JP2016519947A - 汗カルボン酸の知覚に関与する嗅覚受容体およびその使用 - Google Patents

汗カルボン酸の知覚に関与する嗅覚受容体およびその使用 Download PDF

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Abstract

本発明は、OR分類内のクラス1に属する7つの嗅覚受容体(OR)の特定のサブクラスの天然のリガンドとしての、ヒトの汗に存在するカルボン酸の同定に関する。本発明は、本発明の7つのORの活性を特異的に調節する剤のスクリーニングアッセイの基準としての、ORポリペプチドおよびカルボン酸の相互作用の使用を包含する。

Description

発明の分野
本発明は、嗅覚受容体の特性決定に関する。特に、本発明は、7つのクラス1嗅覚受容体、およびヒトの汗に存在するカルボン酸に対応するそれらの天然のリガンドの同定に関する。本発明は、嗅覚受容体とそれらのそれぞれの天然のリガンドとの間の相互作用を調節する化合物、特に、アンタゴニストまたはブロッカーをスクリーニング
するアッセイおよび方法を提供する。本発明は、汗の悪臭を弱めるための上述の化合物を含む組成物および方法をさらに提供する。
発明の背景
嗅覚受容体
嗅覚受容体(OR)をコードする遺伝子は、単一の生理学的機能に特化した、ヒト身体における遺伝子の最大ファミリー(全ゲノムの3%)を表す。これらのORは、Gタンパク質共役型受容体(GPCR)のスーパーファミリーに属する。GPCRは、多数の異なる細胞タイプの表面に通常位置する膜受容体である。これらの受容体の共通する特徴は、細胞膜内においてバレルを形成する7つの膜貫通型スパンからなり、ヘテロ三量体GTPaseと相互作用し、これにより、それらの活性化因子の結合に際してシグナルを伝達する、それらの能力に存する。
ヒトゲノムにおいて、嗅覚受容体の特徴的符号を含有する、約900個の配列が見出された。しかしながら、これらの60%が、非機能性偽遺伝子をコードし、これにより、ヒトに約380個の異なるORタンパク質を残すように思われる。
ORは、それらの配列における6つの保存アミノ酸モチーフにより特徴付けられる。第1は、受容体の細胞外のN末端に位置するFILLGモチーフ(配列番号17)である。これは、3つの可変だが、大抵疎水性のアミノ酸により分けられた、高度に保存されたフェニルアラニンおよびグリシンに対応する。他のモチーフは、細胞内ループ1におけるLHTPMY(配列番号18)、膜貫通型ドメイン3の末端および細胞内ループ2の開始のMAYDRYVAIC(配列番号19)、膜貫通型ドメイン5の末端のSY(配列番号20)、膜貫通型ドメイン6の開始におけるFSTCSSH(配列番号21)、および膜貫通型ドメイン7におけるPMLNPF(配列番号22)を含む。
哺乳類ORは、2つの別個のクラスに通常細分される。クラス1 ORは、魚類様受容体とも呼ばれ、魚において見出されるORとより密接に関連する同種の群を形成し、それ故、脊椎動物の進化を通じて維持された、保存された残存を表すと思われている。先祖のORのこの群の遺残は、それらが、哺乳類化学的知覚において重要な役割を果たすことを示唆する。ヒトにおいて、クラス1 ORは、潜在的な機能タンパク質に対応する、68個の非偽遺伝子配列を包含する。これらの受容体は、「クラス1」ORとしてのこれらの分類を可能にする、これらの配列における幾つかの特徴的ドメインを共有する。膜貫通型ドメインに位置する幾つかのアミノ酸は、魚類様ORのメンバー内で高度に保存されることはまた、注意されるべきである。魚類様ORと対照的に、クラス2 ORは、四肢脊椎動物においてまず出現し、拡大して、ヒトにおいて現在公知のORレパートリーの大部分を形成した。クラス2 ORは、空気中の匂い物質の検出が要求される、陸生生命への適合を恐らく表す。
匂い知覚のメカニズム
それぞれのORは、異なる分子と相互作用することができ、それぞれの匂い物質分子は、1つより多くのORを活性化し得る。したがって、匂い知覚は、単一のORの単純な活性化に頼るのではなく、幾つかのORの複数の活性化にむしろ頼る。匂い(単一の分子または混合物であり得る)は、その識別および特性決定に十分である、活性化ORの固有のセットと対形成される。幾つかのさらなるORが要求されていてもよく(高濃度)、または活性化されていなくてもよい(低濃度)ので、匂い物質濃度は、匂いのプロファイルに劇的に影響し得る。それ故、活性化ORのセットは、異なる匂い濃度によって異なり、様々な匂い知覚を導く。380個のORのプールを用いて可能な組合せの数はほぼ無限であり、これにより、嗅覚系の傑出した識別特性を説明する。匂い物質受容体は、嗅上皮を構成する小領域における鼻腔の上部に位置する、特殊化した嗅覚神経(OSN)において発現される。これらの細胞の1つの末端の糸状の拡大は、それらの表面上でORを含有し、匂い物質が溶解される、鼻の粘液において浮遊する。逆の端で、OSNは、頭蓋の底部の篩骨を通ってその軸索を拡大して、嗅球に、嗅覚刺激の統合に打ち込む脳の小領域を繋げる。嗅上皮を通じて散らばった何千万ものOSNの傑出した特徴は、それぞれ1つが、ヒトゲノムにおいて利用可能な約400個のOR遺伝子のうち1つだけを発現することである。一致する遺伝子を発現するOSNは、それらの軸索を、糸球体と呼ばれる構造を形成する嗅球の同一の小領域に繋げる。活性化ORの特異的セットによる匂いの符号化が、球において、活性化糸球体の対応するパターンにより地理的に翻訳されるということは、OSNのこの組織化に由来する。この情報は、それが解読され、解析される、皮質の嗅覚領域にさらに伝達される。OSNにおいて、ORの引き金を引くことは、タイプIIIアデニル酸シクラーゼを刺激して、環状AMPを産生し、これが、第2のメッセンジャーの役割を果たす、嗅覚特異的Gタンパク質(Galpha−olf)の活性化を促進する。cAMP依存性カチオンチャネルに結合する際、このメッセンジャーは、カルシウムの細胞内への流入を誘導する。カルシウムは、塩素イオンの流出を促進する別のチャネルの開放を引き起こし、故に、シグナルをそれぞれの脳領域にもたらす神経の活動電位の引き金を引く。
匂い物質分子のORでの特性決定
培養細胞株は、学業的と産業的状況の両方で目的の受容体を特性決定し、研究するために広く用いられてきた。このアプローチは、対応する遺伝子の細胞への導入、およびそれに続く、その安定的または一過性の過剰発現の促進を含む。受容体の活性は、機能アッセイを用いてモニターされ得る。培養が容易な細胞株の使用は、機能アッセイを行うのが容易であると同時に、1日当たり数千の測定を促進する。典型的には、医薬産業において、非嗅覚受容体において1日当たり1,000,000個の化合物のライブラリーを試験することが一般的である。OR発見の結果、非嗅覚受容体の発現に適当な細胞株においてORを発現させる、幾つかの試みが成されたが、多くが不成功のままであった。かかる失敗の理由は、受容体を産生する細胞の障害においてではなく、むしろ受容体を細胞の表面に送ることができないことにおいて見られ得る。ORの機能的発現を改善することが狙いの技術は、従来の細胞株をOR発現に適当なように操作することを要求する。事実、細胞表面でのORの正しい発現および標的化は、非嗅覚細胞株に存在しない、OSN特異的細胞内機構を要求することが長く疑われていた。OSNにおける発現の徹底的分析により、この感覚細胞に特異的である、タンパク質の新規ファミリーの2つのメンバーが明らかにされた。モデルORと同時に、従来の細胞株に共導入されるとき、いわゆる受容体輸送タンパク質1および2(RTP1およびRTP2)は、細胞表面発現と、受容体のその同族の匂い物質への応答の両方を増強した。細胞においてORの活性化に際してその匂い物質分子により生じるcAMPの産生は、(Saito et al., 2004 Cell Vol. 119, 679−691)に記載される通り、レポーター遺伝子の使用からなる間接的アプローチにより検出され得る。この遺伝子は、cAMPにより誘導可能なプロモーターの制御下に置かれ、cAMPにより誘導された際にのみ発現される。異なる遺伝子がこの目的のために用いられ得るが、最も一般的なものの1つは、発光タンパク質ルシフェラーゼをコードする。その基質であるルシフェリンを切断する間、この酵素は、容易に検出され、定量化される光を放出する。放出された光の強度は、産生されたルシフェラーゼの量を反映し、cAMPの増大に比例し、それ故、受容体の活性に直接関連する。レポーター遺伝子アッセイの利点の1つは、受容体活性化とレポーター産生の間のシグナル増幅への依存である。これは、他の機能アッセイによってはほとんど検出され得ない、弱い応答を特に感知できるアッセイを作製する。
他の機能アッセイはまた、ORのその匂い物質リガンドによる活性化を証明するために用いられている。これらのアッセイの1つは、受容体細胞内カルシウム増大の活性化に際して生じる細胞質カルシウムにおける増加をモニターすることを含む(Krautwurtz D. et al. 1998. Cell 95, 917−26)。
これまで、匂い物質活性化因子の同定は、わずかなマウス匂い物質ORについて唯一報告されている。マウスOR脱オーファン化の例は、Malnic et al., 1999, Cell 96, 713−23、Saito H. et al. 2009. Sci. Signal. 2, 1−14において示される。
ヒトOR活性化因子の同定も報告されている。脱オーファン化ヒトORの例は、例えば、Fujita Y et al. 2007. J. Recept. Signal. Transduct. Res. 27, 323−34、Keller A. et al. 2007. Nature 449, 468−72、Matarazzo V. et al. 2005. Chem. Senses 30, 195−207、Saito H. et al. 2009. Sci. Signal. 2, 1−14、Sanz G. et al. 2005. Chem. Senses 30, 69−80、Schmiedeberg K. et al. 2007. J Struct. Biol. 159, 400−12.、Shirokova E. et al. 2004. J. Biol. Chem. 280, 11807−15.、Spehr M. et al. 2003. Science 299, 2054−58.、Wetzel, K. et al. 1999. J. Neurosci. 19, 7426−33、Sallmann et al. PCT番号WO2006/094704において示される。
受容体の幾つかについて、1つより多くのリガンドが同定されている。同一のORを活性化する匂い物質は、異なる匂い物質ファミリー、例えば、アルコール、アルデヒド、エステルなどに属し得る(Sanz G. et al. 2005. Chem. Senses 30, 69−80、Saito H. et al. 2009. Sci. Signal. 2, 1−14)。
身体の悪臭
我々の近代社会において、ヒトの身体により放出される匂い、およびより正確には汗における匂いは、不快または攻撃とさえしばしばみなされる。これらの匂いの知覚を弱めるための有意な努力が、化粧産業により成されている。ヒトの汗に存在する分子の種々のカテゴリーのうち、短鎖カルボン酸が特に重要である。実際に、50種より多くの異なる酸が、汗において同定されている。一連の酸は、悪臭の生成に関与するか、または悪臭の生成に重要であると想定される(表1)。例えば、3−ヒドロキシ−3−メチルヘキサン酸または(E)−3−メチル−2−ヘキセン酸は、刺激性の匂いを有し、両方が、腋窩の悪臭の重要な関与因子であることは公知である(Zeng et al. 1991; J. Chem. Ecolog.Vol. 17 pp 1469−1492、Gautschi et al., 2007, Chimia,Vol. 61 pp 27−32)。別の短鎖カルボン酸であるイソ吉草酸は、汗をかいている足により放出される特徴的なチーズ風味の匂いに関与する主要な分子として同定された(Ara et al. 2006. Can. J. Microbiol.Vol. 52 pp 357−364)。酸は、アポクリン腺により直接産生されることはない。これらは、グルタミン接合体の形成下で出現し、皮膚細菌酵素の作用下で放出される。それ故、幾つかの臭気剤の存在量は、その細菌フローラの組成に依存して、1つの個体から別に変動していてもよい。
Figure 2016519947
汗の悪臭を弱めるための異なるストラテジーが開発されてきた。最も一般的なものは、悪臭を好ましい芳香で圧倒することを含む。より精巧なアプローチにおいて、芳香は、悪臭と上手く調和し、知覚をより好ましい特徴にシフトするよう設計される。この場合において、芳香は、それ自体強い匂い物質である必要はない。
悪臭を低減する別の方法は、匂い物質分子の産生を制限することからなる。これは、皮膚細菌集団を静菌剤で制限すること、または臭気剤の放出に関与する酵素をブロックすることのいずれかにより達成され得る。
悪臭分子の受容体を特異的にブロックする、アンタゴニストおよび/またはブロッカーの開発も考慮され得る。理想的なブロッカーは、それ自体匂いを有さず、香りに影響せず、それ故、完全な創造の自由を調香師に与えることになる。
本発明において、ORのクラス1に属する7つの嗅覚受容体が、ヒトの汗に存在するカルボン酸により活性化されることが、驚くべきことに発見された。この予想外の発見により、調香師およびフレーバリスト会社にとって目的となる化合物の同定が可能になる。実際に、これらの7つの嗅覚受容体の同定された天然のリガンドは、汗の悪臭の重要な関与因子であることは公知である。汗の悪臭の知覚を修飾するための、芳香組成物におけるこれらの嗅覚受容体のブロッカーまたはアンタゴニストの同定および使用は、デオドラント開発の新たな可能性を開き得る、オリジナルの概念を表す。
本発明は、ヒトの汗に存在するカルボン酸の天然の受容体としての、ORのクラス1に属する7つの嗅覚受容体(OR)、すなわち、OR52L1、OR52E8、OR52B2、OR51I2、OR52E1、OR52A5およびOR56A5(本発明のOR)の同定に関する。本発明は、本発明のORの活性を調節する剤のスクリーニングアッセイの基準としてのこれらのORポリペプチドとカルボン酸の相互作用の使用を包含する。
本発明はまた、7つのORのカルボン酸との相互作用に基づくスクリーニング方法を行うためのキットも包含する。
あるいは、本発明は、ヒトの汗に存在するカルボン酸の天然の受容体としての、ORのクラス1に属する6つの嗅覚受容体(OR)、すなわち、OR52L1、OR52E8、OR52B2、OR52E1、OR52A5およびOR56A5の群の同定に関する。本発明は、本発明のORの活性を調節する剤のスクリーニングアッセイの基準としてのこれらのORポリペプチドとカルボン酸の相互作用の使用を包含する。
本発明はまた、OR52L1、OR52E8、OR52B2、OR52E1、OR52A5およびOR56A5のカルボン酸との相互作用に基づくスクリーニング方法を行うためのキットも包含する。
本発明は、本発明のORの1つ以上の活性を調節する剤を同定する方法であって、a)ORポリペプチドをカルボン酸と、候補モジュレーターの存在下または不存在下で、前記カルボン酸の前記ORポリペプチドへの結合を可能にする条件下で接触させること、およびb)前記ORポリペプチドの前記カルボン酸への結合を測定することを含み、ここで、候補モジュレーターの不存在下での結合と比較した、前記候補モジュレーターの存在下での結合の低減が、本発明のORの活性を調節する剤としての候補モジュレーターを同定する、方法を包含する。
したがって、本発明は、OR52L1、OR52E8、OR52B2、OR51I2、OR52E1、OR52A5およびOR56A5からなる群より選択される、1つ以上の嗅覚受容体(OR)の機能を調節する剤を同定する方法であって、
a)前記1つ以上のORを、ブタン酸、イソ吉草酸、ペンタン酸、ヘキサン酸、2−メチルヘキサン酸、3−メチルヘキサン酸、(E)−3−メチル−2−ヘキセン酸、3−ヒドロキシ−3−メチルヘキサン酸、ヘプタン酸、2−メチルヘプタン酸、オクタン酸、4−エチルオクタン酸、ノナン酸、デカン酸、ウンデカン酸および安息香酸からなる群より選択される1つ以上のカルボン酸と、前記剤の存在下および不存在下で、前記カルボン酸の前記ORへの結合を可能にするか、または前記ORの前記カルボン酸による活性化を可能にする条件下で接触させる工程、
b)前記剤の存在下および不存在下で、前記1つ以上のORの前記1つ以上のカルボン酸への結合、または前記1つ以上のORの活性を比較する工程を含み、ここで、剤の不存在下での結合または活性と比較した、前記剤の存在下での結合または活性の差が、前記1つ以上のカルボン酸に応答して前記1つ以上のORの機能を調節する剤としての剤を同定する、
方法を提供する。
