WO2012063860A1 - コリネ型細菌形質転換体及びそれを用いるフェノールの製造方法 - Google Patents

コリネ型細菌形質転換体及びそれを用いるフェノールの製造方法 Download PDF

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WO2012063860A1
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gene
dca
corynebacterium glutamicum
phenol
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湯川　英明
乾　将行
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グリーンフェノール・高機能フェノール樹脂製造技術研究組合
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    • C12Y401/01—Carboxy-lyases (4.1.1)
    • C12Y401/01061—4-Hydroxybenzoate decarboxylase (4.1.1.61)

Definitions

  • the present invention relates to phenol production technology. More specifically, the present invention relates to a transformant of Corynebacterium glutamicum that has been subjected to a specific genetic manipulation in order to impart a phenol production function, and an efficient phenol production technique using the transformant.
  • Phenol resin is produced by addition condensation reaction of phenol and aldehydes, and is the oldest resin in plastics. Due to its excellent heat resistance, durability, etc., metal substitute materials for automobiles are still used today. It is used for various applications such as semiconductor sealing materials and circuit boards.
  • phenolic resins have so far been highly reactive with phenols and aldehydes as raw materials, and the resulting polymer has a complicated three-dimensional network structure, making it difficult to design precise structures of polymers and to develop nanomaterials. It has been considered difficult to use for high value-added applications.
  • due to the rapid development of polymer property theory and simulation it has become possible to create highly functional materials from phenolic resins by refining the network structure. against this background, the production of phenolic resin in Japan is increasing year by year.
  • the current industrial production method of phenol is a high-energy consumption process in the typical chemical industry that uses benzene and propylene derived from petroleum as raw materials and requires a large amount of solvents and a large amount of heat energy. is there. Therefore, from the viewpoint of global environmental conservation and greenhouse gas reduction, there is an urgent need to develop an environmentally conscious process that can be manufactured from renewable resources with low carbon dioxide emissions and low waste emissions, that is, establishment of biophenol production technology. It has become. So far, no phenol-producing bacteria have been reported in nature.
  • Non-Patent Document 1 uses 2 mM 4-hydroxybenzoate using a cell suspension or cell extract of Clostridium hydroxybenzoicum. Disclosed is a technique for complete conversion to phenol in 50 hours. Patent Document 1 discloses a technique for producing phenol from 4-hydroxybenzoate using a transformed bacterium introduced with 4-hydroxybenzoate decarboxylase gene of Enterobacter cloacae. However, the methods of Non-Patent Document 1 and Patent Document 1 cannot produce phenol sufficiently efficiently in practice.
  • An object of the present invention is to provide a microorganism capable of efficiently producing phenol using 4-hydroxybenzoate as a raw material, and a method capable of efficiently producing phenol using 4-hydroxybenzoate as a raw material.
  • a transformant obtained by introducing 4-hydroxybenzoate decarboxylase gene into Corynebacterium glutamicum can efficiently produce phenol from 4-hydroxybenzoate.
  • phenol can be produced more efficiently when the phenol 2-monooxygenase gene present on the chromosome of the host Corynebacterium glutamicum is disrupted or deleted.
  • This transformant has a high phenol production efficiency, particularly when reacted in a reaction solution under a reducing condition without substantially growing.
  • the present invention has been completed based on the above findings, and provides the following transformants and methods for producing phenol.
  • Item 1 A transformant having phenol-producing ability, wherein a gene encoding an enzyme having 4-hydroxybenzoate decarboxylase activity is introduced into a host, Corynebacterium glutamicum.
  • Item 2. The genes encoding enzymes with 4-hydroxybenzoate decarboxylase activity are Bacillus subtilis, Bacillus atrophaeus, Bacillus subtilis subsp.
  • the transformant according to Item 1, wherein the gene encoding an enzyme having 4-hydroxybenzoate decarboxylase activity is the following DNA (a) or (b): (a) SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 50, or SEQ ID NO: DNA consisting of 53 base sequences (b) a DNA that hybridizes under stringent conditions with a DNA comprising a base sequence complementary to any base sequence of (a) and encodes a polypeptide having 4-hydroxybenzoate decarboxylase activity Item 4.
  • a transformant according to claim 1. Item 5. Item 1-4, wherein the host Corynebacterium glutamicum is a gene that encodes an enzyme having 4-hydroxybenzoate hydroxylase activity that is present on the chromosome thereof. The transformant in any one.
  • the host Corynebacterium glutamicum has a gene that encodes an enzyme with phenol 2-monooxygenase activity that is present on the chromosome of Corynebacterium glutamicum R (FERM P-18976), ATCC13032, or ATCC13869.
  • Item 4. The transformant according to any one of Items 1 to 3, wherein Item 8.
  • the host Corynebacterium glutamicum has a disrupted or defective gene encoding an enzyme with 4-hydroxybenzoate hydroxylase activity present on the chromosome of Corynebacterium glutamicum R (FERM P-18976), ATCC13032, or ATCC13869.
  • Item 4. The transformant according to any one of Items 1 to 3, wherein Item 9.
  • Corynebacterium glutamicum PHE21 (Accession number: NITE BP-996), PHE21-2, PHE21-3, PHE21-4, PHE21-5, PHE21-6, PHE21-7, PHE21-8, PHE21-9, PHE21-10 , PHE21-11, PHE21-12, PHE22-1, PHE22-2, PHE22-3, PHE22-4, PHE22-5, PHE22-6, PHE22-7, PHE22-8, PHE22-9, PHE22-10, PHE22 -11, PHE22-12, PHE23-1, PHE23-2, PHE23-3, PHE23-4, PHE23-5, PHE23-6, PHE23-7, PHE23-8, PHE23-9, PHE23-10, PHE23-11 Or a transformant of PHE23-12.
  • Item 10 The method comprises reacting the transformant according to any one of Items 1 to 9 in a reaction solution containing 4-hydroxybenzoate or a salt thereof under reducing conditions, and recovering phenol in the reaction solution.
  • a method for producing phenol Item 11.
  • Item 11. The method for producing phenol according to Item 10, wherein the transformant does not substantially grow in the reaction step.
  • Item 12. The method for producing phenol according to Item 10 or 11, wherein the oxidation-reduction potential of the reaction solution under reducing conditions is -200 to -500 millivolts.
  • phenol can be produced from 4-hydroxybenzoate with high efficiency.
  • the growth of microorganisms is hindered by the cytotoxicity of solvents such as phenol. Therefore, it was difficult to produce phenol using microorganisms. It is possible to produce phenol efficiently.
  • Transformant having phenol-producing ability of the present invention has a gene encoding an enzyme having 4-hydroxybenzoate decarboxylase activity introduced into the host Corynebacterium glutamicum. It is a transformant.
  • Corynebacterium glutamicum used as a host host is a group of microorganisms defined in Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, Vol. 8, 599 (1974). Specifically, Corynebacterium glutamicum R (FERM P-18976), ATCC13032, ATCC13869, ATCC13058, ATCC13059, ATCC13060, ATCC13232, ATCC13286, ATCC13287, ATCC13655, ATCC13745, ATCC13746, ATCC13761, 318 -233 (FERM BP-1497) or MJ-233AB-41 (FERM BP-1498).
  • R (FERM P-18976) strain ATCC13032 strain, and ATCC13869 strain are preferable, and R (FERM P-18976) strain is more preferable.
  • coryneforms such as Brevibacterium flavum, Brevibacterium lactofermentum, Brevibacterium divaricatum, Corynebacterium lilium, etc.
  • the name of the bacterium is the same as Corynebacterium glutamicum [Liebl, W.
  • Corynebacterium glutamicum may be a mutant strain or an artificial genetic recombinant in addition to the wild strain.
  • disrupted strains of genes such as lactate (lactic acid) dehydrogenase (LDH), phosphoenolpyrvate carboxylase, and malate dehydrogenase.
  • LDH lactate
  • phosphoenolpyrvate carboxylase phosphoenolpyrvate carboxylase
  • malate dehydrogenase a disrupted strain of lactate dehydrogenase gene is preferable. In this gene-disrupted strain, the metabolic pathway from pyruvate to lactic acid is blocked because the lactate dehydrogenase gene is disrupted.
  • a disrupted strain of the lactate dehydrogenase gene of Corynebacterium glutamicum R is particularly preferable.
  • Such a gene-disrupted strain can be prepared according to a conventional method by genetic engineering techniques.
  • WO2005 / 010182A1 describes a lactate dehydrogenase-disrupted strain and a method for producing the same.
  • 4-hydroxybenzoate decarboxylase enzyme gene (bsdBCD or dca) 4-Hydroxybenzoate decarboxylase is an enzyme that catalyzes a phenol formation reaction by decarboxylation of 4-hydroxybenzoate.
  • the origin of the gene encoding the enzyme having 4-hydroxybenzoate decarboxylase activity is not particularly limited, Bacillus subtilis, Bacillus megaterium, Bacillus licheniformis, Bacillus licheniformis, Bacillus atrophaeus (Bacillus atrophaeus), genes from Bacillus bacteria such as Bacillus subtilis subsp.
  • genes derived from Bacillus bacteria, particularly Bacillus subtilis, Enterobacter bacteria, particularly Enterobacter cloacae genes, and Escherichia bacteria, particularly Escherichia coli genes are preferred.
  • Various abbreviations are used for genes encoding enzymes having 4-hydroxybenzoate decarboxylase activity depending on their origins.
  • the 4-hydroxybenzoate decarboxylase gene derived from Bacillus subtilis is abbreviated as bsdBCD.
  • the 4-hydroxybenzoate decarboxylase gene may be abbreviated as “dca” regardless of origin.
  • the 4-hydroxybenzoate decarboxylase enzyme gene derived from Bacillus subtilis the DNA consisting of the base sequence of SEQ ID NO: 16 is used, and as the 4-hydroxybenzoate decarboxylase enzyme gene derived from Bacillus Atropheaeus, the DNA consisting of the base sequence of SEQ ID NO: 23
  • the 4-hydroxybenzoate decarboxylase enzyme gene derived from Bacillus subtilis subspecies Spidzeny the DNA consisting of the base sequence of SEQ ID NO: 26
  • the 4-hydroxybenzoate decarboxylase enzyme gene derived from Citrobacter koseri is SEQ ID NO: 29.
  • the DNA consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 32 is As the 4-hydroxybenzoate decarboxylase enzyme gene derived from akae, the DNA consisting of the base sequence of SEQ ID NO: 35 is used, and as the 4-hydroxybenzoate decarboxylase enzyme gene derived from Enterobacter ⁇ Holmeshey, the DNA consisting of the base sequence of SEQ ID NO: 38 is used.
  • the 4-hydroxybenzoate decarboxylase enzyme gene derived from Enterobacter Sakazaki the DNA consisting of the base sequence of SEQ ID NO: 41 is used, and as the 4-hydroxybenzoate decarboxylase enzyme gene derived from Escherichia coli, the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 44 is used.
  • the 4-hydroxybenzoate-decarboxylase enzyme gene derived from Escherichia Ferguson the DNA comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 47 is the 4-hydroxybenzoate derived from Paenibacillus polymixer.
  • DNA consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 50, as the 4-hydroxybenzoate decarboxylase gene derived from Pantoea ananatis include a DNA comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 53.
  • SEQ ID NO: 16 SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 50
  • stringent conditions refers to general conditions such as those described in Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition, 1989, Vol 2, p11.45. Specifically, it refers to the case where hybridization occurs at a temperature 5 to 10 ° C. lower than the melting temperature (Tm) of the complete hybrid.
  • 4-hydroxybenzoate decarboxylase activity can be measured by the method described in “Genomics, 86, 342-351, 2005“ Materials and Methods ””. Briefly, a test enzyme is added to a test solution, a reaction solution containing 100 mM MES, pH 6.0, 1 mM DTT, 5 mM 4-hydroxybenzoate and the enzyme is prepared, and the absorbance gradient at 270 nm (initial Speed). A similar reaction is carried out for the system to which 4-hydroxybenzoate is not added to obtain a background value. The difference between the two measurements is defined as 4-hydroxybenzoate decarboxylase activity.
  • SEQ ID NO: 16 SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 50
  • a DNA encoding a polypeptide having a nucleotide sequence of 90% or more, preferably 95% or more, more preferably 98% or more, and having a 4-hydroxybenzoate decarboxylase activity is identical to the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 53 Can be used.
  • the identity of the base sequence is a value calculated by GENETYX ver.8 (manufactured by GENETYX GENETICS).
  • a DNA analog comprising a sequence can be selected from a DNA library of another species by, for example, PCR or hybridization using a primer or probe designed according to a conventional method based on these base sequences.
  • a DNA encoding a polypeptide having 4-hydroxybenzoate-decarboxylase activity is obtained with high probability.
  • Each DNA encoding 4-hydroxybenzoate decarboxylase enzyme amplified by PCR may be cloned into an appropriate vector that can be amplified in the host.
  • Any plasmid vector may be used as long as it contains a gene that controls the autonomous replication function in Corynebacterium glutamicum. Specific examples thereof include pAM330 derived from Brevibacterium lactofermentum 2256 [JP 58-67699], [Miwa, K. et al., Cryptic plasmids in glutamic acid-producing bacteria. Agric. Biol. Chem. 48: 2901-2903 (1984)] and [Yamaguchi, R.
  • pCG4 derived from Corynebacterium glutamicum T250 [JP-A 57-183799 ], [Katsumata, R. et al., Protoplast transfor mation of glutamate-producing bacteria with plasmid DNA. J. Bacteriol., 159: 306-311 (1984)], pAG1, pAG3, pAG14, pAG50 (JP 62-166890), pEK0, pEC5, pEKEx1 [Eikmanns, BJ et al., A family of Corynebacterium glutamicum / Escherichia coli shuttle vectors for cloning, controlled gene expression, and promoter probing. Gene, 102: 93-98 (1991)].
  • Preferred promoters include the promoter PgapA of glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase A gene (gapA) derived from Corynebacterium glutamicum R, the promoter Pmdh of malate dehydrogenase gene (mdh), and the promoter PldhA of lactate dehydrogenase A gene (ldhA). Among them, PgapA is preferable.
  • Preferred terminators include the rrnB T1T2 terminator of the E. coli rRNA operon, the trpA terminator of E. coli, the trp terminator of Brevibacterium lactofermentum, and the rrnB T1T2 terminator is preferred.
  • Transformation transformation methods may be used without limitation any known methods. Examples of such known methods include calcium chloride / rubidium chloride method, calcium phosphate method, DEAE-dextran mediated transfection, and electroporation.
  • the electric pulse method is suitable for Corynebacterium glutamicum, and the electric pulse method is a known method [Kurusu, Y. et al., Electroporation-transformation system for Coryneform bacteria by auxotrophic complementation. Agric. Biol. Chem. 54: 443-447 (1990)] and [Vertes AA et al., Presence of mrr- and mcr-like restriction systems in Coryneform bacteria. Res. Microbiol. 144: 181-185 (1993)] .
  • a natural medium or a synthetic medium containing a carbon source, a nitrogen source, inorganic salts, and other nutrient substances can be usually used.
  • carbon sources examples include glucose, fructose, sucrose, mannose, maltose, mannitol, xylose, arabinose, galactose, starch, molasses, sorbitol, glycerin, and other sugars or sugar alcohols; acetic acid, citric fermentation, lactic acid, fumaric acid, maleic acid Or organic acids, such as gluconic acid; Alcohol, such as ethanol and propanol, etc. are mentioned. Moreover, hydrocarbons, such as normal paraffin, etc. can be used if desired. A carbon source can be used individually by 1 type, or may mix and use 2 or more types. The concentration of these carbon sources in the medium is usually about 0.1 to 10 (w / v%).
  • the nitrogen source examples include inorganic or organic ammonium compounds such as ammonium chloride, ammonium sulfate, ammonium nitrate, and ammonium acetate, urea, aqueous ammonia, sodium nitrate, and potassium nitrate. Further, corn steep liquor, meat extract, bepton, NZ-amine, protein hydrolyzate, nitrogen-containing organic compounds such as amino acids, and the like can also be used.
  • a nitrogen source may be used individually by 1 type, and may mix and use 2 or more types. The nitrogen source concentration in the medium varies depending on the nitrogen compound used, but is usually about 0.1 to 10 (w / v%).
  • inorganic salts include monopotassium phosphate, dipotassium phosphate, magnesium sulfate, sodium chloride, ferrous nitrate, manganese sulfate, zinc sulfate, cobalt sulfate, and calcium carbonate. These inorganic salts may be used alone or in a combination of two or more. The concentration of inorganic salts in the medium varies depending on the inorganic salt used, but is usually about 0.01 to 1 (w / v%).
  • nutritional substances include meat extract, peptone, polypeptone, yeast extract, dry yeast, corn steep liquor, skim milk powder, defatted soy hydrochloride hydrolyzate, or animal and plant or microbial cell extracts and their degradation products.
  • the medium concentration of the nutrient substance varies depending on the nutrient substance to be used, but is usually about 0.1 to 10 (w / v%).
  • vitamins can be added as necessary. Examples of vitamins include biotin, thiamine (vitamin B1), pyridoxine (vitamin B6), pantothenic acid, inositol, nicotinic acid and the like.
  • the pH of the medium is preferably about 5-8.
  • a preferred microorganism culture medium is A medium (Inui, M. et al., Metabolic analysis of Corynebacterium glutamicum during lactate and succinate productions under oxygen deprivation conditions.J. Mol. Microbiol. Biotechnol. 7: 182-196 (2004)).
  • BT medium [Omumasaba, CA et al., Corynebacterium glutamicum glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase isoforms with opposite, ATP-dependent regulation. J. Mol. Microbiol. Biotechnol. 8: 91-103 (2004)].
  • the culture temperature may be about 15 to 45 ° C.
  • the culture time may be about 1 to 7 days.
  • the host Corynebacterium glutamicum has a gene (poxF) that encodes an enzyme having phenol 2-monooxygenase activity that is disrupted or deleted on the chromosome. Is preferable, and this makes it possible to produce phenol more efficiently. Further, the host Corynebacterium glutamicum preferably has a gene (pobA) encoding an enzyme having 4-hydroxybenzoate hydroxylase activity present on its chromosome destroyed or deleted, Phenol can be produced more efficiently. It is particularly preferred that both poxF and pobA are destroyed or deleted.
  • a deletion type gene is prepared by deleting a partial sequence of the gene and modified so as not to produce a normal functioning enzyme protein, and transforming a bacterium with the DNA containing the gene, By causing homologous recombination with this gene, the gene on the chromosome can be replaced with a deletion or destruction type gene. Even if the enzyme protein encoded by the deletion-type or disruption-type gene is produced, it has a three-dimensional structure different from that of the wild-type enzyme protein, and its function is reduced or lost.
  • Phenol is produced by a method comprising a step of reacting the transformant of the present invention described above in a reaction solution containing 4-hydroxybenzoate and a step of recovering phenol in the reaction solution. Can be manufactured.
  • the transformant Prior to the growth reaction of the microorganism , the transformant is preferably grown by culturing at a temperature of about 25 to 38 ° C. for about 12 to 48 hours under aerobic conditions.
  • a natural medium or a synthetic medium containing a carbon source, a nitrogen source, inorganic salts, and other nutrient substances can be used.
  • carbon sources sugars (monosaccharides such as glucose, fructose, mannose, xylose, arabinose, galactose; disaccharides such as sucrose, maltose, lactose, cellobiose, xylobiose, trehalose; polysaccharides such as starch; molasses etc.), Sugar alcohols such as mannitol, sorbitol, xylitol, glycerin; organic acids such as acetic acid, citrate, lactic acid, fumaric acid, maleic acid and gluconic acid; alcohols such as ethanol and propanol; hydrocarbons such as normal paraffin Can also be used.
  • a carbon source can be used individually by 1 type or in mixture of 2 or more
  • inorganic or organic ammonium compounds such as ammonium chloride, ammonium sulfate, ammonium nitrate and ammonium acetate, urea, aqueous ammonia, sodium nitrate, potassium nitrate and the like can be used.
  • corn steep liquor, meat extract, peptone, NZ-amine, protein hydrolyzate, nitrogen-containing organic compounds such as amino acids, and the like can be used.
  • a nitrogen source can be used individually by 1 type or in mixture of 2 or more types. The concentration of the nitrogen source in the medium varies depending on the nitrogen compound used, but is usually about 0.1 to 10 (w / v%).
  • inorganic salts examples include monopotassium phosphate, dipotassium phosphate, magnesium sulfate, sodium chloride, ferrous nitrate, manganese sulfate, zinc sulfate, cobalt sulfate, and calcium carbonate.
  • One inorganic salt can be used alone, or two or more inorganic salts can be mixed and used.
  • the concentration of inorganic salts in the medium varies depending on the inorganic salt used, but is usually about 0.01 to 1 (w / v%).
  • Examples of nutritional substances include meat extract, peptone, polypeptone, yeast extract, dry yeast, corn steep liquor, skim milk powder, defatted soy hydrochloride hydrolyzate, extracts of animals and plants or microbial cells, and degradation products thereof.
  • concentration of the nutrient substance in the medium varies depending on the nutrient substance to be used, but is usually about 0.1 to 10 (w / v%).
  • vitamins can be added as necessary. Examples of vitamins include biotin, thiamine (vitamin B1), pyridoxine (vitamin B6), pantothenic acid, inositol, nicotinic acid and the like.
  • the pH of the medium is preferably about 6-8.
  • Corynebacterium glutamicum As a specific preferable medium for Corynebacterium glutamicum, A medium [Inui, M. et al., Metabolic analysis of Corynebacterium glutamicum during lactate and succinate productions under oxygen deprivation conditions. J. Mol. Microbiol. Biotechnol. -196 (2004)), BT medium (Omumasaba, CA et al., Corynebacterium glutamicum glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase isoforms with opposite, ATP-dependent regulation. J. Mol. Microbiol.biBiotechnol. 8: 91-103 (2004) ] Etc. are mentioned. In these media, the saccharide concentration may be used within the above range.
  • reaction solution water containing a phenol precursor (phenol raw material), a buffer solution, an inorganic salt medium, or the like can be used.
  • 4-Hydroxybenzoate is used as a precursor.
  • 4-hydroxybenzoates include salts such as sodium salts and potassium salts; esters with alcohols having 1 to 4 carbon atoms. Among these, a salt is preferable and a sodium salt is more preferable.
  • a precursor can be used individually by 1 type or in mixture of 2 or more types.
  • the concentration of 4-hydroxybenzoate in the reaction solution is preferably about 0.5 to 20 (w / v%), more preferably about 1 to 10 (w / v%), and about 2 to 5 (w / v%). Even more preferred.
  • 4-hydroxybenzoate is an aromatic compound, it has a cell survival inhibitory effect. However, if the 4-hydroxybenzoate concentration is in the above range, phenol can be produced efficiently.
  • the buffer include phosphate buffer, tris buffer, carbonate buffer, and the like. The concentration of the buffer is preferably about 10 to 150 mM.
  • the inorganic salt medium include one or two inorganic salts such as monopotassium phosphate, dipotassium phosphate, magnesium sulfate, sodium chloride, ferrous nitrate, manganese sulfate, zinc sulfate, cobalt sulfate, and calcium carbonate. Examples include a medium containing the above.
  • a medium containing magnesium sulfate is preferable.
  • the inorganic salt medium specifically, BT medium [Omumasaba, CA et al., Corynebacterium glutamicum glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase isoforms with opposite, ATP-dependent regulation. J. Mol. Microbiol. Biotechnol. 8: 91-103 (2004)].
  • the concentration of inorganic salts in the medium varies depending on the inorganic salt used, but is usually about 0.01 to 1 (w / v%).
  • the pH of the reaction solution is preferably about 6-8.
  • the reaction temperature that is, the survival temperature of the transformant during the reaction is preferably about 20 to 50 ° C, more preferably about 25 to 47 ° C. If it is the said temperature range, a phenol can be manufactured efficiently.
  • the reaction time is preferably about 1 to 7 days, more preferably about 1 to 3 days.
  • the culture may be any of batch type, fed-batch type, and continuous type. Among these, the batch type is preferable.
  • the reaction may be carried out under aerobic conditions or under reducing conditions, but is preferably carried out under reducing conditions. Under reducing conditions, Corynebacterium glutamicum does not substantially grow and can produce phenol more efficiently.
  • the reduction condition is defined by the redox potential of the reaction solution.
