WO2012108493A1 - 発酵法による目的物質の製造法 - Google Patents

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WO2012108493A1
WO2012108493A1 PCT/JP2012/052947 JP2012052947W WO2012108493A1 WO 2012108493 A1 WO2012108493 A1 WO 2012108493A1 JP 2012052947 W JP2012052947 W JP 2012052947W WO 2012108493 A1 WO2012108493 A1 WO 2012108493A1
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protein
gene
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fruka
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哲朗 氏原
阿部 哲也
誠 矢ヶ崎
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協和発酵バイオ株式会社
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    • Y02P20/52Improvements relating to the production of bulk chemicals using catalysts, e.g. selective catalysts

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing a target substance using a coryneform bacterium in which the activity of a PTS protein related to fructose uptake is reduced or lost compared to a parent strain, and the target substance can be produced.
  • one method for improving the productivity is a method for modifying the ability to take up sugar as a raw material.
  • the mechanism of carbohydrate uptake, including sugars, in microorganisms has been researched and is known to be classified into several types.
  • transporters that take in the main sugars by phosphorylation in particular examples thereof include a phosphoenolpyruvate: sugar phosphate transfer system (hereinafter also referred to as PTS or phosphotransferase system) (Non-patent Document 1).
  • the PTS system consists of a substrate independent common system EI (encoded by ptsI), HPr (encoded by ptsH) and a substrate-specific component EII (Non-Patent Documents 2 to 4).
  • Substrate-specific EII varies depending on the organism, but the major intestinal bacteria and coryneform bacteria that have been studied are being identified. Among them, fructose-specific EII is FruA (PtsF). (Non-patent Document 5).
  • FruA which incorporates fructose from the outside and converts it to fructose monophosphate
  • fructose monophosphate is converted to fructose 1,6-bisphosphate, an important intermediate in glycolysis.
  • FruK FruK
  • Patent Document 1 an amino acid production method using an Escherichia bacterium with enhanced ptsG gene (Patent Document 1) or an amino acid production method using an Escherichia bacterium with enhanced crr gene that functions similarly to ptsH, ptsI, and ptsG
  • Patent Document 2 an amino acid production method using an Escherichia bacterium with enhanced crr gene that functions similarly to ptsH, ptsI, and ptsG
  • Patent Document 3 a method of promoting the uptake and metabolism of sugars not via the PTS system such as pentose by destroying the main sugar, that is, the PTS system which is an uptake system of glucose or the like.
  • Patent Document 4 a method of promoting the uptake and metabolism of sugars not via the PTS system such as pentose by destroying the main sugar, that is, the PTS system which is an uptake system of glucose or the like.
  • Patent Document 4 by destroying the PTS system, which is a glucose uptake system, and taking it in through another route, the metabolic pathway of sugar can be changed and the productivity of the target substance can be increased.
  • Patent Document 5 It is also known that by disrupting the fructose uptake system and introducing an exogenous fructokinase, the metabolic pathway of sugar can be changed to increase productivity.
  • This invention makes it a subject to improve a sugar consumption rate, when producing a useful substance by a fermentation method using coryneform bacteria.
  • the present invention relates to the following (1) to (6).
  • a coryneform bacterium having a reduced or lost activity of a PTS protein related to fructose uptake compared to the parent strain and capable of producing a target substance is cultured in a medium, and the target substance is contained in the culture. And producing the target substance, and collecting the target substance from the culture.
  • Coryneform bacteria capable of producing the target substance with reduced or lost activity of the PTS protein related to fructose uptake compared to the parent strain encode the protein present on the chromosomal DNA of the parent strain.
  • the production method according to (1) above which is a coryneform bacterium in which the activity of the protein is reduced or lost as compared to the parent strain due to the introduction of a base deletion, substitution or addition into the gene.
  • Amino acids are L-lysine, L-arginine, L-histidine, L-isoleucine, L-valine, L-leucine, L-threonine, L-phenylalanine, L-tyrosine, L-tryptophan, L-cysteine, L -An amino acid selected from the group consisting of -glutamic acid, L-citrulline, L-glutamine, L-proline, L-serine, L-ornithine, L-methionine, L-aspartic acid, L-asparagine, and glycine (1 ) To (5).
  • a target substance can be efficiently produced using a fermentation method.
  • Coryneform bacterium used in the present invention is a coryneform bacterium in which the activity of the PTS protein related to fructose uptake is reduced or lost compared to the parent strain, and produces the target substance. It is a coryneform bacterium that can.
  • Coryneform bacteria whose PTS protein activity related to fructose uptake is reduced or lost compared to the parent strain encodes PTS protein related to wild type fructose uptake that does not contain mutations present on chromosomal DNA
  • PTS protein activity related to fructose uptake is 80% or less, preferably 50% or less, compared with the parent strain More preferably 30% or less, even more preferably 20% or less, particularly preferably 10% or less, most preferably reduced to 0%, and (b) the amount of transcription or fructose of the gene compared to the parent strain.
  • the production amount of PTS protein related to uptake is 80% or less, preferably 50% or less, more preferably 30% or less, and still more preferably 20 Or less, particularly preferably 10% or less, most preferably be mentioned coryneform bacteria decreased to 0%. More preferable examples include coryneform bacteria in which part or all of the gene encoding FruK protein or FruA protein is deleted.
  • the gene encoding the FruA protein may be any gene that encodes a polypeptide having FruA activity that takes in fructose and controls the reaction to fructose 1-phosphate, and the gene encoding the FruK protein includes fructose 1 Any DNA may be used as long as it encodes a polypeptide having FruK activity that controls the reaction from phosphate to fructose 1,6-bisphosphate.
  • a gene encoding a protein exhibiting fructose uptake activity together with a protein having an acid sequence [5] A gene having a base sequence represented by SEQ ID NO: 3 [6] A gene having a base sequence represented by SEQ ID NO: 4 [7 ] Fructose uptake activity together with a DNA having a base sequence complementary to the base sequence represented by SEQ ID NO: 3 and a protein having an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 that hybridizes under stringent conditions
  • a gene is DNA that may contain a transcriptional regulatory region, a promoter region, and the like in addition to a protein coding region.
  • the transcriptional regulatory region include DNA consisting of 100 bases upstream from the 5 'end of the coding region on the chromosomal DNA, preferably 50 bases.
  • the promoter region is a region corresponding to the -10 and -35 regions. Can give.
  • the promoter and transcriptional regulatory region are preferably 10 bases or more, more preferably 20 bases or more, and even more preferably the entire region is deleted. Preferably, it is 10 bases or more, more preferably 20 bases or more, still more preferably 100 bases or more, particularly preferably 200 bases or more, and most preferably deletion of the entire coding region.
  • Base substitution is within 150th base from the 5 'end of the coding region, preferably within 100th base, more preferably within 50th base, particularly preferably within 30th base, most preferably 20th base. Substitutions that introduce nonsense codons by substituting the bases within [An Introduction to Genetic Analysis 7th edition, WHFreeman (2000)].
  • Base addition is within 150th base from the 5 'end of the coding region, preferably within 100th base, more preferably within 50th base, particularly preferably within 30th base, most preferably 20th base.
  • the DNA fragment of 50 bases or more preferably 100 bases or more, more preferably 200 bases or more, even more preferably 500 bases or more, particularly preferably 1 kb or more can be added.
  • chloramphenicol resistance gene and kanamycin resistance gene can be inserted.
  • the coryneform bacterium in which the activity of the PTS protein related to fructose uptake is reduced or lost from the parent strain is, for example, the amount of transcription of the gene encoding the PTS type protein related to fructose uptake by Northern blotting. Alternatively, the production amount of PTS protein related to fructose uptake can be confirmed by comparing with the parent strain by Western blotting.
  • hybridize means that the DNA hybridizes to DNA having a specific base sequence or a part of the DNA. Therefore, the DNA having the specific base sequence or a part thereof can be used as a probe for Northern or Southern blot analysis, or can be used as an oligonucleotide primer for PCR analysis. Examples of the DNA used as a probe include at least 100 bases, preferably 200 bases or more, more preferably 500 bases or more. The DNA used as a primer is at least 10 bases, preferably 15 bases. The above DNA can be mentioned.
  • DNA hybridization experiment methods are well known. For example, those skilled in the art can determine hybridization conditions according to the present specification. The hybridization conditions are described in Molecular Cloning 2nd Edition, 3rd Edition (2001), Methods General and Molecular Bacteriology, ASM Press (1994), Immunology methods manual, Academic press (1996). Can be done according to other standard textbooks.
  • DNA that hybridizes under stringent conditions can be obtained by following the instructions attached to the commercially available hybridization kit.
  • Examples of commercially available hybridization kits include kits in which probes are prepared by the random prime method and hybridization is performed under stringent conditions.
