 40 ⁇ L, respectively.
  • the flow path for flowing the liquid into the first chamber is formed by a nozzle 119a having a hole 118a drilled in the silicon rubber plate 104, a hole drilled in the cassette member 105, and an opening 110 attached thereto.
  • the A flow path for allowing the liquid to flow into the second chamber is formed by a nozzle 119b having 118b drilled in the silicon rubber 108, a hole drilled in the cassette member 109, and an opening 111 attached thereto. Further, when the liquid is discharged from the first and second chambers, the liquid is discharged from these openings 117a and 117b, respectively.
  • the lengths of the nozzles 119a and 119b are 10 mm, and the inner diameter is 0.8 mm.
  • the supply of the liquid to the first chamber is not limited to the case of flowing in from the nozzle 119a, and the liquid may be supplied from the nozzle 117a.
  • the supply of the liquid to the second chamber is not limited to the case of flowing in from the nozzle 119b, but may be performed from the nozzle 117b.
  • the supply route may be a combination of the cases.
  • the liquid may be supplied to each chamber as follows.
  • the liquid may flow from the opening 110 of the nozzle 119a and flow out from the opening 111 of the nozzle 119b.
  • the liquid fills the first chamber and subsequently flows through the through hole 14 into the second chamber and fills it.
  • the reverse, ie, liquid is introduced from the opening 111 of the nozzle 119b, fills the second chamber, and then passes through the through-hole 14 and into the first chamber. May be satisfied.
  • the liquid flows in from the opening 111 of the nozzle 119b and flows out from the opening 110 of the nozzle 119a.
  • an Ag / AgCl electrode was disposed on the surface of the silicon rubber plate 104 so as to be exposed inside the first chamber.
  • an Ag / AgCl electrode was disposed on the surface of the silicon rubber plate 108 so as to be exposed inside the second chamber.
  • the wiring connected to the first electrode was connected to the lead 18 so as to pass through the inside of the silicon rubber plate 104 and the inside of the cassette member 105 and protrude outside the single particle analyzing apparatus 1 through the nozzle 117a.
  • the wiring connected to the second electrode was connected to the lead 20 so as to pass through the inside of the silicon rubber plate 108 and the inside of the cassette member 109 and protrude outside the single particle analyzer 1 through the nozzle 117b.
  • the case where the electrodes are connected via the nozzles 117a and 117b has been described with reference to the drawings.
  • the present invention is not limited to this.
  • the cassette members 105 and 109 may have a configuration in which perforations are opened immediately above and directly below the through holes 14 and the electrodes are disposed directly above and below the through holes 14 through the holes (not shown). .
  • Energization between the first electrode 16 and the second electrode 17 is performed through the lead 18 or the lead 20.
  • Lead 18 and lead 20 were each connected to ground (not shown). Furthermore, an ammeter and a power source were interposed in the lead 20 in this order (not shown).
  • Example 4 Single Particle Analysis (1) Detection of Particles with a Diameter of 0.78 ⁇ m Single particle analysis was performed using the single particle analyzer 1 manufactured in Example 3.
  • the second chamber 13 was filled with a TE (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA) buffer solution.
  • the first chamber 12 was filled with a TE buffer solution in which particles to be measured were suspended.
  • the particles to be measured are polystyrene fine particles having a diameter of 0.78 ⁇ m and surface-modified with carboxylate groups.
  • the first electrode was grounded, a voltage of 1 V was applied to the second electrode, and the current was measured.
  • a spike-like current drop of 4.9 nA was observed with respect to the base current of 87 nA.
  • Each spike-like current drop signal corresponds to the passage of fine particles through the through-hole.
  • no signal is observed when switching to the reverse bias, it can be seen that the negatively charged fine particles are moved in the positive potential direction by electrophoresis.
  • Two types of particles having different particle diameters in the first chamber 12 of the single particle analyzer 1 having the same structure as the above (1) was filled with a suspended TE buffer solution.
  • One particle is a polystyrene fine particle having a diameter of 0.78 ⁇ m and surface-modified with a carboxylate group.
  • the other particle is a 0.90 ⁇ m diameter polystyrene fine particle surface-modified with a carboxylate group.
  • the second chamber 13 was filled with a TE buffer solution.
  • FIG. 13 shows a current signal at that time.
  • a spike-like current drop signal was detected as in the detection of (1) above.
  • FIG. 14 shows a graph in which the amount of current decrease from the base current value is plotted as a histogram. From this graph, the detected current values could be clearly classified into a distribution around 5 nA and a distribution around 7 nA.
  • Such a single particle analyzer makes it possible to easily identify microparticles such as bacteria, viruses or pollen having various shapes. Moreover, by using such a single particle analysis device, it is possible to easily identify microparticles including bacteria, viruses, pollen, and the like having various shapes.
  • Example 5 Particle Shape Analysis A partition made of a 35 nm thick SiN thin film having a circular opening having a diameter of 1 ⁇ m and a through-hole is produced by the same method as in Example 2, and using this, the same method as in Example 3 is used. A single particle analyzer was manufactured. Measurement was performed on particles having a plurality of shapes using this apparatus.
  • the second chamber 13 was filled with a TE (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA) buffer solution.
  • the first chamber 12 was filled with a TE buffer solution in which particles to be measured were suspended.
  • the particles to be measured are polystyrene fine particles having a diameter of 0.78 ⁇ m and surface-modified with carboxylate groups.
  • the polystyrene fine particles exist as a monomer, a dimer or a trimer.
  • a monomer is a simple substance in which one particle exists alone.
  • a dimer is a dimer state in which two particles are bound to each other through a portion of their surface.
  • a trimer is a trimeric state in which three particles are connected in series via a portion of their surface.
  • FIG. 15A shows a signal when the polystyrene fine particles in a single state pass.
  • the regions indicated by (1), (2) and (3) in FIG. 15A are relative positional relationships (1), (2) between the particles and the through-holes shown in FIG. ) And (3), respectively.
  • there is no spike-like current drop and it shows a simple signal shape having only a single valley.
  • FIG. 16B shows the calculated particle shape based on the measured current signal. Two spherical particles of 0.78 ⁇ m are connected to each other through a part of their surfaces. It is assumed that the width of the coupling portion, which is a constricted portion, is 0.38 ⁇ m.
  • FIG. 16C shows a scanning electron micrograph of the measured polystyrene fine particles in the dimer state.
  • FIG. 17A shows the same graph as the current data of FIG. 16A except that the base current is set to 0A.
  • Regions denoted by (1), (2), and (3) in FIG. 17A are relative positional relationships (1), (2) between the particles and the through holes shown in FIG. ) And (3).
  • the area (2) in FIG. 17A corresponds to the change in the current value when the coupling portion, which is a narrow portion, passes through the position of the partition wall.
  • FIG. 18 a signal when the polystyrene fine particles in the trimer state pass through the through holes is shown in FIG.
  • spike-like current drop signals were observed in three consecutive times. That is, the data has three valleys.
  • the regions indicated by (1), (2), and (3) in FIG. 18 (a) are the relative positional relationships (1), (1), ( This corresponds to 2) and (3).
  • the increase in the current value between the region (1) and the region (2) in FIG. 18A is the timing at which the constricted portion that is the junction between the first and second particles passes through the position of the partition wall.
  • the increase in the current value between region (2) and region (3) in FIG. 18 (a) is when the constricted portion, which is the joint between the second and third particles, passes through the position of the partition wall.
  • changes in current value corresponds to changes in current value.
  • the calculation for calculating the shape of the measurement object from the change of the measured current value is, for example, ACS NANO, VOL. 6, NO. 4, 3499-3505, 2012, based on the description of “Single-Nanoparticle Detection Using a Low-Aspect-Ratio Pore”. This document is incorporated herein by reference.
  • the particle shape can be determined from the current signal shape.

