WO2012137970A1 - 改変ラミニンおよびその利用 - Google Patents

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WO2012137970A1
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cells
cell
human
chain
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関口　清俊
征雅 谿口
誠人 中川
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国立大学法人大阪大学
国立大学法人京都大学
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    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/30—Organic components

Definitions

  • the present invention relates to a modified human laminin and use thereof. Specifically, the present invention relates to a modified human laminin in which a cell growth regulatory molecule is bound to laminin or a fragment thereof, a cell culture method using the modified human laminin, a method for establishing iPS cells, and the The present invention relates to a culture substrate coated with modified human laminin.
  • Stem cells especially pluripotent stem cells such as ES cells and iPS cells, are attracting attention worldwide for their application in regenerative medicine.
  • the cells are usually used as feeder cells as fibroblasts derived from mouse embryos that have been treated with radiation or antibiotics to stop cell division ( Incubated in the presence of MEF).
  • STO cells are usually used as MEFs, but SNL cells (McMahon, A. P. & Bradley, A. Cell 62, 1073-1085 (1990)) are often used to induce iPS cells. ing.
  • SNL cells McMahon, A. P. & Bradley, A. Cell 62, 1073-1085 (1990)
  • the use of these feeder cells is a major limitation.
  • Matrigel is known to contain abundant basement membrane components such as laminin and type IV collagen, its composition has not been completely elucidated, and since it is derived from a mouse, it is human in regenerative medicine. It is not suitable for stem cell culture.
  • Laminin is a major cell adhesion molecule of the basement membrane, a heterotrimer composed of three subunit chains of ⁇ chain, ⁇ chain and ⁇ chain, and is a huge glycoprotein with a molecular weight of 800,000 Da. Three subunit chains associate on the C-terminal side to form a coiled-coil structure and form a heterotrimeric molecule stabilized by disulfide bonds.
  • the present inventors have reported that a recombinant protein of human laminin (particularly laminin 332 consisting of ⁇ 3 ⁇ 3 ⁇ 2 and laminin 511 consisting of ⁇ 5 ⁇ 1 ⁇ 1) is effective in maintaining the pluripotency of human ES cells (non-patent literature). 1).
  • adhesion receptors other than laminin receptors are also expressed on the surface of human stem cells. Ineffective use of receptors. Therefore, development of a new human-derived extracellular matrix having adhesion activity closer to that of nature and capable of culturing human stem cells under feeder-free conditions is eagerly desired.
  • the present invention relates to a culture substrate capable of maintaining and culturing stem cells while maintaining pluripotency in a feeder-free culture environment, a cell culture method and iPS cell establishment method using the culture substrate, and a coating on the extracellular matrix It is an object of the present invention to provide a cultured substrate.
  • the present invention includes the following inventions in order to solve the above problems.
  • Cell growth control at least one position of laminin or ⁇ -chain N-terminus, ⁇ -chain C-terminus, ⁇ -chain N-terminus and ⁇ -chain N-terminus of laminin fragment forming heterotrimer A modified laminin characterized in that the molecules are bound.
  • the modified laminin according to [1], wherein the cell growth control molecule is a growth factor binding molecule.
  • the laminin is composed of one ⁇ chain selected from ⁇ 1 to ⁇ 5, one ⁇ chain selected from ⁇ 1 to ⁇ 3, and one ⁇ chain selected from ⁇ 1 to ⁇ 3.
  • A a fragment containing fibronectin or its cell adhesion active site
  • b a fragment containing collagen or its cell adhesion active site
  • c a fragment containing vitronectin or its cell adhesion active site
  • d nephronectin or its cell adhesion active site
  • E Fragment containing osteopontin or its cell adhesion active site
  • f Fragment containing MAEG or its cell adhesion active site
  • g Tenascin or fragment containing its cell adhesion active site
  • h SVEP1 or its cell Fragment containing an adhesion active site
  • i TGF- ⁇ 1 late associated peptide or fragment containing its cell adhesion active site
  • j TGF- ⁇ 3 late associated p eptide or fragment containing the cell adhesion active site
  • k globular domain 4 and / or 5 of laminin ⁇ chain Spherical domain 4 and / or 5 of laminin ⁇ chain
  • [12] A method for culturing mammalian cells, comprising culturing in the presence of the modified human laminin according to any one of [1] to [11].
  • the culture method according to [12], wherein the mammalian cells are ES cells, iPS cells, or somatic stem cells.
  • [16] The culture substrate according to [15], wherein the modified human laminin is coated at a concentration of 0.03 to 25 ⁇ g / cm 2 .
  • a method for establishing an iPS cell comprising a step of bringing a nuclear reprogramming substance into contact with a somatic cell in the presence of the modified laminin according to any one of [1] to [11].
  • the nuclear reprogramming substance includes one or more kinds of substances selected from the group consisting of Oct family, Sox family, Klf family, Lin family and Glis family and nucleic acids encoding them. The method for establishing iPS cells according to [17].
  • modified human laminin as an extracellular matrix capable of maintaining and culturing stem cells while maintaining pluripotency in a feeder-free culture environment, a cell culture method and iPS cell establishment method using the modified human laminin, and A culture substrate coated with modified human laminin can be provided.
  • human-derived modified human laminin to establish iPS cells in a xeno-free medium or culturing human stem cells, highly safe human stem cells that can be applied to regenerative medicine can be provided.
  • FIG. 3 is a diagram showing the results of SDS-PAGE analysis of modified human laminin (hereinafter referred to as “Plus # 2 laminin E8”). It is a figure which shows the result of having compared the density
  • Modified human laminin (hereinafter referred to as “Plus # 3 laminin E8”) or E8 fragment of human laminin ⁇ 5 ⁇ 1 ⁇ 1, in which E8 fragment of Plus # 1 laminin E8, Plus # 2 laminin E8, human laminin ⁇ 5 ⁇ 1 ⁇ 1 and human perlecan domains I to III are fused, Or it is a figure which shows the result of having cultured the human iPS cell using the culture base material which coated Matrigel for 7 days, and confirming engraftment.
  • Human iPS cells are subcultured for 10 passages using a culture substrate coated with Plus # 1 laminin E8 or Plus # 2 laminin E8, and immunized with undifferentiated markers Oct3 / 4, SSEA-4 and TRA-1-60 It is a figure which shows the dyeing
  • FIG. 2 shows the structure of an episomal plasmid vector, where (I) is pCEB-hSK-O and (II) is pCEB-hUL-G.
  • the present invention relates to cell growth in at least one of the N-terminus of the ⁇ chain, the C-terminus of the ⁇ -chain, the N-terminus of the ⁇ -chain and the N-terminus of the ⁇ -chain of laminin or a laminin fragment forming a heterotrimer.
  • a modified laminin characterized in that a regulatory molecule is attached.
  • Laminin is a heterotrimeric molecule composed of three subunit chains, an ⁇ chain, a ⁇ chain, and a ⁇ chain.
  • the laminin constituting the modified laminin of the present invention may be any isoform. That is, the laminin constituting the modified laminin of the present invention has one ⁇ chain selected from ⁇ 1 to ⁇ 5, one ⁇ chain selected from ⁇ 1 to ⁇ 3, and one ⁇ selected from ⁇ 1 to ⁇ 3. What consists of a chain
  • strand should just be sufficient. Specifically, twelve types described in Table 1 and all other isoforms can be suitably used. Laminin ⁇ 3 ⁇ 3 ⁇ 2 and laminin ⁇ 5 ⁇ 1 ⁇ 1 are preferable.
  • laminin The origin of laminin is not particularly limited, and laminin derived from various organisms can be used.
  • Laminin derived from a mammal is preferable. Examples of mammals include, but are not limited to, humans, mice, rats, cows, pigs and the like. Among these, it is particularly preferable to use human-derived laminin.
  • human-derived laminin When culturing human stem cells to obtain materials for human regenerative medicine, it is preferable to use human-derived laminin because a culture environment that satisfies the xeno-free condition of excluding heterogeneous components from the culture system is required. .
  • the laminin constituting the modified laminin of the present invention may be full length or a fragment thereof. That is, it may be a full-length laminin consisting of a full-length ⁇ chain, a full-length ⁇ chain and a full-length ⁇ chain, or a laminin fragment where at least one of the ⁇ chain, ⁇ chain and ⁇ chain is a fragment shorter than the full length. .
  • the laminin fragment is required to form a heterotrimer.
  • the laminin fragment preferably has integrin binding activity. It can be confirmed that the laminin fragment forms a heterotrimer by subjecting the laminin fragment to SDS-PAGE and detecting the number of bands (see Example 1). Whether the laminin fragment has integrin binding activity can be confirmed by ELISA or the like (see Example 4).
  • the laminin fragment constituting the modified laminin of the present invention is not particularly limited as long as it forms a heterotrimer composed of an ⁇ chain, a ⁇ chain, and a ⁇ chain. From the viewpoint of strength of integrin binding activity and expression efficiency as a recombinant protein (that can be produced in a high yield as a recombinant protein compared to full-length laminin), an E8 fragment of laminin is preferred.
  • the E8 fragment of laminin was identified as a fragment having strong cell adhesion activity among fragments obtained by digesting mouse laminin ⁇ 1 ⁇ 1 ⁇ 1 (hereinafter referred to as “mouse laminin 111”) with elastase (Edgar D ., Timpl R., Thoenen H.The heparin-binding domain of laminin is responsible for its effects on neurite outgrowth and neuronal survival. EMBO J., 3: 1463-1468, 1984., Goodman SL., DeutzvonR. der Mark K.Two distinct cell-binding domains in laminin can independently promote nonneuronal cell adhesion and spreading. J. Cell Biol., 105: 589-598, 1987.).
  • laminin other than mouse laminin 111 is also digested with elastase, the presence of a fragment corresponding to the E8 fragment of mouse laminin 111 is presumed, but laminin other than mouse laminin 111 is digested with elastase to isolate and identify the E8 fragment. None has been reported. Therefore, the laminin E8 used in the present invention does not need to be a laminin elastase digestion product, has the same cell adhesion activity as the E8 of mouse laminin 111, has the same structure, and the same level. Any fragment of laminin having a molecular weight may be used.
  • Laminin may be a natural type or a modified type in which one or more amino acid residues are modified while maintaining its biological activity.
  • a method for producing laminin is not particularly limited, and examples thereof include a method for purifying from a laminin highly expressing cell and a method for producing a recombinant protein.
  • a method for producing a laminin fragment is also not particularly limited, and examples thereof include a method of digesting full-length laminin with a proteolytic enzyme such as elastase, fractionating and purifying the target fragment, and a method of producing it as a recombinant protein. Both laminin and laminin fragment are preferably produced as recombinant proteins from the viewpoint of production amount, quality uniformity, production cost, and the like.
  • Recombinant laminin and recombinant laminin fragments can be produced by appropriately using known gene recombination techniques.
  • a method for producing recombinant laminin and recombinant laminin fragment for example, DNAs encoding full-length proteins or partial proteins of ⁇ chain, ⁇ chain, and ⁇ chain are obtained and inserted into expression vectors, respectively.
  • the three types of expression vectors thus obtained can be co-introduced into an appropriate host cell and expressed, and the protein forming the trimer can be purified by a known method. For example, Ido et al.
  • the base sequence information of the genes encoding the ⁇ chain, ⁇ chain, and ⁇ chain constituting the main mammalian laminin and the amino acid sequence information of each chain can be obtained from a known database (GenBank, etc.).
  • Table 1 shows the accession numbers of the chains constituting laminin for main mammals including humans.
  • the base sequence information and amino acid sequence information of laminin constituent chains of various mammals can also be obtained from known databases (GenBank, etc.).
  • Laminin E8 is a fragment obtained by removing globular domains 4 and 5 from a C-terminal fragment of ⁇ chain (hereinafter referred to as “ ⁇ chain E8”), a C-terminal fragment of ⁇ chain (hereinafter referred to as “ ⁇ chain E8”) and ⁇
  • the C-terminal fragment of the chain (hereinafter referred to as “ ⁇ chain E8”) is a fragment forming a trimer, and the molecular weight of the trimer is about 150 to about 170 kDa.
  • the ⁇ chain E8 usually consists of about 770 amino acids, and about 230 amino acids on the N-terminal side are involved in trimer formation.
  • the ⁇ chain E8 usually consists of about 220 to about 230 amino acids.
  • the ⁇ chain E8 usually consists of about 240 to about 250 amino acids.
  • the third glutamic acid residue from the C-terminal part of ⁇ chain E8 is essential for the cell adhesion activity of laminin E8 (Hiroyuki Ido, Aya Nakamura, Reiko Kobayashi, Shunsuke Ito, Shaoliang Li, Sugiko Futaki, andakiKiyotoshi Sekiguchi, “The requirement of the glutamic acid residue at the third position from the carboxyl termini of the laminin ⁇ chains in integrin binding by laminins ”The Journal of Biological Chemistry, 282, 11144-11154, 2007.).
  • the cell growth control molecule constituting the modified laminin of the present invention means an extracellular factor necessary for cell culture and amplification. Specifically, (i) it binds to a receptor on the cell surface and binds to a cell scaffold.
  • a cell adhesion molecule of an extracellular matrix to be provided or (ii) a molecule associated with growth factor localization control or activity control by binding to a growth factor (referred to herein as a “growth factor binding molecule”) Applicable.
  • the growth factor to which the growth factor binding molecule is bound is synonymous with the growth factor, and is not particularly limited as long as it is a substance that promotes cell proliferation, growth, differentiation, and the like.
  • EGF Epidermal growth factor
  • bFGF basic fibroblast growth factor
  • TGF Transforming growth factor
  • IGF Insulin-like growth factor
  • PDGF Plater-derived growth factor
  • VEGF Vasicular endothelial growth factor
  • HGF Hepatocyte growth factor
  • NGF Neve growth factor
  • the cell adhesion molecule constituting the modified laminin of the present invention may be either a molecule involved in adhesion between a cell and an extracellular matrix, or a molecule involved in adhesion between cells, and a membrane protein present in the cell membrane In addition to the extracellular matrix, these are not particularly limited. Further, the cell adhesion molecule constituting the modified laminin of the present invention may be the full length of the cell adhesion molecule or a fragment containing the cell adhesion site of the cell adhesion molecule. Examples of the adhesion molecule include the following (a) to (e), and at least one selected from these is preferable.
  • A Cell adhesion molecule that binds to integrin
  • b Cell adhesion molecule that binds to membrane-bound proteoglycan
  • c Cell adhesion molecule that binds to discoidin domain receptor
  • d Cell adhesion molecule that binds to dystroglycan
  • Examples of the cell adhesion molecule that binds to integrin include fibronectin, collagen, vitronectin, nephronectin, osteopontin, MAEG, tenascin, SVEP1, TGF- ⁇ 1 ateassociated peptide, and TGF- ⁇ 3 deacidoidate.
  • Examples of cell adhesion molecules that bind to membrane-bound proteoglycans include fibronectin, vitronectin, nephronectin, laminin, and the like.
  • Examples of cell adhesion molecules that bind to dystroglycan include laminin.
  • Suitable cell adhesion molecules constituting the modified laminin of the present invention include, for example, fibronectin, vitronectin, nephronectin, osteopontin, MAEG, TGF- ⁇ 1 latency associated peptide, TGF- ⁇ 3 lateness associatedArgentate -Proteins containing Asp sequences in their molecules, collagen type I, collagen type IV, other collagen molecules, SVEP1, E-cadherin, N-cadherin, P-cadherin and other intercellular adhesion molecules of the cadherin family.
  • fragment containing the cell adhesion active site of the cell adhesion molecule examples include, for example, fragments containing the seventh to tenth human fibronectin type III modules (Fusao Kimizuka, Yoichi Ohdate, Yasutoshi Kawase, Tomoko Shimojyo, Yuki Taguchi, Kimikazu Hashino, Shoichi Goto, Hidetaka Hashi, Ikunoshin Kato, Kiyotoshi Sekiguchi, and Koiti Titani, “Role of type III homology repeats in cell adhesive function within the cell-binding domain of fibronenal ist 305 1999.), a fragment containing the 12th to 14th fibronectin type III module (Ri-ichiroh Manabe, beNaoko Oh-e, Toshinaga Maeda, Tomohiko Fukuda, and Kiyotoshi Sekiguchi, “Modulation of cell adhesive activity of fibroneternative spliced EDA segment ”The Journal of Cell Biology
  • a linker region in the central part of nephronectin (Yuya Sato, Toshihiko Uemura, Keisuke Morimitsu, Ryoko Sato-Nishiuchi, Ri-ichiroh Manabe, Junichi Takagi, Masashi Yition, alpha8beta1 ”The Journal of Biological Chemistry, 284, 14524-14536, 2009.).
  • globular domains 4 and / or 5 of human laminin ⁇ chain can also be suitably used as cell adhesion molecules constituting the modified human laminin of the present invention.
  • the method for producing a cell adhesion molecule is not particularly limited, and examples thereof include a method for purification from cells expressing the target cell adhesion molecule and a method for producing a recombinant protein.
  • the recombinant protein can be produced by appropriately using a known gene recombination technique.
  • Human fibronectin, vitronectin, nephronectin, osteopontin, MAEG, TGF- ⁇ 1, TGF- ⁇ 3, tenascin, type I collagen, type IV collagen, SVEP1, E-cadherin, N-cadherin and P-cadherin are encoded.
  • the nucleotide sequence information and amino acid sequence information of the gene to be obtained can be obtained from a known database (GenBank etc.) with the accession numbers described in Table 3, respectively.
  • the base sequence information and amino acid sequence information of a gene of a cell adhesion molecule derived from a non-human organism can be obtained from a known database (GenBank, etc.).
  • Table 4 shows the base sequence information and amino acid sequence information of a lectin gene derived from a non-human organism among cell adhesion molecules that bind to sugar chains on the cell surface.
  • the growth factor-binding molecule constituting the modified laminin of the present invention is not particularly limited as long as it is a molecule that can bind to a growth factor involved in the growth of cultured cells. By chimerizing the growth factor-binding molecule, it becomes possible to capture the growth factor on the substrate surface, to cause the growth factor to act on the cells more efficiently (more physiologically), and to stimulate proliferation.
  • the growth factor binding molecule constituting the modified laminin of the present invention may be the full length of the growth factor binding molecule or a fragment containing a growth factor binding site. Examples of the growth factor binding molecule include heparan sulfate proteoglycan.
  • heparan sulfate proteoglycans examples include perlecan, agrin, type XVIII collagen, syndecan 1-4, glypican 1-6, and the like.
  • growth factor-binding molecules other than heparan sulfate proteoglycans include latent TGF- ⁇ binding protein 1-4.
  • the fragment containing the growth factor binding site of the growth factor binding molecule include, for example, perlecan domains I to III (regions from the 22nd valine to the 1676th proline from the N terminus; amino acid sequence information is described in Table 5), Regions containing the first to eighth of the follistatin (FS) domain of agrin (Uwe Winzen, Gregory J.
  • Agrin is a chimeric proteoglycan with the attachment sites for heparan sulfate / chondroitin sulfate multiple serine-glycine clusters ”The Journal of Biological Chemistry, 27j8, 30106-30114,1142008.).
  • the method for producing a growth factor binding molecule is not particularly limited, and examples thereof include a method for purification from cells expressing the target growth factor binding molecule and a method for producing a recombinant protein.
  • the recombinant protein can be produced by appropriately using a known gene recombination technique.
  • the nucleotide sequence information and amino acid sequence information of the genes encoding human perlecan, agrin, type XVIII collagen, syndecan 1 to 4, glypican 1 to 6, and latent TGF- ⁇ binding protein 1 to 4 are shown in Table 5, respectively. Can be obtained from a known database (GenBank, etc.) with the accession number.
  • the modified laminin of the present invention is the N-terminal of the ⁇ chain of the laminin fragment in which the cell growth regulatory molecule (for example, cell adhesion molecule, growth factor binding molecule, etc.) forms a laminin or heterotrimer, the ⁇ chain It may be bonded to at least one position of the C-terminal, the N-terminal of the ⁇ chain, and the N-terminal of the ⁇ chain. Therefore, in the modified laminin of the present invention, the cell growth regulatory molecule may be bound at two sites, may be bound at three sites, or may be bound at four sites. When cell growth control molecules bind to multiple sites, the cell growth control molecules may be one type or two or more types. The cell growth regulatory molecule may be bound to any of the above four sites, but it is preferable that the globular domain 4 and / or 5 of the laminin ⁇ chain is bound to the C-terminus of the ⁇ chain.
  • the cell growth regulatory molecule for example, cell adhesion molecule, growth factor binding
  • the modified laminin of the present invention can be produced as a recombinant modified laminin by appropriately using a known gene recombination technique.
  • a DNA encoding the human laminin ⁇ chain E8 and a DNA encoding the cell growth control molecule are ligated to form human laminin.
  • An expression vector is prepared in which a fusion gene encoding a fusion protein in which a cell growth regulatory molecule is bound to the N-terminus of the E8 ⁇ chain is inserted.
  • modified laminin in which cell growth control molecules are bound to other sites and a modified laminin in which cell growth control molecules are bound to a plurality of locations can also be produced according to this.
  • the modified laminin of the present invention may be obtained by chemically binding a cell growth regulatory molecule to at least one of the N-terminus of the ⁇ chain, the C-terminus of the ⁇ -chain, the N-terminus of the ⁇ -chain, and the N-terminus of the ⁇ -chain. Good.
  • the modified laminin of the present invention has a high cell adhesion activity and / or proliferation stimulating activity, and can be provided as a highly pure and homogeneous protein, and thus is very useful as an extracellular matrix for cultured cells, particularly cultured stem cells. is there.
  • the modified laminin of the present invention as a human-derived modified laminin, human stem cells can be cultured in a feeder-free and xeno-free environment, and highly safe human stem cells that can be applied to regenerative medicine are provided. be able to.
  • the present invention provides a culture method for culturing mammalian cells in the presence of the modified laminin of the present invention. Since the modified laminin of the present invention has a high cell adhesion activity and / or proliferation stimulating activity, cells that have been conventionally cultured using feeder cells can be used as an extracellular matrix that serves as a scaffold for mammalian cells. Can be cultured without using feeder cells.
  • the culture method of the present invention can be applied to any mammalian cell culture, but is preferably applied to stem cell culture.
  • Stem cells mean cells having self-replicating ability and pluripotency, and include somatic stem cells, pluripotent stem cells, and the like.
  • somatic stem cells include neural stem cells, mesenchymal stem cells, and hematopoietic stem cells.
  • pluripotent stem cells include ES cells (embryonic stem cells), iPS cells (artificial pluripotent stem cells), mGS cells (pluripotent germ stem cells), and fusion cells of ES cells and somatic cells. More preferred are pluripotent stem cells, and more preferred are ES cells and iPS cells.
  • Mammals are not particularly limited, and examples include humans, mice, rats, cows, and pigs. Of these, humans are preferable. That is, the culture method of the present invention is preferably used for culturing human stem cells. When human stem cells are cultured using the culture method of the present invention, it is preferable to use human-derived modified laminin.
  • the method of culturing in the presence of the modified human laminin may be a method of culturing cells using a medium supplemented with the modified laminin of the present invention, or a method of culturing cells using a culture substrate coated with the modified laminin of the present invention. But you can.
  • the modified laminin may be added to the medium in advance, or the modified laminin may be added to the medium at the time of use.
