WO2012020744A1 - 糖化ヘモグロビンの測定方法 - Google Patents

糖化ヘモグロビンの測定方法 Download PDF

Info

Publication number
WO2012020744A1
WO2012020744A1 PCT/JP2011/068103 JP2011068103W WO2012020744A1 WO 2012020744 A1 WO2012020744 A1 WO 2012020744A1 JP 2011068103 W JP2011068103 W JP 2011068103W WO 2012020744 A1 WO2012020744 A1 WO 2012020744A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
reagent
hemoglobin
measurement
kit
examples
Prior art date
Application number
PCT/JP2011/068103
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
智美 村上
陽代 征矢
友 大杉
彩子 依田
春樹 角田
政嗣 松下
Original Assignee
協和メデックス株式会社
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 協和メデックス株式会社 filed Critical 協和メデックス株式会社
Priority to CN201180038629.XA priority Critical patent/CN103124793B/zh
Priority to CA2806261A priority patent/CA2806261A1/en
Priority to US13/811,911 priority patent/US20130171676A1/en
Priority to EP11816408.6A priority patent/EP2604698A4/en
Priority to KR1020137002549A priority patent/KR20130107268A/ko
Priority to BR112013001398A priority patent/BR112013001398A2/pt
Priority to JP2012528677A priority patent/JP5871800B2/ja
Publication of WO2012020744A1 publication Critical patent/WO2012020744A1/ja

Links

Images

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/72—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving blood pigments, e.g. haemoglobin, bilirubin or other porphyrins; involving occult blood
    • G01N33/721—Haemoglobin
    • G01N33/723—Glycosylated haemoglobin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/26—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving oxidoreductase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/26—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving oxidoreductase
    • C12Q1/28—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving oxidoreductase involving peroxidase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/34—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase
    • C12Q1/37—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase involving peptidase or proteinase

Definitions

  • the present invention relates to a method for measuring glycated hemoglobin, a measuring reagent, and a measuring kit.
  • Glycated hemoglobin is a saccharified product in which glucose is bound to hemoglobin.
  • Hemoglobin has a tetramer structure consisting of ⁇ and ⁇ chains, but the glycated N-terminus of ⁇ chain is called hemoglobin A1c, and increases as the blood glucose level increases. Measured in clinical tests.
  • an immunoassay method using an antibody such as a chromatography method such as HPLC, electrophoresis, latex immunoagglutination, an enzyme that acts on glycated protein, and a glycated peptide and / or glycated amino acid.
  • An enzyme measurement method using an enzyme is known.
  • glycated hemoglobin As an enzyme measurement method for glycated hemoglobin, first, hemoglobin in a hemoglobin-containing sample is denatured with a denaturing agent, a proteolytic enzyme is allowed to act on the denatured hemoglobin, and then a glycated peptide oxidase is allowed to act on the produced glycated peptide. It is known to react the oxidized hydrogen peroxide with an oxidative coloring type chromogen in the presence of a peroxidase active substance such as peroxidase, lead to the dye, and measure the glycated hemoglobin from the absorbance of the dye produced (absorbance method). It has been.
  • Patent Document 1 a method using a cationic surfactant and / or an amphoteric surfactant
  • Patent Document 2 a method using a sulfone compound and / or a nitro compound
  • Patent Document 4 a method using a tetrazolium compound
  • Patent Document 5 a method using a specific anionic surfactant such as polyoxyethylene alkyl ether sulfates
  • An object of the present invention is to provide a method and a reagent for accurately and highly sensitively measuring glycated hemoglobin in a hemoglobin-containing sample without being affected by hemoglobin.
  • the present inventors conducted a reaction in which a proteolytic enzyme is allowed to act on a hemoglobin-containing sample in the presence of a surfactant and then a fructosyl peptide oxidase is allowed to act in the presence of an isothiazolinone derivative.
  • the inventors have found the knowledge that by measuring the generated hydrogen peroxide, glycated hemoglobin in a hemoglobin-containing sample can be measured accurately and with high sensitivity without being affected by hemoglobin, and the present invention has been completed. That is, the present invention relates to the following [1] to [15].
  • a 1 represents a hydrogen atom or substituted or unsubstituted alkyl
  • a 2 and A 3 are the same or different and each represents a hydrogen atom, substituted or unsubstituted alkyl, halogen atom, or Together form a ring structure
  • the compound represented by formula (I) is 2-alkyl-4-isothiazolin-3-one, 1,2-benzisothiazol-3 (2H) -one, and 2-alkyl-4,5-
  • the measuring method according to [2] which is an isothiazolinone derivative selected from the group consisting of dihalogeno-4-isothiazolin-3-one.
  • a reagent for measuring glycated hemoglobin in a hemoglobin-containing sample comprising a proteolytic enzyme, a fructosyl peptide oxidase, an isothiazolinone derivative, and a surfactant.
  • a 1 represents a hydrogen atom or substituted or unsubstituted alkyl
  • a 2 and A 3 are the same or different and each represents a hydrogen atom, substituted or unsubstituted alkyl, halogen atom, or Together form a ring structure
  • the compound represented by the formula (I) is 2-alkyl-4-isothiazolin-3-one, 1,2-benzisothiazol-3 (2H) -one, and 2-alkyl-4,5-
  • the measuring reagent according to [7] which is an isothiazolinone derivative selected from the group consisting of dihalogeno-4-isothiazolin-3-one.
  • a kit for measuring glycated hemoglobin in a hemoglobin-containing sample comprising: a first reagent containing a proteolytic enzyme, an isothiazolinone derivative, and a surfactant; and a second reagent containing a fructosyl peptide oxidase
  • a kit for measuring glycated hemoglobin comprising: [12] A kit for measuring glycated hemoglobin in a hemoglobin-containing sample, a first reagent containing a proteolytic enzyme and a surfactant, a fructosyl peptide oxidase, and a second reagent containing an isothiazolinone derivative
  • the measurement kit according to [11] or [12], wherein the isothiazolinone derivative is a compound represented by the following formula (I).