  • the oxidation-reduction potential of the reaction solution is preferably about ⁇ 200 mV to ⁇ 500 mV, more preferably about ⁇ 250 mV to ⁇ 500 mV.
  • the reduction state of the reaction solution can be easily estimated with a resazurin indicator (decolorization from blue to colorless in the reduction state), but using a redox potentiometer (for example, BROADLEY JAMES, ORP Electrodes) Can be measured.
  • a known method can be used without limitation.
  • a liquid medium for preparing a reaction solution an aqueous solution for a reaction solution may be used instead of distilled water.
  • the method for preparing the aqueous solution for a reaction solution is, for example, a culture for an anaerobic microorganism such as a sulfate-reducing microorganism.
  • Liquid preparation method (Pfennig, N. et al., (1981): The dissimilatory sulfate-reducing bacteria, In The Prokaryotes, A Handbook on Habitats, Isolation and Identification of Bacteria Ed.
  • an aqueous solution under conditions can be obtained.
  • an aqueous solution for reaction solution under reducing conditions can be obtained by removing dissolved gas by heat treatment or reduced pressure treatment of distilled water or the like.
  • distilled water or the like is treated for about 1 to 60 minutes, preferably about 5 to 40 minutes under reduced pressure of about 10 mmHg or less, preferably about 5 mmHg or less, more preferably about 3 mmHg or less.
  • the dissolved gas, particularly dissolved oxygen can be removed to prepare an aqueous solution for reaction solution under reducing conditions.
  • an appropriate reducing agent for example, thioglycolic acid, ascorbic acid, cysteine hydrochloride, mercaptoacetic acid, thiolacetic acid, glutathione, sodium sulfide, etc.
  • An appropriate combination of these methods is also an effective method for preparing an aqueous solution for reaction solution under reducing conditions.
  • the reaction solution is kept under reducing conditions during the reaction.
  • the reaction system is made of an inert gas such as nitrogen gas or carbon dioxide gas.
  • the method of enclosing is mentioned.
  • a pH maintenance adjustment solution of the reaction system and various nutrient solution In such a case, it is effective to remove oxygen from the added solution in advance.
  • Phenol is produced in the reaction solution by culturing as described above.
  • the phenol can be recovered by recovering the reaction solution, but the phenol can also be separated from the reaction solution by a known method. Examples of such known methods include distillation, membrane permeation, and organic solvent extraction.
  • Example 1 Cloning and expression of a phenol production gene
  • Extraction of chromosomal DNA from Corynebacterium glutamicum R (FERM P-18976) can be performed using the medium A [(NH 2 ) 2 CO 2 g, (NH 4 ) 2 SO 4 7 g, KH 2 PO 4 0.5 g, K 2 HPO 4 0.5 g, MgSO 4 .7H 2 O 0.5 g, 0.06% (w / v) Fe 2 SO 4 .7H 2 O + 0.042% (w / v) MnSO 4 .2H 2 O 1 ml, 0.02% (w / v) biotin solution 1 ml, 0.01% (w / v) thiamin solution 2 ml, yeast extract 2 g, vitamin assay casamino acid 7 g in 1 L of
  • NBRC Medium No.802 medium polypeptone 10 g, yeast extract 2 g, MgSO 4 ⁇ 7H 2 O 1 g dissolved in 1 L distilled water
  • NBRC Medium No.802 medium polypeptone 10 g, yeast extract 2 g, MgSO 4 ⁇ 7H 2 O 1 g dissolved in 1 L distilled water
  • DNA genome extraction kit trade name: GenomicPrep Cells and Tissue DNA Isolation Kit, manufactured by Amersham
  • Chromosomal DNA extraction from Bacillus atrophaeus JCM 9070 was performed using platinum ears in JCM Medium No.22 medium. [Peptone 10 g, beef extract 10 g, NaCl 5 g dissolved in 1 L of distilled water]. After the bacteria, shake culture at 30 ° C until the logarithmic growth phase, collect the cells, and use the DNA genome extraction kit (trade name: GenomicPrep Cells and Tissue DNA Isolation Kit, manufactured by Amersham) according to the instruction manual, Chromosomal DNA was recovered from the collected cells.
  • the DNA genome extraction kit trade name: GenomicPrep Cells and Tissue DNA Isolation Kit, manufactured by Amersham
  • Bacillus subtilis subsp Supijizenii (Bacillus subtilis subsp. Spizizenii) Chromosomal DNA extraction from NBRC one hundred and one thousand two hundred and thirty-nine is, NBRC Medium No.802 medium [polypeptone 10 g, yeast extract 2 g, MgSO 4 ⁇ 7H 2 O 1 g distilled water 1 L After inoculation with a platinum loop and shaking culture at 37 ° C until logarithmic growth phase, the cells are collected, and then a DNA genome extraction kit (trade name: GenomicPrep Cells and Tissue DNA Isolation Kit, Amersham) Chromosomal DNA was collected from the collected cells according to the instruction manual.
  • NBRC Medium No.802 medium polypeptone 10 g, yeast extract 2 g, MgSO 4 ⁇ 7H 2 O 1 g distilled water 1 L
  • a DNA genome extraction kit (trade name: GenomicPrep Cells and Tissue DNA Isolation Kit, Amersham) Chromos
  • Citrobacter koseri ATCC BAA-895 chromosomal DNA (Catalog No. BAA-895D-5) was obtained from ATCC (American Type Culture Collection).
  • NBRC 13534, NBRC Medium No. 802 medium [polypeptone 10 g, yeast extract 2 g, MgSO 4 ⁇ 7H 2 O 1 g dissolved in 1 L distilled water] After inoculation using platinum ears and shaking culture at 37 ° C until the logarithmic growth phase, after collecting the cells, using DNA genome extraction kit (trade name: GenomicPrep Cells and Tissue DNA Isolation Kit, manufactured by Amersham) According to the instruction manual, chromosomal DNA was recovered from the collected cells.
  • DNA genome extraction kit trade name: GenomicPrep Cells and Tissue DNA Isolation Kit, manufactured by Amersham
  • NBRC Medium No.802 medium polypeptone 10 g, yeast extract 2 g, MgSO 4 ⁇ 7H 2 O 1 g dissolved in 1 L distilled water
  • DNA genome extraction kit trade name: GenomicPrep Cells and Tissue DNA Isolation Kit, manufactured by Amersham
  • Chromosomal DNA extraction from Enterobacter hormaechei ATCC 49162 was performed using Tryptic Soy Broth medium [Tryptic Soy Broth (Becton, Dickinson and Company Catalog No. 211825) 30 g in 1 L distilled water] After inoculation using, shake culture at 30 ° C until the logarithmic growth phase, collect the cells and handle them using a DNA genome extraction kit (trade name: GenomicPrep Cells and Tissue DNA Isolation Kit, manufactured by Amersham) Chromosomal DNA was recovered from the collected cells according to the instructions.
  • Tryptic Soy Broth medium Tryptic Soy Broth (Becton, Dickinson and Company Catalog No. 211825) 30 g in 1 L distilled water]
  • Chromosomal DNA (Catalog No. BAA-894D-5) from Enterobacter sakazakii ATCC BAA-894 was obtained from ATCC (American Type Culture Collection). Extraction of chromosomal DNA from Escherichia coli W NBRC 13500 is done in NBRC Medium No.802 medium [polypeptone 10 g, yeast extract 2 g, MgSO 4 ⁇ 7H 2 O 1 g dissolved in 1 L of distilled water] After inoculation with platinum ears, shake culture at 30 ° C until logarithmic growth phase, collect cells, and use DNA genome extraction kit (trade name: GenomicPrep Cells and Tissue DNA Isolation Kit, manufactured by Amersham) According to the instruction manual, chromosomal DNA was recovered from the collected cells.
  • NBRC Medium No.802 medium polypeptone 10 g, yeast extract 2 g, MgSO 4 ⁇ 7H 2 O 1 g dissolved in 1 L distilled water
  • DNA genome extraction kit trade name: GenomicPrep Cells and Tissue DNA Isolation Kit, manufactured by Amersham
  • Extraction of chromosomal DNA from Pantoea ananatis LMG 320103 was performed by dissolving BCCM / LMG BacteriCulture Medium No.1 medium [beef extract 1 g, yeast extract 2 g, peptone 5 g, NaCl 5 g] After inoculation with platinum ears, shake culture at 30 ° C until the logarithmic growth phase, collect the cells and collect DNA genome extraction kit (trade name: GenomicPrep Cells and Tissue DNA Isolation Kit, manufactured by Amersham) The chromosomal DNA was collected from the collected cells according to the instruction manual.
  • Cloning Vector pCRB22 DNA fragment containing the DNA replication origin (hereinafter referred to as pCASE1-ori) of plasmid pCASE1 from Corynebacterium casei JCM12072 and the cloning vector pHSG298 (manufactured by Takara Bio Inc.), respectively, by the following PCR method Amplified by During PCR, in order to clone the pCASE1-ori sequence and the cloning vector pHSG298, respectively, the following pairs of primers were synthesized based on SEQ ID NO: 1 (pCASE1-ori sequence) and SEQ ID NO: 2 (cloning vector-pHSG298). ,used.
  • pCASE1-ori sequence amplification primer (a-1); 5'- AT AGATCT AGAACGTCCGTAGGAGC -3 '(SEQ ID NO: 3) (B-1); 5'-AT AGATCT GACTTGGTTACGATGGAC-3 '(SEQ ID NO: 4)
  • the primers (a-1) and (b-1) have a BglII restriction enzyme site added.
  • Cloning vector pHSG298 amplification primer (a-2); 5'- AT AGATCT AGGTTTCCCGACTGGAAAG -3 '(SEQ ID NO: 5) (B-2); 5'- AT AGATCT CGTGCCAGCTGCATTAATGA -3 '(SEQ ID NO: 6)
  • a BglII restriction enzyme site is added to primers (a-2) and (b-2).
  • template DNA total DNA extracted from Corynebacterium casei JCM12072 obtained from Japan. Collection of Microorganisms (JCM) and cloning vector pHSG298 (manufactured by Takara Bio Inc.) were used. Actual PCR was performed under the following conditions using a thermal cycler GeneAmp PCR System 9700 (Applied Biosystems) and TaKaRa LA Taq (Takara Bio Inc.) as a reaction reagent.
  • About 10 ⁇ l of about 1.4-kb DNA fragment containing plasmid pCASE1-ori sequence derived from Corynebacterium casei strain amplified by PCR and about 10 ⁇ l of about 2.7-kb DNA fragment containing cloning vector pHSG298 were each digested with restriction enzyme BglII, and 70 ° C. After inactivating the restriction enzyme for 10 minutes, mix the two and add 1 unit of T4 DNA ligase 10x buffer and 1 unit of T4 DNA ligase (Takara Bio Inc.) 1 unit. Then, it was made 10 ⁇ l with sterilized distilled water, reacted at 15 ° C. for 3 hours, and bound. This was designated as Ligation A solution.
  • the resulting ligation A solution was transformed into Escherichia coli JM109 by the calcium chloride method [Journal of Molecular Biology, 53, 159 (1970)], and an LB agar medium containing 1 ⁇ g polypeptone, 0.5% yeast containing 50 ⁇ g / ml kanamycin. Extract, 0.5% sodium chloride, and 1.5% agar).
  • the growing strain on the medium was subjected to liquid culture by a conventional method, plasmid DNA was extracted from the culture, and the plasmid was cleaved with restriction enzyme BglII to confirm the inserted fragment.
  • the cloning vector containing the pCASE1-ori sequence was named pCRB22.
  • cloning vector pCRB207 DNA fragment containing promoter sequence (hereinafter referred to as PgapA) of gapA gene encoding glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase derived from Corynebacterium glutamicum R, and cloning vector A DNA fragment containing an rrnBT1T2 bidirectional terminator sequence (hereinafter referred to as terminator sequence) derived from pKK223-3 (Pharmacia) was amplified by the following method.
  • PgapA promoter sequence
  • terminator sequence rrnBT1T2 bidirectional terminator sequence
  • PgapA sequence amplification primer (a-3); 5'- CTCT GTCGAC CCGAAGATCTGAAGATTCCTG -3 '(SEQ ID NO: 9) (B-3); 5'- CTCT GTCGAC GGATCC CCATGG TGTGTCTCCTCTAAAGATTGTAGG -3 ' (SEQ ID NO: 10)
  • the primer (a-3) has a SalI restriction enzyme site
  • the primer (b-3) has a SalI, BamHI and NcoI restriction enzyme sites.
  • Terminator sequence amplification primer (a-4); 5'- CTCT GCATGC CCATGG CTGTTTTGGCGGATGAGAGA -3 ' (SEQ ID NO: 11) (B-4); 5'-CTCT GCATGC TCATGA AAGAGTTTGTAGAAACGCAAAAAGG -3 (SEQ ID NO: 12)
  • the primer (a-4) has SphI and NcoI restriction enzyme sites, and the primer (b-4) has SphI and BspHI restriction enzyme sites.
  • chromosomal DNA extracted from Corynebacterium glutamicum R (FERM P-18976) and pKK223-3 plasmid (Pharmacia) were used. Actual PCR was performed under the following conditions using a thermal cycler GeneAmp PCR System 9700 (Applied Biosystems) and TaKaRa LA Taq (Takara Bio Inc.) as a reaction reagent.
  • the resulting ligation solution B was transformed into Escherichia coli JM109 by the calcium chloride method [Journal of Molecular Biology, 53, 159 (1970)], and an LB agar medium containing 50 ⁇ g / ml kanamycin [1% polypeptone, 0.5% yeast Extract, 0.5% sodium chloride, and 1.5% agar).
  • the growing strain on the medium was subjected to liquid culture by a conventional method, plasmid DNA was extracted from the culture solution, and the plasmid was cleaved with restriction enzyme SalI to confirm the inserted fragment.
  • the cloning vector containing the PgapA sequence was named pCRB206.
  • 10 ⁇ l of about 0.4-kb DNA fragment containing the terminator sequence derived from pKK223-3 plasmid amplified by PCR is digested with restriction enzymes NcoI and BspHI, and 2 ⁇ l of the above cloning vector pCRB206 is digested with restriction enzyme NcoI and treated at 70 ° C. for 10 minutes. After inactivating the restriction enzyme, mix both components, add 1 ⁇ l of T4 DNA ligase 10 ⁇ buffer and 1 unit of T4 DNA ligase (Takara Bio Inc.) and sterilized distilled water. 10 ⁇ l was allowed to react at 15 ° C. for 3 hours for binding. This was designated as Ligation C solution.
  • the obtained ligation C solution was transformed into Escherichia coli JM109 by the calcium chloride method [Journal of Molecular Biology, 53, 159 (1970)], and an LB agar medium containing 50 ⁇ g / ml kanamycin [1% polypeptone, 0.5% yeast Extract, 0.5% sodium chloride, and 1.5% agar).
  • the growing strain on the medium was subjected to liquid culture by a conventional method, plasmid DNA was extracted from the culture, and the plasmid was cleaved with a restriction enzyme to confirm the inserted fragment.
  • the cloning vector containing the rrnBT1T2 terminator sequence was named pCRB207.
  • Cloning Vector pCRB209 A DNA fragment containing the promoter (hereinafter referred to as PgapA) sequence of gapA (glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase A) gene derived from Corynebacterium glutamicum R was amplified by the following method. During PCR, the following pair of primers were synthesized and used based on SEQ ID NO: 13 (pCRB207) in order to clone the pCRB207 sequence.
  • PgapA promoter sequence of gapA gene derived from Corynebacterium glutamicum R
  • pCRB207 sequence amplification primer (a-5); 5'- CTCT CATATG CTGTTTTGGCGGATGAGAG -3 '(SEQ ID NO: 14) (B-5); 5'-CTCT CATATG GTGTCTCCTCTAAAGATTGTAGG-3 '(SEQ ID NO: 15)
  • an NdeI restriction enzyme site is added to the primers (a-5) and (b-5).
  • the cloning vector pCRB207 containing the gapA promoter and the rrnBT1T2 terminator sequence was used as the template DNA.
  • the actual PCR was performed using the thermal cycler GeneAmp PCR System 9700 (Applied Biosystems) and TaKaRa LA Taq (Takara Shuzo Co., Ltd.) as a reaction reagent under the following conditions.
  • the obtained ligation D solution was transformed into Escherichia coli JM109 by the calcium chloride method [Journal of Molecular Biology, 53, 159 (1970)], and an LB agar medium containing 50 ⁇ g / ml kanamycin [1% polypeptone, 0.5% yeast Extract, 0.5% sodium chloride, and 1.5% agar).
  • the growing strain on this medium was subjected to liquid culture by a conventional method, plasmid DNA was extracted from the culture, and the plasmid was cleaved with the restriction enzyme NdeI to confirm the insertion of the restriction enzyme site.
  • the cloning vector containing the PgapA sequence and the rrnBT1T2 terminator sequence was named pCRB209.
  • bsdBCD gene amplification primer (a-6); 5'-CTCT CATATG AAAGCAGAATTCAAGCGTAAAG -3 '(SEQ ID NO: 17) (B-6); 5'-CTCT CATATG GATCAAGCCTTTCGTTCCG -3 '(SEQ ID NO: 18)
  • the NdeI restriction enzyme site is added to the primers (a-6) and (b-6).
  • dca gene amplification primer (a-9); 5'-CTCT CATATG AAACTCGTTGTCGGGATG -3 '(SEQ ID NO: 24) (B-9); 5'-CTCT CATATG TCAGGCCTTTCTTTCC -3 '(SEQ ID NO: 25)
  • an NdeI restriction enzyme site is added to the primers (a-9) and (b-9).
  • dca gene amplification primer (a-10); 5'-CTCT CATATG AAAGCAGAATTCAAGCGTAAAG -3 '(SEQ ID NO: 27) (B-10); 5'-CTCT CATATG TCAAGCCTTTCGTTCCGG -3 '(SEQ ID NO: 28)
  • the primers (a-10) and (b-10) have an NdeI restriction enzyme site added.
  • dca gene amplification primer (a-11); 5'- CTCT CATATG AGACTGATTGTGGGGATG -3 '(SEQ ID NO: 30) (B-11); 5'-CTCT CATATG TTAACGCTTATCTTCCGCCAG-3 '(SEQ ID NO: 31)
  • an NdeI restriction enzyme site is added to the primers (a-11) and (b-11).
  • dca gene amplification primer (a-12); 5'-CTCT CATATG AAACTGATTATTGGGATGACCG-3 '(SEQ ID NO: 33) (B-12); 5'-CTCT CATATG TTAACGCTTATCTGCCGCC-3 '(SEQ ID NO: 34)
  • the NdeI restriction enzyme site is added to the primers (a-12) and (b-12).
  • Cloning of Enterobacter cloacae-derived phenol production gene A DNA fragment containing the dca gene encoding a gene having 4-hydroxybenzoate decarboxylase activity derived from Enterobacter cloacae was amplified by the following PCR method. At the time of PCR, in order to clone the dca gene, based on SEQ ID NO: 35 (Enterobacter cloacae dca gene), each of the following pair of primers was applied to “394 DNA / RNA synthesizer (Applied Biosystems)” synthesizer) ”and used.
  • dca gene amplification primer (a-13); 5'-CTCT CATATG AGATTGATCGTGGGAATGAC -3 '(SEQ ID NO: 36) (B-13); 5'-CTCT CATATG TTACAGCAATGGCGGAATGG -3 '(SEQ ID NO: 37)
  • an NdeI restriction enzyme site is added to the primers (a-13) and (b-13).
  • dca gene amplification primer (a-14); 5'- CTCT CATATG AGATTGATTGTGGGAATGAC -3 '(SEQ ID NO: 39) (B-14); 5'-CTCT CATATG GAGTCTGGTTTAGTTCTCTGC-3 '(SEQ ID NO: 40)
  • an NdeI restriction enzyme site is added to the primers (a-14) and (b-14).
  • dca gene amplification primer (a-15); 5'-CTCT CATATG AGGCTAATTGTCGGAATGAC-3 '(SEQ ID NO: 42) (B-15); 5'-CTCT CATATG TTAACGCTTACCATCCGCC -3 '(SEQ ID NO: 43)
  • an NdeI restriction enzyme site is added to the primers (a-15) and (b-15).
  • dca gene amplification primer (a-16); 5'-CTCT CATATG AAACTGATCGTCGGGATG -3 '(SEQ ID NO: 45) (B-16); 5'-CTCT CATATG TTAGCGCTTACCTTCCGC-3 '(SEQ ID NO: 46)
  • the NdeI restriction enzyme site is added to the primers (a-16) and (b-16).
  • dca gene amplification primer (a-17); 5'- CTCT CATATG AGACTGATCGTCGGGAT -3 '(SEQ ID NO: 48) (B-17); 5'-CTCT CATATG TTAGCGCTTATCTGCCGC -3 '(SEQ ID NO: 49)
  • an NdeI restriction enzyme site is added to the primers (a-17) and (b-17).
  • dca gene amplification primer (a-18); 5'-CTCT CATATG AAGAAAATCATTGTAGGAATATCGG -3 '(SEQ ID NO: 51) (B-18); 5'-CTCT CATATG CTATATCCGCTCTGGAATAGG -3 '(SEQ ID NO: 52)
  • an NdeI restriction enzyme site is added to the primers (a-18) and (b-18).
  • dca gene amplification primer (a-19); 5'- CTCT CATATG AGTAGATTACTGTTAATTTCATTCGTAC -3 (SEQ ID NO: 54) (B-19); 5'- CTCT CATATG TTACTTAGCTAACAGAGGAGGG -3 ' (SEQ ID NO: 55)
  • NdeI restriction enzyme site is added to the primers (a-19) and (b-19).
  • chromosomal DNA extracted from Bacillus subtilis NBRC 14144 obtained from NITE (National Institute of Technology and Evaluation) Biological Resource Center (NBRC) was used.
  • Bacillus Atrophaeus chromosomal DNA extracted from Bacillus Atrophaeus JCM 9070 obtained from Japan Collection of Microorganisms (JCM) was used.
  • the Bacillus subtilis subspecies spidizenii used chromosomal DNA extracted from the Bacillus subtilis subsp.
  • Citrobacter coseri Citrobacter coseri chromosomal DNA (catalog No. BAA-895D-5) obtained from American Type Culture Collection (ATCC) was used.
  • Enterobacter aerogenes used chromosomal DNA extracted from Enterobacter aerogenes NBRC 13534 obtained from NITE (National Institute of Technology and Evaluation) Biological Resource Center (NBRC).
  • Enterobacter cloacae was chromosomal DNA extracted from Enterobacter cloacae NBRC 13535 obtained from the National Institute of Technology and Evaluation (NITE) Biological Resource Center (NBRC).
  • Enterobacter holmasei used chromosomal DNA extracted from Enterobacter hormeshii ATCC 49162 obtained from the American Type Culture Collection (ATCC).
  • Enterobacter Sakazaki used Enterobacter Sakazaki chromosomal DNA (catalog No. BAA-894D-5) obtained from the American Type Culture Collection (ATCC).
  • Escherichia coli W used chromosomal DNA extracted from Escherichia coli NBRC 13500 obtained from NITE (National Institute of Technology and Evaluation) Biological Resource Center (NBRC).
  • Escherichia Ferg Sony used chromosomal DNA extracted from Escherichia Ferg Sony NBRC 102419 obtained from the National Institute of Technology and Evaluation (NITE) Biological Resource Center (NBRC).
  • NBRC National Institute of Technology and Evaluation
  • NBRC National Institute of Technology and Evaluation
  • NBRC National Institute of Technology and Evaluation
  • NBRC National Institute of Technology and Evaluation
  • Pantoea ananatis chromosomal DNA extracted from Pantoea ananatis LMG 20103 obtained from BCCM / LMG (Belgian Coordinated Collections of Microorganisms / Laboratory for Microbiology, University of Gent) was used.
  • Primer (a-17) and (b-17) are combined to amplify the signal, and Paenibacillus polymixer dca gene is amplified to combine the primer (a-18) and (b-18), and the Pantoea ananatis dca gene is amplified. To do so, the combination of primers (a-19) and (b-19) was used.