好ましい態様において、前記剤は、前記カルボン酸のここで挙げられた全7つのORへの結合への影響、またはここで挙げられた全7つのORの前記カルボン酸による活性化への影響について試験される。
本発明はまた、OR52L1、OR52E8、OR52B2、OR52E1、OR52A5およびOR56A5からなる群より選択される、1つ以上の嗅覚受容体(OR)の機能を調節する剤を同定する方法であって、
a)前記1つ以上のORを、ブタン酸、ペンタン酸、ヘキサン酸、3−ヒドロキシ−3−メチルヘキサン酸、ヘプタン酸、2−メチルヘプタン酸、オクタン酸、4−エチルオクタン酸、ノナン酸、デカン酸およびウンデカン酸からなる群より選択される1つ以上のカルボン酸と、前記剤の存在下および不存在下で、前記カルボン酸の前記ORへの結合を可能にする、または前記ORの前記カルボン酸による活性化を可能にする条件下で接触させる工程、
b)前記剤の存在下および不存在下での前記1つ以上のORの前記1つ以上のカルボン酸への結合、または前記1つ以上のORの活性を比較する工程を含み、ここで、剤の不存在下での結合または活性と比較した、前記剤の存在下での結合または活性の差が、前記1つ以上のカルボン酸に応答して前記1つ以上のORの機能を調節する剤としての剤を同定する、
方法も提供する。
好ましい態様において、前記剤は、前記カルボン酸のここで挙げられた6つのORの群の全メンバーへの結合への影響、またはここで挙げられた6つのORの群の全メンバーの前記カルボン酸による活性化への影響について試験される。好ましくは、6つのORの前記群は、OR52L1、OR52E8、OR52B2、OR52E1、OR52A5およびOR56A5からなる。
さらなる態様において、前記剤は、ペンタン酸のOR52L1への結合への影響、またはOR52L1のペンタン酸による活性化への影響について試験される。
別の態様において、前記剤は、3−ヒドロキシ−3−メチルヘキサン酸のOR52E8への結合への影響、またはOR52E8の3−ヒドロキシ−3−メチルヘキサン酸による活性化への影響について試験される。
次の態様において、前記剤は、ヘキサン酸、ヘプタン酸、オクタン酸、ノナン酸、デカン酸、もしくはウンデカン酸のOR52B2への結合への影響、またはOR52B2のヘキサン酸、ヘプタン酸、オクタン酸、ノナン酸、デカン酸、もしくはウンデカン酸による活性化への影響について試験される。
別の態様において、前記剤は、ブタン酸、イソ吉草酸、ペンタン酸、ヘキサン酸、2−メチルヘキサン酸、3−メチルヘキサン酸、(E)−3−メチル−2−ヘキサン酸、もしくは安息香酸のOR51I2への結合への影響、またはOR51I2のブタン酸、イソ吉草酸、ペンタン酸、ヘキサン酸、2−メチルヘキサン酸、3−メチルヘキサン酸、(E)−3−メチル−2−ヘキサン酸、もしくは安息香酸による活性化への影響について試験される。
さらなる態様において、前記剤は、ブタン酸のOR52E1への結合への影響、またはOR52E1のブタン酸による活性化への影響について試験される。
なお別の態様において、前記剤は、4−エチルオクタン酸のOR52A5への結合への影響、またはOR52A5の4−エチルオクタン酸による活性化への影響について試験される。
別の態様において、前記剤は、ヘキサン酸、ヘプタン酸、2−メチルヘプタン酸、オクタン酸、ノナン酸、デカン酸、もしくはウンデカン酸のOR56A5への影響、またはOR56A5のヘキサン酸、ヘプタン酸、2−メチルヘプタン酸、オクタン酸、
ノナン酸、デカン酸、もしくはウンデカン酸による活性化への影響について試験される。
好ましくは、前記1つ以上のORポリペプチドは、配列番号2、4、6、8、10、12または14のアミノ酸配列により定義される。本発明は、試料において、試料における本発明のORのいずれか1つの活性を調節する剤の存在を検出する方法であって、a)ORポリペプチドをカルボン酸と、前記試料の存在下および不存在下で、前記カルボン酸の前記ORポリペプチドへの結合を可能にする条件下で接触させること、およびb)前記ORポリペプチドの前記カルボン酸への結合を測定することを含み、ここで、候補モジュレーターの不存在下での結合と比較した、試料の存在下での結合の低減が、前記試料におけるORの活性を調節する剤の試料における存在を示す、方法をさらに包含する。
本発明は、本発明のORのいずれか1つの機能を調節する剤を同定する方法であって、a)ORポリペプチドをカルボン酸と、候補モジュレーターの存在下または不存在下で、前記ORポリペプチドのカルボン酸による活性化を可能にする条件下で接触させること、およびb)前記ORポリペプチドのシグナル伝達活性を測定することを含み、ここで、前記候補モジュレーターの不存在下での活性と比較した、前記候補モジュレーターの存在下での活性の変化が、前記ORの機能を調節する剤としての前記候補モジュレーターを同定する、方法をさらに包含する。
本発明は、本発明のORのいずれか1つの機能を調節する剤を同定する方法であって、a)ORポリペプチドを候補モジュレーターと接触させること、b)前記ORポリペプチドのシグナル伝達活性を前記候補モジュレーターの存在下で測定すること、およびc)前記候補モジュレーターの存在下で測定した活性を、前記ORポリペプチドがカルボン酸とそのEC50で接触させた試料において測定した前記活性と比較することを含み、ここで、候補モジュレーターの存在下で測定した活性の量が、そのEC50で存在する前記カルボン酸により誘導される量の少なくとも10%であるとき、前記候補モジュレーターを、ORの機能を調節する剤として同定する、方法をさらに包含する。
本発明は、試料において、本発明のORの機能を調節する剤の存在を検出する方法であって、a)ORポリペプチドをカルボン酸と、前記試料の存在下および不存在下で接触させること、b)前記ORポリペプチドのシグナル伝達活性を測定すること、およびc)前記試料なしでORおよびカルボン酸を含有する反応物において測定した前記活性の量を、OR、カルボン酸および前記試料を含有する反応物において測定した前記活性の量と比較することを含み、ここで、前記試料の不存在下での活性と比較した、前記試料の存在下での前記活性の変化が、前記試料におけるORの機能を調節する剤の存在を示す、方法をさらに包含する。
本発明は、試料において、本発明のORの機能を調節する剤の存在を検出する方法であって、a)ORポリペプチドを前記試料と接触させること、b)前記ORポリペプチドのシグナル伝達活性を前記試料の存在下で測定すること、およびc)前記試料の存在下で測定した前記活性を、前記ORポリペプチドが、そのEC50で存在するカルボン酸と接触させた反応物において測定した前記活性と比較することを含み、ここで、前記試料の存在下で測定した活性の量が、そのEC50で存在するカルボン酸により誘導される量の少なくとも10%であれば、ORの機能を調節する剤を検出する、方法をさらに包含する。
本発明によると、結合方法を用いるとき、カルボン酸は、検出可能に標識されていてもよい。前記方法において、カルボン酸は、ラジオアイソトープ、フルオロフォア、および蛍光のクエンチャーからなる群より選択される部分で検出可能に標識されていてもよい。
上述の方法のいずれか1つの一態様において、接触は、前記ORポリペプチドを発現する細胞内または細胞上で行われる。本発明によると、前記細胞は、ヒト胎児由来腎臓細胞(Hek293)、チャイニーズハムスター細胞(CHO)、サル細胞(COS)、一次嗅覚細胞、ツメガエル細胞、昆虫細胞、酵母または細菌であってもよいが、これらに限定されない。
上述の方法のいずれか1つの別の態様において、接触は、合成リポソーム内または上で行われる(Tajib et al., 2000, Nature Biotechnology 18: 649−654を参照、これは、ここで引用により組み込まれる)またはORポリペプチドを含有する、ウイルスにより誘導される出芽膜(WO0102551、2001を参照、ここで引用により組み込まれる)。
上述の方法のいずれか1つの別の態様において、方法は、前記ORポリペプチドを発現する細胞由来の膜分画を用いて行われる。
上述の方法のいずれか1つの好ましい態様において、方法は、タンパク質チップ上で行われる。
上述の方法のいずれか1つの別の好ましい態様において、測定は、標識置換、表面プラズモン共鳴、蛍光共鳴エネルギー移動、蛍光クエンチング、および蛍光偏光から選択される方法を用いて行われる。
上述の方法のいずれか1つの別の態様において、剤は、ペプチド、ポリペプチド、抗体もしくはその抗原結合フラグメント、脂質、炭水化物、核酸、および小有機分子からなる群より選択される。
本発明によると、機能アッセイが用いられるとき、本発明のORのシグナル伝達活性を測定する工程は、第2のメッセンジャーのレベルの変化を検出することを含んでいてもよい。
別の態様において、シグナル伝達活性を測定する工程は、グアニンヌクレオチド結合/架橋または交換、アデニル酸シクラーゼ活性、cAMP、タンパク質キナーゼC活性、タンパク質キナーゼA活性、ホスファチジルイノシトール分解、ジアシルグリセロール、イノシトール三リン酸、細胞内カルシウム、カルシウム流動、アラキドン酸、MAPキナーゼ活性、チロシンキナーゼ活性、メラノフォアアッセイ、受容体初期化アッセイ、またはレポーター遺伝子発現の測定を含む。Gタンパク質結合/架橋または交換が測定されるとき、可能な全Gαサブユニットのうち、好ましくは、GTP結合タンパク質Gタンパク質アルファ−olfサブユニット(嗅覚)、さらにG−olfの行為が研究される。ヒトG−olfサブユニットの配列は、Genebankにおいて受託番号L10665の下、既に寄託されている。しかしながら、他の種のG−olfサブユニットが用いられ、研究されていてもよい。
好ましい態様において、シグナル伝達活性の測定は、蛍光または発光アッセイを用いることを含む。蛍光および発光アッセイは、fluo3、Fluo4またはFura(Molecular probes)、Ca3−kit family(Molecular Device)およびエクオリンを含むCa2+感受性フルオロフォアの使用を含んでいてもよい。さらに、前記アッセイは、自動蛍光定量的または発光リーダー、例えば、FDSS(Hammamatsu)またはFLIPR(Molecular Device)を適用してもいてもよい。
本発明は、細胞において本発明のORの活性を調節する方法であって、ORの活性が調節されるように、前記細胞にカルボン酸またはORポリペプチドの活性を調節する剤を運ぶ工程を含む、方法を包含する。
上述の方法のいずれか1つの別の態様において、方法は、ハイスループットスクリーニング方法である。
上述の方法のいずれか1つの別の態様において、剤は、化学物質ライブラリーまたは動物の器官抽出物の一部である。
本発明によると、上述の方法のいずれかにより同定もしくは検出された剤、または前記剤を含む組成物を用いて、汗の悪臭が弱められていてもよい。あるいは、これらは、匂い物質ブロッカーまたは匂い物質アンタゴニストの調製のために用いられてもよい。例えば、ORブロッカーまたはアンタゴニストは、デオドラントとして用いられてもよい。ORブロッカーまたはアンタゴニストは、既に用いられている芳香または香料製剤に、その有効性を強化するためのデオドラントとして加えられてもよい。
本発明は、単離されたORポリペプチドおよびカルボン酸を含む組成物も包含する。好ましい態様において、前記組成物は、ここで同定された全7つのOR、または2、3、4、5、もしくは6つの受容体のその任意の組合せを包含する。好ましくは、6つのORの前記群は、OR52L1、OR52E8、OR52B2、OR52E1、OR52A5およびOR56A5からなる。
本発明は、本発明のORのシグナル伝達を調節する剤をスクリーニングするためのキットの製造のための、または匂い物質ブロッカーもしくは匂い物質アンタゴニストをスクリーニングするためのキットの製造のための本発明のORとの組合せにおけるカルボン酸の使用にさらに関する。
加えて、本発明は、本発明のORのリガンドとしての、哺乳類の汗に存在するカルボン酸の使用を包含する。
本発明は、本発明の複合体のカルボン酸/ORを認識する抗体またはそのフラグメントにも関する。
本発明は、単離されたORポリペプチドまたは幾つかの単離されたORポリペプチド、カルボン酸およびそのための包装材料を含むキット、ORポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドまたはORポリペプチドをコードする幾つかの単離されたポリヌクレオチド、カルボン酸、およびそのための包装材料を含むキット、ORポリペプチドを発現する細胞もしくはその膜、またはORポリペプチドを発現する幾つかの細胞もしくはその膜、カルボン酸およびそのための包装材料を含むキットをさらに包含する。前記細胞は、前記ORをコードするポリヌクレオチドで形質転換されてもよい。好ましい態様において、前記キットは、ここで同定された全7つのOR、または2、3、4、5、もしくは6つの受容体のその任意の組合せ、およびそれらのそれぞれのカルボン酸を包含する。好ましくは、6つのORの前記群は、OR52L1、OR52E8、OR52B2、OR52E1、OR52A5およびOR56A5からなる。
図1は、本発明の7つの嗅覚受容体(OR)をコードするDNAおよび対応するポリペプチド配列を示す。 図1は、本発明の7つの嗅覚受容体(OR)をコードするDNAおよび対応するポリペプチド配列を示す。 図1は、本発明の7つの嗅覚受容体(OR)をコードするDNAおよび対応するポリペプチド配列を示す。 図2A〜Gは、汗において見出された全カルボン酸であるそれらの異なる活性化因子での本発明の7つの受容体の濃度応答性分析に対応する。これらの分析は、「実験手順」に記載される手順に従い行われた。 図2A〜Gは、汗において見出された全カルボン酸であるそれらの異なる活性化因子での本発明の7つの受容体の濃度応答性分析に対応する。これらの分析は、「実験手順」に記載される手順に従い行われた。 図2A〜Gは、汗において見出された全カルボン酸であるそれらの異なる活性化因子での本発明の7つの受容体の濃度応答性分析に対応する。これらの分析は、「実験手順」に記載される手順に従い行われた。 図2A〜Gは、汗において見出された全カルボン酸であるそれらの異なる活性化因子での本発明の7つの受容体の濃度応答性分析に対応する。これらの分析は、「実験手順」に記載される手順に従い行われた。 図2A〜Gは、汗において見出された全カルボン酸であるそれらの異なる活性化因子での本発明の7つの受容体の濃度応答性分析に対応する。これらの分析は、「実験手順」に記載される手順に従い行われた。 図2A〜Gは、汗において見出された全カルボン酸であるそれらの異なる活性化因子での本発明の7つの受容体の濃度応答性分析に対応する。これらの分析は、「実験手順」に記載される手順に従い行われた。 図2A〜Gは、汗において見出された全カルボン酸であるそれらの異なる活性化因子での本発明の7つの受容体の濃度応答性分析に対応する。これらの分析は、「実験手順」に記載される手順に従い行われた。 図2A〜Gは、汗において見出された全カルボン酸であるそれらの異なる活性化因子での本発明の7つの受容体の濃度応答性分析に対応する。これらの分析は、「実験手順」に記載される手順に従い行われた。 図2A〜Gは、汗において見出された全カルボン酸であるそれらの異なる活性化因子での本発明の7つの受容体の濃度応答性分析に対応する。これらの分析は、「実験手順」に記載される手順に従い行われた。 図2A〜Gは、汗において見出された全カルボン酸であるそれらの異なる活性化因子での本発明の7つの受容体の濃度応答性分析に対応する。これらの分析は、「実験手順」に記載される手順に従い行われた。
発明の詳細な説明
定義
ここで用いられる場合、用語「嗅覚受容体ポリペプチド(OR)」は、嗅神経細胞において生成されるGタンパク質共役型受容体ファミリーに由来するポリペプチドを一般に指す。ORは、匂い物質分子と相互作用し、匂い物質シグナルを伝達する能力を有し得る。用語「本発明による嗅覚受容体(OR)」または「本発明による嗅覚受容体ポリペプチド」は、カルボン酸を選択的に検出することができることが本発明において示された7つの嗅覚受容体の群を指す。本発明による嗅覚受容体の例は、図1において表される配列(配列番号2、4、6、8、10、12および14)に対して少なくとも80%のアミノ酸同一性、および好ましくは、100%を含む、90%以上、95%以上、96%以上、97%以上、98%以上、99%以上のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含むが、これらに限定されない。前記相同性は、ポリペプチド全体またはポリペプチドのただ部分、例えば、CDRドメイン(受容体のリガンド結合ドメイン)に関してもよい。PilpelおよびLancet(Protein Science 8:969−977、 1999)によると、GPCRのCDRドメインは、公開された指標に従い定義され得る:TM3−#4、TM3−#8、TM3−#11、TM3−#12、TM3−#15、TM4−#11、TM4−#15、TM4−#19、TM4−#22、TM4−#23、TM4−#26、TM5−#3、TM5−#6、TM5−#7、TM5−#10、TM5−#11およびTM5−#13(式中、TMxは、前記受容体の膜貫通型領域を示し、#は、前記領域内のアミノ酸位置を示す)。
