WO2012029922A1 - 悪臭抑制剤の探索方法、悪臭抑制剤、及び悪臭抑制方法 - Google Patents

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carboxaldehyde
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綾 加藤
菜穂子 齋藤
悦司 脇坂
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Definitions

  • the present invention relates to a method for searching malodor control agents, malodor control agents, and malodor control methods.
  • malodorous molecules In our living environment, there are many malodorous molecules with different polarities and molecular weights.
  • Various deodorizing methods have been developed so far to deodorize various malodorous molecules.
  • deodorization methods are roughly classified into biological methods, chemical methods, physical methods, and sensory methods.
  • highly polar short chain fatty acids and amines can be deodorized by a chemical method, that is, neutralization reaction.
  • sulfur compounds such as thiols can be deodorized by a physical method, that is, adsorption treatment.
  • malodorous molecules such as medium- and long-chain fatty acids and skatole remain that cannot be handled by the conventional deodorization method.
  • the smell is bound to the olfactory receptor on the olfactory nerve cell located in the olfactory epithelium in the upper nasal cavity, and the response of the receptor is transmitted to the central nervous system. It is recognized by. In humans, it has been reported that there are 387 olfactory receptors, and the genes encoding them are about 3% of all human genes. In general, olfactory receptors and odor molecules are associated with each other in a plurality of combinations. That is, each olfactory receptor receives a plurality of odor molecules with similar structures with different affinities, while each odorant receptor is received by a plurality of olfactory receptors. Furthermore, it has been reported that an odor molecule that activates one olfactory receptor acts as an antagonist that inhibits activation of another olfactory receptor. The combination of these multiple olfactory receptor responses has led to the recognition of individual odors.
  • olfactory receptor antagonism Unlike the deodorization method by adding another odor such as a perfume or a fragrance, the odor modulation by this receptor antagonism can specifically lose the recognition of a bad odor. In addition, there is no discomfort due to the smell of the fragrance.
  • Nonanoic acid, hexanoic acid, isovaleric acid, etc. which are typical causative substances of body odor
  • the odor has been conventionally used as a deodorant or a deodorant, or a fragrance or fragrance (Patent Documents 1 and 2 and non-patent documents). It has been deodorized and deodorized by means such as Patent Document 1).
  • these measures are methods that reduce the generation of odor substances in the first place or make another odor more strongly recognized, and are different from deodorization by masking based on olfactory receptor antagonism.
  • a deodorant when a deodorant is used, it takes time to reduce the odorous substance and thus lacks immediate effect.
  • the odor of the fragrance itself may cause discomfort.
  • olfactory receptor antagonism For olfactory receptor antagonism, it is necessary to search for and identify substances that exhibit an effective olfactory receptor antagonistic action against individual malodorous molecules, but such a search is not easy.
  • odor evaluation has been performed by sensory tests by experts.
  • the sensory test has problems such as the need to train experts who can evaluate odors and low throughput.
  • Patent Documents 1 to 3 Aldehyde perfume ingredients have been blended in human and environmental fragrances and deodorants, cleaning compositions, etc.
  • Patent Documents 1 to 3 They are used as fragrance components and have not been used as antagonists that suppress the response of olfactory receptors to malodors.
  • the present invention provides a method for searching a malodor suppressor comprising the following steps: Adding a test substance and a malodor causing substance to any one of olfactory receptors selected from OR51E1, OR2W1, OR10A6, OR51I2 and OR51L1; Measuring a response of the olfactory receptor to the causative agent of the malodor; Identifying a test substance that suppresses the response of the olfactory receptor based on the measured response; Selecting the identified test substance as a malodor control agent; I will provide a.
  • the present invention is a compound for use in antagonism of any one of olfactory receptors selected from OR51E1, OR2W1, OR10A6, OR51I2 and OR51L1, which is selected from the group consisting of Compounds that are more than one: 3- (3-isopropyl-phenyl) -butyraldehyde, 4-isopropyl-1-methylcyclohexanecarbaldehyde, 3- (4-tert-butylphenyl) propanal, 3- (4 isopropylphenyl) -2-methylpropanal, 3,7-dimethyl-7-hydroxyoctanal, p-tert-butyl- ⁇ -methylhydrocinnamaldehyde, 7-methoxy-3,7-dimethyloctanal, 3- (4-isobutyl -Phenyl) -2-methyl-propionaldehyde, 4-isopro 1-methylcyclohexylmethanol, 4- (2-meth-methyl-
  • the present invention provides an olfactory receptor antagonist for use in malodor control, which antagonizes any one of olfactory receptors selected from OR51E1, OR2W1, OR10A6, OR51I2, and OR51L1; And one or more antagonists selected from the group consisting of: 3- (3-isopropyl-phenyl) -butyraldehyde, 4-isopropyl-1-methylcyclohexanecarbaldehyde, 3- (4-tert-butylphenyl) Propanal, 3- (4 isopropylphenyl) -2-methylpropanal, 3,7-dimethyl-7-hydroxyoctanal, p-tert-butyl- ⁇ -methylhydrocinnamaldehyde, 7-methoxy-3,7- Dimethyl octanal, 3- (4-isobutyl-phenyl)- -Methyl-propionaldehyde, 4-isopropyl-1-methylcyclo
  • the present invention is a method of suppressing malodor and a method of suppressing malodor and an olfactory receptor antagonist against malodor, wherein the antagonist is selected from OR51E1, OR2W1, OR10A6, OR51I2, and OR51L1.
  • the term “masking” relating to odor refers to all means for making the target odor unrecognized or weakening recognition. “Masking” may include chemical means, physical means, biological means, and sensory means. For example, as masking, any means for removing odor molecules that cause the target odor from the environment (for example, adsorption and chemical decomposition of odor molecules), to prevent the target odor from being released into the environment. (For example, containment), a method of adding another odor such as a fragrance or a fragrance to make it difficult to recognize the target odor, and the like.
  • “masking by olfactory receptor antagonism” is a form of the above-mentioned “masking” in a broad sense, and by applying both an odor molecule of a target odor and another odor molecule, This is a means to inhibit the receptor response to the target odor molecule by the odor molecule of the target and consequently change the odor recognized by the individual.
  • Masking by olfactory receptor antagonism is distinguished from means for canceling the target odor by another strong odor, such as a fragrance, even if the means uses other odor molecules.
  • An example of masking by olfactory receptor antagonism is the case of using a substance that inhibits the response of the olfactory receptor, such as an antagonist (antagonist). If a substance that inhibits the response is applied to the receptor of the odor molecule that causes a specific odor, the response of the receptor to the odor molecule is suppressed, so that the odor finally perceived by the individual is changed. Can do.
  • the present invention provides a method for searching a malodor suppressor using the response of an olfactory receptor as an index, and a malodor control method and a malodor suppressor based on olfactory receptor antagonism.
  • the present inventor succeeded in newly identifying an olfactory receptor that responds to malodor-causing substances such as nonanoic acid, hexanoic acid, and isovaleric acid odor. Furthermore, the present inventor has found that a substance that suppresses the response of the olfactory receptor can be used as a malodor suppressant that suppresses malodor by masking with olfactory receptor antagonism. Furthermore, the present inventor succeeded in identifying an olfactory receptor that responds to malodor-causing substances such as nonanoic acid, hexanoic acid, and isovaleric acid, and an antagonist to the olfactory receptor. The receptor antagonist can suppress malodor by masking with olfactory receptor antagonism. Based on these findings, the present inventor has completed the present invention.
  • the present invention there is no problem such as low immediate effect and discomfort based on the odor of the fragrance, which have occurred in the conventional odor eliminating method using the odor eliminating agent or fragrance, and the odor is specifically detected. It can be deodorized. Moreover, according to this invention, such a malodor control agent can be searched efficiently.
  • the present invention provides a method for searching for malodor control agents.
  • the method comprises the steps of adding a test substance and a malodor causing substance to any one of olfactory receptors selected from OR51E1, OR2W1, OR10A6, OR51I2, and OR51L1; measuring a response of the olfactory receptor; Identifying a test substance that suppresses the response of the olfactory receptor based on the determined response; and selecting the identified test substance as a malodor suppressant.
  • a test substance and a causative substance of the malodor are added to an olfactory receptor that responds to malodor.
  • the olfactory receptor used in the method of the present invention includes any one of olfactory receptors selected from OR51E1, OR2W1, OR10A6, OR51I2, and OR51L1.
  • OR51E1, OR2W1, OR10A6, OR51I2, and OR51L1 are olfactory receptors expressed in human olfactory cells, and are registered in GenBank as GIs: 205277377, 1692334888, 52218735, and 28217435, respectively.
  • OR10A6 is a protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, encoded by a gene having the gene sequence represented by SEQ ID NO: 1.
  • OR2W1 is a protein consisting of an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4 encoded by a gene having a gene sequence represented by SEQ ID NO: 3.
  • OR51E1 is a protein consisting of an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 6 encoded by a gene having a gene sequence represented by SEQ ID NO: 5.
  • OR51I2 is a protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 8, encoded by a gene having the gene sequence represented by SEQ ID NO: 7.
  • OR51L1 is a protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 10 encoded by a gene having the gene sequence represented by SEQ ID NO: 9.
  • the olfactory receptor used in the method of the present invention is 80% or more, preferably 85% or more, more preferably 90% or more, with respect to the amino acid sequence of OR51E1, OR2W1, OR10A6, OR51I2 or OR51L1. More preferred is a polypeptide having an amino acid sequence having a sequence identity of 95% or more, more preferably 98% or more, and having a response to malodor such as nonanoic acid, hexanoic acid or isovaleric acid. In the method of the present invention, any one of the olfactory receptors may be used alone, or a plurality may be used in combination.
  • the olfactory receptor exhibits a response to nonanoic acid, hexanoic acid, or isovaleric acid. Therefore, substances that suppress the response of these receptors are olfactory receptor antagonism.
  • the masking based on the above causes a change in the recognition of nonanoic acid odor, hexanoic acid odor or isovaleric acid odor in the center, and as a result, the malodor caused by nonanoic acid, hexanoic acid or isovaleric acid can be suppressed.
  • nonanoic acid, hexanoic acid or isovaleric acid is preferred as the causative substance of malodor used in the present invention, and the malodor suppressed by the malodor suppressant searched for by the method of the present invention is hexanoic acid odor.
  • Hexanoic acid odor, nonanoic acid odor and isovaleric odor are generally known as body odor (or fatty acid odor) caused by sweat or sebum, for example.
  • the olfactory receptor used is selected from OR51E1, OR2W1, OR10A6, OR51I2, and OR51L1, preferably from OR51E1, OR10A6, and OR51I2.
  • the causative agent of malodor selected and used is hexanoic acid.
  • the olfactory receptor used is selected from OR51E1, OR2W1, and OR10A6, preferably OR10A6, and the malodor causing substance used Is nonanoic acid.
  • the olfactory receptor used is selected from OR51I2 and OR51E1, preferably OR51I2, and the malodor causing substance used is Isovaleric acid.
  • the olfactory receptor used is selected from OR2W1, OR10A6 and OR51E1, preferably OR10A6.
  • OR5A6 OR10A6
  • OR51E1 OR10A6
  • a malodor inhibitor that suppresses both of the odors can be searched.