  • a 1 represents a hydrogen atom or substituted or unsubstituted alkyl
  • a 2 and A 3 are the same or different and each represents a hydrogen atom, a substituted or unsubstituted alkyl, or a halogen atom, Or together form a ring structure
  • the compound represented by formula (I) is 2-alkyl-4-isothiazolin-3-one, 1,2-benzisothiazol-3 (2H) -one, and 2-alkyl-4,5-
  • the measurement kit according to [13] which is an isothiazolinone derivative selected from the group consisting of dihalogeno-4-isothiazolin-3-one.
  • a method, a reagent, and a kit for accurately and highly sensitively measuring glycated hemoglobin in a hemoglobin-containing sample without being affected by hemoglobin are provided.
  • ⁇ represents the kit of Comparative Example 5
  • ⁇ represents the kit of Example 9
  • ⁇ represents the measurement using the kit of Example 10
  • the vertical axis represents the reaction absorbance ( ⁇ 10 ⁇ 4 Abs)
  • the horizontal axis Represents the hemoglobin concentration (mg / mL).
  • ⁇ represents the kit of Comparative Example 4
  • ⁇ represents the kit of Example 7
  • ⁇ represents the measurement using the kit of Example 8
  • the vertical axis represents the reaction absorbance ( ⁇ 10 ⁇ 4 Abs)
  • the horizontal axis Represents the hemoglobin concentration (mg / mL).
  • ⁇ represents the kit of Comparative Example 11
  • ⁇ represents the kit of Example 21
  • ⁇ represents the measurement using the kit of Example 22
  • the vertical axis represents the reaction absorbance ( ⁇ 10 ⁇ 4 Abs)
  • the horizontal axis Represents the hemoglobin concentration (mg / mL).
  • a proteolytic enzyme acts on glycated hemoglobin in a hemoglobin-containing sample in the presence of a surfactant. Then, in a reaction in which fructosyl peptide oxidase is allowed to act, the reaction is performed in the presence of an isothiazolinone derivative, and the hydrogen peroxide produced is measured.
  • the isothiazolinone derivative may be present in a reaction in which fructosyl peptide oxidase acts, or may be present in both a reaction in which proteolytic enzyme acts and a reaction in which fructosyl peptide oxidase acts. Specifically, a measurement method including the following steps is exemplified.
  • ⁇ Measurement method 1> (1) A step of allowing a proteolytic enzyme to act on glycated hemoglobin in a hemoglobin-containing sample in the presence of a surfactant; (2) A step of causing a fructosyl peptide oxidase to act on the reaction product obtained in step (1) in the presence of an isothiazolinone derivative to generate hydrogen peroxide; (3) measuring hydrogen peroxide produced in step (2); and (4) Based on a calibration curve representing the relationship between the amount of hydrogen peroxide and the concentration of glycated hemoglobin prepared in advance using a known concentration of glycated hemoglobin, from the amount of hydrogen peroxide measured in step (3), the hemoglobin-containing sample The step of determining the glycated hemoglobin concentration.
  • ⁇ Measurement method 2> A step of allowing a proteolytic enzyme to act on glycated hemoglobin in a hemoglobin-containing sample in the presence of an isothiazolinone derivative and a surfactant; (2) reacting the reaction product obtained in step (1) with fructosyl peptide oxidase to generate hydrogen peroxide; (3) measuring hydrogen peroxide produced in step (2); and (4) Based on a calibration curve representing the relationship between the amount of hydrogen peroxide and the concentration of glycated hemoglobin prepared in advance using a known concentration of glycated hemoglobin, from the amount of hydrogen peroxide measured in step (3), the hemoglobin-containing sample The step of determining the glycated hemoglobin concentration.
  • the method for measuring glycated hemoglobin in the hemoglobin-containing sample of the present invention includes a method for calculating the ratio of the amount of glycated hemoglobin in the hemoglobin-containing sample to the total hemoglobin (that is, the total hemoglobin in which hemoglobin and glycated hemoglobin are combined). Include.
  • the method for measuring glycated hemoglobin in the hemoglobin-containing sample of the present invention is specifically a measurement method including the following steps.
  • ⁇ Measurement method 3> (1) determining the amount of total hemoglobin in the hemoglobin-containing sample (that is, total hemoglobin obtained by combining hemoglobin and glycated hemoglobin); (2) a step of allowing a proteolytic enzyme to act on glycated hemoglobin in a hemoglobin-containing sample in the presence of a surfactant; (3) a step of causing the reaction product obtained in step (2) to act on a fructosyl peptide oxidase in the presence of an isothiazolinone derivative to generate hydrogen peroxide; (4) measuring hydrogen peroxide produced in step (3); and (5) Based on a calibration curve representing the relationship between the amount of hydrogen peroxide and the amount of glycated hemoglobin prepared in advance using a known amount of glycated hemoglobin, from the amount of hydrogen peroxide measured in step (4), the hemoglobin-containing sample Determining the amount of glycated hemoglobin of; and (6) A step of
  • ⁇ Measurement method 4> (1) determining the amount of total hemoglobin in the hemoglobin-containing sample (that is, total hemoglobin obtained by combining hemoglobin and glycated hemoglobin); (2) a step of allowing a proteolytic enzyme to act on glycated hemoglobin in a hemoglobin-containing sample in the presence of an isothiazolinone derivative and a surfactant; (3) a step of causing a fructosyl peptide oxidase to act on the reaction product obtained in step (2) to generate hydrogen peroxide; (4) measuring hydrogen peroxide produced in step (3); and (5) Based on a calibration curve representing the relationship between the amount of hydrogen peroxide and the amount of glycated hemoglobin prepared in advance using a known amount of glycated hemoglobin, from the amount of hydrogen peroxide measured in step (4), the hemoglobin-containing sample Determining the amount of glycated hemoglobin of; and (6) A step of calculating a
  • the hemoglobin-containing sample in the measurement method of the present invention is not particularly limited as long as it contains hemoglobin and can be applied to the measurement method of glycated hemoglobin of the present invention.