  • DNA-immobilized filter and probe DNA are 50% formamide, 5 ⁇ SSC (750 mmol / l sodium chloride, 75 mmol / l sodium citrate), 50 mmol / l phosphoric acid. After incubation overnight at 42 ° C. in a solution containing sodium (pH 7.6), 5 ⁇ Denhardt's solution, 10% dextran sulfate, and 20 ⁇ g / l denatured salmon sperm DNA, X Conditions for washing the filter in SSC solution are preferred, but lower stringent conditions can also be used. Stringent conditions can be changed by adjusting the formamide concentration (lower stringent concentration reduces the stringency), and changing the salt concentration and temperature conditions.
  • low stringent conditions for example, 6 ⁇ SSCE (20 ⁇ SSCE is 3 mol / l sodium chloride, 0.2 mol / l sodium dihydrogen phosphate, 0.02 mol / l EDTA, pH 7.4), 0.5% Incubate overnight at 37 ° C in a solution containing SDS, 30% formamide, 100 ⁇ g / l denatured salmon sperm DNA, then wash with 50 ° C 1x SSC, 0.1% SDS solution.
  • examples of lower stringent conditions include conditions in which hybridization is performed using a solution having a high salt concentration (for example, 5 ⁇ SSC) under the above-described low stringency conditions and then washed.
  • the various conditions described above can also be set by adding or changing a blocking reagent used to suppress the background of hybridization experiments.
  • the addition of the blocking reagent described above may be accompanied by a change in hybridization conditions in order to adapt the conditions.
  • the DNA that can hybridize under the above-mentioned stringent conditions includes, for example, a DNA comprising the base sequence represented by SEQ ID NO: 3 or 4 when calculated based on the above-described parameters using BLAST, FASTA, etc. And at least 90% or more, preferably 95% or more, more preferably 97% or more, still more preferably 98% or more, particularly preferably 99% or more.
  • the ability to produce the target substance refers to the ability to produce the target substance to the extent that it can be recovered from the cells or medium when the coryneform bacterium used in the present invention is cultured in the medium.
  • Coryneform bacteria capable of producing the target substance include coryneform bacteria with enhanced properties if the parent strain originally has the property, and if the parent strain does not have the property, A coryneform bacterium artificially imparted with properties can be mentioned.
  • coryneform bacteria used in the present invention include coryneform bacteria belonging to the genus Corynebacterium, Brevibacterium, or Microbacterium.
  • Corynebacterium glutamicum As microorganisms belonging to the genus Corynebacterium, Corynebacterium glutamicum, Corynebacterium acetoacidophilum, Corynebacterium acetoglutamicum, Corynebacterium carnae (Corynebacterium callunae), Corynebacterium herculis, Corynebacterium lilium, Corynebacterium melassecola, Corynebacterium thermoaminogenes, etc.
  • the microorganisms belonging to the genus Brevibacterium include Brevibacterium saccharolyticum, Brevibacterium immariophilum, Brevibacterium roseum, Brevibacterium thiogenitalis (Brevibacterium thiogenitalis) and the like, specifically, Brevibacterium saccharolyticum ATCC 14066, Brevibacterium immariophilum ATCC 14068, Brevibacterium roseum ATCC 13825, Brevibacterium thiogenitalis ATCC 19240 and the like.
  • Coryneform bacterium of the present invention can produce a target substance and has the activity of FruK protein and FruA protein (hereinafter also referred to as FruKA activity).
  • the FruKA activity of the parent strain can be introduced into a coryneform bacterium, such as a normal mutation treatment method, a gene replacement method using a recombinant DNA technique, a cell fusion method, or a transduction method. It can be obtained by reducing or losing it using a method or a method capable of suppressing the expression of a gene encoding FruK protein and FruA protein, such as an antisense method.
  • the parent strain may be a wild strain or a breeding strain artificially bred from the wild strain as long as it has the ability to produce the target substance and has FruKA activity. May be.
  • A a method for mitigating or canceling at least one of the mechanisms controlling biosynthesis of a target substance
  • B a method for enhancing expression of at least one enzyme involved in biosynthesis of a target substance
  • C a method for increasing the number of copies of at least one enzyme gene involved in biosynthesis of a target substance
  • D a method of weakening or blocking at least one metabolic pathway that branches from a biosynthetic pathway of a target substance to a metabolite other than the target substance; and (e) a degree of resistance to an analog of the target substance compared to a wild-type strain.
  • the above known methods can be used alone or in combination.
  • coryneform bacteria having the ability to produce L-arginine examples include coryneform bacteria having the ability to produce L-lysine such as Corynebacterium glutamicum RB2631 (WO2006 / 035831). Can be exemplified by Corynebacterium glutamicum AHP-3 (FERM BP-7382).
  • Examples of coryneform bacteria that can be used for the preparation of coryneform bacteria having the ability to produce the target substance described above include coryneform bacteria to which the above methods (a) to (e) can be applied, or the above genetic traits. Any coryneform bacterium may be used, and preferably, the above-described coryneform bacterium belonging to the genus Corynebacterium, Brevibacterium, or Microbacterium. be able to.
  • the mutation treatment method examples include a method using N-methyl-N′-nitro-N-nitrosoguanidine (NTG) (Microbial Experiment Manual, 1986, p. 131, Kodansha Scientific), ultraviolet irradiation method, etc. Can give.
  • NTG N-methyl-N′-nitro-N-nitrosoguanidine
  • FruKA gene FruK protein and FruA protein
  • homologous recombination is performed.
  • the FruKA gene originally present on the chromosome can be replaced by homologous recombination or the like by incorporating the gene into the parent strain chromosome.
  • FruKA gene replacement by recombinant DNA technology can be performed by introducing a mutation into the FruKA gene according to the method described in J. Bacteriol., 182, 6884 (2000) and the like.
  • the FruKA gene has the nucleotide sequence information of the known FruKA gene derived from Corynebacterium glutamicum [for example, National Center for Biotechnology Information (NCBI) accession number NC_006958 REGION: 2012568..2013560, NC_006958 REGION: 2013557..2015623] Can be obtained by PCR method or the like.
  • NCBI National Center for Biotechnology Information
  • a recombinant plasmid is prepared by inserting the FruKA gene into which the mutation has been introduced (hereinafter referred to as a mutant gene) into an appropriate plasmid vector or the like.
  • a plasmid vector for example, a plasmid that cannot autonomously replicate in the parent strain and has a resistance marker gene for antibiotics and a Bacillus subtilis levanshuclease gene sacB [Mol. Microbiol., 6, 1195 (1992)] is used. Can do.
  • any method for introducing a recombinant plasmid having mutant DNA into a parent strain any method can be used as long as it can introduce DNA into coryneform bacteria.
  • electroporation Appl. Microbiol. Biotech., 52, 541 (1999)
  • protoplast method J. Bacteriol., 159, 306 (1984)]. Since the recombinant plasmid cannot autonomously replicate in the parent strain, the recombinant plasmid is integrated into the chromosome by obtaining a strain that is resistant to the antibiotic according to the antibiotic resistance marker of the recombinant plasmid. Transformed strains can be obtained.
  • the FruKA gene on the chromosome of the parent strain can be obtained by a selection method utilizing the production of a suicide substrate by Bacillus subtilis levansucklease incorporated into the chromosome together with the mutant gene [J. Bacteriol., 174, 5462 (1992)].
  • a strain in which is substituted with a mutant gene can be obtained.
  • gene replacement on the chromosome of the parent strain can be performed, but not limited to the above method, other gene replacement methods may be used as long as they can replace genes on the chromosome of coryneform bacteria. it can.
  • substitutions, deletions, or additions into the FruKA gene on the chromosome of the parent strain include cell fusion methods and transduction methods. For example, edited by Hiroshi Aida et al., Amino Acid Fermentation, 1986 The methods described in the Society Publishing Center can be mentioned.
  • the number of bases into which mutations are introduced is not limited as long as FruKA activity can be reduced or lost by base substitution, deletion, or addition of the FruKA gene.
  • the site for introducing the mutation is not necessarily limited to the base sequence of the coding region of the FruKA gene, as long as the mutation can reduce or eliminate the FruKA activity. However, the coding region of the FruKA gene is preferred.
  • Examples of a method for reducing or eliminating FruKA activity by introducing a base substitution include a method by introducing a nonsense mutation.
  • a method for introducing a nonsense mutation for example, PCR is performed using a primer containing a stop codon and the FruKA gene, and the FruKA gene on which the obtained nonsense mutation has been introduced is used to replace the FruKA gene on the parental chromosome. There are methods.
  • the FruK and FruA genes are each cleaved with a restriction enzyme, and an appropriate number of base sequences are deleted and recombined. Examples thereof include a method for incorporating the obtained mutant FruKA gene into a chromosome.
  • a strain having a reduced or lost FruKA activity takes advantage of the fact that growth is delayed or impossible in a medium containing fructose as a single carbon source. In this case, the FruKA activity is reduced or lost by obtaining a strain that does not grow on a medium containing fructose as a single carbon source, or that has grown much worse than the parent strain. Can be obtained.
  • the method for selecting coryneform bacteria having reduced or lost FruKA activity can also be used as a method for selecting coryneform bacteria that have a higher sugar consumption rate than the parent strain and are more suitable for producing useful substances.