  • the olfactory receptor used is selected from OR51I2 and OR51E1, preferably OR51I2.
  • the olfactory receptor used is preferably OR51E1.
  • a malodor suppressor that suppresses the three kinds of odors can be searched.
  • the olfactory receptor used is preferably OR51E1.
  • test substance used in the method of the present invention is not particularly limited as long as it is a substance desired to be used as a malodor control agent.
  • the test substance may be a naturally occurring substance, a substance artificially synthesized by a chemical or biological method, etc., and may be a compound, a composition or a mixture. Good.
  • the olfactory receptor can be used in any form as long as the function of the receptor is not lost.
  • an olfactory receptor is a tissue or cell that naturally expresses an olfactory receptor, such as an olfactory receptor or olfactory cell isolated from a living body, or a culture thereof; a membrane of an olfactory cell carrying the olfactory receptor Used in the form of a recombinant cell or culture thereof genetically engineered to express the olfactory receptor; a membrane of the recombinant cell; and an artificial lipid bilayer membrane having the olfactory receptor Can be done. All of these forms fall within the scope of the olfactory receptor used in the present invention.
  • cells that naturally express olfactory receptors such as olfactory cells, recombinant cells genetically engineered to express olfactory receptors, or cultures thereof are used.
  • the recombinant cell can be produced by transforming a cell using a vector incorporating a gene encoding an olfactory receptor.
  • RTP1S is preferably introduced together with the receptor in order to promote cell membrane expression of the olfactory receptor.
  • An example of RTP1S that can be used for the production of the recombinant cell is human RTP1S. Human RTP1S is registered with GenBank as GI: 50234917.
  • Human RTP1S is a protein consisting of an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 12 encoded by a gene having a gene sequence represented by SEQ ID NO: 11. Further, instead of human RTP1S, the amino acid sequence of human RTP1S (SEQ ID NO: 12) is 80% or higher, preferably 85% or higher, more preferably 90% or higher, still more preferably 95% or higher, still more preferably 98%.
  • a polypeptide that has an amino acid sequence having a sequence identity of at least% and promotes the expression of the olfactory receptor membrane in the same manner as human RTP1S may be used.
  • mouse RTP1S (see Sci Signal., 2009, 2 (60): ra9 above) has 89% sequence identity with the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 12, and is in the membrane of the olfactory receptor It is a protein that has a function of promoting expression and can be used to produce the above-described recombinant cells.
  • sequence identity of a base sequence and an amino acid sequence is calculated by the Lippman-Pearson method (Lipman-Pearson method; Science, 227, 1435, (1985)). Specifically, using the homology analysis (Search homology) program of genetic information software Genetyx-Win (Ver. 5.1.1; software development), the unit size to compare (ktup) should be set to 2. Is calculated by the homology analysis (Search homology) program of genetic information software Genetyx-Win (Ver. 5.1.1; software development).
  • the response of the olfactory receptor to the odor causing substance is measured.
  • the measurement may be performed by any method known in the art as a method for measuring the response of the olfactory receptor, such as a calcium imaging method.
  • a method for measuring the response of the olfactory receptor such as a calcium imaging method.
  • the olfactory receptor is activated by an odor molecule, it is known to increase the amount of intracellular cAMP by activating adenylate cyclase in combination with intracellular G ⁇ s (Mombaerts P .Nat Neurosci. 5.263-278).
  • the response of the olfactory receptor can be measured by using the amount of intracellular cAMP after addition of the odor molecule as an index.
  • Examples of the method for measuring the amount of cAMP include an ELISA method and a reporter gene assay method.
  • the inhibitory effect of the test substance on the response of the receptor to the malodor causing substance is evaluated, and the test substance that suppresses the response is identified.
  • the inhibitory effect can be evaluated, for example, by comparing the response of the receptor to the malodor-causing substance measured when different concentrations of the test substance are added. More specific examples are between higher test substance added group and lower test substance added group; between test substance added group and non-added group; or before and after adding test substance. Compare the response of the receptor to the substance.
  • the test substance can be identified as a substance that suppresses the response of the olfactory receptor. For example, if the receptor response in the test substance addition group is suppressed to 80% or less, preferably 50% or less compared to the control group, the test substance can be selected as a malodor suppressant.
  • test substance identified in the above procedure causes a change in the perception of the malodor in the center by masking based on olfactory receptor antagonism by suppressing the response of the olfactory receptor to the malodor used in the above procedure. As a result, it is a substance that can prevent the individual from recognizing the malodor. Therefore, the test substance identified by the above procedure is selected as a malodor control agent for the malodor used in the above procedure.
  • the present invention provides a malodor control agent comprising an olfactory receptor antagonist for malodor as an active ingredient.
  • the malodor to be suppressed includes a hexanoic acid odor, a nonanoic acid odor, and an isovaleric acid odor.
  • These odors are generally known as body odors (or fatty acid odors) caused by sweat or sebum, for example. Any one or more, preferably all of these odors are suppressed by the malodor control agent of the present invention.
  • the olfactory receptor for the malodor includes any one of olfactory receptors selected from OR51E1, OR2W1, OR10A6, OR51I2, and OR51L1.
  • the antagonist which is an active ingredient of the malodor control agent of the present invention may be an antagonist for any one of these olfactory receptors or an antagonist for a plurality of them.
  • the olfactory receptor exhibits a response to nonanoic acid, hexanoic acid or isovaleric acid odor as shown in FIGS.
  • Examples of the antagonist include substances shown in the following Tables 1-1 to 1-2. As shown in Table 3, these substances are antagonists (antagonists) of the olfactory receptor that suppress the response of the olfactory receptor. These substances have been conventionally known as fragrances, but have not been known so far to have olfactory receptor antagonist activity.
  • the active ingredient of the malodor control agent of the present invention is preferably flurohydral, 4-isopropyl-1-methylcyclohexanecarbaldehyde, burgeonal, hydroxycitronellal, 4 -Isopropylcyclohexanecarbaldehyde, 4- (2-methoxyphenyl) -2-methyl-2-butanol, Florosa, Cyclemon A, Isocyclocitral, Tripral, Polenal II, Methoxycitronellal, more preferably Florhydral , Burgeonal, hydroxycitronellal, 4-isopropylcyclohexanecarbaldehyde, fluroza, isocyclocitral, tripral, porenal II, methoxycitronellal, and more preferably Furoruhidoraru, bourgeonal include methoxy citronellal and iso cyclo citral.
  • Cyclemone A (1,2,3,4,5,6,7,8-octahydro-8,8-dimethyl-2-naphthalenecarboxaldehyde
  • tripral (2,4-dimethyl-3-cyclohexane-1-) Carboxaldehyde
  • Polenal II (2-cyclohexylpropanal) is available from Kao Corporation.
  • Cyclamenaldehyde (3- (4-isopropylphenyl) -2-methylpropanal), hydroxycitronellal (3,7-dimethyl-7-hydroxyoctanal), methoxycitronellal (7-methoxy-3,7- Dimethyl octanal), citronellal (3,7-dimethyl-6-octenal), isocyclocitral (2,4,6-trimethyl-3-cyclohexene-1-carboxaldehyde, 3,5,6-trimethyl-3-cyclohexene 1-carboxaldehyde) and cuminaldehyde (4-isopropylbenzaldehyde) are described in “Synthetic perfume chemistry and product knowledge, augmented and revised edition by Motokazu Into, Chemical Industry Daily,” for example, International Flavors & Fragrances, and Givaudan.
  • 4-Isopropyl-1-methylcyclohexanecarbaldehyde can be synthesized, for example, by the method described in JP-A-2009-149811. Further, 4-isopropyl-1-methylcyclohexylmethanol can be synthesized, for example, by the method described in JP-A-2008-1667, and 4- (2-methoxyphenyl) -2-methyl-2-butanol is For example, it can be synthesized by the method described in JP-A-9-111281.
  • 4-isopropylcyclohexanecarbaldehyde can be synthesized using 155.47 g of 4-isopropylcyclohexylmethanol (Mayol: Firmenich) as a starting material by the method described in JP-A-2-188549.
  • the resulting product is identified, for example, as follows.
  • the active ingredient of the malodor control agent of the present invention may be any one or more of the above antagonists. That is, the malodor control agent of the present invention contains any of the above antagonists alone or in combination of two or more. Preferably, the malodor control agent of the present invention consists essentially of any one or a combination of two or more of the above antagonists.
  • the present invention provides a method for suppressing malodor comprising the step of causing both offensive odor and an olfactory receptor antagonist against odor to coexist.
  • a receptor antagonist for the malodor And the malodor and the antagonist are allowed to coexist, or the antagonist is applied to the individual in advance and the malodor and the antagonist are allowed to coexist later.
  • the malodor receptor and the antagonist are combined to suppress the response of the receptor, so that masking by olfactory receptor antagonism occurs and malodor is suppressed.
  • the individual is not particularly limited as long as it is a mammal, but is preferably a human.
  • the types of malodor to be suppressed, olfactory receptors, and antagonists used are the same as in the case of the above-mentioned malodor suppressor.
  • the antagonists listed in Tables 1-1 to 1-2 suppress the response of olfactory receptors selected from OR51E1, OR2W1, OR10A6, OR51I2, and OR51L1 to odor molecules. If the antagonist is used, it is possible to specifically suppress the odor derived from the odor molecule sensed by the olfactory receptor by masking with the olfactory receptor antagonism.
  • the malodor control compound or composition includes, in addition to the malodor control agent, other components having a deodorizing effect, or any component used for the deodorant or deodorant, for example, perfume, powder component, liquid Fats and oils, solid fats and oils, waxes, hydrocarbons, plant extracts, Chinese herbal ingredients, higher alcohols, lower alcohols, esters, long chain fatty acids, surfactants (nonionic surfactants, anionic surfactants, cationic surfactants) Agents, amphoteric surfactants, etc.), sterols, polyhydric alcohols, humectants, water-soluble polymer compounds, thickeners, film agents, bactericides, preservatives, UV absorbers, retention agents, cooling sensates, Warming agent, stimulant, sequestering agent, sugar, amino acids, organic amines, synthetic resin emulsion, pH adjuster, antioxidant, antioxidant assistant, oil, powder, capsules, chelating agent, inorganic Salt, organic salt pigment, prevention Bi agents, colorants,
  • any known deodorant having a chemical or physical deodorizing effect can be used.
  • Deodorant active ingredient extracted from each part such as leaf, petiole, fruit, stem, root, bark (eg, green tea extract); lactic acid, gluconic acid, succinic acid, glutanic acid, adipic acid, malic acid, tartaric acid, Organic acids such as maleic acid, fumaric acid, itaconic acid, citric acid, benzoic acid, salicylic acid, various amino acids and their salts, glyoxal, oxidizing agents, flavonoids, catechins, polyphenols; porous materials such as activated carbon and zeolite Inclusion agents such as cyclodextrins; photocatalysts; various masking agents and the like.
  • Example 1 Identification of Olfactory Receptor Responding to Offensive Odor 1 Cloning of Human Olfactory Receptor Gene Human olfactory receptor is based on sequence information registered in GenBank and human genomic DNA female (G1521: Promega) as a template. The PCR method was used for cloning. Each gene amplified by the PCR method is incorporated into a pENTR vector (Invitrogen) according to the manual, and NotI and AscI created downstream of the Flag-Rho tag sequence on the pME18S vector using the NotI and AscI sites present on the pENTR vector. Recomposed to the site.