ここで用いられる場合、用語「ORポリヌクレオチド」は、ここで定義されるORポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを指す。好ましくは、前記ポリヌクレオチドは、図1に表される配列(配列番号1、3、5、7、9、11および13)に対して100%を含む、少なくとも80%以上、好ましくは、90%以上、95%以上、96%以上、97%以上、98%以上、99%以上の核酸同一性を有する。
ここで用いられる場合、用語「OR結合」は、匂い物質分子のORポリペプチドによる特異的結合を指す。匂い物質分子の例は、カルボン酸、エステル、アルコールおよびアミンを含むが、これらに限定されない。
ここで用いられる場合、用語「ORシグナル伝達活性」は、ORポリペプチドによるシグナル伝達の開始または伝播を指す。ORシグナル伝達活性は、以下のうち1つ以上をアッセイすることによるシグナル伝達カスケードにおける検出可能な工程を測定することにより、モニターされる:Gタンパク質、最も詳細には、G−olfでのGTP交換のためのGDPの刺激、アデニル酸シクラーゼ活性の変化、タンパク質キナーゼC調節、タンパク質キナーゼA調節、ホスファチジルイノシトール分解(第2のメッセンジャージアシルグリセロール、およびイノシトール三リン酸を生成する)、細胞内カルシウム流動、MAPキナーゼの活性化、チロシンキナーゼの調節、内部移行アッセイ、遺伝子もしくはレポーター遺伝子活性の調節、またはメラノフォアアッセイ。測定可能な活性が、ここで記載されるOR活性アッセイのいずれかと比較して、カルボン酸の実質的不存在下で確立された基準より10%以上上または下に変化するなら、シグナル伝達カスケードにおける検出可能な工程は、開始されたか、または仲介されたと見なされる。測定可能な活性は、直接的に測定され得る(例えば、cAMPまたはジアシルグリセロールレベルの測定など)。あるいは、測定可能な活性が間接的に測定され得る(例えば、レポーター遺伝子アッセイなど)。これらのアッセイの大部分について、キットが市販されている。
本発明によるカルボン酸は、哺乳類の汗、好ましくは、ヒトの汗に存在するカルボン酸であり、汗の悪臭の生成に関与するか、または重要である(例えば、表1を参照)。
本発明による「ブロッカー」または「ブロックする化合物」は、1つ以上の匂い物質分子により誘発される匂いの知覚を減弱するかまたは消失させる分子である。ブロッカーは、前記匂いを伝達するORと相互作用することにより、または受容体に対して天然のリガンドと相互作用することにより作用し得る。本発明の「ブロックする化合物」は、アゴニストにより誘導される細胞内応答、例えば、ヒトの汗に存在するカルボン酸を、少なくとも10%、好ましくは、15〜25%、より好ましくは、25〜50%、および最も好ましくは、50〜100%低減し得る。「ブロッカー」はまた、本発明のブロッカーをコードするヌクレオチド配列も指し得る。本発明により有用なブロッカーは、抗体、小分子、アプタマー、フォトアプタマー、修飾された天然のリガンドなどを含むが、これらに限定されず、これは、カルボン酸を介したシグナル伝達に要求されるORの少なくとも一部(例えば、リガンド結合部位)に特異的に結合するか、またはORに結合するシグナル伝達経路を(例えば、少なくとも10%)ブロックするかまたは低減することができる。好ましくは、ブロッキング剤は、好ましくは揮発性物質であるか、または適当な溶媒または添加剤と組合せて、揮発性物質を生じ得る。
ここで用いられる場合、「アンタゴニスト」は、受容体に結合し、リガンドまたはアゴニストにより誘導される細胞内応答、例えば、ヒトの汗に存在するカルボン酸を、アゴニストの存在下および不存在下での細胞内応答と比較して、少なくとも10%、好ましくは、15〜25%、より好ましくは、25〜50%、および最も好ましくは、50〜100%阻害するリガンドである。アンタゴニストは、競合的であってもよく、すなわち、それは、アゴニストまたはリガンドと同一の部位に結合するが、受容体の活性化形態により開始される細胞内応答を活性化せず、それ故、前記リガンドまたはアゴニストによる活性化を回避する。あるいは、アンタゴニストは、非競合的であってもよく、すなわち、それは、アゴニストまたはリガンド結合部位以外の部位に結合し、不活性な構造の受容体をブロックし、それ故、アゴニストにより嗅覚シグナルの伝達を回避する。
ここで用いられる場合、「天然のリガンド」は、ヒトの汗に存在するカルボン酸、例えば、ここで例示されるカルボン酸に少なくとも均等である方法で受容体に結合する天然に存在するリガンドを指す。「天然のリガンド」は、天然で見られず、受容体に結合するよう操作された、操作されたリガンドを指さず、それは、結合するよう操作されたものと異なる方法、異なる程度または種類のいずれかで以前に操作されていない。かかる操作されたリガンドは、もはや天然に存在するものではなく、「非天然」であり、天然に存在する分子からもたらされる。
ここで用いられる場合、「モジュレーター」は、受容体のリガンド、例えば、ヒトの汗に存在するカルボン酸の存在または不存在下のいずれかで、本発明の受容体の細胞表面発現を増大するか、もしくは低減する、本発明のORのリガンドの結合を増大するか、もしくは低減する化合物、または本発明のORの活性化形態により開始される細胞内応答を増大するか、もしくは低減する任意の化合物を指す。モジュレーターは、ここで定義される、アンタゴニスト、またはブロッカーを含む。モジュレーターは、例えば、小分子、ポリペプチド、ペプチド、抗体もしくはその抗原結合フラグメント、脂質、炭水化物、核酸、アプタマー、フォトアプタマー、または小化学化合物または小有機分子であり得る。候補モジュレーターは、例えば、合成の小分子、動物、植物、細菌または真菌細胞の抽出物、およびかかる細胞由来の条件培地に含有される化合物を含む、天然または合成の化合物であり得る。
ここで用いられる場合、用語「増大」および「低減」は、本発明のORに結合するリガンドの量および/または本発明のORを介した細胞シグナル伝達の量の少なくとも10%の変化を指す。結合またはシグナル伝達の「増大」または「低減」は、好ましくは、候補モジュレーターの存在下で、本発明のORをリガンドと接触させた応答において測定され、ここで、結合またはシグナル伝達の変化は、候補モジュレーターの不存在下での結合またはシグナル伝達に対するものである。
ここで用いられる場合、用語「小分子」は、3000ダルトン未満、好ましくは、2000または1500未満、なおより好ましくは、1000未満、および最も好ましくは、600ダルトン未満の分子量を有する化合物を指す。「小有機分子」は、炭素を含む小分子である。
ここで用いられる場合、例えば、結合もしくはシグナル伝達活性、または物質の量に適用される、用語「変化」、「差」、「低減」、または「増大」は、所定のアッセイにおける標準と比較して、結合、シグナル伝達活性、または例えば、mRNA、ポリペプチドまたはリガンドのレベルの少なくとも10%の増大または低減を指す。
ここで用いられる場合、用語「カルボン酸の本発明のORへの結合を可能にする条件」は、ORがカルボン酸に結合する、例えば、温度、塩濃度、pHおよびタンパク質濃度の条件を指す。正確な結合条件は、アッセイの性質、例えば、アッセイが、生きた細胞を用いるか、または細胞の膜分画のみを用いるかに依存して変動することになる。しかしながら、本発明のORは、細胞表面タンパク質であるので、好ましい条件は、生理学的塩(90mM)およびpH(約7.0〜8.0)を一般に含むことになる。結合のための温度は、15℃〜37℃で変動し得るが、好ましくは、室温〜約30℃の間となる。結合反応におけるカルボン酸の濃度はまた、約0.5〜2μMで変動するが、好ましくは、約1μMとなる。
ここで用いられる場合、用語「試料」は、本発明のORへの結合、またはシグナル伝達活性を調節する剤またはモジュレーター化合物の存在について試験される分子の供給源を指す。試料は、環境試料、動物、植物、酵母または細菌細胞もしくは組織の天然の抽出物、臨床試料、合成試料、または組換え細胞由来もしくは発酵過程由来の条件培地であり得る。
ここで用いられる場合、「組織」は、生物において特定の機能を行う細胞の凝集体である。ここで用いられる場合、用語「組織」は、特定の生理学的領域由来の細胞材料を指す。特定の組織における細胞は、幾つかの異なる細胞種を含み得る。この非限定的な例は、神経細胞およびグリア細胞、ならびに毛細管内皮細胞および血液細胞をさらに含む脳組織、所定の組織切片または試料に含有される全てである。固形組織に加え、用語「組織」は、非固形組織、例えば、血液を包含することも意図される。
ここで用いられる場合、用語「膜分画」は、本発明のORを含有する細胞脂質膜の調製物を指す。ここで用いられる場合、「膜分画」は、細胞のホモジネートと別個であり、ここで、非膜関連の細胞構成物の少なくとも部分(すなわち、少なくとも10%、および好ましくはより多く)が取り除かれている。用語「膜関連」は、脂質膜に統合されるか、または脂質膜に統合される成分と物理的に関連するいずれかである、これらの細胞構成物を指す。
ここで用いられる場合、用語「第2のメッセンジャーアッセイ」は、グアニンヌクレオチド結合または交換、アデニル酸シクラーゼ、細胞内cAMP、細胞内イノシトールホスフェート、細胞内ジアシルグリセロール濃度、アラキドン酸濃度、MAPキナーゼまたはチロシンキナーゼ、タンパク質キナーゼC活性、もしくはレポーター遺伝子発現の測定、または当該技術分野において公知かつここで定義された方法によるエクオリンに基づくアッセイを好ましくは含む。
ここで用いられる場合、用語「第2のメッセンジャー」は、GPCRからのシグナルの伝達に関与するGタンパク質共役型受容体の活性化により、濃度を変動するよう生成または生じた分子を指す。第2のメッセンジャーの非限定的な例は、cAMP、ジアシルグリセロール、イノシトール三リン酸、アラキドン酸放出、イノシトール三リン酸および細胞内カルシウムを含む。用語「第2のメッセンジャーのレベルの変化」は、候補モジュレーターの不存在下で行われたアッセイにおいて検出された量と比較して、所定の第2のメッセンジャーの検出されたレベルの少なくとも10%の増大または低減を指す。
ここで用いられる場合、用語「エクオリンに基づくアッセイ」は、活性化GPCRにより誘導される細胞内カルシウム流動を測定するGPCR活性のアッセイを指し、ここで、細胞内カルシウム流動が、細胞において発現されるエクオリンの発光により測定される。
ここで用いられる場合、用語「結合」は、分子(例えば、リガンド、例えば、カルボン酸または抗体)の受容体(例えば、本発明のOR)との物理的関連を指す。ここで用いられる場合、結合は、1mM未満、一般的には、1mM〜10nMの範囲のEC50またはKdで生じるなら、「特異的」である。例えば、結合は、EC50またはKdが1mM、500μM、100μM、10μM、9.5μM、9μM、8.5μM、8μM、7.5μM、7μM、6.5μM、6μM、5.5μM、5μM、4.5μM、4μM、3.5μM、3μM、2.5μM、2μM、1.5μM、1μM、750nM、500nM、250nMまたは100nM以下であれば、特異的である。
ここで用いられる場合、用語「EC50」は、カルボン酸または他のリガンドの結合を含む所定の活性およびORの機能的活性が、化合物の不存在下で同一のアッセイを用いて測定可能なOR活性の最大値の50%である、化合物の濃度を指す。これと異なり規定すると、「EC50」は、100%の活性化がさらなるアゴニストの添加で増大しない活性の量に設定されたとき、50%の活性化を示す化合物の濃度である。
ここで用いられる場合、用語「飽和」は、リガンド濃度のさらなる増大が、リガンドの結合またはOR特異的シグナル伝達活性の増大に失敗する、ヒトの汗に存在するカルボン酸、または他のリガンドの濃度を指す。
ここで用いられる場合、用語「IC50」は、本発明のORの最大活性化を50%低減する、アンタゴニストまたはブロッカーの濃度である。
ここで用いられる場合、用語「結合の低減」は、公知または疑われるモジュレーターを欠くアッセイにおいて検出される結合と比較して、本発明のORの公知または疑われるモジュレーターでの所定のアッセイにおいて検出されるリガンド結合の量の少なくとも10%の低減を指す。
ここで用いられる場合、用語「Gタンパク質共役型受容体」または「GPCR」は、7つのアルファらせん状膜貫通型ドメインを有する膜関連ポリペプチドを指す。機能的GPCRは、リガンドまたはアゴニストと関連し、また、Gタンパク質と関連し、かつ活性化する。本発明のORポリペプチドは、GPCRである。
ここで用いられる場合、用語「抗体」は、対象ポリペプチドの1つと特異的に反応性でもある、従来の免疫グロブリン分子、およびそのフラグメントである。抗体は、従来技術を用いてフラグメント化され、フラグメントは、抗体全体についての後述と同一の方法で有用性についてスクリーニングされ得る。例えば、F(ab)2フラグメントは、抗体をペプシンで処理することにより、生成され得る。得られたF(ab)2フラグメントを処理して、ジスルフィド結合を減らし、Fabフラグメントが産生され得る。本発明の抗体は、抗体の少なくとも1つのCDR領域により与えられる、ポリペプチドについての親和性を有する、二重特異的1本鎖、ならびにキメラおよびヒト化分子を含むことがさらに意図される。好ましい態様において、抗体は、それに結合し、検出され得る標識をさらに含む(例えば、標識は、ラジオアイソトープ、蛍光化合物、化学発光化合物、酵素、または酵素補因子であり得る)。モノクローナルまたはポリクローナル抗体、およびその高頻度可変部分(FAB、FAB’’など)、ならびに抗体を産生するハイブリドーマ細胞は、特定疾患、好ましくは、後述されるものの診断およびモニターの分野において特異的な産業上の適用を見出す、本発明のさらなる側面である。本発明による阻害剤は、標識されたモノクローナルもしくはポリクローナル抗体、または抗体の高頻度可変部分を含むが、これらに限定されない。
ここで用いられる場合、用語「OR恒常的活性」は、前記嗅覚受容体のリガンドを添加することなく自発的に生じる、細胞に発現される嗅覚受容体の測定可能な活性を指す。
ここで用いられる場合、用語「インバースアンタゴニスト」は、ORに結合し、ORの恒常的活性を低減または抑制する分子を指す。
本発明は、ヒトの汗に存在するカルボン酸が、嗅覚受容体の特定の群、ここで定義されるORポリペプチドの天然のリガンドであるという発見に関する。OR/カルボン酸相互作用は、かかる相互作用、およびしたがってORの機能を調節する剤についてのスクリーニングアッセイに有用である。このOR/カルボン酸相互作用はまた、産業において興味を引き得るモジュレーターの同定も提供する。
ORの活性を調節する剤の同定のためのアッセイ
ORの活性を調節する剤は、前記受容体のカルボン酸との相互作用を利用する多数の方法で同定され得る。例えば、培養細胞においてインビトロで、またはインビボのいずれかにおいて、OR/カルボン酸結合を再構成する能力が、結合を妨害する剤の同定のための標的を提供する。結合の崩壊に基づくアッセイは、剤、例えば、小有機分子を、かかる分子のライブラリーまたは集合物から同定し得る。あるいは、かかるアッセイは、植物、真菌または細菌抽出物またはヒト組織試料でさえ含む、天然の供給源由来の試料または抽出物において剤を同定し得る。次に、OR/カルボン酸結合のモジュレーターが、前記受容体を介した下流シグナル伝達を測定する結合アッセイまたは機能アッセイを用いてスクリーニングされ得る。結合アッセイと機能アッセイの両方が、カルボン酸を用いて立証される。
OR機能を調節する剤を同定するためにより直接的にOR/カルボン酸相互作用を使用する別のアプローチは、候補剤または候補モジュレーターにより誘導されるOR下流シグナル伝達の変化を測定する。これらの機能アッセイは、単離細胞膜分画において、または受容体を表面に発現している細胞において行われ得る。
以下の記載は、ORとカルボン酸の相互作用に基づく結合と機能アッセイの両方の方法を提供する。
A.ORポリペプチド