  • 2.3-kb about 2.3-kb for Citrobacter coseri dca gene, about 2.3-kb for Enterobacter aerogenes dca gene, about 2.3-kb for Enterobacter cloacae dca gene, about 2.4- ⁇ for Enterobacter formacey dca gene kb, about 2.3-kb for Enterobacter Sakazaki dca gene, about 2.3-kb for Escherichia coli W dca gene, about 2.3-kb for Escherichia Ferg Sony dca gene, about 2.3-kb for Paenibacillus polymixer dca gene, Pantoea Ananatis In the case of the dca gene, a DNA fragment of about 2.3-kb It was detected.
  • T4 DNA ligase 10 ⁇ buffer T4 DNA ligase (Takara Bio) 1 unit of each component was added, made up to 10 ⁇ l with sterile distilled water, reacted at 15 ° C. for 3 hours, and bound. This was designated as Ligation E solution, G solution, H solution, I solution, J solution, K solution, L solution, M solution, N solution, O solution, P solution and Q solution, respectively.
  • Each of the 12 types of ligation E solution, G solution, H solution, I solution, J solution, K solution, L solution, M solution, N solution, O solution, P solution and Q solution was converted into calcium chloride method [Journal of Molecular Biology, 53, 159 (1970)) and transformed into LB agar medium (1% polypeptone, 0.5% yeast extract, 0.5% sodium chloride, and 1.5% agar) containing 50 ⁇ g / ml of kanamycin. Applied.
  • Each of the growing strains on the medium was subjected to liquid culture by a conventional method, plasmid DNA was extracted from the culture solution, and each plasmid was cleaved with a restriction enzyme to confirm the inserted fragment.
  • the bsdBCD gene (ligation E solution) derived from the Bacillus subtilis strain has an inserted fragment of about 2.3-kb in length.
  • the inserted fragment of about 2.3-kb in length is the dca gene derived from Bacillus subtilis subsp. Spidizenii strain (ligation H solution)
  • the inserted fragment of about 2.3-kb in length is the dca gene derived from Citrobacter koseri strain
  • the insert fragment of about 2.3-kb in length is derived from Enterobacter Aerogenes strain.
  • the insert fragment of about 2.3-kb length is derived from Enterobacter cloacae
  • an insert fragment of about 2.3-kb in length is inserted into the dca gene derived from Enterobacter holmeschei strain (ligation ligation).
  • the insert fragment of about 2.4-kb in length is the dca gene derived from Enterobacter Sakazaki strain (Ligation M solution)
  • the insert fragment of about 2.3-kb in length is the dca gene derived from Escherichia coli W strain.
  • the insert fragment of about 2.3-kb in length is the dca gene derived from Escherichia Ferg Sony strain (ligation O solution).
  • (Ligation P solution) an inserted fragment having a length of about 2.3-kb was observed
  • the dca gene derived from Pantoea ananatis strain (Ligation Q solution) an inserted fragment having a length of about 2.3-kb was observed.
  • the plasmid containing the bsdBCD gene derived from the Bacillus subtilis strain is pCRB209-bsdBCD / BS (Fig.
  • the plasmid containing the dca gene derived from the Bacillus atrophaeus strain is pCRB209-dca / BAE, and the plasmid containing the dca gene derived from the Bacillus subtilis subsp.
  • a plasmid containing the dca gene derived from Citrobacter koseri strain pCRB209-dca / CKO a plasmid containing the dca gene derived from Enterobacter aerogenes strain pCRB209-dca / EAE
  • a plasmid containing the dca gene derived from Enterobacter cloacae strain pCRB209-dca / ECL, pCRB209-dca / EHO a plasmid containing the dca gene from Enterobacter horumesii, pCRB209-dca / ESA
  • a plasmid containing the dca gene from Enterobacter Sakazaki a plasmid containing the dca gene from Escherichia coli W PCRB209-dca / ECK, Escherichia Fergsoni Line-derived dca gene Plasmids containing the dca gene derived from Citr
  • poxF-1 region amplification primer (a-7); 5'-CTCT TCTAGA TACGTCCTAAACACCCGAC -3 '(SEQ ID NO: 19) (B-7); 5'- GACCAACCATTGCTGACTTGCGTATCCATAGTCAGGCTTC -3 ' (SEQ ID NO: 20)
  • the primer (a-7) has an XbaI restriction enzyme site added.
  • poxF-2 region amplification primer (a-8); 5'- CAAGTCAGCAATGGTTGGTC -3 '(SEQ ID NO: 21) (B-8); 5'-CTCT TCTAGA TGATCAGTACCAAGGGTGAG -3 '(SEQ ID NO: 22)
  • the XbaI restriction enzyme site is added to the primer (b-8).
  • chromosomal DNA extracted from Corynebacterium glutamicum R was used as the template DNA.
  • Actual PCR was performed under the following conditions using a thermal cycler GeneAmp PCR System 9700 (Applied Biosystems) and TaKaRa LA Taq (Takara Bio Inc.) as a reaction reagent.
  • the poxF deletion fragment was amplified by PCR.
  • Actual PCR was performed under the following conditions using a thermal cycler GeneAmp PCR System 9700 (Applied Biosystems) and TaKaRa LA Taq (Takara Bio Inc.) as a reaction reagent.
  • Corynebacterium glutamicum R-derived poxF deletion sequence about 1.7-kb DNA fragment 10 ⁇ l amplified by the above PCR and about 4.4-kb markerless chromosomal gene transfer plasmid pCRA725 [J. Mol. Microbiol. Biotechnol., Vol. 8 , 243-254 (2004), (Japanese Patent Laid-Open No. 2006-124440)] 2 ⁇ l each was cleaved with the restriction enzyme XbaI and inactivated by treating at 70 ° C. for 10 minutes.
  • T4 DNA ligase 10 ⁇ buffer 1 ⁇ l and T4 DNA ligase (Takara Bio Inc.) 1 unit was added to 10 ⁇ l with sterilized distilled water, reacted at 15 ° C. for 3 hours, and bound. This was designated as Ligation F solution.
  • the resulting ligation F solution was transformed into Escherichia coli JM109 by the calcium chloride method [Journal of Molecular Biology, 53, 159 (1970)], and an LB agar medium containing 50 ⁇ g / ml kanamycin [1% polypeptone, 0.5% yeast Extract, 0.5% sodium chloride, and 1.5% agar).
  • the growing strain on the medium was subjected to liquid culture by a conventional method, plasmid DNA was extracted from the culture solution, and each plasmid was cleaved with the restriction enzyme XbaI to confirm the inserted fragment.
  • plasmid DNA was extracted from the culture solution, and each plasmid was cleaved with the restriction enzyme XbaI to confirm the inserted fragment.
  • XbaI restriction enzyme
  • an insertion fragment of about 1.7-kb in length was observed in the case of the pheA deletion gene derived from the Corynebacterium glutamicum strain (ligation F solution).
  • a plasmid containing a poxF deletion gene derived from Corynebacterium glutamicum was named pCRA725-poxF / CG.
  • Corynebacterium glutamicum strain pobA gene disruption plasmid A DNA fragment necessary for constructing a markerless disruption plasmid of the pobA gene on the chromosome of Corynebacterium glutamicum strain was amplified by the following PCR method. Based on the sequence of Corynebacterium glutamicum R, the following pair of primers were synthesized and used using “394 DNA / RNA synthesizer” (Applied Biosystems), respectively.
  • pobA-1 region amplification primer (a-20); 5'- CTCT TCTAGA GAAACGATCAAGTGCACCAG -3 '(SEQ ID NO: 56) (B-20); 5'- GACACGAGCGTTTATACCTCTAATTGCCACTGGTACGTGG -3 ' (SEQ ID NO: 57)
  • the XbaI restriction enzyme site is added to the primer (a-20).
  • pobA-2 region amplification primer (a-21); 5'- GAGGTATAAACGCTCGTGTC -3 '(SEQ ID NO: 58) (B-21); 5'-CTCT GAGCTC GAGAACACGAACCATACGAG -3 (SEQ ID NO: 59)
  • a SacI restriction enzyme site is added to the primer (b-21).
  • chromosomal DNA extracted from Corynebacterium glutamicum R was used as the template DNA.
  • Actual PCR was performed under the following conditions using a thermal cycler GeneAmp PCR System 9700 (Applied Biosystems) and TaKaRa LA Taq (Takara Bio Inc.) as a reaction reagent.
  • the pobA-deleted fragment was amplified by PCR using the obtained pobA-1 and pobA-2 binding fragments as templates. Actual PCR was performed under the following conditions using a thermal cycler GeneAmp PCR System 9700 (Applied Biosystems) and TaKaRa LA Taq (Takara Bio Inc.) as a reaction reagent.
  • Corynebacterium glutamicum R-derived pobA deletion sequence about 2.0 ⁇ l of DNA fragment 10 ⁇ l and about 4.4-kb markerless chromosomal gene transfer plasmid pCRA725 [J. Mol. Microbiol. Biotechnol. Vol. 8, 243- 254 (2004), (Japanese Patent Laid-Open No. 2006-124440)] 2 ⁇ l were cleaved with the restriction enzymes XbaI and SacI, respectively, and the restriction enzyme was inactivated by treating at 70 ° C. for 10 minutes.
  • T4 DNA ligase 10 ⁇ buffer 1 ⁇ l and T4 DNA ligase (Takara Bio Inc.) 1 unit was added, made 10 ⁇ l with sterilized distilled water, reacted at 15 ° C. for 3 hours, and bound. This was designated as Ligation R solution.
  • the resulting ligation solution R was transformed into Escherichia coli JM109 by the calcium chloride method [Journal of Molecular Biology, 53, 159 (1970)], and an LB agar medium containing 50 ⁇ g / ml kanamycin [1% polypeptone, 0.5% yeast Extract, 0.5% sodium chloride, and 1.5% agar).
  • the growing strain on the medium was subjected to liquid culture by a conventional method, plasmid DNA was extracted from the culture solution, and the plasmid was cleaved with restriction enzymes XbaI and SacI to confirm the inserted fragment.
  • restriction enzymes XbaI and SacI restriction enzymes XbaI and SacI to confirm the inserted fragment.
  • an insertion fragment of about 2.0-kb in length was observed in the case of the pobA deletion gene derived from Corynebacterium glutamicum strain (ligation N solution).
  • the plasmid containing the pobA deletion gene derived from Corynebacterium glutamicum was named pCRA725-pobA / CG.
  • kanamycin resistance by expression of the kanamycin resistance gene on pCRA725-poxF / CG and expression of the sacR-sacB gene of Bacillus subtilis Shows the lethality in sucrose-containing medium, whereas in the case of double crossover, the sensitivity to kanamycin due to the loss of the kanamycin resistance gene on pCRA725-poxF / CG and the sucrose-containing medium due to the loss of the sacR-sacB gene Shows viability.
  • the markerless chromosomal gene disruption strain shows kanamycin sensitivity and sucrose-containing medium viability. Therefore, a strain showing kanamycin sensitivity and viability of sucrose-containing medium was selected.
  • This Corynebacterium glutamicum R strain poxF gene marker-less disrupted strain was named Corynebacterium glutamicum ⁇ poxF.
  • the markerless chromosomal gene transfer vector pCRA725 is a plasmid that cannot replicate in Corynebacterium glutamicum R.
  • the electric pulse method [Agric. Biol. Chem., Vol. 54, 443-447 (1990) and Res. Microbiol., Vol. 144, 181-185 (1993)] Bacterial glutamicum ⁇ poxF was transformed and applied to A agar medium (A liquid medium and 1.5% agar) containing 50 ⁇ g / ml of kanamycin.
  • kanamycin resistance by expression of the kanamycin resistance gene on pCRA725-pobA / CG and expression of the sacR-sacB gene of Bacillus subtilis Shows the lethality in sucrose-containing medium
  • kanamycin susceptibility due to loss of kanamycin resistance gene on pCRA725-pobA / CG and sucrose-containing medium due to sacR-sacB gene deletion Shows viability. Therefore, the markerless chromosomal gene disruption strain shows kanamycin sensitivity and sucrose-containing medium viability.
  • Strains with the introduction of pCRB209-bsdBCD / BS were identified as Corynebacterium glutamicum PHE21, and strains with the introduction of pCRB209-dca / BAE were identified as Corynebacterium glutamicum PHE21-2 and pCRB209-dca / BSS.
  • the strains with the introduction of Corynebacterium glutamicum PHE21-3 and pCRB209-dca / CKO were identified as the strains with the introduction of Corynebacterium glutamicum PHE21-4 and the strains with the introduction of pCRB209-dca / EAE were identified as Corynebacterium glutamicum PHE21.
  • strains with introduction of pCRB209-dca / ECL were identified as Corynebacterium glutamicum PHE21-6
  • strains with introduction of pCRB209-dca / EHO were identified as Corynebacterium glutamicum PHE21-7
  • pCRB209-dca / ESA The strains with the introduction of Corynebacterium glutamicum PHE21-8 and pCRB209-dca / ECK are the strains with the introduction of Corynebacterium glutamicum PHE21-9 and pCRB209-dca / EFE.
  • Corynebak Strains with the introduction of L are the strains with the introduction of Corynebacterium glutamicum PHE21-9 and pCRB209-dca / EFE.
  • Corynebacterium glutamicum PHE21 has been deposited with the Patent Biological Depository Center of the National Institute of Technology and Evaluation, 2-5-8 Kazusa Kamashi, Kisarazu, Chiba, Japan (zip code 292-0818). Date: October 21, 2010, accession number: NITE BP-996).
  • Strains with the introduction of pCRB209-bsdBCD / BS were introduced with Corynebacterium glutamicum PHE22-1 and strains with the introduction of pCRB209-dca / BAE were introduced with Corynebacterium glutamicum PHE22-2 and pCRB209-dca / BSS.
  • Strains with the introduction of pCRB209-bsdBCD / BS were introduced with Corynebacterium glutamicum PHE23-1, and strains with the introduction of pCRB209-dca / BAE were introduced with Corynebacterium glutamicum PHE23-2 and pCRB209-dca / BSS.
  • strains with the introduction of / ESA were identified as Corynebacterium glutamicum PHE23-8, and strains with the introduction of pCRB209-dca / ECK were identified as Corynebacterium glutamicum PHE23-9 and pCRB209-dca / EFE.
  • Strain Corineva The strains with the introduction of therium glutamicum PHE23-10 and pCRB209-dca / PPY were named Corynebacterium glutamicum PHE23-11 and the strains with the introduction of pCRB209-dca / PAM were named Corynebacterium glutamicum PHE23-12 .
  • the outline of gene recombination of this strain is summarized in Table 3.
  • Example 2 Phenol production experiment of Corynebacterium glutamicum byproduct pathway disruption strain and R strain (wild strain) introduced with phenol production gene Corynebacterium glutamicum ⁇ poxF / phenol production gene introduced strain prepared in Example 1 (see Table 1) ) and, a agar medium [(NH 2) 2 CO 2g containing kanamycin 50 ⁇ g / ml, (NH 4) 2 SO 4 7g, KH 2 PO 4 0.5 g, K 2 HPO 4 0.5 g, MgSO 4 .7H 2 O 0.5 g, 0.06% (w / v) Fe 2 SO 4 .7H 2 O + 0.042% (w / v) MnSO 4 .2H 2 O 1 ml, 0.02% (w / v) biotin solution 1 ml, 0.01% ( w / v) 2 ml of thiamin solution, 2 g of yeast extract, 7 g of vitamin assay casamino acid, 40 g
  • Corynebacterium glutamicum ⁇ poxF / phenol-producing gene-introduced strain grown on the above plate was inoculated into a test tube containing 10 ml of A liquid medium containing 50 ⁇ g / ml of kanamycin, and then at 28 ° C. for 15 hours. Aerobic shaking culture was performed.
  • the Corynebacterium glutamicum ⁇ poxF / phenol-producing gene-introduced strain grown under the above conditions is inoculated into a 2 L Erlenmeyer flask containing 500 ml of liquid A medium containing 50 ⁇ g / ml of kanamycin, and is preferably incubated at 28 ° C. for 15 hours. Vigorously shaking culture was performed.
  • BT (-urea) liquid medium [0.7% ammonium sulfate, 0.05% potassium dihydrogen phosphate, 0.05% dipotassium hydrogen phosphate, 0.05% magnesium sulfate. 7 hydrate, 0.0006% iron sulfate 7-hydrate, 0.00042% manganese sulfate hydrate, 0.00002% biotin, 0.00002% thiamine hydrochloride].
  • This cell suspension is placed in a 100 ml medium bottle, and under reduced conditions (redox potential: -450 mV), sodium 4-hydroxybenzoate as a substrate is added to a concentration of 250 mM, and the water bath is kept at 33 ° C.
  • the reaction was carried out with stirring. At this time, the reaction was carried out while controlling with a pH controller (manufactured by Able Corporation, model: DT-1023) using 2.5N ammonia water so that the pH of the reaction solution did not fall below 7.0.
  • the sampled reaction solution was centrifuged (4 ° C., 15,000 ⁇ g, 10 minutes), and phenol was quantified using the obtained supernatant.
  • Corynebacterium glutamicum PHE21 strain produced 65 mM (6 g / L) phenol after 1 hour and 180 mM (17 g / L) after 4 hours in the reaction under reducing conditions (Table 1). 4).
  • the results of Corynebacterium glutamicum PHE21-2 to PHE21-12 under the same conditions are also shown in Table 4.
  • Example 2 the Corynebacterium glutamicum ⁇ poxF ⁇ pobA / phenol-producing gene-introduced strain prepared in Example 1 (see Table 2) was added to the A agar medium [(NH 2 ) 2 CO 2g, (NH 4 ) 2 containing 50 ⁇ g / ml of kanamycin.
  • Corynebacterium glutamicum ⁇ poxF ⁇ pobA / phenol-producing gene-introduced strain grown on the above plate was inoculated into a test tube containing 10 ml of A liquid medium containing 50 ⁇ g / ml of kanamycin, and then at 28 ° C. for 15 hours. Aerobic shaking culture was performed.
  • the Corynebacterium glutamicum ⁇ poxF ⁇ pobA / phenol-producing gene-introduced strain grown under the above conditions is inoculated into a 2 L Erlenmeyer flask containing 500 ml of A liquid medium containing 50 ⁇ g / ml of kanamycin, and preferably at 28 ° C. for 15 hours. Vigorously shaking culture was performed.
  • BT (-urea) liquid medium [0.7% ammonium sulfate, 0.05% potassium dihydrogen phosphate, 0.05% dipotassium hydrogen phosphate, 0.05% magnesium sulfate. 7 hydrate, 0.0006% iron sulfate 7-hydrate, 0.00042% manganese sulfate hydrate, 0.00002% biotin, 0.00002% thiamine hydrochloride].
  • This cell suspension is placed in a 100 ml medium bottle, and under reduced conditions (redox potential: -450 mV), sodium 4-hydroxybenzoate as a substrate is added to a concentration of 250 mM, and the water bath is kept at 33 ° C.
  • the reaction was carried out with stirring. At this time, the reaction was carried out while controlling with a pH controller (manufactured by Able Corporation, model: DT-1023) using 2.5N ammonia water so that the pH of the reaction solution did not fall below 7.0.
  • the sampled reaction solution was centrifuged (4 ° C., 15,000 ⁇ g, 10 minutes), and phenol was quantified using the obtained supernatant.
  • Corynebacterium glutamicum PHE22-1 to PHE22-12 produced phenol as shown in Table 5 after 1 hour in the reaction under reducing conditions. From this result, an improvement in phenol productivity was observed by disrupting the poxA gene.
  • Example 3 the Corynebacterium glutamicum R strain / phenol production gene-introduced strain (see Table 3) prepared in Example 1 was added to an A agar medium containing 50 ⁇ g / ml kanamycin [(NH 2 ) 2 CO 2g, ( NH 4) 2 SO 4 7g, KH 2 PO 4 0.5 g, K 2 HPO 4 0.5 g, MgSO 4 .7H 2 O 0.5 g, 0.06% (w / v) Fe 2 SO 4 .7H 2 O + 0.042% ( w / v) MnSO 4 .2H 2 O 1 ml, 0.02% (w / v) biotin solution 1 ml, 0.01% (w / v) thiamin solution 2 ml, yeast extract 2 g, vitamin assay casamino acid 7 g, glucose 40 g and 15 g of agar were suspended in 1 L of distilled water] and allowed to stand in the dark
  • Corynebacterium glutamicum R strain / phenol-producing gene-introduced strain grown on the above plate was inoculated into a test tube containing 10 ml of A liquid medium containing 50 ⁇ g / ml of kanamycin, and then incubated at 28 ° C. for 15 hours. The culture was aerobically shaken.
  • Corynebacterium glutamicum R strain / phenol production gene introduced strain grown under the above conditions is inoculated into a 2 L Erlenmeyer flask containing 500 ml of liquid A medium containing 50 ⁇ g / ml kanamycin, and at 28 ° C. for 15 hours. Aerobic shaking culture was performed.
  • BT (-urea) liquid medium [0.7% ammonium sulfate, 0.05% potassium dihydrogen phosphate, 0.05% dipotassium hydrogen phosphate, 0.05% magnesium sulfate. 7 hydrate, 0.0006% iron sulfate 7-hydrate, 0.00042% manganese sulfate hydrate, 0.00002% biotin, 0.00002% thiamine hydrochloride].
  • This cell suspension is placed in a 100 ml medium bottle, and under reduced conditions (redox potential: -450 mV), sodium 4-hydroxybenzoate as a substrate is added to a concentration of 250 mM, and the water bath is kept at 33 ° C.
  • the reaction was carried out with stirring. At this time, the reaction was carried out while controlling with a pH controller (manufactured by Able Corporation, model: DT-1023) using 2.5N ammonia water so that the pH of the reaction solution did not fall below 7.0.
  • the sampled reaction solution was centrifuged (4 ° C., 15,000 ⁇ g, 10 minutes), and phenol was quantified using the obtained supernatant.
  • Example 3 Suitability test as a host for phenol production Effect of phenol on aerobic growth Corynebacterium glutamicum, Escherichia coli and Pseudomonas putida were tested for inhibition of phenol growth in aerobic culture.
  • Pseudomonas putida S12 used in this test has been reported as a solvent-resistant bacterium, and a technique that has been used only as a host for producing phenol has been disclosed so far.
  • Corynebacterium glutamicum R A agar medium [(NH 2) 2 CO 2g , (NH 4) 2 SO 4 7g, KH 2 PO 4 0.5 g, K 2 HPO 4 0.5 g, MgSO 4 .7H 2 O 0.5 g, 0.06% (w / v) Fe 2 SO 4 .7H 2 O + 0.042% (w / v) MnSO 4 .2H 2 O 1 ml, 0.02% (w / v) biotin solution 1 ml, 0.01% (w / v ) 2 ml of thiamin solution, 2 g of yeast extract, 7 g of vitamin assay casamino acid, 40 g of glucose and 15 g of agar were suspended in 1 L of distilled water] and left to stand at 33 ° C.
  • Corynebacterium glutamicum R grown on the above plate was mixed with A liquid medium [(NH 2 ) 2 CO 2 g, (NH 4 ) 2 SO 4 7 g, KH 2 PO 4 0.5 g, K 2 HPO 4 0.5 g, MgSO 4 .7H 2 O 0.5 g, 0.06% (w / v) Fe 2 SO 4 .7H 2 O + 0.042% (w / v) MnSO 4 .2H 2 O 1 ml, 0.02% (w / v) biotin solution 1 ml , 0.01% (w / v) thiamin solution 2 ml, yeast extract 2 g, vitamin assay casamino acid 7 g, glucose 40 g dissolved in 1 L of distilled water] The culture was aerobically shaken at 13 ° C for 13 hours.
  • Escherichia coli JM109 was applied to LB agar medium (1% polypeptone, 0.5% yeast extract, 0.5% sodium chloride, and 1.5% agar), and allowed to stand at 37 ° C. for 15 hours in the dark.
  • Escherichia coli JM109 grown on the above plate was inoculated into a test tube containing 10 ml of LB liquid medium [1% polypeptone, 0.5% yeast extract and 0.5% sodium chloride], and the mixture was favorably incubated at 37 ° C. for 13 hours. Vigorously shaking culture was performed.
  • the culture was aerobically shaken at 0 ° C. Growth of the bacteria was carried out by measuring the absorbance of OD 610.