  • pENTR vector Invitrogen
  • HEK293 cells each expressing 350 types of human olfactory receptors were prepared.
  • a reaction solution having the composition shown in Table 2 was prepared and allowed to stand in a clean bench for 15 minutes, and then added to each well of a 96-well plate (BD).
  • 100 ⁇ l of HEK2 ⁇ BR> X3 cells (3 ⁇ 10 5 cells / cm 2 ) was seeded in each well and cultured in an incubator maintained at 37 ° C. and 5% CO 2 for 24 hours.
  • Luciferase assay The olfactory receptor expressed in HEK293 cells increases the amount of intracellular cAMP by coupling with intracellular G ⁇ s and activating adenylate cyclase.
  • a luciferase reporter gene assay was used to monitor the increase in intracellular cAMP level as a luminescence value derived from the firefly luciferase gene (fluc2P-CRE-hygro).
  • a renilla luciferase gene fused with the CMV promoter downstream was simultaneously introduced, and used as an internal standard for correcting errors in gene transfer efficiency and cell number.
  • the medium was removed with Pipetman, and 75 ⁇ l of a solution containing an odorant (hexanoic acid 1 mM or nonanoic acid 300 ⁇ M) prepared in CD293 medium (Invitrogen) was added.
  • the cells were cultured for 4 hours in a CO 2 incubator to fully express the luciferase gene in the cells.
  • the luciferase activity was measured using a Dual-Glo TM luciferase assay system (promega) according to the operation manual of the product.
  • a value obtained by dividing the luminescence value derived from firefly luciferase induced by odor substance stimulation by the luminescence value in cells not subjected to odor substance stimulation was calculated as a fold increase, and used as an index of response intensity.
  • Example 2 Response of Olfactory Receptor to Hexanoic Acid
  • olfactory receptors OR2W1, OR10A6, OR51E1, OR51I2, OR51L1 to hexanoic acid (0, 10, 30, 100, 300, and 1000 ⁇ M)
  • the response was examined.
  • all olfactory receptors showed a concentration-dependent response to hexanoic acid (FIG. 2).
  • Example 3 Response of olfactory receptor to isovaleric acid
  • isovaleric acid (0, 3, 10, 30, 100, 300, olfactory receptors OR2W1, OR10A6, OR51E1, OR51I2, OR51L1) And 1000 ⁇ M).
  • the olfactory receptors OR51E1 and OR51I2 responded to isovaleric acid in a concentration-dependent manner (FIG. 3).
  • Example 4 Identification of Malodor Suppressor
  • the inhibitory activity on the olfactory receptor response was examined for 52 types of test substances.
  • OR2W1, OR10A6, OR51E1, OR51I2, and OR51L1 were expressed in HEK293 cells, and luciferase assay was performed.
  • hexanoic acid was used as an odor substance, and a test substance was added together with hexanoic acid.
  • the response of the olfactory receptor to hexanoic acid was measured, and the decrease in the receptor response due to the addition of the test substance was evaluated.
  • the inhibition rate of the receptor response by the test substance was calculated as follows.
  • the luminescence value (X) derived from firefly luciferase induced by odor stimulation with hexanoic acid alone was subtracted by the luminescence value (Y) in the cells in which the same receptor was introduced and no odor stimulation was performed.
  • the luminescence value (Z) by stimulation with a mixture of hexanoic acid and the test substance was subtracted by the luminescence value (Y) in cells not subjected to odor stimulation.
  • the receptor response inhibitory activity by the test substance was calculated based on the increase in luminescence value (XY) by stimulation with hexanoic acid alone.
  • Inhibition rate (%) ⁇ 1- (ZY) / (XY) ⁇ ⁇ 100
  • Inhibitory activity was shown (Table 3).
  • several of the test substances that showed inhibitory activity were examined for concentration dependent response inhibition of the hexanoic acid response.
  • the test substance concentrations used were 3, 10, 30, 100, and 300 ⁇ M.
  • Example 5 Evaluation of Malodor Control ability of Test Substance
  • the malodor suppression ability of the test substance having the receptor response inhibitory activity identified in Example 4 was confirmed by a sensory test. Put a cotton ball in a glass bottle (Saiyo Glass No.11, 110ml in volume), and test as a malodor, hexanoic acid diluted 100 times with propylene glycol, 10 times diluted nonanoic acid or 1000 times diluted isovaleric acid, and test 20 ⁇ l of the material was dropped onto a cotton ball. The glass bottle was allowed to stand overnight at room temperature, and the odor molecules were sufficiently volatilized in the glass bottle.
  • the sensory evaluation test was conducted by 3 panelists (5 persons for isovaleric acid), the odor intensity when dropping malodor alone was set to 5, and the odor intensity when mixing test substances was 0 to 10 It was evaluated in 20 steps as (0.5 increments).