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Abstract

　１つの実施形態によれば、測定容器と、前記測定容器を絶縁性隔壁により区画された第１のチャンバーおよび第２のチャンバーと、前記隔壁に開口された前記第１のチャンバーと前記第２のチャンバーとを連通する貫通孔と、前記第１のチャンバー内に配置された第１の電極と、前記第２のチャンバー内に配置された第２の電極とを具備する一粒子解析装置が提供される。前記第１の電極と第２の電極との間は前記隔壁の前記貫通孔を通して通電される。前記第１のチャンバー内の粒子状の測定対象物が前記貫通孔から前記第２のチャンバー内に通過するときの電気特性を測定し、前記測定対象物の形状が測定される。（ａ）前記測定対象粒子の径をａ、前記貫通孔の径をｄ、前記貫通孔近傍の前記隔壁の厚さをｔとすると、次式ｔ＜ａ＜ｄ≦１００ａが満たされる、または（ｂ）前記測定対象粒子の長径をＬ、短径をｓ、前記貫通孔の径をｄ、前記貫通孔近傍の前記隔壁の厚さをｔとすると次式ｓ＜Ｌ、ｓ＜ｄ≦１００ｓ、ｔ＜Ｌが満たされる。

Description

一粒子解析装置および解析方法
　本発明の実施形態は、一粒子解析装置および解析方法に関する。
　ウイルスや細菌を同定する方法としては、遺伝子を同定するＰＣＲ法やＤＮＡチップを用いる方法、抗原抗体反応を用いるＥＬＩＳＡ法等がよく知られている。また試料中の粒子の大きさを判定することでウイルスや細菌を検出する試みもなされている。
米国特許第２，６５６，５０８号明細書
　本発明の課題は、粒子の大きさおよび形状の違いをより正確に識別することができる一粒子解析装置および解析方法を提供することである。
　１つの実施形態によれば、測定容器と、前記測定容器を絶縁性隔壁により区画された第１のチャンバーおよび第２のチャンバーと、前記隔壁に開口された前記第１のチャンバーと前記第２のチャンバーとを連通する貫通孔と、前記第１のチャンバー内に配置された第１の電極と、前記第２のチャンバー内に配置された第２の電極とを具備する一粒子解析装置が提供される。前記第１の電極と第２の電極との間は前記隔壁の前記貫通孔を通して通電される。前記第１のチャンバー内の粒子状の測定対象物が前記貫通孔から前記第２のチャンバー内に通過するときの電気特性を測定し、前記測定対象物の形状が測定される。（ａ）前記測定対象粒子の径をａ、前記貫通孔の径をｄ、前記貫通孔近傍の前記隔壁の厚さをｔとすると、次式ｔ＜ａ＜ｄ≦１００ａが満たされる、または（ｂ）前記測定対象粒子の長径をＬ、短径をｓ、前記貫通孔の径をｄ、前記貫通孔近傍の前記隔壁の厚さをｔとすると次式ｓ＜Ｌ、ｓ＜ｄ≦１００ｓ、ｔ＜Ｌが満たされる。
　粒子の大きさおよび形状の違いをより正確に識別することができる一粒子解析装置および解析方法が提供される。
図１は、実施形態の断面構造を示す模式図である。 図２は、隔壁を示す平面図および断面図である。 図３は、貫通孔の開口形状の例を示す平面図である。 図４は、実施形態により得られる検出信号の例を示すグラフである。 図５は、測定対象物の例を示す略図である。 図６は、実施形態の断面構造を示す模式図である。 図７は、実施形態により得られる検出信号の例を示すグラフである。 図８は、実施形態により得られる検出信号の例の経時的な変化を示すグラフである。 図９は、隔壁に貫通孔を形成する工程を示す模式図である。 図１０は、実施形態を示す平面図および断面図である。 図１１は、実施形態の分解図である。 図１２は、実施例で測定された検出信号を示すグラフである。 図１３は、実施例で測定された検出信号を示すグラフである。 図１４は、異なる径を有する２粒子を測定した結果を示すグラフである。 図１５は、単体ビーズが直径１μｍポアを通過した際のイオン電流変化を示すグラフである。 図１６は、イオン電流変化を示すグラフ（ａ）、イオン電流変化から計算される測定対象物の形状を示す図（ｂ）、および測定対象物の電子顕微鏡写真（ｃ）である。 図１７は、二量体ビーズが直径１μｍポアを通過した際のイオン電流変化を示すグラフである。 図１８は、三量体ビーズが直径１μｍポアを通過した際のイオン電流変化を示すグラフである。
　以下、図面を参照しながら実施形態について説明する。
　（１）装置の構成
　図１に一粒子解析装置の１例である第１の実施形態の断面構成を示す。図１に示すように、一粒子解析装置は測定容器１０を備える。測定容器１０は、絶縁性の隔壁１１により区画された第１のチャンバー１２と第２のチャンバー１３を有する。隔壁１１には、前記第１のチャンバー１２と前記第２のチャンバー１３とを連通するように貫通孔１４が開口する。隔壁１１は、貫通孔１４の近傍部を除いて、十分な厚さを有する基板１５により支持される。測定容器１０の壁には電極１６と電極１７が設けられる。電極１６は、一部が第１のチャンバー１２内に露出するように設けられている。電極１７は、一部が第２のチャンバー１３内に露出するように設けられている。電極１６はリード１８を通してアース１９に接続されている。電極１７はリード２０を通してアース２１に接続されている。電流計２２および電源２３は、このリード２０に電極１７側からこの順序で介装されている。なお、図１に示した装置は、さらにノイズ除去回路や電圧安定化回路等を実装するのが好ましい。
　図２（ａ）は、第１のチャンバー１２側から見た隔壁１１の平面図である。隔壁１１には、開口形状が円形の貫通孔１４が開口されている。図２（ｂ）は隔壁１１を線ｂ－ｂに沿って切断した断面である。隔壁１１に開口している貫通孔１４の開口部の径をｄとし、隔壁１１の厚さをｔとすると次式
ｔ＜ｄ
が満たされる。
　隔壁１１を支持する基板１５が配置される位置は、隔壁１１の貫通孔１４の近傍部を除く領域である。即ち、基板１５は、貫通孔１４の内部を測定対象物が通り抜けている際に、測定対象物に係る電気抵抗が貫通孔１４を規定するように存在する隔壁１１のみが影響するように配置される。従って、基板１５は、貫通孔１４の内部を測定対象物が通り抜けている際に、測定対象物に係る電気抵抗には影響せず、測定対象物に係る電気抵抗を得るための計算において無視することができる。隔壁１１の貫通孔１４の近傍は、貫通孔１４を規定する隔壁１１の縁から基板１５までの距離で規定される範囲であり、図２（２）において記号ｐで示される。貫通孔１４の近傍は、貫通孔１４の全周囲に広がる領域である。貫通孔１４の近傍と貫通孔１４の開口部の径ｄとの関係は、好ましくは次式
ｐ≧ｄ
が満たされ、より好ましくは次式
ｐ≧０．５ｄ
が満たされてよい。
　測定容器１０は、全体または第１のチャンバー１２内部、第２のチャンバー１３の内部、第１の電極１６との接触部分、第２の電極との接触部分がそれ自身電気的および化学的に不活性なそれ自身公知の何れかの材質により構成されればよい。例えば、ガラス、サファイア、セラミック、樹脂、ゴム、エラストマー、ＳｉＯ２、ＳｉＮ、Ａｌ２Ｏ３などから形成されてよい。
　隔壁１１は、それ自身電気的および化学的に不活性であり且つ絶縁性の材質、例えば、ガラス、サファイア、セラミック、樹脂、ゴム、エラストマー、ＳｉＯ２、ＳｉＮ、Ａｌ２Ｏ３などにより形成されてよい。
