KR20200052189A - Spr 센서를 이용한 세포막단백질-리간드 상호작용의 확인 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 SPR 센서를 이용한 세포막단백질-리간드 상호작용의 확인 방법에 관한 것으로, 더욱 구체적으로는, 표면에 재조합 감각수용체 발현세포가 고정된 SPR 센서를 이용한 감각수용체단백질-리간드 상호작용의 확인방법에 관한 것이다.

Description

SPR 센서를 이용한 세포막단백질-리간드 상호작용의 확인 방법 {Method for identification of cellular membrane-ligand interaction using SPR sensor}

본 발명은 SPR 센서를 이용한 세포막단백질-리간드 상호작용의 확인 방법에 관한 것으로, 더욱 구체적으로는, 표면에 재조합 감각수용체 발현세포가 고정된 SPR 센서를 이용한 감각수용체단백질-리간드 상호작용의 확인방법에 관한 것이다.

인간의 감각 가운데 그 복잡성으로 인하여 가장 알려지지 않은 영역이 후각 분야이며, 특히 후각의 인지는 수많은 후각 신경세포에 의해 발생한 신경신호의 조합에 의해 이루어져 그 메커니즘이 매우 복잡한 것으로 알려져 있다.

특히, 세포막에서 발현되는 막 단백질로 이루어져 그 구조가 매우 복잡하고 이종세포에서의 발현이 극히 어려운 것으로 알려져 있는 후각 수용체(olfactory receptor)는 냄새 물질을 선택적으로 결합하는 단백질로 후각 신경세포 막에 발현되어 있다. 인간은 약 390개의 후각 수용체를 가지고 있으며 냄새물질과 후각 수용체 간의 선택적인 결합에 의해 후각 신경세포에서 후각 신경신호가 발생한다. 이렇게 발생한 후각 신경신호는 인간의 뇌의 한 부분인 후각신경구(olfactory bulb)에 모이고 신호의 조합이 일어나게 되며, 조합된 후각 신경신로를 대뇌에서 인지함으로써 냄새를 인지하게 된다.

이러한 후각수용체는 최근들어 그 기전 및 질병 관련 연구가 시작되고 있으며, 이러한 수용체의 새로운 생리적 역할이 규명됨으로써 그에 따라 수용체를 활용한 신약개발에도 많은 관심이 생겨나고 있다.

한편, 기존에 알려져 있는 감각수용체 기반 전기 센서 연구는 후각수용체 기반 전기 센서, 미각 수용체 기반 전기 센서 등인데, 재현성에 문제가 있으며, 암 탐침에 국한되어 있는 제한점이 있어 왔다.

이에, 식품산업계, 의료 임상계 등에 향후 다방면에 활용가능성이 높은 후각수용체 기반 새로운 센서 시스템의 개발이 절실히 요구된다.

미국공개특허 US 2017/0285009 국제공개특허 WO 2014/191047

본 발명의 목적은 감각수용체 발현세포가 고정된 SPR 센서의 제조방법, 그로부터 얻어진 SPR 센서 및 상기 SPR 센서를 이용한 세포막단백질(감각수용체단백질)-리간드 상호작용의 확인 방법을 제공하는데 있다.

상술한 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 SPR 센서를 이용한 세포막단백질-리간드 상호작용의 확인 방법을 제공한다.

구체적으로, 본 발명은 세포막단백질인 감각수용체 단백질-리간드 상호작용을 확인하기 위한 SPR 센서의 제조방법 및 그로부터 얻어지는 SPR 센서, 그리고 이를 이용한 감각수용체단백질-리간드 상호작용 확인 방법을 제공한다.

본 발명에 따라 제조되는 SPR 센서 제조방법은 감각수용체 발현세포 및 SPR 센서 모두에 알데히드 처리를 함으로써, 세포가 SPR 센서에 잘 고정되게 하고, 이렇게 얻어진 SPR 센서를 이용하여 후각수용체 단백질과 상호작용하는 리간드를 발굴해 낼 수 있어, 식품, 의약품 개발, 유해물질 감별 등 다양한 산업적 활용이 가능하다.