  • Pseudomonas putida F1 and S12 were applied to LB agar medium [1% polypeptone, 0.5% yeast extract, 0.5% sodium chloride, and 1.5% agar] and allowed to stand in the dark at 30 ° C. for 15 hours. Pseudomonas putida F1 and S12 grown on the above plate were placed in a test tube containing 10 ml of LB (+ glucose) liquid medium [1% polypeptone, 0.5% yeast extract, 0.5% sodium chloride and 0.4% glucose]. Then, shaking culture was performed aerobically at 30 ° C. for 13 hours.
  • Escherichia coli was significantly inhibited from growth in the presence of 0.16% phenol, and was completely inhibited from growth at 0.20% phenol.
  • Pseudomonas putida F1 and Pseudomonas putida S12 which had been reported as a solvent-resistant bacterium, showed almost the same tendency.
  • growth was significantly inhibited, and 0.20% phenol completely inhibited growth.
  • Corynebacterium glutamicum had little effect on growth even in the presence of 0.16% phenol, which was significantly inhibited by Escherichia coli, and was completely inhibited by Escherichia coli and Pseudomonas putida.
  • Corynebacterium glutamicum has higher resistance to phenol and higher suitability as a host for phenol production than Escherichia coli and Pseudomonas putida.
  • phenol can be produced from 4-hydroxybenzoate using microorganisms with practical efficiency.

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Abstract

　4-ヒドロキシベンゾエート デカルボキシラーゼ(4-hydroxybenzoate decarboxylase)活性を有する酵素をコードする遺伝子が、宿主のコリネバクテリウム グルタミカムに導入された、フェノール生産能を有する形質転換体。この形質転換体を、還元条件下、4-ヒドロキシベンゾエート又はその塩を含有する反応液中で反応させる工程と、反応液中のフェノールを回収する工程とを含むフェノールの製造方法。

Description

コリネ型細菌形質転換体及びそれを用いるフェノールの製造方法
　本発明は、フェノール生産技術に関する。さらに詳しくは、フェノール生産機能を付与するために特定の遺伝子操作が施されたコリネバクテリウム　グルタミカムの形質転換体、及びこの形質転換体を用いた効率的なフェノールの製造技術に関する。
　地球温暖化、及び化石資源枯渇問題を背景に、再生可能資源を原料とした化学品の製造は、バイオ燃料製造と並び、新産業バイオリファイナリーとして低炭素社会実現の重要な方策であることが認識され、大きな注目が集まっている。
　しかし、再生可能資源を原料としたバイオフェノール生産は、乳酸やエタノールの生産と比較して、原料となる糖類から代謝反応段数が大変多いために生産性が低く、また生産物であるフェノールにより菌の増殖が阻害されたり、フェノールによる細胞毒性がある等の理由により、これまで工業的生産が不可能とされていた。
　フェノールの重要な用途として、フェノール樹脂が挙げられる。フェノール樹脂は、フェノールとアルデヒド類との付加縮合反応により生成し、プラスチックの中でも最も古い歴史のある樹脂であり、その優れた耐熱性、耐久性等の特長から、現在でも自動車用金属代替材料、半導体封止材料、回路基板など様々な用途に用いられている。また、これまでフェノール樹脂は、原料のフェノールとアルデヒド類の反応性が極めて高く、得られる高分子が複雑な三次元網目構造になるため、ポリマーの精密構造設計やナノマテリアルへの展開が困難であり、高付加価値の用途への利用が難しいとされてきた。しかしながら、近年、高分子の物性理論やシミュレーションの急速な発展により、ネットワーク構造を精密化すればフェノール樹脂から高機能性材料の創製が可能となってきた。このような背景から日本におけるフェノール樹脂生産量も年々増加している。
　フェノールの現在の工業的生産法（クメン法）は、石油由来のベンゼンとプロピレンを原料とし、多量の溶剤類及び多量の熱エネルギーを必要とする、典型的な化学工業の高エネルギー消費型プロセスである。従って、地球環境保全や温室効果ガス削減の観点から、二酸化炭素排出が少ない省エネルギー型で、再生可能資源から製造でき、低廃棄物排出の環境調和型プロセスの開発、即ちバイオフェノール製造技術確立が急務となっている。
　これまで自然界においてフェノール生産菌は報告されていない。
　遺伝子組み換え菌によるフェノールの生産技術について述べれば、非特許文献１は、クロストリディウム ヒドロキシベンゾイカム(Clostridium hydroxybenzoicum)の細胞縣濁液又は細胞抽出液を用いて、2 mM の4-ヒドロキシベンゾエートを50 時間で完全にフェノールに変換する技術を開示している。
　また、特許文献１は、エンテロバクター クロアカエ（Enterobacter cloacae）の4-ヒドロキシベンゾエート デカルボキシラーゼ遺伝子を導入した形質転換菌を用いて4-ヒドロキシベンゾエートからフェノールを製造する技術を開示している。
　しかし、非特許文献１及び特許文献１の方法は、実用上十分に効率よくフェノールを製造することができない。
特開２００６－０５０９１４号
International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, Vol.52, 2002, 801-807.
　本発明は、4-ヒドロキシベンゾエートを原料として効率よくフェノールを製造できる微生物、及び4-ヒドロキシベンゾエートを原料として効率よくフェノールを製造できる方法を提供することを課題とする。
　上記課題を解決するために本発明者らは研究を重ね、以下の知見を得た。
(i)　コリネバクテリウム　グルタミカムに４-ヒドロキシベンゾエート　デカルボキシラーゼ遺伝子を導入した形質転換体は、効率よく、4-ヒドロキシベンゾエートからフェノールを生産できる。
(ii)　この形質転換体において、宿主のコリネバクテリウム　グルタミカムの染色体上に存在するフェノール2-モノオキシゲナーゼ遺伝子が破壊又は欠損しているときは、一層効率よくフェノールを生産できる。
(iii)　この形質転換体は、還元条件下の反応液中で実質的に増殖しない状態で反応させる場合、特に、フェノール生産効率が高い。
　本発明は上記知見に基づき完成されたものであり、以下の形質転換体及びフェノールの製造方法を提供する。
項１．
　4-ヒドロキシベンゾエート デカルボキシラーゼ(4-hydroxybenzoate decarboxylase)活性を有する酵素をコードする遺伝子が、宿主のコリネバクテリウム グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）に導入された、フェノール生産能を有する形質転換体。
項２．
　4-ヒドロキシベンゾエート デカルボキシラーゼ活性を有する酵素をコードする遺伝子が、バチラス サブチリス（Bacillus subtilis）、バチラス アトロファエウス（Bacillus atrophaeus）、バチラス サブチリス 亜種 スピジゼニイ（Bacillus subtilis subsp. spizizenii）、シトロバクター コセリ（Citrobacter koseri）、エンテロバクター アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）、エンテロバクター クロアカエ（Enterobacter cloacae）、エンテロバクター ホルメシェイ（Enterobacter hormaechei）、エンテロバクター サカザキ（Enterobacter sakazakii）、エシェリヒア コリ（Escherichia coli）、エシェリヒア フェルグソニー（Escherichia fergusonii）、パエニバチラス ポリミキサ（Paenibacillus polymyxa）、又はパントエア アナナティス（Pantoea ananatis）由来の遺伝子である項１に記載の形質転換体。
項３．
　4-ヒドロキシベンゾエート デカルボキシラーゼ活性を有する酵素をコードする遺伝子が下記の(a)又は(b)のDNAである項１に記載の形質転換体。
(a)　 配列番号16、配列番号23、配列番号26、配列番号29、配列番号32、配列番号35、配列番号38、配列番号41、配列番号44、配列番号47、配列番号50、又は配列番号53の塩基配列からなるDNA
(b)　(a)の何れかの塩基配列と相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ4-ヒドロキシベンゾエート デカルボキシラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするDNA
項４．
　宿主のコリネバクテリウム グルタミカムが、その染色体上に存在するフェノール2-モノオキシゲナーゼ（phenol 2-monooxygenase）活性を有する酵素をコードする遺伝子が破壊され、又は欠損したものである、項１～３の何れかに記載の形質転換体。
項５．
　宿主のコリネバクテリウム グルタミカムが、その染色体上に存在する4-ヒドロキシベンゾエート ヒドロキシラーゼ(4-hydroxybenzoate hydroxylase)活性を有する酵素をコードする遺伝子が破壊され、又は欠
損したものである、項１～４の何れかに記載の形質転換体。
項６．
　宿主のコリネバクテリウム グルタミカムが、コリネバクテリウム グルミカムR（FERM　P－18976）、ATCC13032、又はATCC13869である項１～３の何れかに記載の形質転換体。
項７．
　宿主のコリネバクテリウム グルタミカムが、コリネバクテリウム グルミカムR（FERM　P－18976）、ATCC13032、又はATCC13869の染色体上に存在するフェノール2-モノオキシゲナーゼ活性を有する酵素をコードする遺伝子が破壊され、又は欠損したものである、項１～３の何れかに記載の形質転換体。
項８．
　宿主のコリネバクテリウム グルタミカムが、コリネバクテリウム グルミカムR（FERM　P－18976）、ATCC13032、又はATCC13869の染色体上に存在する4-ヒドロキシベンゾエート ヒドロキシラーゼ活性を有する酵素をコードする遺伝子が破壊され、又は欠損したものである、項１～３の何れかに記載の形質転換体。
項９．
　コリネバクテリウム グルタミカム PHE21（受託番号：NITE BP-996）、PHE21-2、PHE21-3、PHE21-4、PHE21-5、PHE21-6、PHE21-7、PHE21-8、PHE21-9、PHE21-10、PHE21-11、PHE21-12、PHE22-1、PHE22-2、PHE22-3、PHE22-4、PHE22-5、PHE22-6、PHE22-7、PHE22-8、PHE22-9、PHE22-10、PHE22-11、PHE22-12、PHE23-1、PHE23-2、PHE23-3、PHE23-4、PHE23-5、PHE23-6、PHE23-7、PHE23-8、PHE23-9、PHE23-10、PHE23-11、又はPHE23-12の形質転換体。
項１０．
　項１～９の何れかに記載の形質転換体を、還元条件下、4-ヒドロキシベンゾエート又はその塩を含有する反応液中で反応させる工程と、反応液中のフェノールを回収する工程とを含むフェノールの製造方法。
項１１．
　反応工程において、形質転換体が実質的に増殖しない項１０に記載のフェノールの製造方法。
項１２．
　還元条件下の反応液の酸化還元電位が－２００～－５００ミリボルトである項１０又は１１に記載のフェノールの製造方法。
　本発明の形質転換体を用いることにより、4-ヒドロキシベンゾエートからフェノールを高効率で製造することができる。
　一般に微生物はフェノールのような溶剤の細胞毒性により生育が阻害されるため、微生物を用いてフェノールを製造することは困難であったが、本発明方法によれば、微生物を用いて、実用上十分に効率良くフェノールを製造することができる。
実施例で用いたプラスミドの構成を示す図である。 各種の微生物の好気条件下における増殖に及ぼすフェノールの影響を示す図である。
　以下、本発明を詳細に説明する。
（Ｉ）フェノール生産能を有する形質転換体
　本発明のフェノール生産能を有する形質転換体は、4-ヒドロキシベンゾエート デカルボキシラーゼ活性を有する酵素をコードする遺伝子が、宿主のコリネバクテリウム　グルタミカムに導入された形質転換体である。
宿主
　宿主として用いられるコリネバクテリウム グルタミカムとは、バージーズ・マニュアル・デターミネイティブ・バクテリオロジー〔Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology、Vol. 8、599（1974）〕に定義されている一群の微生物である。
　具体的には、コリネバクテリウム　グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）R（FERM P-18976）、ATCC13032、ATCC13869、ATCC13058、ATCC13059、ATCC13060、ATCC13232、ATCC13286、ATCC13287、ATCC13655、ATCC13745、ATCC13746、ATCC13761、ATCC14020、ATCC31831、MJ-233（FERM BP-1497）又はMJ-233AB-41（FERM BP-1498）等の菌株が挙げられる。中でも、R（FERM P-18976）株、ATCC13032株、及びATCC13869株が好ましく、R（FERM P-18976）株がより好ましい。
　なお、分子生物学的分類により、ブレビバクテリウム フラバム（Brevibacterium flavum）、ブレビバクテリウム ラクトファーメンタム（Brevibacterium lactofermentum）、ブレビバクテリウム ディバリカタム（Brevibacterium divaricatum）、コリネバクテリウム リリウム（Corynebacterium lilium）等のコリネ型細菌もコリネバクテリウム　グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）に菌名が統一されている〔Liebl, W. et al., Transfer of Brevibacterium divaricatum DSM 20297T, "Brevibacterium flavum" DSM 20411, "Brevibacterium lactofermentum" DSM 20412 and DSM 1412, and Corynebacterium glutamicum and their distinction by rRNA gene restriction patterns. Int J Syst Bacteriol. 41:255-260. (1991)、駒形和男ら, コリネフォルム細菌の分類, 発酵と工業, 45:944-963 (1987)〕ため、本発明に含まれる。
　また、コリネバクテリウム グルタミカムは、野生株の他に、その変異株や人為的な遺伝子組換え体であってもよい。例えば、ラクテート（乳酸）デヒドロゲナーゼ（lactate dehydrogenase：LDH）、フォスフォエノールピルベートカルボキシラーゼ（phosphoenolpyrvate carboxylase）、マレートデヒドロゲナーゼ（malate dehydrogenase）などの遺伝子の破壊株が挙げられる。このような遺伝子破壊株を宿主として用いることにより、フェノールの生産性を向上させたり、副生成物の生成を抑制したりすることができる。
　中でも、ラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子の破壊株が好ましい。この遺伝子破壊株は、乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子が破壊されていることにより、ピルビン酸から乳酸への代謝経路が遮断されている。中でも、コリネバクテリウム グルタミカムR（FERM P-18976）のラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子の破壊株が特に好ましい。
　このような遺伝子破壊株は、遺伝子工学的手法により常法に従い作製できる。例えば、ＷＯ２００５／０１０１８２Ａ１に、乳酸デヒドロゲナーゼ破壊株、及びその作製方法が記載されている。
4-ヒドロキシベンゾエート デカルボキシラーゼ酵素遺伝子（bsdBCD又はdca）
　4-ヒドロキシベンゾエート デカルボキシラーゼは、4-ヒドロキシベンゾエートの脱炭酸によるフェノールの生成反応を触媒する酵素である。
　4-ヒドロキシベンゾエート デカルボキシラーゼ活性を有する酵素をコードする遺伝子の由来は特に限定されないが、バチラス サブチリス（Bacillus subtilis）、バチラス メガテリウム（Bacillus megaterium）、バチラス リッケニフォーミス（Bacillus licheniformis）、バチラス アトロファエウス（Bacillus atrophaeus）、バチラス サブチリス 亜種 スピジゼニイ（Bacillus subtilis subsp. spizizenii）のようなバチラス属細菌由来の遺伝子；シトロバクター コセリ（Citrobacter koseri）のようなシトロバクター属細菌由来の遺伝子；エンテロバクター アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）、エンテロバクター クロアカエ（Enterobacter cloacae）、エンテロバクター ホルメシェイ（Enterobacter hormaechei）、エンテロバクター サカザキ（Enterobacter sakazakii）のようなエンテロバクター属細菌由来の遺伝子；エシェリヒア コリ（Escherichia coli）、エシェリヒア フェルグソニー（Escherichia fergusonii）のようなエシェリヒア属細菌由来の遺伝子；パエニバチラス ポリミキサ（Paenibacillus polymyxa）のようなパエニバチラス属細菌由来の遺伝子；パントエア アナナティス（Pantoea ananatis）のようなパントエア属細菌由来の遺伝子などが挙げられる。中でも、バチラス属細菌、特にバチラス サブチリス由来の遺伝子、エンテロバクター属細菌、特にエンテロバクター クロアカエ由来の遺伝子、エシェリヒア属細菌、特にエシェリヒア コリ由来の遺伝子が好ましい。
　なお、4-ヒドロキシベンゾエート デカルボキシラーゼ活性を有する酵素をコードする遺伝子は、由来により異なる種々の略称が用いられている。例えば、バチラス サブチリス由来の4-ヒドロキシベンゾエート デカルボキシラーゼ遺伝子はbsdBCDと略称されている。本明細書では、4-ヒドロキシベンゾエート デカルボキシラーゼ遺伝子を、由来を問わず「dca」と略称することがある。
　バチラス サブチリス由来の4-ヒドロキシベンゾエート デカルボキシラーゼ酵素遺伝子としては、配列番号16の塩基配列からなるDNAが、バチラス アトロファエウス由来の4-ヒドロキシベンゾエート デカルボキシラーゼ酵素遺伝子としては、配列番号23の塩基配列からなるDNAが、バチラス サブチリス 亜種 スピジゼニイ由来の4-ヒドロキシベンゾエート デカルボキシラーゼ酵素遺伝子としては、配列番号26の塩基配列からなるDNAが、シトロバクター コセリ由来の4-ヒドロキシベンゾエート デカルボキシラーゼ酵素遺伝子としては、配列番号29の塩基配列からなるDNAが、エンテロバクター アエロゲネス由来の4-ヒドロキシベンゾエート デカルボキシラーゼ酵素遺伝子としては、配列番号32の塩基配列からなるDNAが、エンテロバクター クロアカエ由来の4-ヒドロキシベンゾエート デカルボキシラーゼ酵素遺伝子としては、配列番号35の塩基配列からなるDNAが、エンテロバクター ホルメシェイ由来の4-ヒドロキシベンゾエート デカルボキシラーゼ酵素遺伝子としては、配列番号38の塩基配列からなるDNAが、エンテロバクター サカザキ由来の4-ヒドロキシベンゾエート デカルボキシラーゼ酵素遺伝子としては、配列番号41の塩基配列からなるDNAが、エシェリヒア コリ由来の4-ヒドロキシベンゾエート デカルボキシラーゼ酵素遺伝子としては、配列番号44の塩基配列からなるDNAが、エシェリヒア フェルグソニー由来の4-ヒドロキシベンゾエート デカルボキシラーゼ酵素遺伝子としては、配列番号47の塩基配列からなるDNAが、パエニバチラス ポリミキサ由来の4-ヒドロキシベンゾエート デカルボキシラーゼ酵素遺伝子としては、配列番号50の塩基配列からなるDNAが、パントエア アナナティス由来の4-ヒドロキシベンゾエート デカルボキシラーゼ酵素遺伝子としては、配列番号53の塩基配列からなるDNAが挙げられる。
　また、本発明では、配列番号16、配列番号23、配列番号26、配列番号29、配列番号32、配列番号35、配列番号38、配列番号41、配列番号44、配列番号47、配列番号50、又は配列番号53の塩基配列と相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ4-ヒドロキシベンゾエート デカルボキシラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするDNAも使用できる。
　本発明において「ストリンジェントな条件」は、一般的な条件、例えば、Molecular　Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition,1989,Vol2,p11.45に記載された条件を指す。具体的には、完全ハイブリッドの融解温度(Ｔｍ)より5～10℃低い温度でハイブリダイゼーションが起こる場合を指す。
　4-ヒドロキシベンゾエート デカルボキシラーゼ活性は、「Genomics,　86, 342-351, 2005 “Materials and Methods”」に記載の方法で測定できる。簡単に説明すると、試験用液に被験酵素を添加し、100mM MES, pH6.0、1 mM DTT、5 mM 4-ヒドロキシベンゾエートと酵素を含む反応液を調製し、270 nmにおける吸光度の傾き(初速度)を測定する。4-ヒドロキシベンゾエートを添加しない系についても同様に反応を行い、バックグラウンド値とする。両測定値の差を4-ヒドロキシベンゾエート デカルボキシラーゼ活性とする。
　また、本発明では、配列番号16、配列番号23、配列番号26、配列番号29、配列番号32、配列番号35、配列番号38、配列番号41、配列番号44、配列番号47、配列番号50、又は配列番号53の塩基配列と同一性が90％以上、好ましくは95％以上、より好ましくは98％以上の塩基配列からなり、かつ4-ヒドロキシベンゾエート デカルボキシラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするDNAも使用できる。
　本発明において、塩基配列の同一性は、GENETYX ver.8（GENETYX 株式会社ゼネティックス製）により算出した値である。
　配列番号16、配列番号23、配列番号26、配列番号29、配列番号32、配列番号35、配列番号38、配列番号41、配列番号44、配列番号47、配列番号50、又は配列番号53の塩基配列からなるDNAの類縁体は、例えば、これらの塩基配列に基づき常法に従い設計したプライマー又はプローブを用いたPCR又はハイブリダイゼーションにより、他生物種のDNAライブラリーから選択することができ、これにより高確率で4-ヒドロキシベンゾエート デカルボキシラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするDNAが得られる。
形質転換のためのベクターの構築
　PCRで増幅した4-ヒドロキシベンゾエート デカルボキシラーゼ酵素をコードするDNAは、それぞれ、宿主で増幅できる適切なベクターにクローニングすればよい。
　プラスミドベクターとしては、コリネバクテリウム　グルタミカム内で自律複製機能を司る遺伝子を含むものであれば良い。その具体例としては、ブレビバクテリウム　ラクトファーメンタム（Brevibacterium lactofermentum）2256由来のpAM330〔特開昭58-67699〕、〔Miwa, K. et al., Cryptic plasmids in glutamic acid-producing bacteria. Agric. Biol. Chem. 48:2901-2903（1984）〕 及び 〔Yamaguchi, R. et al., Determination of the complete nucleotide sequence of the Brevibacterium lactofermentum plasmid pAM330 and the analysis of its genetic information. Nucleic Acids Symp. Ser. 16:265-267（1985）〕、コリネバクテリウム グルタミカム ATCC13058由来のpHM1519 〔Miwa, K. et al., Cryptic plasmids in glutamic acid-producing bacteria. Agric. Biol. Chem. 48:2901-2903（1984）〕及びpCRY30 〔Kurusu, Y. et al., Identification of plasmid partition function in coryneform bacteria. Appl. Environ. Microbiol. 57:759-764 （1991）〕、コリネバクテリウム グルタミカム T250由来のpCG4〔特開昭57-183799〕、〔Katsumata, R. et al., Protoplast transformation of glutamate-producing bacteria with plasmid DNA. J. Bacteriol.、159:306-311 （1984）〕、pAG1、pAG3、pAG14、pAG50〔特開昭62-166890〕、pEK0、pEC5、pEKEx1 〔Eikmanns, B.J. et al., A family of Corynebacterium glutamicum/Escherichia coli shuttle vectors for cloning, controlled gene expression, and promoter probing. Gene, 102:93-98 （1991）〕などが挙げられる。