　第１の電極および第２の電極のための電極材料としては、例えば、Ａｇ／ＡｇＣｌ電極、Ｐｔ電極、Ａｕ電極など、それ自身公知の何れの材料が使用されてもよい。好ましくは、Ａｇ／ＡｇＣｌ電極である。
　第１のチャンバーの容積と、第２のチャンバーの容積は同じであっても、異なっていてもよい。第１のチャンバーの容積は、例えば、１ｚＬ～１ｍＬであってよく、好ましくは１ｆＬ～１μＬであってよい。第２のチャンバーの容積は、例えば、１ｚＬ～１ｍＬであってよく、好ましくは１ｆＬ～１μＬであってよい。また、貫通孔の大きさに依存して第１チャンバーと第２のチャンバーの容積を変更してもよい。例えば、貫通孔の径ｄが１ｎｍオーダーの場合、即ち、１ｎｍ≦ｄ＜１０ｎｍの場合には、それぞれのチャンバーの容積は、例えば、１ｚＬ～１ｍＬ、１ｚＬ～１０ｍＬなどであってよい。貫通孔の径ｄが１ｍｍオーダーの場合、即ち、１ｍｍ≦ｄ＜１０ｍｍの場合には、それぞれのチャンバーの容積は、例えば、１μＬ～１ｍＬ、１μＬ～１Ｌであってもよい。
　貫通孔１４の径および貫通孔１４近傍の隔壁１１の厚さは、具体的には測定対象粒子の大きさに依存して決定されてよい。詳しくは後述する。
　（２）解析方法
　図１に記載の実施形態を用いて、粒子の大きさおよび形状を測定する方法を以下に説明する。
　第１のチャンバー１２内および第２のチャンバー１３内に液体を充填する。このとき、第１のチャンバー１２内と第２のチャンバー１３内との間には、貫通孔１４を介して液絡が取れている。第１のチャンバー１２内には、測定対象物である粒子２４が含まれる。第１の電極１６および第２の電極１７は、それぞれ第１のチャンバー１２および第２のチャンバー１３内に充填されて液体に浸漬されている。
　第１のチャンバーおよび第２のチャンバーに含まれる液体は、第１の電極１６と第２の電極１７の間に通電可能な液体であってよい。通電可能な液体は、例えば、ＫＣｌ水溶液などの電解質溶液、ＴＥ緩衝溶液およびＰＢＳ緩衝溶液などの緩衝溶液などであってよい。
　前記第１のチャンバー１２内と前記第２のチャンバー１３内に、溶液が満たされた状態で、第１の電極１６と第２の電極１７の間に電源２３により通電する。この通電により発生する電流値を電流計２２で経時的に測定する。第１のチャンバー内の粒子２４は、拡散により貫通孔１４を通り第２のチャンバー内に移動する。粒子２４が貫通孔１４を通過するときに電流計２２で測定される電流値は粒子２４の大きさおよび形状に依存して低下する。
　測定される検出信号としての電流値の変化の例を図４に示す。縦軸に電流値、横軸に測定時間を示す。貫通孔１４内に粒子が存在していない状態では、貫通孔１４を介する第１の電極と第２の電極との間の電流値は一定の値を示す（４１）。この電流値は基底値である。貫通孔１４を粒子２４が通過するときには、電流値は粒子２４の大きさおよび形状に依存して低下する（４２）。粒子２４が貫通孔１４を完全に通過した後に、電流値は、粒子２４が通過する以前のレベルにまで回復する（４３）。
　この現象は次のように説明できる。貫通孔１４内を粒子２４が通過するときには、電流パスである貫通孔１４内のイオンなどの通電可能な液体中の通電物質が、粒子２４の分だけ排除される。それにより、電流抵抗が上昇し、その結果、電流値が低下する。粒子２４の通過が終了すれば、電流値は元のレベルに回復する。粒子２４が一つ通過すれば、電流低下信号は一つ観測される。電流低下信号をカウントすれば、通過した粒子の数を数えることができる。ここで、粒子２４の存在により貫通孔１４内で排除されるイオンの量は、粒子２４の大きさおよび形状に依存する。
　また、上記の例においては、第１のチャンバー内から第２のチャンバー内への粒子２４の移動は、拡散によるものである。しかしながら、この移動は拡散に限るものではない。例えば、第１のチャンバー内から第２のチャンバー内に粒子を移動するような電気泳動または液体の流動によって、粒子の移動が促進されてもよい。電気泳動により移動を促進する場合には、例えば、第１の電極１６と第２の電極１７との間の通電により行われてもよく、第１の電極１６および第２の電極１７以外の電極を用いることにより電気泳動が行われてもよい。例えば、粒子２４が負に帯電している場合には、第２の電極１７の電圧を正に設定することにより、第１のチャンバーから第２のチャンバーに向けた電気泳動が行われる。第１のチャンバー内から第２のチャンバー内への液体の流動により粒子２４の移動が促進される場合には、例えば、次のようにそれを行ってよい。第１のチャンバー側の測定容器壁面に液体が流入するための第１の開口部を設ける。更に第２のチャンバー側の測定容器壁面に液体を排出するための第２の開口部を設ける。第１の開口部から液体を流入すること、および／または第２の開口部から液体を排出することにより、粒子２４の移動が促進される。
　もしくは、第１のチャンバー側の測定容器壁面に液体が流入するための第１の流入口と、液体が流出するための第１の流出口とが設けられる。第２のチャンバー側の測定容器壁面に液体が流入するための第２の流入口と、液体が流出するための第２の流出口とが設けられる。第１のチャンバー側において、液体を第１の流入口から第１の流出口にフローさせ、第２のチャンバー側において、液体を第２の流入口から第２の流出口にフローさせる。このとき、第１のチャンバー側のフロー速度よりも、第２のチャンバー側のフロー速度の方が速い場合には、貫通孔１４において、第１のチャンバーから第２のチャンバーへの液体の流れが発生する。この流れによって、粒子２４の移動が促進される。
　また、電気浸透流によって、第１のチャンバーから第２のチャンバーへの液体の流れを生じさせてもよい。また、第１のチャンバー内と第２のチャンバー内との圧力差により、第１のチャンバーから第２のチャンバーへの液体の流れを生じさせてもよい。電気浸透流および圧力差を得るための手段はそれ自身公知の何れの手段を利用してもよい。
　上述では、検出信号として一定電圧を印加した際の電流値を測定した例を示したが、検出信号は、定電流を印加した際の電圧値であっても、抵抗値であってもよい。電流値および抵抗値の測定は、それ自身公知の何れの方法を利用して行われてよい。
　また、電源２３と電流計２２は第２の電極にリード２０により電極１７に介装されなくてもよい。即ち、電流計２２および電源２３は、リード１８に第１の電極１６側からこの順序で介装されてもよい。
　上述の実施形態では、測定容器の壁面に第１の電極１６および第２の電極１７を配置した例を示した。しかしながら、第１の電極１６および第２の電極１７は、それぞれ第１のチャンバー内および第２のチャンバー内に配置されればよい。従って、第１のチャンバー内の溶液に接する隔壁上に第１の電極１６が配置され、第２のチャンバー内の溶液に接する隔壁上もしくは基板１５上に第２の電極１７が配置されてもよい。また、第１のリードなどに接続されて第１のチャンバー内の溶液中に第１の電極１６が配置され、第２のリードなどに接続されて第２のチャンバー内の溶液中に第２の電極１７が配置されてもよい。