  • a coryneform bacterium having the ability to produce the target substance obtained as described above and having reduced or lost FruKA activity compared to the parent strain is cultured in a medium, and the target substance is produced and accumulated in the culture, By collecting the target substance, the target substance can be produced.
  • the coryneform bacterium used in the present invention is also a coryneform bacterium having an improved sugar consumption rate, and can efficiently produce a target substance.
  • Coryneform bacteria can be cultured by a normal method for culturing bacteria having the ability to produce a target substance.
  • the medium any of a synthetic medium or a natural medium can be used as long as it contains a suitable amount of carbon source, nitrogen source, inorganic salts and the like.
  • the carbon source glucose can be mainly used. Although sugars that pass through the PTS system other than glucose can also be used, use of sucrose or fructose is not preferred because FruKA activity is reduced or lost.
  • Nitrogen sources include ammonia, ammonium chloride, ammonium sulfate, ammonium carbonate, ammonium acetate and other inorganic and organic ammonium salts, urea, other nitrogen-containing compounds, meat extract, yeast extract, corn steep liquor, soybean hydrolysate Nitrogen-containing organic substances such as can be used.
  • the inorganic salt potassium monohydrogen phosphate, potassium dihydrogen phosphate, ammonium sulfate, sodium chloride, magnesium sulfate, calcium carbonate and the like can be used.
  • trace nutrient sources such as biotin, thiamine, nicotinamide, and nicotinic acid can be added as necessary.
  • These micronutrient sources can be substituted with medium additives such as meat extract, yeast extract, corn steep liquor, casamino acid and the like.
  • the culture is performed under aerobic conditions such as shaking culture and deep aeration stirring culture.
  • the culture temperature is generally preferably 20 to 42 ° C, more preferably 30 to 40 ° C.
  • the pH of the medium is preferably maintained in the vicinity of neutrality in the range of 5-9.
  • the pH of the medium is adjusted using an inorganic or organic acid, an alkaline solution, urea, calcium carbonate, ammonia, a pH buffer solution, or the like.
  • the culture period is usually 1 to 6 days.
  • the collection of the target substance from the culture after completion of the culture does not require a special method. That is, the target substance accumulated outside the cells can be collected by combining conventionally known ion exchange resin method, precipitation method and other methods according to the type of target substance.
  • the target substance accumulated in the microbial cells can be collected from the microbial cell disruption solution or the membrane fraction depending on the type of the target substance, by physically or enzymatically destroying the microbial cells.
  • the target substance can be used as a microbial catalyst or the like in a state where the target substance is still present in the cells.
  • Amino acids include L-lysine, L-arginine, L-histidine, L-isoleucine, L-valine, L-leucine, L-threonine, L-phenylalanine, L-tyrosine, L-tryptophan, L-cysteine, L- Examples include glutamic acid, L-citrulline, L-glutamine, L-proline, L-serine, L-ornithine, L-methionine, L-aspartic acid, L-asparagine, and glycine, and preferably L-asparagine Examples thereof include acid, L-glutamic acid, L-amino acid biosynthesized via L-aspartic acid, L-glutamic acid or pyruvic acid in the metabolic pathway of microorganisms.
  • L-amino acids biosynthesized via L-aspartic acid examples include L-methionine, L-lysine, L-threonine, and L-asparagine, and biosynthesis via L-glutamic acid.
  • L-amino acid examples include L-glutamine, L-arginine, L-ornithine, and L-proline.
  • L-amino acids biosynthesized via pyruvic acid include L-alanine, L-valine, L-leucine, and L-isoleucine.
  • Examples of the peptide include dipeptides such as alanylglutamine and carnosine, and tripeptides such as glutathione.
  • Examples of the protein include physiologically active polypeptides such as G-CSF, erythropoietin, and HGF. Examples of the present invention are shown below, but the present invention is not limited to these Examples.
  • a chromosomal DNA of Corynebacterium glutamicum ATCC13032 was prepared, And a DNA comprising the base sequence represented by SEQ ID NO: 6 and a DNA comprising the base sequence represented by SEQ ID NO: 7 and SEQ ID NO: 8
  • a combination of DNAs consisting of the base sequences represented by the above was used as a primer set, and two types of PCR were performed using PrimeStarMax DNA polymerase (manufactured by Takara Bio Inc.) and the attached buffer.
  • Two PCR products of about 0.5 kb obtained by the PCR were each subjected to agarose gel electrophoresis, extracted and purified using Wizard® SV Gel and PCR Clean-Up System (Promega).
  • PCR was performed using both purified products as templates and DNA consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 5 and DNA consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 8 as a primer set.
  • the obtained PCR product was subjected to agarose gel electrophoresis, followed by extraction and purification using Wizard® SV SV Gel and PCR Clean-Up System to obtain a DNA fragment of about 1.0 kb.
  • the DNA fragment was treated with a restriction enzyme using a restriction enzyme Sse8387I (Takara Bio Inc.) and an attached buffer.
  • the obtained restriction enzyme-treated fragment was extracted and purified using Wizard® SV SV Gel and PCR Clean-Up System.
  • the previously constructed pESB30 was treated with Sse8387I, mixed with the obtained restriction enzyme-treated fragment, and subjected to ligase reaction using Ligation Kit Ver. 1 (Takara Bio Inc.). Using the reaction product, Escherichia coli DH5 ⁇ strain (manufactured by Toyobo Co., Ltd.) was transformed by a conventional method.
  • LB agar medium containing 10 ⁇ g / ml kanamycin 10 g Bactotryptone (Difco), 5 g yeast extract (Difco), 10 g sodium chloride, 16 g Bactogar (Difco)]
  • the medium was cultured on a medium containing 1 L of water and adjusted to pH 7.0, and a transformant was selected.
  • the transformed strain was cultured overnight in an LB medium containing 20 ⁇ g / ml kanamycin, and a plasmid was prepared from the obtained culture solution by the alkaline SDS method (Molecular Cloning 3rd edition). This plasmid was named pDfruKA.
  • the transformed strain was transformed into Suc agar medium [100 g of sucrose, 7 g of meat extract, 10 g of peptone, 3 g of sodium chloride, 5 g of yeast extract (manufactured by Difco), and 15 g of bacto agar ( A colony that grows by culturing at 30 ° C. for 1 day was selected.
  • the thus obtained colonies were prepared using a medium containing fructose as a single carbon source [ammonium chloride 4 g, monopotassium phosphate 1 g, dipotassium phosphate 3 g, urea 2 g, biotin 100 mg, thiamine hydrochloride 5 mg, nicotinic acid 5 mg, Iron sulfate heptahydrate 10 mg, zinc sulfate heptahydrate 1 mg, copper sulfate pentahydrate 0.2 mg, manganese sulfate pentahydrate 1 mg, calcium chloride 10 mg, fructose 10 g, magnesium sulfate 0.4 g and 15 g Bactergar (manufactured by Difco) in 1 L of water and adjusted to pH 7.2] was inoculated to obtain a colony whose growth deteriorated or could not grow, and was named WT ⁇ fruKA strain.
  • FruA gene disruption plasmid was carried out in the same manner as in the FruKA gene disruption strain, but the primer set was replaced with DNA consisting of the nucleotide sequences represented by SEQ ID NO: 6 and SEQ ID NO: 7 instead of SEQ ID NO: 9 and DNA having a base sequence represented by 10 was used.
  • the thus constructed strain was inoculated into a medium using fructose as a single carbon source, and a colony whose growth deteriorated or could not grow was named WT ⁇ fruA strain.
  • WT ⁇ fruKA and WT ⁇ fruA strains The obtained WT strain, WT ⁇ fruA strain, WT ⁇ fruKA strain was used as a seed medium (glucose 60 g, corn steep liquor 5 g, ammonium sulfate 80 g, potassium monohydrogen phosphate 12 g, magnesium sulfate heptahydrate 4 g, iron sulfate heptahydrate 40 mg, manganese sulfate Pentahydrate 20 mg, copper sulfate 2 mg, nickel chloride hexahydrate 2 mg, cobalt chloride hexahydrate 2 mg, calcium chloride dihydrate 200 mg, hexaammonium hexamolybdate tetrahydrate 40 mg, ⁇ -alanine 40 mg, nicotine A 2 L Erlenmeyer flask containing 6 g of calcium carbonate in 300 ml was inoculated with 40 mg of acid, 40 mg of thiamine hydrochloride and
  • this seed culture solution was added to the main culture medium (glucose 60 g, corn steep liquor 5 g, ammonium sulfate 80 g, potassium monohydrogen phosphate 12 g, magnesium sulfate heptahydrate 4 g, iron sulfate heptahydrate 40 mg, manganese sulfate pentahydrate.
  • the main culture medium glucose 60 g, corn steep liquor 5 g, ammonium sulfate 80 g, potassium monohydrogen phosphate 12 g, magnesium sulfate heptahydrate 4 g, iron sulfate heptahydrate 40 mg, manganese sulfate pentahydrate.