  • the amount of the modified laminin to be added is not particularly limited, but a concentration of about 0.03 to about 25 ⁇ g / cm 2 is preferable, more preferably about 0.06 to about 10 ⁇ g / cm 2 with respect to the culture area of the incubator used for culture. 2 , more preferably from about 0.38 to about 3.8 ⁇ g / cm 2 .
  • the culture method of the present invention a culture method when culturing human stem cells in the presence of human-derived modified laminin will be described, but the culture method of the present invention is not limited thereto, It can also be suitably used for culturing mammalian cells other than humans.
  • the medium to be used is not particularly limited, but a synthetic medium is preferred, and a synthetic medium containing no non-human biological component (xenofree) is particularly preferred.
  • xenofree non-human biological component
  • TeSR2 is a xeno-free medium.
  • media described in the following documents (i) to (v) can also be suitably used.
  • Method 1 Add 0.25% trypsin / DMEM-F12 (eg 1 ml / 60 mm dish) to a culture dish (days 3-5) of human iPS cells co-cultured with feeder cells (eg MEF) at 37 ° C. Incubate for 2-3 minutes and wash the culture dish with DMEM-F12 to remove feeder cells.
  • the cell suspension obtained by physically detaching whole cells by adding the culture solution was passed through a BD Falcon cell strainer 100 ⁇ m (BD Falcon # 352460), and then the strainer was washed to isolate only human iPS cell colonies, to recover.
  • Method 2 Cell detachment solution (for example, ES / iPS cell detachment solution (Reprocell RCHETP002), 1 mg / ml dispase / DMEM) in culture dishes (3-5 days) of human iPS cells co-cultured with feeder cells (for example, MEF) -F12, 10 mg / ml collagenase IV / DMEM-F12, etc.) is added (for example, 1 ml / 60 mm dish) and incubated at 37 ° C. for 5 minutes to detach human iPS cells and MEF. The cells are transferred to a 15 ml centrifuge tube, and about 10 ml of the culture solution is added to suspend the cells. Then, the tube is allowed to stand for 5 minutes to precipitate only the colonies. The supernatant is removed, and the same operation is repeated twice or more to precipitate and collect only human iPS cell colonies.
  • feeder cells for example, MEF
  • the colonies of collected human iPS cells are dispersed into single cells.
  • the method for dispersing the cells in a single cell is not particularly limited, and examples thereof include a trypsin treatment method and a method of crushing colonies by flushing the culture solution several times using a P-1000 pipetteman or the like.
  • After being dispersed in a single cell it is suspended in an appropriate culture medium (for example, TeSR2) and seeded on a culture dish coated with human-derived modified laminin (for example, 1.0 ⁇ g / cm 2 ). Cultivation is performed under CO 2 concentration conditions compatible with the culture medium used, and the culture medium is exchanged every day.
  • subculture can be performed by a method of seeding human iPS cells while maintaining an appropriately sized colony form as in the conventional method, and human iPS cells are converted into single cells.
  • the state of being dispersed in a single cell does not require that all cells in the cell suspension are dispersed in a single cell.
  • the state in which about 10 or more cells adhered are contained in the cell suspension is also included in the state of being dispersed in a single cell.
  • TrypLE Select (trade name, Invitrogen # 12563011) is added to a culture dish in which human iPS cells are cultured (for example, 1 ml / 100 mm dish), and is incubated at 37 ° C. for 5 minutes.
  • a colony of human iPS cells is crushed by flushing the culture solution several times using a P-1000 pipetteman or the like, and dispersed into single cells.
  • Suspend cells by adding culture medium and collect in a centrifuge tube.
  • the cells were suspended in fresh culture solution and coated with human-derived modified laminin (for example, 1.0 ⁇ g / cm 2 ).
  • human-derived modified laminin for example, 1.0 ⁇ g / cm 2 .
  • a culture dish is seeded with human iPS cells dispersed in a single cell at a seeding density of, for example, about 40,000 cells / cm 2 .
  • Cultivation is performed under CO 2 concentration conditions compatible with the culture medium used, and the culture medium is exchanged every day.
  • the enzyme solution is removed, the culture solution is added, and the culture solution is flushed several times using, for example, a P-1000 pipetteman or the like, so that human iPS cells are crushed small enough to maintain about 50 to about 100 colonies.
  • the cell suspension is collected in a centrifuge tube, and after centrifugation (200 ⁇ g, 3 minutes) and washing with the same culture solution are repeated twice, the cells are suspended in a fresh culture solution, and human-derived modified laminin is added.
  • a culture dish coated eg 1.5 ⁇ g / cm 2
  • Cultivation is performed under CO 2 concentration conditions compatible with the culture medium used, and the culture medium is exchanged every day.
  • the present invention provides a method for establishing iPS cells in the presence of the modified laminin of the present invention.
  • the iPS cell establishment method of the present invention only needs to include a step of bringing a nuclear reprogramming substance into contact with a somatic cell in the presence of the modified laminin of the present invention. Furthermore, it is preferable to include a step of culturing somatic cells that have been contacted with a nuclear reprogramming substance in the presence of the modified laminin of the present invention.
  • iPS cells can be established according to the procedures described in (vi) to (xiii) below, for example.
  • iPS cells that are inferior to ES cells in pluripotency can be produced in humans and mice.
  • the specific factor is defined as “nuclear reprogramming substance” in the present invention, and is introduced into a somatic cell or brought into contact with a somatic cell together with a factor for improving the establishment efficiency of an iPS cell.
  • a substance (s) capable of inducing iPS cells from a protein it may be composed of any substance such as a protein factor or a nucleic acid encoding the same (including a form incorporated in a vector) or a low molecular weight compound. Good.
  • the nuclear reprogramming substance is a protein factor or a nucleic acid encoding the same
  • the following combinations are preferably exemplified (in the following, only the name of the protein factor is described).
  • c-Myc can be replaced with T85A (active mutant), L-Myc.) (3) Oct3 / 4, Klf4, c-Myc, Sox2, Fbx15, Nanog, ERas, TcelI (4) Oct3 / 4, Klf4, c-Myc, Sox2, TERT, SV40 Large T antigen (hereinafter SV40LT) (5) Oct3 / 4, Klf4, c-Myc, Sox2, TERT, HPV16 E6 (6) Oct3 / 4, Klf4, c-Myc, Sox2, TERT, HPV16 E7 (7) Oct3 / 4, Klf4, c-Myc, Sox2, TERT, HPV6 E6, HPV16 E7 (8) Oct3 / 4, Klf4, c-Myc, Sox2, TERT, Bmil (See above, WO 2007/069666 (however, regarding the substitution of Sox2 to Sox18 and the substitution of Klf4 to Klf1 or Kl
  • Sox2 Sox1, Sox3, Sox15, Sox17, Sox18
  • Sox7 Sox7
  • Glis family members Glis2, Glis3, etc. can be used instead of Glis1.
  • L-Myc or Lin28B can be used instead of c-Myc or Lin28, respectively.
  • a combination that does not fall under the above (1) to (26) but includes all of the components in any of them and further includes any other substance is also included in the category of “nuclear reprogramming substance” in the present invention. Can be included.
  • the condition that the somatic cells subject to nuclear reprogramming have endogenously expressed some of the components in any of (1) to (26) above at a sufficient level for nuclear reprogramming.
  • a combination of only the remaining components excluding the component can also be included in the category of “nuclear reprogramming substance” in the present invention.
  • at least one, preferably two or more, more preferably three or more selected from Oct3 / 4, Sox2, Klf4, L-Myc, Lin28 and Glis1 are preferred nuclear reprogramming substances. Take as an example.
  • Mouse and human cDNA sequence information for each of the above proteinaceous factors can be obtained by referring to NCBI accession numbers described in WO 2007/069666 (Nanog is described as “ECAT4” in this publication)
  • mouse and human cDNA sequence information of Lin28, Lin28B, Esrrb, Esrrg, L-Myc, and Glis1 can be obtained by referring to NCBI accession numbers listed in Table 6, respectively). These cDNAs can be easily isolated.
  • the introduction of a nuclear reprogramming substance capable of inducing iPS cells into a somatic cell can be carried out using a known method for introducing a protein into a cell when the substance is a protein factor.
  • a method using a protein introduction reagent examples include a method using a protein introduction reagent, a method using a protein introduction domain or a cell-permeable peptide fusion protein, and a microinjection method.
  • electroporation method semi-intact cell method (Kano, F. et al. Methods in Molecular Biology, Vol. 322, 357-365 (2006)), introduction method using Wr-t peptide (Kondo, E. et al. Protein introduction methods such as Mol. Cancer Ther.
  • the nuclear reprogramming substance in the form of a nucleic acid encoding it rather than as the protein factor itself.
  • the nucleic acid may be DNA or RNA, or may be a DNA / RNA chimera.
  • the nucleic acid may be double-stranded or single-stranded.
  • the nucleic acid is double stranded DNA, in particular cDNA.
  • the nuclear reprogramming substance cDNA is inserted into an appropriate expression vector containing a promoter that can function in a host somatic cell.
  • expression vectors examples include retroviruses, lentiviruses, adenoviruses, adeno-associated viruses, herpes viruses, Sendai virus and other viral vectors, animal cell expression plasmids (eg, pA-11, pxT1, pRc / CMV, pRc / RSV). , PcDNAI / Neo) and the like.
  • the kind of vector to be used can be suitably selected according to the use of the iPS cell obtained.
  • adenovirus vectors, plasmid vectors, adeno-associated virus vectors, retrovirus vectors, lentivirus vectors, Sendai virus vectors and the like can be used.
  • the nucleic acid (reprogramming gene) that is a nuclear reprogramming substance may be incorporated on a separate expression vector, or two or more, preferably 2-3 types of genes may be incorporated into one expression vector. It is preferable to select the former when using a retrovirus or lentiviral vector with high gene transfer efficiency, and the latter when using a plasmid, adenovirus, episomal vector, or the like. Furthermore, an expression vector incorporating two or more types of genes and an expression vector incorporating only one gene can be used in combination.
  • the present invention provides a method for rapidly expanding stem cells.
  • the rapid expansion method of the present invention includes a step of dispersing stem cells into single cells, and a step of culturing the stem cells dispersed in single cells in the presence of the modified laminin of the present invention. What is necessary is just to seed the dispersed stem cells at a density of about 2 ⁇ 10 4 to about 20 ⁇ 10 4 cells / cm 2 .
  • the seeding density is more preferably about 3 ⁇ 10 4 to about 10 ⁇ 10 4 cells / cm 2 , and further preferably about 4 ⁇ 10 4 to about 5 ⁇ 10 4 cells / cm 2 .
  • the adhesion efficiency when the monodispersed stem cells are seeded at the above cell density is very low.
  • a significantly high adhesion efficiency is obtained. Then, since it proliferates vigorously, stem cells can be proliferated at a remarkably higher rate than the conventional method.
  • the culture method can be performed according to the description of the culture method of the present invention.
  • the rapid expansion method for stem cells of the present invention is preferably applied to pluripotent stem cells such as ES cells and iPS cells, and more preferably to ES cells. Further, it is preferably applied to human pluripotent stem cells, and more preferably applied to human ES cells.
  • the method for rapidly expanding stem cells of the present invention is applied to human stem cells, it is preferable to use human-derived modified laminin.
  • the present invention provides a method for isolating a stem cell-derived clone from a stem cell.
  • the single cell-derived clone isolation method of the present invention includes a step of dispersing stem cells into single cells, and a step of culturing the stem cells dispersed in single cells in the presence of the modified laminin of the present invention. What is necessary is just to form the colony derived from a single cell.
  • a single cell-derived clone separation method of the present invention a single cell-derived clone of a stem cell, which was difficult in a conventional culture system, can be formed and separated, and uniform stem cells can be easily obtained. It becomes possible.
  • a method for forming a single cell-derived colony and isolating a single cell-derived clone is not particularly limited.
  • a known limiting dilution method can be suitably used.
  • a cell density and a culture substrate to be used are appropriately selected according to the method to be used, and human stem cells dispersed in a single cell are seeded and cultured.
  • the culture method can be performed according to the description of the culture method of the present invention.
  • the single cell-derived clone separation method for stem cells of the present invention is preferably applied to pluripotent stem cells such as ES cells and iPS cells, and more preferably to ES cells. Further, it is preferably applied to human pluripotent stem cells, and more preferably applied to human ES cells.
  • the method for isolating a stem cell-derived clone of the present invention is applied to human stem cells, it is preferable to use human-derived modified laminin.
  • the present invention provides a method for culturing single cells of stem cells.
  • the single cell culture method of the present invention includes a step of dispersing stem cells into single cells, and a step of culturing the stem cells dispersed in single cells in the presence of the modified laminin of the present invention. What is necessary is just to maintain in the state of a single cell, without making it proliferate. Stem cells that have formed colonies may have different cell states in the periphery of the colony and in the interior of the colonies. However, according to the single cell culture method of the present invention, cells do not form colonies, and thus stem cells that have a uniform state. Thus, improvement in differentiation induction efficiency can be expected.
  • the cell density is appropriately selected according to the culture substrate to be used, seeded with stem cells dispersed in the single cells, and before the cells proliferate. It is preferable to use the cells for other purposes.
  • the time that can be maintained in the state of a single cell may be extended by using a culture solution that does not contain a growth factor or a culture solution in which the growth factor is reduced.
  • the stem cell single cell culture method of the present invention is preferably applied to pluripotent stem cells such as ES cells and iPS cells, and more preferably to ES cells. Further, it is preferably applied to human pluripotent stem cells, and more preferably applied to human ES cells. When applying the stem cell single cell culture method of the present invention to human stem cells, it is preferable to use human-derived modified laminin.
  • the present invention provides a culture substrate coated with the modified laminin of the present invention.
  • the cell cultured using the culture substrate of the present invention is not particularly limited, and any cell that can be cultured can be cultured using the culture substrate of the present invention.
  • Stem cells are preferred.
  • Stem cells include somatic stem cells, pluripotent stem cells and the like.
  • somatic stem cells include neural stem cells, mesenchymal stem cells, and hematopoietic stem cells.
  • pluripotent stem cells include ES cells (embryonic stem cells), iPS cells (artificial pluripotent stem cells), mGS cells (pluripotent germ stem cells), and fusion cells of ES cells and somatic cells.
  • pluripotent stem cells More preferred are pluripotent stem cells, and more preferred are ES cells and iPS cells. Mammals include humans, mice, rats, cows, pigs and the like. Of these, humans are preferable.
  • the culture substrate of the present invention is very useful when culturing cells that have been conventionally cultured using feeder cells without using feeder cells.
  • the method for producing the culture substrate of the present invention is not particularly limited, and any method may be used as long as it can coat a known incubator with the modified laminin of the present invention.
  • physiological salt of the above-described modified laminin of the present invention adjusted to neutral pH with an appropriate solvent such as PBS, physiological saline, trishydroxymethylaminomethane or 4- (2-hydroxyethyl) -1-piperazine ethanesulfonic acid.
  • the diluted laminin is coated on the surface of the incubator by diluting with water or the like, and adding this solution to a suitable incubator and allowing to stand at about 4 to 37 ° C. for about 1 to 12 hours.
  • a culture substrate can be produced.
  • the incubator is not limited as long as it can be used for culturing mammalian cells.
  • a glass or plastic petri dish, flask, multiwell plate, culture slide, microcarrier, polyvinylidene fluoride membrane, etc. A polymer film etc. are mentioned.
  • Coating concentration of the modified laminin is not particularly limited, but is preferably from about 0.03 to about 25 [mu] g / cm 2, more preferably from about 0.06 to about 10 [mu] g / cm 2, from about 0.38 to about 3.8 ⁇ g / cm 2 is more preferable. Since the culture substrate of the present invention uses modified laminin, a large number of human stem cells can adhere and proliferate even at a low coating concentration as compared with the case where a conventional matrigel is coated.
  • the culture substrate of the present invention may be coated with a single modified laminin or may be coated with a plurality of different modified laminins.
  • components other than the modified laminin may be coated.
  • serum components, extracellular matrix molecules, growth factors, differentiation inducing factors, morphogenic factors (morphogens) and the like can be mentioned.
  • non-biological components such as a synthetic polymer gel (synthetic polymer) may be coated.
  • the culture substrate of the present invention is preferably coated with human-derived modified laminin.
  • the components other than the modified laminin are preferably human-derived components.
  • the culture substrate of the present invention coated with human-derived modified laminin maintains human stem cells while maintaining pluripotency in a culture environment that does not use feeder cells normally used for human stem cell culture (feeder-free) It becomes possible to culture.
  • human stem cells are cultured on feeder cells such as mouse embryonic fibroblasts (MEF) whose growth has been stopped by X-ray irradiation or mitomycin C treatment in order to maintain clonal proliferation and undifferentiation.
  • feeder cells such as mouse embryonic fibroblasts (MEF) whose growth has been stopped by X-ray irradiation or mitomycin C treatment in order to maintain clonal proliferation and undifferentiation.
  • a culture system for co-culturing stem cells such a culture system that does not use feeder cells is feeder-free.
  • a medium from which xenogeneic components are excluded is used, human stem cells can be cultured under culture conditions that are completely free of xenogeneic components (Xeno-Free). It is possible to provide highly safe human stem cells that are very unlikely to express virulence. Examples of the xenofree medium include TeSR2 (trade name, STEMCELL TECHNOLOGIES).
  • Example 1 Production of modified human laminin
  • recombinant human laminin 511E8 (Hereinafter referred to as “rhLM511E8”) was prepared by adding human laminin ⁇ 1 chain globular domain 4-5 (hereinafter referred to as “human laminin ⁇ 1 chain LG45”) to the C-terminal part of E8 of human laminin ⁇ 5 chain.
  • PCR was carried out using the following three types of primer sets, and a 6 ⁇ His tag ( Three types of pBluescript KS (+) each having a DNA sequence encoding HHHHHH), a DNA sequence encoding HA (hemagglutinin) tag (YPYDVPDYA), or a DNA sequence encoding FLAG tag (DYKDDDDK) were prepared.
  • a plasmid containing the full-length base sequence of ⁇ 5 chain, ⁇ 1 chain, and ⁇ 1 chain (Hiroyuki Ido, Kenji Harada, Sugiko Futaki, Yoshitaka Hayashi, Ryoko Nishiuchi, Yuko Natsuka, Shaoliang Li, Yoshinao Wada, Ariana C.
  • PCR was performed using the following primers to amplify regions corresponding to ⁇ 5 (Ala 2534 -Ala 3327 ), ⁇ 1 (Leu 1561 -Leu 1786 ), and ⁇ 1 (Asn 1362 -Pro 1609 ) of each strand.
  • the amplified DNA fragment was inserted into the EcoRV site of the multicloning site of pBluescript KS (+) to which the tag sequence was added, and then the amplified DNA fragment including the sequence encoding the 5′-side tag was subjected to restriction enzymes EcoRI and HindIII.
  • an expression vector pSecTag2B for mammalian cells (Invitrogen, having a DNA sequence encoding the mouse Ig- ⁇ chain V-J2-C signal peptide internally), and a human ⁇ 5 chain E8 fragment (N-terminal) 6 ⁇ His tag on the side), human ⁇ 1 chain E8 fragment (including the HA tag on the N-terminal side), and human ⁇ 1 chain E8 fragment (including the FLAG tag on the N-terminal side), respectively.
  • the amplified product was digested with the restriction enzyme AscI and inserted into the AscI-PmeI site of the human laminin ⁇ 5 chain E8 expression vector to prepare a human laminin ⁇ 1 chain LG45 fusion human laminin ⁇ 5 chain E8 fragment expression vector.
  • PCR was performed using a human laminin ⁇ 5 chain E8 fragment expression vector as a template and the following primers to amplify 754 base pairs at the 3 ′ side of the ⁇ 5 chain E8 fragment.
  • the sequence used for extension PCR is added to the 5 ′ side of the primer of SEQ ID NO: 14.
  • Human laminin ⁇ 5 chain partial fragment amplification primer 5′-CAATGATCTGGAGCTGGCCGACGCCTACTACCTG-3 ′ (forward, SEQ ID NO: 13) 5'-CTCTGCATCAGGCCCCAGGCCCGGGGTC-3 '(reverse, SEQ ID NO: 14)
  • a plasmid containing the full-length base sequence of human laminin ⁇ 1 chain (Hiroyuki Ido, Kenji Harada, Yoshiko Yagi, and Kiyotoshi Sekiguchi, “Probing the integrin-binding site within the globular domain of laminin-511 with the function-blocking monoclonal antibody 4C7 . ”, Matrix Biology, 25 (2), 112-117, 2006) was used as a template to perform PCR using the following primers to amplify a region corresponding to the human laminin ⁇ 1 chain LG45 site (Asp 2684 -Ser 3075 ) .
  • the obtained two kinds of DNA fragments were ligated and amplified by extension PCR using the following primers to obtain DNA fragments encoding the C-terminal part of human laminin ⁇ 5 chain E8 and the human laminin ⁇ 1 chain LG45 site.
  • the amplified DNA was digested with the restriction enzyme AscI and inserted into the AscI-PmeI site of the human laminin ⁇ 5 chain E8 expression vector to prepare a human laminin ⁇ 1 chain LG45 fusion human laminin ⁇ 5 chain E8 fragment expression vector.
  • the amplified product is digested with restriction enzymes NheI and NotI, and inserted into the corresponding site of mammalian cell expression vector pSecTag2B (Invitrogen, which has a gene sequence encoding a mouse Ig- ⁇ chain VJ2-C signal peptide endogenously). Then, an expression vector of FNIII7-10 fusion human laminin ⁇ 1E8 fragment expression vector was prepared.
  • PCR was performed using a human laminin ⁇ 1 chain E8 fragment expression vector as a template and the following primers, and regions corresponding to mouse Ig- ⁇ chain V-J2-C signal peptide-FLAG tag and ⁇ 1 chain E8 fragment were respectively represented. Amplified.
  • arrangement used for extension PCR is added to the 5 'side of the primer of sequence number 18 and 19.
  • human fibronectin expression vectors Hiroki Akamatsu, Keiko Ichihara-Tanaka, Keiichi Ozono, Wataru Kamiike, Hikaru Matsuda, and Kiyotoshi Sekiguchi, “Suppression of Transformed Phenotypes of Human Fibrosarcoma Cells by Overexpression of Recombinant Fibronectin”, Cancer Research, 56, 4541-4546, 1996) was used as a template, and PCR was performed using the following primers to amplify a region corresponding to FNIII 7 to 10 (Pro 1173 -Arg 1539 ). In addition, the sequence used for extension PCR is added to the 5 ′ side of the primers of SEQ ID NOs: 21 and 22.
  • the three types of DNA fragments obtained were ligated and amplified by extension PCR using the following primers to encode mouse Ig- ⁇ chain V-J2-C signal peptide-FLAG tag-FNIII7-10- ⁇ 1 chain E8 A DNA fragment was obtained.
  • the amplified DNA was digested with restriction enzymes NheI and NotI and inserted into the corresponding site of mammalian cell expression vector pSecTag2B (Invitrogen) to prepare an expression vector for FNIII7-10 fusion human laminin ⁇ 1E8 fragment.
  • each chain expression vector 150 ⁇ g of each chain expression vector was simultaneously transferred to 300 ml of 293-F cells (1.0 ⁇ 10 6 cells / ml) using transfection reagent 293fectin (trade name, Invitrogen) and Opti-MEM (trade name, Invitrogen). After infecting and culturing for 72 hours, the culture solution was collected. The culture solution was centrifuged at 1000 ⁇ g for 10 minutes, and the supernatant was further centrifuged at 15,000 ⁇ g for 30 minutes to remove cells and insoluble matters. 10 ml of Ni-NTA agarose (Qiagen) was added to the culture supernatant and incubated overnight to adsorb the target protein.