　上記の実施形態では、図２（ａ）および図２（ｂ）に示すように開口形状が円形の貫通孔１４について説明した。しかしながら、貫通孔の開口形状は円形に限定されるものではない。例えば、図３（ａ）に示すような楕円形の貫通孔３１であってもよい。図３（ｂ）に示すような楕円形と円形との複合円形の貫通孔３２であってもよい。しかしながら、これらに限定するものではない。測定対象物となる粒子の形状に応じて、貫通孔の開口形状が選択されてよい。例えば、円盤状の粒子または棒状粒子の場合、図３（ａ）の開口形状が楕円形の貫通孔が形状認識の点で好ましいであろう。土星形状または突起のある球状の粒子の場合には、図３（ｂ）の開口部形状が複合円形である貫通孔が形状認識の点で好ましいであろう。また、矩形や多角形、若しくは矩形または多角形と、楕円形又は円形との組み合わせの貫通孔形状としてもよいことは言うまでもない。
　（３）貫通孔の径および隔壁の厚さ
　上述した通り、第１の電極１６および第２の電極１７は、第１のチャンバー１２内の液体、貫通孔１４、および第２のチャンバー１３内の液体を介して通電される。この通電により生じる電気信号を測定することにより、貫通孔１４を通過する測定対象、即ち、粒子２４の大きさおよび形状が測定される。この測定を達成するために、次の関係が重要である。即ち、隔壁１１に開口している貫通孔１４の開口部の径（以下、「貫通孔の径」と記す）をｄとし、貫通孔１４の近傍の隔壁１１の厚さをｔとすると、貫通孔の径ｄは、厚さｔよりも大きい。また、測定対象である球形粒子２４の径をａとすると、貫通孔１４の径ｄは、球形粒子２４の径ａよりも大きい。また、貫通孔１４近傍の隔壁１１の厚さｔは球形粒子２４の径ａよりも小さい。更に、この関係について説明する。
　図５に測定対象である粒子の例として、球状粒子５１と細長粒子５２とを示す。ここで粒子の「径」について、粒状粒子５１においては径をａとする。一方、細長粒子５２においては、「径」について「長径」をＬとし、「短径」をｓとする。図２（ａ）に示すように、開口形状が円形の場合、貫通孔１４の径をｄとし、貫通孔近傍の隔壁１１の厚さをｔとする。また、例えば、図３（ａ）に示すように、開口部は円形を除く形状、例えば、楕円状、細長形状などであってもよい。この場合には、楕円の短径を貫通孔の径ｄとして参照する。例えば、図３（ｂ）に示すように、開口部は、例えば、楕円形の一部と円形の一部を組み合わせたような形状でもよい。この場合、開口部の径ｄは、最も小さい径の大きさとし、その大きさをｄとして参照する。このような条件において、測定対象である粒子５１の径ａと貫通孔１４の径ｄと貫通孔１４近傍の隔壁の厚さｔとの関係は次の式を満たす；
ｔ＜ａ＜ｄ≦１００ａ。
　また、測定対象が長細粒子５２である場合、短径ｓ、長径L、貫通孔１４の径ｄおよび貫通孔１４近傍の厚さｔの関係は次の式を満たす；
ｓ＜ｄ≦１００ｓ、および
ｔ＜Ｌ。
　ここで、ｔはｓよりも小さくとも（ｔ＜ｓ）、大きくともよく（ｔ＞ｓ）、ｔとｓが同じ大きさであってもよい（ｔ＝ｓ）。また、Ｌは、ｄよりも小さくとも（Ｌ＜ｄ）、大きくともよく（Ｌ＞ｄ）、Ｌとｄが同じ大きさであってもよい（Ｌ＝ｄ）。
　球状粒子５１の径ａと貫通孔１４近傍の隔壁の厚さｔとの関係はｔ～１００ｔ＜ａであってよく、例えば、２ｔ＜ａ、５ｔ＜ａ、１０ｔ＜ａ、１００ｔ＜ａであってもよい。
　球形粒子５１の径ａと貫通孔１４の径ｄとの関係は、１～２＜ｄ／ａ≦５～１００であってよく、例えば、１＜ｄ／ａ≦７５、１＜ｄ／ａ≦５０、１＜ｄ／ａ≦２５、１＜ｄ／ａ≦１０および１＜ｄ／ａ≦５であってもよい。
　長細粒子５２の長径Ｌと貫通孔１４近傍の隔壁の厚さｔとの関係はｔ～１００ｔ＜Ｌであってよく、例えば、２ｔ＜Ｌ、５ｔ＜Ｌ、１０ｔ＜Ｌ、１００ｔ＜Ｌであってもよい。
　長細粒子５２の短径ｓと貫通孔１４の径ｄとの関係は、１～２＜ｄ／ｓ≦５～１００であってよく、例えば、１＜ｄ／ｓ≦７５、１＜ｄ／ｓ≦５０、１＜ｄ／ｓ≦２５、１＜ｄ／ｓ≦１０および１＜ｄ／ｓ≦５であってもよい。
　なお、貫通孔近傍とは、測定されるべき粒子の形状および大きさを測定可能にするために必要とされる隔壁の厚さがｔであるべき領域であればよい。隔壁の厚さがｔであるべき領域、即ち、貫通孔近傍の径をＡとすると、Ａは貫通孔ｄに対して次の式が満たされてよい；２ｄ≦Ａ≦１５０００ｔ、好ましくは３ｄ≦Ａ≦１００００ｔ。
　測定対象物は、１ｍｍ以下の粒子であってよい。例えば、測定対象物は、花粉、細菌およびウイルスであってよい。
　花粉は球状粒子であり、その粒径は約５０μｍ～約１００μｍである。花粉の例は、例えば、ヒノキ花粉（粒径約３０μｍ～約４５μｍ）、スギ花粉（粒径約３０μｍ～約４０μｍ）、マツ花粉（粒径約４５μｍ～約５５μｍ）を含む。
　細菌の例は、例えば、炭疽菌、ペスト菌およびボツリヌス菌などを含む。炭疽菌は、約１．０μｍ～約１．２μｍの短径を有し、約５．０μｍ～約２．０μｍの粒子長を有する。ペスト菌は、約０．５μｍ～約０．８μｍの短径を有し、約１．５μｍ～２．０μｍの粒子長を有する。ボツリヌス菌は、約０．５μｍ～約２．０μｍの短径を有し、約２．０～約１０μｍの粒子長を有する。
　ウイルスの例は、例えば、天然痘ウイルス、鳥インフルエンザウイルス、ＳＡＲＳウイルス、口蹄疫ウイルスおよびエボラウイルスなどを含む。天然痘ウイルスは約２００ｎｍの粒子径を有する。鳥インフルエンザウイルスは約８０ｎｍ～約１３０ｎｍの粒子径を有する。ＳＡＲＳウイルスは約６０ｎｍ～約２２０ｎｍの粒子径を有する。口蹄疫ウイルスは約２１～約２５ｎｍの粒子径を有する。エボラウイルスは約８０ｎｍ～約８００ｎｍの粒子長を有するひも状のウイルスである。
　上述のような測定対象物を測定するためには、貫通孔１４の径ｄは１０ｎｍ以上１ｍｍ以下、または５０ｎｍ以上１ｍｍ以下であってよい。例えば、貫通孔１４の径ｄは、１０ｎｍ以上、３０ｎｍ以上、５０ｎｍ以上、７５ｎｍ以上、１００ｎｍ以上、１５０ｎｍ以上、２００ｎｍ以上、５００ｎｍ以上、８００ｎｍ以上、１μｍ以上、２μｍ以上、３μｍ以上、５μｍ以上、１０μｍ以上、２０μｍ以上、５０μｍ以上、７５μｍ以上、１００μｍ以上、２５０μｍ以上、５００μｍ以上または７５０μｍ以上などであってよい。或いは、例えば、貫通孔１４の径ｄは、１ｍｍ以下、８００μｍ以下、７５０μｍ以下、５００μｍ以下、２５０μｍ以下、１００μｍ以下、７５μｍ以下、５０μ以下、２０μ以下、１０μｍ以下、５μｍ以下、３μｍ以下、２μｍ以下、１μｍ以下、８００ｎｍ以下、５００ｎｍ以下、２００ｎｍ以下、１５０ｎｍ以下、１００ｎｍ以下、７５ｎｍ以下または５０ｎｍ以下などであってよい。また、上記下限と上限を組み合わせてなる範囲も好ましい。
　隔壁１１の厚さは、測定対象物の大きさ、即ち、径の大きさに応じて決定されればよい。例えば、隔壁１１の厚さは、１０ｎｍ～５００ｎｍ、２０ｎｍ～４５０ｎｍなどであってよい。例えば、細菌などを測定する場合には、隔壁１１の厚さは、３５ｎｍ～５０ｎｍであることがより好ましい。しかしながら、隔壁１１の厚さはこのような範囲に限定されるものではなく、上述の測定対象物の径ａ、貫通孔１４の径ｄおよび貫通孔１４の近傍の隔壁の厚さｔの関係を満たせばよい。
　（４）異なる形状の２種類の粒子を測定したときの検出信号