  • L-arginine-producing RB2631 was confirmed in order to confirm the application to the production of useful substances.
  • a FruKA gene-deficient strain of the strain (WO2006 / 035831) was constructed, and its L-arginine production ability was examined.
  • the RB2631 ⁇ fruKA strain which is a FruKA gene-deficient strain of the RB2631 strain
  • the RB2631 ⁇ fruA strain which is a FruA gene-deficient strain
  • the RB2631 ⁇ fruKA strain in which the FruKA gene was disrupted was shown to have a high sugar consumption rate and L-arginine productivity.
  • L-lysine-producing bacteria an amino acid having a biosynthetic pathway different from that of L-arginine, was constructed as a FruKA gene and a FruA gene-deficient strain of AHP-3 strain (FERMBP-7382). The L-lysine productivity was examined.
  • AHP-3 ⁇ fruKA strain which is a FruKA gene-deficient strain of AHP-3 strain
  • AHP-3 ⁇ fruA strain which is a FruA gene-deficient strain, were constructed by the same method as described in Example 1.
  • a target substance can be efficiently produced using a fermentation method.

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Abstract

 親株に比べフラクトースの取り込みに係るPTS系蛋白質の活性が低下、または喪失しており、かつ目的物質を生産することができるコリネ型細菌を培地に培養し、培養物中に該目的物質を生成蓄積させ、該培養物中から該目的物質を採取することにより、該目的物質を効率よく製造することができる。

Description

発酵法による目的物質の製造法
 本発明は、親株に比べフラクトースの取り込みに係るPTS系蛋白質の活性が低下、または喪失しており、かつ目的物質を生産することができるコリネ型細菌を用いた、該目的物質の製造方法に関する。
 発酵法による目的物質の製造法において、その生産性を向上させる方法の一つとして、原料である糖の取り込み能力を改変する方法をあげることができる。
 微生物における糖を初めとする炭水化物の取り込み機構については研究が進んでおり、いくつかの種類に分類されることが知られており、それらのなかで特に主要な糖をリン酸化して取り込む輸送体として、ホスホエノールピルビン酸:糖リン酸転移系(以下、PTS又はフォスフォトランスフェラーゼ系ともいう)があげられる(非特許文献1)。
 PTS系は基質に依存しない共通系EI(ptsIによってコードされる)、HPr(ptsHによってコードされる)と基質特異的な構成成分EIIからなる(非特許文献2~4)。
 基質特異的なEIIは生物によって種類は異なるが、研究の進んでいる腸内細菌や、コリネ型細菌ではその主要なものについては同定されつつあり、そのうち、フラクトース特異的なEIIはFruA(PtsF)によってコードされることが知られている(非特許文献5)。
 フラクトースのPTS系による取り込みには、フラクトースを外部から取り込んでフラクトース1リン酸に変換するFruAのほかに、フラクトース1リン酸を解糖系の重要な中間体であるフラクトース1,6ビスリン酸に変換するFruK(PfkB)が必要であることが知られている(非特許文献6及び7)。
 物質生産において、PTS系を改変することで生産性を向上させている例がいくつか知られている。 例えば、ptsG遺伝子を強化したエシェリヒア属細菌を用いたアミノ酸製造法(特許文献1)やptsH,ptsI,及びptsGと同様の働きをするcrr遺伝子を強化したエシェリヒア属細菌を用いたアミノ酸の製造法(特許文献2)が知られている。
 さらに、主要な糖、すなわちグルコースなどの取り込み系であるPTS系を破壊することでペントースなどのPTS系を経由しない糖の取り込み、代謝を促進する方法が知られている(特許文献3)。
 また、グルコースの取り込み系であるPTS系を破壊し、別経路によって取り込ませることで糖の代謝経路を変化させ、目的物質の生産性を上げることができることが知られている(特許文献4)。また、フラクトースの取り込み系を破壊し、外来のフラクトキナーゼを導入することで糖の代謝経路を変化させ、生産性を上げることができることも知られている(非特許文献5)。
 しかしながら、特定の糖のPTS取り込み系を破壊することで、他の糖のPTS系による取り込み能力を向上させ、目的物質を効率よく製造できることは知られていなかった。また、PTS取り込み系と取り込み後の代謝系を同時に破壊した際に、他の糖の取り込み能力が上昇するということは知られていなかった。特にグルコースは糖取り込み制御の中核を担うため、単純に取り込み系を強化しても細胞内グルコース濃度の上昇に伴って取り込み速度が低下するなどの問題があり、グルコース消費速度の向上は困難であることが予想されていた(非特許文献8)。
国際公開第03/04670 国際公開第03/04674 特開平5-49441号公報 米国特許出願公開第2009/0142843明細書
Mol.Microbiol.,35,699(2000) Microbiol.Rev.,57,543(1993) J.Bacteriol.,174,1433(1992) Biochem.Soc.Trans.,33,220(2005) FEMS Microbiol.Lett.,244,259(2005) Advan,Enzyme Regul.42,349,(2002) Eur.J.Biochem.,254,96(1998) FEMS Microbiol.Rev.,32,891(2008)
 本発明は、コリネ型細菌を用いて発酵法により有用物質を生産するに際し、糖消費速度を向上させることを課題とする。
 本発明は、以下の(1)~(6)に関する。
(1)親株に比べフラクトースの取り込みに係るPTS系蛋白質の活性が低下、または喪失しており、かつ目的物質を生産することができるコリネ型細菌を培地に培養し、培養物中に該目的物質を生成蓄積させ、該培養物中から該目的物質を採取することを特徴とする該目的物質の製造法。
(2)親株に比べフラクトースの取り込みに係るPTS系蛋白質の活性が低下、または喪失しており、かつ目的物質を生産することができるコリネ型細菌が、親株の染色体DNA上にある該蛋白質をコードする遺伝子に塩基の欠失、置換または付加が導入されたことにより、親株に比べ該蛋白質の活性が低下、または喪失したコリネ型細菌であることを特徴とする上記(1)の製造法。
(3)フラクトースの取り込みに係るPTS系蛋白質が、FruK蛋白質およびFruA蛋白質を含む蛋白質である上記(1)または(2)の製造法。
(4)コリネ型細菌がコリネバクテリウム・グルタミカムである上記(1)~(3)のいずれか1つの製造法。
(5)目的物質がアミノ酸、ペプチドまたはタンパク質である上記(1)~(4)のいずれか1つの製造法。
(6)アミノ酸がL-リジン、L-アルギニン、L-ヒスチジン、L-イソロイシン、L-バリン、L-ロイシン、L-スレオニン、L-フェニルアラニン、L-チロシン、L-トリプトファン、L-システイン、L-グルタミン酸、L-シトルリン、L-グルタミン、L-プロリン、L-セリン、L-オルニチン、L-メチオニン、L-アスパラギン酸、L-アスパラギン、およびグリシンからなる群より選ばれるアミノ酸である上記(1)~(5)のいずれか1つの製造法。
 本発明により、発酵法を用いて目的物質を効率よく製造することができる。
1.本発明に用いられるコリネ型細菌
 本発明に用いられるコリネ型細菌は、親株に比べフラクトースの取り込みに係るPTS系蛋白質の活性が低下、または喪失しているコリネ型細菌であり、かつ目的物質を生産することができるコリネ型細菌である。
 親株に比べフラクトースの取り込みに係るPTS系蛋白質の活性が低下、または喪失しているコリネ型細菌は、染色体DNA上に存在する変異が入っていない野生型のフラクトースの取り込みに係るPTS系蛋白質をコードする遺伝子の塩基配列に、塩基の欠失、置換または付加を導入することにより得られる、(a)親株に比べ、フラクトースの取り込みに係るPTS系蛋白質の活性が80%以下、好ましくは50%以下、より好ましくは30%以下、さらに好ましくは20%以下、特に好ましくは10%以下、最も好ましくは0%に低下したコリネ型細菌、および(b)親株に比べ、該遺伝子の転写量またはフラクトースの取り込みに係るPTS系蛋白質の生産量が80%以下、好ましくは50%以下、より好ましくは30%以下、さらに好ましくは20%以下、特に好ましくは10%以下、最も好ましくは0%に低下したコリネ型細菌をあげることができる。より好ましくはFruK蛋白質またはFruA蛋白質をコードする遺伝子の一部または全部が欠損したコリネ型細菌をあげることができる。