  • the test substances were flurohydral (Givaudan), burgeonal (Givaudan), hydroxycitronellal (Givaudan, International Flavors & Fragrances, etc.), 4-isopropylcyclohexanecarbaldehyde, diluted 100 times with propylene glycol for hexanoic acid.
  • perfume floralol diluted 100 times with propylene glycol
  • propylene glycol which is a substance having no effect of inhibiting response to the olfactory receptor
  • Example 4 In order to investigate the specificity of malodor control by the test substance having the receptor response inhibitory activity identified in Example 4, it is a malodor different in structure from fatty acid, and the olfactory receptor identified in Example 1 is an odor substance that does not respond A similar sensory test was performed using cresol. In the experiment, cresol diluted 100 times with propylene glycol was used as a bad odor, and fluorhydral diluted 100 times with propylene glycol was used as a test substance. As a result of the test, the smell of cresol was not suppressed by fluorhydral (FIG. 8). Therefore, the suppression effect was shown to be odor specific.

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Abstract

　嗅覚受容体の応答を指標として悪臭抑制剤を探索する方法、ならびに嗅覚受容体アンタゴニズムに基づく悪臭抑制方法及び悪臭抑制剤の提供。以下の工程を含む悪臭抑制剤の探索方法：ＯＲ５１Ｅ１、ＯＲ２Ｗ１、ＯＲ１０Ａ６、ＯＲ５１Ｉ２及びＯＲ５１Ｌ１から選択される嗅覚受容体のいずれか１つに試験物質及び悪臭の原因物質を添加する工程；当該悪臭の原因物質に対する当該嗅覚受容体の応答を測定する工程；測定された応答に基づいて当該嗅覚受容体の応答を抑制する試験物質を同定する工程；当該同定された試験物質を、悪臭抑制剤として選択する工程。ＯＲ５１Ｅ１、ＯＲ２Ｗ１、ＯＲ１０Ａ６、ＯＲ５１Ｉ２及びＯＲ５１Ｌ１から選択される嗅覚受容体のいずれか１つに対するアンタゴニスト及び当該アンタゴニストによる悪臭抑制方法。

Description

悪臭抑制剤の探索方法、悪臭抑制剤、及び悪臭抑制方法
　本発明は、悪臭抑制剤を探索する方法、悪臭抑制剤、及び悪臭抑制方法に関する。
　我々の生活環境には、極性や分子量が異なる多数の悪臭分子が存在する。多様な悪臭分子を消臭するために、これまで様々な消臭方法が開発されてきた。一般的に消臭方法は、生物的方法、化学的方法、物理的方法、感覚的方法に大別される。悪臭分子の中で、極性の高い短鎖脂肪酸やアミン類については、化学的方法、すなわち中和反応による消臭が可能である。またチオールなどの硫黄化合物に関しては、物理的方法、すなわち吸着処理による消臭が可能である。しかし、中鎖・長鎖脂肪酸やスカトールなど、従来の消臭法では対応できない悪臭分子が数多く残されている。
　ヒト等の哺乳動物においては、匂いは、鼻腔上部の嗅上皮に存在する嗅神経細胞上の嗅覚受容体に匂い分子が結合し、それに対する受容体の応答が中枢神経系へと伝達されることにより認識されている。ヒトの場合、嗅覚受容体は３８７個存在することが報告されており、これらをコードする遺伝子はヒトの全遺伝子の約３％にあたる。
　一般的に、嗅覚受容体と匂い分子は複数対複数の組み合わせで対応付けられている。すなわち、個々の嗅覚受容体は構造の類似した複数の匂い分子を異なる親和性で受容し、一方で、個々の匂い分子は複数の嗅覚受容体によって受容される。さらに、ある嗅覚受容体を活性化する匂い分子が、別の嗅覚受容体の活性化を阻害するアンタゴニストとして働くことも報告されている。これら複数の嗅覚受容体の応答の組み合わせが、個々の匂いの認識をもたらしている。
　従って、同じ匂い分子が存在する場合でも、同時に他の匂い分子が存在すると、当該他の匂い分子によって受容体応答が阻害され、最終的に認識される匂いが全く異なることがある。このような仕組みを嗅覚受容体のアンタゴニズムと呼ぶ。この受容体アンタゴニズムによる匂いの変調は、香水や芳香剤等の別の匂いを付加することによる消臭方法と異なり、悪臭の認識を特異的に失くしてしまうことができる。また芳香剤の匂いによる不快感が生じることもない。
　体臭の代表的な原因物質であるノナン酸やヘキサン酸、イソ吉草酸等については、従来、その匂いは、防臭又は消臭剤の使用や香料や芳香剤の使用（特許文献１～２及び非特許文献１）などの手段により防臭・消臭されていた。しかし、これらの手段は、そもそもの匂い物質の発生を減少させるか又は別の匂いをより強く認識させる方法であって、嗅覚受容体アンタゴニズムに基づくマスキングによる消臭とは異なる。また従来の方法では、消臭剤を使用する場合は、匂い物質減少までに時間を要するため即効性に欠ける。芳香剤を使用する場合、芳香剤自体の匂いに対する不快感が生じることがある。あるいは従来の方法では、目的とする悪臭以外の匂いも消されてしまう場合がある。嗅覚受容体アンタゴニズムに基づくマスキングによる消臭であれば、上記の点を解消できる可能性がある。
　嗅覚受容体アンタゴニズムのためには、個々の悪臭分子に対して有効な嗅覚受容体アンタゴニスト作用を示す物質を探索、同定しなければならないが、そのような探索は容易ではない。従来、匂いの評価は、専門家による官能試験によって行われてきた。しかし、官能試験には、匂いを評価できる専門家の育成が必要なことや、スループット性が低いなどの問題がある。
　嗅覚受容体アンタゴニズムによる匂い制御のためには、匂いと嗅覚受容体とを関連付けることは重要であろう。ノナン酸やヘキサン酸を受容する嗅覚受容体に関しては、これまでに、ＯＲ２Ｗ１がヘキサン酸およびノナン酸に対して応答すること、ＯＲ５１Ｅ１がノナン酸に対して応答すること、及びＯＲ５１Ｌ１がヘキサン酸に応答することが報告されている（非特許文献２）。またＯＲ５１Ｅ１がイソ吉草酸に対して応答するという報告もある（非特許文献３）。
　アルデヒド系香料成分は、以前より、人体又は環境用の芳香・消臭剤やクリーニング組成物等に配合されていた（特許文献１～３）。しかし、これらは芳香成分として使用されており、悪臭に対する嗅覚受容体の応答を抑制するアンタゴニストとして使用されてはいなかった。
特開２００３－１９０２６４号公報 特開２００３－１１３３９２号公報 特表２００３－５１８１６２号公報
嗅覚とにおい物質　川崎通昭、堀内哲嗣郎（におい・香り環境協会） Ｓａｉｔｏ　Ｈ．，Ｃｈｉ　Ｑ．，Ｚｈｕａｎｇ　Ｈ．，Ｍａｔｓｕｎａｍｉ　Ｈ．，Ｍａｉｎｌａｎｄ　Ｊ．Ｄ．Ｓｃｉ　Ｓｉｇｎａｌ．，２００９，２（６０）：ｒａ９ Ｐｈｉｌｉｐｐｅａｕ　ｅｔ　ａｌ．，ＡＣＨＥＭＳ　２００９　Ａｎｎｕａｌ　Ｍｅｅｔｉｎｇ　Ａｂｓｔｒａｃｔ，　３１ｓｔ　Ａｎｎｕａｌ　Ｍｅｅｔｉｎｇ　ｏｆ　Ｔｈｅ　Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ　ｆｏｒ　Ｃｈｅｍｏｒｅｃｅｐｔｉｏｎ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，＃Ｐ１２１
　すなわち、一態様において、本発明は、以下の工程を含む悪臭抑制剤の探索方法：
　ＯＲ５１Ｅ１、ＯＲ２Ｗ１、ＯＲ１０Ａ６、ＯＲ５１Ｉ２及びＯＲ５１Ｌ１から選択される嗅覚受容体のいずれか１つに試験物質及び悪臭の原因物質を添加する工程；
　当該悪臭の原因物質に対する当該嗅覚受容体の応答を測定する工程；
　測定された応答に基づいて当該嗅覚受容体の応答を抑制する試験物質を同定する工程；
　当該同定された試験物質を、悪臭抑制剤として選択する工程、
を提供する。
　別の態様において、本発明は、ＯＲ５１Ｅ１、ＯＲ２Ｗ１、ＯＲ１０Ａ６、ＯＲ５１Ｉ２及びＯＲ５１Ｌ１から選択される嗅覚受容体のいずれか１つの拮抗に使用するための化合物であって、以下からなる群から選択される１つ以上である化合物：３－（３－イソプロピル－フェニル）－ブチルアルデヒド、４－イソプロピル－１－メチルシクロヘキサンカルバルデヒド、３－（４－ｔｅｒｔ－ブチルフェニル）プロパナール、３－（４イソプロピルフェニル）－２－メチルプロパナール、３，７－ジメチル－７－ヒドロキシオクタナール、ｐ－ｔｅｒｔ－ブチル－α－メチルヒドロシナムアルデヒド、７－メトキシ－３，７－ジメチルオクタナール、３－（４－イソブチル－フェニル）－２－メチル－プロピオンアルデヒド、４－イソプロピル－１－メチルシクロヘキシルメタノール、４－（２－メトキシフェニル）－２－メチル－２－ブタノール、テトラヒドロ－４－メチル－２－（２－メチルプロピル）－２Ｈ－ピラン－４－オール、２，２－ジメチル－３－（３－メチルフェニル）プロパノール、４－イソプロピルシクロヘキサンカルバルデヒド、３，７－ジメチル－６－オクテナール、１，２，３，４，５，６，７，８－オクタヒドロ－８，８－ジメチル－２－ナフタレンカルボキシアルデヒド、２，４，６－トリメチル－３－シクロヘキセン－１－カルボキシアルデヒド、３，５，６－トリメチル－３－シクロヘキセン－１－カルボキシアルデヒド、２，４－ジメチル－３－シクロヘキサン－１－カルボキシアルデヒド、４－イソプロピルベンズアルデヒド、及び２－シクロヘキシルプロパナール、
を提供する。
　また別の態様において、本発明は、悪臭抑制に使用するための嗅覚受容体アンタゴニストであって、ＯＲ５１Ｅ１、ＯＲ２Ｗ１、ＯＲ１０Ａ６、ＯＲ５１Ｉ２及びＯＲ５１Ｌ１から選択される嗅覚受容体のいずれか１つに拮抗し、且つ以下からなる群から選択される１つ以上であるアンタゴニスト：３－（３－イソプロピル－フェニル）－ブチルアルデヒド、４－イソプロピル－１－メチルシクロヘキサンカルバルデヒド、３－（４－ｔｅｒｔ－ブチルフェニル）プロパナール、３－（４イソプロピルフェニル）－２－メチルプロパナール、３，７－ジメチル－７－ヒドロキシオクタナール、ｐ－ｔｅｒｔ－ブチル－α－メチルヒドロシナムアルデヒド、７－メトキシ－３，７－ジメチルオクタナール、３－（４－イソブチル－フェニル）－２－メチル－プロピオンアルデヒド、４－イソプロピル－１－メチルシクロヘキシルメタノール、４－（２－メトキシフェニル）－２－メチル－２－ブタノール、テトラヒドロ－４－メチル－２－（２－メチルプロピル）－２Ｈ－ピラン－４－オール、２，２－ジメチル－３－（３－メチルフェニル）プロパノール、４－イソプロピルシクロヘキサンカルバルデヒド、３，７－ジメチル－６－オクテナール、１，２，３，４，５，６，７，８－オクタヒドロ－８，８－ジメチル－２－ナフタレンカルボキシアルデヒド、２，４，６－トリメチル－３－シクロヘキセン－１－カルボキシアルデヒド、３，５，６－トリメチル－３－シクロヘキセン－１－カルボキシアルデヒド、２，４－ジメチル－３－シクロヘキサン－１－カルボキシアルデヒド、４－イソプロピルベンズアルデヒド、及び２－シクロヘキシルプロパナール、