도 1은 본 발명에 따른 후각수용체 발현 세포주 구축을 위해 이용하는 재조합 벡터의 개열 지도를 나타낸 것이다 (pIRES-RTP1-IRES-GST-OR5V1-IRES-puroR).
도 2는 본 발명에 따른 후각수용체 발현 세포주 구축을 위해 이용하는 재조합 벡터의 개열 지도를 나타낸 것이다 (pIRES-RTP1-IRES-GST-OR6M1-IRES-puroR).
도 3은 본 발명에 따라 얻어진 후각수용체 발현 세포에서의 단백질 발현결과를 확인한 이미지이다.
도 4는 본 발명에서 SPR 센서에 표면 개질 과정을 개략적으로 나타낸 그림이다.
도 5는 본 발명에 따른 SPR 센서에서의 프테로스틸벤의 RU 값을 나타낸 결과이다.

다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로, 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.

이하, 구체적으로 본 발명을 설명한다.

본 발명은 일 관점에서, 감각수용체를 발현하는 세포가 고정된 SPR 센서의 제조방법에 관한 것이다.

구체적으로, 본 발명에 따른 방법은, 다음의 과정을 거친다.

(a) 감각수용체를 발현하는 세포 표면에 알데히드기를 도입하는 단계;

(b) 덱스트란이 처리된 SPR(Surface Plasmon Resonance) 센서 표면에 알데히드 커플링 반응을 수행하는 단계; 및

(c) 상기 감각수용체를 발현하는 세포를 상기 센서에 반응시키는 단계;

여기서, 상기 감각수용체는 미각 수용체, 후각 수용체 등 일수 있다.

상기 (a) 단계에서, 감각수용체 발현세포는 알데히드기를 도입한 후 우선 얼음(ice)에 보관하는 것을 특징으로 할 수 있다.

상기 세포에 알데히드기를 도입하는 방법은, 세포에 소듐 아세테이트 (pH 5.5) 및 소듐 피리오데이트를 처리하고, 순차적으로 소듐 아세테이트 (pH 4.0)을 처리하는 방법으로 수행된다.

본 발명에서는, 후각수용체로써 OR6M1, OR5V1, OR1A1, OR51E2, OR6V1 등을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.

본 발명에 있어서, 상기 SPR 센서 표면에 카복시메틸덱스트란(carboxymethyldextran) 하이드로겔을 도포함으로써, 덱스트란을 표면 처리된 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에서 사용되는 용어 “SPR 센서”는 표면 플라즈몬 공명법(Surface Plasmon Resonance; SPR)으로 물질의 농도 등을 측정하는 센서를 의미한다. SPR 법은 형광물질과 같은 별도의 표지물질 없이(label-free) 광학적 원리를 이용하여 분자들 간의 상호작용, 예컨대, 단백질 등 생체물질의 결합친화도 등을 계측할 수 있다. 표면 플라즈몬(surface plasmon)이란 금속 표면과 같은 도체 표면을 따라서 전파하는 자유전자의 양자화 된 진동을 의미하는, 금속에 나타나는 광-전자 효과로서, 특정 파장의 광이 금속에 조사되면 대부분의 광에너지가 자유전자로 전이되는 공명현상이 일어나면서 플라즈몬(표면파)의 90%에 달하는 반사광의 환원과정이 발생하게 되고, 특정부위에서의 결합이 증가할수록 그 파장의 이동이 증가한다. 공명이 일어나는 입사각, 즉 공명각은 금속박막에 근접한 물질의 굴절률 변화에 민감하며, SPR 센서는 이러한 성질을 이용하여 금속박막에 근접한 물질, 즉 시료의 굴절률 변화로부터 시료의 정량 분석이 가능하다.

본 발명에 있어서, 상기 알데히드 커플링 반응은, SPR 센서에 EDC(1-ethyl-3-(3-dimethylamino-propyl)carbodiimide)/NHS (N-hydroxysuccinimide), 하이드라진, 및 에탄올아민을 순서대로 처리하는 것을 특징으로 할 수 있다.

구체적으로, SPR 센서에 있어서 알데히드 커플링(aldehyde coupling) 반응은 도 4에 나타난 바와 같이 최종적으로 SPR 센서 덱스트란에 알데히드기를 도입할 수 있게 한다. 일 예로, SPR 장치에 상기 SPR 센서를 넣고 상기 알데히드 커플링 반응을 수행하는 것 일 수 있다.