　上記（１）および（３）に記載される装置を用いて、異なる２種類の粒子を測定すること以外は上記（２）の方法により測定することを想定する。
　図６に示すように第１のチャンバー１２には、形状の異なる２つの異なる粒子、粒子Ａ６１と、粒子Ｂ６２が含まれる。粒子Ａ６１は、長手方向に沿った断面がほぼ一定の円である長細粒子である。粒子Ｂ６２は長手方向の軸の中央に絞り部を有する長細粒子である。上述の方法と同様に、第１の電極１６と第２の電極１７間に電源２３により通電する。この通電により発生する電流値を電流計２２で経時的に測定する。
　測定される検出信号としての電流値の変化の例を図７に示す。貫通孔１４内に粒子が存在していない状態では、電流値は一定の基底値を示す（７１）。図７には、粒子Ａ６１と、粒子Ｂ６２がこの順番で順次に貫通孔１４を通過した場合の電流信号を示す。
　貫通孔１４を粒子Ａ６１が貫通孔１４を通過すると、その大きさおよび形状に依存して電流値が低下する（７２）。粒子Ａ６１が貫通孔１４を完全に追加した後、電流値は基底値にまで回復する（７３）。更に、粒子Ｂ６２が貫通孔１４を通過すると、その大きさおよび形状に依存して電流値が低下する（７４）。粒子Ｂ６２が貫通孔１４を完全に追加した後、電流値は基底値にまで回復する（７５）。粒子Ｂ６２の場合には、長手方向軸の中央の絞り部が貫通孔１４を通過しているときの電流値が、絞り部の形状に依存して電流値が上昇する。このような経時的な電流値の変化に基づいて、第１のチャンバーに存在する粒子群に、粒子Ａ６１および粒子Ｂ６２が存在し、最初に貫通孔１４を通過した粒子は粒子Ａ６１であり、次に貫通孔１４を通過した粒子は粒子Ｂ６２であると判定することが可能になる。従って、このように検出される電気信号の経時的変化を測定することにより、試料中の粒子の大きさおよび形状を判定することが可能になる。
　更に、図８を用いて、粒子Ｂ６２が貫通孔１４を通過する状態と、得られる電気信号との関係を経時的に説明する。図８（ａ）には、粒子Ｂ６２が貫通孔１４を通過する際の、粒子Ｂ６２と貫通孔１４の位置関係を模式的に示す。図８（ｂ）には、図８（ａ）で示されたそれぞれの位置関係に粒子Ｂ６２と貫通孔１４とがあるときに検出される電流値の変化を経時的に示す。図８（ａ－１）～（ａ－５）は上段から下段に向けて時系列順に粒子Ｂ６２と隔壁との位置関係を記載する。図８（ｂ）は（ｂ－１）～（ｂ－５）を含む。図８（ｂ－１）～（ｂ－５）は、図８（ａ－１）～（ａ－５）にそれぞれ対応し、上段から下段に向けて時系列順に電流値の変化を記載する。
　粒子Ｂ６２が、貫通孔１４に入ってない場合（ａ－１）には、電流信号は基底値のままであり変化は見られない（ｂ－１）。粒子Ｂ６２が貫通孔１４を通過し始めると（ａ－２）、粒子Ｂ６２が貫通孔１４を横切っている領域の形状に応じて、電流値が低下する（ｂ－２）。さらに、粒子Ｂ６２の長手方向の軸中央の絞り部が貫通孔１４を通過すると（ａ－３）、電流値が上昇する（ｂ－３）。更に、粒子Ｂ６２の形状の変化に従い（ａ－４）、再び絞り部よりも太い部分が貫通孔１４を通過すると（ａ－４）、再び電流値は低下する（ｂ－４）。粒子Ｂ６２が、完全に貫通孔１４を通過した後（ａ－５）には、基底値にまで電流値は回復する（ｂ－５）。
　このように検出される電気信号の経時的変化を測定することにより、試料中の粒子の大きさおよび形状を判定することが可能になる。この現象は、隔壁１１の厚さが粒子Ｂの長さよりも充分に薄く設定されていることにより、初めて観測できる現象である。なお、本発明により、粒子が１粒子の状態で存在しているのか、２粒子以上が凝集しているのかも識別が可能であることは言うまでもない。
　（５）隔壁の製造方法
　図９を用いて、隔壁１１の製造方法の１例を説明する。
　まず、Ｓｉ基板９１に、ＳｉＯ２膜９２を積層する（図９ａ）。なお、ＳｉＯ２膜９２は、熱酸化膜でも、熱ＣＶＤ（Chemical Vapor Deposition）法でも、プラズマＣＶＤ法でもよい。次にＳｉＯ２膜９２上にレジスト９３を塗布する。更に、貫通孔を形成すべき領域に対して露光および現像することによってレジスト９３に開口パターンを形成する（図９ｂ）。露光は光を用いたフォトリソグラフィ法を用いても、電子線描画法を用いてもよい。一般には、１μｍよりも大きいパターンを形成するためには、フォトリソグラフィがよく用いられている。１μｍよりも小さいパターン形成するためには、電子線描画法を用いることが多い。しかしながら、必ずしもそれに限定されるものではない。
　次に、形成したレジスト９３パターンをマスクにして、ＳｉＯ２膜９２をエッチングする（図９ｃ）。エッチングは、ＮＨ４ＦまたはＨＦを用いたウェットエッチングであってもよく、ＣＦ４ガスによるＲＩＥ(Reactive Ion Etching)などの異方性のあるドライエッチングであってもよい。パターン精度を得るためには、ドライエッチングが好ましい。また、ドライエッチング耐性を確保するために、レジストパターンを金属層に転写してから、金属膜をマスクにしてＳｉＯ２膜９２のエッチングを行ってもよい。
　エッチング後にレジストを剥離する（図９ｄ）。次にＳｉ基板９１の裏面にレジスト９４を塗布する。更に、貫通孔を形成すべき領域を含む領域を開口するようにパターン形成を行う（図９ｅ）。パターン形成したレジストをマスクにして、Ｓｉ基板９１をエッチングして、貫通孔部分のＳｉＯ２膜８２を露出する（図９ｆ）。最後にマスクとして使用したレジスト９４を除去する（図９ｇ）。裏面エッチングの際にも、表面と同様に金属膜にパターンを転写してから行ってもよい。
　これにより、ＳｉＯ２膜９２の膜厚で規定される貫通孔９５を持つ隔壁が形成される。
　なお、隔壁として用いられる膜は、ＳｉＯ２膜に限定されるものではなく、ＳｉＮ膜であっても、Ａｌ２Ｏ３膜であっても、他の絶縁膜であってもよい。更に、基板材料もＳｉに限定されるものではなく、ガラス、サファイア、セラミック、樹脂でもよい。
　裏面のエッチング方法は、それ自身公知のエッチング技術が利用できる。そのような技術は、例えば、ＳＦ６とＣ４Ｆ８ガスなどによる垂直深堀エッチング、ＫＯＨによるウェットエッチング、ＣＦ４系ガスによるドライエッチングなどによる等方的なエッチングなどを含むが、これらに限定するものではない。また、貫通孔９５の形成方法は、基板上の薄膜に貫通孔を形成する方法に限定するものではない。例えば、貫通孔を形成した薄膜を支持基板上に接着することによって、貫通孔を有する隔壁を形成してもよい。
　実施例１　隔壁の製造
　１０ｍｍ角の大きさであり、厚さ０．２ｍｍのＳｉ基板を用意した。ＳｉＯ２膜としてＴＥＯＳ膜を４００ｎｍの厚さで積層した。次に、レジストを塗布し、フォトリソグラフィにより露光および現像することにより貫通孔のための直径１．５μｍの円形パターンを基板の第１の面に形成した上で、ＳｉＯ２膜をＣＦ４ガスによってエッチングを行った。基板の第２の面に対して、ＳＦ６とＣ４Ｆ８ガスを切り替えることによる垂直深堀エッチングを行った。それにより、直径２００μｍの領域をエッチングした。基板両面（即ち、第１の面および第２の面）のレジストを除去した。これにより、直径１．５μｍの円形の開口形状を有する貫通孔を有する隔壁を形成した。