ORポリペプチドとカルボン酸の相互作用を用いるアッセイは、ORポリペプチドの供給源を必要とする。ヒトORのポリヌクレオチドおよびポリペプチド配列は、ここで図1で提示される。ヒトOR52L1、OR52E8、OR52B2、OR51I2、OR52E1、OR52A5およびOR56A5ポリヌクレオチド配列はまた、それぞれ、GenBank受託番号 NM_001005173(配列番号1)、NM_001005168(配列番号3)、NM_001004052(配列番号5)、NM_001004754(配列番号7)、NG_033197(配列番号9)、NM_001005160(配列番号11)、NM_001146033(配列番号13)で入手可能である。ポリペプチド配列はまた、Uniprotデータベースにおいて、それぞれ、受託番号Q8NGH7(配列番号2)、Q6IFG1(配列番号4)、Q96RD2(配列番号6)、Q9H344(配列番号8)、Q8NGJ3(配列番号10)、Q9H2C5(配列番号12)、およびP0C7T3(配列番号14)で記録されている。
当業者は、公知の配列から設計されたプライマーまたはプローブを用いて、基本的なPCRおよび分子クローニング技術を通じて、タンパク質をコードするmRNAを含有する試料からOR配列を容易に増幅し得る。また、OR遺伝子はイントロンのない遺伝子であるので、当業者は、OR配列をゲノムDNAから増幅し得る。
組換えポリペプチドの発現は、当該技術分野において周知である。当業者は、真核細胞または原核細胞における本発明によるORポリペプチドの発現のため、ベクターおよび発現制御配列を容易に選択し得る。ORポリペプチドは、結合またはシグナル伝達機能を有するように、細胞膜または合成リポソームと好ましくは結合する。細胞の膜分画の調製方法は、当該技術分野において周知であり、例えば、Hubbard & Cohn, 1975, J. Cell Biol. 64: 461−479(これは、ここで引用により組み込まれる)により報告された方法である。ORポリペプチドを含む膜を生産するために、かかる膜の単離技術を本発明のORポリペプチドの1つを内在性にまたは組換え発現する細胞に、例えば適用し得る。あるいは、ORポリペプチドは、ポリペプチドの界面活性剤溶液の希釈により、膜調製物に組み込まれ得る(例えば、Salamon et al., 1996, Biophys. J. 71:283−294を参照、これは、ここで引用により組み込まれる)。
B.汗に存在するカルボン酸
かかるカルボン酸の構造は、当業者により周知である。加えて、当業者は、均等な酸を前記構造から容易にもたらしてもよく、前記均等物、ORポリペプチドに結合するか、および/または調節できるかを容易に試験してもよい。カルボン酸は、天然の試料から単離されるか、または化学的に合成されてもよい。
前記酸を定量化するために用いられ得る方法は、a)抽出および精製のため、溶媒抽出、油抽出、蒸気抽出、CO2超臨界抽出、液体クロマトグラフィー、蒸留、ガスクロマトグラフィー、b)定量化のため、ガスクロマトグラフィー、液体クロマトグラフィーおよび質量分析であってもよいが、これらに限定されない。前記方法は、当該技術分野において周知である。
カルボン酸は、精製された形態で用いられてもよく、または組成物として用いられてもよい。本発明による所定の結合または機能アッセイにおいて必要な酸の量は、アッセイに依存して変動するが、1回のアッセイ当たり、1μM〜1000μMの標識された酸、および10μM〜10mMの無標識の酸を一般的に用いる。所定のアッセイに必要であれば、カルボン酸は、上で挙げられた放射性標識を組込むかまたは添加することにより、標識され得る。
C.OR活性のモジュレーターを同定するためのアッセイ
カルボン酸が、クラス1の嗅覚受容体ファミリーに属する7つのORのリガンドであるという発見は、OR活性のモジュレーターを同定するためのスクリーニングアッセイの開発を可能にする。スクリーニングアッセイは、2つの一般的なアプローチを有する。
1)リガンド結合アッセイ、ここで、本発明による1つ以上のORを発現する細胞、かかる細胞由来の膜抽出物、または本発明による1つ以上のORを含む固定された脂質膜が、前記1つ以上のORに結合することが公知の標識されたカルボン酸、および候補化合物に暴露される。インキュベーション後、反応混合物は、標識されたカルボン酸の前記ORへの特異的結合について測定される。標識されたカルボン酸と干渉するか、またはORから置換させる化合物が、OR活性のモジュレーター、好ましくは、ブロッカーまたはアンタゴニストとして同定され得る。機能分析は、それらが適合するこれらのカテゴリーにおいて決定される正の化合物において行われ得る。
化合物の結合は、3つの主なカテゴリーに分類され得る:競合的結合、非競合的結合、および競合しない結合。競合結合する化合物は、第2の(参考)化合物に似ており、標的分子(ここで、受容体)の同一の結合ポケットに結合する。添加の際、競合結合する化合物は、前記第3の化合物を前記標的から置き換える。非競合結合する化合物は、第2の(参考)化合物と同一の標的分子の結合ポケットに結合しないが、前記標的分子上の前記第2の化合物の作用と相互作用し得る。第2の化合物は、非競合結合する化合物の添加の際に、置き換わらない。競合結合しない化合物は、第2の化合物が既に結合したとき、標的分子に結合する。協力的な結合は、化合物が、参考化合物であってもよい、別の化合物の結合を促進することを意味する。したがって、協力的作用は、前記他の化合物のKdの分析において見られる。
2)機能アッセイ、ここで、ORのシグナル伝達活性が測定される。
a)アゴニストスクリーニングのため、ORを発現する細胞またはそれから調製された膜が、候補化合物とインキュベートされ、ORのシグナル伝達活性が測定される。アッセイは、カルボン酸をアゴニストとして用いて証明され、受容体活性を調節する化合物により誘導された活性が、カルボン酸により誘導されたものと比較される。アゴニストまたは部分的アゴニストは、100μM以下で存在するときカルボン酸の最大活性の少なくとも10%に対応する最大生物学的活性を有し、好ましくは、50%、75%、100%またはそれ以上を有し、これは、カルボン酸の2倍、5倍、10倍またはそれ以上の活性を含む。
b)アンタゴニストのスクリーニングのため、ORを発現する細胞またはそれから単離された膜が、候補化合物ありまたはなしで、カルボン酸の存在下でシグナル伝達活性についてアッセイされる。アンタゴニストは、アンタゴニストを欠く反応と比較して、カルボン酸により刺激される受容体活性のレベルを、少なくとも10%低減する。
c)インバースアンタゴニストスクリーニングのため、恒常的OR活性を発現する細胞またはそれから単離された膜が、カルボン酸リガンドの不存在下で受容体の活性を測定する機能アッセイにおいて用いられる。インバースアンタゴニストは、ORの恒常的活性を少なくとも10%低減する化合物である。ORの過剰発現は、恒常的活性化に通じてもよい。ORは、強力な恒常的プロモーター、例えば、CMV初期プロモーターの制御下に置くことにより、過剰発現され得る。あるいは、保存GPCRアミノ酸またはアミノ酸ドメインのある種の変異は、恒常的活性に通じる傾向にある。例えば、Kjelsberg et al., 1992, J. Biol. Chem. 267:1430、McWhinney et al., 2000. J. Biol. Chem. 275:2087、Ren et al., 1993, J. Biol. Chem. 268:16483、Samama et al., 1993, J.Biol. Chem 268:4625、Parma et al., 1993, Nature 365:649、Parma et al., 1998, J. Pharmacol. Exp. Ther. 286:85、およびParent et al., 1996, J. Biol. Chem. 271:7949を参照。
リガンド結合および置換アッセイ:
カルボン酸のORポリペプチドへの結合を阻害する化合物をスクリーニングするために、カルボン酸と共に、細胞において発現されたORポリペプチド、または受容体ポリペプチドを含有する単離された膜を用い得る。結合またはカルボン酸置換単独を測定するアッセイにおいて同定されるとき、化合物は、それらが、アゴニスト、アンタゴニストまたはインバースアンタゴニストとして作用するかどうかを決定するために機能的試験にかけられなければならない。
置換実験のため、ORポリペプチドを発現する細胞(一般的に、1回のアッセイ当たり25,000細胞、または膜抽出物1〜100μg)は、結合緩衝液(例えば、50mM Hepes pH7.4、1mM CaCl2、0.5% ウシ血清アルブミン(BSA)(脂肪酸を含まない)、および0,5mM MgCl2)において、1.5時間(例えば、27℃にて)、標識されたカルボン酸と、増加濃度の候補モジュレーターの存在下または不存在下でインキュベートされる。アッセイを証明し、校正するために、増加濃度の非標識カルボン酸を用いて、対照競合反応が行われ得る。インキュベーション後、細胞が広範囲に渡り洗浄され、結合した標識されたカルボン酸が、所定の標識に応じて測定される(例えば、シンチレーション測定、酵素アッセイ、蛍光など)。候補モジュレーターの存在下で結合した標識されたカルボン酸の量の少なくとも10%の低減は、結合の候補モジュレーターによる結合の置換を示す。候補モジュレーターは、標識されたカルボン酸の50%を置換していれば、このアッセイまたはここで記載される他のアッセイにおいて特異的に結合するとみなされる。
あるいは、結合または結合の置換は、表面プラズモン共鳴(SPR)によりモニターされ得る。表面プラズモン共鳴アッセイは、水相から、センサーの膜上に固定されたORポリペプチドへのカルボン酸の結合または結合の喪失により引き起こされる固定されたセンサー付近での質量の変化により、2つの分子間の結合を測定するための定量的方法として用いられ得る。この質量の変化は、カルボン酸または候補モジュレーターの注入または除去後の時間に対する共鳴単位として測定され、Biacore Biosensor(Biacore AB)を用いて測定される。ORポリペプチドは、Salamonら(Salamon et al., 1996, Biophys J. 71: 283−294; Salamon et al., 2001, Biophys. J. 80: 1557−1567; Salamon et al., 1999, Trends Biochem. Sci. 24: 213−219、それぞれが、ここで引用により組み込まれる)により記載される方法に従い、薄いフィルムの脂質膜におけるセンサーチップ上に固定され得る(例えば、研究グレードCM5チップ、Biacore AB)。Sarrioらは、SPRを用いて、チップ状の脂質層に固定されたGPCR A(1)アデノシン受容体へのリガンドの結合が検出され得ることを証明した(Sarrio et al., 2000, Mol. Cell. Biol. 20: 5164−5174、ここで、引用により組込まれる)。SPRアッセイにおける本発明のORへのカルボン酸結合の条件は、開始時にSarrioらにより報告された条件を用いて、当業者により、首尾よく調整され得る。
SPRは、少なくとも2つの方法で、結合のモジュレーターについてアッセイし得る。第1に、カルボン酸は、固定されたORポリペプチドに予め結合され、続いて、流速約10μl/分、および1nM〜1000μMの範囲、好ましくは、約100μMの濃度で、候補モジュレーターが注入され得る。結合したカルボン酸の置換が定量化され、これにより、モジュレーター結合の検出が可能になる。あるいは、膜に結合したカルボキシルポリペプチドが、候補モジュレーターと予めインキュベートされ、カルボン酸が試される。モジュレーターに予め暴露されたチップのものと比較した、モジュレーターに暴露されたORへのカルボン酸結合の差は、結合を証明する。いずれかのアッセイにおいて、候補モジュレーターの不存在下で結合したカルボン酸の量と比較した、候補モジュレーターの存在下で結合したカルボン酸結合の10%以上の低減は、候補モジュレーターが、ORとカルボン酸の相互作用を阻害することを示す。Biacoreシステムは、候補モジュレーターを同定するシステム、例えば、質量分析、またはガスクロマトグラフィーに差し込まれ得る。
カルボン酸のORへの結合の阻害を測定する別の方法は、蛍光共鳴エネルギー移動(FRET)を用いる。FRETは、互いに近接した(通常、間隔100A未満)蛍光供与体(D)と蛍光受容体(A)の間で、Dのスペクトルの放出がAのスペクトルの励起と重複する場合に、生じる量子力学の現象である。試験されるべき分子、例えば、カルボン酸およびORポリペプチドは、相補的対の供与体と受容体フルオロフォアで標識される。OR/カルボン酸の相互作用に起因して互いに隣接する間、供与体フルオロフォアの励起に際して放出された蛍光は、分子が結合されないときの励起波長に応答して放出されたものと異なる波長を有し、これにより、それぞれの波長での放出強度の測定により、結合対未結合のポリペプチドの定量が可能になる。標的分子を標識するため用いられる、フルオロフォアの供与体/受容体対は、当該技術分野において周知である。
FRETのバリエーションは、蛍光クエンチングを用いて、分子の相互作用がモニターされる。相互作用する対における一方の分子が、フルオロフォアで標識され、他方は、密接同格になったとき、蛍光のフルオロフォアをクエンチする分子で標識され得る。励起の際の蛍光の変化は、フルオロフォア:クエンチャー対でタグ付けされた分子の結合の変化の指標である。一般に、標識されたORポリペプチドの蛍光の増大は、クエンチャーを生じるカルボン酸が置換されたことの指標である。クエンチングアッセイについて、候補モジュレーターのない試料と比較した、候補モジュレーターを含有する試料における蛍光放出の強度の10%以上の増大は、候補モジュレーターが、OR/カルボン酸の相互作用を阻害することを示す。
生物発光共鳴エネルギー移動(BRET)は、インビボでの分子間相互作用をモニターするためのシステムである。アッセイは、ウミシイタケルシフェラーゼ(Rluc)および例えば、黄色蛍光タンパク質(YPF)または緑色蛍光タンパク質(GFP)を含有する融合タンパク質間の非放射性エネルギー移動に基づく。BRETシグナルは、セレンテラジン誘導体基質の酸化により生じる。前記システムは、細胞浸透性かつ無毒性のセレンテラジン誘導体基質DeepBleuCTM(DBC)および緑色蛍光タンパク質(GFP)の変異体を受容体として適用してもよい。供与体および受容体が、密接にあるとき、DBCの触媒性低減から生じるエネルギーは、RlucからGFPに移り、次に、その特徴的波長の蛍光を放出する。この方法により、2つの試験される分子間の距離がより長くなることを可能にし、フルオロフォアの角度に依存しない。
表面プラズモン共鳴、FRETおよびBRET方法に加えて、蛍光偏光測定は、カルボン酸受容体結合の定量化に有用である。蛍光でタグ付けされた分子の蛍光偏光値は、回転性相関時間または回転率に依存する。タンパク質複合体、例えば、ORの蛍光標識されたカルボン酸との結合により形成されるものは、複合体化されていない、標識されたカルボン酸より大きい偏光値を有する。OR/カルボン酸の相互作用の候補阻害剤の包含は、候補阻害剤が、ORのカルボン酸との相互作用を妨害するか、または阻害するなら、候補阻害剤のない混合物と比較して、蛍光偏光の低減を生じる。蛍光偏光は、ポリペプチドまたはタンパク質複合体の形成を妨害する小分子の同定に十分に適している。候補モジュレーターを欠く試料における蛍光偏光と比較した、候補モジュレーターを含有する試料における蛍光偏光の10%以上の低減は、候補モジュレーターが、OR/カルボン酸の相互作用を阻害することを示す。
OR/カルボン酸の相互作用をモニターするための別の代替は、バイオセンサーアッセイを用いる。ICSバイオセンサーは、AMBRI(Australian Membrane Biotechnology Research Institute; http//www.ambri.com.au/)により記載されている。この技術において、分子、例えば、ORおよびカルボン酸の結合は、懸濁された膜二重層におけるグラマシジンにより促進されるイオンチャネルの閉鎖、これにより、バイオセンサーのアドミッタンス(インピーダンスに類似)の測定可能な変化に繋がる。このアプローチは、6桁のアドミッタンス変化の大きさに渡り直線的であり、小分子組合せライブラリーの巨大なスケールのハイスループットスクリーニングに理想的に適している。候補モジュレーターを欠く試料のアドミッタンスと比較した、候補モジュレーターを含有する試料におけるアドミッタンスの10%以上の変化(増大または低減)は、候補モジュレーターが、ORとカルボン酸の相互作用を阻害することを示す。
酸とタンパク質の相互作用のアッセイにおいて、相互作用のモジュレーターが、物理的に相互作用するタンパク質のドメインと直接的に相互作用することが必須であるとは限らないという可能性があることに注意することとは重要である。モジュレーターが、酸とタンパク質の相互作用の部位から取り除かれた位置で相互作用し、例えば、ORポリペプチドの構造の変化を生じるという可能性もある。それにも関わらず、この方法で作用するモジュレーター(阻害剤またはアゴニスト)は、ORの活性を調節するための剤として興味深い。