  • 293fectin trade name, Invitrogen
  • Opti-MEM trade name, Invitrogen
  • Ni-NTA agarose was recovered, washed with TBS ( ⁇ ) (Tris buffered saline without Ca and Mg) and 10 mM imidazole / TBS ( ⁇ ) and then eluted with 200 mM imidazole / TBS ( ⁇ ).
  • TBS Tris buffered saline without Ca and Mg
  • ⁇ 10 mM imidazole / TBS
  • ⁇ 200 mM imidazole / TBS
  • the amount of protein in the elution fraction was confirmed by the absorbance of A280, 3 ml of ANTI-FLAG M2 affinity Gel (Sigma) was added to the fraction from which the target protein was eluted, and the mixture was swirled at 4 ° C. overnight.
  • the gel was transferred to a polyprep column (Bio-Rad, # 731-1550B04), washed with TBS ( ⁇ ), and eluted with TBS ( ⁇ ) containing 100 ⁇ g / ml FLAG peptide (Sigma, # F3290). The elution fraction was confirmed by silver staining, and the eluted fractions were combined and dialyzed against PBS ( ⁇ ) (phosphate buffered physiological saline). The purified product after dialysis was sterilized by passing through a 0.22 ⁇ m disc syringe filter (Millipore, # SLGV033RS) and stored at ⁇ 80 ° C.
  • PBS phosphate buffered physiological saline
  • Electrophoresis was performed under reducing conditions using a buffer consisting of 25 mM Tris, 192 mM glycine, and 0.1% sodium dodecyl sulfate according to the Laemmli method.
  • Quick-CBB WAKO, # 299-50101 was used for protein staining.
  • Example 2 Comparison of concentration-dependent adhesion efficiency of human iPS cells to various extracellular substrates
  • Human iPS cell The human iPS cell used the strain
  • tic JCRB13311
  • the solution containing the tic cell colony and mouse feeder cells was passed through a BD Falcon cell strainer 100 ⁇ m, and the tic cell colony was separated by washing the strainer.
  • the remaining colonies were recovered with TeSR2 (trade name, STEMCELL TECHNOLOGIES), which is a xenofree medium, finely crushed with a P-1000 pipetman, resuspended in TeSR2, and seeded in an incubator coated with Matrigel.
  • TeSR2 trade name, STEMCELL TECHNOLOGIES
  • the culture medium was changed every day under conditions of 37 ° C. and 5% CO 2 , and expanded culture was performed until 4-5 days. Cells expanded in this way were subjected to experiments.
  • the Matrigel solution was added to the plate in a range of 0.1 to 30 ⁇ g / cm 2 , and the Plus # 1 laminin E8 solution and the Plus # 2 laminin E8 solution were added in the range of 0.0038 to 3.8 ⁇ g / cm 2 .
  • Example 3 Subculture of human iPS cells in an incubator coated with various extracellular substrates (I)]
  • Human iPS cells Human iPS cells are 32R1 (Masato Nakagawa, Nanako Takizawa, Megumi Narita, Tomoko Ichisaka, Shinya Yamanaka, “Promotion of direct reprogramming by transformation-deficient Myc.”, Proceedings of the National Academy of Sciences, 107 ( 32), 14152-14157, 2010).
  • 32R1 cells were maintained on MSTO mouse feeder cells (Kazutoshi Takahashi, Koji Tanabe, Mari Ohnuki, Megumi Narita, Tomoko Ichisaka, Kiichiro Tomoda, Shinya Yamanaka, “Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors.”, Cell, 131 (5), 861-872, 2007).
  • Example 4 Binding activity of Plus # 2 laminin E8 to recombinant human ⁇ 5 ⁇ 1 integrin or ⁇ 6 ⁇ 1 integrin]
  • Experimental method The binding activity of Plus # 2 laminin E8, rhLM511E8 or fibronectin and recombinant human ⁇ 5 ⁇ 1 integrin or ⁇ 6 ⁇ 1 integrin was measured.
  • Fibronectin is prepared according to the method of Sekiguchi et al. (Kiyotoshi Sekiguchi and Sen-itiroh Hakomori, “Domain structure of human plasma fibronectin. Differences and similarities between human and hamster fibronectins.”, The Journal of Biological Chemistry, 258, 3967-3973, 1983).
  • Recombinant human ⁇ 5 ⁇ 1 integrin was prepared using an expression vector prepared by Takagi et al. (Junichi Takagi, Harold P. Erickson, and Timothy A. Springer, “C-terminal opening mimics 'inside-out' activation of integrin alpha5beta1.” , Nature structural & molecular biology, 8 (5), 412-416, 2001). This recombinant human ⁇ 5 ⁇ 1 integrin is composed of an ⁇ 5 subunit and an extracellular domain of the ⁇ 1 subunit.
  • a sequence consisting mainly of an acidic amino acid residue and a hydrophobic amino acid residue is present at the C-terminal part of ⁇ 5, and a base is mainly present at the C-terminal part of ⁇ 1.
  • a sequence consisting of a hydrophobic amino acid residue and a hydrophobic amino acid residue is added.
  • a FLAG tag is added to the C-terminal part of ⁇ 5, and a 6 ⁇ His tag is added to the C-terminal part of ⁇ 1.
  • Recombinant human integrin ⁇ 6 ⁇ 1 is produced by the method of Ido et al.
  • Tris buffered saline containing 1% (w / v) bovine serum albumin and 0.02% (v / v) Tween-20 10 nM recombinant human ⁇ 5 ⁇ 1 or ⁇ 6 ⁇ 1 integrin was reacted at room temperature for 3 hours in the presence of 1 mM Mn 2+ .
  • Tris buffered saline containing 1 mM Mn 2+ , 0.1% (w / v) bovine serum albumin and 0.02% (v / v) Tween-20 hereinafter “1 mM Mn 2+ / 0.
  • the wells were washed three times with 1% BSA / TBS-T 0.02 ), and then a biotinylated rabbit polyclonal antibody that recognizes the dimerization site of the recombinant integrin was incubated at room temperature in the presence of 1 mM Mn 2+. The reaction was performed for 3 hours. The wells were washed three times with 1 mM Mn 2+ /0.1% BSA / TBS-T 0.02 , and then HRP-labeled streptavidin was reacted at room temperature for 15 minutes in the presence of 1 mM Mn 2+ .
  • the wells were washed three times with 1 mM Mn 2+ /0.1% BSA / TBS-T 0.02 , and then an o-phenylenediamine / H 2 O 2 solution was added to perform a color reaction. To stop the reaction, 2.5 MH 2 SO 4 was used. For quantification of the color intensity, the absorbance at a wavelength of 490 nm was measured using a multiplate reader.
  • Example 5 Monodisperse culture of human ES cells in an incubator coated with various extracellular substrates
  • Human ES cell H9 strain purchased from National Stem Cell Bank was used as the human ES cell.
  • As feeder cells SNL cells treated with mitomycin C to stop cell division (McMahon, AP & Bradley, A. Cell 62, 1073-1085 (1990)) were used to repopulate H9 cells on feeder cells. went.
  • a primate ES cell culture medium (ReproCELL) was used as the medium, and co-culture was performed.
  • the X0.5 TrypLE Select added previously was removed, 3 ml / well of maintenance culture medium was added, and then the cells were detached with a cell scraper. (3-4) Cell Culture After removing feeder cells, 13,000 monodispersed H9 cells were seeded on the previously prepared coating plate (6-well plate), and 37 ° C. CO 2 5% Single dispersion culture was performed in an incubator. The next day, the medium was replaced with a maintenance culture medium. The medium was changed every other day, and every day from around the 6th and 7th days after the start of the culture.
  • FIG. 5 shows the results of H9 cell monodisperse culture in an incubator coated with various extracellular substrates, 7 days of culture, and then staining the grown cell colonies with alkaline phosphatase (ALP). It was.
  • Example 6 Subculture of human iPS cells in an incubator coated with various extracellular substrates (II)]
  • Human iPS cells In human iPS cells, 4 genes of Oct3 / 4, KLF4, SOX2, and L-MYC are introduced into adult skin-derived fibroblasts (aHDF-Slc7al) using a retrovirus.
  • 32R1 cells (Masato Nakagawa, Nanako Takizawa, Megumi Narita, Tomoko Ichisaka, Shinya Yamanaka, “Promotion of direct reprogramming by transformation-deficient Myc.”, Proceedings of the National Academy of Sciences, 107 (32), 14152- 14157, 2010).
  • human perlecan expression vectors (Shaoliang Li, Chisei Shimono, Naoko Norioka, Itsuko Nakano, Tetsuo Okubo, Yoshiko Yagi, Maria Hayashi, Yuya Sato, Hitomi Fujisaki, Shunji Hattori, Nobuo Sugiura, Koji Kimata and Kiyotoshi Sekiguchi, “Activin A Binds to Perlecan through Its Pro-region That Has Heparin / Heparan Sulfate Binding Activity ”, Journal of Biological Chemistry, 285 (47), 36645-36655, 2010), and PCR using the following primers and Pln-D1 A region corresponding to / 2/3 (Gly 25 -Glu 1680 ) was amplified.
  • a restriction enzyme HindIII recognition sequence is added to the 5 ′ side of the primer.
  • the obtained DNA fragment was digested with the restriction enzyme HindIII and inserted into the site of the human laminin ⁇ 1 chain E8 fragment expression vector to prepare a Pln-D1 / 2/3 fusion human laminin ⁇ 1 chain E8 fragment expression vector.
  • (xiv) Primer for amplification of Pln-D1 / 2/3 sequence 5′-ACGAAGCTTGGGCTGAGGGCATACGATGGC-3 ′ (forward, SEQ ID NO: 23) 5'-ATAAAGCTTCTCGACCACCAGTGGGGCTTGG-3 '(reverse, SEQ ID NO: 24)
  • FIG. 6 shows the state of human iPS cells before passage on the seventh day from the start of culture. 6, Matrigel coat (Matrigel (coating amount: 30 ⁇ g / cm 2 )), rhLM511E8 coat (E8 in the figure), Plus # 1 laminin E8 coat (E8plus # 1 in the figure), lower stage From the left, Plus # 2 laminin E8 coat (E8plus # 2 in the figure) and Plus # 3 laminin E8 coat (E8plus # 3 in the figure). In an incubator coated with various extracellular substrates, engraftment of 32R1 cells was confirmed.
  • Matrigel coat Matrigel (coating amount: 30 ⁇ g / cm 2 )
  • rhLM511E8 coat E8 in the figure
  • Plus # 1 laminin E8 coat E8plus # 1 in the figure
  • lower stage From the left Plus # 2 laminin E8 coat (E8plus # 2 in the figure)
  • Plus # 3 laminin E8 coat E8plus #
  • FIG. 7 shows the results of immunostaining in human iPS cells that had been subcultured for 10 passages using an incubator coated with Plus # 1 laminin E8 or Plus # 2 laminin E8.
  • the upper two rows are results using an incubator coated with Plus # 1 laminin E8 (LN511E8plus # 1 in the drawing), and the lower two rows are Plus # 2 laminin E8 (LN511E8plus # 2 in the drawing). It is the result using the incubator coated with.
  • Each upper phase difference image (PH) is shown, and the lower row is an immunofluorescence image (FL).
  • Example 7 Monodisperse culture of human iPS cells in an incubator coated with various extracellular substrates
  • Human iPS cells The same 32R1 cells as in Examples 3 and 6 were used.
  • Extracellular matrix In the same manner as in Example 5, Plus # 1 laminin E8, Plus # 2 laminin E8, full-length laminin 511 and Matrigel were used.
  • Example 3 Culture of human iPS cells The plate was coated in the same manner as in Example 3. In the same manner as in Example 6, the feeder cells were removed, and 13,000 32R1 cells dispersed in a single manner were seeded on a previously prepared coating plate (6-well plate), and single in a 37 ° C. CO 2 5% incubator. Dispersion culture was performed. The next day, the medium was replaced with a maintenance culture medium. The medium was changed every other day, and every day from around the 6th and 7th days after the start of the culture.
  • FIG. 8 shows the results of performing single dispersion culture of 32R1 cells in an incubator coated with various extracellular substrates, culturing for 7 days, and then staining the grown cell colonies with alkaline phosphatase (ALP). It was.
  • no coat from the left on the upper stage (None in the figure), Matrigel coat (Matrigel in the figure), full length laminin 511 coat (LN511FL in the figure), Plus # 1 laminin E8 coat from the left in the lower stage (LN511E8plus in the figure) # 1) Plus # 2 laminin E8 coat (LN511E8 plus # 2 in the figure).
  • Example 8 Establishment of human iPS cells
  • Human iPS cells were used using an incubator coated with Plus # 1 laminin E8 or Plus # 2 laminin E8, instead of using human iPS cell lines established in advance as in Examples 6 and 7 above. Tried to establish. The coating concentration was 0.5 ⁇ g / cm 2 .
  • adult skin-derived fibroblasts HDF1388 cells
  • HDF1388 cells are episomal according to the method described in US provisional application 61 / 521,153.
  • the reprogramming gene was introduced using plasmid vectors pCEB-hSK-O and pCEB-hUL-G, and cultured in a maintenance culture medium (mTeSR1 (StemCell Technologies) and NutriStem (Cosmo Bio) 1: 1 mixed solution). went. The number of human iPS cell colonies was counted 30 days after the introduction of the reprogramming gene.
  • pCEB-hSK-O episomal plasmid is an expression in which human SOX2 and human KLF4 translation regions are linked via a 2A sequence and human OCT3 / 4 translation regions are placed under the control of separate CAG promoters.
  • a plasmid having a cassette see FIG. 10I.
  • the human L-MYC and human LIN28 translation regions were joined via a 2A sequence, and the human GLISI translation region was placed under the control of separate CAG promoters. It is a plasmid having an expression cassette (see FIG. 10 (II)).
  • episomal plasmids include plasmids described in Okita et al., “A more efficient method to generate integration-free human iPS cells”, Nature Methods, 8 (5), 409 (2011) and International Publication WO2011 / 016588. It was produced using.

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Abstract

　ラミニン、または、ヘテロ３量体を形成しているラミニンフラグメントのα鎖のＮ末端、α鎖のＣ末端、β鎖のＮ末端およびγ鎖のＮ末端の少なくとも１箇所に細胞増殖制御分子が結合していることを特徴とする改変ラミニン、当該改変ラミニンの存在下で細胞を培養する培養方法、当該改変ラミニンの存在下でｉＰＳ細胞を樹立する方法、および当該改変ラミニンをコーティングした培養基材を提供する。本発明の改変ラミニン用いて、ゼノフリー環境下でヒト幹細胞を培養することにより、再生医療への応用が可能な安全性の高いヒト幹細胞を提供することができる。

Description

改変ラミニンおよびその利用
　本発明は、改変ヒトラミニンおよびその利用に関するものであり、詳細には、ラミニンまたはそのフラグメントに細胞増殖制御分子が結合した改変ヒトラミニン、当該改変ヒトラミニンを用いる細胞培養方法およびｉＰＳ細胞の樹立方法、並びに当該改変ヒトラミニンをコーティングした培養基材に関するものである。
　幹細胞、特にＥＳ細胞やｉＰＳ細胞などの多能性幹細胞は、その再生医療への応用が世界的に注目されている。しかし、多分化能を保持したまま幹細胞を培養、維持するためには、通常、細胞は、フィーダー細胞として、放射線や抗生物質で処理して細胞分裂を停止させたマウス胎仔由来の線維芽細胞（ＭＥＦ）の共存下で培養される。ＭＥＦとしては、通常ＳＴＯ細胞等がよく使われるが、ｉＰＳ細胞の誘導には、ＳＮＬ細胞（McMahon, A. P. & Bradley, A. Cell 62, 1073-1085 (1990)）等がよく使われている。しかしながら、幹細胞を臨床応用する段階では、これらフィーダー細胞の使用が大きな制約となっている。この問題を解決するために、これまでにフィーダー細胞に代えて様々な細胞接着分子が幹細胞の細胞外基質として試みられており、中でも基底膜成分を過剰産生するマウスＥＨＳ腫瘍から調製した粗抽出物（マトリゲルという商品名で市販されている）が、最も多分化能維持の活性が高いと報告されている。しかし、マトリゲルはラミニン、ＩＶ型コラーゲン等の基底膜成分を豊富に含むことが知られているものの、その組成は完全には解明されておらず、またマウス由来であるため、再生医療でのヒト幹細胞の培養に適したものではない。
　ヒト幹細胞を再生医療に応用するためには、フィーダー細胞を使用しないフィーダーフリー条件と、培養系から異種由来の成分を排除するゼノフリー（Ｘｅｎｏ－Ｆｒｅｅ）条件を満たす培養環境が望ましい。そこで、ヒト由来の細胞外基質として、ヒトビトロネクチンやヒトフィブロネクチンの使用が試みられているが、これらはマトリゲルに比べてヒト幹細胞の未分化維持効果や接着効率が劣り、品質、材料源確保、安全性等の面で問題が生じる。このように、再生医療に応用するためのヒト幹細胞の維持培養に適した細胞外基質の開発は進んでいないのが現状であり、化学的組成が均一なヒト由来の細胞外基質を用いる新たなヒト幹細胞培養技術の開発が強く求められている。
　ラミニンは基底膜の主要な細胞接着分子であり、α鎖、β鎖およびγ鎖の３本のサブユニット鎖からなるヘテロ３量体で、分子量８０万Ｄａの巨大な糖タンパク質である。３本のサブユニット鎖がＣ末端側で会合してコイルドコイル構造を作りジスルフィド結合によって安定化したヘテロ３量体分子を形成している。本発明者らは、ヒトラミニン（特に、α３β３γ２からなるラミニン３３２およびα５β１γ１からなるラミニン５１１）の組換えタンパク質が、ヒトＥＳ細胞の多分化能維持に有効であることを報告している（非特許文献１参照）。しかし、ヒト幹細胞の表面にはラミニン受容体以外の接着受容体（細胞表面にあって細胞外基質への細胞の接着を媒介する膜結合分子）も発現しており、ラミニン分子単独ではこれらの接着受容体を有効活用できない。そこで、より天然に近い接着活性を有し、フィーダーフリー条件下でヒト幹細胞を培養可能な新たなヒト由来の細胞外基質の開発が切望されている。
Miyazaki T, Futaki S, Hasegawa K, Kawasaki M, Sanzen N, Hayashi M, Kawase E, Sekiguchi K, Nakatsuji N, Suemori H. Recombinant human laminin isoforms can support the undifferentiated growth of human embryonic stem cells. Biochem. Biophys. Res. Commun. 375:27-35, 2008.