　実施例２　隔壁の製造
　１０ｍｍ角の大きさであり、厚さ０．６ｍｍのＳｉ基板に２０ｎｍのＳｉＮ膜を積層した。更にレジストを塗布し、電子線描画法により、直径７５ｎｍの円形の開口パターンを形成した。形成したレジストパターンをマスクにしてＳｉＮ膜をＣＦ４ガスによりエッチングした。更には、裏面に対して、レジストを塗布した上でフォトリソグラフィによりパターン形成を行った。次に、ＫＯＨによるウェットエッチングを行い５０μｍ角の開口部を形成した。その後、レジストを除去した。これにより、直径７５ｎｍの円形開口形状の貫通孔を有する隔壁を形成した。この隔壁の貫通孔近傍の厚さは２０ｎｍであった。
　実施例３　一粒子解析装置
　実施例１で形成された隔壁を使用して実施形態の１例である一粒子解析装置１を製造した。この一粒子解析装置１を図１０および１１を使用して説明する。図１０（ａ）は、一粒子解析装置１の平面図である。図１０（ｂ）は線Ｂ－Ｂに沿って切断した一粒子解析装置１の断面図である。図１１は、一粒子解析装置１の分解図である。一粒子解析装置１の大きさは２．５ｃｍ×２．５ｃｍであり、厚さが１ｃｍである。
　図１１に示すようにこの装置は、９つの部材を積層させ、ねじ１１６で固定された装置である。まず、実施例２で形成された貫通孔が開口している隔壁を、厚さ０．６ｍｍのシリコンゴム板１０１の中央に固定した。予め隔壁の厚さを考慮して、固定部には１０ｍｍ角の大きさで深さ０．６ｍｍの凹部を形成した。更に、シリコンゴム板１０１の中央部に開口部を形成し、隔壁における貫通孔の部分およびその周辺の部分をシリコンゴム板１０１から露出させた。
　シリコンゴム板１０１からＺ軸方向には、第１のチャンバー１２が形成される。第１のチャンバーは、その内部空間を規定するための開口部をそれぞれに有する３枚の板状部材とカセット部材が積層されて構成される。即ち、第１のチャンバー１２は、シリコンゴム板１０２、アクリル板１０３、シリコンゴム板１０４、並びにアクリル製のカセット部材１０５が、シリコンゴム板１０１側からこの順番でＺ軸方向に積層されてなる（図１０（ｂ））。シリコンゴム板１０２、アクリル板１０３およびシリコンゴム板１０４の厚さは各０．５ｍｍである。
　シリコンゴム板１０１からＺ軸方向と反対の方向には、第２のチャンバー１３が形成される。第２のチャンバーは、その内部空間を規定するための開口部を有する３枚の板状部材とカセット部材が積層されて構成される。即ち、第２のチャンバー１３は、シリコンゴム板１０６、アクリル板１０７、シリコンゴム板１０８、並びにアクリル製のカセット部材１０９をシリコンゴム板１０１側からこの順番でＺ軸方向とは反対の方向に積層されてなる（図１０（ｂ））。シリコンゴム板１０６、アクリル板１０７およびシリコンゴム板１０８の厚さは各０．５ｍｍである。
　シリコンゴム板１０２、１０４、１０６および１０８は、それぞれ直線状の開口部１２Ａ、１２Ｃ、１３Ａおよび１３Ｃを有する（図１１）。各開口部１２Ａ、１２Ｃ、１３Ａおよび１３Ｃは、各板の平面に沿ってＸ軸方向に直線状に伸びる。それぞれの開口部１２Ａ、１２Ｃ、１３Ａおよび１３Ｃの長径は７ｍｍ短径は２ｍｍである。
　アクリル板１０３および１０７は、Ｌ字型の開口部１２Ｂおよび１３Ｂを有する。各開口部１２Ｂは、アクリル板１０３の平面に沿ってＸ軸方向に直線状に伸びた後でＹ軸方向に折れ曲がり伸びる。各開口部１３Ｂは、アクリル板１０７の平面に沿ってＸ軸方向に反対の方向に直線状に伸びた後でＹ軸方向に反対の方向に折れ曲がり伸びる。それぞれの開口部開口部１２Ｂおよび１３ＢのＸ軸方向の長径は２０ｍｍ、Ｙ軸方向の長径は９ｍｍであり、短径は２ｍｍである。
　このように規定される第１のチャンバーおよび第２のチャンバーの容積は、それぞれ４０μＬである。
　第１のチャンバーに液体を流入するための流路は、シリコンゴム板１０４に穿孔された孔１１８ａとカセット部材１０５に穿孔された孔とそこに取り付けられた開口部１１０を有するノズル１１９ａにより形成される。第２のチャンバーに液体を流入するための流路は、シリコンゴム１０８に穿孔された１１８ｂとカセット部材１０９に穿孔された孔とそこに取り付けられた開口部１１１を有するノズル１１９ｂにより形成される。また、第１および第２のチャンバー内から液体が排出される場合には、これらの開口部１１７ａおよび１１７ｂからそれぞれ排出される。このノズル１１９ａおよび１１９ｂの長さは、１０ｍｍであり、内径は０．８ｍｍである。また、第１のチャンバーへの液体の供給は、ノズル１１９ａから流入させる場合に限定されず、ノズル１１７ａから流入させてもよい。第２のチャンバーへの液体の供給は、ノズル１１９ｂから流入させる場合に限定されず、ノズル１１７ｂから流入させてもよい。それぞれの場合を組み合わせた供給ルートであってもよい。
　或いは、各チャンバーへの液体の供給を次のように行ってもよい。第１および第２のチャンバーへの液体の供給および／または排出のために、液体が、ノズル１１９ａの開口部１１０から流入され、ノズル１１９ｂの開口部１１１から流出されてもよい。これにより、液体は、第１のチャンバーを満たし、それに続いて、貫通孔１４を通過して第２のチャンバー内に流入され、それを満たす。或いは、その逆、即ち、液体が、ノズル１１９ｂの開口部１１１から流入され、第２のチャンバー内を満たし、それに続いて、貫通孔１４を通過して第１のチャンバー内に流入されて、それを満たしてもよい。この場合、第１および第２のチャンバーへの液体の供給および／または排出のために、液体は、ノズル１１９ｂの開口部１１１から流入され、ノズル１１９ａの開口部１１０から流出される。
　第１の電極１６として、第１のチャンバー内部に露出するようにシリコンゴム板１０４表面にＡｇ／ＡｇＣｌ電極を配置した。第２の電極１７として、第２のチャンバー内部に露出するようにシリコンゴム板１０８表面にＡｇ／ＡｇＣｌ電極を配置した。
　シリコンゴム板１０１、１０２、１０４、１０６および１０８と、アクリル板１０３および１０７と、カセット部材１０５および１０９との組み立ては、位置決めのための２本のピンに沿って行った。ピン１１２に対して、各部材に穿孔されたピン穴１１３Ａ～１１３Ｈを順次に挿入した。同時に、図１１では示されていないがもう１つのピンに対して、各部材に穿孔されたピン穴１１４Ａ～１１４Ｈを順次に挿入した。これにより互いに対応する部位同士を適切な位置で積層した。次に、ねじ穴１１５を通してこれらの７つの部材とカセット部材１０５および１０９を４本のねじ１１６によって固定した。
　第１の電極に接続された配線は、シリコンゴム板１０４内部およびカセット部材１０５内部を通過して一粒子解析装置１の外部にノズル１１７ａを通り突出するようにリード１８に接続された。第２の電極に接続された配線は、シリコンゴム板１０８内部およびカセット部材１０９内部を通過して一粒子解析装置１の外部にノズル１１７ｂを通り突出するようにリード２０に接続された。なお、ここでは、電極をノズル１１７ａ及び１１７ｂを介して、接続する場合について図を用いて説明したが、これに限るものではない。例えば、カセット部材１０５及び１０９の、それぞれ貫通孔１４直上及び直下に穿孔を開口し、その孔を介して、電極を貫通孔１４の直上および直下に配置する構成にしてもよい（図示せず）。