 FruA蛋白質をコードする遺伝子としては、フラクトースを取り込み、フラクトース1リン酸への反応を司るFruA活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子であればいずれでもよく、FruK蛋白質をコードする遺伝子としては、フラクトース1リン酸からフラクトース1,6ビスリン酸への反応を司るFruK活性を有するポリペプチドをコードするDNAであればいずれでもよいが、具体的には以下の遺伝子、
[1]配列番号1で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質をコードする遺伝子
[2]配列番号2で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質をコードする遺伝子
[3]配列番号1で表されるアミノ酸配列と80%以上、好ましくは90%以上、より好ましくは95%以上、さらに好ましくは97%以上、特に好ましくは98%以上、最も好ましくは99%以上の同一性を有し、かつ配列番号2で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質と供にフラクトース取り込み活性を示す蛋白質をコードする遺伝子
[4]配列番号2で表されるアミノ酸配列と80%以上、好ましくは90%以上、より好ましくは95%以上、さらに好ましくは97%以上、特に好ましくは98%以上、最も好ましくは99%以上の同一性を有し、かつ配列番号1で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質と供にフラクトース取り込み活性を示す蛋白質をコードする遺伝子
[5]配列番号3で表される塩基配列を有する遺伝子
[6]配列番号4で表される塩基配列を有する遺伝子
[7]配列番号3で表される塩基配列と相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ配列番号2で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質と供にフラクトース取り込み活性を示す蛋白質をコードする遺伝子、および
[8]配列番号2で表される塩基配列と相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ配列番号1で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質と供にフラクトース取り込み活性を示す蛋白質をコードする遺伝子
などをあげることができる。
 本明細書において遺伝子とは、蛋白質のコーディング領域に加え、転写調節領域およびプロモーター領域などを含んでもよいDNAである。
 転写調節領域としては、染色体DNA上におけるコーディング領域の5’末端より上流側100塩基、好ましくは50塩基からなるDNAをあげることができ、プロモーター領域としては、-10および-35領域に相当する領域をあげることができる。
 フラクトースの取り込みに係るPTS系蛋白質をコードする遺伝子への塩基の欠失、置換または付加の導入は、該蛋白質の活性を親株より低下または喪失させる塩基の欠失、置換または付加であれば、塩基の種類および数に制限はないが、塩基の欠失としては、プロモーターおよび転写調節領域は、好ましくは10塩基以上、より好ましくは20塩基以上、さらに好ましくは全部の領域の欠失、コーディング領域は、好ましくは10塩基以上、より好ましくは20塩基以上、さらに好ましくは100塩基以上、特に好ましくは200塩基以上、最も好ましくはコーディング領域全部の欠失をあげることができる。
 塩基の置換としては、コーディング領域の5’末端から150番目以内の塩基、好ましくは100番目以内の塩基、より好ましくは50番目以内の塩基、特に好ましくは30番目以内の塩基、最も好ましくは20番目以内の塩基を置換してナンセンスコドンを導入する置換をあげることができる[An Introduction to Genetic Analysis 7th edition, W.H.Freeman (2000)]。
 塩基の付加としては、コーディング領域の5’末端から150番目以内の塩基、好ましくは100番目以内の塩基、より好ましくは50番目以内の塩基、特に好ましくは30番目以内の塩基、最も好ましくは20番目以内の塩基の直後に、50塩基以上、好ましくは100塩基以上、より好ましくは200塩基以上、さらに好ましくは500塩基以上、特に好ましくは1kb以上のDNA断片を付加することをあげることができ、特に好ましくはクロラムフェニコール耐性遺伝子およびカナマイシン耐性遺伝子などの挿入をあげることができる。
 アミノ酸配列や塩基配列の同一性は、Karlin and AltschulによるアルゴリズムBLAST[Pro. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 5873(1993)] やFASTA [Methods Enzymol., 183, 63 (1990)]を用いて決定することができる。このアルゴリズムBLASTに基づいて、BLASTNやBLASTXとよばれるプログラムが開発されている[J. Mol. Biol., 215, 403(1990) ]。BLASTに基づいてBLASTNによって塩基配列を解析する場合には、パラメータは例えばScore=100、wordlength=12とする。また、BLASTに基づいてBLASTXによってアミノ酸配列を解析する場合には、パラメータは例えばscore=50、wordlength=3とする。BLASTとGapped BLASTプログラムを用いる場合には、各プログラムのデフォルトパラメーターを用いる。これらの解析方法の具体的な手法はよく知られている。
 フラクトースの取り込みに係るPTS系蛋白質の活性が親株より低下、または喪失したコリネ型細菌であることは、例えば、フラクトースの取り込みに係るPTS系蛋白質をコードする遺伝子の転写量を、ノーザン・ブロッティングにより、またはフラクトースの取り込みに係るPTS系蛋白質の生産量をウェスタン・ブロッティングにより、親株と比較することにより確認することができる。
 また、フラクトースを単一炭素源として含有する培地で培養したとき、親株に比べて生育が悪いか、生育しないことをもって、フラクトースの取り込みに係るPTS系蛋白質の活性が親株より低下、または喪失したコリネ型細菌であることを確認することができる。
 上記でいう「ハイブリダイズする」とは、特定の塩基配列を有するDNAまたは該DNAの一部にDNAがハイブリダイズすることである。したがって、該特定の塩基配列を有するDNAまたはその一部は、ノーザンまたはサザンブロット解析のプローブとして用いることができ、またPCR解析のオリゴヌクレオチドプライマーとして使用できるDNAである。プローブとして用いられるDNAとしては、少なくとも100塩基以上、好ましくは200塩基以上、より好ましくは500塩基以上のDNAをあげることができ、プライマーとして用いられるDNAとしては、少なくとも10塩基以上、好ましくは15塩基以上のDNAをあげることができる。
 DNAのハイブリダイゼーション実験の方法はよく知られており、例えば当業者であれば本願明細書に従い、ハイブリダイゼーションの条件を決定することができる。該ハイブリダイゼーションの条件は、モレキュラー・クローニング第2版、第3版(2001年)、Methods for General and Molecular Bacteriology, ASM Press(1994)、Immunology methods manual, Academic press(1996)に記載の他、多数の他の標準的な教科書に従っておこなうことができる。
 また、市販のハイブリダイゼーションキットに付属した説明書に従うことによっても、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAを取得することができる。市販のハイブリダイゼーションキットとしては、例えばランダムプライム法によりプローブを作製し、ストリンジェントな条件でハイブリダイゼーションを行うキットをあげることができる。
 上記のストリンジェントな条件とは、DNAを固定化したフィルターとプローブDNAとを50%ホルムアミド、5×SSC(750mmol/lの塩化ナトリウム、75mmol/lのクエン酸ナトリウム)、50mmol/lのリン酸ナトリウム(pH7.6)、5×デンハルト溶液、10%の硫酸デキストラン、および20μg/lの変性させたサケ精子DNAを含む溶液中で42℃で一晩、インキュベートした後、例えば約65℃の0.2×SSC溶液中で該フィルターを洗浄する条件が好ましいが、より低いストリンジェント条件を用いることもできる。ストリンジェンな条件の変更は、ホルムアミドの濃度調整(ホルムアミドの濃度を下げるほど低ストリンジェントになる)、塩濃度および温度条件の変更により可能である。低ストリンジェント条件としては、例えば6×SSCE(20×SSCEは、3mol/lの塩化ナトリウム、0.2mol/lのリン酸二水素ナトリウム、0.02mol/lのEDTA、pH7.4)、0.5%のSDS、30%のホルムアミド、100μg/lの変性させたサケ精子DNAを含む溶液中で、37℃で一晩インキュベートした後、50℃の1×SSC、0.1%SDS溶液を用いて洗浄する条件をあげることができる。また、さらに低いストリンジェントな条件としては、上記した低ストリンジェント条件において、高塩濃度(例えば5×SSC)の溶液を用いてハイブリダイゼーションを行った後、洗浄する条件をあげることができる。
 上記した様々な条件は、ハイブリダイゼーション実験のバックグラウンドを抑えるために用いるブロッキング試薬を添加、または変更することにより設定することもできる。上記したブロッキング試薬の添加は、条件を適合させるために、ハイブリダイゼーション条件の変更を伴ってもよい。
 上記したストリンジェントな条件下でハイブリダイズ可能なDNAとしては、例えばBLASTやFASTA等を用いて上記したパラメータ等に基づいて計算したときに、配列番号3または4で表される塩基配列からなるDNAと少なくとも90%以上、好ましくは95%以上、より好ましくは97%以上、さらに好ましくは98%以上、特に好ましくは99%以上の同一性を有するDNAをあげることができる。