　好ましいプロモーターとしては、コリネバクテリウム　グルタミカムR由来のグリセルアルデヒド3-フォスフェートデヒドロゲナーゼA遺伝子(gapA)のプロモーターPgapA、マレートデヒドロゲナーゼ遺伝子（mdh）のプロモーターPmdh、ラクテートデヒドロゲナーゼA遺伝子（ldhA）のプロモーターPldhAなどが挙げられ、中でも、PgapAが好ましい。
　好ましいターミネーターとしては、大腸菌rRNAオペロンのrrnB T1T2 ターミネーター、大腸菌のtrpA ターミネーター、ブレビバクテリウム ラクトファーメンタム（Brevibacterium lactofermentum）のtrp ターミネーターなどが挙げられ、中でも、rrnB T1T2 ターミネーターが好ましい。
形質転換
　形質転換方法は、公知の方法を制限無く使用できる。このような公知の方法として、例えば塩化カルシウム／塩化ルビジウム法、リン酸カルシウム法、ＤＥＡＥ－デキストラン介在トランスフェクション、電気穿孔法などが挙げられる。中でも、コリネバクテリウム　グルタミカムには、電気パルス法が好適であり、電気パルス法は、公知の方法 〔Kurusu, Y. et al., Electroporation-transformation system for Coryneform bacteria by auxotrophic complementation. Agric. Biol. Chem. 54:443-447 （1990）〕 及び 〔Vertes A.A. et al., Presence of mrr- and mcr-like restriction systems in Coryneform bacteria. Res. Microbiol. 144:181-185 （1993）〕により行うことができる。
　形質転換体は、微生物の培養に通常使用される培地を用いて培養すればよい。この培地としては、通常、炭素源、窒素源、無機塩類及びその他の栄養物質等を含有する天然培地又は合成培地等を用いることができる。
　炭素源としては、グルコース、フルクトース、スクロース、マンノース、マルトース、マンニトール、キシロース、アラビノース、ガラクトース、澱粉、糖蜜、ソルビトール、グリセリン等の糖質又は糖アルコール；酢酸、クエン酵、乳酸、フマル酸、マレイン酸又はグルコン酸等の有機酸；エタノール、プロパノール等のアルコール等が挙げられる。また、所望によりノルマルパラフィン等の炭化水素等も用いることができる。炭素源は、１種を単独で使用でき、又は２種以上を混合して使用してもよい。培地中のこれら炭素源の濃度は、通常、約0.1～10（ｗ／ｖ％）とすればよい。
　窒素源としては、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、酢酸アンモニウム等の無機又は有機アンモニウム化合物、尿素、アンモニア水、硝酸ナトリウム、硝酸カリウム等が挙げられる。また、コーンスティープリカー、肉エキス、ベプトン、NZ－アミン、蛋白質加水分解物、アミノ酸等の含窒素有機化合物等も使用できる。窒素源は、１種を単独で使用してもよく、また２種以上を混合して使用してもよい。培地中の窒素源濃度は、使用する窒素化合物によっても異なるが、通常、約0.1～10（ｗ／ｖ％）とすればよい。
　無機塩類としては、例えばリン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硝酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸亜鉛、硫酸コバルト、又は炭酸カルシウム等が挙げられる。これら無機塩は、１種を単独で使用してもよく、また２種以上を混合して使用してもよい。培地中の無機塩類濃度は、使用する無機塩によっても異なるが、通常、約0.01～1（ｗ／ｖ％）とすればよい。
　栄養物質としては、例えば肉エキス、ペプトン、ポリペプトン、酵母エキス、乾燥酵母、コーンスティープリカー、脱脂粉乳、脱脂大豆塩酸加水分解物、又は動植物若しくは微生物菌体のエキスやそれらの分解物等が挙げられる。栄養物質の培地濃度は、使用する栄養物質によっても異なるが、通常、約0.1～10（ｗ／ｖ％）とすればよい。さらに、必要に応じて、ビタミン類を添加することもできる。ビタミン類としては、例えば、ビオチン、チアミン（ビタミンB1）、ピリドキシン（ビタミンB6）、パントテン酸、イノシトール、ニコチン酸等が挙げられる。
　培地のｐＨは約５～８が好ましい。
　好ましい微生物培養培地としては、A培地〔Inui, M. et al., Metabolic analysis of Corynebacterium glutamicum during lactate and succinate productions under oxygen deprivation conditions. J. Mol. Microbiol. Biotechnol. 7:182-196 (2004)〕、BT培地〔Omumasaba, C.A. et al., Corynebacterium glutamicum glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase isoforms with opposite, ATP-dependent regulation. J. Mol. Microbiol. Biotechnol. 8:91-103 (2004)〕等が挙げられる。
　培養温度は約１５～４５℃とすればよく、培養時間は約１～７日間とすればよい。
宿主染色体遺伝子の破壊又は欠失
　宿主のコリネバクテリウム グルタミカムは、その染色体上に存在するフェノール2-モノオキシゲナーゼ活性を有する酵素をコードする遺伝子（poxF）が、破壊され、または欠失していることが好ましく、これにより一層効率良くフェノールを製造することができる。
　また、宿主のコリネバクテリウム グルタミカムは、その染色体上に存在する4-ヒドロキシベンゾエート ヒドロキシラーゼ活性を有する酵素をコードする遺伝子(pobA)が破壊され、または欠失していることが好ましく、これにより、一層効率良くフェノールを製造することができる。
　poxF及びpobAの双方が破壊され、または欠失していることが特に好ましい。
　遺伝子の部分配列を欠失し、正常に機能する酵素タンパク質を産生しないように改変した欠失型遺伝子を作製し、該遺伝子を含むＤＮＡで細菌を形質転換して、欠失型遺伝子と染色体上の遺伝子とで相同組換えを起こさせることにより、染色体上の遺伝子を欠失型又は破壊型の遺伝子に置換することができる。欠失型又は破壊型の遺伝子によってコードされる酵素タンパク質は、生成したとしても、野生型酵素タンパク質とは異なる立体構造を有し、機能が低下又は消失している。このような相同組換えを利用した遺伝子置換による遺伝子欠失又は破壊は既に確立しており、温度感受性複製起点を含むプラスミド、接合伝達可能なプラスミドを用いる方法、宿主内で複製起点を持たないスイサイドベクターを利用する方法などがある（米国特許第6303383号、特開平05-007491号）。
　具体的には、実施例１の項目に記載の方法により、poxFが破壊又は欠失したコリネバクテリウム　グルタミカムを得ることができる。また、同様の方法でpobAが破壊又は欠失したコリネバクテリウム　グルタミカムを得ることができる。
（ＩＩ）フェノールの製造方法
　上記説明した本発明の形質転換体を、4-ヒドロキシベンゾエートを含有する反応液中で反応させる工程と、反応液中のフェノールを回収する工程とを含む方法によりフェノールを製造することができる。
微生物の増殖
　反応に先立ち、形質転換体を好気条件下で、温度約２５～３８℃で、約１２～４８時間培養して増殖させることが好ましい。
培養用培地
　反応に先立つ形質転換体の好気的培養に用いる培地は、炭素源、窒素源、無機塩類およびその他の栄養物質等を含有する天然培地または合成培地を用いることができる。
　炭素源として、糖類（グルコース、フルクトース、マンノース、キシロース、アラビノース、ガラクトースのような単糖；スクロース、マルトース、ラクトース、セロビオース、キシロビオース、トレハロースのような二糖；澱粉のような多糖；糖蜜等）、マンニトール、ソルビトール、キシリトール、グリセリンのような糖アルコール；酢酸、クエン酵、乳酸、フマル酸、マレイン酸、グルコン酸のような有機酸；エタノール、プロパノールのようなアルコール；ノルマルパラフィンのような炭化水素等も用いることができる。
　炭素源は、１種を単独で、又は２種以上を混合して使用できる。
　窒素源としては、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、酢酸アンモニウムのような無機又は有機アンモニウム化合物、尿素、アンモニア水、硝酸ナトリウム、硝酸カリウム等を使用できる。また、コーンスティープリカー、肉エキス、ペプトン、NZ－アミン、蛋白質加水分解物、アミノ酸等の含窒素有機化合物等も使用できる。窒素源は、１種を単独で、又は２種以上を混合して使用できる。窒素源の培地中の濃度は、使用する窒素化合物によっても異なるが、通常、約0.1～10（ｗ／ｖ％）とすればよい。
　無機塩類としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硝酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸亜鉛、硫酸コバルト、炭酸カルシウム等が挙げられる。無機塩は、１種を単独で、又は2種以上を混合して使用できる。無機塩類の培地中の濃度は、使用する無機塩によっても異なるが、通常、約0.01～1（ｗ／ｖ％）とすればよい。
　栄養物質としては、肉エキス、ペプトン、ポリペプトン、酵母エキス、乾燥酵母、コーンスティープリカー、脱脂粉乳、脱脂大豆塩酸加水分解物、動植物又は微生物菌体のエキスやそれらの分解物等が挙げられる。栄養物質の培地中の濃度は、使用する栄養物質によっても異なるが、通常約0.1～10（ｗ／ｖ％）とすればよい。
　さらに、必要に応じて、ビタミン類を添加することもできる。ビタミン類としては、ビオチン、チアミン（ビタミンB1）、ピリドキシン（ビタミンB6）、パントテン酸、イノシトール、ニコチン酸等が挙げられる。
　培地のｐＨは約６～８が好ましい。
　具体的な好ましいコリネバクテリウム　グルタミカム用培地としては、A培地〔Inui, M. et al., Metabolic analysis of Corynebacterium glutamicum during lactate and succinate productions under oxygen deprivation conditions. J. Mol. Microbiol. Biotechnol. 7:182-196 (2004)〕、BT培地〔Omumasaba, C.A. et al., Corynebacterium glutamicum glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase isoforms with opposite, ATP-dependent regulation. J. Mol. Microbiol. Biotechnol. 8:91-103 (2004)〕等が挙げられる。これらの培地において、糖類濃度を上記範囲にして用いればよい。
反応液
　反応液は、フェノール前駆体(フェノール原料)を含有する水、緩衝液、無機塩培地などを用いることができる。
　前駆体としては4-ヒドロキシベンゾエートを用いる。4-ヒドロキシベンゾエートとしては、ナトリウム塩、カリウム塩のような塩；炭素数１～４のアルコールとのエステルなどが挙げられる。中でも、塩が好ましく、ナトリウム塩がより好ましい。前駆体は、１種を単独で、又は２種以上を混合して使用できる。
　反応液中の4-ヒドロキシベンゾエートの濃度は、約0.5～20（ｗ／ｖ％）が好ましく、約1～10（ｗ／ｖ％）がより好ましく、約2～5（ｗ／ｖ％）がさらにより好ましい。4-ヒドロキシベンゾエートは、芳香族化合物であるため細胞生存阻害作用を有するが、4-ヒドロキシベンゾエート濃度が上記範囲であれば、効率良く、フェノールを製造できる。
　緩衝液としては、リン酸バッファー、トリスバファー、炭酸バッファーなどが挙げられる。緩衝液の濃度は、約10～150 mMが好ましい。
　無機塩培地としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硝酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸亜鉛、硫酸コバルト、炭酸カルシウム等の無機塩の１種又は２種以上を含む培地が挙げられる。中でも、硫酸マグネシウムを含む培地が好ましい。無機塩培地として、具体的には、BT培地〔Omumasaba, C.A. et al., Corynebacterium glutamicum glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase isoforms with opposite, ATP-dependent regulation. J. Mol. Microbiol. Biotechnol. 8:91-103 (2004)〕等が挙げられる。無機塩類の培地中の濃度は、使用する無機塩によっても異なるが、通常、約0.01～1（ｗ／ｖ％）とすればよい。
　反応液のｐＨは約６～８が好ましい。反応中は、アンモニア水溶液、水酸化ナトリウム水溶液などを用いて、ｐＨコントローラー (例えば、エイブル株式会社製、型式：DT-1023）で、反応液のｐＨを中性付近、特に約７にコントロールしながら反応させることが好ましい。
反応条件
　反応温度、即ち反応中の形質転換体の生存温度は、約２０～５０℃が好ましく、約２５～４７℃がより好ましい。上記温度範囲であれば、効率良くフェノールを製造できる。
　また、反応時間は、約１～７日間が好ましく、約１～３日間がより好ましい。
　培養は、バッチ式、流加式、連続式の何れでもよい。中でも、バッチ式が好ましい。
＜還元条件＞
　反応は、好気的条件で行ってもよく、還元条件で行ってもよいが、還元条件で行うことが好ましい。還元条件では、コリネバクテリウム グルタミカムは実質的に増殖せず、一層効率的にフェノールを生産させることができる。
　還元条件は、反応液の酸化還元電位で規定される。反応液の酸化還元電位は、約－２００ｍＶ～－５００ｍＶが好ましく、約－２５０ｍＶ～－５００ｍＶがより好ましい。
　反応液の還元状態は簡便にはレサズリン指示薬（還元状態であれば、青色から無色への脱色）で推定できるが、正確には酸化還元電位差計（例えば、BROADLEY　JAMES社製、ORP Electrodes）を用いて測定できる。
　還元条件にある反応液の調整方法は、公知の方法を制限なく使用できる。例えば、反応液調製用の液体媒体として、蒸留水などの代わりに反応液用水溶液を使用してもよく、反応液用水溶液の調整方法は、例えば硫酸還元微生物などの絶対嫌気性微生物用の培養液調整方法（Pfennig, N. et al.,（1981）：The dissimilatory sulfate-reducing bacteria，In The Prokaryotes，A Handbook on Habitats, Isolation and Identification of Bacteria Ed．By Starr，M．P．et al., p.926-940，Berlin，Springer Verlag．）や「農芸化学実験書　第三巻、京都大学農学部　農芸化学教室編、1990年第26刷、産業図書株式会社出版」などが参考となり、所望する還元条件下の水溶液を得ることができる。
　具体的には、蒸留水などを加熱処理や減圧処理して溶解ガスを除去することにより、還元条件の反応液用水溶液を得ることができる。この場合、約10 mmHg以下、好ましくは約5 mmHg以下、より好ましくは約3 mmHg以下の減圧下で、約1～60分程度、好ましくは約5～40分程度、蒸留水などを処理することにより、溶解ガス、特に溶解酸素を除去して還元条件下の反応液用水溶液を作成することができる。
　また、適当な還元剤（例えば、チオグリコール酸、アスコルビン酸、システィン塩酸塩、メルカプト酢酸、チオール酢酸、グルタチオン、硫化ソーダ等）を添加して還元条件の反応液用水溶液を調整することもできる。
　これらの方法を適宜組み合わせることも有効な還元条件の反応液用水溶液の調整方法である。
　反応中も反応液を還元条件に維持することが好ましい。反応途中での還元条件を維持するために、反応系外からの酸素の混入を可能な限り防止することが望ましく、具体的には、反応系を窒素ガス等の不活性ガスや炭酸ガス等で封入する方法が挙げられる。酸素混入をより効果的に防止する方法としては、反応途中において本発明の好気性細菌の菌体内の代謝機能を効率よく機能させるために、反応系のｐＨ維持調整液の添加や各種栄養素溶解液を適宜添加する必要が生じる場合もあるが、このような場合には添加溶液から酸素を予め除去しておくことが有効である。
フェノールの回収
　上記のようにして培養することにより、反応液中にフェノールが生産される。反応液を回収することによりフェノールを回収できるが、さらに、公知の方法でフェノールを反応液から分離することもできる。そのような公知の方法として、蒸留法、膜透過法、有機溶媒抽出法等が挙げられる。
　以下、本発明を実施例により詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
実施例1　フェノール生産遺伝子のクローニングと発現
(1) 微生物からの染色体DNAの抽出
　コリネバクテリウム グルタミカム （Corynebacterium glutamicum） R (FERM P-18976)からの染色体DNA抽出は、A培地 [(NH2)2CO　2 g、(NH4)2SO4　7 g、KH2PO4　0.5 g、K2HPO4　0.5 g、MgSO4.7H2O　0.5 g、0.06% (w/v) Fe2 SO4.7H2O + 0.042% (w/v) MnSO4.2H2O　1 ml、0.02% (w/v) biotin solution　1 ml、0.01% (w/v) thiamin solution 2 ml、yeast extract　2 g、vitamin assay casamino acid　7 gを蒸留水1 Lに溶解] に、炭素源として、最終濃度4%になるように50% (w/v)グルコース溶液を添加し、白金耳を用いて植菌後、対数増殖期まで33℃で振盪培養し、菌体を集菌後、DNAゲノム抽出キット（商品名：GenomicPrep Cells and Tissue DNA Isolation Kit、アマシャム社製）を用いて、取扱説明書に従い、集めた菌体から染色体DNAを回収した。
　バチラス サブチリス（Bacillus subtilis）NBRC 14144からの染色体DNA抽出は、NBRC Medium No.802培地 [polypeptone 10 g, yeast extract 2 g, MgSO4・7H2O 1 gを蒸留水1 Lに溶解] に、白金耳を用いて植菌後、対数増殖期まで37℃で振盪培養し、菌体を集菌後、DNAゲノム抽出キット(商品名：GenomicPrep Cells and Tissue DNA Isolation Kit、アマシャム社製)を用いて、取扱説明書に従い、集めた菌体から染色体DNAを回収した。
　バチラス アトロファエウス（Bacillus atrophaeus）JCM 9070からの染色体DNA抽出は、JCM Medium No.22培地 [peptone 10 g, beef extract 10 g, NaCl 5 gを蒸留水1 Lに溶解] に、白金耳を用いて植菌後、対数増殖期まで30℃で振盪培養し、菌体を集菌後、DNAゲノム抽出キット(商品名：GenomicPrep Cells and Tissue DNA Isolation Kit、アマシャム社製)を用いて、取扱説明書に従い、集めた菌体から染色体DNAを回収した。
　バチラス サブチリス 亜種 スピジゼニイ（Bacillus subtilis subsp. spizizenii）NBRC 101239からの染色体DNA抽出は、NBRC Medium No.802培地 [polypeptone 10 g, yeast extract 2 g, MgSO4・7H2O 1 gを蒸留水1 Lに溶解]に、白金耳を用いて植菌後、対数増殖期まで37℃で振盪培養し、菌体を集菌後、DNAゲノム抽出キット(商品名：GenomicPrep Cells and Tissue DNA Isolation Kit、アマシャム社製)を用いて、取扱説明書に従い、集めた菌体から染色体DNAを回収した。
　シトロバクター コセリ（Citrobacter koseri）ATCC BAA-895の染色体DNA（Catalog No. BAA-895D-5）はATCC（American Type Culture Collection）より入手した。
　エンテロバクター アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）NBRC 13534からの染色体DNA抽出は、NBRC Medium No.802培地 [polypeptone 10 g, yeast extract 2 g, MgSO4・7H2O 1 gを蒸留水1 Lに溶解]に、白金耳を用いて植菌後、対数増殖期まで37℃で振盪培養し、菌体を集菌後、DNAゲノム抽出キット(商品名：GenomicPrep Cells and Tissue DNA Isolation Kit、アマシャム社製)を用いて、取扱説明書に従い、集めた菌体から染色体DNAを回収した。
　エンテロバクター クロアカエ（Enterobacter cloacae）NBRC 13535からの染色体DNA抽出は、NBRC Medium No.802培地 [polypeptone 10 g, yeast extract 2 g, MgSO4・7H2O 1 gを蒸留水1 Lに溶解]に、白金耳を用いて植菌後、対数増殖期まで37℃で振盪培養し、菌体を集菌後、DNAゲノム抽出キット(商品名：GenomicPrep Cells and Tissue DNA Isolation Kit、アマシャム社製)を用いて、取扱説明書に従い、集めた菌体から染色体DNAを回収した。
　エンテロバクター ホルメシェイ（Enterobacter hormaechei）ATCC 49162からの染色体DNA抽出は、Tryptic Soy Broth培地 [Tryptic Soy Broth (Becton, Dickinson and Company製　Catalog No. 211825) 30 gを蒸留水1 Lに溶解]に、白金耳を用いて植菌後、対数増殖期まで30℃で振盪培養し、菌体を集菌後、DNAゲノム抽出キット(商品名：GenomicPrep Cells and Tissue DNA Isolation Kit、アマシャム社製)を用いて、取扱説明書に従い、集めた菌体から染色体DNAを回収した。
　エンテロバクター サカザキ（Enterobacter sakazakii）ATCC BAA-894からの染色体DNA（Catalog No. BAA-894D-5）はATCC（American Type Culture Collection）より入手した。

　エシェリヒア コリ（Escherichia coli） W NBRC 13500からの染色体DNA抽出は、NBRC Medium No.802培地 [polypeptone 10 g, yeast extract 2 g, MgSO4・7H2O 1 gを蒸留水1 Lに溶解]に、白金耳を用いて植菌後、対数増殖期まで30℃で振盪培養し、菌体を集菌後、DNAゲノム抽出キット(商品名：GenomicPrep Cells and Tissue DNA Isolation Kit、アマシャム社製)を用いて、取扱説明書に従い、集めた菌体から染色体DNAを回収した。
　エシェリヒア フェルグソニー（Escherichia fergusonii）NBRC 102419からの染色体DNA抽出は、NBRC Medium No.802培地 [polypeptone 10 g, yeast extract 2 g, MgSO4・7H2O 1 gを蒸留水1 Lに溶解]に、白金耳を用いて植菌後、対数増殖期まで30℃で振盪培養し、菌体を集菌後、DNAゲノム抽出キット(商品名：GenomicPrep Cells and Tissue DNA Isolation Kit、アマシャム社製)を用いて、取扱説明書に従い、集めた菌体から染色体DNAを回収した。
　パエニバチラス ポリミキサ（Paenibacillus polymyxa）NBRC 15309からの染色体DNA抽出は、NBRC Medium No.802培地 [polypeptone 10 g, yeast extract 2 g, MgSO4・7H2O 1 gを蒸留水1 Lに溶解]に、白金耳を用いて植菌後、対数増殖期まで30℃で振盪培養し、菌体を集菌後、DNAゲノム抽出キット(商品名：GenomicPrep Cells and Tissue DNA Isolation Kit、アマシャム社製)を用いて、取扱説明書に従い、集めた菌体から染色体DNAを回収した。
　パントエア アナナティス（Pantoea ananatis）LMG 20103からの染色体DNA抽出は、BCCM/LMG BacteriCulture Medium No.1培地 [beef extract 1 g, yeast extract 2 g, peptone 5 g, NaCl 5 gを蒸留水1 Lに溶解]に、白金耳を用いて植菌後、対数増殖期まで30℃で振盪培養し、菌体を集菌後、DNAゲノム抽出キット(商品名：GenomicPrep Cells and Tissue DNA Isolation Kit、アマシャム社製)を用いて、取扱説明書に従い、集めた菌体から染色体DNAを回収した。
(2) クローニングベクターの構築
クローニングベクターpCRB22の構築
　コリネバクテリウム カゼイ JCM12072由来のプラスミドpCASE1のDNA複製起点（以降、pCASE1-oriと記す）配列、及びクローニングベクターpHSG298（タカラバイオ株式会社製）をそれぞれ含むDNA断片を以下のPCR法により増幅した。
　PCRに際して、pCASE1-ori配列、クローニングベクターpHSG298をそれぞれクローン化するべく、配列番号1（pCASE1-ori配列）、配列番号2（クローニングベクター－pHSG298）を基に、それぞれ下記の一対のプライマーを合成し、使用した。
　pCASE1-ori配列増幅用プライマー
（a-1）；　5’- AT AGATCT AGAACGTCCGTAGGAGC -3’　　 （配列番号3）
（b-1）；　5’- AT AGATCT GACTTGGTTACGATGGAC -3’　　（配列番号4）
　尚、プライマー（a-1）及び（b-1）には、BglII制限酵素部位が付加されている。

　クローニングベクターpHSG298増幅用プライマー
（a-2）；　5’- AT AGATCT AGGTTTCCCGACTGGAAAG -3’　 （配列番号5）
（b-2）；　5’- AT AGATCT CGTGCCAGCTGCATTAATGA -3’　（配列番号6）
　尚、プライマー（a-2）及び（b-2）には、BglII制限酵素部位が付加されている。