  • whole blood, blood cells, and blood cells mixed with plasma And samples obtained by hemolyzing these samples.
  • the hemolysis treatment is not particularly limited as long as it is a treatment that hemolyzes whole blood, blood cells, and a sample in which blood cells are mixed with plasma, and examples thereof include physical methods, chemical methods, and biological methods.
  • Examples of the physical method include a method using a hypotonic solution such as distilled water and a method using ultrasonic waves.
  • Examples of the chemical method include a method using an organic solvent such as methanol, ethanol, and acetone, and a method using a polyoxyethylene surfactant.
  • biological methods include a method using an antibody or complement.
  • the glycated hemoglobin in the present invention is produced by binding sugar such as glucose to hemoglobin, and examples thereof include hemoglobin A1a, hemoglobin A1b, hemoglobin A1c, and hemoglobin A1c is preferable.
  • the isothiazolinone derivative in the present invention is not particularly limited as long as it is an isothiazolinone derivative that enables the method for measuring glycated hemoglobin of the present invention.
  • a compound represented by the following formula (I) [hereinafter referred to as compound (I) ].
  • a 1 represents a hydrogen atom or substituted or unsubstituted alkyl
  • a 2 and A 3 are the same or different and each represents a hydrogen atom, a substituted or unsubstituted alkyl, or a halogen atom, Or together form a ring structure
  • a 1 in the compound (I) represents a substituted or unsubstituted alkyl
  • a 2 and A 3 are the same or different and each represents a hydrogen atom, a substituted or unsubstituted alkyl, a halogen atom, or together.
  • Examples of the alkyl in the substituted or unsubstituted alkyl include linear alkyl having 1 to 20 carbon atoms and branched alkyl having 3 to 20 carbon atoms.
  • linear alkyl having 1 to 20 carbon atoms examples include methyl, ethyl, propyl, butyl, pentyl, hexyl, heptyl, octyl, nonyl, decyl, undecyl, dodecyl (lauryl), tridecyl, tetradecyl (myristyl), pentadecyl, hexadecyl (Cetyl), heptadecyl, octadecyl (stearyl), nonadecyl, icosyl and the like.
  • Examples of the branched alkyl having 3 to 20 carbon atoms include isopropyl, isobutyl, isopentyl, isohexyl, isoheptyl, isooctyl, isononyl, isodecyl, isoundecyl, isododecyl, isotridecyl, isotetradecyl, isopentadecyl, isohexadecyl, isoheptadecyl, isooctadecyl , Isononadecyl, isoicosyl, octyldodecyl and the like.
  • halogen atom examples include a chlorine atom, a bromine atom, and an iodine atom.
  • substituent in the substituted alkyl include a phenyl group, a hydroxyl group, a sulfo group, a cyano group, and a halogen atom.
  • a halogen atom the above-mentioned halogen atom etc. are mentioned, for example.
  • Examples of the ring structure formed by combining A 2 and A 3 include a benzene ring and a naphthalene ring.
  • compound (I) examples include 2-alkyl-4-isothiazolin-3-one, 1,2-benzisothiazol-3 (2H) -one, 2-alkyl-4,5-dihalogeno-4- And isothiazoline-3-one.
  • Examples of commercially available compounds (I) include 2-octyl-4-isothiazolin-3-one (manufactured by Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.), 1,2-benzisothiazol-3 (2H) -one (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) 4,5-dichloro-2-octyl-4-isothiazolin-3-one (manufactured by Hichem) and the like.
  • the concentration of the isothiazolinone derivative in the reaction solution is not particularly limited as long as it allows the method for measuring glycated hemoglobin according to the present invention, but is usually 0.005 to 20 mmol. / L, preferably 0.01 to 10 mmol / L.
  • the surfactant in the present invention is not particularly limited as long as it is a surfactant that enables the method for measuring glycated hemoglobin of the present invention.
  • a cationic surfactant for example, a cationic surfactant, an anionic surfactant, an amphoteric surfactant Agents, nonionic surfactants and the like.
  • cationic surfactant examples include quaternary ammonium salts, pyridinium salts, phosphonium salts, imidazolium salts, isoquinolinium salts, and the like, and quaternary ammonium salts, pyridinium salts, and phosphonium salts are preferable.
  • quaternary ammonium salt having at least one linear alkyl having 8 to 20 carbon atoms is preferable.
  • linear alkyl having 8 to 20 carbon atoms include octyl, nonyl, decyl, undecyl, dodecyl (lauryl), tridecyl, tetradecyl (myristyl), pentadecyl, hexadecyl (cetyl), heptadecyl, octadecyl (stearyl), nonadecyl, icosyl Etc.
  • Specific examples (products) of the quaternary ammonium salt include, for example, decyltrimethylammonium chloride, decyltrimethylammonium bromide (hereinafter referred to as C10TMA), dodecyltrimethylammonium chloride, dodecyltrimethylammonium bromide, hexadecyltrimethylammonium chloride, hexadecyl.
  • C10TMA decyltrimethylammonium chloride
  • C10TMA decyltrimethylammonium bromide
  • dodecyltrimethylammonium chloride dodecyltrimethylammonium bromide
  • hexadecyltrimethylammonium chloride dodecyltrimethylammonium bromide
  • hexadecyltrimethylammonium chloride hexadecyl.