 目的物質を生産することができるとは、本発明に用いるコリネ型細菌を培地に培養したときに、目的物質を細胞または培地から回収できる程度に生産する能力をいう。
 目的物質を生産することができるコリネ型細菌としては、親株が当該性質を元来有している場合はその性質が強化されたコリネ型細菌、親株が当該性質を有していない場合は、当該性質を人工的に付与したコリネ型細菌をあげることができる。
 本発明で用いられるコリネ型細菌としては、コリネバクテリウム(Corynebacterium)属、ブレビバクテリウム(Brevibacterium)属、またはミクロバクテリウム(Microbacterium)属に属するコリネ型細菌をあげることができる。
 コリネバクテリウム属に属する微生物としては、コリネバクテリウム・グルタミカム(Corynebacterium glutamicum)、コリネバクテリウム・アセトアシドフィラム(Corynebacterium acetoacidophilum)、コリネバクテリウム・アセトグルタミカム(Corynebacterium acetoglutamicum)、コリネバクテリウム・カルナエ(Corynebacterium callunae)、コリネバクテリウム・ハーキュリス(Corynebacterium herculis)、コリネバクテリウム・リリウム(Corynebacterium lilium)、コリネバクテリウム・メラセコラ(Corynebacterium melassecola)、コリネバクテリウム・サーモアミノゲネス(Corynebacterium thermoaminogenes)等をあげることができ、具体的には、Corynebacterium glutamicum ATCC13032、Corynebacterium glutamicum ATCC13060、Corynebacterium glutamicum ATCC13826(旧属種Brevibacterium flavum)、Corynebacterium glutamicum ATCC14020(旧属種Brevibacterium divaricatum)、Corynebacterium glutamicum ATCC13869(旧属種Brevibacterium lactofermentum)、Corynebacterium acetoacidophilum ATCC13870、Corynebacterium acetoglutamicum  ATCC15806、Corynebacterium callunae ATCC15991、Corynebacterium herculis ATCC13868、Corynebacterium lilium ATCC15990、Corynebacterium melassecola ATCC17965、Corynebacterium thermoaminogenes ATCC9244等をあげることができる。
 ブレビバクテリウム属に属する微生物としては、ブレビバクテリウム・サッカロリティカム(Brevibacterium saccharolyticum)、ブレビバクテリウム・イマリオフィラム(Brevibacterium immariophilum)、ブレビバクテリウム・ロゼウム(Brevibacterium roseum)、ブレビバクテリウム・チオゲニタリス(Brevibacterium thiogenitalis)等をあげることができ、具体的には、Brevibacterium saccharolyticum ATCC14066、Brevibacterium immariophilum ATCC14068、Brevibacterium roseum ATCC13825、Brevibacterium thiogenitalis ATCC19240等をあげることができる。
 ミクロバクテリウム属に属する微生物としては、ミクロバクテリウム・アンモニアフィラム(Microbacterium ammoniaphilum)等をあげることができ、具体的には、Microbacterium ammoniaphilum ATCC15354等をあげることができる。
2.本発明のコリネ型細菌の製造法
 本発明のコリネ型細菌は、目的物質を生産することができ、かつFruK蛋白質およびFruA蛋白質の活性(以下、FruKA活性と称することもある)を有するコリネ型細菌を親株とし、該親株のFruKA活性を、通常の突然変異処理法、組換えDNA技術等による遺伝子置換法、細胞融合法、あるいは形質導入法等の、コリネ型細菌に変異を導入することができる方法、またはアンチセンス法等のFruK蛋白質およびFruA蛋白質をコードする遺伝子の発現を抑制できる方法等を用いて、低下または喪失させることにより得ることができる。
 親株は、目的物質を生産する能力を有しており、かつFruKA活性を有するコリネ型細菌であれば、野生株であってもよいし、該野生株から人工的に育種された育種株であってもよい。
 コリネ型細菌に目的物質を生成する能力を人工的に付与する方法としては、
(a)目的物質の生合成を制御する機構の少なくとも1つを緩和又は解除する方法、
(b)目的物質の生合成に関与する酵素の少なくとも1つを発現強化する方法、
(c)目的物質の生合成に関与する酵素遺伝子の少なくとも1つのコピー数を増加させる方法、
(d)目的物質の生合成経路から該目的物質以外の代謝産物へ分岐する代謝経路の少なくとも1つを弱化又は遮断する方法、及び
(e)野生型株に比べ、目的物質のアナログに対する耐性度が高い細胞株を選択する方法、
などをあげることができ、上記公知の方法は単独又は組み合わせて用いることができる。
 上記(a)~(e)のいずれか、又は組み合わせた方法による目的物質、特に目的物質がアミノ酸である場合、当該アミノ酸を生産する能力を有するコリネ型細菌の調製方法については、Biotechnology 2nd ed., Vol.6, Products of Primary Metabolism (VCH Verlagsgesellschaft mbH, Weinheim, 1996) section 14a, 14bやAdvances in Biochemical Engineering/ Biotechnology, 79, 1-35 (2003)、Agric. Biol. Chem., 51, 2089-2094(1987)、アミノ酸発酵、学会出版センター、相田 浩ら(1986)に多くの例が記載されており、また上記以外にも具体的なアミノ酸を生産する能力を有するコリネ型細菌の調製方法は、特開2003-164297、Agric. Biol. Chem., 39, 153-160 (1975)、Agric. Biol. Chem.,39, 1149-1153(1975)、特開昭58-13599、J. Gen. Appl. Microbiol., 4, 272-283(1958)、特開昭63-94985、Agric. Biol. Chem., 37, 2013-2023(1973)、WO97/15673、特開昭56-18596、特開昭56-144092、特表2003-511086およびWO2006/001380など数多くの報告があり、上記文献等を参照することによりアミノ酸を生産する能力を有するコリネ型細菌を調製することができる。
 上記方法によって調製することができるL-アルギニンを生産する能力を有するコリネ型細菌としては、例えばコリネバクテリウム・グルタミカム RB2631(WO2006/035831)など、L-リジンを生産する能力を有するコリネ型細菌としては、コリネバクテリウム・グルタミカム AHP-3(FERM BP-7382)などをあげることができる。
 上記した目的物質を生産する能力を有するコリネ型細菌の調製に用いることができるコリネ型細菌としては、上記(a)~(e)の方法を適用することができるコリネ型細菌又は上記遺伝的形質を有するコリネ型細菌であればいずれであってもよく、好ましくは上記したコリネバクテリウム(Corynebacterium)属、ブレビバクテリウム(Brevibacterium)属、またはミクロバクテリウム(Microbacterium)属に属するコリネ型細菌をあげることができる。
 突然変異処理法としては、例えば、N-メチル-N’-ニトロ-N-ニトロソグアニジン(NTG)を用いる方法(微生物実験マニュアル、1986年、131頁、講談社サイエンティフィック社)、紫外線照射法等をあげることができる。
 組換えDNA技術による遺伝子置換法としては、インビトロでFruK蛋白質およびFruA蛋白質をコードする遺伝子(以下、FruKA遺伝子とも称する)に1以上の塩基の置換、欠失、または付加を導入し、相同組換え等により該遺伝子を親株の染色体に組み込み、さらに相同組換え等により染色体上に元来存在していたFruKA遺伝子を置換する方法をあげることができる。
 FruKA遺伝子に1以上の塩基の置換、欠失、または付加を導入する方法としては、例えばMolecular cloning:a laboratory manual,3rded., Cold Spring Harbor Laboratory Press(2001)〔以下、モレキュラー・クローニング第3版と略す〕、Current Protocols in Molecular Biology,JohnWiley& Sons(1987-1997)(以下、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジーと略す)、Nucleic Acids Research, 10, 6487(1982)、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79, 6409(1982)、Gene,34,315(1985)、Nucleic Acids Research, 13, 4431(1985)、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 488(1985)等に記載されている部位特異的変異導入法に準ずる方法をあげることができる。