記載される結合アッセイのいずれかを用いて、試料、例えば、組織試料における、OR分子に結合するか、またはカルボン酸のORへの結合に影響する剤の存在が決定され得る。このため、ORポリペプチドを、試料の存在下または不存在下でカルボン酸または別のリガンドと反応させ、カルボン酸またはリガンド結合が、用いられる結合アッセイに応じて測定される。カルボン酸または他のリガンドの結合の10%以上の低減は、試料が、カルボン酸またはリガンドのORポリペプチドへの結合を調節する剤を含有することを示す。
タンパク質チップ
本発明の方法は、タンパク質チップ上で適用されてもよい。前記タンパク質チップは、ガラススライドまたはニトロセルロース膜であってもよいが、これらに限定されない。タンパク質チップのアレイに基づく方法は、当該技術分野において周知である。タンパク質アレイは、カルボン酸との結合に関与する、本発明による1つ以上のORポリペプチドまたはそのフラグメントを好ましくは含む。タンパク質チップは、カルボン酸との結合に関与する、本発明による全7つのORポリペプチド、またはそのフラグメントを好ましくは含む。
受容体活性の機能アッセイ
i.GTPase/GTP結合アッセイ:
GPCR、例えば、ORポリペプチドについて、受容体活性の測定は、受容体を含有する細胞膜によるGTPの結合である。Traynor and Nahorski, 1995, Mol. Pharmacol. 47: 848−854(ここで、引用により組込まれる)に記載される方法において、標識されたGTPの膜への結合を測定することにより、Gタンパク質の膜への共役を本質的に測定する。GTP結合アッセイのため、受容体を発現する細胞から単離された膜は、20mM HEPES pH7.4、100mM NaCl、および10mM MgCl2、80pM 35S−GTPγSおよび3μM GDPを含有する緩衝液においてインキュベートされる。アッセイ混合物は、未結合の標識されたGTPが、GF/B濾紙での濾過により取り除かれた後、30℃で60分間インキュベートされる。結合した、標識されたGTPは、液体シンチレーション測定により測定される。カルボン酸により誘導されたOR活性の調節についてアッセイするために、ORポリペプチドを発現する細胞から調製した膜は、カルボン酸と混合され、GTP結合アッセイは、OR活性の候補モジュレーターの存在下または不存在下で行われる。モジュレーターのないアッセイと比較した、候補モジュレーターを含有するこの種のアッセイにおけるシンチレーション測定により測定される、標識されたGTP結合の10%以上の低減は、候補モジュレーターがOR活性を阻害することを示す。
同様のGTP結合アッセイをカルボン酸なしで行い、アゴニストとして作用する化合物が同定され得る。この場合において、カルボン酸により刺激されるGTP結合が、標準として用いられる。化合物が1mM以下で存在するとき、カルボン酸により誘導されるGTP結合のレベルの少なくとも50%を誘導し、好ましくは、カルボン酸により誘導されるものと同じであるか、それより高いレベルを誘導するなら、化合物はアゴニストであるとみなされる。
GTPase活性は、ORポリペプチドを含有する膜をガンマ−32P−GTPとインキュベートすることにより、測定される。活性GTPaseは、標識を無機リン酸塩として放出し、そしてそれが、20mM H3PO4における活性炭の5%懸濁液における遊離無機リン酸塩の分離により検出され、続いて、シンチレーション測定される。対照は、候補化合物の可能性のある非特異的作用を排除するために、ORを発現しない細胞(偽遺伝子導入された)から単離された膜を用いたアッセイを含む。
ORにより制御されるGTPase活性に対する候補モジュレーターの作用についてアッセイするために、膜試料は、モジュレーターありおよびなしでカルボン酸とインキュベートされ、続いて、GTPaseアッセイされる。モジュレーターのない試料と比較した、GTP結合またはGTPase活性のレベルの10%以上の変化(増大または低減)は、候補モジュレーターによるカルボキシル調節の指標である。
ii.下流経路活性化アッセイ:
a.カルシウム流動−エクオリンに基づくアッセイ
エクオリンアッセイは、GPCRの活性化により誘導される細胞内カルシウム放出またはカルシウム流動(流入)に対するミトコンドリアまたは細胞質アポエクオリンの応答性を利用する(Stables et al., 1997, Anal. Biochem. 252:115−126、Detheux et al., 2000, J. Exp. Med., 192 1501−1508、共に、ここで引用により組込まれる)。簡単に言うと、OR発現クローンは、ミトコンドリアまたは細胞質アポエクオリンおよびG−アルファ−16またはG−olfを同時発現するよう、遺伝子導入される。細胞は、5μM セレンテラジンHまたは誘導体(Molecular Probes)と室温で4時間インキュベートされ、DMEM−F12培養培地において洗浄され、0.5×106細胞/mlの濃度で再懸濁される。次に、細胞は、試験アゴニストペプチドと混合され、エクオリンによる光放出は、ルミノメーターで30秒間記録される。結果は、相対的光単位(RLU)として表される。対照は、候補化合物の可能性のある非特異的作用を排除するために、C356を発現しない細胞(偽遺伝子導入された)から単離された膜を用いたアッセイを含む。
エクオリン活性または細胞内カルシウムレベルは、光強度が、ORポリペプチドを発現するが、候補モジュレーターで処理されない細胞の試料と比較した、またはORポリペプチドを発現しない(偽遺伝子導入された)が、候補モジュレーターで処理された細胞の試料と比較した、ORポリペプチドを発現し、候補モジュレーターで処理された細胞の試料において10%以上増大または低減するなら、「変化」する。
カルボン酸の不存在下で行われるとき、アッセイを用いて、OR活性のアゴニストまたはインバースアゴニストが同定され得る。アッセイがカルボン酸の存在下で行われるとき、これを用いて、アンタゴニストについてアッセイされ得る。
1)Fluo3、4、Fura2、およびCalcium3(Molecular Device)に基づくアッセイ
蛍光に基づくアッセイは、受容体活性化により引き金を引かれるカルシウム流動を利用する:CNGを介したカルシウム流入、例えば、または小胞体からのカルシウム放出のいずれか。Fluo3、Fluo4およびFura2(Molecular Probes)およびCalcum3キットシリーズ(Molecular Device)を含むが、これらに限定されない、カルシウムを結合する幾つかのフルオロフォアが公知である。かかるフルオロフォア−カルシウム複合体は、特定の波長の蛍光を放出する。これにより、Gタンパク質共役型受容体の活性化の際、小胞体から放出されるか、またはCNGを介して流入したカルシウムが、フルオロフォアに結合し、特定の蛍光放出が生じる。ORを過剰発現する細胞は、1〜8μM フルオロフォアの溶液と、37℃で30〜60分間インキュベートされる。食塩水緩衝液での洗浄後、同じ緩衝液50μlが、細胞を含有するそれぞれのウェル(6〜1536)に注がれる。次に、試験されるアゴニストが、かかる添加された細胞に注入され、続いて、ORの活性化が、蛍光測定される。
細胞内カルシウムレベルは、蛍光強度が、ORポリペプチドを発現するが、候補モジュレーターで処理されていない細胞の試料、またはORポリペプチドを発現しない(偽遺伝子導入細胞)が、候補モジュレーターで処理された細胞の試料と比較して、ORポリペプチドを発現し、候補モジュレーターで処理された細胞の試料において、10%以上増大または低減するなら、「変化」する。
2)偏光解消/過偏光膜アッセイ(例えば、DiBacフルオロフォア)
このアッセイの原理は、細胞膜の偏光解消に従う。陰イオンプローブDiBAC4(3)は、膜電位に依存した方法で、細胞内と細胞外コンパートメントの間で分配される。膜電位の増大(偏光解消)に伴い、プローブは、細胞内にさらに分配され、蛍光の増大を生じる。逆に、過偏光は、染料排出に起因した蛍光の低減を導く。
DiBAC4(3)プローブは、488nmの波長で励起され、540nmの波長で放出される。
実験の日に、アッセイ緩衝液(食塩水緩衝液)に、グルコースを終濃度10mM、およびDiBAC4(3)プローブを終濃度5μMで加える。アッセイ緩衝液を37℃で維持する。細胞培養培地を取り除き、ORを過剰発現する細胞を含有するそれぞれのウェルを、予め温めたアッセイ緩衝液200μlで2回すすぐ。DiBAC4(3)を含有するアッセイ緩衝液180μlを入れ、細胞を適当な温度で30分間インキュベートする。細胞プレートは、この30分間のインキュベーション後にアッセイできる。いずれもの添加に先立ち、2分間基準を集める。候補モジュレーター20μlを適当なウェルに加え、データをさらに25分間集める。
膜偏光は、蛍光強度が、ORポリペプチドを発現するが、候補モジュレーターで処理されていない細胞の試料、またはORポリペプチドを発現しない(偽遺伝子導入細胞)が、候補モジュレーターで処理された細胞の試料と比較して、ORポリペプチドを発現し、候補モジュレーターで処理された細胞の試料において10%以上増大または低減するなら、「変化」する。
3)メラノフォアアッセイ。メラノフォアアッセイは、色に基づくアッセイである。基本的に、このアッセイのため用いられる細胞は、カエルであるアフリカツメガエル(Xenopus Laevis)の皮膚からもたらされる。これらの不死化細胞はメラノソームを含有し、そしてそれは、暗色素を含有する小器官である。アデニル酸シクラーゼまたはホスホリパーゼCの活性化の引き金を引く内在性または組換えGPCRの活性化は、メラノソーム分散、故に、細胞の暗色化を導く。あるいは、アデニル酸シクラーゼまたはホスホリパーゼCを阻害するGPCRは、細胞を明るくする。これにより、第2のメッセンジャーの濃度を測定する代わりに、細胞の色調の変化を観察するというヒットを容易に正確に狙うことができる。この色の変化は、650nMでの吸光度を測定するマイクロプレートリーダーにおいて、またはビデオ画像処理システムにおいて調べることにより、容易に定量化され得る。
b.アデニル酸シクラーゼアッセイ:
アデニル酸シクラーゼ活性についてのアッセイは、Kenimer & Nirenberg, 1981, Mol. Pharmacol. 20: 585−591(ここで、引用により組み込まれる)により記載される。このアッセイは、Solomon et al., 1974, Anal. Biochem. 58: 541−548(これも、ここで引用により組込まれる)により教示されるアッセイの修飾である。簡単に言うと、反応液100μlは、50mM Tris−Hcl(pH7.5)、5mM MgCl2、20mM クレアチンリン酸(二ナトリウム塩)、クレアチンホスホキナーゼ10単位(タンパク質71μg)、1mM α−32P−ATP(テトラナトリウム塩、2μCi)、0.5mM 環状AMP、G−3H−標識環状AMP(約10,000cpm)、0.5mM Ro20−1724、0.25% エタノール、および試験されるべきタンパク質ホモジネート(すなわち、ORポリペプチドを発現するか、または発現せず、候補モジュレーターありまたはなしのカルボン酸で処理されたかまたは処理されていない、細胞由来のホモジネート)50〜200μgを含有する。反応混合物は、37℃で6分間一般的にインキュベートされる。インキュベーション後、反応混合物は、6% 冷トリクロロ酢酸0.9mlを加えることにより、除タンパクされる。試験管は、1800×gにて20分間遠心分離され、それぞれの上清溶液が、Dowex AG50W−X4カラムに加えられる。カラム由来のcAMP分画は、0.1mM イミダゾール−HCl(pH7.5)4mlでカウント用バイアルに溶出される。アッセイは、三連で行われるべきである。対照反応はまた、ORポリペプチドを発現しない細胞由来のタンパク質ホモジネートを用いて行われるべきである。
アッセイは、ORを発現し、候補モジュレーターありまたはなしのカルボン酸で処理されたか、または処理されていない細胞または細胞の抽出物を用いて行われるべきである。対照の反応は、幾つかの候補モジュレーターの可能性のある非特異的作用を排除するために、偽遺伝子導入細胞、またはそれら由来の抽出物を用いて行われるべきである。
本発明によると、アデニル酸シクラーゼ活性は、候補モジュレーターで処理されていない細胞の同様の試料と比較して、またはORポリペプチドを発現しない(偽遺伝子導入細胞)が、候補モジュレーターで処理された細胞の試料と比較して、OR活性の候補モジュレーターで処理された細胞から採取された試料において10%以上増大するか、または低減するなら、それは「変化」する。あるいは、参考化合物で処理された試料におけるORポリペプチドの候補モジュレーターにより10%以上の活性の低減が、試験されてもよい。
c.cAMPアッセイ:
細胞内cAMPは、当該技術分野で広く公知の方法によるcAMPラジオイムノアッセイ(RIA)またはcAMP結合タンパク質を用いて測定される。例えば、Horton & Baxendale, 1995, Methods Mol. Biol. 41: 91−105(これは、ここで引用により組み込まれる)は、cAMPのためのRIAを記載する。
cAMPの測定のための多数のキットが市販される(例えば、LJL Biosystemsにより販売される、High Efficiency Fluorescence Polarization−based homogeneous assay、およびNEN Life Science製品)。対照反応は、幾つかの候補モジュレーターの可能性のある非特異的作用を排除するために、偽遺伝子導入細胞の抽出物を用いて行われるべきである。
アッセイは、ORポリペプチドを発現し、候補モジュレーターありまたはなしのカルボン酸で処理されたかまたは処理されていない細胞または細胞の抽出物を用いて行われるべきである。対照反応は、幾つかの候補モジュレーターの可能性のある非特異的作用を排除するために、偽遺伝子導入細胞、またはそれに由来する抽出物を用いて行われるべきである。
上記のHorton & Baxendale, 1995のRIAに基づくアッセイを用いて、ORポリペプチドを発現し、OR活性の候補モジュレーターで処理された細胞において(またはかかる細胞の抽出物において)検出されたcAMPのレベルが、候補モジュレーターで処理されていない類似の細胞におけるcAMPレベルと比較して、少なくとも10%増大または低減するなら、cAMPのレベルは、「変化」する。
d.リン脂質分解、DAG産生、およびイノシトール三リン酸レベル:
リン脂質の分解を活性化する受容体は、リン脂質分解、および得られた第2のメッセンジャーDAGおよび/またはイノシトール三リン酸(IP3)の産生をモニターすることにより、ORの公知または疑われるモジュレーターの活性に起因する変化についてモニターされ得る。これらのそれぞれを測定する方法は、Ian M. Bird. Totowa, NJ, Humana Press, 1998により編集された、Phospholipid Signaling Protocols(これは、ここで引用により組み込まれる)に記載される。ホスファチジルイノシトール分解についてのアッセイも記載される、Rudolph et al., 1999, J. Biol. Chem. 274: 11824−11831(ここで引用により組み込まれる)も参照のこと。アッセイは、候補モジュレーターありまたはなしのカルボン酸で処理されたかまたは処理されていない、ORを発現する細胞またはORを発現する細胞の抽出物を用いて行われるべきである。対照反応は、幾つかの候補モジュレーターの可能性のある非特異的作用を排除するために、偽遺伝子導入細胞、またはそれに由来する抽出物を用いて行われるべきである。
本発明によると、ホスファチジルイノシトール分解、およびジアシルグリセロールおよび/またはイノシトール三リン酸レベルが、候補モジュレーターで処理されていないカルボキシルポリペプチドを発現する細胞由来の試料において観察されたレベルと比較して、ORポリペプチドを発現し、カルボン酸の存在下または不存在下で、候補モジュレーターで処理された細胞由来の試料において、少なくとも10%増大または低減するなら、それらは「変化」する。
e.PKC活性化アッセイ:
成長因子受容体チロシンキナーゼは、タンパク質キナーゼC(PKC)の活性化に関与する経路を介してシグナル伝達する傾向にあり、リン脂質およびカルシウムにより活性化されるタンパク質キナーゼのファミリーである。PKC活性化は、c−fos、c−mycおよびc−junを含む癌原遺伝子転写因子コード遺伝子のアレイの転写、タンパク質分解酵素、コラゲナーゼタイプIおよびプラスミノーゲン活性化因子阻害剤を含むタンパク質分解酵素阻害剤、ならびに細胞内接着分子I(ICAM I)を含む接着分子を最終的にもたらす。PKCにより誘導される遺伝子産物の増大を検出するよう設計されたアッセイを用いて、PKC活性化、これにより、受容体活性がモニターされ得る。加えて、PKCを介してシグナル伝達する受容体の活性は、PKC活性化により活性化される遺伝子の制御配列により分けられた、レポーター遺伝子構築物の使用を通じてモニターされ得る。この種のレポーター遺伝子に基づくアッセイは、以下でより詳細に考察される。