  • Examples thereof include trimethylammonium bromide, didecyldimethylammonium chloride, didecyldimethylammonium bromide, didodecyldimethylammonium chloride, didodecyldimethylammonium bromide (all manufactured by Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.).
  • pyridinium salt a pyridinium salt represented by the following general formula (II) [hereinafter referred to as compound (II)] is used.
  • R 1 is substituted or unsubstituted alkyl, or substituted or unsubstituted alkenyl
  • R a is a hydrogen atom, substituted or unsubstituted alkyl, or substituted or unsubstituted alkenyl
  • n is 1 to 5
  • X ⁇ represents a monovalent anion.
  • Examples of the alkyl in the substituted or unsubstituted alkyl in R 1 include linear alkyl having 1 to 20 carbon atoms, branched alkyl having 3 to 20 carbon atoms, and the like. A branched alkyl having 8 to 20 is preferable.
  • linear alkyl having 1 to 20 carbon atoms examples include methyl, ethyl, propyl, butyl, pentyl, hexyl, heptyl, octyl, nonyl, decyl, undecyl, dodecyl (lauryl), tridecyl, tetradecyl (myristyl), pentadecyl, hexadecyl (Cetyl), heptadecyl, octadecyl (stearyl), nonadecyl, icosyl and the like.
  • Examples of the branched alkyl having 3 to 20 carbon atoms include isopropyl, isobutyl, isopentyl, isohexyl, isoheptyl, isooctyl, isononyl, isodecyl, isoundecyl, isododecyl, isotridecyl, isotetradecyl, isopentadecyl, isohexadecyl, isoheptadecyl, isooctadecyl , Isononadecyl, isoicosyl, octyldodecyl and the like.
  • Examples of the linear alkyl having 8 to 20 carbon atoms include the aforementioned linear alkyl having 8 to 20 carbon atoms.
  • Examples of the branched alkyl having 8 to 20 carbon atoms include isooctyl, isononyl, isodecyl, isoundecyl, isododecyl, isotridecyl, isotetradecyl, isopentadecyl, isohexadecyl, isoheptadecyl, isooctadecyl, isononadecyl, isoicosyl, octyldodecyl and the like. It is done.
  • the alkenyl in the substituted or unsubstituted alkenyl includes, for example, alkenyl having 2 to 20 carbon atoms, and preferably alkenyl having 8 to 20 carbon atoms.
  • alkenyl having 2 to 20 carbon atoms include vinyl, propenyl, allyl, butenyl, pentenyl, hexenyl, heptenyl, octenyl, nonenyl, decenyl, undecenyl, dodecenyl, tetradecenyl, pentadecenyl, hexadecenyl, heptadecenyl, octadecenyl, oleyl, nonadecenyl, Etc.
  • alkenyl having 8 to 20 carbon atoms examples include octenyl, nonenyl, decenyl, undecenyl, dodecenyl, tetradecenyl, pentadecenyl, hexadecenyl, heptadecenyl, octadecenyl, oleyl, nonadecenyl, icocenyl and the like.
  • examples of the substituent in the substituted alkyl and the substituted alkenyl include a phenyl group, a hydroxyl group, a sulfo group, a cyano group, and a halogen atom.
  • examples of the halogen atom include a chlorine atom, a bromine atom, and an iodine atom.
  • examples of the alkyl in the substituted or unsubstituted alkyl include linear alkyl having 1 to 20 carbon atoms and branched alkyl having 3 to 20 carbon atoms.
  • examples of the linear alkyl having 1 to 20 carbon atoms include the aforementioned linear alkyl having 1 to 20 carbon atoms.
  • examples of the branched alkyl having 3 to 20 carbon atoms include the aforementioned branched alkyl having 3 to 20 carbon atoms.
  • the alkenyl in the substituted or unsubstituted alkenyl includes, for example, alkenyl having 2 to 20 carbon atoms.
  • alkenyl having 2 to 20 carbon atoms include the above-mentioned linear alkenyl having 2 to 20 carbon atoms.
  • examples of the substituent in the substituted alkyl and the substituted alkenyl include a phenyl group, a hydroxyl group, a sulfo group, a cyano group, and a halogen atom.
  • examples of the phenyl group-substituted alkyl include benzyl and 1-phenylethyl.
  • examples of the halogen atom include a chlorine atom, a bromine atom, and an iodine atom.
  • X in the compound (II) - represents a monovalent anion.
  • monovalent anions include halogen ions, OH ⁇ , PF 6 ⁇ , BF 4 ⁇ , CH 3 CH 2 OSO 3 ⁇ , (CF 3 SO 2 ) 2 N ⁇ and the like.
  • halogen ion include Cl ⁇ , Br ⁇ , I ⁇ and the like.
  • compound (II) examples include, for example, 1-dodecylpyridinium chloride (hereinafter referred to as C12py; manufactured by Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.), 1-cetylpyridinium chloride, 1-cetyl-4-methylpyridinium chloride (Tokyo Chemical Industry). And N-octadecyl-4-stilbazole bromide (manufactured by Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.).
  • C12py 1-dodecylpyridinium chloride
  • C12py 1-cetylpyridinium chloride
  • 1-cetyl-4-methylpyridinium chloride Tokyo Chemical Industry
  • N-octadecyl-4-stilbazole bromide manufactured by Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.
  • a phosphonium salt represented by the following general formula (III) [hereinafter referred to as compound (III)] is used.
  • R 2 to R 5 are the same or different and each represents a substituted or unsubstituted alkyl, and Y ⁇ represents a monovalent anion.
  • examples of the alkyl in the substituted or unsubstituted alkyl include linear alkyl having 8 to 20 carbon atoms and branched alkyl having 8 to 20 carbon atoms.