 組換えDNA技術による遺伝子置換は、J.Bacteriol., 182, 6884(2000)等に記載の方法に従って、FruKA遺伝子に変異を導入することにより行うことができる。
 FruKA遺伝子は、公知のコリネバクテリウム・グルタミカム由来のFruKA遺伝子の塩基配列情報〔例えば、国立バイオテクノロジー情報センター(NCBI)アクセッション・ナンバーNC_006958 REGION: 2012568..2013560、NC_006958 REGION: 2013557..2015623〕に基づいて、PCR法等により取得することができる。
 該変異を導入されたFruKA遺伝子(以下、変異体遺伝子と称す)を適当なプラスミドベクター等に挿入することにより、組換え体プラスミドを作製する。
 プラスミドベクターとしては、例えば、親株中では自律複製できず、かつ抗生物質に対する耐性マーカー遺伝子および枯草菌のレバンシュークラーゼ遺伝子sacB[Mol. Microbiol., 6, 1195(1992)]を有するプラスミドを用いることができる。
 変異体DNAを有する組換え体プラスミドを親株へ導入する方法としては、コリネ型細菌へDNAを導入できる方法であればいずれも用いることができ、例えば、電気穿孔法[Appl. Microbiol. Biotech., 52, 541(1999)]やプロトプラスト法[J. Bacteriol., 159, 306(1984)]等をあげることができる。
 該組換え体プラスミドは親株中で自律複製できないので、該組換え体プラスミドの有する抗生物質耐性マーカーに応じた抗生物質に耐性を示す株を取得することにより、該組換え体プラスミドが染色体に組み込まれた形質転換株を取得することができる。
 さらに、変異体遺伝子と共に染色体上に組み込まれる枯草菌レバンシュークラーゼが自殺基質を生産することを利用した選択法[J. Bacteriol., 174, 5462(1992)]によって、親株の染色体上のFruKA遺伝子が変異体遺伝子に置換された株を取得することができる。
 以上の方法で、親株の染色体上の遺伝子置換を行うことができるが、上記の方法に限らず、コリネ型細菌の染色体上の遺伝子を置換できる方法であれば他の遺伝子置換法も用いることもできる。
 親株の染色体上のFruKA遺伝子に置換、欠失、または付加を導入する方法としては、他にも細胞融合法、形質導入法をあげることができ、例えば、相田浩ら編、アミノ酸発酵、1986年、学会出版センターに記載の方法等をあげることができる。
 変異を導入する塩基の数は、FruKA遺伝子の塩基の置換、欠失、または付加によって、FruKA活性を低下または喪失させることができる数であれば限定されない。変異を導入する部位は、該変異によってFruKA活性を低下または喪失させることができる部位であれば必ずしもFruKA遺伝子のコーディング領域の塩基配列中に限られず、FruKA遺伝子の転写・翻訳調節領域中であってもよいが、FruKA遺伝子のコーディング領域が好ましい。
 塩基置換を導入してFruKA活性を低下または喪失させる方法としては、例えばナンセンス変異の導入による方法があげられる。
 ナンセンス変異を導入する方法としては、例えば、終止コドンを含むプライマーおよびFruKA遺伝子を用いてPCRを行い、得られたナンセンス変異が導入されたFruKA遺伝子を用いて親株の染色体上のFruKA遺伝子を置換する方法があげられる。
 塩基配列の欠失を導入することによってFruKA活性を低下または喪失させる方法としては、例えば、FruKおよびFruA遺伝子をそれぞれ制限酵素等で切断し、適当な数の塩基配列を削除した後に再結合させて得られる変異FruKA遺伝子を染色体に組み込む方法等をあげることができる。
 FruKA活性が低下または喪失した株はフラクトースを単一炭素源として含有する培地で生育が遅延または生育不能であることを利用し、変異を導入したコリネ型細菌の中から、グルコースを単一炭素源とした場合は親株と同等の生育をするが、フラクトースを単一炭素源とした培地では生育しないか、親株に比べて極めて生育が悪くなった株を取得することで、FruKA活性が低下または喪失した株を得ることができる。
 FruKA活性が低下または喪失したコリネ型細菌の選択方法は、糖消費速度が親株より向上した、より有用物質の製造に適したコリネ型細菌の選択方法としても用いることができる。
 上記のようにして得られる、目的物質を生産する能力を有し、かつ親株に比べFruKA活性が低下または喪失したコリネ型細菌を培地に培養し、培養物中に該目的物質を生成蓄積させ、該目的物質を採取することにより、該目的物質を製造することができる。本発明で用いられるコリネ型細菌は、糖消費速度が向上したコリネ型細菌でもあり、目的物質を効率よく製造することができる。
 コリネ型細菌の培養は、目的物質を生産する能力を有する細菌の通常の培養法によって行うことができる。
 培地としては、炭素源、窒素源、無機塩類などを適量含有する培地であれば合成培地または天然培地いずれも使用できる。
 炭素源としては、主にグルコースを用いることができる。グルコース以外のPTS系を経由する糖も用いることができるが、FruKA活性が低下または喪失しているため、スクロース、フラクトースの使用は好ましくない。
 窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、炭酸アンモニウム、酢酸アンモニウムなどの各種無機および有機アンモニウム塩類、尿素、その他窒素含有化合物、ならびに肉エキス、酵母エキス、コーン・スティープ・リカー、大豆加水分解物等の窒素含有有機物を用いることができる。
 無機塩としてはリン酸第一水素カリウム、リン酸第二水素カリウム、硫酸アンモニウム、塩化ナトリウム、硫酸マグネシウム、炭酸カルシウム等を用いることができる。
 その他、必要に応じて、ビオチン、チアミン、ニコチンアミド、ニコチン酸等の微量栄養源を加えることができる。これら微量栄養源は、肉エキス、酵母エキス、コーン・スティープ・リカー、カザミノ酸等の培地添加物で代用することもできる。
 培養は、振とう培養、深部通気撹拌培養等の好気的条件下で行う。培養温度は一般に20~42℃が好適であり、さらに好ましくは30℃~40℃である。培地のpHは5~9の範囲で、中性付近に維持することが好ましい。培地のpHの調整は、無機あるいは有機の酸、アルカリ溶液、尿素、炭酸カルシウム、アンモニア、pH緩衝液などを用いて行う。
 培養期間は通常1~6日間である。
 培養終了後の培養物からの目的物質の採取は、特別な方法が必要とされることはない。すなわち、菌体外に蓄積した目的物質は、従来より周知となっているイオン交換樹脂法、沈澱法その他の方法を、目的物質の種類に応じて組み合わせることにより採取することができる。また、菌体内に蓄積した目的物質は、菌体を物理的または酵素的に破壊し、目的物質の種類に応じて菌体破砕液又は膜画分から採取することができる。尚、目的物質によっては、目的物質を菌体中に存在したままの状態で、微生物触媒等として利用することもできる。
 本発明により製造することができる有用物質は特に限定されないが、アミノ酸、ペプチドおよびタンパク質などをあげることができる。
 アミノ酸としては、L-リジン、L-アルギニン、L-ヒスチジン、L-イソロイシン、L-バリン、L-ロイシン、L-スレオニン、L-フェニルアラニン、L-チロシン、L-トリプトファン、L-システイン、L-グルタミン酸、L-シトルリン、L-グルタミン、L-プロリン、L-セリン、L-オルニチン、L-メチオニン、L-アスパラギン酸、L-アスパラギン、およびグリシンなどをあげることができ、好ましくは、L-アスパラギン酸、L-グルタミン酸、微生物の代謝経路上L-アスパラギン酸、L-グルタミン酸またはピルビン酸を経由して生合成されるL-アミノ酸等をあげることができる。
 L-アスパラギン酸を経由して生合成されるL-アミノ酸としては、L-メチオニン、L-リジン、L-スレオニン、およびL-アスパラギン等をあげることができ、L-グルタミン酸を経由して生合成されるL-アミノ酸としては、L-グルタミン、L-アルギニン、L-オルニチン、およびL-プロリン等があげられる。ピルビン酸を経由して生合成されるL-アミノ酸としては、L-アラニン、L-バリン、L-ロイシン、およびL-イソロイシン等があげられる。
 ペプチドとしては、アラニルグルタミンおよびカルノシン等のジペプチド、グルタチオン等のトリペプチドをあげることができ、タンパク質としてはG-CSF、エリスロポエチンおよびHGF等の生理活性ポリペプチドをあげることができる。
 以下に本発明の実施例を示すが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
(1)遺伝子破壊用プラスミドの構築
 カナマイシンに対する耐性を付与する遺伝子を有するプラスミドpHSG299〔Gene, 61, 63(1987)〕をPstIで処理し、切断部位にBacillus subtilisに由来するレバンシュークラーゼ遺伝子sacBを含む2.6キロベースペア(以下、kbと略す)のDNA断片〔Mol.Microbiol., 6, 1195(1992)〕を連結し、プラスミドpESB30を得た。
(2)fruKA遺伝子破壊株造成用プラスミドの構築
 斎藤らの方法〔Biochim. Biophys. Acta, 72, 619(1963)〕に準じてコリネバクテリウム・グルタミカムATCC13032株の染色体DNAを調製し、該染色体DNAを鋳型とし、配列番号5で表される塩基配列からなるDNAと配列番号6で表される塩基配列からなるDNAとの組み合わせ、および配列番号7で表される塩基配列からなるDNAと配列番号8で表される塩基配列からなるDNAの組み合わせをそれぞれプライマーセットとし、PrimeStarMaxDNAポリメラーゼ(タカラバイオ社製)および添付のバッファーを用いて2種類のPCRを行った。該PCRにより得られた2つの約0.5kbのPCR産物をそれぞれアガロース・ゲル電気泳動し、Wizard(R) SV Gel and PCR Clean-Up System(Promega社製)を用いて抽出、精製した。