　本発明は、フィーダーフリーの培養環境で、多分化能を保持したまま幹細胞を維持培養可能な培養基材、当該培養基材を用いる細胞培養方法およびｉＰＳ細胞樹立方法、並びに当該細胞外基質がコーティングされた培養基材を提供することを課題とする。
　本発明は、上記課題を解決するために、以下の発明を包含する。
［１］ラミニン、または、ヘテロ３量体を形成しているラミニンフラグメントのα鎖のＮ末端、α鎖のＣ末端、β鎖のＮ末端およびγ鎖のＮ末端の少なくとも１箇所に細胞増殖制御分子が結合していることを特徴とする改変ラミニン。
［２］細胞増殖制御分子が、細胞接着分子である前記［１］に記載の改変ラミニン。
［３］細胞増殖制御分子が、増殖因子結合分子である前記［１］に記載の改変ラミニン。
［４］ラミニンフラグメントが、インテグリン結合活性を有していることを特徴とする前記［１］～［３］のいずれかに記載の改変ラミニン。
［５］ラミニンフラグメントが、ラミニンＥ８フラグメントである前記［４］に記載の改変ラミニン。
［６］ラミニンが、α１～α５から選択される１種のα鎖、β１～β３から選択される１種のβ鎖、γ１～γ３から選択される１種のγ鎖からなることを特徴とする前記［１］～［５］のいずれかに記載の改変ラミニン。
［７］ラミニンが、ラミニンα５β１γ１またはラミニンα３β３γ２である前記［６］に記載の改変ラミニン。
［８］細胞接着分子が、以下の（ａ）～（ｅ）から選択される少なくとも１種以上であることを特徴とする前記［２］に記載の改変ヒトラミニン。
（ａ）インテグリンと結合する細胞接着分子
（ｂ）膜結合型プロテオグリカンと結合する細胞接着分子
（ｃ）ジスコイジンドメイン受容体と結合する細胞接着分子
（ｄ）ジストログリカンと結合する細胞接着分子
（ｅ）細胞表面の糖鎖と結合する細胞接着分子
［９］細胞接着分子が、以下の（ａ）～（ｋ）から選択される少なくとも１種以上であることを特徴とする前記［２］に記載の改変ヒトラミニン。
（ａ）フィブロネクチンまたはその細胞接着活性部位を含むフラグメント
（ｂ）コラーゲンまたはその細胞接着活性部位を含むフラグメント
（ｃ）ビトロネクチンまたはその細胞接着活性部位を含むフラグメント
（ｄ）ネフロネクチンまたはその細胞接着活性部位を含むフラグメント
（ｅ）オステオポンティンまたはその細胞接着活性部位を含むフラグメント
（ｆ）ＭＡＥＧまたはその細胞接着活性部位を含むフラグメント
（ｇ）テネイシンまたはその細胞接着活性部位を含むフラグメント
（ｈ）ＳＶＥＰ１またはその細胞接着活性部位を含むフラグメント
（ｉ）ＴＧＦ－β１ ｌａｔｅｎｃｙ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｐｅｐｔｉｄｅまたはその細胞接着活性部位を含むフラグメント
（ｊ）ＴＧＦ－β３ ｌａｔｅｎｃｙ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｐｅｐｔｉｄｅまたはその細胞接着活性部位を含むフラグメント
（ｋ）ラミニンα鎖の球状ドメイン４および／または５
ラミニンα鎖の球状ドメイン４および／または５
［１０］増殖因子結合分子が、以下の（ａ）～（ｆ）から選択される少なくとも１種以上であることを特徴とする前記［３］に記載の改変ヒトラミニン。
（ａ）パールカンまたはその増殖因子結合部位を含むフラグメント
（ｂ）アグリンまたはその増殖因子結合部位を含むフラグメント
（ｃ）ＸＶＩＩＩ型コラーゲンまたはその増殖因子結合部位を含むフラグメント
（ｄ）シンデカンまたはその増殖因子結合部位を含むフラグメント
（ｅ）グリピカンまたはその増殖因子結合部位を含むフラグメント
（ｆ）ｌａｔｅｎｔ ＴＧＦ－βｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎまたはその増殖因子結合部位を含むフラグメント
［１１］ヒト由来である前記［１］～［１０］のいずれかに記載の改変ラミニン。
［１２］哺乳動物細胞の培養方法であって、前記［１］～［１１］のいずれかに記載の改変ヒトラミニンの存在下で培養することを特徴とする培養方法。
［１３］哺乳動物細胞が、ＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞または体性幹細胞である前記［１２］に記載の培養方法。
［１４］フィーダー細胞を用いないことを特徴とする前記［１２］または［１３］に記載の培養方法。
［１５］前記［１］～［１１］のいずれかに記載の改変ヒトラミニンがコーティングされていることを特徴とする培養基材。
［１６］改変ヒトラミニンが０．０３～２５μｇ／ｃｍ２の濃度でコーティングされていることを特徴とする前記［１５］に記載の培養基材。
［１７］前記［１］～［１１］のいずれかに記載の改変ラミニンの存在下で、核初期化物質を体細胞に接触させる工程を含むことを特徴とするｉＰＳ細胞の樹立方法。
［１８］前記核初期化物質は、Ｏｃｔファミリー、Ｓｏｘファミリー、Ｋｌｆファミリー、ＬｉｎファミリーおよびＧｌｉｓファミリー並びにそれらをコードする核酸からなる群より選択される１種類以上の物質を含むことを特徴とする前記［１７］に記載のｉＰＳ細胞の樹立方法。
　本発明によれば、フィーダーフリーの培養環境で、多分化能を保持したまま幹細胞を維持培養可能な細胞外基質としての改変ヒトラミニン、当該改変ヒトラミニンを用いる細胞培養方法およびｉＰＳ細胞樹立方法、並びに当該改変ヒトラミニンがコーティングされた培養基材を提供することができる。ヒト由来の改変ヒトラミニンを用いて、ゼノフリーの培地でｉＰＳ細胞を樹立することやヒト幹細胞を培養することにより、再生医療への応用が可能な安全性の高いヒト幹細胞を提供することができる。
ヒトラミニンα５β１γ１のＥ８フラグメントとヒトラミニンα１鎖球状ドメイン４－５番目を融合させた改変ヒトラミニン（以下「Ｐｌｕｓ＃１ラミニンＥ８」と記す）とヒトラミニンα５β１γ１のＥ８フラグメントとヒトフィブロネクチンの細胞接着部位を融合させた改変ヒトラミニン（以下、「Ｐｌｕｓ＃２ラミニンＥ８」と記す）のＳＤＳ－ＰＡＧＥ解析の結果を示す図である。 ヒトｉＰＳ細胞のＰｌｕｓ＃１ラミニンＥ８、Ｐｌｕｓ＃２ラミニンＥ８またはマトリゲルへの濃度依存的接着効率を比較した結果を示す図である。 Ｐｌｕｓ＃１ラミニンＥ８、Ｐｌｕｓ＃２ラミニンＥ８またはマトリゲルをコーティングした培養基材を用いてヒトｉＰＳ細胞を１代または３代継代培養した結果を示す図である。 Ｐｌｕｓ＃２ラミニンＥ８の組換えヒトα５β１インテグリンまたは組換えヒトα６β１インテグリンに対する結合活性を確認した結果を示す図である。 Ｐｌｕｓ＃１ラミニンＥ８、Ｐｌｕｓ＃２ラミニンＥ８、全長ラミニン５１１またはマトリゲルをコーティングした培養基材を用いてヒトＥＳ細胞を単一分散培養した結果を示す図である。 Ｐｌｕｓ＃１ラミニンＥ８、Ｐｌｕｓ＃２ラミニンＥ８、ヒトラミニンα５β１γ１のＥ８フラグメントとヒトパールカンのドメインＩ～IIIを融合させた改変ヒトラミニン（以下「Ｐｌｕｓ＃３ラミニンＥ８」と記す）またはヒトラミニンα５β１γ１のＥ８フラグメント、またはマトリゲルをコーティングした培養基材を用いてヒトｉＰＳ細胞を７日間培養し、生着を確認した結果を示す図である。 Ｐｌｕｓ＃１ラミニンＥ８またはＰｌｕｓ＃２ラミニンＥ８をコーティングした培養基材を用いてヒトｉＰＳ細胞を１０代継代培養し、未分化マーカーのＯｃt３／４、ＳＳＥＡ－４およびＴＲＡ－１－６０を免疫染色した結果を示す図である。 Ｐｌｕｓ＃１ラミニンＥ８、Ｐｌｕｓ＃２ラミニンＥ８、全長ラミニン５１１またはマトリゲルをコーティングした培養基材を用いてヒトｉＰＳ細胞を単一分散培養した結果を示す図である。 ノンコートディッシュ、Ｐｌｕｓ＃１ラミニンＥ８コートディッシュおよびＰｌｕｓ＃２ラミニンＥ８コートディッシュを用いて、成人皮膚由来線維芽細胞からヒトｉＰＳ細胞の樹立を検討した結果を示す図である。 エピソーマルプラスミドベクターの構造を示す図であり、（Ｉ）はｐＣＥＢ－ｈＳＫ－Ｏ、（ＩＩ）はｐＣＥＢ－ｈＵＬ－Ｇである。
〔改変ヒトラミニン〕
　本発明は、ラミニン、または、ヘテロ３量体を形成しているラミニンフラグメントのα鎖のＮ末端、α鎖のＣ末端、β鎖のＮ末端およびγ鎖のＮ末端の少なくとも１箇所に細胞増殖制御分子が結合していることを特徴とする改変ラミニンを提供する。
　ラミニンは、α鎖、β鎖およびγ鎖の３本のサブユニット鎖からなるヘテロ３量体分子である。α鎖はα１～α５の５種類、β鎖はβ１～β３の３種類、γ鎖はγ１～γ３の３種類が知られており、それらの組み合わせで少なくとも１２種類以上のアイソフォームが存在する（表１参照）。本発明の改変ラミニンを構成するラミニンは、いずれのアイソフォームであってもよい。すなわち、本発明の改変ラミニンを構成するラミニンは、α１～α５から選択される１種のα鎖、β１～β３から選択される１種のβ鎖、γ１～γ３から選択される１種のγ鎖からなるものであればよい。具体的には、表１に記載の１２種類、およびこれら以外のすべてのアイソフォームを好適に用いることができる。好ましくはラミニンα３β３γ２、ラミニンα５β１γ１である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　ラミニンの由来は特に限定されず、各種生物由来のラミニンを用いることができる。好ましくは哺乳動物由来のラミニンである。哺乳動物としては、例えば、ヒト、マウス、ラット、ウシ、ブタ等が挙げられるが、限定されない。なかでもヒト由来のラミニンを用いることが特に好ましい。ヒトの再生医療の材料を得るためにヒト幹細胞を培養する場合には、培養系から異種由来の成分を排除するゼノフリー条件を満たす培養環境が求められることから、ヒト由来のラミニンを用いることが好ましい。
　本発明の改変ラミニンを構成するラミニンは全長であってもよく、そのフラグメントであってもよい。すなわち、全長α鎖、全長β鎖および全長γ鎖からなる全長ラミニンであってもよく、α鎖、β鎖およびγ鎖の少なくとも１つ以上が全長より短いフラグメントからなるラミニンフラグメントであってもよい。ただし、ラミニンフラグメントはヘテロ３量体を形成していることを要する。また、ラミニンフラグメントはインテグリン結合活性を有していることが好ましい。ラミニンフラグメントがヘテロ３量体を形成していることは、ラミニンフラグメントをＳＤＳ－ＰＡＧＥに供し、バンドの数を検出すること等により確認できる（実施例１参照）。ラミニンフラグメントがインテグリン結合活性を有していることは、ＥＬＩＳＡ法等により確認することができる（実施例４参照）。
　本発明の改変ラミニンを構成するラミニンフラグメントは、α鎖、β鎖およびγ鎖からなるヘテロ３量体を形成しているものであればよく、分子量等は特に限定されない。インテグリン結合活性の強さ、組換えタンパク質としての発現効率（全長ラミニンと比較して、組換えタンパク質として高収量で製造できること）の観点から、ラミニンのＥ８フラグメントが好ましい。ラミニンのＥ８フラグメントは、マウスラミニンα１β１γ１（以下「マウスラミニン１１１」と記す）をエラスターゼで消化して得られたフラグメントの中で、強い細胞接着活性をもつフラグメントとして同定されたものである（Edgar D., Timpl R., Thoenen H.The heparin-binding domain of laminin is responsible for its effects on neurite outgrowth and neuronal survival. EMBO J., 3:1463-1468, 1984.、Goodman SL., Deutzmann R., von der Mark K.Two distinct cell-binding domains in laminin can independently promote nonneuronal cell adhesion and spreading. J. Cell Biol., 105:589-598, 1987.）。マウスラミニン１１１以外のラミニンについてもエラスターゼで消化した際にマウスラミニン１１１のＥ８フラグメントに相当するフラグメントの存在が推定されるが、マウスラミニン１１１以外のラミニンをエラスターゼで消化してＥ８フラグメントを分離・同定したことは報告されていない。したがって、本発明に用いられるラミニンＥ８は、ラミニンのエラスターゼ消化産物であることを要するものではなく、マウスラミニン１１１のＥ８と同様の細胞接着活性を有し、同様の構造を有し、同程度の分子量を有するラミニンのフラグメントであればよい。
　ラミニンは天然型であってもよく、その生物学的活性を維持したまま１またはそれ以上のアミノ酸残基が修飾された修飾型であってもよい。ラミニンの製造方法は特に限定されず、例えば、ラミニン高発現細胞から精製する方法や、組換えタンパク質として製造する方法などが挙げられる。ラミニンフラグメントの製造方法も特に限定されず、例えば、全長ラミニンをエラスターゼ等のタンパク質分解酵素で消化し、目的のフラグメントを分取、精製する方法や、組換えタンパク質として製造する方法などが挙げられる。製造量、品質の均一性、製造コスト等の観点から、ラミニンおよびラミニンフラグメントの両者とも、組換えタンパク質として製造することが好ましい。
　組換えラミニン、組換えラミニンフラグメントは、公知の遺伝子組換え技術を適宜用いることにより製造することができる。組換えラミニン、組換えラミニンフラグメントの製造方法としては、例えば、α鎖、β鎖およびγ鎖の各全長タンパク質または部分タンパク質をコードするＤＮＡをそれぞれ取得し、これをそれぞれ発現ベクターに挿入し、得られた３種類の発現ベクターを適切な宿主細胞に共導入して発現させ、３量体を形成しているタンパク質を公知の方法で精製することにより製造することができる。組換えラミニン（全長）の製造方法としては、例えばＩｄｏら（Hiroyuki Ido, Kenji Harada, Sugiko Futaki, Yoshitaka Hayashi, Ryoko Nishiuchi, Yuko Natsuka, Shaoliang Li, Yoshinao Wada,Ariana C. Combs, James M. Ervasti, and Kiyotoshi Sekiguchi, “Molecular dissection of the α-dystroglycan- and integrin-binding sites within the globular domain of human laminin-10” The Journal of Biological Chemistry, 279, 10946-10954, 2004.）などが挙げられるが、これに限定されるものではない。組換えラミニンフラグメント（ヒトラミニンＥ８）の製造方法としては、Ｉｄｏら（Hiroyuki Ido, Aya Nakamura, Reiko Kobayashi, Shunsuke Ito, Shaoliang Li, Sugiko Futaki, and Kiyotoshi Sekiguchi, “The requirement of the glutamic acid residue at the third position from the carboxyl termini of the laminin γ chains in integrin binding by laminins” The Journal of Biological Chemistry, 282, 11144-11154, 2007.）の方法が挙げられるが、これに限定されるものではない。
　主要な哺乳類のラミニンを構成するα鎖、β鎖、γ鎖をコードする遺伝子の塩基配列情報および各鎖のアミノ酸配列情報は、公知のデータベース（ＧｅｎＢａｎｋ等）から取得することができる。表１に、ヒトを含む主な哺乳類について、ラミニンを構成する各鎖のアクセッション番号を示す。これら以外の各種哺乳動物のラミニン構成鎖の塩基配列情報およびアミノ酸配列情報も同様に公知のデータベース（ＧｅｎＢａｎｋ等）から取得することができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　ラミニンＥ８は、α鎖のＣ末端フラグメントから球状ドメイン４および５が除かれたフラグメント（以下「α鎖Ｅ８」と記す）、β鎖のＣ末端フラグメント（以下「β鎖Ｅ８」と記す）およびγ鎖のＣ末端フラグメント（以下「γ鎖Ｅ８」と記す）が３量体を形成したフラグメントであり、３量体の分子量は約１５０～約１７０ｋＤａである。α鎖Ｅ８は通常約７７０個のアミノ酸からなり、Ｎ末端側の約２３０アミノ酸が３量体形成に関わる。β鎖Ｅ８は通常約２２０～約２３０個のアミノ酸からなる。γ鎖Ｅ８は通常約２４０～約２５０個のアミノ酸からなる。γ鎖Ｅ８のＣ末端部から３番目のグルタミン酸残基はラミニンＥ８の細胞接着活性に必須である（Hiroyuki Ido, Aya Nakamura, Reiko Kobayashi, Shunsuke Ito, Shaoliang Li, Sugiko Futaki, and Kiyotoshi Sekiguchi, “The requirement of the glutamic acid residue at the third position from the carboxyl termini of the laminin γ chains in integrin binding by laminins” The Journal of Biological Chemistry, 282, 11144-11154, 2007.）。
　本発明の改変ラミニンを構成する細胞増殖制御分子は、細胞の培養および増幅に必要な細胞外因子を意味し、具体的には、（ｉ）細胞表面の受容体と結合し、細胞の足場を提供する細胞外基質の細胞接着分子、あるいは（ｉｉ）増殖因子と結合することにより、増殖因子の局在制御や活性制御に係る分子（本明細書において「増殖因子結合分子」と称する）がそれに該当する。増殖因子結合分子の結合対象である増殖因子は、成長因子と同義であり、細胞の増殖、成長、分化等を促進する物質であれば特に限定されない。例えば、ＥＧＦ（Epidermal growth factor）、ｂＦＧＦ（basic fibroblast growth factor）、ＴＧＦ（Transforming growth factor）、ＩＧＦ（Insulin-like growth factor）、ＰＤＧＦ（Platelet-derived growth factor）、ＶＥＧＦ（Vesicular endothelial growth factor）、ＨＧＦ（Hepatocyte growth factor）、ＮＧＦ（Nerve growth factor）などが挙げられる。
　本発明の改変ラミニンを構成する細胞接着分子は、細胞と細胞外基質との接着に関与する分子、および、細胞同士の接着に関与する分子のいずれであってもよく、細胞膜に存在する膜タンパク質のみならず、細胞外基質をも含み、特にこれらは限定されない。また、本発明の改変ラミニンを構成する細胞接着分子は、細胞接着分子の全長であってもよく、細胞接着分子の細胞接着部位を含むフラグメントであってもよい。接着分子としては、以下の（ａ）～（ｅ）が挙げられ、これらのなかから選択される少なくとも１種以上であることが好ましい。
（ａ）インテグリンと結合する細胞接着分子
（ｂ）膜結合型プロテオグリカンと結合する細胞接着分子
（ｃ）ジスコイジンドメイン受容体と結合する細胞接着分子
（ｄ）ジストログリカンと結合する細胞接着分子
（ｅ）細胞表面の糖鎖と結合する細胞接着分子
　インテグリンと結合する細胞接着分子としては、例えば、フィブロネクチン、コラーゲン、ビトロネクチン、ネフロネクチン、オステオポンティン、ＭＡＥＧ、テネイシン、ＳＶＥＰ１、ＴＧＦ－β１ ｌａｔｅｎｃｙ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｐｅｐｔｉｄｅ、ＴＧＦ－β３ ｌａｔｅｎｃｙ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｐｅｐｔｉｄｅなどが挙げられる。膜結合型プロテオグリカンと結合する細胞接着分子としては、例えば、フィブロネクチン、ビトロネクチン、ネフロネクチン、ラミニンなどが挙げられる。ジストログリカンと結合する細胞接着分子としては、例えば、ラミニンなどが挙げられる。細胞表面の糖鎖と結合する細胞接着分子としては、Ｃｏｎｃａｎａｖａｌｉｎ Ａ、Ｄｏｌｉｃｈｏｓ ｂｉｆｌｏｒｕｓ ａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ、Ａｒａｃｈｉｓ ｈｙｐｏｇａｅａ ａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ、Ｒｉｃｉｎｕｓ ｃｏｍｍｕｎｉｓ ａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ、Ｗｈｅａｔ ｇｅｒｍ ａｇｇｌｕｔｉｎｉｎなどが挙げられる。ただし、これらに限定されるものではない。
　本発明の改変ラミニンを構成する好適な細胞接着分子としては、例えば、フィブロネクチン、ビトロネクチン、ネフロネクチン、オステオポンティン、ＭＡＥＧ、ＴＧＦ－β１ ｌａｔｅｎｃｙ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｐｅｐｔｉｄｅ、ＴＧＦ－β３ ｌａｔｅｎｃｙ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｐｅｐｔｉｄｅ、テネイシン等のＡｒｇ－Ｇｌｙ－Ａｓｐ配列を分子内に含むタンパク質、Ｉ型コラーゲン、ＩＶ型コラーゲン、その他のコラーゲン分子、ＳＶＥＰ１、Ｅ－カドヘリン、Ｎ－カドヘリン、Ｐ－カドヘリンなど、カドヘリンファミリーの細胞間接着分子が挙げられる。また、細胞接着分子の細胞接着活性部位を含むフラグメントとしては、例えば、ヒトフィブロネクチンのIII型モジュールの７番目～１０番目を含むフラグメント（Fusao Kimizuka, Yoichi Ohdate, Yasutoshi Kawase, Tomoko Shimojyo, Yuki Taguchi, Kimikazu Hashino, Shoichi Goto, Hidetaka Hashi, Ikunoshin Kato, Kiyotoshi Sekiguchi, and Koiti Titani, “Role of type III homology repeats in cell adhesive function within the cell-binding domain of fibronectin” The Journal of Biological Chemistry, 266, 3045-3051, 1999.）、フィブロネクチンのIII型モジュールの１２番目～１４番目を含むフラグメント（Ri-ichiroh Manabe, Naoko Oh-e, Toshinaga Maeda, Tomohiko Fukuda, and Kiyotoshi Sekiguchi, “Modulation of cell adhesive activity of fibronectin by the alternatively spliced EDA segment” The Journal of Cell Biology, 139, 295-307, 1997.）、ネフロネクチンの分子中央部のリンカー領域（Yuya Sato, Toshihiko Uemura, Keisuke Morimitsu, Ryoko Sato-Nishiuchi, Ri-ichiroh Manabe, Junichi Takagi, Masashi Yamada, and Kiyotoshi Sekiguchi, “Molecular basis of the recognition of nephronectin by integrin alpha8beta1” The Journal of Biological Chemistry, 284, 14524-14536, 2009.）などが挙げられる。さらに、ヒトラミニンα鎖の球状ドメイン４および／または５も本発明の改変ヒトラミニンを構成する細胞接着分子として好適に用いることができる。
　細胞接着分子の製造方法は特に限定されず、例えば、目的の細胞接着分子を発現している細胞から精製する方法や、組換えタンパク質として製造する方法などが挙げられる。組換えタンパク質は、公知の遺伝子組換え技術を適宜用いることにより製造することができる。なお、ヒトのフィブロネクチン、ビトロネクチン、ネフロネクチン、オステオポンティン、ＭＡＥＧ、ＴＧＦ－β１、ＴＧＦ－β３、テネイシン、Ｉ型コラーゲン、ＩＶ型コラーゲン、ＳＶＥＰ１、Ｅ－カドヘリン、Ｎ－カドヘリン、Ｐ－カドヘリンをそれぞれコードする遺伝子の塩基配列情報およびアミノ酸配列情報は、それぞれ表３に記載したアクセッション番号で公知のデータベース（ＧｅｎＢａｎｋ等）から取得することができる。ヒト以外の生物由来の細胞接着分子の遺伝子の塩基配列情報およびアミノ酸配列情報も同様に公知のデータベース（ＧｅｎＢａｎｋ等）から取得することができる。一例として、細胞表面の糖鎖と結合する細胞接着分子の中でヒト以外の生物由来のレクチンの遺伝子の塩基配列情報およびアミノ酸配列情報を、それぞれ表４に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　本発明の改変ラミニンを構成する増殖因子結合分子は、培養細胞の増殖に関与する増殖因子と結合可能な分子であればよく、特に限定されない。増殖因子結合分子をキメラ化することにより、増殖因子を基質面に捕捉し、より効率的に（より生理的に）増殖因子を細胞に対して作用させ、増殖を刺激することが可能となる。本発明の改変ラミニンを構成する増殖因子結合分子は、増殖因子結合分子の全長であってもよく、増殖因子結合部位を含むフラグメントであってもよい。増殖因子結合分子としては、例えば、ヘパラン硫酸プロテオグリカンを挙げることができる。ヘパラン硫酸プロテオグリカンとしては、例えば、パールカン、アグリン、ＸＶＩＩＩ型コラーゲン、シンデカン１～４、グリピカン１～６などが挙げられる。また、ヘパラン硫酸プロテオグリカン以外の増殖因子結合分子としては、例えば、ｌａｔｅｎｔ ＴＧＦ－β ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ１～４などが挙げられる。増殖因子結合分子の増殖因子結合部位を含むフラグメントとしては、例えば、パールカンのドメインＩ～III（Ｎ末端から２２番目のバリンから１６７６番目のプロリンまでの領域；アミノ酸配列情報は表５に記載）、アグリンのフォリスタチン（ＦＳ）ドメインの１番目から８番目までを含む領域（Uwe Winzen, Gregory J. Cole, and Willi Halfter, “Agrin is a chimeric proteoglycan with the attachment sites for heparan sulfate/chondroitin sulfate located in two multiple serine-glycine clusters” The Journal of Biological Chemistry, 27j8, 30106-30114, 2008.）などが挙げられる。
　増殖因子結合分子の製造方法は特に限定されず、例えば、目的の増殖因子結合分子を発現している細胞から精製する方法や、組換えタンパク質として製造する方法などが挙げられる。組換えタンパク質は、公知の遺伝子組換え技術を適宜用いることにより製造することができる。なお、ヒトのパールカン、アグリン、ＸＶＩＩＩ型コラーゲン、シンデカン１～４、グリピカン１～６、ｌａｔｅｎｔ ＴＧＦ－β ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ１～４をそれぞれコードする遺伝子の塩基配列情報およびアミノ酸配列情報は、それぞれ表５に記載したアクセッション番号で公知のデータベース（ＧｅｎＢａｎｋ等）から取得することができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
　本発明の改変ラミニンは、上記の細胞増殖制御分子（例えば、細胞接着分子、増殖因子結合分子等）がラミニンまたはヘテロ３量体を形成しているラミニンフラグメントのα鎖のＮ末端、α鎖のＣ末端、β鎖のＮ末端およびγ鎖のＮ末端の少なくとも１箇所に結合していればよい。したがって、本発明の改変ラミニンは、細胞増殖制御分子が２箇所に結合していてもよく、３箇所に結合していてもよく、４箇所に結合していてもよい。細胞増殖制御分子が複数箇所に結合する場合、細胞増殖制御分子は１種でもよく、２種以上でもよい。細胞増殖制御分子は上記４箇所であればどこに結合してもよいが、α鎖のＣ末端には、ラミニンα鎖の球状ドメイン４および／または５が結合することが好ましい。
　本発明の改変ラミニンは、公知の遺伝子組換え技術を適宜用いることにより、組換え改変ラミニンとして製造することができる。例えば、ヒトラミニンＥ８のα鎖のＮ末端に細胞増殖制御分子を結合した改変ラミニンを作製する場合には、ヒトラミニンのα鎖Ｅ８をコードするＤＮＡと細胞増殖制御分子をコードするＤＮＡを連結し、ヒトラミニンＥ８のα鎖のＮ末端に細胞増殖制御分子を結合した融合タンパク質をコードする融合遺伝子を挿入した発現ベクターを作製する。これとヒトラミニンのβ鎖Ｅ８発現ベクターおよびγ鎖Ｅ８発現ベクターの３種類の発現ベクターを適切な宿主細胞に共導入して発現させ、３量体を形成しているタンパク質を公知の方法で精製することにより製造することができる。他の箇所に細胞増殖制御分子が結合した改変ラミニンや複数箇所に細胞増殖制御分子が結合した改変ラミニンも、これに準じて製造することができる。また、本発明の改変ラミニンは、α鎖のＮ末端、α鎖のＣ末端、β鎖のＮ末端およびγ鎖のＮ末端の少なくとも１箇所に、細胞増殖制御分子を化学的に結合させてもよい。
　本発明の改変ラミニンは、高い細胞接着活性および／または増殖刺激活性を有し、高純度かつ均一なタンパク質として提供することができるので、培養細胞、特に培養幹細胞の細胞外基質として非常に有用である。本発明の改変ラミニンをヒト由来の改変ラミニンとすることにより、ヒト幹細胞をフィーダーフリーおよびゼノフリーの環境で培養することが可能となり、再生医療への応用が可能な安全性の高いヒト幹細胞を提供することができる。
〔哺乳動物細胞の培養方法〕
　本発明は、上記本発明の改変ラミニンの存在下で哺乳動物細胞を培養する培養方法を提供する。本発明の改変ラミニンは、高い細胞接着活性および／または増殖刺激活性を有しているので、哺乳動物細胞の足場となる細胞外基質として用いることにより、従来フィーダー細胞を用いて培養している細胞を、フィーダー細胞を用いることなく培養することが可能となる。
　本発明の培養方法は、どのような哺乳動物細胞の培養にも適用できるが、幹細胞の培養に適用することが好ましい。幹細胞は、自己複製能と多分化能を持った細胞を意味し、体性幹細胞、多能性幹細胞などが含まれる。体性幹細胞としては、神経幹細胞、間葉系幹細胞、造血幹細胞などが挙げられる。多能性幹細胞としては、ＥＳ細胞（胚性幹細胞）、ｉＰＳ細胞（人工多能性幹細胞）、ｍＧＳ細胞（多能性生殖幹細胞）、ＥＳ細胞と体細胞との融合細胞などが挙げられる。より好ましくは多能性幹細胞であり、さらに好ましくはＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞である。哺乳動物は特に限定されず、ヒト、マウス、ラット、ウシ、ブタ等が挙げられる。なかでもヒトが好ましい。すなわち、本発明の培養方法は、ヒト幹細胞の培養に用いることが好ましい。また、本発明の培養方法用いてヒト幹細胞の培養を行う場合には、ヒト由来の改変ラミニンを用いることが好ましい。
　改変ヒトラミニンの存在下で培養する方法は、本発明の改変ラミニンを添加した培地を用いて細胞を培養する方法でもよく、本発明の改変ラミニンをコーティングした培養基材を用いて細胞を培養する方法でもよい。改変ラミニンを添加した培地を用いる場合は、予め改変ラミニンを培地に添加しておいてもよく、用時に改変ラミニンを培地に添加してもよい。添加する改変ラミニンの量は特に限定されないが、培養に用いる培養器の培養面積に対して約０．０３～約２５μｇ／ｃｍ２の濃度が好ましく、より好ましくは約０．０６～約１０μｇ／ｃｍ２であり、さらに好ましくは約０．３８～約３．８μｇ／ｃｍ２である。
　以下、本発明の培養方法の実施形態として、ヒト由来の改変ラミニンの存在下でヒト幹細胞を培養する場合の培養方法について説明するが、本発明の培養方法はこれに限定されるものではなく、ヒト以外の哺乳動物細胞の培養にも好適に用いることができる。
　本発明の培養方法でヒト幹細胞を培養する場合、使用する培地は特に限定されないが、合成培地が好ましく、ヒト以外の生物由来成分を含まない（ゼノフリー）合成培地が特に好ましい。本発明の培養方法を用いて、ヒト幹細胞をフィーダーフリーかつゼノフリーの培養条件で培養することにより、再生医療への応用が可能な安全性の高いヒト幹細胞を提供することができる。合成培地は、市販品を好適に用いることができる。市販の合成培地としては、ｍＴｅＳＲ１（商品名、STEMCELL TECHNOLOGIES）、ＴｅＳＲ２（商品名、STEMCELL TECHNOLOGIES）、ＳｔｅｍＰｒｏ ｈＥＳＣ ＳＦＭ（商品名、Invitrogen）、ｈＥＳＦ－ＧＲＯ（商品名、株式会社細胞科学研究所）等が挙げられる。このうちＴｅＳＲ２がゼノフリーの培地である。また、以下の文献(i)～(v)に記載された培地も好適に用いることができる。
(i) Liu, Y. et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 346:131-139, 2006.