PKC活性のより直接的な測定のため、Kikkawa et al., 1982, J. Biol. Chem. 257: 13341(ここで、引用により組込まれる)の方法が用いられ得る。このアッセイは、PKC基質ペプチドのリン酸化を測定し、続いて、ホスホセルロース紙への結合により分けられる。このPKCアッセイシステムを用いて、精製されたキナーゼの活性、または粗細胞抽出物における活性が測定され得る。タンパク質キナーゼC試料は、アッセイの直前に、20mM HEPES/2mM DTTに希釈され得る。
アッセイのための基質は、ミリストイル化された、アラニンに富むタンパク質キナーゼC基質タンパク質(MARCKS)からもたらされた、ペプチドAc−FKKSFKL−NH2(配列番号15)である。このペプチドの酵素のKmは、約50μMである。他の基本的な、当該技術分野で公知のタンパク質キナーゼC選択的ペプチドも、それらのKmの少なくとも2〜3倍の濃度で用いられ得る。アッセイに必要とされる補因子は、カルシウム、マグネシウム、ATP、ホスファチジルセリンおよびジアシルグリセロールを含む。使用者の意図に依存して、アッセイは、存在するPKCの量(活性化条件)または存在する活性なPCKの量(非活性化条件)を決定するために行われ得る。本発明による大抵の目的のため、活性化され得るPKCを測定するよりむしろ、試料が単離されたときの、試料における活性なPKCが測定されるように、非活性化条件が用いられる。非活性化条件のため、カルシウムは、EGTAに都合のよいアッセイにおいて取り除かれる。
アッセイは、20mM HEPES pH7.4、1〜2mM DTT、5mM MgCl2、100μM ATP、約1μCi γ−32P−ATP、100μg/ml ペプチド基質(約100μM)、140μM/3.8μM ホスファチジルセリン/ジアシルグリセロール膜、および100μM カルシウム(または最も好ましくは、500μM EGTA)を含有する混合物において行われる。20mM HEPES pH7.4、2mM DTTに希釈された試料48μlが、80μlの終反応体積において用いられる。反応は、30℃で5〜10分間行われ、続いて、100mM ATPおよび100mM EDTAを含有する、pH値8.0の溶液25μlが添加されて、反応を停止させる。
反応を停止させた後、それぞれの反応液の一部(85μl)が、Whatman P81リン酸セルロース濾紙にスポットされ、続いて、0.4% リン酸500mlで4回(1回の洗浄当たり5〜10分)、および95% EtOH500mlで2〜5分間最後に洗浄される。結合した放射能が、シンチレーション測定により測定される。標識されたATPの特異的活性(cpm/nmol)が、反応試料をP81紙にスポットし、洗浄することなくカウントすることにより、決定される。1分間当たりに移動したnmolのリン酸塩として定義されたPKC活性の単位は、以下の通り計算される:
単位活性(nmol/min)
=__(紙上のcpm)×(計105μl/スポットの85μl)__
(アッセイ時間、分)(ATPの特異的活性cpm/nmol)
代替アッセイは、PanVeraにより販売されるProtein Kinase C Assay Kit(カタログ番号P2747)を用いて行われ得る。
アッセイは、候補モジュレーターありまたはなしのカルボン酸で処置されたかまたは処理されていない、ORポリペプチドを発現する細胞由来の抽出物において行われる。対照反応は、幾つかの候補モジュレーターの可能性のある非特異的作用を排除するために、偽遺伝子導入細胞、またはそれに由来する抽出物を用いて行われるべきである。
本発明によると、上述のいずれかのアッセイにより測定されたPKCの単位が、候補モジュレーターで処理されていない細胞由来の同様の試料において行われた反応と比較して、ORを発現し、候補モジュレーターで処理された細胞由来の抽出物において、少なくとも10%増大するか、または低減するとき、PKC活性は、候補モジュレーターにより「変化」する。
f.PKA活性化アッセイ
PKA活性は、市販の幾つかのキットのいずれか、例えば、molecular device IMAP PKA assay kit、またはpromega ProFluor PKA assay kitを用いてアッセイされ得る。
アッセイは、候補モジュレーターありまたはなしのカルボン酸で処理されたかまたは処理されていない、ORを発現する細胞または細胞の抽出物を用いて行われるべきである。対照反応は、幾つかの候補モジュレーターの可能性のある非特異的作用を排除するために、偽遺伝子導入細胞、またはそれに由来する抽出物を用いて行われるべきである。
活性のレベルが、候補モジュレーターで処理されていない同様の細胞由来の試料におけるPKAキナーゼ活性と比較して、候補モジュレーターで処理された、ORポリペプチドを発現する細胞由来の試料において10%以上増大または低減するなら、PKA活性は「変化」する。
g.キナーゼアッセイ:
MAPキナーゼ活性は、市販の幾つかのキットのいずれか、例えば、New England Biolabs(カタログ番号9820)により販売されるp38 MAP Kinase assay kitまたはPerkin−Elmer Life Sciences により販売されるFlashPlate(商標) MAP キナーゼアッセイを用いてアッセイされ得る。
アッセイは、候補モジュレーターありまたはなしのカルボン酸で処理されたかまたは処理されていない、ORを発現する細胞または細胞の抽出物を用いて行われるべきである。対照反応は、幾つかの候補モジュレーターの可能性のある非特異的作用を排除するために、偽遺伝子導入細胞、またはそれに由来する抽出物を用いて行われるべきである。
活性のレベルが、候補モジュレーターで処理されていない同様の細胞由来の試料におけるMAPキナーゼ活性と比較して、候補モジュレーターで処理された、ORポリペプチドを発現する細胞由来の試料において10%以上増大または低減すれば、MAPキナーゼ活性は「変化」する。
公知の合成または天然のチロシンキナーゼ基質および標識されたリン酸塩を用いた、チロシンキナーゼ活性についての直接的アッセイが周知であり、他の種類のキナーゼ(例えば、Ser/Thrキナーゼ)についての類似のアッセイである。キナーゼアッセイは、候補モジュレーターありまたはなしのカルボン酸で処理されたか、または処理されていない、ORポリペプチドを発現する細胞から調製された、精製キナーゼと粗抽出物両方で行われ得る。対照反応は、幾つかの候補モジュレーターの可能性のある非特異的作用を排除するために、偽遺伝子導入細胞、またはそれに由来する抽出物を用いて行われるべきである。基質は、完全長タンパク質または基質を表す合成ペプチドのいずれかであり得る。Pinna & Ruzzene(1996, Biochem. Biophys. Acta 1314: 191−225、これは、ここで引用により組み込まれる)は、キナーゼ活性を測定するのに有用な多数のリン酸化基質部位を挙げる。多数のキナーゼ基質ペプチドは市販されている。特に有用である1つは、多くの受容体および非受容体チロシンキナーゼの基質である、「Src−related peptide」(RRLIEDAEYAARG(配列番号16)、Sigma # A7433から入手可能)である。後述のアッセイは、ペプチド基質の濾紙への結合を必要としないので、ペプチド基質は、結合を促進するために、網状の正の帯電を有するべきである。一般に、ペプチド基質は、少なくとも2つの塩基性残基およびフリーのアミノ末端を有するべきである。反応は、0.7〜1.5mMのペプチド濃度を一般的に使用する。
アッセイは、5×キナーゼ緩衝液(5mg/mL BSA、150mM Tris−Cl(pH7.5)、100mM MgCl2、アッセイされる正確なキナーゼに依存して、MnCl2が、MgCl2の代わりにまたはこれに加えて用いられ得る)5μl、1.0mM ATP(終濃度0.2mM)5μl、ガンマ−32P−ATP(100〜500cpm/pmol)、10mM ペプチド基質(終濃度1.2mM)3μl、試験されるべきキナーゼを含有する細胞抽出物(キナーゼアッセイのため用いられる細胞抽出物は、ホスファターゼ阻害剤(例えば、0.1〜1mM オルトバナジン酸ナトリウム)を含有するべきである)、および25μlまでの量のH2Oを含む体積25μlにおいて一般的に行われる。反応は30℃で行われ、細胞抽出物の添加により開始される。
キナーゼ反応は30秒〜約30分間行われ、続いて、10% 氷冷トリクロロ酢酸(TCA)45μlが加えられる。試料を、微量遠心機において2分間回転させ、上清35μlが、Whatman P81リン酸セルロース濾紙サークルにスポットされる。濾紙は、0.5% 冷リン酸500mlで3回洗浄され、続いて、アセトン200ml、室温で5分間、1回洗浄される。濾紙を乾燥させ、取り込まれた32Pが、シンチレーション測定により測定される。キナーゼ反応におけるATPの特異的活性(例えば、cpm/pmol)は、反応物の小さな試料(2〜5μl)をP81濾紙サークルにスポットし、洗浄することなく直接カウントすることにより、決定される。次に、キナーゼ反応で得られた1分間当たりのカウント(ブランクを引く)は、反応において移動されたリン酸塩のモル数を決定するための特異的活動により割られる。
アッセイは、候補モジュレーターありまたはなしのカルボン酸で処理されたかまたは処理されていない、ORを発現する細胞または細胞の抽出物を用いて行われるべきである。対照反応は、幾つかの候補モジュレーターの可能性のある非特異的作用を排除するために、偽遺伝子導入細胞、またはそれに由来する抽出物を用いて行われるべきである。
キナーゼ活性のレベルが、候補モジュレーターで処理されていない同様の細胞由来の試料におけるキナーゼ活性と比較して、候補モジュレーターで処理された、ORポリペプチドを発現する細胞由来の試料において10%以上増大または低減するなら、チロシンキナーゼ活性は「変化」する。
h.下流経路の活性化のための転写レポーター:
モジュレーターの受容体、例えば、本発明のORポリペプチドへの結合により開始される細胞内シグナルは、挙動に細胞内事象のカスケードを設定し、その最終結果は、1つ以上の遺伝子の転写および/または翻訳の迅速かつ検出可能な変化である。それ故、受容体の活性は、OR活性化に応答した制御配列によりもたらされたレポーター遺伝子の発現を測定することにより、モニターされ得る。
ここで用いられる場合、「プロモーター」は、基礎プロモーターのみでなく、受容体により制御される発現に必要な任意のエンハンサーまたは転写因子結合部位を含む、遺伝子の発現の受容体により仲介される制御に必要な転写制御エレメントを指す。アゴニスト結合から生じた細胞内シグナルに応答するプロモーター、および転写、翻訳または最終活性が、容易に検出可能かつ測定可能であるレポーター遺伝子への選択されたプロモーターの作動可能な結合を選択することにより、転写に基づくレポーターアッセイは、所定の受容体が活性化されるかどうかの迅速な指標を提供する。
レポーター遺伝子、例えば、ルシフェラーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ(CAT)、緑色蛍光タンパク質(GFP)、ベータ−ラクタマーゼまたはベータ−ガラクトシダーゼが、当該技術分野で周知であり、それらの産物物の検出のためのアッセイである。
受容体活性のモニターに特に十分に適した遺伝子は、一般的に、受容体とエフェクタータンパク質またはリガンドとの間の接触の数分内に迅速に誘導される、「最初期」遺伝子である。最初期遺伝子転写の誘導は、新規制御タンパク質の合成を必要としない。リガンド結合への迅速な応答に加えて、レポーター構築物を作るのに有用な好ましい遺伝子の特性決定は、静止状態の細胞における低発現または検出可能でない発現、一過性であり、新規タンパク質合成に依存した誘導、それに続き、転写を止めるのに新規タンパク質合成を必要とすること、およびこれらの遺伝子から転写されたmRNAsが短い半減期を有することを含む。転写制御エレメントが、それが有用であるために、これらの特性の全てを有することは必要ではないが、好ましい。
OR活性をカルボン酸に応答する転写レポーター構築物でアッセイするために、ORポリペプチドを安定的に発現する細胞が、レポーター構築物で安定的に遺伝子導入される。アゴニストについてスクリーニングするために、処理されていない細胞が、候補モジュレーターに暴露されるか、またはカルボン酸に暴露され、レポーターの発現が測定される。カルボン酸で処理された培養物は、公知のアゴニストにより誘導される転写のレベルの基準として働く。任意のモジュレーターの不存在下でのレポーター発現と比較した、候補モジュレーターの存在下でのレポーター発現の少なくとも10%の増大は、候補がOR活性のモジュレーターであることを示す。アゴニストは、カルボン酸と少なくとも等しいか、好ましくは、同量またはよりレポーター発現を誘導することになる。部分的アゴニストは、カルボン酸と比較して、受容体を活性化しなくてもよい。このアプローチはまた、インバースアンタゴニストについてスクリーニングするために用いられ、ここで、細胞は、カルボン酸または他のアゴニストの不存在下でのレポーターの上昇した基礎活性が存在するレベルで、ORポリペプチドを発現する。候補モジュレーターの非存在と比較した、候補モジュレーターの存在下での10%以上のレポーター活性の低減は、化合物がインバースアゴニストであることを示す。
アンタゴニストについてスクリーニングするために、ORを発現する細胞およびレポーター構築物を有する細胞は、候補モジュレーターの存在および不存在下で、カルボン酸(または別のアゴニスト)に暴露される。候補モジュレーターの不存在下と比較した、候補モジュレーターの存在下でのレポーターの10%以上の低減は、候補がOR活性のアンタゴニストであることを示す。
転写アッセイのための対照は、本発明のORを発現しないが、レポーター構築物を有する細胞、およびプロモーターを有し、レポーター構築物のない細胞を含む。ORにより制御される転写のモジュレーターとして同定された化合物は、それらの活性の特異性およびスペクトルを決定するために、それらが、他の制御配列により、および他の受容体によりもたらされる転写に影響するかどうかを決定するために分析される。
転写レポーターアッセイ、および大抵の細胞に基づくアッセイは、OR活性を調節するものについての化学化合物の化学ライブラリーをスクリーニングするために十分に適している。ライブラリーは、例えば、天然供給源、例えば、植物、動物、細菌など由来のライブラリーであり得る。
本発明により有用な候補モジュレーター
候補モジュレーターは、合成または天然の化合物の巨大なライブラリーからスクリーニングされ得る。多数の手段が、種々の種類の化合物の無作為および方向付けた合成のため、現在用いられる。合成化合物ライブラリーは、例えば、Maybridge Chemical Co.(Trevillet、Cornwall、UK)、Comgenex(Princeton、NJ)、Brandon Associates(Merrimack, NH)、およびMicrosource(New Milford、CT)を含む、多数の会社から市販されている。稀な化学ライブラリーは、Aldrich(Milwaukee、WI)から入手可能である。小有機分子の組合せライブラリーは、利用可能であり、調製され得る。あるいは、細菌、真菌、植物、および動物抽出物の形態の天然化合物のライブラリーが、例えば、Pan Laboratories(Bothell、WA)またはMycoSearch(NC)から入手可能であり、あるいは当該技術分野で周知の方法により容易に生産可能である。加えて、天然および合成的に産生されたライブラリーおよび化合物が、従来の化学、物理、および生化学的手段を通じて、容易に修飾される。
[実施例]
本発明を、以下の非限定的な例によりさらに説明する。
実験の方法:
細胞培養および細胞株生成
細胞を、10% ウシ胎児血清(M10)を含有する基礎培地(EMEM、Lonza)において維持した。Lipofectamine 2000を用いて、HEK293Tをシャペロンタンパク質RTP1A1およびRTP2およびピューロマイシンに対する耐性遺伝子の配列を含有する発現ベクターで形質転換することにより、HEK293T−RTP1A1/RTP2細胞を生成した。10μg/ml ピューロマイシンを培養培地に添加することにより、組換え細胞集団を選択した。限界希釈方法により、モノクローナルな集団をさらに得た。簡単に言うと、1ml当たり1個の細胞を含有するように細胞懸濁液を希釈し、この希釈液をポリ−D−リジンでコーティングした96ウェルプレートに入れた(1ウェル当たり希釈液200μl)。5日間培養後、1ウェル毎の細胞コロニーの存在および数を位相差顕微鏡下でチェックした。さらに5日間培養後、細胞を含有する単一コロニーを回収し、それぞれの回収した集団を独立して増幅させた。