이렇게 알데히드 처리된 센서에, 상기 감각수용체를 발현하는 세포를 반응시켜 상기 센서에 고정시킬 수 있다. 이러한 과정은, SPR 장치 내에 포함되어 있는 별도의 다수 유량 셀(flow cell)에서 상기 후각수용체 발현 세포를 고정시키는 것을 포함한다.

본 발명은, 다른 관점에서, 상기 제조방법으로 제조된 감각수용체가 발현된 세포가 고정되어 있는 SPR 센서에 관한 것이다.

본 발명에 따른 SPR 센서는, 더욱 구체적으로 SPR 센서 내 금속 박막칩 표면에 덱스트란 층이 도포되어 있고, 그 표면에 알데히드 커플링 반응을 통하여 알데히드가 도입되어 있으며, 여기에 후각수용체를 발현하는 세포가 고정되어 있는 센서이다.

특히나, 이러한 SPR 센서는 본 기술분야에 널리 알려져 있는 바와 같이, 다수의 유량 셀 (flow cell)을 포함할 수 있으며, 이들 유량 셀 중 하나의 유량 셀에 상기 후각수용체를 발현하는 세포가 고정되어 있는 것을 특징으로 할 수 있다.

아울러, 상기 SPR 센서에 다른 유량 셀에는, 상기 후각수용체가 발현하지 않는 세포를 고정하여 후각수용체 발현 세포가 고정되어 있는 유량 셀과 실험결과를 비교함으로써, 후각수용체에 직접적으로 결합하는 리간드를 확인할 수 있다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예 등을 들어 상세하게 설명하기로 한다. 그러나, 본 발명에 따른 실시예들은 여러 가지 다른 형태로 변형될 수 있으며, 본 발명의 범위가 하기 실시예들에 한정되는 것으로 해석되어서는 안 된다. 본 발명의 실시예들은 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.

실시예 1. 본 발명에 따른 SPR 칩을 이용한 세포막 단백질-리간드 상호작용의 확인

1.1 본 발명에 따른 SPR 칩의 제조

(1) SPR 칩에 고정을 위한 재조합 후각수용체 발현 세포주 구축

후각수용체를 안정적으로 발현하는 세포주 구축을 위해서, mammalian expression 벡터인 pIRES 벡터(Clontech 사 구입)에, 인간 후각수용체 단백질 발현을 위해 샤페론 단백질인 RTP1 (receptor transporter protein1, NP_714919.2 origene사 구입)를 클로닝하여 pIRES-RTP1을 제작하였다.

인간 후각수용체 OR6M1 (NP_001005325, origene사 구입), OR5V1 (NP_110503, origene사 구입) 클론의 ORF 부분을 GST 태깅(tagging) 벡터인 pGEX4T1 (GE사)에 서브클로닝한 후, GST-tag와 함께 기 제작된 pIRES-RTP1에 서브클로닝하였다. 이를 통해, pIRES-RTP1-IRES-GST-OR5V1(or OR6M1)을 구축하였다.

안정적 발현세포주 구축을 위해, 선별 약물 마커(selective drug marker)로 퓨로마이신(puromycine)을 이용하여 스크리닝하고자 하였으며, 이를 위해, 발현벡터에 퓨로마이신 저항 유전자를 가지고 있는 pRIES-puro3 벡터를 이용하였다.

앞서 제작되었던 pIRES-RTP1-IRES-GST-OR5V1에서 제한효소 처리를 통해 RTP1-IRES-GST-OR5V1 부분을 pIRES-puro3 vector (clonetech사)에 서브클로닝하였다. (도 1 및 도 2의 벡터 개열지도 참고)

(2) 안정적 후각수용체 발현 세포주 구축

① 형질전환

Transient transfection (일시적 주입) 효율이 뛰어난 인간 배아 신장 세포인 HEK293t 세포주 (ATCC®CRL-11268™)에 리포펙타민 3000 키트 (invitrogen사)를 이용해, 키트에 공급된 프로토콜에 따라 상기 발현용 클론을 형질전환 시켰다.

② 안정적 세포추 구축을 위한 형질전환 세포 스크리닝

발현 세포주만 스크리닝을 위해 일시적 주입 2일 후에, 퓨로마이신(10ug/ml)을 처리하여 형질전환 세포를 선택하였다. 발현세포를 1세포/웰 농도로 희석하여, 96 웰 수준에서 배양하여, 단일 클론을 선택하여 배양하였다.