(ii) Vallier, L. et al., J. Cell Sci. 118:4495-4509, 2005.
(iii) Li, Y. et al., Biotechnol. Bioeng., 91:688-698, 2005.
(iv) Yao, S. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 103:6907-6912, 2006.
(v) Lu, J. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 103:5688-5693, 2006.
　本発明の培養方法を用いてヒトｉＰＳ細胞を培養する場合の一実施形態を以下に示す。
（１）フィーダー細胞との共培養系からヒトｉＰＳ細胞を回収する
　以下の方法１または方法２のいずれかの方法で、フィーダー細胞との共培養系からヒトｉＰＳ細胞を回収する。
方法１：
　フィーダー細胞（例えばＭＥＦ）と共培養しているヒトｉＰＳ細胞の培養ディッシュ（３～５日目）に０．２５％トリプシン／ＤＭＥＭ－Ｆ１２を添加して（例えば１ｍｌ／６０ｍｍディッシュ）、３７℃で２～３分間恒温処理し、培養ディッシュをＤＭＥＭ－Ｆ１２で洗浄してフィーダー細胞を除去する。培養液を加えて全体細胞を物理的に剥離した細胞懸濁液をＢＤ Ｆａｌｃｏｎセルストレーナー１００μｍ（BD Falcon #352460）に通した後、ストレーナーを洗浄することでヒトｉＰＳ細胞のコロニーのみを分離し、回収する。
方法２：
　フィーダー細胞（例えばＭＥＦ）と共培養しているヒトｉＰＳ細胞の培養ディッシュ（３～５日目）に細胞剥離液（例えば、ＥＳ／ｉＰＳ細胞用剥離液（リプロセル ＲＣＨＥＴＰ００２）、１ｍｇ/ｍｌ ｄｉｓｐａｓｅ/ＤＭＥＭ－Ｆ１２、１０ｍｇ/ｍｌ ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅＩＶ／ＤＭＥＭ－Ｆ１２など）を添加して（例えば１ｍｌ／６０ｍｍディッシュ）、３７℃で５分間恒温処理し、ヒトｉＰＳ細胞とＭＥＦを剥離する。細胞を１５ｍｌ遠心チューブに移し、培養液を約１０ｍｌ入れて細胞を懸濁した後、５分間チューブを静置してコロニーのみを沈降させる。上清を除去し、同様の操作を２回以上繰り返して、ヒトｉＰＳ細胞のコロニーのみを沈降させ、回収する。
（２）ヒトｉＰＳ細胞をヒト由来の改変ラミニンをコーティングした培養基材へ移行する
　回収したヒトｉＰＳ細胞のコロニーを単一細胞に分散させる。単一細胞に分散させる方法は特に限定されないが、例えば、トリプシン処理する方法、Ｐ－１０００ピペットマン等を用いて培養液を数回フラッシングすることによりコロニーを砕く方法等が挙げられる。単一細胞に分散させた後、適切な培養液（例えばＴｅＳＲ２など）に懸濁し、ヒト由来の改変ラミニンをコーティング（例えば１．０μｇ／ｃｍ２）した培養ディッシュに播種する。培養は、用いた培養液に適合するＣＯ２濃度条件で行い、培養液の交換は毎日行う。
（３）継代培養
　拡大エリアの不足あるいはコロニー内に死細胞の出現が目立つようになるのを目安に、継代操作を行う。本発明の培養方法では、従来の方法と同様にヒトｉＰＳ細胞を適度な大きさのコロニー形態を維持した状態で播種する方法で継代培養を行ってもよく、ヒトｉＰＳ細胞を単一細胞に分散させて播種する方法で継代培養を行ってもよい。ここで、単一細胞に分散された状態は、細胞懸濁液中の全細胞が単一細胞に分散されていることを要するものではなく、単一細胞に分散された細胞以外に数個～十数個程度が接着した状態の細胞が細胞懸濁液中に含まれている状態も単一細胞に分散された状態に含まれる。
単一細胞に分散する場合：
　ヒトｉＰＳ細胞を培養している培養ディッシュに、ＴｒｙｐＬＥ Ｓｅｌｅｃｔ（商品名、Invitrogen #12563011）を添加して（例えば１ｍｌ／１００ｍｍディッシュ）、３７℃で５分間恒温処理する。例えばＰ－１０００ピペットマン等を用いて培養液を数回フラッシングすることによりヒトｉＰＳ細胞のコロニーを砕き、単一細胞に分散させる。培養液を加えて細胞を懸濁し、遠心チューブに回収する。遠心（１０００×ｇ、３分）と同培養液による洗浄操作を２度繰り返した後、新鮮な培養液に細胞を懸濁し、ヒト由来の改変ラミニンをコーティング（例えば１．０μｇ／ｃｍ２）した培養ディッシュに、例えば約４００００細胞／ｃｍ２の播種密度で単一細胞に分散したヒトｉＰＳ細胞を播種する。培養は、用いた培養液に適合するＣＯ２濃度条件で行い、培養液の交換は毎日行う。
単一細胞に分散しない場合：
　ヒトｉＰＳ細胞を単一細胞に分散しない場合は、細胞の剥離にＣｏｌｌａｇｅｎａｓｅＩＶ、Ｄｉｓｐａｓｅ、Ａｃｃｕｔａｓｅ等の酵素を用いる。ヒトｉＰＳ細胞を培養している培養ディッシュに、１０ｍｇ／ｍｌ ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ／ＤＭＥＭ－Ｆ１２、または２ｍｇ／ｍｌ ｄｉｓｐａｓｅ／ＤＭＥＭ－Ｆ１２、またはＡｃｃｕｔａｓｅ（Millipore #SCR005）を添加して（例えば１ｍｌ／６０ｍｍディッシュ）、３７℃で５分間恒温処理する。酵素液を除いて培養液を加え、例えばＰ－１０００のピペットマン等を用いて培養液を数回フラッシングすることによりヒトｉＰＳ細胞が約５０～約１００個のコロニー状を維持する程度に小さく砕く。細胞懸濁液を遠心チューブに回収し、遠心（２００×ｇ、３分）と同培養液による洗浄操作を２度繰り返した後、新鮮な培養液に細胞を懸濁し、ヒト由来の改変ラミニンをコーティング（例えば１．５μｇ／ｃｍ２）した培養ディッシュに２分の１～４分の１希釈量を播種する。培養は、用いた培養液に適合するＣＯ２濃度条件で行い、培養液の交換は毎日行う。
〔ｉＰＳ細胞の樹立方法〕
　本発明は、上記本発明の改変ラミニンの存在下でｉＰＳ細胞を樹立する方法を提供する。本発明のｉＰＳ細胞樹立方法は、上記本発明の改変ラミニンの存在下で核初期化物質を体細胞に接触させる工程を含むものであればよい。さらに核初期化物質の接触を受けた体細胞を、本発明の改変ラミニンの存在下で培養する工程を含むことが好ましい。
　ｉＰＳ細胞の樹立方法については、例えば以下の(vi)～(xiii)に記載した手順に従い樹立可能なことが公知である。
(vi) Takahashi, K. and Yamanaka, S., Cell, 126: 663-676 (2006)
(vii) Okita, K. et al., Nature, 448: 313-317 (2007)
(viii) Wernig, M. et al., Nature, 448: 318-324 (2007)
(ix) Maherali, N. et al., Cell Stem Cell, 1: 55-70 (2007)
(x) Nakagawa, M. et al., Nat. Biotethnol., 26: 101-106 (2008)
(xi) Takahashi, K. et al., Cell, 131: 861-872 (2007)
(xii) Yu, J. et al., Science, 318: 1917-1920 (2007)
(xiii) Maekawa, M. et al., Nature, 474: 225-229 (2011)
　このように、体細胞に特定因子を導入することにより、ヒトおよびマウスで、分化多能性においてＥＳ細胞と遜色のないｉＰＳ細胞を作製できることが示された。当該特定因子については、本発明において「核初期化物質」と定義を行うものとし、体細胞に導入することにより、あるいはｉＰＳ細胞の樹立効率改善因子と共に体細胞に接触させることにより、該体細胞からｉＰＳ細胞を誘導することができる物質（群）であれば、タンパク性因子またはそれをコードする核酸（ベクターに組み込まれた形態を含む）、あるいは低分子化合物等のいかなる物質から構成されてもよい。
　核初期化物質がタンパク性因子またはそれをコードする核酸の場合、好ましくは以下の組み合わせが例示される（以下においては、タンパク性因子の名称のみを記載する）。
(1) Ｏｃｔ３／４, Ｋｌｆ４, ｃ－Ｍｙｃ
(2) Ｏｃｔ３／４, Ｋｌｆ４, ｃ－Ｍｙｃ, Ｓｏｘ２（ここで、Ｓｏｘ２はＳｏｘ１, Ｓｏｘ３, Ｓｏｘ１５, Ｓｏｘ１７またはＳｏｘ１８で置換可能である。また、Ｋｌｆ４はＫｌｆ１, Ｋｌｆ２またはＫｌｆ５で置換可能である。さらに、ｃ－ＭｙｃはＴ８５Ａ（活性型変異体）, Ｌ－Ｍｙｃで置換可能である。）
(3) Ｏｃｔ３／４, Ｋｌｆ４, ｃ－Ｍｙｃ, Ｓｏｘ２, Ｆｂｘ１５, Ｎａｎｏｇ, ＥＲａｓ, ＴｃｅｌＩ
(4) Ｏｃｔ３／４, Ｋｌｆ４, ｃ－Ｍｙｃ, Ｓｏｘ２, ＴＥＲＴ, ＳＶ４０ Ｌａｒｇｅ Ｔ ａｎｔｉｇｅｎ（以下、ＳＶ４０ＬＴ）
(5) Ｏｃｔ３／４, Ｋｌｆ４, ｃ－Ｍｙｃ, Ｓｏｘ２, ＴＥＲＴ, ＨＰＶ１６ Ｅ６
(6) Ｏｃｔ３／４, Ｋｌｆ４, ｃ－Ｍｙｃ, Ｓｏｘ２, ＴＥＲＴ, ＨＰＶ１６ Ｅ７
(7) Ｏｃｔ３／４, Ｋｌｆ４, ｃ－Ｍｙｃ, Ｓｏｘ２, ＴＥＲＴ, ＨＰＶ６ Ｅ６, ＨＰＶ１６ Ｅ７
(8) Ｏｃｔ３／４, Ｋｌｆ４, ｃ－Ｍｙｃ, Ｓｏｘ２, ＴＥＲＴ, Ｂｍｉｌ
（以上、WO 2007/069666を参照（但し、上記(2)の組み合わせにおいて、Ｓｏｘ２からＳｏｘ１８への置換、Ｋｌｆ４からＫｌｆ１もしくはＫｌｆ５への置換については、Nature Biotechnology, 26, 101-106 (2008)を参照）。「Ｏｃｔ３／４, Ｋｌｆ４, ｃ－Ｍｙｃ, Ｓｏｘ２」の組み合わせについては、Cell, 126, 663-676 (2006)、Cell, 131, 861-872 (2007) 等も参照。「Ｏｃｔ３／４, Ｋｌｆ４（またはＫｌｆ５）,ｃ－Ｍｙｃ, Ｓｏｘ２」の組み合わせについては、Nat. Cell Biol., 11, 197-203 (2009) も参照。「Ｏｃｔ３／４, Ｋｌｆ４, ｃ－Ｍｙｃ, Ｓｏｘ２, ｈＴＥＲＴ, ＳＶ４０ＬＴ」の組み合わせについては、Nature, 451, 141-146 (2008)も参照。）
(9) Ｏｃｔ３／４, Ｋｌｆ４, Ｓｏｘ２（Nature Biotechnology, 26, 101-106 (2008)を参照）
(10) Ｏｃｔ３／４, Ｓｏｘ２, Ｎａｎｏｇ, Ｌｉｎ２８（Science, 318, 1917-1920 (2007)を参照）
(11) Ｏｃｔ３／４, Ｓｏｘ２, Ｎａｎｏｇ, Ｌｉｎ２８, ｈＴＥＲＴ, ＳＶ４０ＬＴ（Stem Cells, 26, 1998-2005 (2008)を参照）
(12) Ｏｃｔ３／４, Ｋｌｆ４, ｃ－Ｍｙｃ, Ｓｏｘ２, Ｎａｎｏｇ, Ｌｉｎ２８（Cell Research (2008) 600-603を参照）
(13) Ｏｃｔ３／４, Ｋｌｆ４, ｃ－Ｍｙｃ, Ｓｏｘ２, ＳＶ４０ＬＴ（Stem Cells, 26, 1998-2005 (2008)も参照）
(14) Ｏｃｔ３／４, Ｋｌｆ４（Nature 454:646-650 (2008)、Cell Stem Cell, 2:525-528(2008))を参照）
(15) Ｏｃｔ３／４, ｃ－Ｍｙｃ（Nature 454:646-650 (2008)を参照）
(16) Ｏｃｔ３／４, Ｓｏｘ２（Nature, 451, 141-146 (2008), WO2008/118820を参照）
(17) Ｏｃｔ３／４, Ｓｏｘ２, Ｎａｎｏｇ（WO2008/118820を参照）
(18) Ｏｃｔ３／４, Ｓｏｘ２, Ｌｉｎ２８（WO2008/118820を参照）
(19) Ｏｃｔ３／４, Ｓｏｘ２, ｃ－Ｍｙｃ, Ｅｓｒｒｂ（ここで、ＥｓｒｒｂはＥｓｒｒｇで置換可能である。Nat. Cell Biol., 11, 197-203 (2009) を参照）
(20) Ｏｃｔ３／４, Ｓｏｘ２, Ｅｓｒｒｂ（Nat. Cell Biol., 11, 197-203 (2009) を参照）
(21) Ｏｃｔ３／４, Ｋｌｆ４, Ｌ－Ｍｙｃ（Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 107, 14152-14157 (2010) を参照）
(22) Ｏｃｔ３／４, Ｎａｎｏｇ
(23) Ｏｃｔ３／４（Cell 136: 411-419 (2009)、Nature, 08436, doi:10.1038 published online(2009）
(24) Ｏｃｔ３／４, Ｋｌｆ４, ｃ－Ｍｙｃ, Ｓｏｘ２, Ｎａｎｏｇ, Ｌｉｎ２８, ＳＶ４０ＬＴ（Science, 324: 797-801 (2009)を参照）
(25) Ｏｃｔ３／４, Ｋｌｆ４, Ｓｏｘ２, ｃ－Ｍｙｃ, Ｇｌｉｓ１（Nature, 474: 225-229 (2011), WO2010/098419, WO2011/102531を参照）
(26) Ｏｃｔ３／４, Ｋｌｆ４, Ｓｏｘ２, Ｇｌｉｓ１（Nature, 474: 225-229 (2011) , WO2010/098419, WO2011/102531を参照）
　上記(1)～(26)において、Ｏｃｔ３／４に代えて他のＯｃｔファミリーのメンバー、例えばＯｃｔ１Ａ、Ｏｃｔ６などを用いることもできる。また、Ｓｏｘ２（またはＳｏｘ１、Ｓｏｘ３、Ｓｏｘ１５、Ｓｏｘ１７、Ｓｏｘ１８）に代えて他のＳｏｘファミリーのメンバー、例えばＳｏｘ７などを用いることもできる。また、Ｇｌｉｓ１に代えて他のＧｌｉｓファミリーメンバーＧｌｉｓ２、Ｇｌｉｓ３などを用いることもできる。さらに上記(1)～(26)においてｃ－ＭｙｃまたはＬｉｎ２８を核初期化物質として含む場合、ｃ－ＭｙｃまたはＬｉｎ２８に代えてそれぞれＬ－ＭｙｃまたはＬｉｎ２８Ｂを用いることもできる。
　また、上記(1)～(26)には該当しないが、それらのいずれかにおける構成要素をすべて含み、かつ任意の他の物質をさらに含む組み合わせも、本発明における「核初期化物質」の範疇に含まれ得る。また、核初期化の対象となる体細胞が上記(1)～(26)のいずれかにおける構成要素の一部を、核初期化のために十分なレベルで内在的に発現している条件下にあっては、当該構成要素を除いた残りの構成要素のみの組み合わせもまた、本発明における「核初期化物質」の範疇に含まれ得る。
　これらの組み合わせの中で、Ｏｃｔ３／４, Ｓｏｘ２, Ｋｌｆ４, Ｌ－Ｍｙｃ, Ｌｉｎ２８およびＧｌｉｓ１から選択される少なくとも１つ、好ましくは２つ以上、より好ましくは３つ以上が、好ましい核初期化物質の例として挙げられる。
　上記の各タンパク性因子のマウスおよびヒトｃＤＮＡ配列情報は、WO 2007/069666に記載のＮＣＢＩ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒｓを参照することにより取得することができ（Ｎａｎｏｇは当該公報中では「ＥＣＡＴ４」との名称で記載されている。なお、Ｌｉｎ２８、Ｌｉｎ２８Ｂ、Ｅｓｒｒｂ、Ｅｓｒｒｇ、Ｌ－Ｍｙｃ、Ｇｌｉｓ１のマウスおよびヒトｃＤＮＡ配列情報は、それぞれ表６に記載したＮＣＢＩ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒｓを参照することにより取得できる。）、当業者は容易にこれらのｃＤＮＡを単離することができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
　これらｉＰＳ細胞を誘導し得る核初期化物質の体細胞への導入は、該物質がタンパク性因子である場合、自体公知の細胞へのタンパク質導入方法を用いて実施することができる。そのような方法としては、例えば、タンパク質導入試薬を用いる方法、タンパク質導入ドメインもしくは細胞透過性ペプチド融合タンパク質を用いる方法、マイクロインジェクション法などが挙げられる。その他、エレクトロポレーション法、セミインタクトセル法（Kano, F. et al. Methods in Molecular Biology, Vol. 322, 357-365(2006)）、Ｗｒ－ｔペプチドによる導入法（Kondo, E. et al., Mol. Cancer Ther. 3(12), 1623-1630(2004)）などのタンパク質導入法も用いることができる。ｉＰＳ細胞の樹立効率を重視するのであれば、核初期化物質を、タンパク性因子自体としてではなく、それをコードする核酸の形態で用いることがむしろ好ましい。該核酸はＤＮＡであってもＲＮＡであってもよく、あるいはＤＮＡ／ＲＮＡキメラであってもよい。また、該核酸は二本鎖であっても、一本鎖であってもよい。好ましくは、該核酸は二本鎖ＤＮＡ、特にｃＤＮＡである。核初期化物質のｃＤＮＡは、宿主となる体細胞で機能し得るプロモーターを含む適当な発現ベクターに挿入される。発現ベクターとしては、例えば、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、センダイウイルスなどのウイルスベクター、動物細胞発現プラスミド（例、ｐＡ－１１，ｐｘＴ１，ｐＲｃ／ＣＭＶ，ｐＲｃ／ＲＳＶ，ｐｃＤＮＡＩ／Ｎｅｏ）などが用いられ得る。用いるベクターの種類は、得られるｉＰＳ細胞の用途に応じて適宜選択することができる。例えば、アデノウイルスベクター、プラスミドベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、センダイウイルスベクターなどが使用され得る。核初期化物質である核酸（初期化遺伝子）は、各々別個の発現ベクター上に組み込んでもよいし、１つの発現ベクターに２種類以上、好ましくは２～３種類の遺伝子を組み込んでもよい。遺伝子導入効率の高いレトロウイルスやレンチウイルスベクターを用いる場合は前者を、プラスミド、アデノウイルス、エピソーマルベクターなどを用いる場合は後者を選択することが好ましい。さらに、２種類以上の遺伝子を組み込んだ発現ベクターと、１遺伝子のみを組み込んだ発現ベクターとを併用することもできる。
〔幹細胞の急速拡大方法〕
　本発明は、幹細胞の急速拡大方法を提供する。本発明の急速拡大方法は、幹細胞を単一細胞に分散する工程と、単一細胞に分散された幹細胞を、上記本発明の改変ラミニンの存在下で培養する工程とを含み、単一細胞に分散された幹細胞を約２×１０４～約２０×１０４ｃｅｌｌ／ｃｍ２の密度で播種するものであればよい。播種密度は、約３×１０４～約１０×１０４ｃｅｌｌ／ｃｍ２がより好ましく、約４×１０４～約５×１０４ｃｅｌｌ／ｃｍ２がさらに好ましい。従来の培養系では、単一に分散された幹細胞を上記細胞密度で播種した場合の接着効率は非常に低いものであるが、本発明の急速拡大方法によれば、顕著に高い接着効率が得られ、その後旺盛に増殖するので、従来法と比較して格段の速度で幹細胞を増殖させることができる。
　幹細胞を単一細胞に分散する工程では、上述の「単一細胞に分散する場合」と同様に、培養ディッシュから剥離、回収した幹細胞のコロニーを例えば、トリプシン処理やＰ－１０００ピペットマン等を用いて培養液を数回フラッシングすることにより単一細胞に分散する。続いて、公知の細胞計数方法で細胞数をカウントし、上記播種密度となるように、適宜細胞懸濁液の細胞濃度を調整する。培養方法については、上記本発明の培養方法に記載に準じて行うことができる。
　本発明の幹細胞の急速拡大方法は、ＥＳ細胞やｉＰＳ細胞などの多能性幹細胞に適用することが好ましく、ＥＳ細胞に適用することがより好ましい。また、ヒト多能性幹細胞に適用することが好ましく、ヒトＥＳ細胞に適用することがより好ましい。本発明の幹細胞の急速拡大方法をヒト幹細胞に適用する場合には、ヒト由来の改変ラミニンを使用することが好ましい。
〔幹細胞の単一細胞由来クローン分離方法〕
　本発明は、幹細胞の単一細胞由来クローン分離方法を提供する。本発明の単一細胞由来クローン分離方法は、幹細胞を単一細胞に分散する工程と、単一細胞に分散された幹細胞を、上記本発明の改変ラミニンの存在下で培養する工程とを含み、単一細胞由来のコロニーを形成させるものであればよい。本発明の単一細胞由来クローン分離方法によれば、従来の培養系では困難であった幹細胞の単一細胞由来クローンを形成させ、分離することができ、均一な幹細胞を容易に取得することが可能となる。