 さらに、両精製物を鋳型とし、配列番号5で表される塩基配列からなるDNAと配列番号8で表される塩基配列からなるDNAをプライマーセットとしてPCRを行った。得られたPCR産物をアガロース・ゲル電気泳動した後、Wizard(R) SV Gel and PCR Clean-Up Systemを用いて抽出、精製し、約1.0kbのDNA断片を得た。該DNA断片を制限酵素Sse8387I (タカラバイオ社製)および添付のバッファーを用いて制限酵素処理した。得られた制限酵素処理断片は、Wizard(R) SV Gel and PCR Clean-Up Systemを用いて抽出、精製した。
 同時に、先に造成したpESB30をSse8387Iで処理しておき、得られた制限酵素処理断片と混和し、ライゲーションキットVer.1(タカラバイオ社製)を用い、リガーゼ反応を行った。反応産物を用い、常法によりEscherichia coli DH5α株(東洋紡社製)を形質転換した。該菌株を、20μg/mlのカナマイシンを含むLB寒天培地〔10gのバクトトリプトン(ディフコ社製)、5gの酵母エキス(ディフコ社製)、10gの塩化ナトリウム、16gのバクトアガー(ディフコ社製)を水1Lに含み、pH7.0に調整された培地〕上で培養し、形質転換株を選択した。該形質転換株を20μg/mlのカナマイシンを含むLB培地を用いて終夜培養し、得られた培養液からアルカリSDS法(モレキュラー・クローニング第3版)によりプラスミドを調製した。このプラスミドをpDfruKAと命名した。
(3)FruKA遺伝子破壊株の造成
 (2)で調製したプラスミドpDfruKAを用い、レストらの方法〔Appl. Microbiol. Biotech., 52, 541(1999)〕に準じて電気穿孔法によりコリネバクテリウム・グルタミカムATCC13032株を形質転換し、それぞれカナマイシン耐性株を選択した。カナマイシン耐性株では、それぞれの株の染色体にpDfruKAがCampbellタイプの相同組換えにより組み込まれていると推測される。このような株では、染色体上に元来存在しているFruKAをコードするDNAとpDfruKA上のfruKAが破壊された構造のDNAが染色体上に近接して存在しており、その間で2回目の相同組換えが起こりやすくなっている。
 sacBがコードするレバンシュークラーゼはショ糖を自殺基質に転換するので、sacBを有する微生物はショ糖を含有する培地において生育できない。しかし、元来染色体上に存在しているFruKA遺伝子の周辺領域とpDfruKA上のFruKA遺伝子が破壊された構造のDNAとの間で2回目の相同組換えが起こった株では、いずれかのDNAがsacBとともに欠失するので、ショ糖を含有する培地においても生育することができる。このようにして、宿主微生物の染色体上に元来存在していたFruKA遺伝子が欠失した微生物を取得することができる。
 このことを利用して、上記形質転換株をSuc寒天培地〔100gのショ糖、7gの肉エキス、10gのペプトン、3gの塩化ナトリウム、5gの酵母エキス(ディフコ社製)、および15gのバクトアガー(ディフコ社製)を水1Lに含みpH7.2に調整した培地〕上に塗布し、30℃で1日間培養して生育するコロニーを選択した。
 このようにして得られたコロニーをフラクトースを単一炭素源とした培地〔塩化アンモニウム4g、リン酸一カリウム1g、リン酸二カリウム3g、尿素2g、ビオチン100mg、チアミン塩酸塩5mg、ニコチン酸5mg、硫酸鉄7水和物10mg、硫酸亜鉛7水和物1mg、硫酸銅5水和物0.2mg、硫酸マンガン5水和物1mg、塩化カルシウム10mg、フラクトース、10g、硫酸マグネシウム0.4g及び15gのバクトアガー(ディフコ社製)を水1Lに含み、pH7.2に調製した培地〕に植菌し、生育が悪化もしくは生育ができないコロニーを取得し、WTΔfruKA株と命名した。
(4)FruA遺伝子破壊株の造成
 FruKA遺伝子の破壊と同様の方法を利用して、Corynebacterium glutamicum ATCC13032株 (以下、WT株と称す)のFruA遺伝子のみを破壊した株もコントロールとして造成した。
 FruA遺伝子破壊用プラスミドの造成はFruKA遺伝子破壊株の際と同様に行ったが、プライマーセットは配列番号6および配列番号7で表される塩基配列からなるDNAの代わりに、配列番号9および配列番号10で表される塩基配列からなるDNAを用いた。
 このようにして造成された菌株をフラクトースを単一炭素源とした培地に植菌し、生育が悪化もしくは生育ができないコロニーをWTΔfruA株と命名した。
(5)WTΔfruKA株、WTΔfruA株の評価 
 取得したWT株、WTΔfruA株、WTΔfruKA株を種培地(グルコース60g、コーンスティープリカー5g、硫酸アンモニウム80g、リン酸一水素カリウム12g、硫酸マグネシウム7水和物4g、硫酸鉄7水和物40mg、硫酸マンガン5水和物20mg、硫酸銅2mg、塩化ニッケル6水和物2mg、塩化コバルト6水和物2mg、塩化カルシウム2水和物200mg、七モリブデン酸六アンモニウム4水和物40mg、βアラニン40mg、ニコチン酸40mg、チアミン塩酸塩40mg、ビオチン0.4mgを水1Lに含みpH7.2に調整した培地)300mlに炭酸カルシウム6gの入った2L三角フラスコに植菌して28℃で24時間培養した。この種培養液100mlを本培養培地(グルコース60g、コーンスティープリカー5g、硫酸アンモニウム80g、リン酸一水素カリウム12g、硫酸マグネシウム7水和物4g、硫酸鉄7水和物40mg、硫酸マンガン5水和物20mg、硫酸銅2mg、塩化ニッケル6水和物2mg、塩化コバルト6水和物2mg、塩化カルシウム2水和物200mg、七モリブデン酸六アンモニウム40mg、βアラニン40mg、ニコチン酸40mg、チアミン塩酸塩40mg、ビオチン0.4mgを水1Lに含んだ培地)1150mlの入ったジャーファーメンターに植菌し、33℃で培養した。培養は、pH6.7に保たれるようにアンモニア水で調整しながら行った。培養はグルコースが消費されつくした時点で終了し、その時点での培養時間を計測した。
 その結果、表1に示すように、FruKA遺伝子を破壊したWTΔfruKA株において糖消費速度が速いことが示された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
L-アルギニンの製造
 表1に示すとおり、野生株のFruKA遺伝子を破壊することにより糖消費向上効果が得られたことから、有用物質の製造への応用を確認するため、L-アルギニン生産菌RB2631株(WO2006/035831)のFruKA遺伝子欠損株を造成し、そのL-アルギニン生産能を調べた。
 実施例1に記載した方法と同様の手法により、RB2631株のFruKA遺伝子欠損株であるRB2631ΔfruKA株、及びFruA遺伝子欠損株であるRB2631ΔfruA株を造成した。
 これらの株を実施例1に記載の条件と同条件でジャーファーメンターにて培養した。ただし培養温度は37℃とした。
 その結果、表2に示すように、FruKA遺伝子を破壊したRB2631ΔfruKA株において、糖消費速度、及びL-アルギニン生産性が高いことが示された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
L-リジン生産菌を用いた検討
 L-アルギニンとは異なる生合成経路を持つアミノ酸であるL-リジンの生産菌、AHP-3株(FERMBP-7382)のFruKA遺伝子およびFruA遺伝子欠損株を造成し、そのL-リジン生産性を調べた。
 実施例1に記載の方法と同様の手法により、AHP-3株のFruKA遺伝子欠損株であるAHP-3ΔfruKA株、及びFruA遺伝子欠損株であるAHP-3ΔfruA株を造成した。
 これらの株を実施例1に記載の条件と同条件でジャーファーメンターにて培養した。
 その結果、表3に示すように、FruKA遺伝子を破壊したAHP-3ΔfruKA株において、糖消費速度、及びL-リジン生産性が高いことが示された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
  
 本発明により、発酵法を用いて目的物質を効率よく製造することができる。
配列番号5-人工配列の説明:合成DNA
配列番号6-人工配列の説明:合成DNA
配列番号7-人工配列の説明:合成DNA
配列番号8-人工配列の説明:合成DNA
配列番号9-人工配列の説明:合成DNA
配列番号10-人工配列の説明:合成DNA

Claims (6)

  1. 親株に比べフラクトースの取り込みに係るPTS系蛋白質の活性が低下、または喪失しており、かつ目的物質を生産することができるコリネ型細菌を培地に培養し、培養物中に該目的物質を生成蓄積させ、該培養物中から該目的物質を採取することを特徴とする該目的物質の製造法。
  2. 親株に比べフラクトースの取り込みに係るPTS系蛋白質の活性が低下、または喪失しており、かつ目的物質を生産することができるコリネ型細菌が、親株の染色体DNA上にある該蛋白質をコードする遺伝子に塩基の欠失、置換または付加が導入されたことにより、親株に比べ該蛋白質の活性が低下、または喪失したコリネ型細菌であることを特徴とする請求項1記載の製造法。
  3. フラクトースの取り込みに係るPTS系蛋白質が、FruK蛋白質およびFruA蛋白質を含む蛋白質である請求項1または2の製造法。
  4. コリネ型細菌がコリネバクテリウム・グルタミカムである請求項1~3のいずれか1項に記載の製造法。
  5. 目的物質がアミノ酸、ペプチドまたは蛋白質である請求項1~4のいずれか1項に記載の製造法。
  6. アミノ酸がL-リジン、L-アルギニン、L-ヒスチジン、L-イソロイシン、L-バリン、L-ロイシン、L-スレオニン、L-フェニルアラニン、L-チロシン、L-トリプトファン、L-システイン、L-グルタミン酸、L-シトルリン、L-グルタミン、L-プロリン、L-セリン、L-オルニチン、L-メチオニン、L-アスパラギン酸、L-アスパラギン、およびグリシンからなる群より選ばれるアミノ酸である請求項1~5のいずれか1項に記載の製造法。
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