を提供する。
　また別の態様において、本発明は、悪臭と、悪臭に対する嗅覚受容体のアンタゴニストとを共存させる工程を含む悪臭抑制方法であって、該アンタゴニストがＯＲ５１Ｅ１、ＯＲ２Ｗ１、ＯＲ１０Ａ６、ＯＲ５１Ｉ２及びＯＲ５１Ｌ１から選択される嗅覚受容体のいずれか１つに対するアンタゴニストであって、且つ３－（３－イソプロピル－フェニル）－ブチルアルデヒド、４－イソプロピル－１－メチルシクロヘキサンカルバルデヒド、３－（４－ｔｅｒｔ－ブチルフェニル）プロパナール、３－（４イソプロピルフェニル）－２－メチルプロパナール、３，７－ジメチル－７－ヒドロキシオクタナール、ｐ－ｔｅｒｔ－ブチル－α－メチルヒドロシナムアルデヒド、７－メトキシ－３，７－ジメチルオクタナール、３－（４－イソブチル－フェニル）－２－メチル－プロピオンアルデヒド、４－イソプロピル－１－メチルシクロヘキシルメタノール、４－（２－メトキシフェニル）－２－メチル－２－ブタノール、テトラヒドロ－４－メチル－２－（２－メチルプロピル）－２Ｈ－ピラン－４－オール、２，２－ジメチル－３－（３－メチルフェニル）プロパノール、４－イソプロピルシクロヘキサンカルバルデヒド、３，７－ジメチル－６－オクテナール、１，２，３，４，５，６，７，８－オクタヒドロ－８，８－ジメチル－２－ナフタレンカルボキシアルデヒド、２，４，６－トリメチル－３－シクロヘキセン－１－カルボキシアルデヒド、３，５，６－トリメチル－３－シクロヘキセン－１－カルボキシアルデヒド、２，４－ジメチル－３－シクロヘキサン－１－カルボキシアルデヒド、４－イソプロピルベンズアルデヒド、及び２－シクロヘキシルプロパナールからなる群より選択される１つ以上である、方法を提供する。
嗅覚受容体のヘキサン酸及びノナン酸に対する応答。横軸は個々の嗅覚受容体、縦軸は応答強度を示す。 種々の濃度のヘキサン酸に対する嗅覚受容体の応答。エラーバー＝±ＳＥ。 種々の濃度のイソ吉草酸に対する嗅覚受容体の応答。エラーバー＝±ＳＥ。 受容体のヘキサン酸応答における試験物質の濃度依存的阻害を示す。エラーバー＝±ＳＥ。 ブルゲオナール及びフロルヒドラールによるヘキサン酸臭抑制能の官能評価。エラーバー＝±ＳＥ。 試験物質によるノナン酸臭抑制能の官能評価。エラーバー＝±ＳＥ。 試験物質によるイソ吉草酸臭抑制能の官能評価。エラーバー＝±ＳＥ。 試験物質によるクレゾール臭抑制能の官能評価。エラーバー＝±ＳＥ。
　本明細書において、匂いに関する用語「マスキング」とは、目的の匂いを認識させなくするか又は認識を弱めるための手段全般を指す。「マスキング」は、化学的手段、物理的手段、生物的手段、及び感覚的手段を含み得る。例えば、マスキングとしては、目的の匂いの原因となる匂い分子を環境から除去するための任意の手段（例えば、匂い分子の吸着及び化学的分解）、目的の匂いが環境に放出されないようにするための手段（例えば、封じ込め）、香料や芳香剤などの別の匂いを添加して目的の匂いを認識しにくくする方法、等が挙げられる。
　本明細書における「嗅覚受容体アンタゴニズムによるマスキング」とは、上述の広義の「マスキング」の一形態であって、目的の匂いの匂い分子と他の匂い分子をともに適用することにより、当該他の匂い分子によって目的の匂い分子に対する受容体応答を阻害し結果的に個体に認識される匂いを変化させる手段である。嗅覚受容体アンタゴニズムによるマスキングは、同様に他の匂い分子を用いる手段であっても、芳香剤等の、目的の匂いを別の強い匂いによって打ち消す手段とは区別される。嗅覚受容体アンタゴニズムによるマスキングの一例は、アンタゴニスト（拮抗剤）等の嗅覚受容体の応答を阻害する物質を使用するケースである。特定の匂いをもたらす匂い分子の受容体にその応答を阻害する物質を適用すれば、当該受容体の当該匂い分子に対する応答が抑制されるため、最終的に個体に知覚される匂いを変化させることができる。
　本発明は、嗅覚受容体の応答を指標として悪臭抑制剤を探索する方法、ならびに嗅覚受容体アンタゴニズムに基づく悪臭抑制方法及び悪臭抑制剤を提供する。
　本発明者は、ノナン酸、ヘキサン酸、イソ吉草酸臭等の悪臭原因物質に応答する嗅覚受容体を新たに同定することに成功した。さらに本発明者は、当該嗅覚受容体の応答を抑制する物質を、嗅覚受容体アンタゴニズムによるマスキングにより悪臭を抑制する悪臭抑制剤として用いることができることを見出した。さらに本発明者は、ノナン酸、ヘキサン酸、イソ吉草酸等の悪臭原因物質に応答する嗅覚受容体、及び当該嗅覚受容体に対するアンタゴニストを同定することに成功した。当該受容体アンタゴニストは、嗅覚受容体アンタゴニズムによるマスキングにより悪臭を抑制することができる。これらの知見に基づき、本発明者は本発明を完成した。
　本発明によれば、従来の消臭剤や芳香剤を用いる消臭方法において生じていた即効性の低さや芳香剤の匂いに基づく不快感等の問題を生じることがなく、悪臭を特異的に消臭することができる。また本発明によれば、そのような悪臭抑制剤を、効率よく探索することができる。
　一態様において、本発明は、悪臭抑制剤の探索方法を提供する。当該方法は、ＯＲ５１Ｅ１、ＯＲ２Ｗ１、ＯＲ１０Ａ６、ＯＲ５１Ｉ２及びＯＲ５１Ｌ１から選択される嗅覚受容体のいずれか１つに試験物質及び悪臭の原因物質を添加する工程；当該嗅覚受容体の応答を測定する工程；測定された応答に基づいて当該嗅覚受容体の応答を抑制する試験物質を同定する工程；及び、当該同定された試験物質を、悪臭抑制剤として選択する工程を含む。
　本発明の方法においては、悪臭に応答する嗅覚受容体に、試験物質及び当該悪臭の原因物質が添加される。本発明の方法で使用される嗅覚受容体としては、ＯＲ５１Ｅ１、ＯＲ２Ｗ１、ＯＲ１０Ａ６、ＯＲ５１Ｉ２及びＯＲ５１Ｌ１から選択される嗅覚受容体のいずれか１つが挙げられる。
　ＯＲ５１Ｅ１、ＯＲ２Ｗ１、ＯＲ１０Ａ６、ＯＲ５１Ｉ２及びＯＲ５１Ｌ１は、ヒト嗅細胞で発現している嗅覚受容体であり、それぞれ、ＧｅｎＢａｎｋにＧＩ：２０５２７７３７７、１６９２３４７８８、５２２１８８３５、２８４１７２４３５、及び５２３１７１４３として登録されている。
　ＯＲ１０Ａ６は、配列番号１で示される遺伝子配列を有する遺伝子にコードされる、配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質である。
　ＯＲ２Ｗ１は、配列番号３で示される遺伝子配列を有する遺伝子にコードされる、配列番号４で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質である。
　ＯＲ５１Ｅ１は、配列番号５で示される遺伝子配列を有する遺伝子にコードされる、配列番号６で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質である。
　ＯＲ５１Ｉ２は、配列番号７で示される遺伝子配列を有する遺伝子にコードされる、配列番号８で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質である。
　ＯＲ５１Ｌ１は、配列番号９で示される遺伝子配列を有する遺伝子にコードされる、配列番号１０で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質である。
　また、本発明の方法に使用される嗅覚受容体としては、上記ＯＲ５１Ｅ１、ＯＲ２Ｗ１、ＯＲ１０Ａ６、ＯＲ５１Ｉ２又はＯＲ５１Ｌ１のアミノ酸配列に対して、８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、更に好ましくは９５％以上、なお好ましくは９８％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、ノナン酸、ヘキサン酸又はイソ吉草酸等の悪臭に対する応答性を有するポリペプチドが挙げられる。本発明の方法では、当該嗅覚受容体のうちのいずれかを単独で使用してもよく、又は複数を組み合わせて使用してもよい。
　上記嗅覚受容体は、図１、２及び３に示すとおり、ノナン酸、ヘキサン酸又はイソ吉草酸に対して応答を示すので、これらの受容体の応答を抑制する物質は、嗅覚受容体アンタゴニズムに基づくマスキングにより中枢におけるノナン酸臭、ヘキサン酸臭又はイソ吉草酸臭の認識に変化を生じさせ、結果としてノナン酸、ヘキサン酸又はイソ吉草酸による悪臭を抑制することができる。従って、本発明で使用される悪臭の原因物質としては、ノナン酸、ヘキサン酸又はイソ吉草酸が好ましく、また本発明の方法で探索された悪臭抑制剤によって抑制される悪臭としては、ヘキサン酸臭、ノナン酸臭及びイソ吉草酸臭が挙げられる。ヘキサン酸臭、ノナン酸臭及びイソ吉草酸臭は、例えば汗や皮脂を原因とする体臭の匂い（もしくは脂肪酸臭）等として一般的に知られている。
　従って、本発明の方法においてヘキサン酸臭の抑制剤を探索する場合には、使用される嗅覚受容体は、ＯＲ５１Ｅ１、ＯＲ２Ｗ１、ＯＲ１０Ａ６、ＯＲ５１Ｉ２及びＯＲ５１Ｌ１から選択され、好ましくは、ＯＲ５１Ｅ１、ＯＲ１０Ａ６及びＯＲ５１Ｉ２から選択され、使用される悪臭の原因物質はヘキサン酸である。また、本発明の方法においてノナン酸臭の抑制剤を探索する場合には、使用される嗅覚受容体は、ＯＲ５１Ｅ１、ＯＲ２Ｗ１及びＯＲ１０Ａ６から選択され、好ましくはＯＲ１０Ａ６であり、使用される悪臭の原因物質はノナン酸である。また、本発明の方法においてイソ吉草酸臭の抑制剤を探索する場合には、使用される嗅覚受容体は、ＯＲ５１Ｉ２及びＯＲ５１Ｅ１から選択され、好ましくはＯＲ５１Ｉ２であり、使用される悪臭の原因物質はイソ吉草酸である。
　あるいは、ヘキサン酸臭及びノナン酸臭の両方に応答する嗅覚受容体を用いることによって、当該臭いの両方を抑制する悪臭抑制剤を探索することができる。この場合、使用される嗅覚受容体はＯＲ２Ｗ１、ＯＲ１０Ａ６、及びＯＲ５１Ｅ１から選択され、好ましくは、ＯＲ１０Ａ６である。またあるいは、ヘキサン酸臭及びイソ吉草酸臭の両方に応答する嗅覚受容体を用いることによって、当該臭いの両方を抑制する悪臭抑制剤を探索することができる。この場合、使用される嗅覚受容体はＯＲ５１Ｉ２及びＯＲ５１Ｅ１から選択され、好ましくは、ＯＲ５１Ｉ２である。またあるいは、ノナン酸臭及びイソ吉草酸臭の両方に応答する嗅覚受容体を用いることによって、当該臭いの両方を抑制する悪臭抑制剤を探索することができる。この場合、使用される嗅覚受容体は、好ましくはＯＲ５１Ｅ１である。またあるいは、ヘキサン酸臭、ノナン酸臭及びイソ吉草酸臭のいずれにも応答する嗅覚受容体を用いることによって、当該３種類の臭いを抑制する悪臭抑制剤を探索することができる。この場合、使用される嗅覚受容体は、好ましくはＯＲ５１Ｅ１である。