  • Examples of the linear alkyl having 8 to 20 carbon atoms include the aforementioned linear alkyl having 8 to 20 carbon atoms.
  • Examples of the branched alkyl having 8 to 20 carbon atoms include the aforementioned branched alkyl having 8 to 20 carbon atoms.
  • the substituent in the substituted alkyl include a phenyl group, a hydroxyl group, a sulfo group, a cyano group, and a halogen atom.
  • Examples of the phenyl group-substituted alkyl include benzyl and 1-phenylethyl.
  • Examples of the halogen atom include a chlorine atom, a bromine atom, and an iodine atom.
  • examples of the alkyl in the substituted or unsubstituted alkyl include linear alkyl having 1 to 20 carbon atoms and branched alkyl having 3 to 20 carbon atoms.
  • Examples of the linear alkyl having 1 to 20 carbon atoms include the aforementioned linear alkyl having 1 to 20 carbon atoms.
  • Examples of the branched alkyl having 3 to 20 carbon atoms include the aforementioned branched alkyl having 3 to 20 carbon atoms.
  • the substituent in the substituted alkyl include a phenyl group, a hydroxyl group, a sulfo group, a cyano group, and a halogen atom.
  • Examples of the phenyl group-substituted alkyl include benzyl and 1-phenylethyl.
  • Examples of the halogen atom include a chlorine atom, a bromine atom, and an iodine atom.
  • Y ⁇ represents a monovalent anion.
  • monovalent anions include halogen ions, OH ⁇ , PF 6 ⁇ , BF 4 ⁇ , CH 3 CH 2 OSO 3 ⁇ , (CF 3 SO 2 ) 2 N ⁇ , B (C 6 H 5 ) 4 ⁇ , And anions such as benzotriazolate.
  • halogen ion include Cl ⁇ , Br ⁇ , I ⁇ and the like.
  • compound (III) examples include tetraoctylphosphonium bromide (manufactured by Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.), tributyloctylphosphonium bromide (manufactured by Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.), tributyldodecylphosphonium bromide, tributylhexadecylphosphonium bromide and the like. .
  • an imidazolium salt [hereinafter referred to as compound (IV)] represented by the following general formula (IV) is used.
  • R 6 and R 8 are the same or different and each represents substituted or unsubstituted alkyl, substituted or unsubstituted alkenyl
  • R 7 , R 9 , and R 10 are hydrogen atoms, substituted or unsubstituted alkyl, substituted or represents unsubstituted alkenyl
  • Z - represents a monovalent anion
  • examples of the alkyl in the substituted or unsubstituted alkyl include linear alkyl having 8 to 20 carbon atoms and branched alkyl having 8 to 20 carbon atoms.
  • examples of the linear alkyl having 8 to 20 carbon atoms include the aforementioned linear alkyl having 8 to 20 carbon atoms.
  • examples of the branched alkyl having 8 to 20 carbon atoms include the aforementioned branched alkyl having 8 to 20 carbon atoms.
  • the alkenyl in the substituted or unsubstituted alkenyl includes, for example, alkenyl having 8 to 20 carbon atoms.
  • alkenyl having 8 to 20 carbon atoms include the aforementioned alkenyl having 8 to 20 carbon atoms.
  • examples of the substituent in the substituted alkyl and the substituted alkenyl include a phenyl group, a hydroxyl group, a sulfo group, a cyano group, and a halogen atom.
  • examples of the phenyl group-substituted alkyl include benzyl and 1-phenylethyl.
  • examples of the halogen atom include a chlorine atom, a bromine atom, and an iodine atom.
  • examples of the alkyl in the substituted or unsubstituted alkyl include linear alkyl having 1 to 20 carbon atoms and branched alkyl having 3 to 20 carbon atoms.
  • examples of the linear alkyl having 1 to 20 carbon atoms include the aforementioned linear alkyl having 1 to 20 carbon atoms.
  • examples of the branched alkyl having 3 to 20 carbon atoms include the aforementioned branched alkyl having 3 to 20 carbon atoms.
  • examples of the alkenyl in the substituted or unsubstituted alkenyl include alkenyl having 2 to 20 carbon atoms.
  • examples of the alkenyl having 2 to 20 carbon atoms include the aforementioned alkenyl having 2 to 20 carbon atoms.
  • examples of the substituent in the substituted alkyl and the substituted alkenyl include a phenyl group, a hydroxyl group, a sulfo group, a cyano group, and a halogen atom.
  • examples of the phenyl group-substituted alkyl include benzyl and 1-phenylethyl.
  • examples of the halogen atom include a chlorine atom, a bromine atom, and an iodine atom.
  • Z ⁇ represents a monovalent anion.
  • the halogen ion include Cl ⁇ , Br ⁇ , I ⁇ and the like.
  • product (IV) examples include, for example, 1-methyl-3-octylimidazolium bromide (manufactured by Tokyo Chemical Industry), 1-methyl-3-octylimidazolium chloride (manufactured by Tokyo Chemical Industry), And dodecyl-2-methyl-3-benzylimidazolium chloride.
  • an isoquinolinium salt represented by the following general formula (V) [hereinafter referred to as compound (V)] is used.
  • R 11 represents substituted or unsubstituted alkyl, substituted or unsubstituted alkenyl, and W ⁇ represents a monovalent anion.
  • examples of the alkyl in the substituted or unsubstituted alkyl include linear alkyl having 8 to 20 carbon atoms and branched alkyl having 8 to 20 carbon atoms.
  • examples of the linear alkyl having 8 to 20 carbon atoms include the aforementioned linear alkyl having 8 to 20 carbon atoms.
  • examples of the branched alkyl having 8 to 20 carbon atoms include the aforementioned branched alkyl having 8 to 20 carbon atoms.
  • the alkenyl in the substituted or unsubstituted alkenyl includes, for example, alkenyl having 8 to 20 carbon atoms.