③ 안정적 발현 세포주에서 타겟 단백질 발현

안정적 발현 세포주 확인을 위해, 후각수용체 GST 태그를 gst 항체(ab chem사 구입)를 이용하여 면역염색하여 발현양 및 발현 빈도를 확인한 결과, 아래 그림과 같이 균일한 발현을 확인할 수 있었다. 구체적으로, GST 태그된 후각수용체의 안정적 발현을 확인하기 위해서, GST 항체를 이용하여 세포를 면역염색하여 발현 여부 및 발현 양상을 확인하였다. 면역염색 방법은 아래 단계를 통해 수행되었다. 우선, Coverslip에 2일간 배양한 세포를 4% paraformaldehyde in PBS 로 20분간 고정화시켰다. 고정 후, 남은 paraformaldehyde의 제거를 위해, PBS (phosphate buffered saline, 웰진 사)을 이용하여, 5분간 3번 닦아주었다. 항체의 안정적 접근을 위해서, 5% BSA (Bovine Serum Albumin, 시그마알드리치 사), 0.3% Triton X-100 (시그마알드리치 사) 의 농도로 PBS에 녹인 용액을 30분간 처리하여, 세포의 삼투화를 수행했다. 0.1% Tween 20 (시그마알드리치 사) 와 5% BSA 가 PBS에 희석한 용액을 이용하여, 1:200 비율의 농도로 희석한 GST 항체를 세포에 2시간동안 처리하였다. 결합하지 않은 과량의 GST 항체를 제거하기 위해, 0.1% Tween 20 (시그마알드리치 사) 와 5% BSA 가 PBS에 희석한 용액을 이용해 10분간 5번 세포를 닦아준 후, 같은 용액에 FITC (Fluorescein isothiocyanate)가 태그된 2차 항체 (anti-mouse IgG-FITC, 시그마알드리치 사)를 1:1000의 비율로 희석하여 붙여주었다. FITC를 형광물질로서 추후 형광현미경을 이용하여 세포를 관찰하면, 초록색의 형광 신호를 보여준다. 과량의 항체를 0.1% Tween 20 (시그마알드리치 사) 와 5% BSA 가 PBS에 희석한 용액을 이용해 10분간 5번 세포를 닦아주었다. PBS 로 10분간 3번 더 처리하여 닦아준 후, 300 uM DAPI (4′)를 1:1000으로 PBS에 희석한 용액을 이용해 세포에 20분간 처리해 주었다. DAPI는 DNA에 결합할 수 있으므로, 형광현미경으로 관찰할 수 있는 DAPI 신호는 핵의 위치를 말해준다. PBS로 5분간 3번 닦아준 후, coverslip을 slide glass에 mounting 하여 샘플을 준비했다. 준비된 세포 샘플을 형광현미경(니콘 사)을 이용하여 특정파장에서의 형광신호를 관찰하였다. 그 결과는 도 3과 같았다. 후각수용체를 발현하는 세포는 녹색의 형광 신호를 관찰할 수 있고, 모든 세포가 발현되는 것으로 미루어, 후각수용체가 안정적으로 모든 세포에서 발현되는 것을 확인할 수 있다. 특히 녹색의 신호는 세포질과 세포막에서 관찰되는 것으로 미루어, 후각수용체의 발현이 정상적으로 이루어지고 있음을 알 수 있다. 반면, 네가티브 대조군으로 사용한 형질전환되지 않은 Hek293t 세포의 경우, 똑같은 과정의 면역염색법을 통해 염색하였지만, 핵을 의미하는 푸른색의 DAPI 신호만을 확인할 수 있고, 녹색 형광신호를 전혀 확인할 수 없었다. 이를 통해, 후각수용체의 안정적 발현을 확인할 수 있었다.

(3) 세포가 고정된 SPR 칩 제작

상기 얻어진 재조합 후각수용체 세포들 표면에 알데히드기를 다수 만들기 위해서 상기 2ⅹ10⁶ cells를 1mL의 1mM sodium metaperiodate solution in sodium acetate buffer (pH5.5)에 resuspension시키고 20분 동안 얼음에 넣고 반응시킨 뒤, 1mL의 sodium acetate buffer pH4.0에 순차적으로 처리하였다.