　本発明の方法に使用される試験物質は、悪臭抑制剤として使用することを所望する物質であれば、特に制限されない。試験物質は、天然に存在する物質であっても、化学的又は生物学的方法等で人工的に合成した物質であってもよく、また化合物であっても、組成物若しくは混合物であってもよい。
　本発明の方法において、嗅覚受容体は、受容体の機能を失わない限り、任意の形態で使用され得る。例えば、嗅覚受容体は、生体から単離された嗅覚受容器若しくは嗅細胞等の天然に嗅覚受容体を発現する組織や細胞、又はそれらの培養物；当該嗅覚受容体を担持した嗅細胞の膜；当該嗅覚受容体を発現するように遺伝的に操作された組換え細胞又はその培養物；当該組換え細胞の膜；及び、当該嗅覚受容体を有する人工脂質二重膜、等の形態で使用され得る。これらの形態は全て、本発明で使用される嗅覚受容体の範囲に含まれる。
　好ましい態様においては、嗅細胞等の天然に嗅覚受容体を発現する細胞、又は嗅覚受容体を発現するように遺伝的に操作された組換え細胞、あるいはそれらの培養物が使用される。当該組換え細胞は、嗅覚受容体をコードする遺伝子を組み込んだベクターを用いて細胞を形質転換することで作製することができる。このとき、好適には、嗅覚受容体の細胞膜発現を促進するために、ＲＴＰ１Ｓを受容体と共に遺伝子導入する。
　上記組換え細胞の作製に使用できるＲＴＰ１Ｓとしては、例えば、ヒトＲＴＰ１Ｓが挙げられる。ヒトＲＴＰ１Ｓは、ＧｅｎＢａｎｋにＧＩ：５０２３４９１７として登録されている。ヒトＲＴＰ１Ｓは、配列番号１１で示される遺伝子配列を有する遺伝子にコードされる、配列番号１２で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質である。また、ヒトＲＴＰ１Ｓの代わりに、ヒトＲＴＰ１Ｓのアミノ酸配列（配列番号１２）に対して、８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、更に好ましくは９５％以上、なお好ましくは９８％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、ヒトＲＴＰ１Ｓと同様に、嗅覚受容体の膜における発現を促進するポリペプチドを使用してもよい。例えば、マウスＲＴＰ１Ｓ（上述のＳｃｉ　Ｓｉｇｎａｌ．，２００９，２（６０）：ｒａ９を参照）は、配列番号１２で示されるアミノ酸配列と８９％の配列同一性を有し、且つ嗅覚受容体の膜における発現を促進する機能を有し、上記組換え細胞の作製に使用することができるタンパク質である。
　本明細書において、塩基配列及びアミノ酸配列の配列同一性は、リップマン－パーソン法（Ｌｉｐｍａｎ－Ｐｅａｒｓｏｎ法；Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２７，１４３５，（１９８５））によって計算される。具体的には、遺伝情報処理ソフトウェアＧｅｎｅｔｙｘ－Ｗｉｎ（Ｖｅｒ．５．１．１；ソフトウェア開発）のホモロジー解析（Ｓｅａｒｃｈ　ｈｏｍｏｌｏｇｙ）プログラムを用いて、Ｕｎｉｔ　ｓｉｚｅ　ｔｏ　ｃｏｍｐａｒｅ（ｋｔｕｐ）を２として解析を行なうことにより算出される。
　本発明の方法によれば、試験物質及び悪臭の原因物質の添加に続いて、当該悪臭の原因物質に対する嗅覚受容体の応答が測定される。測定は嗅覚受容体の応答を測定する方法として当該分野で知られている任意の方法、例えば、カルシウムイメージング法等によって行えばよい。例えば、嗅覚受容体は、匂い分子によって活性化されると、細胞内のＧαｓと共役してアデニル酸シクラーゼを活性化することで、細胞内ｃＡＭＰ量を増加させることが知られている（Ｍｏｍｂａｅｒｔｓ　Ｐ．Ｎａｔ　Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．５．２６３－２７８）。従って、匂い分子添加後の細胞内ｃＡＭＰ量を指標にすることで、嗅覚受容体の応答を測定することができる。ｃＡＭＰ量を測定する方法としては、ＥＬＩＳＡ法やレポータージーンアッセイ法等が挙げられる。
　次いで、測定された嗅覚受容体の応答に基づいて、当該受容体の悪臭原因物質への応答に対する試験物質の抑制効果を評価し、当該応答を抑制する試験物質を同定する。抑制効果の評価は、例えば、異なる濃度の試験物質を添加した場合に測定された悪臭原因物質に対する受容体の応答を比較することによって行うことができる。より具体的な例としては、より高濃度の試験物質添加群とより低濃度の試験物質添加群との間；試験物質添加群と非添加群との間；又は試験物質添加前後で、悪臭原因物質に対する受容体の応答を比較する。試験物質添加により、又はより高濃度の試験物質の添加により嗅覚受容体の応答が抑制される場合、当該試験物質を、当該嗅覚受容体の応答を抑制する物質として同定することができる。例えば、試験物質添加群における受容体応答が対照群と比較して８０％以下、好ましくは５０％以下に抑制されていれば、当該試験物質を、悪臭抑制剤として選択することができる。
　上記の手順で同定された試験物質は、上記手順で使用された悪臭に対する嗅覚受容体の応答を抑制することによって、嗅覚受容体アンタゴニズムに基づくマスキングにより中枢における当該悪臭の認識に変化を生じさせ、結果として当該悪臭を個体が認識できないようにすることができる物質である。従って、上記手順で同定された試験物質は、上記手順で使用された悪臭に対する悪臭抑制剤として選択される。
　別の一態様として、本発明は、悪臭に対する嗅覚受容体のアンタゴニストを有効成分とする、悪臭抑制剤を提供する。抑制される悪臭としてはヘキサン酸臭、ノナン酸臭及びイソ吉草酸臭が挙げられる。これらの匂いは、例えば汗や皮脂を原因とする体臭の匂い（もしくは脂肪酸臭）等として一般的に知られている。本発明の悪臭抑制剤により、これらの匂いのいずれか１つ以上、好ましくは全てが抑制される。
　上記悪臭に対する嗅覚受容体としては、ＯＲ５１Ｅ１、ＯＲ２Ｗ１、ＯＲ１０Ａ６、ＯＲ５１Ｉ２及びＯＲ５１Ｌ１から選択される嗅覚受容体のいずれか１つが挙げられる。本発明の悪臭抑制剤の有効成分であるアンタゴニストは、これらの嗅覚受容体のいずれか１つに対するアンタゴニストであっても、又は複数に対するアンタゴニストであってもよい。上記嗅覚受容体は、図１、２及び３に示すとおり、ノナン酸、ヘキサン酸又はイソ吉草酸臭に対して応答を示す。従って、これらの受容体の応答を抑制すれば、中枢におけるノナン酸臭、ヘキサン酸臭又はイソ吉草酸臭の認識に変化が生じるため、嗅覚受容体アンタゴニズムによるマスキングによりノナン酸、ヘキサン酸又はイソ吉草酸による悪臭を抑制することができる。
　アンタゴニストとしては、下記表１－１～１－２に示される物質が挙げられる。表３に示すとおり、これらの物質は、上記嗅覚受容体の応答を抑制する、当該嗅覚受容体のアンタゴニスト（拮抗剤）である。これらの物質は、従来香料として知られていたが、嗅覚受容体アンタゴニスト活性を有することは今まで知られていなかった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　表１－１～１－２に記載のアンタゴニストのうち、本発明の悪臭抑制剤の有効成分として、好ましくは、フロルヒドラール、４－イソプロピル－１－メチルシクロヘキサンカルバルデヒド、ブルゲオナール、ヒドロキシシトロネラール、４－イソプロピルシクロヘキサンカルバルデヒド、４－（２－メトキシフェニル）－２－メチル－２－ブタノール、フロローザ、シクレモンＡ、イソシクロシトラール、トリプラール、ポレナールＩＩ、メトキシシトロネラールが挙げられ、より好ましくは、フロルヒドラール、ブルゲオナール、ヒドロキシシトロネラール、４－イソプロピルシクロヘキサンカルバルデヒド、フロローザ、イソシクロシトラール、トリプラール、ポレナールＩＩ、メトキシシトロネラールが挙げられ、さらに好ましくは、フロルヒドラール、ブルゲオナール、メトキシシトロネラール及びイソシクロシトラールが挙げられる。
　表１－１～１－２に記載のアンタゴニストのうち、ブルゲオナール（３－（４－ｔｅｒｔ－ブチルフェニル）プロパナール）、フロルヒドラール（３－（３－イソプロピル－フェニル）－ブチルアルデヒド）、リリアール（ｐ－ｔｅｒｔ－ブチル－α－メチルヒドロシナムアルデヒド）、フロローザ（テトラヒドロ－４－メチル－２－（２－メチルプロピル）－２Ｈ－ピラン－４－オール）はＧｉｖａｕｄａｎ社より入手可能であり、スザラール（３－（４－イソブチル－フェニル）－２－メチル－プロピオンアルデヒド）は高砂香料工業から、マジャントール（２，２－ジメチル－３－（３－メチルフェニル）プロパノール）はＳｙｍｒｉｓｅ社より入手が可能である。また、シクレモンＡ（１，２，３，４，５，６，７，８－オクタヒドロ－８，８－ジメチル－２－ナフタレンカルボキシアルデヒド）、トリプラール（２，４－ジメチル－３－シクロヘキサン－１－カルボキシアルデヒド）はＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｆｌａｖｏｒｓ＆Ｆｒａｇｒａｎｃｅｓ社より入手可能であり、ポレナールＩＩ（２－シクロヘキシルプロパナール）は花王株式会社より入手可能である。シクラメンアルデヒド（３－（４－イソプロピルフェニル）－２－メチルプロパナール）、ヒドロキシシトロネラール（３，７－ジメチル－７－ヒドロキシオクタナール）、メトキシシトロネラール（７－メトキシ－３，７－ジメチルオクタナール）、シトロネラール（３，７－ジメチル－６－オクテナール）、イソシクロシトラール（２，４，６－トリメチル－３－シクロヘキセン－１－カルボキシアルデヒド、３，５，６－トリメチル－３－シクロヘキセン－１－カルボキシアルデヒド）、クミンアルデヒド（４－イソプロピルベンズアルデヒド）は、「合成香料　化学と商品知識　増補改訂版　印藤元一著　化学工業日報社」に記載の通り、例えばＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｆｌａｖｏｒｓ＆Ｆｒａｇｒａｎｃｅｓ社やＧｉｖａｕｄａｎ社、高砂香料工業などから入手することが可能である。４－イソプロピル－１－メチルシクロヘキサンカルバルデヒドは、例えば特開２００９－１４９８１１号公報に記載の方法で合成することが可能である。また、４－イソプロピル－１－メチルシクロヘキシルメタノールは例えば特開２００８－１６６７号公報に記載の方法で合成することが可能であり、４－（２－メトキシフェニル）－２－メチル－２－ブタノールは、例えば特開平９－１１１２８１号公報に記載の方法で合成が可能である。
　一例として、４－イソプロピルシクロヘキサンカルバルデヒドは、特開平２－１８８５４９号公報に記載の方法により、４－イソプロピルシクロヘキシルメタノール（Ｍａｙｏｌ）（マイヨール：フィルメニッヒ社）１５５４．５７ｇを出発原料として合成することができ、得られる生成物は、例えば下記の通りに同定される。
　１Ｈ－ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，４００ＭＨｚ，δｐｐｍ）：０．８０（３Ｈ，ｄ，６．８Ｈｚ），０．８４（３Ｈ，ｄ，６．８Ｈｚ），０．９７－１．０３，１．１９－１．３０，１．３７－１．４８，１．５１－１．６１，１．８１－１．８６，１．９５－１．９９，２．１０－２．２０（１０Ｈ，ａｌｌ　ｍ），２．３８－２．４２（１Ｈ，ｍ），９．５６（０．５Ｈ，ｓ），９．６６（０．５Ｈ，ｓ）