  • alkenyl having 8 to 20 carbon atoms include the aforementioned alkenyl having 8 to 20 carbon atoms.
  • examples of the substituent in the substituted alkyl and the substituted alkenyl include a phenyl group, a hydroxyl group, a sulfo group, a cyano group, and a halogen atom.
  • examples of the phenyl group-substituted alkyl include benzyl and 1-phenylethyl.
  • examples of the halogen atom include a chlorine atom, a bromine atom, and an iodine atom.
  • W ⁇ represents a monovalent anion.
  • the monovalent anion include anions such as halogen ions.
  • the halogen ion include Cl ⁇ , Br ⁇ , I ⁇ and the like.
  • compound (V) examples include, for example, N-laurylisoquinolinium chloride (manufactured by NOF Corporation), N-larlylisoquinolinium bromide (manufactured by NOF Corporation) and the like.
  • anionic surfactant examples include sulfate ester salt, carboxylate salt, sulfonate salt, phosphate ester salt, sulfosuccinate salt, N-methyl taurine salt, N-alkanoyl-N-methyl taurine salt and the like.
  • amphoteric surfactants include tertiary amine oxides and alkylcarboxybetaines.
  • nonionic surfactant examples include polyoxyethylene alkylamine, polyoxyethylene alkenylamine, polyoxyethylene alkyl ether, polyoxyethylene alkenyl ether, polyoxyethylene alkylphenyl ether, ethylenediaminetetrapolyoxyethylene, polyglycerin fatty acid.
  • examples include esters, and polyoxyethylene alkylamines and polyoxyethylene alkyl ethers are preferred.
  • alkyl in the polyoxyethylene alkylamine examples include alkyl having 8 to 20 carbon atoms.
  • alkyl having 8 to 20 carbon atoms examples include octyl, nonyl, decyl, undecyl, dodecyl (lauryl), tridecyl, tetradecyl (myristyl), pentadecyl, hexadecyl (cetyl), heptadecyl, octadecyl (stearyl), nonadecyl, icosyl and the like. Can be mentioned.
  • alkenyl in polyoxyethylene alkenylamine examples include alkenyl having 8 to 20 carbon atoms.
  • alkenyl having 8 to 20 carbon atoms include octenyl, nonenyl, decenyl, undecenyl, dodecenyl, tetradecenyl, pentadecenyl, hexadecenyl, heptadecenyl, octadecenyl, oleyl, nonadecenyl, icocenyl and the like.
  • Examples of the alkyl in the polyoxyethylene alkyl ether include alkyl having 8 to 20 carbon atoms. Examples of the alkyl having 8 to 20 carbon atoms include the aforementioned alkyl having 8 to 20 carbon atoms. Examples of alkenyl in the polyoxyethylene alkenyl ether include alkenyl having 8 to 20 carbon atoms. Examples of the alkenyl having 8 to 20 carbon atoms include the aforementioned alkenyl having 8 to 20 carbon atoms.
  • alkyl in the polyoxyethylene alkylphenyl ether examples include alkyl having 8 to 20 carbon atoms. Examples of the alkyl having 8 to 20 carbon atoms include the aforementioned alkyl having 8 to 20 carbon atoms.
  • the total hemoglobin amount can be determined by a known method, for example, the cyanmethemoglobin method, the oxyhemoglobin method, the SLS-hemoglobin method, or the like.
  • the total hemoglobin amount includes not only the hemoglobin-containing sample itself, but also a sample obtained by adding an isothiazolinone derivative and / or a surfactant to a hemoglobin-containing sample, an isothiazolinone derivative and / or a surfactant and a proteolytic enzyme to a hemoglobin-containing sample. It can also be determined by applying a cyan methemoglobin method, an oxyhemoglobin method, or an SLS-hemoglobin method to a sample obtained by adding s.
  • the reaction in which a proteolytic enzyme is allowed to act on glycated hemoglobin in a hemoglobin-containing sample in the presence of the surfactant may be any conditions as long as the proteolytic enzyme can act on glycated hemoglobin in the presence of the surfactant. But you can do it.
  • the reaction between the glycated hemoglobin in the hemoglobin-containing sample and the proteolytic enzyme is preferably performed in an aqueous medium. Examples of the aqueous medium include an aqueous medium described later. 1.
  • the reaction temperature in the reaction of glycated hemoglobin in a hemoglobin-containing sample with a proteolytic enzyme is usually 10 to 50 ° C., preferably 20 to 40 ° C., and the reaction time is usually 1 minute to 3 hours. 5 minutes to 1 hour is preferred.
  • the concentration of the proteolytic enzyme is not particularly limited as long as the reaction between the glycated hemoglobin in the hemoglobin-containing sample and the proteolytic enzyme proceeds, and is usually 50 to 25000 kU / L, preferably 250 to 10,000 kU / L. L.
  • the proteolytic enzyme is not particularly limited as long as it is an enzyme that acts on glycated hemoglobin in a hemoglobin-containing sample and generates a glycated peptide from glycated hemoglobin.
  • serine protease chymotrypsin, subtilisin, etc.
  • cysteine protease papain, caspase
  • Etc. aspartic protease
  • pepsin, cathepsin D, etc. metalloprotease (thermolysin, etc.)
  • N-terminal threonine protease glutamic acid protease and the like.
  • commercially available proteolytic enzymes can also be used.
  • protease P “Amano” 3G examples include protease P “Amano” 3G, protease K “Amano” (above, Amano Enzyme), actinase AS, actinase E (above).
  • protease P “Amano” 3G examples include protease P “Amano” 3G, protease K “Amano” (above, Amano Enzyme), actinase AS, actinase E (above).