　単一細胞由来のコロニーを形成させ単一細胞由来クローンを分離する方法は特に限定されない。例えば公知の限界希釈法等を好適に用いることができる。用いる方法に応じて適宜細胞密度および使用する培養基材を選択して、単一細胞に分散されたヒト幹細胞を播種し、培養すればよい。培養方法については、上記本発明の培養方法の記載に準じて行うことができる。
　本発明の幹細胞の単一細胞由来クローン分離方法は、ＥＳ細胞やｉＰＳ細胞などの多能性幹細胞に適用することが好ましく、ＥＳ細胞に適用することがより好ましい。また、ヒト多能性幹細胞に適用することが好ましく、ヒトＥＳ細胞に適用することがより好ましい。本発明の幹細胞の単一細胞由来クローン分離方法をヒト幹細胞に適用する場合には、ヒト由来の改変ラミニンを使用することが好ましい。
〔幹細胞の単一細胞培養方法〕
　本発明は、幹細胞の単一細胞培養方法を提供する。本発明の単一細胞培養方法は、幹細胞を単一細胞に分散する工程と、単一細胞に分散された幹細胞を、上記本発明の改変ラミニンの存在下で培養する工程とを含み、細胞を増殖させることなく単一細胞の状態で維持するものであればよい。コロニーを形成した幹細胞は、コロニー周辺部とコロニー内部とで細胞の状態が異なる場合があるが、本発明の単一細胞培養方法によれば、細胞はコロニーを形成しないので、状態の均一な幹細胞を得ることができ、分化誘導効率の向上が期待できる。
　細胞を増殖させることなく単一細胞の状態で維持する方法としては、使用する培養基材に応じて適宜細胞密度を選択して単一細胞に分散された幹細胞を播種し、細胞が増殖する前に細胞を他の用途に使用することが好ましい。また、例えば、増殖因子を含まない培養液、または増殖因子を減量した培養液を用いることにより、単一細胞の状態で維持できる時間を延長してもよい。
　本発明の幹細胞の単一細胞培養方法は、ＥＳ細胞やｉＰＳ細胞などの多能性幹細胞に適用することが好ましく、ＥＳ細胞に適用することがより好ましい。また、ヒト多能性幹細胞に適用することが好ましく、ヒトＥＳ細胞に適用することがより好ましい。本発明の幹細胞の単一細胞培養方法をヒト幹細胞に適用する場合には、ヒト由来の改変ラミニンを使用することが好ましい。
〔培養基材〕
　本発明は、上記本発明の改変ラミニンがコーティングされている培養基材を提供する。本発明の培養基材を用いて培養する細胞は特に限定されず、培養可能な哺乳動物細胞であればどのような細胞でも本発明の培養基材を用いて培養することができる。好ましくは幹細胞である。幹細胞には体性幹細胞、多能性幹細胞などが含まれる。体性幹細胞としては、神経幹細胞、間葉系幹細胞、造血幹細胞などが挙げられる。多能性幹細胞としては、ＥＳ細胞（胚性幹細胞）、ｉＰＳ細胞（人工多能性幹細胞）、ｍＧＳ細胞（多能性生殖幹細胞）、ＥＳ細胞と体細胞との融合細胞などが挙げられる。より好ましくは多能性幹細胞であり、さらに好ましくはＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞である。哺乳動物としては、ヒト、マウス、ラット、ウシ、ブタ等が挙げられる。なかでもヒトが好ましい。本発明の培養基材は、従来フィーダー細胞を用いて培養している細胞を、フィーダー細胞を用いることなく培養する場合に非常に有用である。
　本発明の培養基材を製造する方法は特に限定されず、公知の培養器に本発明の改変ラミニンをコーティングできる方法であればどのような方法でもよい。例えば、上記本発明の改変ラミニンを適当な溶媒、例えばＰＢＳ、生理食塩水、トリスヒドロキシメチルアミノメタンあるいは４－（２－ヒドロキシエチル）－１－ピペラジンエタンスルフォン酸で中性ｐＨとした生理的食塩水などで希釈し、この溶液を適当な培養器に添加して、４℃～３７℃程度で約１～１２時間程度静置することにより、改変ラミニンが培養器表面にコーティングされ、本発明の培養基材が製造できる。培養器としては、哺乳動物細胞の培養に使用できるものであれば限定されず、例えば、ガラス製またはプラスチック製のシャーレ、フラスコ、マルチウェルプレート、カルチャースライド、マイクロキャリア、ポリビニリデンフルオリド膜等のポリマー膜などが挙げられる。
　改変ラミニンのコーティング濃度は、特に限定されないが、約０．０３～約２５μｇ／ｃｍ２が好ましく、約０．０６～約１０μｇ／ｃｍ２がより好ましく、約０．３８～約３．８μｇ／ｃｍ２がさらに好ましい。本発明の培養基材は、改変ラミニンを用いているので、従来用いられているマトリゲルをコーティングする場合と比較して、低いコーティング濃度でも多数のヒト幹細胞が接着し、増殖することができる。
　本発明の培養基材は、単一の改変ラミニンがコーティングされていてもよく、複数の異なる改変ラミニンがコーティングされていてもよい。また、改変ラミニン以外の成分がコーティングされていてもよい。例えば血清成分、細胞外マトリックス分子、成長因子、分化誘導因子、形態形成因子（モルフォゲン）などが挙げられる。また、合成高分子ゲル（合成ポリマー）などの非生物成分がコーティングされていてもよい。
　本発明の培養基材は、ヒト由来の改変ラミニンがコーティングされていることが好ましい。ヒト由来の改変ラミニンがコーティングされている培養基材の場合、上記改変ラミニン以外の成分は、ヒト由来の成分であることが好ましい。ヒト由来の改変ラミニンがコーティングされている本発明の培養基材は、ヒト幹細胞の培養に通常用いられるフィーダー細胞を使用しない培養環境（フィーダーフリー）で、多分化能を保持したままヒト幹細胞を維持培養することが可能となる。通常、ヒト幹細胞の培養には、クローナルな増殖と未分化性を維持させるために、Ｘ線照射やマイトマイシンＣ処理により増殖を停止させたマウス胎児線維芽細胞（ＭＥＦ）等のフィーダー細胞上でヒト幹細胞を共培養する培養系が用いられるが、このようなフィーダー細胞を使用しない培養系がフィーダーフリーである。さらに、異種由来の成分が排除されている培地を使用すれば、完全に異種由来の成分を含まない培養条件（ゼノフリー：Ｘｅｎｏ－Ｆｒｅｅ）でヒト幹細胞を培養することができ、ヒトに対して免疫原性を発現する可能性が非常に低い、高安全性のヒト幹細胞を提供することができる。ゼノフリーの培地としては、例えば、ＴｅＳＲ２（商品名、STEMCELL TECHNOLOGIES）などが挙げられる。
　以下、実施例により本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
〔実施例１：改変ヒトラミニンの作製〕
（１）Ｐｌｕｓ＃１ラミニンＥ８用発現ベクターの作製
　Ｐｌｕｓ＃１ラミニンＥ８（組換えヒトラミニンα５β１γ１のＥ８フラグメントとヒトラミニンα１鎖球状ドメイン４－５番目を融合させた改変ヒトラミニン）は、組換えヒトラミニン５１１Ｅ８（以下「ｒｈＬＭ５１１Ｅ８」と記す）を作製した後に、ヒトラミニンα５鎖のＥ８のＣ末端部にヒトラミニンα１鎖球状ドメイン４－５番目（以下「ヒトラミニンα１鎖ＬＧ４５」と記す）を付加して作製した。
（１－１）ヒトラミニンα５鎖、β１鎖、γ１鎖の各Ｅ８フラグメント発現ベクターの作製
　ｒｈＬＭ５１１Ｅ８は、Ｉｄｏら（Hiroyuki Ido, Aya Nakamura, Reiko Kobayashi, Shunsuke Ito, Shaoliang Li, Sugiko Futaki, and Kiyotoshi Sekiguchi, “The requirement of the glutamic acid residue at the third position from the carboxyl termini of the laminin γ chains in integrin binding by laminins”, The Journal of Biological Chemistry, 282, 11144-11154, 2007）に記載の方法に従い、以下のように作製した。
　最初に、クローニング用プラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＫＳ（＋）（Stratagene）を鋳型として、以下の３種類のプライマーセットを用いてＰＣＲを行い、プラスミドのマルチクローニング部位内のＥｃｏＲＶの５’側に６×Ｈｉｓタグ（HHHHHH）をコードするＤＮＡ配列、ＨＡ（ヘマグルチニン）タグ（YPYDVPDYA）をコードするＤＮＡ配列、またはＦＬＡＧタグ（DYKDDDDK）をコードするＤＮＡ配列が挿入された３種類のｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＫＳ（＋）をそれぞれ作製した。
(i) ６×Ｈｉｓタグ導入用プライマー
　　5’-ATGATGATGAAGCTTATCGATACCGT-3’（forward、配列番号１）
　　5’-CATCATCATGATATCGAATTCCTGCA-3’（reverse、配列番号２）
(ii) ＨＡタグ導入用プライマー
　　5’-ATCATATGGATAAAGCTTATCGATACCGT-3’（forward、配列番号３）
　　5’-GTGCCAGATTATGCAGATATCGAATTCCT-3’（reverse、配列番号４）
(iii) ＦＬＡＧタグ導入用プライマー
　　5’-ATCCTTGTAATCAAGCTTATCGATACCGT-3’（forward、配列番号５）
　　5’-GATGATGATAAGGATATCGAATTCCT-3’（reverse、配列番号６）
　次に、α５鎖、β１鎖、γ１鎖の全長塩基配列を含むプラスミド（Hiroyuki Ido, Kenji Harada, Sugiko Futaki, Yoshitaka Hayashi, Ryoko Nishiuchi, Yuko Natsuka, Shaoliang Li, Yoshinao Wada, Ariana C. Comb, James M. Ervasti, and Kiyotoshi Sekiguchi, “Molecular Dissection of the α-Dystroglycan- and Integrin-binding Sites within the Globular Domain of Human Laminin-10”, The Journal of Biological Chemistry, 279, 10946-10954, 2004）を鋳型として、以下のプライマーを用いたＰＣＲを行い、各鎖のα５（Ａｌａ2534－Ａｌａ3327）、β１（Ｌｅｕ1561－Ｌｅｕ1786）、γ１（Ａｓｎ1362－Ｐｒｏ1609）に相当する領域を増幅した。
(iv) α５鎖Ｅ８フラグメント増幅用プライマー
　　5’-GCTGCCGAGGATGCTGCTGGCCAGG-3’（forward、配列番号７）
　　5’-CTAGGCAGGATGCCGGGCGGGCTGA-3’（reverse、配列番号８）
(v) β１鎖Ｅ８フラグメント増幅用プライマー
　　5’-CTTCAGCATAGTGCTGCTGACATTG-3’（forward、配列番号９）
　　5’-TTACAAGCATGTGCTATACACAGCAAC-3’（reverse、配列番号１０）
(vi) γ１鎖Ｅ８フラグメント増幅用プライマー
　　5’-AATGACATTCTCAACAACCTGAAAG-3’（forward、配列番号１１）
　　5’-CTAGGGCTTTTCAATGGACGGGGTG-3’（reverse、配列番号１２）
　増幅したＤＮＡ断片を、タグ配列を付加したｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＫＳ（＋）のマルチクローニング部位のＥｃｏＲＶ部位に挿入した後、５’側のタグをコードする配列を含めて増幅したＤＮＡ断片を制限酵素ＥｃｏＲＩとＨｉｎｄIIIで切り出し、哺乳細胞用発現ベクターｐＳｅｃＴａｇ２Ｂ（Invitrogen、マウスＩｇ－κ鎖Ｖ－Ｊ２－ＣシグナルペプチドをコードするＤＮＡ配列を内在に有する。）の当該部位に挿入し、ヒトα５鎖Ｅ８フラグメント（Ｎ末端側に６×Ｈｉｓタグを含む）、ヒトβ１鎖Ｅ８フラグメント（Ｎ末端側にＨＡタグを含む）、ヒトγ１鎖Ｅ８フラグメント（Ｎ末端側にＦＬＡＧタグを含む）の発現ベクターをそれぞれ作製した。
（１－２）ヒトラミニンα１鎖ＬＧ４５融合ヒトラミニンα５鎖Ｅ８フラグメント発現ベクターの作製
　５’側から、マウスＩｇ－κ鎖Ｖ－Ｊ２－Ｃシグナルペプチド－６×Ｈｉｓタグ－ヒトラミニンα５鎖Ｅ８－ヒトラミニンα１鎖ＬＧ４５を順にコードするＤＮＡ断片を獲得するために、ヒトラミニンα５鎖Ｅ８をコードするＤＮＡ断片と、ヒトラミニンα１鎖ＬＧ４５をコードするＤＮＡ断片をそれぞれ取得し、エクステンションＰＣＲによってこれら２種類のＤＮＡ断片を連結・増幅した。増幅産物を制限酵素ＡｓｃＩで消化し、ヒトラミニンα５鎖Ｅ８発現ベクターのＡｓｃＩ－ＰｍｅＩ部位に挿入し、ヒトラミニンα１鎖ＬＧ４５融合ヒトラミニンα５鎖Ｅ８フラグメント発現ベクターを作製した。
　はじめに、ヒトラミニンα５鎖Ｅ８フラグメント発現ベクターを鋳型とし、以下のプライマーを用いてＰＣＲを行い、α５鎖Ｅ８フラグメントの３’側７５４塩基対を増幅した。なお、配列番号１４のプライマーの５’側にはエクステンションＰＣＲに使用する配列が付加されている。
(vii) ヒトラミニンα５鎖部分断片増幅用プライマー
　　5’-CAATGATCTGGAGCTGGCCGACGCCTACTACCTG-3’（forward、配列番号１３）
　　5’-CTCTGCATCAGGCCCCAGGCCCGGGGTC-3’（reverse、配列番号１４）
　次に、ヒトラミニンα１鎖の全長塩基配列を含むプラスミド（Hiroyuki Ido, Kenji Harada, Yoshiko Yagi, and Kiyotoshi Sekiguchi, “Probing the integrin-binding site within the globular domain of laminin-511 with the function-blocking monoclonal antibody 4C7.”, Matrix Biology, 25(2), 112-117, 2006）を鋳型として、以下のプライマーを用いたＰＣＲを行い、ヒトラミニンα１鎖ＬＧ４５部位（Asp2684－Ser3075）に相当する領域を増幅した。なお、配列番号１５のプライマーの５’側にはエクステンションＰＣＲに使用する配列が付加されている。
(viii) ヒトラミニンα１鎖ＬＧ４５部位増幅用プライマー
　　5’-CCTGGGGCCTGATGCAGAGGACAGCAA-3’（forward、配列番号１５）
　　5’-AAACTCAGGACTCGGTCCCAGGACAGGAATGAAGG-3’（reverse、配列番号１６）
　得られた２種類のＤＮＡ断片を、以下のプライマーを用いたエクステンションＰＣＲにより連結・増幅させ、ヒトラミニンα５鎖Ｅ８のＣ末端部とヒトラミニンα１鎖ＬＧ４５部位をコードするＤＮＡ断片を得た。増幅したＤＮＡを、制限酵素ＡｓｃＩで消化し、ヒトラミニンα５鎖Ｅ８発現ベクターのＡｓｃＩ－ＰｍｅＩ部位に挿入し、ヒトラミニンα１鎖ＬＧ４５融合ヒトラミニンα５鎖Ｅ８フラグメント発現ベクターを作製した。
(ix) ヒトラミニンα５鎖Ｅ８のＣ末端部とヒトラミニンα１鎖ＬＧ４５部位増幅用プライマー
　　5’-CAATGATCTGGAGCTGGCCGACGCCTACTACCTG-3’（forward、配列番号１３）
　　5’-AAACTCAGGACTCGGTCCCAGGACAGGAATGAAGG-3’（reverse、配列番号１６）
（２）Ｐｌｕｓ＃２ラミニンＥ８用発現ベクターの作製
　Ｐｌｕｓ＃２ラミニンＥ８（ｒｈＬＭ５１１Ｅ８とヒトフィブロネクチンIII型モジュールの７番目～１０番目を融合させた改変ヒトラミニン）はｒｈＬＭ５１１Ｅ８を作製した後に、ヒトラミニンγ１鎖のＥ８のＮ末端部にヒトフィブロネクチンの細胞接着部位（ヒトフィブロネクチンIII型モジュールの７番目～１０番目、以下「ＦＮIII７～１０」と記す）を付加して作製した。
（２－１）ヒトラミニンα５鎖、β１鎖、γ１鎖の各Ｅ８フラグメント発現ベクターの作製
　上記（１－１）と同様の方法でヒトラミニンα５鎖Ｅ８フラグメント（Ｎ末端側に６×Ｈｉｓタグを含む）、β１鎖Ｅ８フラグメント（Ｎ末端側にＨＡタグを含む）、γ１鎖Ｅ８フラグメント（Ｎ末端側にＦＬＡＧタグを含む）の発現ベクターをそれぞれ作製した。
（２－２）ＦＮIII７～１０融合ヒトラミニンγ１Ｅ８フラグメント発現ベクターの作製
　５’側から、マウスＩｇ－κ鎖Ｖ－Ｊ２－Ｃシグナルペプチド－ＦＬＡＧタグ－ＦＮIII７～１０－γ１鎖Ｅ８を順にコードするＤＮＡ断片を獲得するために、マウスＩｇ－κ鎖Ｖ－Ｊ２－Ｃシグナルペプチド－ＦＬＡＧタグをコードするＤＮＡ断片、ＦＮIII７～１０をコードするＤＮＡ断片、およびγ１鎖Ｅ８フラグメントをコードするＤＮＡ断片をそれぞれ取得し、エクステンションＰＣＲによってこれら３種類のＤＮＡ断片を連結・増幅した。増幅産物を制限酵素ＮｈｅＩとＮｏｔＩで消化し、哺乳細胞用発現ベクターｐＳｅｃＴａｇ２Ｂ（Invitrogen、マウスＩｇ－κ鎖Ｖ－Ｊ２－Ｃシグナルペプチドをコードする遺伝子配列を内在的に有する。）の当該部位に挿入し、ＦＮIII７－１０融合ヒトラミニンγ１Ｅ８フラグメント発現ベクターの発現ベクターを作製した。
　まず、ヒトラミニンγ１鎖Ｅ８フラグメント発現ベクターを鋳型として、以下のプライマーを用いてＰＣＲを行い、マウスＩｇ－κ鎖Ｖ－Ｊ２－Ｃシグナルペプチド－ＦＬＡＧタグ、およびγ１鎖Ｅ８フラグメントに相当する領域をそれぞれ増幅した。なお、配列番号１８と１９のプライマーの５’側にはエクステンションＰＣＲに使用する配列が付加されている。
(x) シグナルペプチド配列－ＦＬＡＧタグ配列増幅用プライマー
　　5’-GAGGTCTATATAAGCAGAGCTCTCTGGCTAACTA-3’（forward、配列番号１７）
　　5’-TGGTGGAGACAATGGATCCTTATCATCATCATCC-3’（reverse、配列番号１８）
(xi) γ１鎖Ｅ８フラグメント配列増幅用プライマー
　　5’-TAATTACCGAACAGATAATGACATTCTCAACAACC-3’（forward、配列番号１９）
　　5’-GAAAGGACAGTGGGAGTGGCACC-3’（reverse、配列番号２０）
　次に、ヒトフィブロネクチン発現ベクター（Hiroki Akamatsu, Keiko Ichihara-Tanaka, Keiichi Ozono, Wataru Kamiike, Hikaru Matsuda, and Kiyotoshi Sekiguchi, “Suppression of Transformed Phenotypes of Human Fibrosarcoma Cells by Overexpression of Recombinant Fibronectin”, Cancer Research, 56, 4541-4546, 1996）を鋳型として、以下のプライマーを用いてＰＣＲを行い、ＦＮIII７～１０に相当する領域（Pro1173－Arg1539）を増幅した。なお、配列番号２１と２２のプライマーの５’側にはエクステンションＰＣＲに使用する配列が付加されている。
(xii) ＦＮIII７～１０配列増幅用プライマー
　　5’-GATGATGATAAGGATCCATTGTCTCCACCAACAA-3’（forward、配列番号２１）
　　5’-ATGTCATTATCTGTTCGGTAATTAATGGAAATTGG-3’（reverse、配列番号２２）
　得られた３種類のＤＮＡ断片を、以下のプライマーを用いたエクステンションＰＣＲにより連結・増幅させ、マウスＩｇ－κ鎖Ｖ－Ｊ２－Ｃシグナルペプチド－ＦＬＡＧタグ－ＦＮIII７～１０－γ１鎖Ｅ８をコードするＤＮＡ断片を得た。増幅したＤＮＡを、制限酵素ＮｈｅＩとＮｏｔＩで消化し、哺乳細胞用発現ベクターｐＳｅｃＴａｇ２Ｂ（Invitrogen）の当該部位に挿入し、ＦＮIII７～１０融合ヒトラミニンγ１Ｅ８フラグメントの発現ベクターを作製した。
(xiii) ＦＮIII７～１０融合ヒトラミニンγ１Ｅ８フラグメント増幅用プライマー
　　5’-GAGGTCTATATAAGCAGAGCTCTCTGGCTAACTA-3’（forward、配列番号１７）
　　5’-GAAAGGACAGTGGGAGTGGCACC-3’（reverse、配列番号２０）