　１３Ｃ－ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，１００ＭＨｚ，δｐｐｍ）：１９．８７，１９．９２（ｑ），２４．７９，２６．３２，２６．５７，２８．６３（ｔ），３２．１４，３２．８４，４３．３１，４３．６０（ｄ），４７．１８，５０．６８（ｄ），２０４．６０，２０５．５１（ｄ）
　本発明の悪臭抑制剤の有効成分は、上記アンタゴニストのいずれか１つ以上であればよい。すなわち、本発明の悪臭抑制剤は、上記アンタゴニストのいずれかを単独又は２つ以上の組み合わせとして含有する。好ましくは、本発明の悪臭抑制剤は、上記アンタゴニストのいずれかの単独又は２つ以上の組み合わせから本質的に構成される。
　さらに別の態様として、本発明は、悪臭と、悪臭に対する嗅覚受容体のアンタゴニストとを共存させる工程を含む悪臭抑制方法を提供する。当該方法においては、悪臭存在下で、悪臭の認識の阻害を必要とする個体、好ましくは嗅覚受容体アンタゴニズムによるマスキングによる悪臭の認識の阻害を必要とする個体に、当該悪臭に対する受容体のアンタゴニストを適用して、当該悪臭と当該アンタゴニストとを共存させるか、又は、予め当該個体に当該アンタゴニストを適用しておき、後で当該悪臭と当該アンタゴニストを共存させる。それによって、当該悪臭受容体とアンタゴニストが結合して、当該受容体の応答が抑制されるので、嗅覚受容体アンタゴニズムによるマスキングが生じ、悪臭が抑制される。
　本発明の方法において、上記個体は哺乳類であれば特に限定されないが、好ましくはヒトである。抑制される悪臭、嗅覚受容体、及び使用されるアンタゴニストのタイプは、上述の悪臭抑制剤の場合と同様である。
　下記実施例に示すとおり、表１－１～１－２に記載のアンタゴニストは、ＯＲ５１Ｅ１、ＯＲ２Ｗ１、ＯＲ１０Ａ６、ＯＲ５１Ｉ２及びＯＲ５１Ｌ１から選択される嗅覚受容体の匂い分子に対する応答を抑制する。当該アンタゴニストを使用すれば、当該嗅覚受容体によって感受する匂い分子に由来する匂いを、嗅覚受容体アンタゴニズムによるマスキングによって、匂い特異的に抑制することが可能となる。
　表１－１～１－２に記載の嗅覚受容体アンタゴニスト、あるいは上記本発明の悪臭抑制剤の探索方法によって選択された悪臭抑制剤は、悪臭に対する嗅覚受容体の応答抑制に基づく嗅覚マスキングによって、当該悪臭を抑制するために使用することができ、また、当該悪臭を抑制するための化合物又は組成物の製造のために使用することができる。当該悪臭抑制用化合物又は組成物は、当該悪臭抑制剤に加えて、他の消臭効果を有する成分、又は消臭剤や防臭剤に使用される任意の成分、例えば、香料、粉末成分、液体油脂、固体油脂、ロウ、炭化水素、植物抽出物、漢方成分、高級アルコール類、低級アルコール類、エステル類、長鎖脂肪酸、界面活性剤（非イオン界面活性剤、アニオン界面活性剤、カチオン界面活性剤、両性界面活性剤等）、ステロール類、多価アルコール類、保湿剤、水溶性高分子化合物、増粘剤、皮膜剤、殺菌剤、防腐剤、紫外線吸収剤、保留剤、冷感剤、温感剤、刺激剤、金属イオン封鎖剤、糖分、アミノ酸類、有機アミン類、合成樹脂エマルジョン、ｐＨ調製剤、酸化防止剤、酸化防止助剤、油分、粉体、カプセル類、キレート剤、無機塩、有機塩色素、防カビ剤、着色剤、消泡剤、増量剤、変調剤、有機酸、ポリマー、ポリマー分散剤、酵素、酵素安定剤等を、その目的に応じて適宜含有していてもよい。
　上記悪臭抑制用化合物又は組成物に含有され得る消臭効果を有する他の成分としては、化学的又は物理的な消臭効果を有する公知の消臭剤が何れも使用できるが、例えば、植物の葉、葉柄、実、茎、根、樹皮等の各部位から抽出された消臭有効成分（例えば、緑茶抽出物）；乳酸、グルコン酸、コハク酸、グルタン酸、アジピン酸、リンゴ酸、酒石酸、マレイン酸、フマル酸、イタコン酸、クエン酸、安息香酸、サリチル酸等の有機酸、各種アミノ酸およびこれらの塩、グリオキサール、酸化剤、フラボノイド類、カテキン類、ポリフェノール類；活性炭、ゼオライトなどの多孔性物質；シクロデキストリン類などの包接剤；光触媒；各種マスキング剤、等が挙げられる。
　以下、実施例を示し、本発明をより具体的に説明する。
実施例１　悪臭に応答する嗅覚受容体の同定
１）ヒト嗅覚受容体遺伝子のクローニング
　ヒト嗅覚受容体はＧｅｎＢａｎｋに登録されている配列情報を基に、ｈｕｍａｎ　ｇｅｎｏｍｉｃ　ＤＮＡ　ｆｅｍａｌｅ（Ｇ１５２１：Ｐｒｏｍｅｇａ）を鋳型としたＰＣＲ法によりクローニングした。ＰＣＲ法により増幅した各遺伝子をｐＥＮＴＲベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にマニュアルに従って組込み、ｐＥＮＴＲベクター上に存在するＮｏｔＩ、ＡｓｃＩサイトを利用して、ｐＭＥ１８Ｓベクター上のＦｌａｇ－Ｒｈｏタグ配列の下流に作成したＮｏｔＩ、ＡｓｃＩサイトへと組換えた。
２）ｐＭＥ１８Ｓ－ｈＲＴＰ１Ｓベクターの作製
　ヒトＲＴＰ１Ｓはｈｕｍａｎ　ＲＴＰ１遺伝子（ＭＨＳ１０１０－９２０５８６２：Ｏｐｅｎ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を鋳型としたＰＣＲ法によりクローニングした。ＰＣＲに用いるプライマーには、センス側にＥｃｏＲＩ、アンチセンス側にＸｈｏＩサイトを付加した。ＰＣＲ法により増幅したｈＲＴＰ１Ｓ遺伝子をｐＭＥ１８ＳベクターのＥｃｏＲＩ、ＸｈｏＩサイトへ組込んだ。
３）嗅覚受容体発現細胞の作製
　ヒト嗅覚受容体３５０種をそれぞれ発現させたＨＥＫ２９３細胞を作製した。表２に示す組成の反応液を調製しクリーンベンチ内で１５分静置した後、９６ウェルプレート（ＢＤ）の各ウェルに添加した。次いで、ＨＥＫ２・BR>X３細胞（３×１０５細胞／ｃｍ２）を１００μｌずつ各ウェルに播種し、３７℃、５％ＣＯ２を保持したインキュベータ内で２４時間培養した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
４）ルシフェラーゼアッセイ
　ＨＥＫ２９３細胞に発現させた嗅覚受容体は、細胞内在性のＧαｓと共役しアデニル酸シクラーゼを活性化することで、細胞内ｃＡＭＰ量を増加させる。本研究での匂い応答測定には、細胞内ｃＡＭＰ量の増加をホタルルシフェラーゼ遺伝子（ｆｌｕｃ２Ｐ－ＣＲＥ－ｈｙｇｒｏ）由来の発光値としてモニターするルシフェラーゼレポータージーンアッセイを用いた。また、ＣＭＶプロモータ下流にウミシイタケルシフェラーゼ遺伝子を融合させたもの（ｈＲｌｕｃ－ＣＭＶ）を同時に遺伝子導入し、遺伝子導入効率や細胞数の誤差を補正する内部標準として用いた。
　上記３）で作製した培養物から、培地をピペットマンで取り除き、ＣＤ２９３培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で調製した匂い物質（ヘキサン酸１ｍＭ又はノナン酸３００μＭ）を含む溶液を７５μｌ添加した。細胞をＣＯ２インキュベータ内で４時間培養し、ルシフェラーゼ遺伝子を細胞内で十分に発現させた。ルシフェラーゼの活性測定には、Ｄｕａｌ－ＧｌｏＴＭｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ　ａｓｓａｙ　ｓｙｓｔｅｍ（ｐｒｏｍｅｇａ）を用い、製品の操作マニュアルに従って測定を行った。匂い物質刺激により誘導されたホタルルシフェラーゼ由来の発光値を、匂い物質刺激を行わない細胞での発光値で割った値をｆｏｌｄ　ｉｎｃｒｅａｓｅとして算出し、応答強度の指標とした。
５）結果
　ＯＲ２Ｗ１、ＯＲ１０Ａ６、ＯＲ５１Ｅ１、ＯＲ５１Ｉ２、ＯＲ５１Ｌ１の５種類の嗅覚受容体がヘキサン酸に対して応答を示し、ＯＲ２Ｗ１、ＯＲ１０Ａ６、ＯＲ５１Ｅ１の３種類の嗅覚受容体がノナン酸に対して応答を示した（図１）。
実施例２　ヘキサン酸に対する嗅覚受容体の応答
　実施例１と同様の手順で、嗅覚受容体ＯＲ２Ｗ１、ＯＲ１０Ａ６、ＯＲ５１Ｅ１、ＯＲ５１Ｉ２、ＯＲ５１Ｌ１のヘキサン酸（０、１０、３０、１００、３００、及び１０００μＭ）に対する応答を調べた。その結果、いずれの嗅覚受容体もヘキサン酸に対し濃度依存的な応答を示した（図２）。
実施例３　イソ吉草酸に対する嗅覚受容体の応答
　実施例１と同様の手順で、嗅覚受容体ＯＲ２Ｗ１、ＯＲ１０Ａ６、ＯＲ５１Ｅ１、ＯＲ５１Ｉ２、ＯＲ５１Ｌ１のイソ吉草酸（０、３、１０、３０、１００、３００、及び１０００μＭ）に対する応答を調べた。嗅覚受容体ＯＲ５１Ｅ１及びＯＲ５１Ｉ２が、イソ吉草酸に対して濃度依存的に応答した（図３）。
実施例４　悪臭抑制剤の同定
　実施例１で同定された嗅覚受容体を対象とし、５２種類の試験物質について嗅覚受容体応答に対する阻害活性を調べた。
　実施例１と同様の方法でＨＥＫ２９３細胞にＯＲ２Ｗ１、ＯＲ１０Ａ６、ＯＲ５１Ｅ１、ＯＲ５１Ｉ２、ＯＲ５１Ｌ１をそれぞれ発現させ、ルシフェラーゼアッセイを行った。ルシフェラーゼアッセイにおいては、匂い物質としてヘキサン酸を用い、且つヘキサン酸とともに試験物質を添加した。ヘキサン酸に対する嗅覚受容体の応答を測定し、試験物質添加による受容体応答の低下を評価した。
　試験物質による受容体応答の阻害率は、以下のとおり算出した。ヘキサン酸単独での匂い刺激により誘導されたホタルルシフェラーゼ由来の発光値（Ｘ）を、同じ受容体を導入し匂い刺激を行わなかった細胞での発光値（Ｙ）で引き算した。同様に、ヘキサン酸と試験物質の混合物での刺激による発光値（Ｚ）を、匂い刺激を行わない細胞での発光値（Ｙ）で引き算した。以下の計算式により、ヘキサン酸単独刺激による発光値の増加分（Ｘ－Ｙ）を基準に、試験物質による受容体応答阻害活性を算出した。独立した実験を二連で複数回行い、各回の実験の平均値を得た。
 
　　　　　阻害率（％）＝｛１－（Ｚ－Ｙ）／（Ｘ－Ｙ）｝×１００
 
　その結果、ＯＲ２Ｗ１に対しては７種類、ＯＲ１０Ａ６に対しては３種類、ＯＲ５１Ｅ１に対しては７種類、ＯＲ５１Ｉ２に対しては１０種類、ＯＲ５１Ｌ１に対しては６種類の試験物質が、受容体応答阻害活性を示した（表３）。
　さらに、阻害活性を示した試験物質のうちのいくつかに関して、ヘキサン酸応答の濃度依存的応答阻害を調べた。試験物質の濃度は、３、１０、３０、１００、３００μＭを用いた。各試験物質濃度下におけるヘキサン酸１ｍＭに対する受容体の応答について、試験物質濃度０μＭ下での受容体の応答強度を１００％として、相対応答強度を調べた。その結果、阻害活性を示した試験物質の中でもブルゲオナール及びフロルヒドラールが、４つの嗅覚受容体ＯＲ２Ｗ１、ＯＲ５１Ｅ１、ＯＲ５１Ｉ１、ＯＲ５１Ｌ１のヘキサン酸応答を、いずれも濃度依存的に阻害することが示された（図４）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
実施例５　試験物質の悪臭抑制能の評価
　実施例４で同定した受容体応答阻害活性を有する試験物質の悪臭抑制能を、官能試験によって確認した。
　ガラス瓶（柏洋硝子Ｎｏ．１１、容量１１０ｍｌ）に綿球を入れ、悪臭としてプロピレングリコールで１００倍に希釈したヘキサン酸、１０倍に希釈したノナン酸又は１０００倍に希釈したイソ吉草酸、及び試験物質を綿球に２０μｌ滴下した。ガラス瓶を一晩室温で静置し、匂い分子をガラス瓶中に十分揮発させた。官能評価試験はパネラー３名（イソ吉草酸については５名）で行い、悪臭を単独で滴下した場合の匂いの強さを５とし、試験物質を混合した場合の悪臭の強さを０から１０（０．５刻み）として２０段階で評価した。