  • Kaken Pharma Co., Ltd. examples include thermolysin (manufactured by Daiwa Kasei Co., Ltd.), Sumiteam MP (manufactured by Shin Nippon Chemical Industry Co., Ltd.) and the like.
  • the concentration of the surfactant in the reaction in which the proteolytic enzyme is allowed to act is not particularly limited as long as the reaction between the glycated hemoglobin in the hemoglobin-containing sample and the proteolytic enzyme proceeds, and usually 0.0001 to 10 %, Preferably 0.0005 to 5%.
  • a reaction product containing a glycated peptide is generated by a reaction between glycated hemoglobin in a hemoglobin-containing sample and a proteolytic enzyme.
  • the glycated peptide in this reaction product reacts with fructosyl peptide oxidase to produce hydrogen peroxide.
  • the reaction between the glycated peptide and fructosyl peptide oxidase is preferably performed in an aqueous medium. Examples of the aqueous medium include an aqueous medium described later.
  • the reaction temperature in the reaction between the glycated peptide and fructosyl peptide oxidase is usually 10 to 50 ° C., preferably 20 to 40 ° C., and the reaction time is usually 1 minute to 3 hours, and 2.5 minutes to 1 Time is preferred.
  • the concentration of fructosyl peptide oxidase is not particularly limited as long as the reaction between glycated hemoglobin and fructosyl peptide oxidase proceeds, and is usually 0.1 to 30 kU / L, preferably 0.2 to 15 kU / L.
  • the fructosyl peptide oxidase is not particularly limited as long as it is an enzyme that acts on a glycated peptide to generate hydrogen peroxide.
  • fructosyl derived from filamentous fungi, yeast, actinomycetes, bacteria, or archaea. Peptide oxidase etc. are mentioned.
  • commercially available fructosyl peptide oxidase can also be used. Examples of commercially available products include FPOX-CE (manufactured by Kikkoman), FPOX-EE (manufactured by Kikkoman), and FPOX-CET (manufactured by Kikkoman). Etc.
  • Examples of the method for measuring the generated hydrogen peroxide include a method using an electrode, a method using a hydrogen peroxide measuring reagent, and the like, and a method using a hydrogen peroxide measuring reagent is preferable.
  • the reagent for measuring hydrogen peroxide is a reagent for converting hydrogen peroxide into a detectable substance.
  • Examples of the detectable substance include a dye, light (luminescence), fluorescence, and the like, and a dye is preferable.
  • examples of the reagent for measuring hydrogen peroxide include a reagent containing a peroxidase active substance such as peroxidase and an oxidative coloring type chromogen.
  • examples of the oxidative coloring type chromogen include an oxidative coupling type chromogen and a leuco chromogen, and a leuco chromogen is preferred.
  • leuco chromogen examples include phenothiazine chromogen, triphenylmethane chromogen, diphenylamine chromogen, o-phenylenediamine, hydroxypropionic acid, diaminobenzidine, tetramethylbenzidine and the like, and phenothiazine.
  • a chromogen is preferred.
  • the phenothiazine chromogen examples include 10-N-carboxymethylcarbamoyl-3,7-bis (dimethylamino) -10H-phenothiazine (CCAP), 10-N-methylcarbamoyl-3,7-bis (dimethylamino).
  • -10H-phenothiazine MCDP
  • 10-N- (carboxymethylaminocarbonyl) -3,7-bis (dimethylamino) -10H-phenothiazine sodium salt DA-67
  • 10-N- (carboxymethylaminocarbonyl) -3,7-bis (dimethylamino) -10H-phenothiazine sodium salt DA-67
  • 10-N- (carboxymethylaminocarbonyl) -3,7-bis (dimethylamino) -10H-phenothiazine sodium salt DA-67
  • triphenylmethane chromogen examples include N, N, N ′, N ′, N ′′, N ′′ -hexa (3-sulfopropyl) -4,4 ′, 4 ′′ -triaminotriphenyl And methane (TPM-PS).
  • diphenylamine chromogen examples include N- (carboxymethylaminocarbonyl) -4,4′-bis (dimethylamino) diphenylamine ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ sodium salt (DA-64), 4,4′-bis (dimethylamino) diphenylamine, bis [3-bis (4-chlorophenyl) methyl-4-dimethylaminophenyl] amine (BCMA) and the like.
  • examples of the reagent for measuring hydrogen peroxide include a reagent containing a peroxidase active substance such as peroxidase and a chemiluminescent substance.
  • examples of the chemiluminescent substance include luminol, isoluminol, lucigenin, and acridinium ester.
  • examples of the reagent for measuring hydrogen peroxide include a reagent containing a peroxidase active substance such as peroxidase and a fluorescent substance.
  • examples of the fluorescent substance include 4-hydroxyphenylacetic acid, 3- (4-hydroxyphenyl) propionic acid, and coumarin.
  • the glycated hemoglobin measurement reagent in a sample containing hemoglobin of the present invention is a reagent containing a proteolytic enzyme, fructosyl peptide oxidase, isothiazolinone derivative, and a surfactant.
  • the method for measuring glycated hemoglobin in the hemoglobin-containing sample of the present invention may further contain a hydrogen peroxide measurement reagent.
  • proteolytic enzyme fructosyl peptide oxidase, isothiazolinone derivative, surfactant, and hydrogen peroxide measuring reagent in the measurement reagent of the present invention
  • proteolytic enzyme fructosyl peptide oxidase, isothiazolinone derivative, surfactant, and hydrogen peroxide measuring reagent in the measurement reagent of the present invention
  • examples include derivatives, surfactants, and hydrogen peroxide measuring reagents.
  • the concentration of the proteolytic enzyme in the measurement reagent of the present invention is usually 50 to 25000 kU / L, preferably 250 to 10000 kU / L.
  • the concentration of fructosyl peptide oxidase in the measurement reagent of the present invention is usually 0.1 to 30 kU / L, preferably 0.2 to 15 kU / L.