　鋳型DNAは、Japan. Collection of Microorganisms (JCM)より入手したコリネバクテリウム カゼイ JCM12072から抽出したトータルDNA及びクローニングベクターpHSG298（タカラバイオ株式会社製）を用いた。
　実際のPCRは、サーマルサイクラー　GeneAmp PCR System 9700(アプライド・バイオシステムズ社製)を用い、反応試薬としてTaKaRa LA Taq（タカラバイオ株式会社製）を用いて下記の条件で行った。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000001
　*) pCASE1-ori配列を増幅する場合はプライマー（a-1）と（b-1）の組み合わせ、クローニングベクターpHSG298を増幅する場合はプライマー（a-2）と（b-2）の組み合わせで行った。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000002
　上記で生成した反応液10μlを0.8%アガロースゲルにより電気泳動を行い、pCASE1-ori配列の場合約1.4-kb、クローニングベクターpHSG298の場合、約2.7-kbのDNA断片が検出できた。
　上記のPCRにより増幅したコリネバクテリウム　カゼイ株由来のプラスミドpCASE1-ori配列含む約1.4-kb DNA断片10μl及びクローニングベクターpHSG298を含む約2.7-kb DNA断片10μlを各々制限酵素BglIIで切断し、70℃で10分処理させることにより制限酵素を失活させた後、両者を混合し、これにT4 DNAリガーゼ10×緩衝液　1μl 、T4 DNAリガーゼ （タカラバイオ株式会社製）1 unitの各成分を添加し、滅菌蒸留水で10μl にして、15℃で3時間反応させ、結合させた。これをライゲーションA液とした。
　得られたライゲーションA液を、塩化カルシウム法〔Journal of Molecular Biology, 53, 159 (1970)〕によりエシェリヒア コリJM109を形質転換し、カナマイシン50μg/mlを含むLB寒天培地〔1% ポリペプトン、0.5% 酵母エキス、0.5% 塩化ナトリウム、および1.5% 寒天〕に塗布した。
　培地上の生育株を常法により液体培養し、培養液よりプラスミドDNAを抽出、該プラスミドを制限酵素BglIIでそれぞれ切断し、挿入断片を確認した。この結果、クローニングベクターpHSG298約2.7-kbのDNA断片に加え、pCASE-ori配列の約1.4-kb DNA断片が認められた。
　pCASE1-ori配列を含むクローニングベクターをpCRB22と命名した。
クローニングベクターpCRB207の構築
　コリネバクテリウム グルタミカムR由来のグリセルアルデヒド3リン酸デヒドロゲナーゼ（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase）をコードするgapA遺伝子のプロモーター配列（以降、PgapAと記す）を含むDNA断片、及びクローニングベクターpKK223-3（ファルマシア社製）由来rrnBT1T2双方向ターミネーター配列（以降、ターミネーター配列と記す）を含むDNA断片を以下の方法により増幅した。
　PCRに際して、PgapA配列及びターミネーター配列をそれぞれクローン化するべく、配列番号7（PgapA配列）、配列番号8（ターミネーター配列）を基に、それぞれ下記の一対のプライマーを合成し、使用した。
　PgapA配列増幅用プライマー
（a-3）；　5’- CTCT GTCGAC CCGAAGATCTGAAGATTCCTG -3’（配列番号9）
（b-3）；　5’- CTCT GTCGAC GGATCC CCATGG TGTGTCTCCTCTAAAGATTGTAGG -3’
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　 （配列番号10）
　尚、プライマー（a-3）には、SalI制限酵素部位が、プライマー（b-3）には、SalI、BamHI及びNcoI制限酵素部位が付加されている。
　ターミネーター配列増幅用プライマー
（a-4）；　5’- CTCT GCATGC CCATGG CTGTTTTGGCGGATGAGAGA -3’
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　 （配列番号11）
（b-4）；　5’- CTCT GCATGC TCATGA AAGAGTTTGTAGAAACGCAAAAAGG -3 
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　 （配列番号12）
　尚、プライマー（a-4）には、SphI及びNcoI制限酵素部位が、プライマー（b-4）には、SphI及びBspHI制限酵素部位が付加されている。
　鋳型DNAは、コリネバクテリウム グルタミカム R (FERM P-18976)から抽出した染色体DNA及びpKK223-3プラスミド（ファルマシア社製）を用いた。
　実際のPCRは、サーマルサイクラー　GeneAmp PCR System 9700(アプライド・バイオシステムズ社製)を用い、反応試薬としてTaKaRa LA Taq（タカラバイオ株式会社製）を用いて下記の条件で行った。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000003
　*) PgapA配列を増幅する場合はプライマー(a-7)と(b-7)の組み合わせ、ターミネーター配列を増幅する場合はプライマー(a-8) と (b-8) の組み合わせで行った。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000004
　上記で生成した反応液10μlを0.8%アガロースゲルにより電気泳動を行い、PgapA配列の場合約0.6-kb、ターミネーター配列の場合、約0.4-kbのDNA断片が検出できた。
　上記のPCRにより増幅したコリネバクテリウム グルタミカム R由来PgapA配列を含む約0.6-kb DNA断片10μlとクローニングベクターpCRB22約4.1-kbを各々制限酵素SalIで切断し、70℃で10分処理させることにより制限酵素を失活させた後、両者を混合し、これにT4 DNAリガーゼ10×緩衝液　1μl 、T4 DNAリガーゼ （タカラバイオ株式会社製） 1 unitの各成分を添加し、滅菌蒸留水で10μl にして、15℃で3時間反応させ、結合させた。これをライゲーションB液とした。
　得られたライゲーションB液を、塩化カルシウム法〔Journal of Molecular Biology, 53, 159 (1970)〕によりエシェリヒア コリJM109を形質転換し、カナマイシン50μg/mlを含むLB寒天培地〔1% ポリペプトン、0.5% 酵母エキス、0.5% 塩化ナトリウム、および1.5% 寒天〕に塗布した。
　培地上の生育株を常法により液体培養し、培養液よりプラスミドDNAを抽出、該プラスミドを制限酵素SalIでそれぞれ切断し、挿入断片を確認した。この結果、クローニングベクターpCRB22約4.1-kbのDNA断片に加え、PgapA配列の約0.6-kb DNA断片が認められた。
　PgapA配列を含むクローニングベクターをpCRB206と命名した。
　上記PCRにより増幅したpKK223-3プラスミド由来ターミネーター配列を含む約0.4-kb DNA断片10μlを制限酵素NcoI及びBspHIで、上述のクローニングベクターpCRB206　2μlを制限酵素NcoIで切断し、70℃で10分処理させることにより制限酵素を失活させた後、両者を混合し、これにT4 DNAリガーゼ10×緩衝液　1μl 、T4 DNAリガーゼ （タカラバイオ株式会社製） 1 unitの各成分を添加し、滅菌蒸留水で10μl にして、15℃で3時間反応させ、結合させた。これをライゲーションC液とした。
　得られたライゲーションC液を、塩化カルシウム法〔Journal of Molecular Biology, 53, 159 (1970)〕によりエシェリヒア コリJM109を形質転換し、カナマイシン50μg/mlを含むLB寒天培地〔1% ポリペプトン、0.5% 酵母エキス、0.5% 塩化ナトリウム、および1.5% 寒天〕に塗布した。
　培地上の生育株を常法により液体培養し、培養液よりプラスミドDNAを抽出、該プラスミドを制限酵素で切断し、挿入断片を確認した。この結果、クローニングベクターpCRB206約4.7-kbのDNA断片に加え、ターミネーター配列の約0.4-kb DNA断片が認められた。
　rrnBT1T2ターミネーター配列を含むクローニングベクターをpCRB207と命名した。
クローニングベクターpCRB209の構築
　コリネバクテリウム グルタミカムR由来のgapA（glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase A）遺伝子のプロモーター（以降、PgapAと記す）配列を含むDNA断片を以下の方法により増幅した。
　PCRに際して、pCRB207配列をクローン化するべく、配列番号13（pCRB207）を基に、それぞれ下記の一対のプライマーを合成し、使用した。
　pCRB207配列増幅用プライマー
（a-5）； 5’- CTCT CATATG CTGTTTTGGCGGATGAGAG -3’　　(配列番号14)
（b-5）； 5’- CTCT CATATG GTGTCTCCTCTAAAGATTGTAGG -3’(配列番号15)
尚、プライマー（a-5）及び（b-5）にはNdeI制限酵素部位が付加されている。
　鋳型DNAは、gapAプロモーター及びrrnBT1T2ターミネーター配列を含有するクローニングベクターpCRB207を用いた。
　実際のPCRは、サーマルサイクラー　GeneAmp PCR System 9700(アプライド・バイオシステムズ社製)を用い、反応試薬としてTaKaRa LA Taq（宝酒造株式会社製）を用いて下記の条件で行った。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000005
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000006
　上記で生成した反応液10μlを0.8%アガロースゲルにより電気泳動を行い、クローニングベクターpCRB207配列を含む約5.1-kbのDNA断片が検出できた。
　上記のPCRにより増幅したpCRB207由来遺伝子を含む約5.1-kb DNA断片10μlを制限酵素NdeIで切断し、70℃で10分処理させることにより制限酵素を失活させた後、これにT4 DNAリガーゼ10×緩衝液　1μl 、T4 DNAリガーゼ　（宝酒造株式会社製） 1 unitの各成分を添加し、滅菌蒸留水で10μl にして、15℃で3時間反応させ、結合させた。これをライゲーションD液とした。
　得られたライゲーションD液を、塩化カルシウム法〔Journal of Molecular Biology, 53, 159 (1970)〕によりエシェリヒア コリJM109を形質転換し、カナマイシン50μg/mlを含むLB寒天培地〔1% ポリペプトン、0.5% 酵母エキス、0.5% 塩化ナトリウム、および1.5% 寒天〕に塗布した。
　この培地上の生育株を常法により液体培養し、培養液よりプラスミドDNAを抽出、該プラスミドを制限酵素NdeIで切断し、制限酵素サイトの挿入を確認した。
　PgapA配列及びrrnBT1T2ターミネーター配列を含むクローニングベクタ－をpCRB209と命名した。
(3) フェノール生産遺伝子のクローニング
バチラス サブチリス由来のフェノール生産遺伝子のクローニング
　バチラス サブチリス由来の4-ヒドロキシベンゾエート デカルボキシラーゼ活性を有する遺伝子をコードするbsdBCD遺伝子を含むDNA断片を以下のPCR法により増幅した。
　PCRに際して、bsdBCD遺伝子をクローン化するべく、配列番号16（バチラスサブチリス bsdBCD遺伝子）を基に、それぞれ下記の一対のプライマーを、アプライド・バイオシステムズ（Applied Biosystems）社製「394 DNA/RNAシンセサイザー（synthesizer）」を用いて合成し、使用した。
　bsdBCD遺伝子増幅用プライマー
（a-6）； 5’- CTCT CATATG AAAGCAGAATTCAAGCGTAAAG -3’（配列番号17）
（b-6）； 5’- CTCT CATATG GATCAAGCCTTTCGTTCCG -3’　 （配列番号18）
　尚、プライマー（a-6）及び（b-6）には、NdeI制限酵素部位が付加されている。
バチラス アトロファエウス由来のフェノール生産遺伝子のクローニング
　バチラス アトロファエウス由来の4-ヒドロキシベンゾエート デカルボキシラーゼ活性を有する遺伝子をコードするdca遺伝子を含むDNA断片を以下のPCR法により増幅した。
　PCRに際して、dca遺伝子をクローン化するべく、配列番号23（バチラス アトロファエウス dca遺伝子）を基に、それぞれ下記の一対のプライマーを、アプライド・バイオシステムズ（Applied Biosystems）社製「394 DNA/RNAシンセサイザー（synthesizer）」を用いて合成し、使用した。
　dca遺伝子増幅用プライマー
（a-9）；　5’- CTCT CATATG AAACTCGTTGTCGGGATG -3’（配列番号24）
（b-9）；　5’- CTCT CATATG TCAGGCCTTTCTTTCC -3’　（配列番号25）
　尚、プライマー（a-9）及び（b-9）には、NdeI制限酵素部位が付加されている。
バチラス サブチリス 亜種 スピジゼニイ由来のフェノール生産遺伝子のクローニング
　バチラス サブチリス 亜種 スピジゼニイ由来の4-ヒドロキシベンゾエート デカルボキシラーゼ活性を有する遺伝子をコードするdca遺伝子を含むDNA断片を以下のPCR法により増幅した。
　PCRに際して、dca遺伝子をクローン化するべく、配列番号26（バチラス サブチリス 亜種 スピジゼニイ dca遺伝子）を基に、それぞれ下記の一対のプライマーを、アプライド・バイオシステムズ（Applied Biosystems）社製「394 DNA/RNAシンセサイザー（synthesizer）」を用いて合成し、使用した。
　dca遺伝子増幅用プライマー
（a-10）； 5’- CTCT CATATG AAAGCAGAATTCAAGCGTAAAG -3’(配列番号27)
（b-10）； 5’- CTCT CATATG TCAAGCCTTTCGTTCCGG -3’　　(配列番号28)
　尚、プライマー（a-10）及び（b-10）には、NdeI制限酵素部位が付加されている。
シトロバクター コセリ由来のフェノール生産遺伝子のクローニング
　シトロバクター コセリ由来の4-ヒドロキシベンゾエート デカルボキシラーゼ活性を有する遺伝子をコードするdca遺伝子を含むDNA断片を以下のPCR法により増幅した。
　PCRに際して、dca遺伝子をクローン化するべく、配列番号29（シトロバクター コセリ dca遺伝子）を基に、それぞれ下記の一対のプライマーを、アプライド・バイオシステムズ（Applied Biosystems）社製「394 DNA/RNAシンセサイザー（synthesizer）」を用いて合成し、使用した。
　dca遺伝子増幅用プライマー
（a-11）； 5’- CTCT CATATG AGACTGATTGTGGGGATG -3’　 （配列番号30）
（b-11）； 5’- CTCT CATATG TTAACGCTTATCTTCCGCCAG -3’（配列番号31）
　尚、プライマー（a-11）及び（b-11）には、NdeI制限酵素部位が付加されている。
エンテロバクター アエロゲネス由来のフェノール生産遺伝子のクローニング
　エンテロバクター アエロゲネス由来の4-ヒドロキシベンゾエート デカルボキシラーゼ活性を有する遺伝子をコードするdca遺伝子を含むDNA断片を以下のPCR法により増幅した。
　PCRに際して、dca遺伝子をクローン化するべく、配列番号32（エンテロバクター アエロゲネス dca遺伝子）を基に、それぞれ下記の一対のプライマーを、アプライド・バイオシステムズ（Applied Biosystems）社製「394 DNA/RNAシンセサイザー（synthesizer）」を用いて合成し、使用した。
　 dca遺伝子増幅用プライマー
（a-12）； 5’- CTCT CATATG AAACTGATTATTGGGATGACCG -3’(配列番号33)
（b-12）； 5’- CTCT CATATG TTAACGCTTATCTGCCGCC -3’　 (配列番号34)
　尚、プライマー（a-12）及び（b-12）には、NdeI制限酵素部位が付加されている。
エンテロバクター クロアカエ由来のフェノール生産遺伝子のクローニング
　エンテロバクター クロアカエ由来の4-ヒドロキシベンゾエート デカルボキシラーゼ活性を有する遺伝子をコードするdca遺伝子を含むDNA断片を以下のPCR法により増幅した。
　PCRに際して、dca遺伝子をクローン化するべく、配列番号35（エンテロバクター クロアカエ dca遺伝子）を基に、それぞれ下記の一対のプライマーを、アプライド・バイオシステムズ（Applied Biosystems）社製「394 DNA/RNAシンセサイザー（synthesizer）」を用いて合成し、使用した。
　dca遺伝子増幅用プライマー
（a-13）；　5’- CTCT CATATG AGATTGATCGTGGGAATGAC -3’（配列番号36）
（b-13）；　5’- CTCT CATATG TTACAGCAATGGCGGAATGG -3’（配列番号37）
　尚、プライマー（a-13）及び（b-13）には、NdeI制限酵素部位が付加されている。
エンテロバクター ホルメシェイ由来のフェノール生産遺伝子のクローニング
　エンテロバクター ホルメシェイ由来の4-ヒドロキシベンゾエート デカルボキシラーゼ活性を有する遺伝子をコードするdca遺伝子を含むDNA断片を以下のPCR法により増幅した。
　PCRに際して、dca遺伝子をクローン化するべく、配列番号38（エンテロバクター ホルメシェイ dca遺伝子）を基に、それぞれ下記の一対のプライマーを、アプライド・バイオシステムズ（Applied Biosystems）社製「394 DNA/RNAシンセサイザー（synthesizer）」を用いて合成し、使用した。
　dca遺伝子増幅用プライマー
（a-14）； 5’- CTCT CATATG AGATTGATTGTGGGAATGAC -3’ （配列番号39）
（b-14）； 5’- CTCT CATATG GAGTCTGGTTTAGTTCTCTGC -3’（配列番号40）
　尚、プライマー（a-14）及び（b-14）には、NdeI制限酵素部位が付加されている。
エンテロバクター サカザキ由来のフェノール生産遺伝子のクローニング
　エンテロバクター サカザキ由来の4-ヒドロキシベンゾエート デカルボキシラーゼ活性を有する遺伝子をコードするdca遺伝子を含むDNA断片を以下のPCR法により増幅した。
　PCRに際して、dca遺伝子をクローン化するべく、配列番号41（エンテロバクター サカザキ dca遺伝子）を基に、それぞれ下記の一対のプライマーを、アプライド・バイオシステムズ（Applied Biosystems）社製「394 DNA/RNAシンセサイザー（synthesizer）」を用いて合成し、使用した。
　dca遺伝子増幅用プライマー
（a-15）；　5’- CTCT CATATG AGGCTAATTGTCGGAATGAC -3’（配列番号42）
（b-15）；　5’- CTCT CATATG TTAACGCTTACCATCCGCC -3’ （配列番号43）
　尚、プライマー（a-15）及び（b-15）には、NdeI制限酵素部位が付加されている。
エシェリヒア コリ由来のフェノール生産遺伝子のクローニング
　エシェリヒア コリ由来の4-ヒドロキシベンゾエート デカルボキシラーゼ活性を有する遺伝子をコードするdca遺伝子を含むDNA断片を以下のPCR法により増幅した。
　PCRに際して、dca遺伝子をクローン化するべく、配列番号44（エシェリヒア　コリ dca遺伝子）を基に、それぞれ下記の一対のプライマーを、アプライド・バイオシステムズ（Applied Biosystems）社製「394 DNA/RNAシンセサイザー（synthesizer）」を用いて合成し、使用した。
　dca遺伝子増幅用プライマー
（a-16）；　5’- CTCT CATATG AAACTGATCGTCGGGATG -3’（配列番号45）
（b-16）；　5’- CTCT CATATG TTAGCGCTTACCTTCCGC -3’（配列番号46）
　尚、プライマー（a-16）及び（b-16）には、NdeI制限酵素部位が付加されている。
エシェリヒア フェルグソニー由来のフェノール生産遺伝子のクローニング
　エシェリヒア フェルグソニー由来の4-ヒドロキシベンゾエート デカルボキシラーゼ活性を有する遺伝子をコードするdca遺伝子を含むDNA断片を以下のPCR法により増幅した。
　PCRに際して、dca遺伝子をクローン化するべく、配列番号47（エシェリヒアフェルグソニー dca遺伝子）を基に、それぞれ下記の一対のプライマーを、アプライド・バイオシステムズ（Applied Biosystems）社製「394 DNA/RNAシンセサイザー（synthesizer）」を用いて合成し、使用した。
　dca遺伝子増幅用プライマー
（a-17）；　5’- CTCT CATATG AGACTGATCGTCGGGAT -3’ （配列番号48）
（b-17）；　5’- CTCT CATATG TTAGCGCTTATCTGCCGC -3’（配列番号49）
　尚、プライマー（a-17）及び（b-17）には、NdeI制限酵素部位が付加されている。
パエニバチラス ポリミキサ由来のフェノール生産遺伝子のクローニング
　パエニバチラス ポリミキサ由来の4-ヒドロキシベンゾエート デカルボキシラーゼ活性を有する遺伝子をコードするdca遺伝子を含むDNA断片を以下のPCR法により増幅した。
　PCRに際して、dca遺伝子をクローン化するべく、配列番号50（パエニバチラス ポリミキサ dca遺伝子）を基に、それぞれ下記の一対のプライマーを、アプライド・バイオシステムズ（Applied Biosystems）社製「394 DNA/RNAシンセサイザー（synthesizer）」を用いて合成し、使用した。
　dca遺伝子増幅用プライマー
（a-18）；5’- CTCT CATATG AAGAAAATCATTGTAGGAATATCGG -3’(配列番号51)
（b-18）；5’- CTCT CATATG CTATATCCGCTCTGGAATAGG -3’　　(配列番号52)
　尚、プライマー（a-18）及び（b-18）には、NdeI制限酵素部位が付加されている。
パントエア アナナティス由来のフェノール生産遺伝子のクローニング
　パントエア アナナティス由来の4-ヒドロキシベンゾエート デカルボキシラーゼ活性を有する遺伝子をコードするdca遺伝子を含むDNA断片を以下のPCR法により増幅した。
　PCRに際して、dca遺伝子をクローン化するべく、配列番号53（パントエア アナナティス dca遺伝子）を基に、それぞれ下記の一対のプライマーを、アプライド・バイオシステムズ（Applied Biosystems）社製「394 DNA/RNAシンセサイザー（synthesizer）」を用いて合成し、使用した。
　dca遺伝子増幅用プライマー
（a-19）； 5’- CTCT CATATG AGTAGATTACTGTTAATTTCATTCGTAC -3
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　(配列番号54)
（b-19）； 5’- CTCT CATATG TTACTTAGCTAACAGAGGAGGG -3’
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　(配列番号55)
　尚、プライマー（a-19）及び（b-19）には、NdeI制限酵素部位が付加されている。
　鋳型DNAは、バチラス サブチリスは、NITE（National Institute of Technology and Evaluation） Biological Resource Center（NBRC）より入手したバチラス サブチリス NBRC 14144から抽出した染色体DNAを用いた。
　バチラス アトロファエウスは、Japan Collection of Microorganisms（JCM）より入手したバチラス アトロファエウス JCM 9070から抽出した染色体DNAを用いた。
　バチラス サブチリス 亜種 スピジゼニイは、NITE（National Institute of Technology and Evaluation） Biological Resource Center（NBRC）より入手したバチラス サブチリス 亜種 スピジゼニイNBRC 101239から抽出した染色体DNAを用いた。
　シトロバクター コセリは、American Type Culture Collection (ATCC)より入手したシトロバクター コセリ染色体DNA（catalog No. BAA-895D-5）を用いた。
　エンテロバクター アエロゲネスは、NITE（National Institute of Technology and Evaluation） Biological Resource Center（NBRC）より入手したエンテロバクター アエロゲネスNBRC 13534から抽出した染色体DNAを用いた。
　エンテロバクター クロアカエは、NITE（National Institute of Technology and Evaluation） Biological Resource Center（NBRC）より入手したエンテロバクター クロアカエNBRC 13535から抽出した染色体DNAを用いた。
　エンテロバクター ホルメシェイは、American Type Culture Collection (ATCC)より入手したエンテロバクター ホルメシェイATCC 49162から抽出した染色体DNAを用いた。
　エンテロバクター サカザキは、American Type Culture Collection (ATCC)より入手したエンテロバクター サカザキ染色体DNA（catalog No. BAA-894D-5）を用いた。
　エシェリヒア コリ Wは、NITE（National Institute of Technology and Evaluation） Biological Resource Center（NBRC）より入手したエシェリヒア コリNBRC 13500から抽出した染色体DNAを用いた。
　エシェリヒア フェルグソニーは、NITE（National Institute of Technology and Evaluation） Biological Resource Center（NBRC）より入手したエシェリヒア フェルグソニーNBRC 102419から抽出した染色体DNAを用いた。
　パエニバチラス ポリミキサは、NITE（National Institute of Technology and Evaluation） Biological Resource Center（NBRC）より入手したパエニバチラス ポリミキサNBRC 15309から抽出した染色体DNAを用いた。