（３）Ｐｌｕｓ＃１ラミニンＥ８およびＰｌｕｓ＃２ラミニンＥ８の発現および精製
　Ｐｌｕｓ＃１ラミニンＥ８とＰｌｕｓ＃２ラミニンＥ８の発現は、作製した各鎖の発現ベクターをＦｒｅｅＳｔｙｌｅ２９３－Ｆ細胞（商品名、Invitrogen、以下「２９３－Ｆ細胞」と記す）に導入して行った。すなわち、Ｐｌｕｓ＃１ラミニンＥ８の場合は、ヒトラミニンα１鎖ＬＧ４５融合ヒトラミニンα５鎖Ｅ８フラグメント発現ベクター、ヒトβ１鎖Ｅ８フラグメント発現ベクターおよびヒトγ１鎖Ｅ８フラグメント発現ベクターを２９３－Ｆ細胞に導入し、Ｐｌｕｓ＃２ラミニンＥ８の場合は、ヒトα５鎖Ｅ８フラグメント発現ベクター、ヒトβ１鎖Ｅ８フラグメント発現ベクターおよびＦＮIII７～１０融合ヒトラミニンγ１Ｅ８フラグメント発現ベクターを２９３－Ｆ細胞に導入した。３００ｍｌの２９３－Ｆ細胞（１．０×１０６個／ｍｌ）にトランスフェクション試薬２９３ｆｅｃｔｉｎ（商品名、Invitrogen）およびＯｐｔｉ－ＭＥＭ（商品名、Invitrogen）を用いて各鎖発現ベクターを１５０μｇずつ同時にトランスフェクトし、７２時間培養を行った後、培養液を回収した。培養液は１０００×ｇで１０分間遠心し、その上清をさらに１５，０００×ｇで３０分間遠心し、細胞や不溶物を除去した。培養上清に１０ｍｌのＮｉ－ＮＴＡ ａｇａｒｏｓｅ（キアゲン）を添加し一晩インキュベートして目的タンパク質を吸着させた。Ｎｉ－ＮＴＡ ａｇａｒｏｓｅを回収し、ＴＢＳ（－）（Ｃａ、Ｍｇを含まないトリス緩衝生理的食塩水）および１０ｍＭイミダゾール／ＴＢＳ（－）で洗浄したのち２００ｍＭイミダゾール／ＴＢＳ（－）で溶出した。Ａ２８０の吸光度により溶出画分中におけるタンパク質量を確認し、目的タンパク質が溶出された画分に３ｍｌのＡＮＴＩ－ＦＬＡＧ Ｍ２ ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｇｅｌ（シグマ）を添加し、４℃で一晩旋回させた。ゲルをポリプレップカラム（Bio-Rad、#731-1550B04）に移し、ＴＢＳ（－）で洗浄後、１００μｇ／ｍｌ ＦＬＡＧ ｐｅｐｔｉｄｅ（Sigma、#F3290）を含むＴＢＳ（－）で溶出した。溶出フラクションを銀染色で確認し、溶出された画分を合わせてＰＢＳ（－）（リン酸緩衝生理的食塩水）に対して透析を行った。透析後の精製物を０．２２μmのディスクシリンジフィルター（Millipore、＃SLGV033RS）に通すことで滅菌し、－８０℃で保存した。
（４）Ｐｌｕｓ＃１ラミニンＥ８およびＰｌｕｓ＃２ラミニンＥ８のＳＤＳ－ＰＡＧＥ解析
　ＳＤＳ－ＰＡＧＥ法により精製したＰｌｕｓ＃１ラミニンＥ８とＰｌｕｓ＃２ラミニンＥ８の電気泳動パターンをｒｈＬＭ５１１Ｅ８と比較した。５％～２０％の濃度勾配をもつポリアクリルアミドゲル（ATTO、#2331830）の１ウェルにｒｈＬＭ５１１Ｅ８を１．５μｇ、Ｐｌｕｓ＃１ラミニンＥ８を１．９μｇ、Ｐｌｕｓ＃２ラミニンＥ８を１．９μｇそれぞれアプライし、２０ｍＡで７５分間電気泳動した。電気泳動は、Ｌａｅｍｍｌｉ法に従い、２５ｍＭトリス、１９２ｍＭグリシン、０．１％ドデシル硫酸ナトリウムからなる緩衝液を用いて還元条件下で行った。タンパク質の染色にはＱｕｉｃｋ－ＣＢＢ（WAKO、#299-50101）を用いた。
（５）結果
　結果を図１に示した。Ｐｌｕｓ＃１ラミニンＥ８では３本のバンド（高分子側からα５Ｅ８＋α１ＬＧ４５、γ１Ｅ８、β１Ｅ８）が観察された。α５Ｅ８＋α１ＬＧ４５のバンド位置はα５Ｅ８より高分子側にシフトしていた。この結果は、α５Ｅ８にα１ＬＧ４５が付加されていることを示している。Ｐｌｕｓ＃２ラミニンＥ８でも３本のバンド（高分子側からα５Ｅ８、γ１Ｅ８＋ＦＮIII７～１０、β１Ｅ８）が観察された。γ１Ｅ８＋ＦＮIII７～１０のバンド位置はγ１Ｅ８より高分子側にシフトしていた。この結果は、γ１Ｅ８にＦＮIII７～１０が付加されていることに示している。以上の結果から、設計したＰｌｕｓ＃１ラミニンＥ８およびＰｌｕｓ＃２ラミニンＥ８が得られていることを確認した。
〔実施例２：ヒトｉＰＳ細胞の各種細胞外基質への濃度依存的接着効率の比較〕
（１）ヒトｉＰＳ細胞
　ヒトｉＰＳ細胞は独立行政法人医薬基盤研究所生物資源バンクより購入した株（クローン名：ｔｉｃ（ＪＣＲＢ１３３１））を使用した。ｔｉｃ細胞は、独立行政法人医薬基盤研究所生物資源バンクが推奨する方法に従い、マウスフィーダー細胞との共培養で維持した。共培養ディッシュに、１Ｕ／ｍｌディスパーゼ／ＤＭＥＭ－Ｆ１２を添加し、ｔｉｃ細胞のコロニーをスクレーパーでかき集めた。このｔｉｃ細胞コロニーとマウスフィーダー細胞を含む溶液をＢＤ Ｆａｌｃｏｎセルストレーナー１００μｍに通し、ストレーナーを洗浄することでｔｉｃ細胞コロニーを分離した。残留したコロニーをゼノフリー培地であるＴｅＳＲ２（商品名、STEMCELL TECHNOLOGIES）で回収し、Ｐ－１０００ピペットマンで細かく砕いた後、ＴｅＳＲ２に再懸濁し、マトリゲルをコートした培養器に播種した。３７℃、５％ＣＯ２条件下、毎日培養液交換を行い、４－５日まで拡大培養を行った。このように拡大培養された細胞を実験に供した。
（２）細胞外基質
　細胞外基質として、Ｐｌｕｓ＃１ラミニンＥ８、Ｐｌｕｓ＃２ラミニンＥ８およびＢＤマトリゲルヒトＥＳ細胞用（商品名、BD Bioscience #354277、以下「マトリゲル」と記す）を使用した。Ｐｌｕｓ＃１ラミニンＥ８溶液、Ｐｌｕｓ＃２ラミニンＥ８溶液、マトリゲル溶液をリン酸緩衝生理的食塩水（Invitrogen、#10010－023）で希釈した後、ＢＤ ＦＡＬＣＯＮ ＭＩＣＲＯＴＥＳＴ９６ウェルマイクロプレート（商品名、BD Biosciences、#353072）に添加し、４℃で一晩静置してコーティングを行った。なお、マトリゲル溶液は０．１～３０μｇ／ｃｍ２、Ｐｌｕｓ＃１ラミニンＥ８溶液およびＰｌｕｓ＃２ラミニンＥ８溶液は０．００３８～３．８μｇ／ｃｍ２の範囲になるようにプレートへ添加した。
（３）接着細胞の測定
　ＴｅＳＲ２を用いて培養したヒトｉＰＳ細胞（ｔｉｃ）から培地を除去した後、４．８ｍＭ ＥＤＴＡを含むリン酸緩衝生理的食塩水を加えて、３分間３７℃で恒温処理した。次に、ＴｒｙｐＬＥ Ｓｅｌｅｃｔ（商品名、Invitrogen、#12563-011）を加えて３分間、３７℃で恒温処理し、細胞を単一細胞に分散させた。細胞数をカウントした後、プレートに２．７×１０４ｃｅｌｌ／ｗｅｌｌ（８．２×１０４cｅｌｌ／ｃｍ２）の密度で細胞を播種した。細胞播種から６時間後、上清を除いてＤＭＥＭ－Ｆ１２で１度ウェルを洗浄し、１０％中性ホルマリンを含むリン酸緩衝生理的食塩水を加えて１０分間細胞を固定した。細胞の染色には、ディフ・クイック（登録商標、シスメックス株式会社、#16920）を用いた。風乾の後、１％ＳＤＳを加えて細胞を可溶化し、マルチプレートリーダーを用いて波長５９５ｎｍの吸光度を測定した。
（４）結果
　結果を図２に示した。Ｐｌｕｓ＃１ラミニンＥ８とＰｌｕｓ＃２ラミニンＥ８は低濃度のコーティング（０．１３μｇ／ｃｍ２）でも顕著に高い接着細胞数を示した。一方、汎用されているマトリゲルは１０μｇ／ｃｍ２のコーティングで接着細胞数が最大値に達した。しかし、この最大値はＰｌｕｓ＃１ラミニンＥ８およびＰｌｕｓ＃２ラミニンＥ８の最大値より低かった。この結果から、Ｐｌｕｓ＃１ラミニンＥ８およびＰｌｕｓ＃２ラミニンＥ８は、マトリゲルの約１／８０のタンパク質量でマトリゲルより高いヒトｉＰＳ細胞の細胞接着活性を示すことが明らかとなった。加えて、Ｐｌｕｓ＃１ラミニンＥ８とＰｌｕｓ＃２ラミニンＥ８の至適コーティング濃度は約０．１３～３．８μｇ／ｃｍ２と考えられた。
〔実施例３：各種細胞外基質をコーティングした培養器におけるヒトｉＰＳ細胞の継代培養（Ｉ）〕
（１）ヒトｉＰＳ細胞
　ヒトｉＰＳ細胞は３２Ｒ１（Masato Nakagawa, Nanako Takizawa, Megumi Narita, Tomoko Ichisaka, Shinya Yamanaka, “Promotion of direct reprogramming by transformation-deficient Myc.”, Proceedings of the National Academy of Sciences, 107(32), 14152-14157, 2010）を使用した。３２Ｒ１細胞は、ＭＳＴＯマウスフィーダー細胞上で維持した（Kazutoshi Takahashi, Koji Tanabe, Mari Ohnuki, Megumi Narita, Tomoko Ichisaka, Kiichiro Tomoda, Shinya Yamanaka, “Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors.”, Cell,131(5), 861-872, 2007）。
（２）細胞外基質
　細胞外基質として、Ｐｌｕｓ＃１ラミニンＥ８、Ｐｌｕｓ＃２ラミニンＥ８およびマトリゲルを用いた。Ｐｌｕｓ＃１ラミニンＥ８溶液とＰｌｕｓ＃２ラミニンＥ８溶液をリン酸緩衝生理的食塩水で希釈した後、６ウェルマイクロプレートに０．５μｇ／ｃｍ２の濃度で添加し、４℃で一晩静置、または３７℃で１時間静置してコーティングを行った。マトリゲル溶液はＤＭＥＭ／Ｆ１２溶液で希釈した後、６ウェルマイクロプレートに３５μｇ／ｃｍ２の濃度で添加し、室温で１時間静置してコーティングを行った。
（３）細胞の継代および観察
　フィーダー細胞上で培養した３２Ｒ１細胞をリン酸緩衝生理的食塩水で洗浄し、細胞剥離剤（ＣＴＫ溶液）を加え３７℃で２分間程度処理しフィーダー細胞を除去した。その後、セルスクレーパーにて３２Ｒ１細胞を回収し、細胞外基質をコーティングしたウェルに３２Ｒ１細胞を播種した。２４時間ごとに培地を交換した。５日目に細胞の状態を観察して写真撮影した（１ｓｔ Ｐａｓｓａｇｅ）。７日目および１４日目に細胞を継代し、２１日目に細胞の状態を観察して写真撮影した（３ｒｄ Ｐａｓｓａｇｅ）。
（４）結果
　ヒトｉＰＳ細胞（３２Ｒ１細胞）の観察結果を図３に示した。上段の１ｓｔ Ｐａｓｓａｇｅは、各種細胞外基質をコーティングした培養器で培養を開始してから５日目の細胞の状態を示す写真であり、中段および下段の３ｒｄ Ｐａｓｓａｇｅは、２回継代した後（各種細胞外基質をコーティングした培養器で培養を開始してから２１日目）の細胞の状態を示す写真である。１ｓｔ Ｐａｓｓａｇｅ（５日目）では、マトリゲルコーティング上ではほとんど細胞が残っていなかったのに対して、Ｐｌｕｓ＃１ラミニンＥ８コーティング上、およびＰｌｕｓ＃２ラミニンＥ８コーティング上では、ヒトｉＰＳ細胞が生着していた。３ｒｄ Ｐａｓｓａｇｅ（２１日目）では、ヒトｉＰＳ細胞のコロニーを観察することができ、Ｐｌｕｓ＃１ラミニンＥ８コーティング上、およびＰｌｕｓ＃２ラミニンＥ８コーティング上でヒトｉＰＳ細胞を継続して培養できることが明らかとなった。Ｐｌｕｓ＃１ラミニンＥ８とＰｌｕｓ＃２ラミニンＥ８を比較すると、Ｐｌｕｓ＃２ラミニンＥ８コーティング上のほうが、Ｐｌｕｓ＃１ラミニンＥ８コーティング上より細胞の数が多いことが確認された。
〔実施例４：Ｐｌｕｓ＃２ラミニンＥ８の組換えヒトα５β１インテグリンまたはα６β１インテグリンに対する結合活性〕
（１）実験方法
　Ｐｌｕｓ＃２ラミニンＥ８、ｒｈＬＭ５１１Ｅ８またはフィブロネクチンと、組換えヒトα５β１インテグリンまたはα６β１インテグリンとの結合活性を測定した。フィブロネクチンは、Sekiguchiらの方法（Kiyotoshi Sekiguchi and Sen-itiroh Hakomori, “Domain structure of human plasma fibronectin. Differences and similarities between human and hamster fibronectins.”, The Journal of Biological Chemistry, 258, 3967-3973, 1983）に従い、ゼラチン不溶化アフィニティーカラムを用いて精製したものを使用した。組換えヒトα５β１インテグリンはTakagiらが作製した発現ベクターを用いて作製した（Junichi Takagi, Harold P. Erickson, and Timothy A. Springer, “C-terminal opening mimics 'inside-out' activation of integrin alpha5beta1.”, Nature structural & molecular biology, 8(5), 412-416, 2001）。この組換えヒトα５β１インテグリンはα５サブユニットとβ１サブユニットの細胞外ドメインから構成されている。また、両サブユニットを２量体化するために、α５のＣ末端部には主に酸性アミノ酸残基と疎水性アミノ酸残基からなる配列が、また、β１のＣ末端部には主に塩基性アミノ酸残基と疎水性アミノ酸残基からなる配列がそれぞれ付加されている。さらに、α５のＣ末端部にはＦＬＡＧタグ、β１のＣ末端部には６×Ｈｉｓタグが付加されている。組換えヒトインテグリンα６β１はIdoらの方法（Hiroyuki Ido, Kenji Harada, Yoshiko Yagi, Kiyotoshi Sekiguchi, “Probing the integrin-binding site within the globular domain of laminin-511 with the function-blocking monoclonal antibody 4C7.”, Matrix Biology, 25(2), 112-117, 2006）に従い作製した。分子構造は上記組換えヒトα５β１インテグリンと同様である。
　リン酸緩衝生理的食塩水（Invitrogen、#10010－023）でＰｌｕｓ＃２ラミニンＥ８溶液、ｒｈＬＭ５１１Ｅ８溶液、フィブロネクチン溶液を希釈した後、ＢＤ ＦＡＬＣＯＮ ＭＩＣＲＯＴＥＳＴ９６ウェルマイクロプレート（商品名、BD Biosciences、#353072）に添加し、４℃で一晩静置してコーティングを行った。なお、モル量を考慮し、Ｐｌｕｓ＃２ラミニンＥ８溶液は０．４μｇ／ｃｍ２、ｒｈＬＭ５１１Ｅ８溶液は０．３２μｇ／ｃｍ２、フィブロネクチン溶液は０．５９μｇ／ｃｍ２の各濃度でコートした。
　１％（重量／体積）の牛血清アルブミンと０．０２％（体積／体積）のＴｗｅｅｎ－２０を含むトリス緩衝生理的食塩水でウェルをブロッキングした後、１０ｎＭの組換えヒトα５β１インテグリンまたはα６β１インテグリンを１ｍＭのＭｎ２＋存在下、室温で３時間反応させた。１ｍＭのＭｎ２＋と０．１％（重量／体積）の牛血清アルブミンと０．０２％（体積／体積）のＴｗｅｅｎ－２０を含むトリス緩衝生理的食塩水（以下、「１ｍＭ Ｍｎ２＋／０．１％ ＢＳＡ／ＴＢＳ－Ｔ０．０２」と記す）でウェルを３回洗浄した後、組換えインテグリンの２量体化部位を認識するビオチン化ウサギポリクローナル抗体を１ｍＭのＭｎ２＋存在下、室温で３時間反応させた。１ｍＭ Ｍｎ２＋／０．１％ ＢＳＡ／ＴＢＳ－Ｔ０．０２でウェルを３回洗浄した後、ＨＲＰ標識したストレプトアビジンを１ｍＭのＭｎ２＋存在下、室温で１５分間反応させた。１ｍＭ Ｍｎ２＋／０．１％ ＢＳＡ／ＴＢＳ－Ｔ０．０２でウェルを３回洗浄した後、ｏ－フェニレンジアミン／Ｈ２Ｏ２溶液を加え、発色反応を行った。反応の停止には、２．５Ｍ Ｈ２ＳＯ４を用いた。発色強度の定量にはマルチプレートリーダーを用い、波長４９０ｎｍの吸光度を測定した。
（２）結果
　結果を図４に示した。Ｐｌｕｓ＃２ラミニンＥ８はヒトフィブロネクチンと同程度の組換えヒトα５β１インテグリンに対する結合活性を示した。また、ｒｈＬＭ５１１Ｅ８は組換えヒトα５β１インテグリンに対する結合活性を示さなかった。一方、Ｐｌｕｓ＃２ラミニンＥ８はｒｈＬＭ５１１Ｅ８と同程度の組換えヒトα６β１インテグリンに対する結合活性を示した。また、ヒトフィブロネクチンはヒトα６β１インテグリンに対する結合活性を示さなかった。以上の結果から、Ｐｌｕｓ＃２ラミニンＥ８はα５β１インテグリンとα６β１インテグリンに対する結合活性を有する組換えタンパク質であることが示された。
〔実施例５：各種細胞外基質をコーティングした培養器におけるヒトＥＳ細胞の単一分散培養〕
（１）ヒトＥＳ細胞
　ヒトＥＳ細胞はＮａｔｉｏｎａｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｂａｎｋより購入したＨ９株を使用した。フィーダー細胞には、マイトマイシンＣで処理し細胞分裂を止めたＳＮＬ細胞（McMahon, A. P. & Bradley, A. Cell 62, 1073－1085 (1990)）を用い、Ｈ９細胞のフィーダー細胞上への播き直しを行った。培地には霊長類ＥＳ細胞培養用培地（ReproCELL）を用い、共培養を行った。
（２）細胞外基質
　細胞外基質として、（全長ラミニン５１１は、Ｉｄｏら（Hiroyuki Ido, Kenji Harada, Sugiko Futaki, Yoshitaka Hayashi, Ryoko Nishiuchi, Yuko Natsuka, Shaoliang Li, Yoshinao Wada, Ariana C. Combs, James M. Ervasti, and Kiyotoshi Sekiguchi, “Molecular dissection of the α-dystroglycan- and integrin-binding sites within the globular domain of human laminin-10” Jhe Journal of Biological Chemistry, 279, 10946-10954, 2004.）に記載の方法に従って作製した。
（３）ヒトＥＳ細胞の培養
　Ｈ９細胞は以下の方法により、ＳＮＬフィーダー細胞との共培養系から回収した。
（３－１）培地の準備
　必要量の維持培養培地（ｍＴｅＳＲ１（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）とＮｕｔｒｉＳｔｅｍ（コスモバイオ社）の１：１混合溶液）に１／１０００量の１０ｍＭ Ｙ－２７６３２を加えた。
（３－２）プレートのコーティング
　６ウェルマイクロプレートにＰＢＳ（－）を１．５ｍｌ／ｗｅｌｌを入れ、Ｐｌｕｓ＃１ラミニンＥ８（コート量：０．５μｇ／ｃｍ２）を４．８μｇ／ｗｅｌｌ加え、３７℃ ＣＯ２ ５％インキュベーターで６０分反応させた後、維持培養培地１ｍｌ／ｗｅｌｌ加え培地をなじませた後、上澄みを除去した。同様に、Ｐｌｕｓ＃２ラミニンＥ８をコーティングしたウェルマイクロプレートを準備した。全長ラミニン５１１も同様にコーティングした（コート量：２．０μｇ／ｃｍ２）。それぞれのコーティングプレートは、維持培養培地（Ｙ－２７６３２入り）を１．５ｍｌ／ｗｅｌｌ加え、インキュベーター下で保管した。なお、マトリゲル溶液については上記条件下で、０．１～３０μｇ／ｃｍ２の範囲になるようにプレートへ添加した。
（３－３）フィーダー細胞の除去
　培地を除去し、ＰＢＳ４ｍｌで一回洗浄した後に、ＰＢＳを完全に吸引除去し、ＣＴＫ液を０．５ｍｌ加え、３７℃でインキュベートした。殆どのフィーダー細胞が剥がれたらＣＴＫ液を吸引し、４ｍｌのＰＢＳで１回洗浄、その後にＸ０．５ ＴｒｙｐＬＥ Ｓｅｌｅｃｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社より購入）を６００μｌ／ｗｅｌｌずつ加えてなじませ、３７℃ ＣＯ２ ５％インキュベーターで１分さらに３分反応させた。その後、インキュベーターから取り出し顕微鏡で細胞の様子を観察し、細胞間接着が破壊され細胞が丸くなっている様子を確認した。先に加えたＸ０．５ ＴｒｙｐＬＥ Ｓｅｌｅｃｔを除去し、維持培養培地を３ｍｌ／ｗｅｌｌ加えた後にセルスクレーパーで細胞を剥がした。
（３－４）細胞の培養
　フィーダー細胞を除去し、単一に分散したＨ９細胞１３，０００個を上記にて予め調製したコーティングプレート（6-well plate）に播種し、３７℃ ＣＯ２ ５％インキュベーターで単一分散培養を行った。翌日、維持培養用培地に交換した。培地交換は１日おきに行い、培養開始後６、７日頃から毎日行った。