　試験物質は、ヘキサン酸に対してはプロピレングリコールで１００倍に希釈したフロルヒドラール（Ｇｉｖａｕｄａｎ社）、ブルゲオナール（Ｇｉｖａｕｄａｎ社）、ヒドロキシシトロネラール（Ｇｉｖａｕｄａｎ社、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｆｌａｖｏｒｓ＆Ｆｒａｇｒａｎｃｅｓ社など）、４－イソプロピルシクロヘキサンカルバルデヒド（特開平２－１８８５４９号公報に記載の方法に従って合成）、４－（２－メトキシフェニル）－２－メチル－２－ブタノール（特開平９－１１１２８１号公報）、フロローザ（Ｇｉｖａｕｄａｎ社）、イソシクロシトラール（Ｇｉｖａｕｄａｎ社、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｆｌａｖｏｒｓ＆Ｆｒａｇｒａｎｃｅｓ社など）、トリプラール（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｆｌａｖｏｒｓ＆Ｆｒａｇｒａｎｃｅｓ社）、ポレナールＩＩ（花王株式会社）を、ノナン酸に対しては１０倍に希釈したフロルヒドラールを、イソ吉草酸に対しては１０００倍に希釈したフロルヒドラールを用いた。試験物質の対照物質として、上記嗅覚受容体に対する応答阻害効果のない物質である香料フロラロール（プロピレングリコールで１００倍に希釈）を用い、ヘキサン酸に関して同様の試験を行った。
　ＯＲ２Ｗ１、ＯＲ５１Ｅ１、ＯＲ５１Ｉ２、ＯＲ５１Ｌ１のヘキサン酸応答を抑制するフロルヒドラール及びブルゲオナールは、ヘキサン酸の匂いを著しく抑制させた（図５）。このヘキサン酸臭の抑制は、対照物質（フロラロール）を混合した場合に比べ顕著であった。またノナン酸及びイソ吉草酸について調べた結果、やはりこれらの試験物質によって匂いが抑制された（図６及び７）。なお、１種類又は複数のヘキサン酸受容体の応答を抑制する他の物質（ヒドロキシシトロネラール、４－イソプロピルシクロヘキサンカルバルデヒド、４－（２－メトキシフェニル）－２－メチル－２－ブタノール、フロローザ、イソシクロシトラール、トリプラール、ポレナールＩＩ）についてもヘキサン酸臭の抑制効果を検証したところ、いずれの試験物質もヘキサン酸臭を抑制することが明らかとなった（表４）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
　実施例４で同定した受容体応答阻害活性を有する試験物質による悪臭抑制の特異性を調べるため、脂肪酸と構造の異なる悪臭であり、実施例１で同定した嗅覚受容体が応答しない匂い物質であるクレゾールを用いて、同様の官能試験を行った。実験では、悪臭としてプロピレングリコールで１００倍に希釈したクレゾールを用い、試験物質としてプロピレングリコールで１００倍に希釈したフロルヒドラールを用いた。
　試験の結果、クレゾールの匂いはフロルヒドラールによって抑制されなかった（図８）。従って、抑制効果は匂い特異的であることが示された。

Claims (19)

  1. 　以下の工程を含む悪臭抑制剤の探索方法：
    　ＯＲ５１Ｅ１、ＯＲ２Ｗ１、ＯＲ１０Ａ６、ＯＲ５１Ｉ２及びＯＲ５１Ｌ１から選択される嗅覚受容体のいずれか１つに試験物質及び悪臭の原因物質を添加する工程；
    　当該悪臭の原因物質に対する当該嗅覚受容体の応答を測定する工程；
    　測定された応答に基づいて当該嗅覚受容体の応答を抑制する試験物質を同定する工程；
    　当該同定された試験物質を、悪臭抑制剤として選択する工程。
  2. 　前記悪臭がヘキサン酸の匂いである請求項１記載の方法。
  3. 　前記悪臭がノナン酸の匂いである請求項１記載の方法。
  4. 　前記悪臭がイソ吉草酸の匂いである請求項１記載の方法。
  5. 　前記嗅覚受容体がＯＲ５１Ｅ１、ＯＲ１０Ａ６及びＯＲ５１Ｉ２から選択される請求項２記載の方法。
  6. 　前記嗅覚受容体がＯＲ１０Ａ６である請求項３記載の方法。
  7. 　前記嗅覚受容体がＯＲ５１Ｉ２である請求項４記載の方法。
  8. 　前記嗅覚受容体が、天然に嗅覚受容体を発現する細胞上又は嗅覚受容体を発現するように遺伝的に操作された組換え細胞上に発現された嗅覚受容体である、請求項１記載の方法。
  9. 　試験物質を添加しない嗅覚受容体の応答を測定する工程をさらに含む、請求項１～８のいずれか１項記載の方法。
  10. 　前記試験物質を添加しない嗅覚受容体の応答に対して、試験物質を添加された嗅覚受容体の応答が８０％以下に抑制されていれば、当該試験物質を悪臭抑制剤として選択する、請求項９記載の方法。
  11. 　前記受容体の応答を測定する工程が、レポータージーンアッセイによって行われる、請求項１～８のいずれか１項記載の方法。
  12. 　ＯＲ５１Ｅ１、ＯＲ２Ｗ１、ＯＲ１０Ａ６、ＯＲ５１Ｉ２及びＯＲ５１Ｌ１から選択される嗅覚受容体のいずれか１つの拮抗に使用するための化合物であって、以下からなる群から選択される１つ以上である化合物：３－（３－イソプロピル－フェニル）－ブチルアルデヒド、４－イソプロピル－１－メチルシクロヘキサンカルバルデヒド、３－（４－ｔｅｒｔ－ブチルフェニル）プロパナール、３－（４イソプロピルフェニル）－２－メチルプロパナール、３，７－ジメチル－７－ヒドロキシオクタナール、ｐ－ｔｅｒｔ－ブチル－α－メチルヒドロシナムアルデヒド、７－メトキシ－３，７－ジメチルオクタナール、３－（４－イソブチル－フェニル）－２－メチル－プロピオンアルデヒド、４－イソプロピル－１－メチルシクロヘキシルメタノール、４－（２－メトキシフェニル）－２－メチル－２－ブタノール、テトラヒドロ－４－メチル－２－（２－メチルプロピル）－２Ｈ－ピラン－４－オール、２，２－ジメチル－３－（３－メチルフェニル）プロパノール、４－イソプロピルシクロヘキサンカルバルデヒド、３，７－ジメチル－６－オクテナール、１，２，３，４，５，６，７，８－オクタヒドロ－８，８－ジメチル－２－ナフタレンカルボキシアルデヒド、２，４，６－トリメチル－３－シクロヘキセン－１－カルボキシアルデヒド、３，５，６－トリメチル－３－シクロヘキセン－１－カルボキシアルデヒド、２，４－ジメチル－３－シクロヘキサン－１－カルボキシアルデヒド、４－イソプロピルベンズアルデヒド、及び２－シクロヘキシルプロパナール。
  13. 　３－（３－イソプロピル－フェニル）－ブチルアルデヒド、３－（４－ｔｅｒｔ－ブチルフェニル）プロパナール、７－メトキシ－３，７－ジメチルオクタナール、２，４，６－トリメチル－３－シクロヘキセン－１－カルボキシアルデヒド、又は３，５，６－トリメチル－３－シクロヘキセン－１－カルボキシアルデヒドである、請求項１２記載の化合物。
  14. 　悪臭抑制に使用するための嗅覚受容体アンタゴニストであって、ＯＲ５１Ｅ１、ＯＲ２Ｗ１、ＯＲ１０Ａ６、ＯＲ５１Ｉ２及びＯＲ５１Ｌ１から選択される嗅覚受容体のいずれか１つに拮抗し、且つ以下からなる群から選択される１つ以上であるアンタゴニスト：３－（３－イソプロピル－フェニル）－ブチルアルデヒド、４－イソプロピル－１－メチルシクロヘキサンカルバルデヒド、３－（４－ｔｅｒｔ－ブチルフェニル）プロパナール、３－（４イソプロピルフェニル）－２－メチルプロパナール、３，７－ジメチル－７－ヒドロキシオクタナール、ｐ－ｔｅｒｔ－ブチル－α－メチルヒドロシナムアルデヒド、７－メトキシ－３，７－ジメチルオクタナール、３－（４－イソブチル－フェニル）－２－メチル－プロピオンアルデヒド、４－イソプロピル－１－メチルシクロヘキシルメタノール、４－（２－メトキシフェニル）－２－メチル－２－ブタノール、テトラヒドロ－４－メチル－２－（２－メチルプロピル）－２Ｈ－ピラン－４－オール、２，２－ジメチル－３－（３－メチルフェニル）プロパノール、４－イソプロピルシクロヘキサンカルバルデヒド、３，７－ジメチル－６－オクテナール、１，２，３，４，５，６，７，８－オクタヒドロ－８，８－ジメチル－２－ナフタレンカルボキシアルデヒド、２，４，６－トリメチル－３－シクロヘキセン－１－カルボキシアルデヒド、３，５，６－トリメチル－３－シクロヘキセン－１－カルボキシアルデヒド、２，４－ジメチル－３－シクロヘキサン－１－カルボキシアルデヒド、４－イソプロピルベンズアルデヒド、及び２－シクロヘキシルプロパナール。
  15. 　前記悪臭がノナン酸、ヘキサン酸又はイソ吉草酸の匂いである、請求項１４記載の嗅覚受容体アンタゴニスト。
  16. 　３－（３－イソプロピル－フェニル）－ブチルアルデヒド、３－（４－ｔｅｒｔ－ブチルフェニル）プロパナール、７－メトキシ－３，７－ジメチルオクタナール、２，４，６－トリメチル－３－シクロヘキセン－１－カルボキシアルデヒド、又は３，５，６－トリメチル－３－シクロヘキセン－１－カルボキシアルデヒドである、請求項１４又は１５記載の嗅覚受容体アンタゴニスト。
  17. 　悪臭と、悪臭に対する嗅覚受容体のアンタゴニストとを共存させる工程を含む悪臭抑制方法であって、該アンタゴニストがＯＲ５１Ｅ１、ＯＲ２Ｗ１、ＯＲ１０Ａ６、ＯＲ５１Ｉ２及びＯＲ５１Ｌ１から選択される嗅覚受容体のいずれか１つに対するアンタゴニストであって、且つ３－（３－イソプロピル－フェニル）－ブチルアルデヒド、４－イソプロピル－１－メチルシクロヘキサンカルバルデヒド、３－（４－ｔｅｒｔ－ブチルフェニル）プロパナール、３－（４イソプロピルフェニル）－２－メチルプロパナール、３，７－ジメチル－７－ヒドロキシオクタナール、ｐ－ｔｅｒｔ－ブチル－α－メチルヒドロシナムアルデヒド、７－メトキシ－３，７－ジメチルオクタナール、３－（４－イソブチル－フェニル）－２－メチル－プロピオンアルデヒド、４－イソプロピル－１－メチルシクロヘキシルメタノール、４－（２－メトキシフェニル）－２－メチル－２－ブタノール、テトラヒドロ－４－メチル－２－（２－メチルプロピル）－２Ｈ－ピラン－４－オール、２，２－ジメチル－３－（３－メチルフェニル）プロパノール、４－イソプロピルシクロヘキサンカルバルデヒド、３，７－ジメチル－６－オクテナール、１，２，３，４，５，６，７，８－オクタヒドロ－８，８－ジメチル－２－ナフタレンカルボキシアルデヒド、２，４，６－トリメチル－３－シクロヘキセン－１－カルボキシアルデヒド、３，５，６－トリメチル－３－シクロヘキセン－１－カルボキシアルデヒド、２，４－ジメチル－３－シクロヘキサン－１－カルボキシアルデヒド、４－イソプロピルベンズアルデヒド、及び２－シクロヘキシルプロパナールからなる群より選択される１つ以上である、方法。
  18. 　前記悪臭がノナン酸、ヘキサン酸又はイソ吉草酸の匂いである、請求項１７記載の方法。
  19. 　前記アンタゴニストが、３－（３－イソプロピル－フェニル）－ブチルアルデヒド、３－（４－ｔｅｒｔ－ブチルフェニル）プロパナール、７－メトキシ－３，７－ジメチルオクタナール、２，４，６－トリメチル－３－シクロヘキセン－１－カルボキシアルデヒド、又は３，５，６－トリメチル－３－シクロヘキセン－１－カルボキシアルデヒドである、請求項１７又は１８記載の方法。
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