한편, 세포 고정화를 위해서 사용한 SPR 칩은 덱스트란이 표면에 처리되어있는 CM5 센서 칩(Biocore, GE healthcare)을 이용하였다 도 3에 나타난 과정에서와 같이, 덱스트란이 처리된 CM5 센서 칩을 SPR 기기인 Biacore T200에 넣고, 이때 4개의 유동 셀 (flow cell, FC)에서 FC1은 blank (세포가 없는 대조군 표면), FC2는 후각수용체 발현되지 않은 세포, FC3은 후각수용체가 안정적으로 발현된 세포를 고정시켰다. 구체적으로, 유동 셀에 표면에 카르보닐기를 개질하기 위하여 가교제인 EDC(ethylene dichloride) 0.4M와 이미드계 화합물인 N-하이드로숙신이미드(NHS) 0.1M를 1:1 혼합물을 사용하여 10ug/min 유량에서 3분간 활성화시켰다. 그 다음 하이드라진을 5mM로 처리하고, 마지막으로 에탄올아민을 처리하여 반응하지 않은 상기 이미드계 화합물의 에스터 기능기를 비활성화시켰다. 후각수용체 발현 세포들은 12분간 10ul/min 속도로 유동 셀 3에 주입되었고, 9,000 내지 10,000 반응 단위(response uit, RU)의 표면밀도를 나타내었다(도 4).

(4) 후각수용체에 직접적으로 결합하는 리간드 발굴

상기 제작된 SPR 칩에 50uM의 프테로스틸벤(pterostilbene)을 60초간 주입한 결과, 주입 시점부터 RU 값이 증가하기 시작하였고, 주입이 끝나는 1분 후에는 반응성이 0으로 되돌아갔다. OR6M1 특이적인 반응이라는 것을 확인하기 위하여 프테로스틸벤에 대한 OR6M1 발현 세포주 반응에서 후각수용체가 발현되지 않은 세포의 반응을 제거하였다. 그 결과 도 5와 같이 최종적으로, 낮은 검출 한계(12ppm)에서, 상기 OR6M1과 직접적 상호작용을 하는 프테로스틸벤을 발굴하였다. Irinotecan과 같이 OR6M1에 특이적으로 결합하지 않는 경우에는 RU값이 0 이하로 나타난다.

이상에서, 출원인은 본 발명의 바람직한 실시 예들을 설명하였지만, 이와 같은 실시예들은 본 발명의 기술적 사상을 구현하는 일 실시예 일 뿐이며 본 발명의 기술적 사상을 구현하는 한 어떠한 변경예 또는 수정예도 본 발명의 범위에 속하는 것으로 해석되어야 한다.

Claims (7)

1. (a) 감각수용체를 발현하는 세포 표면에 알데히드기를 도입하는 단계;
   (b) SPR(Surface Plasmon Resonance) 센서 표면에 덱스트란을 처리하고 알데히드 커플링 반응을 수행하는 단계; 및
   (c) 상기 감각수용체를 발현하는 세포를 상기 센서에 반응시키는 단계;
   를 포함하는 감각수용체를 발현하는 세포가 고정된 SPR 센서의 제조방법.
   
2. 제1항에 있어서,
   상기 (a) 단계에서 감각수용체는 후각수용체인 것을 특징으로 하는 방법.
   
3. 제1항에 있어서,
   상기 (b) 단계에서 알데히드 커플링 반응은, SPR 센서 표면에 덱스트란을 처리후, EDC/NHS, 하이드라진, 및 에탄올아민을 순서대로 처리하여 알데히드기를 도입하는 것을 특징으로 하는 방법.
   
4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 따라 제조된, 감각수용체 발현 세포가 고정된 SPR 센서.
   
5. 제4항에 있어서,
   상기 감각수용체 발현 세포는 SPR 센서 내에 유량 셀(flow cell)에 고정되어 있는 것을 특징으로 하는 SPR 센서.
   
6. 제5항에 있어서,
   상기 SPR 센서 내에 다른 유량 셀에는 감각수용체를 발현하지 않는 세포가 고정되어 있는 것을 특징으로 하는 SPR 센서.
   
7. (i) 제6항에 따른 SPR 센서에 후보물질을 처리하는 단계; 및
   (ii) 상기 후보물질이 SPR 센서에 고정된 감각수용체 발현 세포와 반응하는지 여부를 확인하는 단계;
   를 포함하는 감각수용체 단백질-리간드의 결합 확인 방법.

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