　第１の電極１６と第２の電極１７との間の通電は、リード１８またはリード２０を通して行う。リード１８およびリード２０をそれぞれアースに接続した（図示せず）。更に、リード２０に、電流計および電源をこの順番で介装した（図示せず）。
　実施例４　一粒子解析
　（１）直径０．７８μｍの粒子の検出
　実施例３で製造した一粒子解析装置１を使用して一粒子解析を行った。
　第２のチャンバー１３内にＴＥ（１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、１ｍＭ　ＥＤＴＡ）緩衝溶液を充填した。第１のチャンバー１２内には測定対象である粒子を懸濁したＴＥ緩衝溶液を充填した。測定対象である粒子は、カルボキシレート基で表面修飾された直径０．７８μｍのポリスチレン微粒子である。
　次に、第１の電極を接地し、第２の電極に１Ｖの電圧を印加して、電流を計測した。その結果、図１２に示すように、８７ｎＡのベース電流に対して、４．９ｎＡのスパイク状の電流低下が観測された。スパイク状の電流低下信号１つ１つが、微粒子の貫通孔通過に対応する。また、逆バイアスに切り替えたときには、信号が観測されないことから、負に帯電している微粒子が電気泳動によって正の電位方向に移動していることが分かる。
　（２）直径０．７８μｍの粒子と直径０．９０μｍの粒子の検出
　上記（１）と同様の構造の一粒子解析装置１の第１のチャンバー１２内に、異なる粒子径を有する２種類の粒子を懸濁したＴＥ緩衝溶液を充填した。一方の粒子は、カルボキシレート基で表面修飾された直径０．７８μｍのポリスチレン微粒子である。他方の粒子は、カルボキシレート基で表面修飾された直径０．９０μｍのポリスチレン微粒子である。第２のチャンバー１３内には、ＴＥ緩衝溶液を充填した。
　１Ｖの電圧を第２の電極１７に印加して、電流計測を行った。図１３には、その際の電流信号を示す。９０ｎＡのベース電流に対して、上記（１）の検出と同様にスパイク状の電流低下信号が検出された。
　ベース電流値からの電流低下量をヒストグラムとしてプロットしたグラフを図１４に示した。このグラフから５ｎＡ付近の分布と７ｎＡ付近の分布に、検出された電流値を明確に分類することができた。
　更に、ヒストグラムをプロットした上記の結果と、上記の（１）において得られた直径０．７８μｍの粒子を単独で検出したデータと、直径０．９０μｍ微粒子を単独で検出したデータ（ここには示さず）とを比較した。
　この比較の結果、５ｎＡ付近の分布は直径０．７８μｍの粒子による信号であることが同定された。更に、７ｎＡ付近の分布は直径０．９０μｍの粒子による信号であることが同定された。このように、径が１．５μｍである貫通孔を有し、貫通周囲の厚さが４３０ｎｍである隔壁を用いて、それぞれの径が０．７８μｍと０．９０μｍという僅か０．１２μｍの粒径を有する２種類の粒子を識別できることが明らかになった。
　このような一粒子解析装置により、様々な形状を持つ細菌、ウイルスまたは花粉などの微小粒子を容易に識別することが可能になる。また、このような一粒子解析装置を使用して解析することにより、様々な形状を持つ細菌、ウイルスまたは花粉などをはじめとする微小粒子を容易に識別することが可能になる。
　実施例５　粒子形状解析
　直径１μｍの円形開口形状の貫通孔を有する厚さ３５ｎｍのＳｉＮ薄膜からなる隔壁を実施例２と同様の方法により製造し、これを用いて実施例３の方法と同様に一粒子解析装置を製造した。この装置を用いて複数の形状を有する粒子について計測を行った。第２のチャンバー１３内にＴＥ（１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、１ｍＭ　ＥＤＴＡ）緩衝溶液を充填した。第１のチャンバー１２内には測定対象である粒子を懸濁したＴＥ緩衝溶液を充填した。測定対象である粒子は、カルボキシレート基で表面修飾された直径０．７８μｍのポリスチレン微粒子である。このポリスチレン微粒子は、一量体、二量体または三量体として存在している。一量体とは、１つの粒子が単独で存在する単体状態である。二量体は、２つの粒子が、それぞれの表面の一部分を介して互いに結合されている二量体の状態である。三量体は、３つの粒子が、それぞれの表面の一部分を介して直列に結合されている三量体の状態である。
　次に、第１の電極を接地し、第２の電極に１００ｍＶの電圧を印加して、電流を計測した。その結果を図１５～図１８に示す。約９．６ｎＡのベース電流に対して、約４００ｐＡのスパイク状の電流低下が観測された。図１５（ａ）には、単体状態のポリスチレン微粒子が通過した際の信号を示す。図１５（ａ）中の（１）、（２）および（３）でそれぞれ示した領域は、図１５（ｂ）に示した粒子と貫通孔との相対的な位置関係（１）、（２）および（３）にそれぞれ対応する。単体の場合には、スパイク状の電流低下はなく、単一の谷のみを有する単純な信号形状を示す。
　次に、二量体状態のポリスチレン微粒子が貫通孔を通過した場合の信号を図１６（ａ）に示す。この場合には、スパイク状の電流低下信号が、２連続で観測された。即ち電流信号は、２つの大きな谷を有する。図１６（ｂ）には、計測された電流信号を基にして、算出した粒子形状を示す。０．７８μｍの２つの球形粒子が、それぞれの表面の一部分を介して互いに繋がっている。くびれた部分である結合部の幅は０．３８μｍであることが想定される。図１６（ｃ）には計測した二量体状態のポリスチレン微粒子の走査型電子顕微鏡写真を示す。この電気顕微鏡写真から、実際に測定されたポリスチレン微粒子が、まさに、図１６（ｂ）に示した計算により導き出された形状と同等の形状を有する粒子であることが明らかになった。図１７（ａ）は、ベース電流を０Ａとした以外は図１６（ａ）の電流データと同じグラフを示した。図１７（ａ）中の（１）、（２）および（３）を付した領域は、それぞれ図１７（ｂ）に示した粒子と貫通孔との相対的な位置関係（１）、（２）および（３）に対応する。図１７（ａ）の（２）の領域は、まさにくびれた部分である結合部が隔壁の位置を通過しているときの電流値の変化に対応する。
　さらに、三量体状態のポリスチレン微粒子が貫通孔を通過した場合の信号を図１８（ａ）に示す。この場合には、スパイク状の電流低下信号が３連続で観測された。即ち、データは、３つの谷を有する。図１８（ａ）中の（１）、（２）および（３）で示された領域は、それぞれ図１８（ｂ）に示した粒子と貫通孔との相対的な位置関係（１）、（２）および（３）に対応する。図１８（ａ）の領域（１）および領域（２）の間の電流値の増加は、ちょうど１番目と２番目の粒子間の結合部であるくびれ部分が隔壁の位置を通過しているタイミングに対応する。図１８（ａ）の領域（２）と領域（３）の間の電流値の増加は、２番目と３番目の粒子間の結合部であるくびれ部分が隔壁の位置を通過しているときの電流値の変化に対応する。