匂い物質分子希釈
匂い物質分子を、1mol/L(M)の濃度でジメチルスルホキシド(DMSO)に希釈して、ストック溶液を生成した。
スクリーニング実験のため、匂い物質分子のストック溶液を96ウェルプレートに配置したEMEMに希釈した。2mMの濃度、632μMの濃度、および200μMの濃度で試験する分子(1分子/ウェル)を含有するプレートを調製した。
濃度応答性分析のため、96ウェルプレートに置いたEMEM中のストック溶液から試験する分子の連続希釈液を調製した。
ルシフェラーゼアッセイ
最初の脱オーファン化スクリーニングおよび用量応答性分析のため、ルシフェラーゼに基づく遺伝子レポーターアッセイ(Promega、Leiden、The Nederlands)を、Saitoら(2004)に記載される通り、用いた。簡単に言うと、ポリ−D−リジンでコーティングした96ウェルプレート(BD Bioscience、Erembodegem−Dorp、Belgium)に細胞を播種し、CREルシフェラーゼを含有するプラスミドおよび嗅覚受容体を含有するプラスミドで遺伝子導入した。遺伝子導入の16時間後、培養培地を、決定した濃度の試験するリガンドを含有する血清を含まないEMEMにより置き換えた。37℃で4時間のインキュベーション後、細胞を溶解し、製造元のプロトコールに従い、発光測定を進めた。発光の放出をSpectra Max M5 reader(Molecular Devices、Sunnyvale、CA)にて記録した。結果を、アデニル酸シクラーゼ活性化因子Forskolin 10μMにより誘導される応答の割合として表した。
例1:匂い物質分子ライブラリーのスクリーニング
カルボン酸および他の種類の分子を含有する匂い物質分子ライブラリーを用いて、本発明の7つのORの活性化因子を同定した。7つの嗅覚受容体において、一連の148個の匂い物質分子で脱オーファン化キャンペーンを行った。汗に存在する16個のカルボン酸を、148個の試験する匂い物質と共にインキュベートした。黒色の四角は、受容体の1つの匂い物質分子に対する応答に対応する。カルボン酸に対応する表の部分を太く囲った。7つの試験したクラス1受容体は、全て、カルボン酸に特異的かつ独占的に応答した。
それぞれの分子を、3つの異なる濃度(1mM、316μM、100μM)で試験した。試験するライブラリーの異なる分子を、同一濃度で、目的の受容体を発現する細胞を含有する96ウェルプレート(1ウェル/分子)に配置した。上で説明したルシフェラーゼ活性を用いて、試験する分子の活性を測定した。試験する分子により誘導されるルシフェラーゼ活性の中央値、および付随する標準偏差を決定した。推定活性分子(ヒット)を、中央値+2標準偏差より高いか、または同等のルシフェラーゼ活性を含む分子として定義した。
表2は、この脱オーファン化の結果を要約する。それぞれのOR活性化分子対を、受容体に対応する列と分子に対応する行の交差において黒色の四角により示す。結果は、本発明の7つのORが、ヒトの汗に存在するカルボン酸により活性化されることを明確に示す。
本発明の7つのORを、カルボン酸を含有しない異なる分子ライブラリーを試験することを目的とする、巨大スクリーニングキャンペーンにさらに含めた。上述の通り、これらのスクリーニングを行った。合計823個の分子を、OR52L1、OR52E8、OR51I2、OR52A5およびOR56A5にて試験した。合計592個の分子をOR52B2にて試験し、合計777個の分子をOR52E1にて試験した。試験した分子の完全なリストを表3において示す。分子の全てが、本発明の7つのORのいずれにおいてもヒットを示さなかった。この結果は、本発明の7つのORのカルボン酸リガンドに対する非常に高い選択性を確かにする。
故に、クラス1由来の7つの試験したOR(本発明のOR、すなわち、OR52L1、OR52E8、OR52B2、OR51I2、OR52E1、OR52A5およびOR56A5に対応する)が、カルボン酸に特異的かつ独占的に応答することを見出した。
例2:リガンドとORの相互作用の用量応答性分析
濃度応答性分析によりヒットを評価した。上述のルシフェラーゼアッセイを用いて、1mM〜316nMのヒット分子の片対数連続希釈を対応するORにて試験した。
結果を表2に示す。完全な結果を図2A〜Gに示す。
本発明者らは、試験した7つのORのそれぞれが、カルボキシル機能を含有する少なくとも1つの分子に応答したことを観察した。これらの活性化因子の、ヒトの汗において生じる公知のカルボン酸との注意深い比較により、受容体のそれぞれが、汗において放出された少なくとも1つのカルボン酸に対応することが明らかになった。これらの酸の幾つか、例えば、ヘキサン酸、3−メチルヘキサン酸、(E)−3−メチル−2−ヘキセン酸、3−ヒドロキシ−3−メチルヘキサン酸、ヘプタン酸、オクタン酸、4−エチルオクタン酸(Zeng et al. 1991; J. Chem. Ecolog. Vol. 17 pp 1469−1492、 Natsch et al. 2006 Chem. & Biodiv. Vol. 3 pp 1−20)は、ヒトの汗の悪臭の重要なプロモーターであることが公知である。
故に、本発明のこれらの7つのORは、カルボン酸により誘発される汗の悪臭の知覚に関与し、悪臭の知覚をブロックするアンタゴニストおよび/またはブロッカーの同定のための価値ある候補受容体を構成する。
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故に、本発明のこれらの7つのORは、カルボン酸により誘発される汗の悪臭の知覚に関与し、悪臭の知覚をブロックするアンタゴニストおよび/またはブロッカーの同定のための価値ある候補受容体を構成する。
以下に、当初の特許請求の範囲に記載していた発明を付記する。
[1]
OR52L1、OR52E8、OR52B2、OR51I2、OR52E1、OR52A5およびOR56A5からなる群より選択される1つ以上の嗅覚受容体(OR)の機能を調節する剤を同定する方法であって、
a)前記1つ以上のORを、ブタン酸、イソ吉草酸、ペンタン酸、ヘキサン酸、2−メチルヘキサン酸、3−メチルヘキサン酸、(E)−3−メチル−2−ヘキセン酸、3−ヒドロキシ−3−メチルヘキサン酸、ヘプタン酸、2−メチルヘプタン酸、オクタン酸、4−エチルオクタン酸、ノナン酸、デカン酸、ウンデカン酸および安息香酸からなる群より選択される1つ以上のカルボン酸と、前記剤の存在下および不存在下で、前記カルボン酸の前記ORへの結合を可能にするか、または前記ORの前記カルボン酸による活性化を可能にする条件下で接触させる工程、
b)前記剤の存在下および不存在下での前記1つ以上のORの前記1つ以上のカルボン酸への結合または前記1つ以上のORの活性を比較する工程であって、ここで、剤の不存在下での結合または活性と比較した、前記剤の存在下での結合または活性の差が、前記1つ以上のカルボン酸に応答して前記1つ以上のORの機能を調節する剤としての剤を同定する工程、
を含む方法。
[2]
前記剤を、前記カルボン酸のここで挙げた全7つのORへの結合への影響、またはここで挙げた全7つのORの前記カルボン酸による活性化への影響について試験する、[1]に記載の方法。
[3]
前記剤を、前記カルボン酸のOR52L1、OR52E8、OR52B2、OR52E1、OR52A5およびOR56A5からなる6つのORの群の全メンバーへの結合への影響、またはここで挙げた全6つのORの前記カルボン酸による活性化への影響について試験する、[1]に記載の方法。
[4]
前記剤を、ペンタン酸のOR52L1への結合への影響、またはOR52L1のペンタン酸による活性化への影響について試験する、[1]に記載の方法。
[5]
前記剤を、3−ヒドロキシ−3−メチルヘキサン酸のOR52E8への結合への影響、またはOR52E8の3−ヒドロキシ−3−メチルヘキサン酸による活性化への影響について試験する、[1]に記載の方法。
[6]
前記剤を、ヘキサン酸、ヘプタン酸、オクタン酸、ノナン酸、デカン酸、もしくはウンデカン酸のOR52B2への結合への影響、またはOR52B2のヘキサン酸、ヘプタン酸、オクタン酸、ノナン酸、デカン酸、もしくはウンデカン酸による活性化への影響について試験する、[1]に記載の方法。
[7]
前記剤を、ブタン酸、イソ吉草酸、ペンタン酸、ヘキサン酸、2−メチルヘキサン酸、3−メチルヘキサン酸、(E)−3−メチル−2−ヘキサン酸、もしくは安息香酸のOR51I2への結合への影響、またはOR51I2のブタン酸、イソ吉草酸、ペンタン酸、ヘキサン酸、2−メチルヘキサン酸、3−メチルヘキサン酸、(E)−3−メチル−2−ヘキサン酸、もしくは安息香酸による活性化への影響について試験する、[1]に記載の方法。
[8]
前記剤を、ブタン酸のOR52E1への結合への影響、またはOR52E1のブタン酸による活性化への影響について試験する、[1]に記載の方法。
[9]
前記剤を、4−エチルオクタン酸のOR52A5への結合への影響、またはOR52A5の4−エチルオクタン酸による活性化への影響について試験する、[1]に記載の方法。
[10]
前記剤を、ヘキサン酸、ヘプタン酸、2−メチルヘプタン酸、オクタン酸、ノナン酸、デカン酸、もしくはウンデカン酸のOR56A5への結合への影響、またはOR56A5のヘキサン酸、ヘプタン酸、2−メチルヘプタン酸、オクタン酸、ノナン酸、デカン酸、もしくはウンデカン酸による活性化への影響について試験する、[1]に記載の方法。
[11]
前記1つ以上のORポリペプチドを、配列番号2、4、6、8、10、12または14のアミノ酸配列により定義する、[1]または[2]に記載の方法。
[12]
前記1つ以上のORポリペプチドを、配列番号2、4、6、10、12または14のアミノ酸配列により定義する、[1]または[3]に記載の方法。
[13]
前記1つ以上のカルボン酸を、ラジオアイソトープ、フルオロフォア、および蛍光のクエンチャーを含む群より選択される部分で検出可能に標識してもよい、[1]から[12]のいずれか1に記載の方法。
[14]
試料におけるヒトの汗に存在するカルボン酸を検出する1つ以上のORの活性を調節する剤の存在を検出するために用いる、[1]から[13]のいずれか1に記載の方法。
[15]
前記剤が試料に存在する、[1]から[14]のいずれか1に記載の方法。
[16]
前記1つ以上のORポリペプチドを、前記1つ以上のカルボン酸とそのEC 50 濃度で接触させる、[1]から[15]のいずれか1に記載の方法。
[17]
前記剤が、前記カルボン酸により誘導される細胞内応答を少なくとも10%低減するとき、前記剤を本発明によるORの機能を調節する剤として同定する、[1]から[16]のいずれか1に記載の方法。
[18]
前記接触を、前記ORポリペプチドを発現する細胞内または上で行う、[1]から[17]のいずれか1に記載の方法。
[19]
前記細胞を、ヒト胎児由来腎臓細胞(Hek293)、チャイニーズハムスター細胞(CHO)、サル細胞(COS)、一次嗅覚細胞、ツメガエル細胞、昆虫細胞、酵母または細菌から選択してもよい、[18]に記載の方法。
[20]
前記接触を、ORポリペプチドを含有する合成リポソームまたはウイルスにより誘導される出芽膜内または上で行う、[1]から[17]のいずれか1に記載の方法。
[21]
前記方法を、前記ORポリペプチドを発現する細胞由来の膜分画を用いて行う、[1]から[17]のいずれか1に記載の方法。
[22]
前記方法を、タンパク質チップ上で行う、[1]から[17]のいずれか1に記載の方法。
[23]
前記測定を、標識置換、表面プラズモン共鳴、蛍光共鳴エネルギー移動、蛍光クエンチング、および蛍光偏光から選択する方法を用いて行う、[1]から[17]のいずれか1に記載の方法。
[24]
前記剤を、ペプチド、ポリペプチド、抗体またはその抗原結合フラグメント、脂質、炭水化物、核酸、および小有機分子からなる群より選択する、[1]から[23]のいずれか1に記載の方法。
[25]
前記ORのシグナル伝達活性を測定する前記工程が、第2のメッセンジャーのレベルの変化を検出することを含む、[1]から[24]のいずれか1に記載の方法。
[26]
前記ORのシグナル伝達活性を測定する前記工程が、グアニンヌクレオチド結合/架橋または交換、アデニル酸シクラーゼ活性、cAMP、タンパク質キナーゼC活性、タンパク質キナーゼA活性、ホスファチジルイノシトール分解、ジアシルグリセロール、イノシトール三リン酸、細胞内カルシウム、カルシウム流動、アラキドン酸、MAPキナーゼ活性、チロシンキナーゼ活性、メラノフォアアッセイ、受容体初期化アッセイ、またはレポーター遺伝子発現の測定を含む、[1]から[25]のいずれか1に記載の方法。
[27]
前記ORのシグナル伝達活性を測定する前記工程が、蛍光または発光アッセイを用いることを含む、[1]から[25]のいずれか1に記載の方法。
[28]
前記蛍光および発光アッセイが、fluo3、Fluo4またはFura、Ca3−kit familyまたはエクオリンを含むCa 2+ 感受性フルオロフォアの使用を含む、[27]に記載の方法。
[29]
前記アッセイが、自動蛍光定量的または発光リーダー、例えば、FDSSまたはFLIPRを適用してもよい、[28]に記載の方法。
[30]
ハイスループットスクリーニング方法である、[1]から[29]のいずれか1に記載の方法。
[31]
前記剤が、化学物質ライブラリーまたは動物の器官抽出物の一部である、[1]から[30]のいずれか1に記載の方法。
[32]
[1]から[31]のいずれか1に記載の方法を用いて同定した剤の対象への投与を含む、汗の悪臭を弱める方法
[33]
[1]から[31]のいずれか1に記載の方法を用いて同定した剤を含む、デオドラント、芳香または香料製剤。
[34]
ヒトの汗に存在するカルボン酸を検出する嗅覚受容体(OR)のモジュレーターのスクリーニング方法を行うためのキットであって、
a)単離ORポリペプチド:OR52L1、OR52E8、OR52B2、OR51I2、OR52E1、OR52A5およびOR56A5、
b)ブタン酸、イソ吉草酸、ペンタン酸、ヘキサン酸、2−メチルヘキサン酸、3−メチルヘキサン酸、(E)−3−メチル−2−ヘキセン酸、3−ヒドロキシ−3−メチルヘキサン酸、ヘプタン酸、2−メチルヘプタン酸、オクタン酸、4−エチルオクタン酸、ノナン酸、デカン酸、ウンデカン酸および安息香酸からなる群より選択する1つ以上のカルボン酸、ならびに
c)それらのための包装材料
を含む、キット。
[35]
ヒトの汗に存在するカルボン酸を検出する嗅覚受容体(OR)のモジュレーターのスクリーニング方法を行うためのキットであって、
a)単離ORポリペプチド:OR52L1、OR52E8、OR52B2、OR52E1、OR52A5およびOR56A5、
b)ブタン酸、イソ吉草酸、ペンタン酸、ヘキサン酸、2−メチルヘキサン酸、3−メチルヘキサン酸、(E)−3−メチル−2−ヘキセン酸、3−ヒドロキシ−3−メチルヘキサン酸、ヘプタン酸、2−メチルヘプタン酸、オクタン酸、4−エチルオクタン酸、ノナン酸、デカン酸、ウンデカン酸および安息香酸からなる群より選択する1つ以上のカルボン酸、ならびに
c)それらのための包装材料
を含む、キット。
[36]
ヒトの汗に存在するカルボン酸を検出する嗅覚受容体(OR)のモジュレーターのスクリーニング方法を行うためのキットであって、
a)ORポリペプチド:OR52L1、OR52E8、OR52B2、OR51I2、OR52E1、OR52A5およびOR56A5をコードする単離ポリヌクレオチド、
b)ブタン酸、イソ吉草酸、ペンタン酸、ヘキサン酸、2−メチルヘキサン酸、3−メチルヘキサン酸、(E)−3−メチル−2−ヘキセン酸、3−ヒドロキシ−3−メチルヘキサン酸、ヘプタン酸、2−メチルヘプタン酸、オクタン酸、4−エチルオクタン酸、ノナン酸、デカン酸、ウンデカン酸および安息香酸からなる群より選択するカルボン酸、ならびに
c)それらのための包装材料
を含む、キット。
[37]
ヒトの汗に存在するカルボン酸を検出する嗅覚受容体(OR)のモジュレーターのスクリーニング方法を行うためのキットであって、
a)ORポリペプチド:OR52L1、OR52E8、OR52B2、OR52E1、OR52A5およびOR56A5をコードする単離ポリヌクレオチド、
b)ブタン酸、イソ吉草酸、ペンタン酸、ヘキサン酸、2−メチルヘキサン酸、3−メチルヘキサン酸、(E)−3−メチル−2−ヘキセン酸、3−ヒドロキシ−3−メチルヘキサン酸、ヘプタン酸、2−メチルヘプタン酸、オクタン酸、4−エチルオクタン酸、ノナン酸、デカン酸、ウンデカン酸および安息香酸からなる群より選択するカルボン酸、ならびに
c)それらのための包装材料
を含む、キット。
[38]
ヒトの汗に存在するカルボン酸を検出する嗅覚受容体(OR)のモジュレーターのスクリーニング方法を行うためのキットであって、