　パントエア アナナティスは、BCCM/LMG（Belgian Coordinated Collections of Microorganisms / Laboratory for Microbiology, University of Gent）より入手したパントエア アナナティスLMG 20103から抽出した染色体DNAを用いた。
　実際のPCRは、サーマルサイクラー　GeneAmp PCR System 9700(アプライド・バイオシステムズ社製)を用い、反応試薬としてTaKaRa LA Taq（タカラバイオ株式会社製）を用いて下記の条件で行った。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000007
*)バチラス サブチリス bsdBCD遺伝子を増幅する場合はプライマー（a-6）と （b-6）の組み合わせ、バチラス アトロファエウスdca遺伝子を増幅する場合はプライマー（a-9）と （b-9）の組み合わせ、バチラス サブチリス 亜種　スピジゼニイ dca遺伝子を増幅する場合はプライマー（a-10）と （b-10）の組み合わせ、シトロバクター コセリ dca遺伝子を増幅する場合はプライマー（a-11）と （b-11）の組み合わせ、エンテロバクター アエロゲネス dca遺伝子を増幅する場合はプライマー（a-12）と （b-12）の組み合わせ、エンテロバクター クロアカエ dca遺伝子を増幅する場合はプライマー（a-13）と （b-13）の組み合わせ、エンテロバクター ホルメシェイ dca遺伝子を増幅する場合はプライマー（a-14）と （b-14）の組み合わせ、エンテロバクター サカザキ dca遺伝子を増幅する場合はプライマー（a-15）と （b-15）の組み合わせ、エシェリヒア コリ W　dca遺伝子を増幅する場合はプライマー（a-16）と （b-16）の組み合わせ、エシェリヒア フェルグソニー dca遺伝子を増幅する場合はプライマー（a-17）と （b-17）の組み合わせ、パエニバチラス ポリミキサ dca遺伝子を増幅する場合はプライマー（a-18）と （b-18）の組み合わせ、パントエア アナナティス dca遺伝子を増幅する場合はプライマー（a-19）と （b-19）の組み合わせで行った。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000008
　上記で生成した反応液10μlを0.8%アガロースゲルにより電気泳動を行い、バチラス サブチリス bsdBCD遺伝子の場合約2.3-kb、バチラス アトロファエウス bsdBCD遺伝子の場合約2.3-kb、バチラス サブチリス 亜種　スピジゼニイ dca遺伝子の場合約2.3-kb、シトロバクター コセリ dca遺伝子の場合約2.3-kb、エンテロバクター アエロゲネス dca遺伝子の場合約2.3-kb、エンテロバクター クロアカエdca遺伝子の場合約2.3-kb、エンテロバクター ホルメシェイdca遺伝子の場合約2.4-kb、エンテロバクター サカザキ dca遺伝子の場合約2.3-kb、エシェリヒア コリ W dca遺伝子の場合約2.3-kb、エシェリヒア フェルグソニー dca遺伝子の場合約2.3-kb、パエニバチラス ポリミキサ dca遺伝子の場合約2.3-kb、パントエア アナナティス dca遺伝子の場合約2.3-kbのDNA断片が検出できた。
(4) フェノール生産遺伝子発現プラスミドの構築
フェノール生産遺伝子のpCRB209へのクローニング
　上記項(3)に示したPCRにより増幅したバチラス サブチリス株由来 bsdBCD遺伝子を含む約2.3-kb DNA断片、バチラス アトロファエウス株由来 dca遺伝子を含む約2.3-kb DNA断片、バチラス サブチリス 亜種　スピジゼニイ株由来 dca遺伝子を含む約2.3-kb DNA断片、シトロバクター コセリ株由来 dca遺伝子を含む約2.3-kb DNA断片、エンテロバクター アエロゲネス株由来 dca遺伝子を含む約2.3-kb DNA断片、エンテロバクター クロアカエ株由来 dca遺伝子を含む約2.3-kb DNA断片、エンテロバクター ホルメシェイ株由来 dca遺伝子を含む約2.4-kb DNA断片、エンテロバクター サカザキ株由来 dca遺伝子を含む約2.3-kb DNA断片、エシェリヒア コリ W株由来 dca遺伝子を含む約2.3-kb DNA断片、エシェリヒア フェルグソニー株由来 dca遺伝子を含む約2.3-kb DNA断片、パエニバチラス ポリミキサ株由来 dca遺伝子を含む約2.3-kb DNA断片、及びパントエア アナナティス株由来 dca遺伝子を含む約2.3-kb DNA断片のそれぞれ10μl及びPgapAプロモーターを含有するクローニングベクターpCRB209　2μlを各々制限酵素NdeIで切断し、70℃で10分処理させることにより制限酵素を失活させた後、両者を混合し、これにT4 DNAリガーゼ10×緩衝液　1μl 、T4 DNAリガーゼ　（タカラバイオ株式会社製） 1 unitの各成分を添加し、滅菌蒸留水で10μl にして、15℃で3時間反応させ、結合させた。これを、それぞれライゲーションE液、G液、H液、I液、J液、K液、L液、M液、N液、O液、P液及びQ液とした。
　得られた12種類のライゲーションE液、G液、H液、I液、J液、K液、L液、M液、N液、O液、P液及びQ液それぞれを、塩化カルシウム法〔Journal of Molecular Biology, 53, 159 (1970)〕によりエシェリヒア コリJM109を形質転換し、カナマイシン50μg/mlを含むLB寒天培地〔1% ポリペプトン、0.5% 酵母エキス、0.5% 塩化ナトリウム、および1.5% 寒天〕に塗布した。
　各々培地上の生育株を常法により液体培養し、培養液よりプラスミドDNAを抽出、該プラスミドを制限酵素でそれぞれ切断し、挿入断片を確認した。この結果、プラスミドpCRB209約5.1-kbのDNA断片に加え、バチラス　サブチリス株由来 bsdBCD遺伝子（ライゲーションE液）の場合、長さ約2.3-kbの挿入断片が、バチラス アトロファエウス株由来 dca遺伝子（ライゲーションG液）の場合、長さ約2.3-kbの挿入断片が、バチラス サブチリス 亜種　スピジゼニイ株由来 dca遺伝子（ライゲーションH液）の場合、長さ約2.3-kbの挿入断片が、シトロバクター コセリ株由来 dca遺伝子（ライゲーションI液）の場合、長さ約2.3-kbの挿入断片が、エンテロバクター アエロゲネス株由来 dca遺伝子（ライゲーションJ液）の場合、長さ約2.3-kbの挿入断片が、エンテロバクター クロアカエ株由来 dca遺伝子（ライゲーションK液）の場合、長さ約2.3-kbの挿入断片が、エンテロバクター ホルメシェイ株由来 dca遺伝子（ライゲーションL液）の場合、長さ約2.4-kbの挿入断片が、エンテロバクター サカザキ株由来 dca遺伝子（ライゲーションM液）の場合、長さ約2.3-kbの挿入断片が、エシェリヒア コリ W株由来 dca遺伝子（ライゲーションN液）の場合、長さ約2.3-kbの挿入断片が、エシェリヒア フェルグソニー株由来 dca遺伝子（ライゲーションO液）の場合、長さ約2.3-kbの挿入断片が、パエニバチラス ポリミキサ株由来 dca遺伝子（ライゲーションP液）の場合、長さ約2.3-kbの挿入断片が、パントエア アナナティス株由来 dca遺伝子（ライゲーションQ液）の場合、長さ約2.3-kbの挿入断片が認められた。
　バチラス サブチリス株由来 bsdBCD遺伝子を含むプラスミドをpCRB209- bsdBCD/BS（図１）、バチラス アトロファエウス株由来 dca遺伝子を含むプラスミドをpCRB209-dca/BAE、バチラス サブチリス 亜種　スピジゼニイ株由来 dca遺伝子を含むプラスミドをpCRB209-dca/BSS、シトロバクター コセリ株由来 dca遺伝子を含むプラスミドをpCRB209-dca/CKO、エンテロバクター アエロゲネス株由来 dca遺伝子を含むプラスミドをpCRB209-dca/EAE、エンテロバクター クロアカエ株由来 dca遺伝子を含むプラスミドをpCRB209-dca/ECL、エンテロバクター ホルメシェイ株由来 dca遺伝子を含むプラスミドをpCRB209-dca/EHO、エンテロバクター サカザキ株由来 dca遺伝子を含むプラスミドをpCRB209-dca/ESA、エシェリヒア コリ W株由来 dca遺伝子を含むプラスミドをpCRB209-dca/ECK、エシェリヒア フェルグソニー株由来 dca遺伝子を含むプラスミドをpCRB209-dca/EFE、パエニバチラス ポリミキサ株由来 dca遺伝子を含むプラスミドをpCRB209-dca/PPY、パントエア アナナティス株由来 dca遺伝子を含むプラスミドをpCRB209-dca/PAMと命名した。
(5) コリネバクテリウム グルタミカムの染色体遺伝子破壊用プラスミドの構築
コリネバクテリウム グルタミカム株poxF遺伝子破壊用プラスミドの構築
　コリネバクテリウム グルタミカム株の染色体上poxF遺伝子のマーカーレス破壊用プラスミドを構築するために必要なDNA断片を以下のPCR法により増幅した。
　PCRに際してコリネバクテリウム グルタミカム　Rの配列を基に、それぞれ下記の一対のプライマーを、アプライド・バイオシステムズ（Applied Biosystems）社製「394 DNA/RNAシンセサイザー（synthesizer）」を用いて合成し、使用した。
poxF-1領域増幅用プライマー
（a-7）； 5’- CTCT TCTAGA TACGTCCTAAACACCCGAC -3’ （配列番号19）
（b-7）； 5’- GACCAACCATTGCTGACTTGCGTATCCATAGTCAGGCTTC -3’
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　 （配列番号20）
　尚、プライマー（a-7）には、XbaI制限酵素部位が付加されている。

poxF-2領域増幅用プライマー
（a-8）； 5’- CAAGTCAGCAATGGTTGGTC -3’　　　　　　　 (配列番号21)
（b-8）； 5’- CTCT TCTAGA TGATCAGTACCAAGGGTGAG -3’　 (配列番号22)
　尚、プライマー（b-8）には、XbaI制限酵素部位が付加されている。
　鋳型DNAは、コリネバクテリウム グルタミカムRから抽出した染色体DNAを用いた。
　実際のPCRは、サーマルサイクラー　GeneAmp PCR System 9700(アプライド・バイオシステムズ社製)を用い、反応試薬としてTaKaRa LA Taq（タカラバイオ株式会社製）を用いて下記の条件で行った。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000009
上記で生成した反応液10μlを0.8%アガロースゲルにより電気泳動を行い、コリネバクテリウム　グルタミカムpoxF-1領域の場合約0.8-kb、poxF-2領域の場合約0.8-kbのDNA断片が検出できた。
　次に、上記のPCRにより増幅したpoxF-1領域断片とpoxF-2領域断片を1μlずつ混合し、PCRにより2種の断片の結合反応を行った。
　実際のPCRは、サーマルサイクラー　GeneAmp PCR System 9700(アプライド・バイオシステムズ社製)を用い、反応試薬としてTaKaRa LA Taq（タカラバイオ株式会社製）を用いて下記の条件で行った。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000011
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000012
　さらに、得られたpoxF-1及びpoxF-2の結合断片を鋳型とし、PCRによりpoxF欠失断片の増幅を行った。
　実際のPCRは、サーマルサイクラー　GeneAmp PCR System 9700(アプライド・バイオシステムズ社製)を用い、反応試薬としてTaKaRa LA Taq（タカラバイオ株式会社製）を用いて下記の条件で行った。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000013
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000014
　上記で生成した反応液10μlを0.8%アガロースゲルにより電気泳動を行い、poxF欠失断片約1.6-kbが検出できた。
　上記のPCRにより増幅したコリネバクテリウム グルタミカム R由来poxF欠失配列約1.7-kb DNA断片10μlと約4.4-kbのマーカーレス染色体遺伝子導入用プラスミドpCRA725 [J. Mol. Microbiol. Biotechnol., Vol. 8, 243-254(2004) 、（特開2006-124440）] 2μlを各々制限酵素XbaIで切断し、70℃で10分処理させることにより制限酵素を失活させた後、両者を混合し、これにT4 DNAリガーゼ10×緩衝液　1μl 、T4 DNAリガーゼ （タカラバイオ株式会社製） 1 unitの各成分を添加し、滅菌蒸留水で10μl にして、15℃で3時間反応させ、結合させた。これをライゲーションF液とした。
　得られたライゲーションF液を、塩化カルシウム法〔Journal of Molecular Biology, 53, 159 (1970)〕によりエシェリヒア コリJM109を形質転換し、カナマイシン50μg/mlを含むLB寒天培地〔1% ポリペプトン、0.5% 酵母エキス、0.5% 塩化ナトリウム、および1.5% 寒天〕に塗布した。
　培地上の生育株を常法により液体培養し、培養液よりプラスミドDNAを抽出、該プラスミドを制限酵素XbaIでそれぞれ切断し、挿入断片を確認した。この結果、プラスミドpCRA725約4.4-kbのDNA断片に加え、コリネバクテリウム グルタミカム株由来pheA欠失遺伝子（ライゲーションF液）の場合、長さ約1.7-kbの挿入断片が認められた。
　コリネバクテリウム グルタミカム株由来poxF欠失遺伝子を含むプラスミドをpCRA725-poxF/CGと命名した。
コリネバクテリウム グルタミカム株pobA遺伝子破壊用プラスミドの構築
　コリネバクテリウム グルタミカム株の染色体上pobA遺伝子のマーカーレス破壊用プラスミドを構築するために必要なDNA断片を以下のPCR法により増幅した。
　PCRに際してコリネバクテリウム グルタミカム Rの配列を基に、それぞれ下記の一対のプライマーを、アプライド・バイオシステムズ（Applied Biosystems）社製「394 DNA/RNAシンセサイザー（synthesizer）」を用いて合成し、使用した。
pobA-1領域増幅用プライマー
（a-20）； 5’- CTCT TCTAGA GAAACGATCAAGTGCACCAG -3’（配列番号56）
（b-20）； 5’- GACACGAGCGTTTATACCTCTAATTGCCACTGGTACGTGG -3’
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　 （配列番号57）
　尚、プライマー（a-20）には、XbaI制限酵素部位が付加されている。

pobA-2領域増幅用プライマー
（a-21）；　5’- GAGGTATAAACGCTCGTGTC -3’　　　　　 （配列番号58）
（b-21）；　5’- CTCT GAGCTC GAGAACACGAACCATACGAG -3 （配列番号59）
　尚、プライマー（b-21）には、SacI制限酵素部位が付加されている。
　鋳型DNAは、コリネバクテリウム グルタミカムRから抽出した染色体DNAを用いた。
　実際のPCRは、サーマルサイクラー　GeneAmp PCR System 9700(アプライド・バイオシステムズ社製)を用い、反応試薬としてTaKaRa LA Taq（タカラバイオ株式会社製）を用いて下記の条件で行った。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000015
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000016
　上記で生成した反応液10μlを0.8%アガロースゲルにより電気泳動を行い、コリネバクテリウム グルタミカムコリpobA-1領域の場合約1.0-kb、pobA-2領域の場合約1.0-kbのDNA断片が検出できた。
　次に、上記のPCRにより増幅したpobA-1領域断片とpobA-2領域断片を1μlずつ混合し、PCRにより2種の断片の結合反応を行った。
　実際のPCRは、サーマルサイクラー　GeneAmp PCR System 9700(アプライド・バイオシステムズ社製)を用い、反応試薬としてTaKaRa LA Taq（タカラバイオ株式会社製）を用いて下記の条件で行った。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000017
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000018
　さらに、得られたpobA-1及びpobA -2の結合断片を鋳型とし、PCRによりpobA欠失断片の増幅を行った。
　実際のPCRは、サーマルサイクラー　GeneAmp PCR System 9700(アプライド・バイオシステムズ社製)を用い、反応試薬としてTaKaRa LA Taq（タカラバイオ株式会社製）を用いて下記の条件で行った。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000019
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000020
　上記で生成した反応液10μlを0.8%アガロースゲルにより電気泳動を行い、pobA欠失断片約2.0が検出できた。
　上記のPCRにより増幅したコリネバクテリウム グルタミカム R由来pobA欠失配列約2.0 DNA断片10μlと約4.4-kbのマーカーレス染色体遺伝子導入用プラスミドpCRA725 [J. Mol. Microbiol. Biotechnol. Vol. 8, 243-254(2004) 、（特開2006-124440）] 2μlを各々制限酵素XbaI及びSacIで切断し、70℃で10分処理させることにより制限酵素を失活させた後、両者を混合し、これにT4 DNAリガーゼ10×緩衝液　1μl 、T4 DNAリガーゼ （タカラバイオ株式会社製） 1 unitの各成分を添加し、滅菌蒸留水で10μl にして、15℃で3時間反応させ、結合させた。これをライゲーションR液とした。
　得られたライゲーションR液を、塩化カルシウム法〔Journal of Molecular Biology, 53, 159 (1970)〕によりエシェリヒア コリJM109を形質転換し、カナマイシン50μg/mlを含むLB寒天培地〔1% ポリペプトン、0.5% 酵母エキス、0.5% 塩化ナトリウム、および1.5% 寒天〕に塗布した。
　培地上の生育株を常法により液体培養し、培養液よりプラスミドDNAを抽出、該プラスミドを制限酵素XbaI及びSacIでそれぞれ切断し、挿入断片を確認した。この結果、プラスミドpCRA725約4.4-kbのDNA断片に加え、コリネバクテリウム グルタミカム株由来pobA欠失遺伝子（ライゲーションN液）の場合、長さ約2.0-kbの挿入断片が認められた。
　コリネバクテリウム グルタミカム株由来pobA欠失遺伝子を含むプラスミドをpCRA725-pobA/CGと命名した。
(6) 副生経路遺伝子破壊株の構築
コリネバクテリウム グルタミカム株poxF遺伝子破壊株の構築
　マーカーレス染色体遺伝子導入用ベクターpCRA725は、コリネバクテリウム グルタミカムR内で複製不能なプラスミドである。pCRA725-poxF/CGを用いて、電気パルス法 [Agric. Biol. Chem.、Vol. 54、443-447(1990) 及びRes. Microbiol.、Vol. 144、181-185(1993)] により、コリネバクテリウム グルタミカムRを形質転換し、カナマイシン 50μg/mlを含むA寒天培地〔A液体培地、および1.5% 寒天〕に塗布した。上記の培地で得られた一重交叉株を、10%(W/V)スクロース含有BT寒天培地[(NH2)2CO　2g、(NH4)2SO4　7g、KH2PO4　0.5 g、K2HPO4　0.5 g、MgSO4.7H2O　0.5 g、0.06% (w/v) Fe2 SO4.7H2O + 0.042% (w/v) MnSO4.2H2O　1 ml、0.02% (w/v) biotin solution　1 ml、0.01% (w/v) thiamin solution 2 mlを蒸留水1Lに溶解、および1.5% 寒天]に塗付した。
　プラスミドpCRA725-poxF/CGが染色体上の相同領域との一重交叉株の場合、pCRA725-poxF/CG上のカナマイシン耐性遺伝子の発現によるカナマイシン耐性と、バチラス サブチリス（Bacillus subtilis）のsacR-sacB遺伝子の発現によるスクロース含有培地での致死性を示すのに対し、二重交叉株の場合、pCRA725-poxF/CG上のカナマイシン耐性遺伝子の脱落によるカナマイシン感受性と、sacR-sacB遺伝子の脱落によるスクロース含有培地での生育性を示す。従って、マーカーレス染色体遺伝子破壊株は、カナマイシン感受性及びスクロース含有培地生育性を示す。
　そこで、カナマイシン感受性及びスクロース含有培地生育性を示した株を選択した。このコリネバクテリウム グルタミカムR株poxF遺伝子マーカーレス破壊株をコリネバクテリウム グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）ΔpoxFと命名した。
コリネバクテリウム グルタミカム株poxF, pobA遺伝子破壊株の構築
　マーカーレス染色体遺伝子導入用ベクターpCRA725は、コリネバクテリウム グルタミカムR内で複製不能なプラスミドである。pCRA725-pobA/CGを用いて、電気パルス法 [Agric. Biol. Chem., Vol. 54, 443-447(1990) 及びRes. Microbiol., Vol. 144, 181-185(1993)] により、コリネバクテリウム グルタミカムΔpoxFを形質転換し、カナマイシン50μg/mlを含むA寒天培地〔A液体培地、および1.5% 寒天〕に塗布した。上記の培地で得られた一重交叉株を、10%(W/V)スクロース含有BT寒天培地[(NH2)2CO　2g、(NH4)2SO4　7g、KH2PO4　0.5 g、K2HPO4　0.5 g、MgSO4.7H2O　0.5 g、0.06% (w/v) Fe2 SO4.7H2O + 0.042% (w/v) MnSO4.2H2O　1 ml、0.02% (w/v) biotin solution　1 ml、0.01% (w/v) thiamin solution 2 mlを蒸留水1Lに溶解、および1.5% 寒天]に塗付した。
　プラスミドpCRA725-pobA/CGが染色体上の相同領域との一重交叉株の場合、pCRA725-pobA/CG上のカナマイシン耐性遺伝子の発現によるカナマイシン耐性と、バチラス　サブチリス（Bacillus subtilis）のsacR-sacB遺伝子の発現によるスクロース含有培地での致死性を示すのに対し、二重交叉株の場合、pCRA725-pobA/CG上のカナマイシン耐性遺伝子の脱落によるカナマイシン感受性と、sacR-sacB遺伝子の脱落によるスクロース含有培地での生育性を示す。従って、マーカーレス染色体遺伝子破壊株は、カナマイシン感受性及びスクロース含有培地生育性を示す。
　そこで、カナマイシン感受性及びスクロース含有培地生育性を示した株を選択した。このコリネバクテリウム グルタミカムΔpoxF株にpobA遺伝子のマーカーレス破壊を重ねた株を、コリネバクテリウム グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）ΔpoxFΔpobAと命名した。
(7) フェノール生産遺伝子導入株の構築
コリネバクテリウム グルタミカムΔpoxF株へのフェノール生産遺伝子導入
　上述のプラスミド12種類（pCRB209-bsdBCD/BS、pCRB209-dca/BAE、pCRB209-dca/BSS、pCRB209-dca/CKO、pCRB209-dca/EAE、pCRB209-dca/ECL、pCRB209-dca/EHO、pCRB209-dca/ESA、pCRB209-dca/ECK、pCRB209-dca/EFE、pCRB209-dca/PPY及びpCRB209-dca/PAM）をそれぞれ用いて、電気パルス法 [Agric. Biol. Chem.、Vol. 54、443-447(1990) 及びRes. Microbiol.、Vol. 144、181-185(1993)] により、コリネバクテリウム グルタミカムΔpoxF株を形質転換し、カナマイシン 50μg/mlを含むA寒天培地に塗布した。
　この培地上の生育株を常法により液体培養し、培養液よりプラスミドDNAを抽出、該プラスミドを制限酵素で切断し、挿入断片を確認した。この結果、上記で作製のプラスミドpCRB209-bsdBCD/BS、pCRB209-dca/BAE、pCRB209-dca/BSS、pCRB209-dca/CKO、pCRB209-dca/EAE、pCRB209-dca/ECL、pCRB209-dca/EHO、pCRB209-dca/ESA、pCRB209-dca/ECK、pCRB209-dca/EFE、pCRB209-dca/PPY及びpCRB209-dca/PAMの導入が認められた。
　pCRB209-bsdBCD/BSの導入が認められた株をコリネバクテリウム グルタミカムPHE21、pCRB209-dca/BAEの導入が認められた株をコリネバクテリウム グルタミカムPHE21-2、pCRB209-dca/BSSの導入が認められた株をコリネバクテリウム グルタミカムPHE21-3、pCRB209-dca/CKOの導入が認められた株をコリネバクテリウム グルタミカムPHE21-4、pCRB209-dca/EAEの導入が認められた株をコリネバクテリウム グルタミカムPHE21-5、pCRB209-dca/ECLの導入が認められた株をコリネバクテリウム グルタミカムPHE21-6、pCRB209-dca/EHOの導入が認められた株をコリネバクテリウム グルタミカムPHE21-7、pCRB209-dca/ESAの導入が認められた株をコリネバクテリウム グルタミカムPHE21-8、pCRB209-dca/ECKの導入が認められた株をコリネバクテリウム グルタミカムPHE21-9、pCRB209-dca/EFEの導入が認められた株をコリネバクテリウム グルタミカムPHE21-10、pCRB209-dca/PPYの導入が認められた株をコリネバクテリウム グルタミカムPHE21-11、pCRB209-dca/PAMの導入が認められた株をコリネバクテリウム グルタミカムPHE21-12と命名した。尚、本株の遺伝子組換えの概要を、表1にまとめて示した。
　コリネバクテリウム グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）PHE21は、日本国千葉県木更津市かずさ鎌足2-5-8（郵便番号292-0818）の独立行政法人製品評価技術基盤機構　特許生物寄託センターに寄託した（受託日：2010年10月21日、受託番号：NITE BP-996）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000021
コリネバクテリウム グルタミカムΔpoxFΔpobA株へのフェノール生産遺伝子導入