　なお、測定された電流値の変化から、測定対象物の形状を算出するための計算は、例えば、ＡＣＳ　ＮＡＮＯ，ＶＯＬ．６，ＮＯ．４，３４９９－３５０５，２０１２の「Single-Nanoparticle Detection Using a Low-Aspect-Ratio Pore」の記載に基づいて行うことが可能である。この文献は、参照により本明細書に組み込まれる。
　以上のように、電流信号形状から、粒子の形状を判別することが可能である。
１：一粒子解析装置　　　１０：測定容器　　　１１：隔壁
１２：第１のチャンバー　　　１３：第２のチャンバー　　　１４、３１、３２：貫通孔
１５：基板　　　１６：第１の電極　　　１７：第２の電極　　　１８、２０：リード
１９、２１：アース　　　２２：電流計　　　２３：電源　　　２４：粒子
４１、４３、７１、７３、７５：粒子不在時の電流値レベル（基底電流値）
４２、７２、７４：粒子存在時の電流値レベル
５１：球形粒子　　　５２：長細粒子　　　６１：粒子Ａ　　　６２：粒子Ｂ
９１：Ｓｉ基板　　　９２：ＳｉＯ２膜　　　９３、９４：レジスト　　　８５：貫通孔
１０５、１０９：カセット部材
１０１、１０２、１０４、１０６、１０８：シリコンゴム板
１０３、１０７：アクリル板　　　１１０、１１１：開口部　　　１１２：ピン
１１３、１１４：ピン穴　　　１１５：ねじ穴　　　１１６：ねじ
１１７ａ、１１７ｂ、１１９ａ、１１９ｂ：ノズル　　　１１８ａ、１１８ｂ：孔

Claims (19)

  1. 　測定容器と、前記測定容器を絶縁性の隔壁により区画された第１のチャンバーおよび第２のチャンバーと、前記隔壁に開口された前記第１のチャンバーと前記第２のチャンバーとを連通する貫通孔と、前記第１のチャンバー内に配置された第１の電極と、前記第２のチャンバー内に配置された第２の電極とを具備し、前記第１の電極と第２の電極との間に前記隔壁の前記貫通孔を通して通電し、前記第１のチャンバー内の粒子状の測定対象物が前記貫通孔から前記第２のチャンバー内に通過するときの検出信号を測定することにより前記測定対象物の形状を測定する一粒子解析装置であって、
    （ａ）前記測定対象粒子の径をａとして、前記貫通孔の径をｄとし、前記貫通孔近傍の前記隔壁の厚さをｔとすると次の式；
    ｔ＜ａ＜ｄ≦１００ａ
    が満たされる、または
    （ｂ）前記測定対象粒子の長径をＬとし、短径をｓとし、前記貫通孔の径をｄとし、前記貫通孔近傍の前記隔壁の厚さをｔとすると次の式；
    ｓ＜Ｌ、
    ｓ＜ｄ≦１００ｓ、および
    ｔ＜Ｌ
    が満たされる一粒子解析装置。
  2. 　前記貫通孔の径ｄが５０ｎｍ以上１ｍｍ以下である請求項１に記載の一粒子解析装置。
  3. 　前記測定対象が、１ｍｍ以下の径ａを有する粒子である請求項１または２に記載の一粒子解析装置。
  4. 　前記測定対象が、花粉、細菌およびウイルスからなる群より選択される請求項１～３の何れか１項に記載の一粒子解析装置。
  5. 　前記第１の電極および前記第２の電極は、前記隔壁と接触していない請求項１～４の何れか１項に記載の一粒子解析装置。
  6. 前記隔壁が第１の面と第２の面を有し、前記第１の面が前記第１のチャンバー内の第１の電極に接触し、前記第２の面が前記第２のチャンバー内の第２の電極に接触している請求項１～４の何れか１項に記載の一粒子解析装置。
  7. 前記貫通孔近傍の径をＡとすると次の式；
    ２ｄ≦Ａ≦１５０００ｔ
    が満たされる、請求項１～６の何れか１項に記載の一粒子解析装置。
  8. 　（１）測定容器と、前記測定容器を絶縁性の隔壁により区画された第１のチャンバーおよび第２のチャンバーと、前記隔壁に開口された前記第１のチャンバーと前記第２のチャンバーとを連通する貫通孔と、前記第１のチャンバー内に配置された第１の電極と、前記第２のチャンバー内に配置された第２の電極とを具備し、前記第１の電極と第２の電極との間に前記隔壁の前記貫通孔を通して通電し、前記第１のチャンバー内の粒子状の測定対象物が前記貫通孔から前記第２のチャンバー内に通過するときの検出信号を測定し、
    （ａ）前記測定対象粒子の径をａとして、前記貫通孔の径をｄとし、前記貫通孔近傍の前記隔壁の厚さをｔとすると次の式；
    ｔ＜ａ＜ｄ≦１００ａ
    が満たされる、または
    （ｂ）前記測定対象粒子の長径をＬとし、短径をｓとし、前記貫通孔の径をｄとし、前記貫通孔近傍の前記隔壁の厚さをｔとすると次の式；
    ｓ＜Ｌ、
    ｓ＜ｄ≦１００ｓ、および
    ｔ＜Ｌ
    が満たされる、一粒子解析装置を準備することと、
    　（２）前記第１のチャンバーおよび第２のチャンバーに通電可能な液体を含ませることと、
    　（３）前記第１のチャンバーに測定対象物を含ませることと、
    　（４）前記第１のチャンバー内の粒子状の測定対象物が前記貫通孔から前記第２のチャンバー内に通過するときの電気特性を測定することと、
    を具備する前記測定対象物の形状を測定する一粒子解析方法。
  9. 　前記第１の電極と前記第２の電極の間の通電が、電圧を印加されることにより行われ、前記検出信号が電流値である請求項８に記載の一粒子解析方法。
  10. 　前記貫通孔の径ｄが５０ｎｍ以上１ｍｍ以下である請求項８または９に記載の一粒子解析方法。
  11. 　前記測定対象が、１ｍｍ以下の径ａを有する粒子である請求項８～１０の何れか１項に記載の一粒子解析方法。
  12. 　前記測定対象が、花粉、細菌およびウイルスからなる群より選択される請求項８～１１の何れか１項に記載の一粒子解析方法。
  13. 　前記第１のチャンバー内の前記測定対象物が前記貫通孔から前記第２のチャンバー内に通過することが、前記第１のチャンバー内から第２のチャンバー内への前記測定対象物の電気泳動により促進される、請求項８～１２の何れか１項に記載の一粒子解析方法。
  14. 　前記第１のチャンバー内の前記測定対象物が前記貫通孔から前記第２のチャンバー内に通過することが、前記第１のチャンバー内から第２のチャンバー内への前記測定対象物を含む液体の流動により促進される、請求項８～１３の何れか１項に記載の一粒子解析方法。
  15. 　前記液体の流動が、電気浸透流によることを特徴とする請求項１４記載の一粒子解析方法。
  16. 　前記液体の流動が、前記第１のチャンバーと、前記第２のチャンバーとの圧力差によることを特徴とする請求項１４記載の一粒子解析方法。
  17. 　前記第１の電極および前記第２の電極は、前記隔壁と接触していない請求項８～１６の何れか１項に記載の一粒子解析方法。
  18. 前記隔壁が第１の面と第２の面を有し、前記第１の面が前記第１のチャンバー内の第１の電極に接触し、前記第２の面が前記第２のチャンバー内の第２の電極に接触している請求項８～１６の何れか１項に記載の一粒子解析方法。
  19. 前記一粒子解析装置において、前記貫通孔近傍の径をＡとすると次の式；
    ２ｄ≦Ａ≦１５０００ｔ
    が満たされる、請求項８～１８の何れか１項に記載の一粒子解析方法。
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