a)ORポリペプチドOR52L1、OR52E8、OR52B2、OR51I2、OR52E1、OR52A5およびOR56A5の1つ以上を発現する細胞、幾つかの細胞またはその膜、
b)ブタン酸、イソ吉草酸、ペンタン酸、ヘキサン酸、2−メチルヘキサン酸、3−メチルヘキサン酸、(E)−3−メチル−2−ヘキセン酸、3−ヒドロキシ−3−メチルヘキサン酸、ヘプタン酸、2−メチルヘプタン酸、オクタン酸、4−エチルオクタン酸、ノナン酸、デカン酸、ウンデカン酸および安息香酸からなる群より選択するカルボン酸、ならびに
c)それらのための包装材料
を含む、キット。
[39]
ヒトの汗に存在するカルボン酸を検出する嗅覚受容体(OR)のモジュレーターのスクリーニング方法を行うためのキットであって、
a)ORポリペプチドOR52L1、OR52E8、OR52B2、OR52E1、OR52A5およびOR56A5の1つ以上を発現する細胞、幾つかの細胞またはその膜、
b)ブタン酸、イソ吉草酸、ペンタン酸、ヘキサン酸、2−メチルヘキサン酸、3−メチルヘキサン酸、(E)−3−メチル−2−ヘキセン酸、3−ヒドロキシ−3−メチルヘキサン酸、ヘプタン酸、2−メチルヘプタン酸、オクタン酸、4−エチルオクタン酸、ノナン酸、デカン酸、ウンデカン酸および安息香酸からなる群より選択するカルボン酸、ならびに
c)それらのための包装材料
を含む、キット。
[40]
前記細胞が、前記1つ以上のORをコードするポリヌクレオチドで形質転換された、[39]に記載のキット。
[41]
ブタン酸、イソ吉草酸、ペンタン酸、ヘキサン酸、2−メチルヘキサン酸、3−メチルヘキサン酸、(E)−3−メチル−2−ヘキセン酸、3−ヒドロキシ−3−メチルヘキサン酸、ヘプタン酸、2−メチルヘプタン酸、オクタン酸、4−エチルオクタン酸、ノナン酸、デカン酸、ウンデカン酸および安息香酸からなる群より選択するカルボン酸、ならびにOR52L1、OR52E8、OR52B2、OR51I2、OR52E1、OR52A5およびOR56A5からなる群より選択する1つ以上のORポリペプチドにより形成される複合体を認識する、抗体。
[42]
ブタン酸、イソ吉草酸、ペンタン酸、ヘキサン酸、2−メチルヘキサン酸、3−メチルヘキサン酸、(E)−3−メチル−2−ヘキセン酸、3−ヒドロキシ−3−メチルヘキサン酸、ヘプタン酸、2−メチルヘプタン酸、オクタン酸、4−エチルオクタン酸、ノナン酸、デカン酸、ウンデカン酸および安息香酸からなる群より選択するカルボン酸、ならびにOR52L1、OR52E8、OR52B2、OR52E1、OR52A5およびOR56A5からなる群より選択する1つ以上のORポリペプチドにより形成される複合体を認識する、[41]に記載の抗体。

Claims (42)

  1. OR52L1、OR52E8、OR52B2、OR51I2、OR52E1、OR52A5およびOR56A5からなる群より選択される1つ以上の嗅覚受容体(OR)の機能を調節する剤を同定する方法であって、
    a)前記1つ以上のORを、ブタン酸、イソ吉草酸、ペンタン酸、ヘキサン酸、2−メチルヘキサン酸、3−メチルヘキサン酸、(E)−3−メチル−2−ヘキセン酸、3−ヒドロキシ−3−メチルヘキサン酸、ヘプタン酸、2−メチルヘプタン酸、オクタン酸、4−エチルオクタン酸、ノナン酸、デカン酸、ウンデカン酸および安息香酸からなる群より選択される1つ以上のカルボン酸と、前記剤の存在下および不存在下で、前記カルボン酸の前記ORへの結合を可能にするか、または前記ORの前記カルボン酸による活性化を可能にする条件下で接触させる工程、
    b)前記剤の存在下および不存在下での前記1つ以上のORの前記1つ以上のカルボン酸への結合または前記1つ以上のORの活性を比較する工程であって、ここで、剤の不存在下での結合または活性と比較した、前記剤の存在下での結合または活性の差が、前記1つ以上のカルボン酸に応答して前記1つ以上のORの機能を調節する剤としての剤を同定する工程、
    を含む方法。
  2. 前記剤を、前記カルボン酸のここで挙げた全7つのORへの結合への影響、またはここで挙げた全7つのORの前記カルボン酸による活性化への影響について試験する、請求項1に記載の方法。
  3. 前記剤を、前記カルボン酸のOR52L1、OR52E8、OR52B2、OR52E1、OR52A5およびOR56A5からなる6つのORの群の全メンバーへの結合への影響、またはここで挙げた全6つのORの前記カルボン酸による活性化への影響について試験する、請求項1に記載の方法。
  4. 前記剤を、ペンタン酸のOR52L1への結合への影響、またはOR52L1のペンタン酸による活性化への影響について試験する、請求項1に記載の方法。
  5. 前記剤を、3−ヒドロキシ−3−メチルヘキサン酸のOR52E8への結合への影響、またはOR52E8の3−ヒドロキシ−3−メチルヘキサン酸による活性化への影響について試験する、請求項1に記載の方法。
  6. 前記剤を、ヘキサン酸、ヘプタン酸、オクタン酸、ノナン酸、デカン酸、もしくはウンデカン酸のOR52B2への結合への影響、またはOR52B2のヘキサン酸、ヘプタン酸、オクタン酸、ノナン酸、デカン酸、もしくはウンデカン酸による活性化への影響について試験する、請求項1に記載の方法。
  7. 前記剤を、ブタン酸、イソ吉草酸、ペンタン酸、ヘキサン酸、2−メチルヘキサン酸、3−メチルヘキサン酸、(E)−3−メチル−2−ヘキサン酸、もしくは安息香酸のOR51I2への結合への影響、またはOR51I2のブタン酸、イソ吉草酸、ペンタン酸、ヘキサン酸、2−メチルヘキサン酸、3−メチルヘキサン酸、(E)−3−メチル−2−ヘキサン酸、もしくは安息香酸による活性化への影響について試験する、請求項1に記載の方法。
  8. 前記剤を、ブタン酸のOR52E1への結合への影響、またはOR52E1のブタン酸による活性化への影響について試験する、請求項1に記載の方法。
  9. 前記剤を、4−エチルオクタン酸のOR52A5への結合への影響、またはOR52A5の4−エチルオクタン酸による活性化への影響について試験する、請求項1に記載の方法。
  10. 前記剤を、ヘキサン酸、ヘプタン酸、2−メチルヘプタン酸、オクタン酸、ノナン酸、デカン酸、もしくはウンデカン酸のOR56A5への結合への影響、またはOR56A5のヘキサン酸、ヘプタン酸、2−メチルヘプタン酸、オクタン酸、ノナン酸、デカン酸、もしくはウンデカン酸による活性化への影響について試験する、請求項1に記載の方法。
  11. 前記1つ以上のORポリペプチドを、配列番号2、4、6、8、10、12または14のアミノ酸配列により定義する、請求項1または2に記載の方法。
  12. 前記1つ以上のORポリペプチドを、配列番号2、4、6、10、12または14のアミノ酸配列により定義する、請求項1または3に記載の方法。
  13. 前記1つ以上のカルボン酸を、ラジオアイソトープ、フルオロフォア、および蛍光のクエンチャーを含む群より選択される部分で検出可能に標識してもよい、請求項1から12のいずれか1項に記載の方法。
  14. 試料におけるヒトの汗に存在するカルボン酸を検出する1つ以上のORの活性を調節する剤の存在を検出するために用いる、請求項1から13のいずれか1項に記載の方法。
  15. 前記剤が試料に存在する、請求項1から14のいずれか1項に記載の方法。
  16. 前記1つ以上のORポリペプチドを、前記1つ以上のカルボン酸とそのEC50濃度で接触させる、請求項1から15のいずれか1項に記載の方法。
  17. 前記剤が、前記カルボン酸により誘導される細胞内応答を少なくとも10%低減するとき、前記剤を本発明によるORの機能を調節する剤として同定する、請求項1から16のいずれか1項に記載の方法。
  18. 前記接触を、前記ORポリペプチドを発現する細胞内または上で行う、請求項1から17のいずれか1項に記載の方法。
  19. 前記細胞を、ヒト胎児由来腎臓細胞(Hek293)、チャイニーズハムスター細胞(CHO)、サル細胞(COS)、一次嗅覚細胞、ツメガエル細胞、昆虫細胞、酵母または細菌から選択してもよい、請求項18に記載の方法。
  20. 前記接触を、ORポリペプチドを含有する合成リポソームまたはウイルスにより誘導される出芽膜内または上で行う、請求項1から17のいずれか1項に記載の方法。
  21. 前記方法を、前記ORポリペプチドを発現する細胞由来の膜分画を用いて行う、請求項1から17のいずれか1項に記載の方法。
  22. 前記方法を、タンパク質チップ上で行う、請求項1から17のいずれか1項に記載の方法。
  23. 前記測定を、標識置換、表面プラズモン共鳴、蛍光共鳴エネルギー移動、蛍光クエンチング、および蛍光偏光から選択する方法を用いて行う、請求項1から17のいずれか1項に記載の方法。
  24. 前記剤を、ペプチド、ポリペプチド、抗体またはその抗原結合フラグメント、脂質、炭水化物、核酸、および小有機分子からなる群より選択する、請求項1から23のいずれか1項に記載の方法。
  25. 前記ORのシグナル伝達活性を測定する前記工程が、第2のメッセンジャーのレベルの変化を検出することを含む、請求項1から24のいずれか1項に記載の方法。
  26. 前記ORのシグナル伝達活性を測定する前記工程が、グアニンヌクレオチド結合/架橋または交換、アデニル酸シクラーゼ活性、cAMP、タンパク質キナーゼC活性、タンパク質キナーゼA活性、ホスファチジルイノシトール分解、ジアシルグリセロール、イノシトール三リン酸、細胞内カルシウム、カルシウム流動、アラキドン酸、MAPキナーゼ活性、チロシンキナーゼ活性、メラノフォアアッセイ、受容体初期化アッセイ、またはレポーター遺伝子発現の測定を含む、請求項1から25のいずれか1項に記載の方法。
  27. 前記ORのシグナル伝達活性を測定する前記工程が、蛍光または発光アッセイを用いることを含む、請求項1から25のいずれか1項に記載の方法。
  28. 前記蛍光および発光アッセイが、fluo3、Fluo4またはFura、Ca3−kit familyまたはエクオリンを含むCa2+感受性フルオロフォアの使用を含む、請求項27に記載の方法。
  29. 前記アッセイが、自動蛍光定量的または発光リーダー、例えば、FDSSまたはFLIPRを適用してもよい、請求項28に記載の方法。
  30. ハイスループットスクリーニング方法である、請求項1から29のいずれか1項に記載の方法。
  31. 前記剤が、化学物質ライブラリーまたは動物の器官抽出物の一部である、請求項1から30のいずれか1項に記載の方法。
  32. 請求項1から31のいずれか1項に記載の方法を用いて同定した剤の対象への投与を含む、汗の悪臭を弱める方法
  33. 請求項1から31のいずれか1項に記載の方法を用いて同定した剤を含む、デオドラント、芳香または香料製剤。
  34. ヒトの汗に存在するカルボン酸を検出する嗅覚受容体(OR)のモジュレーターのスクリーニング方法を行うためのキットであって、
    a)単離ORポリペプチド:OR52L1、OR52E8、OR52B2、OR51I2、OR52E1、OR52A5およびOR56A5、
    b)ブタン酸、イソ吉草酸、ペンタン酸、ヘキサン酸、2−メチルヘキサン酸、3−メチルヘキサン酸、(E)−3−メチル−2−ヘキセン酸、3−ヒドロキシ−3−メチルヘキサン酸、ヘプタン酸、2−メチルヘプタン酸、オクタン酸、4−エチルオクタン酸、ノナン酸、デカン酸、ウンデカン酸および安息香酸からなる群より選択する1つ以上のカルボン酸、ならびに
    c)それらのための包装材料
    を含む、キット。
  35. ヒトの汗に存在するカルボン酸を検出する嗅覚受容体(OR)のモジュレーターのスクリーニング方法を行うためのキットであって、
    a)単離ORポリペプチド:OR52L1、OR52E8、OR52B2、OR52E1、OR52A5およびOR56A5、
    b)ブタン酸、イソ吉草酸、ペンタン酸、ヘキサン酸、2−メチルヘキサン酸、3−メチルヘキサン酸、(E)−3−メチル−2−ヘキセン酸、3−ヒドロキシ−3−メチルヘキサン酸、ヘプタン酸、2−メチルヘプタン酸、オクタン酸、4−エチルオクタン酸、ノナン酸、デカン酸、ウンデカン酸および安息香酸からなる群より選択する1つ以上のカルボン酸、ならびに
    c)それらのための包装材料
    を含む、キット。
  36. ヒトの汗に存在するカルボン酸を検出する嗅覚受容体(OR)のモジュレーターのスクリーニング方法を行うためのキットであって、
    a)ORポリペプチド:OR52L1、OR52E8、OR52B2、OR51I2、OR52E1、OR52A5およびOR56A5をコードする単離ポリヌクレオチド、
    b)ブタン酸、イソ吉草酸、ペンタン酸、ヘキサン酸、2−メチルヘキサン酸、3−メチルヘキサン酸、(E)−3−メチル−2−ヘキセン酸、3−ヒドロキシ−3−メチルヘキサン酸、ヘプタン酸、2−メチルヘプタン酸、オクタン酸、4−エチルオクタン酸、ノナン酸、デカン酸、ウンデカン酸および安息香酸からなる群より選択するカルボン酸、ならびに
    c)それらのための包装材料
    を含む、キット。
  37. ヒトの汗に存在するカルボン酸を検出する嗅覚受容体(OR)のモジュレーターのスクリーニング方法を行うためのキットであって、
    a)ORポリペプチド:OR52L1、OR52E8、OR52B2、OR52E1、OR52A5およびOR56A5をコードする単離ポリヌクレオチド、
    b)ブタン酸、イソ吉草酸、ペンタン酸、ヘキサン酸、2−メチルヘキサン酸、3−メチルヘキサン酸、(E)−3−メチル−2−ヘキセン酸、3−ヒドロキシ−3−メチルヘキサン酸、ヘプタン酸、2−メチルヘプタン酸、オクタン酸、4−エチルオクタン酸、ノナン酸、デカン酸、ウンデカン酸および安息香酸からなる群より選択するカルボン酸、ならびに
    c)それらのための包装材料
    を含む、キット。
  38. ヒトの汗に存在するカルボン酸を検出する嗅覚受容体(OR)のモジュレーターのスクリーニング方法を行うためのキットであって、
    a)ORポリペプチドOR52L1、OR52E8、OR52B2、OR51I2、OR52E1、OR52A5およびOR56A5の1つ以上を発現する細胞、幾つかの細胞またはその膜、
    b)ブタン酸、イソ吉草酸、ペンタン酸、ヘキサン酸、2−メチルヘキサン酸、3−メチルヘキサン酸、(E)−3−メチル−2−ヘキセン酸、3−ヒドロキシ−3−メチルヘキサン酸、ヘプタン酸、2−メチルヘプタン酸、オクタン酸、4−エチルオクタン酸、ノナン酸、デカン酸、ウンデカン酸および安息香酸からなる群より選択するカルボン酸、ならびに
    c)それらのための包装材料
    を含む、キット。
  39. ヒトの汗に存在するカルボン酸を検出する嗅覚受容体(OR)のモジュレーターのスクリーニング方法を行うためのキットであって、
    a)ORポリペプチドOR52L1、OR52E8、OR52B2、OR52E1、OR52A5およびOR56A5の1つ以上を発現する細胞、幾つかの細胞またはその膜、
    b)ブタン酸、イソ吉草酸、ペンタン酸、ヘキサン酸、2−メチルヘキサン酸、3−メチルヘキサン酸、(E)−3−メチル−2−ヘキセン酸、3−ヒドロキシ−3−メチルヘキサン酸、ヘプタン酸、2−メチルヘプタン酸、オクタン酸、4−エチルオクタン酸、ノナン酸、デカン酸、ウンデカン酸および安息香酸からなる群より選択するカルボン酸、ならびに
    c)それらのための包装材料
    を含む、キット。
  40. 前記細胞が、前記1つ以上のORをコードするポリヌクレオチドで形質転換された、請求項39に記載のキット。
  41. ブタン酸、イソ吉草酸、ペンタン酸、ヘキサン酸、2−メチルヘキサン酸、3−メチルヘキサン酸、(E)−3−メチル−2−ヘキセン酸、3−ヒドロキシ−3−メチルヘキサン酸、ヘプタン酸、2−メチルヘプタン酸、オクタン酸、4−エチルオクタン酸、ノナン酸、デカン酸、ウンデカン酸および安息香酸からなる群より選択するカルボン酸、ならびにOR52L1、OR52E8、OR52B2、OR51I2、OR52E1、OR52A5およびOR56A5からなる群より選択する1つ以上のORポリペプチドにより形成される複合体を認識する、抗体。
  42. ブタン酸、イソ吉草酸、ペンタン酸、ヘキサン酸、2−メチルヘキサン酸、3−メチルヘキサン酸、(E)−3−メチル−2−ヘキセン酸、3−ヒドロキシ−3−メチルヘキサン酸、ヘプタン酸、2−メチルヘプタン酸、オクタン酸、4−エチルオクタン酸、ノナン酸、デカン酸、ウンデカン酸および安息香酸からなる群より選択するカルボン酸、ならびにOR52L1、OR52E8、OR52B2、OR52E1、OR52A5およびOR56A5からなる群より選択する1つ以上のORポリペプチドにより形成される複合体を認識する、請求項41に記載の抗体。
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