　上述のプラスミド12種類（pCRB209-bsdBCD/BS、pCRB209-dca/BAE、pCRB209-dca/BSS、pCRB209-dca/CKO、pCRB209-dca/EAE、pCRB209-dca/ECL、pCRB209-dca/EHO、pCRB209-dca/ESA、pCRB209-dca/ECK、pCRB209-dca/EFE、pCRB209-dca/PPY及びpCRB209-dca/PAM）をそれぞれ用いて、電気パルス法 [Agric. Biol. Chem., Vol. 54, 443-447(1990) 及びRes. Microbiol. Vol. 144, 181-185(1993)] により、コリネバクテリウム グルタミカムΔpoxFΔpobA株を形質転換し、カナマイシン 50μg/mlを含むA寒天培地に塗布した。
　この培地上の生育株を常法により液体培養し、培養液よりプラスミドDNAを抽出、該プラスミドを制限酵素で切断し、挿入断片を確認した。この結果、上記で作製のプラスミドpCRB209-bsdBCD/BS、pCRB209-dca/BAE、pCRB209-dca/BSS、pCRB209-dca/CKO、pCRB209-dca/EAE、pCRB209-dca/ECL、pCRB209-dca/EHO、pCRB209-dca/ESA、pCRB209-dca/ECK、pCRB209-dca/EFE、pCRB209-dca/PPY及びpCRB209-dca/PAMの導入が認められた。
　pCRB209-bsdBCD/BSの導入が認められた株をコリネバクテリウム グルタミカムPHE22-1、pCRB209-dca/BAEの導入が認められた株をコリネバクテリウム グルタミカムPHE22-2、pCRB209-dca/BSSの導入が認められた株をコリネバクテリウム グルタミカムPHE22-3、pCRB209-dca/CKOの導入が認められた株をコリネバクテリウム グルタミカムPHE22-4、pCRB209-dca/EAEの導入が認められた株をコリネバクテリウム グルタミカムPHE22-5、pCRB209-dca/ECLの導入が認められた株をコリネバクテリウム グルタミカムPHE22-6、pCRB209-dca/EHOの導入が認められた株をコリネバクテリウム グルタミカムPHE22-7、pCRB209-dca/ESAの導入が認められた株をコリネバクテリウム グルタミカムPHE22-8、pCRB209-dca/ECKの導入が認められた株をコリネバクテリウム グルタミカムPHE22-9、pCRB209-dca/EFEの導入が認められた株をコリネバクテリウム グルタミカムPHE22-10、pCRB209-dca/PPYの導入が認められた株をコリネバクテリウム グルタミカムPHE22-11、pCRB209-dca/PAMの導入が認められた株をコリネバクテリウム グルタミカムPHE22-12と命名した。尚、本株の遺伝子組換えの概要を、表2にまとめて示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000022
コリネバクテリウム グルタミカム R株へのフェノール生産遺伝子導入
　上述のプラスミド12種類（pCRB209-bsdBCD/BS、pCRB209-dca/BAE、pCRB209-dca/BSS、pCRB209-dca/CKO、pCRB209-dca/EAE、pCRB209-dca/ECL、pCRB209-dca/EHO、pCRB209-dca/ESA、pCRB209-dca/ECK、pCRB209-dca/EFE、pCRB209-dca/PPY及びpCRB209-dca/PAM）をそれぞれ用いて、電気パルス法 [Agric. Biol. Chem., Vol. 54、443-447(1990) 及びRes. Microbiol., Vol. 144、181-185(1993)] により、コリネバクテリウム グルタミカム R株を形質転換し、カナマイシン 50μg/mlを含むA寒天培地に塗布した。
　この培地上の生育株を常法により液体培養し、培養液よりプラスミドDNAを抽出、該プラスミドを制限酵素で切断し、挿入断片を確認した。この結果、上記で作製のプラスミドpCRB209-bsdBCD/BS、pCRB209-dca/BAE、pCRB209-dca/BSS、pCRB209-dca/CKO、pCRB209-dca/EAE、pCRB209-dca/ECL、pCRB209-dca/EHO、pCRB209-dca/ESA、pCRB209-dca/ECK、pCRB209-dca/EFE、pCRB209-dca/PPY及びpCRB209-dca/PAMの導入が認められた。
　pCRB209-bsdBCD/BSの導入が認められた株をコリネバクテリウム グルタミカムPHE23-1、pCRB209-dca/BAEの導入が認められた株をコリネバクテリウム グルタミカムPHE23-2、pCRB209-dca/BSSの導入が認められた株をコリネバクテリウム グルタミカムPHE23-3、pCRB209-dca/CKOの導入が認められた株をコリネバクテリウム グルタミカムPHE23-4、pCRB209-dca/EAEの導入が認められた株をコリネバクテリウム グルタミカムPHE23-5、pCRB209-dca/ECLの導入が認められた株をコリネバクテリウム グルタミカムPHE23-6、pCRB209-dca/EHOの導入が認められた株をコリネバクテリウム グルタミカムPHE23-7、pCRB209-dca/ESAの導入が認められた株をコリネバクテリウム グルタミカムPHE23-8、pCRB209-dca/ECKの導入が認められた株をコリネバクテリウム グルタミカムPHE23-9、pCRB209-dca/EFEの導入が認められた株をコリネバクテリウム グルタミカムPHE23-10、pCRB209-dca/PPYの導入が認められた株をコリネバクテリウム グルタミカムPHE23-11、pCRB209-dca/PAMの導入が認められた株をコリネバクテリウム グルタミカムPHE23-12と命名した。尚、本株の遺伝子組換えの概要を、表3にまとめて示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000023
実施例２　フェノール生産遺伝子を導入したコリネバクテリウム グルタミカム副生経路破壊株及びR株（野生株）のフェノール生成実験
　実施例１において作製したコリネバクテリウム グルタミカムΔpoxF/フェノール生産遺伝子導入株（表1参照）を、カナマイシン50μg/mlを含むA寒天培地[(NH2)2CO　2g、(NH4)2SO4　7g、KH2PO4　0.5 g、K2HPO4　0.5 g、MgSO4.7H2O　0.5 g、0.06% (w/v) Fe2 SO4.7H2O + 0.042% (w/v) MnSO4.2H2O　1 ml、0.02% (w/v) biotin solution　1 ml、0.01% (w/v) thiamin solution 2 ml、yeast extract　2 g、vitamin assay casamino acid　7 g、glucose 40 g、寒天 15 gを蒸留水1Lに懸濁] に塗布し、28℃、20時間暗所に静置した。
　上記のプレートで生育したコリネバクテリウム グルタミカムΔpoxF/フェノール生産遺伝子導入株を、カナマイシン50μg/mlを含有したA液体培地10mlの入った試験管に一白金耳植菌し、28℃にて15時間、好気的に振盪培養を行った。
　上記条件で生育したコリネバクテリウム グルタミカムΔpoxF/フェノール生産遺伝子導入株を、カナマイシン50μg/mlを含有したA液体培地500mlの入った容量2Lの三角フラスコに植菌し、28℃にて15時間、好気的に振盪培養を行った。
　このようにして培養増殖されたそれぞれの菌体は、遠心分離 (4℃、5,000×g, 15分)により菌体を回収した。得られた菌体を、終菌体濃度10％となるようにBT(-尿素)液体培地〔0.7% 硫酸アンモニウム、0.05% リン酸二水素カリウム、0.05% リン酸水素二カリウム、0.05% 硫酸マグネシウム・7水和物、0.0006% 硫酸鉄・7水和物、0.00042% 硫酸マンガン水和物、0.00002% ビオチン、0.00002% チアミン塩酸塩〕に50ml懸濁した。この菌体懸濁液を容量100mlメディウム瓶に入れ、還元条件下（酸化還元電位；-450 mV）、基質としてソディウム 4-ヒドロキシベンゾエートを250 mMとなるように添加し、33℃に保った水浴中で攪拌しながら反応させた。この時、反応液のpHが7.0を下回らないように2.5Nのアンモニア水を用いてpHコントローラー (エイブル株式会社製、型式：DT-1023）でコントロールしながら反応した。
　サンプリングした反応液を遠心分離 (4℃、15,000×g、10分) し、得られた上清液を用いてフェノールの定量を行った。
　この結果、コリネバクテリウム グルタミカムPHE21株は、還元条件下における反応において、1時間後に65 mM（6 g/L）、4時間後に180 mM (17 g/L)のフェノールを生成していた（表４）。同条件下におけるコリネバクテリウム グルタミカムPHE21-2～PHE21-12株の結果も表４に併せて示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000024
 ＊)　表内の表示の略語は以下の通り
＜遺伝子起源略語＞
BS ；　バチラス サブチリス
BAE；　バチラス アトロファエウス
BSS；　バチラス サブチリス 亜種 スピジゼニイ
CKO；　シトロバクター コセリ
EAE；　エンテロバクター アエロゲネス
ECL；　エンテロバクター クロアカエ
EHO；　エンテロバクター ホルメシェイ
ESA；　エンテロバクター サカザキ
ECK；　エシェリヒア コリ W
EFE；　エシェリヒア フェルグソニー
PPY；　パエニバチラス ポリミキサ
PAM；　パントエア アナナティス
　次に、実施例１において作製したコリネバクテリウム グルタミカムΔpoxFΔpobA/フェノール生産遺伝子導入株（表２参照）を、カナマイシン50μg/mlを含むA寒天培地[(NH2)2CO　2g、(NH4)2SO4　7g、KH2PO4　0.5 g、K2HPO4　0.5 g、MgSO4.7H2O　0.5 g、0.06% (w/v) Fe2 SO4.7H2O + 0.042% (w/v) MnSO4.2H2O　1 ml、0.02% (w/v) biotin solution　1 ml、0.01% (w/v) thiamin solution 2 ml、yeast extract　2 g、vitamin assay casamino acid　7 g、glucose 40 g、寒天 15 gを蒸留水1Lに懸濁] に塗布し、28℃、20時間暗所に静置した。
　上記のプレートで生育したコリネバクテリウム グルタミカムΔpoxFΔpobA/フェノール生産遺伝子導入株を、カナマイシン50μg/mlを含有したA液体培地10mlの入った試験管に一白金耳植菌し、28℃にて15時間、好気的に振盪培養を行った。
　上記条件で生育したコリネバクテリウム グルタミカムΔpoxFΔpobA/フェノール生産遺伝子導入株を、カナマイシン50μg/mlを含有したA液体培地500mlの入った容量2Lの三角フラスコに植菌し、28℃にて15時間、好気的に振盪培養を行った。
　このようにして培養増殖されたそれぞれの菌体は、遠心分離 (4℃、5,000×g, 15分)により菌体を回収した。得られた菌体を、終菌体濃度10％となるようにBT(-尿素)液体培地〔0.7% 硫酸アンモニウム、0.05% リン酸二水素カリウム、0.05% リン酸水素二カリウム、0.05% 硫酸マグネシウム・7水和物、0.0006% 硫酸鉄・7水和物、0.00042% 硫酸マンガン水和物、0.00002% ビオチン、0.00002% チアミン塩酸塩〕に50ml懸濁した。この菌体懸濁液を容量100mlメディウム瓶に入れ、還元条件下（酸化還元電位；-450 mV）、基質としてソディウム 4-ヒドロキシベンゾエートを250 mMとなるように添加し、33℃に保った水浴中で攪拌しながら反応させた。この時、反応液のpHが7.0を下回らないように2.5Nのアンモニア水を用いてpHコントローラー (エイブル株式会社製、型式：DT-1023）でコントロールしながら反応した。
　サンプリングした反応液を遠心分離 (4℃、15,000×g、10分) し、得られた上清液を用いてフェノールの定量を行った。
　この結果、コリネバクテリウム グルタミカムPHE22-1～PHE22-12株は、還元条件下における反応において、1時間後に表５に示すようにフェノールを生成していた。
　この結果より、poxA遺伝子を破壊することによりフェノール生産性の向上が観察された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000025
 ＊)　表内の表示の略語は以下の通り
＜遺伝子起源略語＞
BS ；　バチラス サブチリス
BAE；　バチラス アトロファエウス
BSS；　バチラス サブチリス 亜種 スピジゼニイ
CKO；　シトロバクター コセリ
EAE；　エンテロバクター アエロゲネス
ECL；　エンテロバクター クロアカエ
EHO；　エンテロバクター ホルメシェイ
ESA；　エンテロバクター サカザキ
ECK；　エシェリヒア コリ W
EFE；　エシェリヒア フェルグソニー
PPY；　パエニバチラス ポリミキサ
PAM；　パントエア アナナティス
　さらに、比較例として、実施例１において作製したコリネバクテリウム グルタミカムR株/フェノール生産遺伝子導入株（表３参照）を、カナマイシン50μg/mlを含むA寒天培地[(NH2)2CO　2g、(NH4)2SO4　7g、KH2PO4　0.5 g、K2HPO4　0.5 g、MgSO4.7H2O　0.5 g、0.06% (w/v) Fe2 SO4.7H2O + 0.042% (w/v) MnSO4.2H2O　1 ml、0.02% (w/v) biotin solution　1 ml、0.01% (w/v) thiamin solution 2 ml、yeast extract　2 g、vitamin assay casamino acid　7 g、glucose 40 g、寒天 15 gを蒸留水1Lに懸濁] に塗布し、28℃、20時間暗所に静置した。
　上記のプレートで生育したコリネバクテリウム グルタミカムR株/フェノール生産遺伝子導入株を、カナマイシン50μg/mlを含有したA液体培地10mlの入った試験管に一白金耳植菌し、28℃にて15時間、好気的に振盪培養を行った。
　上記条件で生育したコリネバクテリウム グルタミカムR株/フェノール生産遺伝子導入株を、カナマイシン50μg/mlを含有したA液体培地500mlの入った容量2Lの三角フラスコに植菌し、28℃にて15時間、好気的に振盪培養を行った。
　このようにして培養増殖されたそれぞれの菌体は、遠心分離 (4℃、5,000×g, 15分)により菌体を回収した。得られた菌体を、終菌体濃度10％となるようにBT(-尿素)液体培地〔0.7% 硫酸アンモニウム、0.05% リン酸二水素カリウム、0.05% リン酸水素二カリウム、0.05% 硫酸マグネシウム・7水和物、0.0006% 硫酸鉄・7水和物、0.00042% 硫酸マンガン水和物、0.00002% ビオチン、0.00002% チアミン塩酸塩〕に50ml懸濁した。この菌体懸濁液を容量100mlメディウム瓶に入れ、還元条件下（酸化還元電位；-450 mV）、基質としてソディウム 4-ヒドロキシベンゾエートを250 mMとなるように添加し、33℃に保った水浴中で攪拌しながら反応させた。この時、反応液のpHが7.0を下回らないように2.5Nのアンモニア水を用いてpHコントローラー (エイブル株式会社製、型式：DT-1023）でコントロールしながら反応した。
　サンプリングした反応液を遠心分離 (4℃、15,000×g、10分) し、得られた上清液を用いてフェノールの定量を行った。
　この結果、コリネバクテリウム グルタミカムPHE23-1～PHE23-12株は、還元条件下における反応において、1時間後に表６に示すようにフェノールを生成していた。
　この結果より、コリネバクテリウム グルタミカムR株（野生株）よりも、ΔpoxF株（表４）、さらにはΔpoxFΔpobA株（表５）にフェノール生産遺伝子を導入株した方が、フェノール生産性が高いことより、poxF遺伝子の破壊及びpobA遺伝子の破壊によりフェノール生産性に正の効果があることが明らかとなった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000026
 ＊)　表内の表示の略語は以下の通り
＜遺伝子起源略語＞
BS ；　バチラス サブチリス
BAE；　バチラス アトロファエウス
BSS；　バチラス サブチリス 亜種 スピジゼニイ
CKO；　シトロバクター コセリ
EAE；　エンテロバクター アエロゲネス
ECL；　エンテロバクター クロアカエ
EHO；　エンテロバクター ホルメシェイ
ESA；　エンテロバクター サカザキ
ECK；　エシェリヒア コリ W
EFE；　エシェリヒア フェルグソニー
PPY；　パエニバチラス ポリミキサ
PAM；　パントエア アナナティス
実施例３　フェノール生産用宿主としての適性試験
フェノールによる好気増殖への影響
　コリネバクテリウム グルタミカム、エシェリヒア コリおよびシュードモナス プチダについて、好気培養におけるフェノールの生育阻害試験を行った。尚、本試験に用いたシュードモナス プチダS12は、溶媒耐性菌として報告されており、これまでに唯一フェノール生産の宿主として用いられた技術が開示されている。
　コリネバクテリウム グルタミカムRをA寒天培地[(NH2)2CO　2g、(NH4)2SO4　7g、KH2PO4　0.5 g、K2HPO4　0.5 g、MgSO4.7H2O　0.5 g、0.06% (w/v) Fe2 SO4.7H2O + 0.042% (w/v) MnSO4.2H2O　1 ml、0.02% (w/v) biotin solution　1 ml、0.01% (w/v) thiamin solution 2 ml、yeast extract　2 g、vitamin assay casamino acid　7 g、glucose 40 g、寒天 15 gを蒸留水1Lに懸濁]に塗布し、33℃、15時間暗所に静置した。
　上記のプレートで生育したコリネバクテリウム グルタミカムRを、A液体培地[(NH2)2CO　2g、(NH4)2SO4　7g、KH2PO4　0.5 g、K2HPO4　0.5 g、MgSO4.7H2O　0.5 g、0.06% (w/v) Fe2 SO4.7H2O + 0.042% (w/v) MnSO4.2H2O　1 ml、0.02% (w/v) biotin solution　1 ml、0.01% (w/v) thiamin solution 2 ml、yeast extract　2 g、vitamin assay casamino acid　7 g、glucose 40 gを蒸留水1Lに溶解] 10mlの入った試験管に一白金耳植菌し、33℃にて13時間、好気的に振盪培養を行った。
　上記条件で生育したコリネバクテリウム グルタミカムRを、A液体培地100mlに初期菌体濃度OD610=0.05となるように植菌し、同時にフェノールが終濃度0、0.16、0.2、0.24、0.32mMとなるように添加し、33℃にて好気的に振盪培養を行った。菌体の生育はOD610の吸光度を測定することにより行った。
　エシェリヒア コリJM109をLB寒天培地〔1% ポリペプトン、0.5% 酵母エキス、0.5% 塩化ナトリウム、および1.5% 寒天〕に塗布し、37℃、15時間暗所に静置した。
　上記プレートで生育したエシェリヒア コリJM109を、LB液体培地〔1% ポリペプトン、0.5% 酵母エキスおよび0.5% 塩化ナトリウム〕10mlの入った試験管に一白金耳植菌し、37℃にて13時間、好気的に振盪培養を行った。
　上記条件で生育したエシェリヒア コリJM109をLB液体培地100mlに初期菌体濃度OD610=0.05となるように植菌し、同時にフェノール濃度が終濃度0、0.16、0.20mMとなるように添加し、37℃にて好気的に振盪培養を行った。菌体の生育はOD610の吸光度を測定することにより行った。
　シュードモナス プチダF1およびS12をLB寒天培地〔1% ポリペプトン、0.5% 酵母エキス、0.5% 塩化ナトリウム、および1.5% 寒天〕に塗布し、30℃、15時間暗所に静置した。
　上記プレートで生育したシュードモナス プチダF1およびS12を、LB（+グルコース）液体培地〔1% ポリペプトン、0.5% 酵母エキス、0.5% 塩化ナトリウムおよび0.4%グルコース〕10mlの入った試験管に一白金耳植菌し、30℃にて13時間、好気的に振盪培養を行った。
　上記条件で生育したシュードモナス プチダF1およびS12株をLB（+グルコース）液体培地100mlに初期菌体濃度OD610=0.05となるように植菌し、同時にフェノール濃度が終濃度0、0.10、0.20mMとなるように添加し、30℃にて好気的に振盪培養を行った。菌体の生育はOD610の吸光度を測定することにより行った。
培地中へのフェノール添加による好気増殖への影響の解析結果を図２に示す。
　エシェリヒア コリは、0.16%フェノール存在下で著しく増殖阻害を受け、0.20％フェノールでは完全に増殖が阻害された。
　シュードモナス プチダF1及び溶剤耐性菌として報告されていたシュードモナス プチダS12は、ほぼ同じ傾向を示し、0.10%フェノール存在下で著しく増殖阻害を受け0.20％フェノールでは完全に増殖が阻害された。
　これに対して、コリネバクテリウム グルタミカムは、エシェリヒア コリが顕著な増殖阻害を受けた0.16%のフェノール存在下においても増殖への影響はほとんどなく、エシェリヒア コリやシュードモナス プチダでは完全に増殖を阻害された0.20%のフェノール存在下においても良好な生育を示した。さらに0.24%のフェノール存在下において増殖が可能であった。
　このように、コリネバクテリウム グルタミカムはエシェリヒア コリおよびシュードモナス プチダと比較して、フェノールに対し高い耐性を有し、フェノール生産の宿主として高い適性を有することが示された。
　本発明方法によれば、微生物を用いて実用的な効率で4-ヒドロキシベンゾエートからフェノールを製造することができる。

Claims (12)

  1. 　4-ヒドロキシベンゾエート デカルボキシラーゼ(4-hydroxybenzoate decarboxylase)活性を有する酵素をコードする遺伝子が、宿主のコリネバクテリウム グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）に導入された、フェノール生産能を有する形質転換体。
  2. 　4-ヒドロキシベンゾエート デカルボキシラーゼ活性を有する酵素をコードする遺伝子が、バチラス サブチリス（Bacillus subtilis）、バチラス アトロファエウス（Bacillus atrophaeus）、バチラス サブチリス 亜種 スピジゼニイ（Bacillus subtilis subsp. spizizenii）、シトロバクター コセリ（Citrobacter koseri）、エンテロバクター アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）、エンテロバクター クロアカエ（Enterobacter cloacae）、エンテロバクター ホルメシェイ（Enterobacter hormaechei）、エンテロバクター サカザキ（Enterobacter sakazakii）、エシェリヒア コリ（Escherichia coli）、エシェリヒア フェルグソニー（Escherichia fergusonii）、パエニバチラス ポリミキサ（Paenibacillus polymyxa）、又はパントエア アナナティス（Pantoea ananatis）由来の遺伝子である請求項１に記載の形質転換体。
  3. 　4-ヒドロキシベンゾエート デカルボキシラーゼ活性を有する酵素をコードする遺伝子が下記の(a)又は(b)のDNAである請求項１に記載の形質転換体。
    (a)　 配列番号16、配列番号23、配列番号26、配列番号29、配列番号32、配列番号35、配列番号38、配列番号41、配列番号44、配列番号47、配列番号50、又は配列番号53の塩基配列からなるDNA
    (b)　(a)の何れかの塩基配列と相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ4-ヒドロキシベンゾエート デカルボキシラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするDNA
  4. 　宿主のコリネバクテリウム グルタミカムが、その染色体上に存在するフェノール2-モノオキシゲナーゼ（phenol 2-monooxygenase）活性を有する酵素をコードする遺伝子が破壊され、又は欠損したものである、請求項１～３の何れかに記載の形質転換体。
  5. 　宿主のコリネバクテリウム グルタミカムが、その染色体上に存在する4-ヒドロキシベンゾエート ヒドロキシラーゼ(4-hydroxybenzoate hydroxylase)活性を有する酵素をコードする遺伝子が破壊され、又は欠損したものである、請求項１～４の何れかに記載の形質転換体。
  6. 　宿主のコリネバクテリウム グルタミカムが、コリネバクテリウム グルミカムR（FERM　P－18976）、ATCC13032、又はATCC13869である請求項１～３の何れかに記載の形質転換体。
  7. 　宿主のコリネバクテリウム グルタミカムが、コリネバクテリウム グルミカムR（FERM　P－18976）、ATCC13032、又はATCC13869の染色体上に存在するフェノール2-モノオキシゲナーゼ活性を有する酵素をコードする遺伝子が破壊され、又は欠損したものである、請求項１～３の何れかに記載の形質転換体。
  8. 　宿主のコリネバクテリウム グルタミカムが、コリネバクテリウム グルミカムR（FERM　P－18976）、ATCC13032、又はATCC13869の染色体上に存在する4-ヒドロキシベンゾエート ヒドロキシラーゼ活性を有する酵素をコードする遺伝子が破壊され、又は欠損したものである、請求項１～３の何れかに記載の形質転換体。
  9. [規則91に基づく訂正 30.11.2011]　
    　コリネバクテリウム グルタミカム PHE21（受託番号：NITE BP-996）、PHE21-2、PHE21-3、PHE21-4、PHE21-5、PHE21-6、PHE21-7、PHE21-8、PHE21-9、PHE21-10、PHE21-11、PHE21-12、PHE22-1、PHE22-2、PHE22-3、PHE22-4、PHE22-5、PHE22-6、PHE22-7、PHE22-8、PHE22-9、PHE22-10、PHE22-11、PHE22-12、PHE23-1、PHE23-2、PHE23-3、PHE23-4、PHE23-5、PHE23-6、PHE23-7、PHE23-8、PHE23-9、PHE23-10、PHE23-11、又はPHE23-12の形質転換体。
  10. 　請求項１～９の何れかに記載の形質転換体を、還元条件下、4-ヒドロキシベンゾエート又はその塩を含有する反応液中で反応させる工程と、反応液中のフェノールを回収する工程とを含むフェノールの製造方法。
  11. 　反応工程において、形質転換体が実質的に増殖しない請求項１０に記載のフェノールの製造方法。
  12. 　還元条件下の反応液の酸化還元電位が－２００～－５００ミリボルトである請求項１０又は１１に記載のフェノールの製造方法。
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