（４）結果
　各種細胞外基質をコーティングした培養器でＨ９細胞の単一分散培養を行い、７日間培養を行った後、増殖した細胞コロニーをアルカリフォスファターゼ（ＡＬＰ）染色した結果を図５に示した。図５中、上段左からコートなし（図中、Ｎｏｎｅ）、マトリゲルコート（図中、Ｍａｔｒｉｇｅｌ）、全長ラミニン５１１コート（図中、ＬＮ５１１ＦＬ）、下段左からＰｌｕｓ＃１ラミニンＥ８コート（図中、ＬＮ５１１Ｅ８ｐｌｕｓ＃１）、Ｐｌｕｓ＃２ラミニンＥ８コート（図中、ＬＮ５１１Ｅ８ｐｌｕｓ＃２）である。アルカリフォスファターゼ染色により、下段のＰｌｕｓ＃１ラミニンＥ８コートおよびＰｌｕｓ＃２ラミニンＥ８コートの培養器においてＨ９細胞の良好な増殖が観察された。一方、上段のコートなしおよびマトリゲルコートの培養器ではＨ９細胞はほとんど観察されなかった。以上の結果から、Ｐｌｕｓ＃１ラミニンＥ８またはＰｌｕｓ＃２ラミニンＥ８をコーティングした培養基材を用いれば、単一分散によるヒトＥＳ細胞の培養方法を容易に提供できることが示された。
〔実施例６：各種細胞外基質をコーティングした培養器におけるヒトｉＰＳ細胞の継代培養（ＩＩ）〕
（１）ヒトｉＰＳ細胞
　ヒトｉＰＳ細胞には、成人皮膚由来線維芽細胞（ａＨＤＦ－Ｓｌｃ７ａｌ）に対してＯｃｔ３／４、ＫＬＦ４、ＳＯＸ２、およびＬ－ＭＹＣの４遺伝子をレトロウイルスを用いて導入することにより樹立された３２Ｒ１細胞（Masato Nakagawa, Nanako Takizawa, Megumi Narita, Tomoko Ichisaka, Shinya Yamanaka, “Promotion of direct reprogramming by transformation-deficient Myc.”, Proceedings of the National Academy of Sciences, 107(32), 14152-14157, 2010）を使用した。
（２）細胞外基質
　Ｐｌｕｓ＃１ラミニンＥ８、Ｐｌｕｓ＃２ラミニンＥ８、Ｐｌｕｓ＃３ラミニンＥ８（ｒｈＬＭ５１１Ｅ８とヒトパールカンのドメインＩ～IIIを融合させた改変ラミニン）、ｒｈＬＭ５１１Ｅ８およびマトリゲルを使用した。Ｐｌｕｓ＃３ラミニンＥ８は、ｒｈＬＭ５１１Ｅ８を作製した後に、ヒトラミニンβ１鎖のＥ８のＮ末端部にヒトパールカンのドメインＩ～III（以下「Ｐｌｎ－Ｄ１／２／３」と記す）を付加して、以下のとおり作製した。
（２－１）ヒトラミニンα５鎖、β１鎖、γ１鎖の各Ｅ８フラグメント発現ベクターの作製
　上記（１－１）と同様の方法でヒトラミニンα５鎖Ｅ８フラグメント（Ｎ末端側に６×Ｈｉｓタグを含む）、β１鎖Ｅ８フラグメント（Ｎ末端側にＨＡタグを含む）、γ１鎖Ｅ８フラグメント（Ｎ末端側にＦＬＡＧタグを含む）の発現ベクターをそれぞれ作製した。
（２－２）Ｐｌｎ－Ｄ１／２／３融合ヒトラミニンβ１鎖Ｅ８フラグメント発現ベクターの作製
　５’側から、マウスＩｇ－κ鎖Ｖ－Ｊ２－Ｃシグナルペプチド－Ｐｌｎ－Ｄ１／２／３－ＨＡタグ－β１鎖Ｅ８を順にコードするＤＮＡ断片を獲得するために、Ｐｌｎ－Ｄ１／２／３をコードするＤＮＡ断片を取得し、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩで消化した。消化産物をヒトラミニンβ１鎖Ｅ８フラグメント発現ベクターの当該部位に挿入し、Ｐｌｎ－Ｄ１／２／３融合ヒトラミニンβ１鎖Ｅ８フラグメント発現ベクターを作製した。
　まず、ヒトパールカン発現ベクター（Shaoliang Li, Chisei Shimono, Naoko Norioka, Itsuko Nakano, Tetsuo Okubo, Yoshiko Yagi, Maria Hayashi, Yuya Sato, Hitomi Fujisaki, Shunji Hattori, Nobuo Sugiura, Koji Kimata and Kiyotoshi Sekiguchi, “Activin A Binds to Perlecan through Its Pro-region That Has Heparin/Heparan Sulfate Binding Activity”, Journal of Biological Chemistry, 285(47), 36645-36655, 2010）を鋳型として、以下のプライマーを用いてＰＣＲを行い、Ｐｌｎ－Ｄ１／２／３に相当する領域（Gly25－Glu1680）を増幅した。なお、プライマーの５’側には制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ認識配列が付加されている。得られたＤＮＡ断片を、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩで消化し、ヒトラミニンβ１鎖Ｅ８フラグメント発現ベクターの当該部位に挿入し、Ｐｌｎ－Ｄ１／２／３融合ヒトラミニンβ１鎖Ｅ８フラグメント発現ベクターを作製した。
(xiv) Ｐｌｎ－Ｄ１／２／３配列増幅用プライマー
　　5’-ACGAAGCTTGGGCTGAGGGCATACGATGGC-3’（forward、配列番号２３）
　　5’-ATAAAGCTTCTCGACCACCAGTGGGGCTTGG-3’（reverse、配列番号２４）
（２－３）Ｐｌｕｓ＃３ラミニンＥ８の発現および精製
　実施例１の（３）と同様の方法で、Ｐｌｕｓ＃３ラミニンＥ８の発現および精製を行った。すなわち、ヒトα５鎖Ｅ８フラグメント発現ベクター、Ｐｌｎ－Ｄ１／２／３融合ヒトラミニンβ１鎖Ｅ８フラグメント発現ベクターおよびヒトγ１鎖Ｅ８フラグメント発現ベクターを２９３－Ｆ細胞に導入した以外は、実施例１の（３）と同様に行った。
（３）ヒトｉＰＳ細胞の培養
　３２Ｒ１細胞は以下の方法により、ＳＮＬフィーダー細胞との共培養系から回収した。
（３－１）培地の準備
　必要量の維持培養培地（ｍＴｅＳＲ１（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）とＮｕｔｒｉＳｔｅｍ（コスモバイオ社）の１：１混合溶液）に１／１０００量の１０ｍＭ Ｙ－２７６３２を加えた。
（３－２）プレートのコーティング
　６ウェルマイクロプレートにＰＢＳ（－）を１．５ｍｌ／ｗｅｌｌを入れ、Ｐｌｕｓ＃１ラミニンＥ８（コート量：０．５μｇ／ｃｍ２）を４．８μｇ／ｗｅｌｌ加え、３７℃ ＣＯ２ ５％インキュベーターで６０分反応させた後、維持培養培地1ｍｌ／ｗｅｌｌ加え培地をなじませた後、上澄みを除去した。同様に、Ｐｌｕｓ＃２および＃３ラミニンＥ８をコーティングしたウェルマイクロプレートを準備した（いずれもコート量は０．５μｇ／ｃｍ２）。それぞれのコーティングプレートは、維持培養培地（Ｙ－２７６３２入り）を１．５ｍｌ／ｗｅｌｌ加え、インキュベーター下で保管した。なお、マトリゲル溶液については上記条件下で、０．１～３０μｇ／ｃｍ２の範囲になるようにプレートへ添加した。
（３－３）フィーダー細胞の除去
　培地を除去し、ＰＢＳ４ｍｌで一回洗浄した後に、ＰＢＳを完全に吸引除去し、ＣＴＫ液を０．５ｍｌ加え、３７℃でインキュベートした。殆どのフィーダー細胞が剥がれたらＣＴＫ液を吸引し、４ｍｌのＰＢＳで１回洗浄、その後にＸ０．５ ＴｒｙｐＬＥ Ｓｅｌｅｃｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社より購入）を６００μｌ／ｗｅｌｌずつ加えてなじませ、３７℃ ＣＯ２ ５％インキュベーターで１分さらに３分反応させた。その後、インキュベーターから取り出し顕微鏡で細胞の様子を観察し、細胞間接着が破壊され細胞が丸くなっている様子を確認した。先に加えたＸ０．５ ＴｒｙｐＬＥ Ｓｅｌｅｃｔを除去し、持培養用培地を３ｍｌ／ｗｅｌｌ加えた後にセルスクレーパーで細胞を剥がした。
（３－４）細胞の培養
　フィーダー細胞を除去し、単一に分散した３２Ｒ１細胞１３，０００個を上記にて予め調製したコーティングプレート（6-well plate）に播種し、３７℃ ＣＯ２ ５％インキュベーターで単一分散培養を行った。翌日、維持培養用培地に交換した。培地交換は１日おきに行い、培養開始後６、７日頃から毎日行った。細胞の継代は７～９日ごとに行った。培養開始７日目の継代前の細胞の状態を写真撮影した（対物４倍）。その後１０代継代培養を行った後、Ｏｃｔ３／４、ＳＳＥＡ－４およびＴＲＡ－１－６０について免疫染色を行い、位相差像および蛍光像を写真撮影した（それぞれ対物１０倍）。
（４）結果
　培養開始７日目における継代前のヒトｉＰＳ細胞の状態を図６に示した。図６中、上段左からマトリゲルコート（図中、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（コート量：３０μｇ／ｃｍ２））、ｒｈＬＭ５１１Ｅ８コート（図中、Ｅ８）、Ｐｌｕｓ＃１ラミニンＥ８コート（図中、Ｅ８ｐｌｕｓ＃１）、下段左からＰｌｕｓ＃２ラミニンＥ８コート（図中、Ｅ８ｐｌｕｓ＃２）、Ｐｌｕｓ＃３ラミニンＥ８コート（図中、Ｅ８ｐｌｕｓ＃３）である。各種細胞外基質をコーティングした培養器において、３２Ｒ１細胞の生着が確認された。
　Ｐｌｕｓ＃１ラミニンＥ８またはＰｌｕｓ＃２ラミニンＥ８をコーティングした培養器を用いて１０代継代培養を行ったヒトｉＰＳ細胞における免疫染色の結果を図７に示した。図７中、上２段はＰｌｕｓ＃１ラミニンＥ８（図中、ＬＮ５１１Ｅ８ｐｌｕｓ＃１）をコートした培養器を用いた結果であり、下２段はＰｌｕｓ＃２ラミニンＥ８（図中、ＬＮ５１１Ｅ８ｐｌｕｓ＃２）をコートした培養器を用いた結果である。各上段位相差像（ＰＨ）であり、下段が免疫蛍光像（ＦＬ）である。図７から明らかなように、未分化のＥＳ細胞およびｉＰＳ細胞のマーカーであるＯｃt３／４、ＳＳＥＡ－４、ＴＲＡ－１－６０の全てが陽性であったことから、Ｐｌｕｓ＃１ラミニンＥ８またはＰｌｕｓ＃２ラミニンＥ８をコーティングした培養基材を用いれば、１０代継代培養を行った後も未分化状態が維持されていることが示された。
〔実施例７：各種細胞外基質をコーティングした培養器におけるヒトｉＰＳ細胞の単一分散培養〕
（１）ヒトｉＰＳ細胞
　実施例３、６と同じ３２Ｒ１細胞を使用した。
（２）細胞外基質
　実施例５と同様に、Ｐｌｕｓ＃１ラミニンＥ８、Ｐｌｕｓ＃２ラミニンＥ８、全長ラミニン５１１およびマトリゲルを使用した。
（３）ヒトｉＰＳ細胞の培養
　実施例３と同様にプレートのコーティングを行った。実施例６と同様にフィーダー細胞を除去し、単一に分散した３２Ｒ１細胞１３，０００個を、予め調製したコーティングプレート（6-well plate）に播種し、３７℃ ＣＯ２ ５％インキュベーターで単一分散培養を行った。翌日、維持培養用培地に交換した。培地交換は１日おきに行い、培養開始後６、７日頃から毎日行った。
（４）結果
　各種細胞外基質をコーティングした培養器で３２Ｒ１細胞の単一分散培養を行い、７日間培養を行った後、増殖した細胞コロニーをアルカリフォスファターゼ（ＡＬＰ）染色した結果を図８に示した。図８中、上段左からコートなし（図中、Ｎｏｎｅ）、マトリゲルコート（図中、Ｍａｔｒｉｇｅｌ）、全長ラミニン５１１コート（図中、ＬＮ５１１ＦＬ）、下段左からＰｌｕｓ＃１ラミニンＥ８コート（図中、ＬＮ５１１Ｅ８ｐｌｕｓ＃１）、Ｐｌｕｓ＃２ラミニンＥ８コート（図中、ＬＮ５１１Ｅ８ｐｌｕｓ＃２）である。アルカリフォスファターゼ染色により、下段のＰｌｕｓ＃１ラミニンＥ８コートおよびＰｌｕｓ＃２ラミニンＥ８コートの培養器において３２Ｒ１細胞の良好な増殖が観察された。一方、上段のコートなしおよびマトリゲルコートの培養器では３２Ｒ１細胞はほとんど観察されなかった。以上の結果から、Ｐｌｕｓ＃１ラミニンＥ８またはＰｌｕｓ＃２ラミニンＥ８をコーティングした培養基材を用いれば、単一分散によるヒトｉＰＳ細胞の培養方法を容易に提供できることが示された。
〔実施例８：ヒトｉＰＳ細胞の樹立〕
（１）実験方法
　上記実施例６および７のように予め樹立されたヒトｉＰＳ細胞株を用いるのではなく、Ｐｌｕｓ＃１ラミニンＥ８またはＰｌｕｓ＃２ラミニンＥ８をコーティングした培養器を用いてヒトｉＰＳ細胞の樹立を試みた。コーティング濃度は０．５μｇ／ｃｍ２とした。具体的には、Ｐｌｕｓ＃１ラミニンＥ８またはＰｌｕｓ＃２ラミニンＥ８をコーティングしたディッシュ上で、米国仮出願６１／５２１，１５３に記載の方法に従い、成人皮膚由来線維芽細胞（ＨＤＦ１３８８細胞）にエピソーマルプラスミドベクターｐＣＥＢ－ｈＳＫ－ＯおよびｐＣＥＢ－ｈＵＬ－Ｇを用いて初期化遺伝子を導入し、維持培養培地（ｍＴｅＳＲ１（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）とＮｕｔｒｉＳｔｅｍ（コスモバイオ社）の１：１混合溶液）で培養を行った。初期化遺伝子の導入後３０日目にヒトｉＰＳ細胞のコロニー数をカウントした。
　ｐＣＥＢ－ｈＳＫ－Ｏエピソーマルプラスミドは、ヒトＳＯＸ２およびヒトＫＬＦ４の各翻訳領域を２Ａ配列を挟んで繋げたコンストラクトとヒトＯＣＴ３／４の翻訳領域を、それぞれ別々のＣＡＧプロモーターの制御下に配置した発現カセットを有するプラスミドである（図１０（Ｉ）参照）。ｐＣＥＢ－ｈＵＬ－Ｇエピソーマルプラスミドは、ヒトＬ－ＭＹＣおよびヒトＬＩＮ２８の各翻訳領域を２Ａ配列を挟んで繋げたコンストラクトと、ヒトＧＬＩＳ１の翻訳領域とを、別々のＣＡＧプロモーターの制御下に配置した発現カセットを有するプラスミドである（図１０（ＩＩ）参照）。
　これらのエピソーマルプラスミドは、Okita et al., “A more efficient method to generate integration-free human iPS cells”, Nature Methods, 8(5), 409 (2011)および国際公報ＷＯ２０１１/０１６５８８に記載のプラスミド等を用いて作製した。
（２）結果
　３つの独立した実験（Ｅｘｐ．１、２、および３）における、ノンコートディッシュ、Ｐｌｕｓ＃１ラミニンＥ８コートディッシュおよびＰｌｕｓ＃２ラミニンＥ８コートディッシュ条件下でのヒトｉＰＳ細胞コロニー数（樹立数）を図９に示した。いずれの実験においても左がノンコートディッシュ、中央がＰｌｕｓ＃１ラミニンＥ８コートディッシュ、右がＰｌｕｓ＃２ラミニンＥ８コートディッシュを表す。図９から明らかなように、Ｅｘｐ．２のＰｌｕｓ＃１ラミニンＥ８コートディッシュを除き、Ｐｌｕｓ＃１ラミニンＥ８コートディッシュまたはＰｌｕｓ＃２ラミニンＥ８コートディッシュにおけるヒトｉＰＳ細胞コロニー数（樹立数）が、ノンコートディッシュより増加した。この結果から、Ｐｌｕｓ＃１ラミニンＥ８またはＰｌｕｓ＃２ラミニンＥ８をコーティングした培養基材は、ｉＰＳ細胞の樹立においても非常に有用であることが示された。
　なお本発明は上述した各実施形態および実施例に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。また、本明細書中に記載された学術文献および特許文献の全てが、本明細書中において参考として援用される。

Claims (18)

  1. 　ラミニン、または、ヘテロ３量体を形成しているラミニンフラグメントのα鎖のＮ末端、α鎖のＣ末端、β鎖のＮ末端およびγ鎖のＮ末端の少なくとも１箇所に細胞増殖制御分子が結合していることを特徴とする改変ラミニン。
  2. 　細胞増殖制御分子が、細胞接着分子である請求項１に記載の改変ラミニン。
  3. 　細胞増殖制御分子が、増殖因子結合分子である請求項１に記載の改変ラミニン。
  4. 　ラミニンフラグメントが、インテグリン結合活性を有していることを特徴とする請求項１～３のいずれかに記載の改変ラミニン。
  5. 　ラミニンフラグメントが、ラミニンＥ８フラグメントである請求項４に記載の改変ラミニン。
  6. 　ラミニンが、α１～α５から選択される１種のα鎖、β１～β３から選択される１種のβ鎖、γ１～γ３から選択される１種のγ鎖からなることを特徴とする請求項１～５のいずれかに記載の改変ラミニン。
  7. 　ラミニンが、ラミニンα５β１γ１またはラミニンα３β３γ２である請求項６に記載の改変ラミニン。
  8. 　細胞接着分子が、以下の（ａ）～（ｅ）から選択される少なくとも１種以上であることを特徴とする請求項２に記載の改変ヒトラミニン。
    （ａ）インテグリンと結合する細胞接着分子
    （ｂ）膜結合型プロテオグリカンと結合する細胞接着分子
    （ｃ）ジスコイジンドメイン受容体と結合する細胞接着分子
    （ｄ）ジストログリカンと結合する細胞接着分子
    （ｅ）細胞表面の糖鎖と結合する細胞接着分子
  9. 　細胞接着分子が、以下の（ａ）～（ｋ）から選択される少なくとも１種以上であることを特徴とする請求項２に記載の改変ヒトラミニン。
    （ａ）フィブロネクチンまたはその細胞接着活性部位を含むフラグメント
    （ｂ）コラーゲンまたはその細胞接着活性部位を含むフラグメント
    （ｃ）ビトロネクチンまたはその細胞接着活性部位を含むフラグメント
    （ｄ）ネフロネクチンまたはその細胞接着活性部位を含むフラグメント
    （ｅ）オステオポンティンまたはその細胞接着活性部位を含むフラグメント
    （ｆ）ＭＡＥＧまたはその細胞接着活性部位を含むフラグメント
    （ｇ）テネイシンまたはその細胞接着活性部位を含むフラグメント
    （ｈ）ＳＶＥＰ１またはその細胞接着活性部位を含むフラグメント
    （ｉ）ＴＧＦ－β１ ｌａｔｅｎｃｙ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｐｅｐｔｉｄｅまたはその細胞接着活性部位を含むフラグメント
    （ｊ）ＴＧＦ－β３ ｌａｔｅｎｃｙ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｐｅｐｔｉｄｅまたはその細胞接着活性部位を含むフラグメント
    （ｋ）ラミニンα鎖の球状ドメイン４および／または５
  10. 　増殖因子結合分子が、以下の（ａ）～（ｆ）から選択される少なくとも１種以上であることを特徴とする請求項３に記載の改変ヒトラミニン。
    （ａ）パールカンまたはその増殖因子結合部位を含むフラグメント
    （ｂ）アグリンまたはその増殖因子結合部位を含むフラグメント
    （ｃ）ＸＶＩＩＩ型コラーゲンまたはその増殖因子結合部位を含むフラグメント
    （ｄ）シンデカンまたはその増殖因子結合部位を含むフラグメント
    （ｅ）グリピカンまたはその増殖因子結合部位を含むフラグメント
    （ｆ）ｌａｔｅｎｔ ＴＧＦ－β ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎまたはその増殖因子結合部位を含むフラグメント
  11. 　ヒト由来である請求項１～１０のいずれかに記載の改変ラミニン。
  12. 　哺乳動物細胞の培養方法であって、請求項１～１１のいずれかに記載の改変ヒトラミニンの存在下で培養することを特徴とする培養方法。
  13. 　哺乳動物細胞が、ＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞または体性幹細胞である請求項１２に記載の培養方法。
  14. 　フィーダー細胞を用いないことを特徴とする請求項１２または１３に記載の培養方法。
  15. 　請求項１～１１のいずれかに記載の改変ヒトラミニンがコーティングされていることを特徴とする培養基材。
  16. 　改変ヒトラミニンが０．０３～２５μｇ／ｃｍ２の濃度でコーティングされていることを特徴とする請求項１５に記載の培養基材。
  17. 　請求項１～１１のいずれかに記載の改変ラミニンの存在下で、核初期化物質を体細胞に接触させる工程を含むことを特徴とするｉＰＳ細胞の樹立方法。
  18. 　前記核初期化物質は、Ｏｃｔファミリー、Ｓｏｘファミリー、Ｋｌｆファミリー、ＬｉｎファミリーおよびＧｌｉｓファミリー並びにそれらをコードする核酸からなる群より選択される１種類以上の物質を含むことを特徴とする請求項１７に記載のｉＰＳ細胞の樹立方法。
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