  • the concentration of the isothiazolinone derivative in the measurement reagent of the present invention is usually 0.005 to 20 mmol / L, preferably 0.01 to 10 mmol / L.
  • the concentration of the surfactant in the measurement reagent of the present invention is usually 0.0001 to 10%, preferably 0.0005 to 5%.
  • the measurement reagent of the present invention may contain an aqueous medium, a stabilizer, an antiseptic, a salt, an interference substance erasing agent, an organic solvent, and the like, if necessary.
  • the aqueous medium include deionized water, distilled water, and a buffer solution, and a buffer solution is preferable.
  • the pH of the aqueous medium is, for example, pH 4-10.
  • a buffer solution is used as the aqueous medium, it is desirable to use a buffering agent corresponding to the set pH.
  • the buffer used in the buffer include tris (hydroxymethyl) aminomethane buffer, phosphate buffer, borate buffer, Good's buffer, and the like.
  • Good buffering agents include, for example, 2-morpholinoethanesulfonic acid (MES), bis (2-hydroxyethyl) iminotris (hydroxymethyl) methane (Bis-Tris), N- (2-acetamido) iminodiacetic acid (ADA) Piperazine-N, N′-bis (2-ethanesulfonic acid) (PIPES), N- (2-acetamido) -2-aminoethanesulfonic acid (ACES), 3-morpholino-2-hydroxypropanesulfonic acid (MOPSO) ), N, N-bis (2-hydroxyethyl) -2-aminoethanesulfonic acid (BES), 3-morpholinopropanesulfonic acid (MOPS), N- [tris (hydroxymethyl) methyl] -2-aminoethanesulfone Acid (TES), 2- [4- (2-hydroxyethyl) -1-piperazinyl] ethane Sulfonic acid (HEPE
  • the concentration of the buffer is usually 0.001 to 2.0 mol / L, preferably 0.005 to 1.0 mol / L.
  • stabilizers include polyoxyethylene surfactants such as ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), sucrose, calcium chloride, calcium acetate, calcium nitrate, potassium ferrocyanide, bovine serum albumin (BSA), and polyoxyethylene alkylphenyl ether. Agents and the like.
  • the preservative include sodium azide and antibiotics.
  • the salts include sodium chloride, sodium nitrate, sodium sulfate, sodium carbonate, sodium formate, sodium acetate, potassium chloride, potassium nitrate, potassium sulfate, potassium carbonate, potassium formate, and potassium acetate.
  • the interfering substance eliminating agent include ascorbic acid oxidase for eliminating the influence of ascorbic acid.
  • organic solvent examples include dimethylformamide (DMF), dimethyl sulfoxide (DMSO), dioxane, acetone, methanol, ethanol and the like for use as a solubilizing agent for the leuco chromogen in an aqueous medium.
  • Kit for measuring glycated hemoglobin in a sample containing hemoglobin The reagent for measuring glycated hemoglobin in a sample containing hemoglobin of the present invention may be stored, distributed and used in the form of a kit.
  • the kit for measuring glycated hemoglobin in a hemoglobin-containing sample of the present invention is used in the method for measuring glycated hemoglobin in a hemoglobin-containing sample of the present invention.
  • Examples of the measurement kit of the present invention include a two-reagent kit, a three-reagent kit, and the like, and a two-reagent kit is preferable.
  • the glycated hemoglobin measurement kit in the hemoglobin-containing sample of the present invention is not particularly limited as long as it is a kit that enables the method for measuring glycated hemoglobin in the hemoglobin-containing sample of the present invention.
  • a kit containing a first reagent containing a degrading enzyme and a second reagent containing a fructosyl peptide oxidase, an isothiazolinone derivative and a surfactant, and a first containing a proteolytic enzyme, an isothiazolinone derivative and a surfactant examples thereof include a kit containing a reagent and a second reagent containing fructosyl peptide oxidase.
  • kits in which a hydrogen peroxide measurement reagent is contained in either or both of the first reagent and the second reagent of these kits include kits in which a hydrogen peroxide measurement reagent is contained in either or both of the first reagent and the second reagent of these kits.
  • a hydrogen peroxide measurement reagent is contained in either or both of the first reagent and the second reagent of these kits.
  • peroxidase and leuco chromogen are contained in separate reagents. That is, it is preferable that the peroxidase and the leuco chromogen are contained in the first reagent and the second reagent or in the second reagent and the first reagent, respectively.
  • the concentration of the proteolytic enzyme in the reagent constituting the measurement kit of the present invention is usually 100 to 30000 kU / L, preferably 500 to 10000 kU / L.
  • the concentration of fructosyl peptide oxidase in the reagent constituting the measurement kit of the present invention is usually 0.5 to 100 kU / L, preferably 1 to 50 kU / L.
  • the concentration of the isothiazolinone derivative in the reagent constituting the measurement kit of the present invention is usually 0.005 to 20 mmol / L, preferably 0.01 to 10 mmol / L.
  • the concentration of the surfactant in the reagent constituting the measurement kit of the present invention is usually 0.0001 to 40%, preferably 0.0005 to 20%.
  • An HbA1c measurement kit comprising the following first reagent and second reagent was prepared.
  • First reagent Bis-Tris (pH 6.8) 10 mmol / L C12py 1.6g / L 2-Octyl-4-isothiazolin-3-one 0.2 g / L Calcium chloride dihydrate 10mmol / L Thermolysin 1800kU / L Peroxidase 40 kU / L
  • Second reagent ADA (pH 7.0) 50 mmol / L FPOX-CE 6kU / L DA-67 60 ⁇ mol / L
  • An HbA1c measurement kit comprising the following first reagent and second reagent was prepared.
  • First reagent Bis-Tris (pH 6.8) 10 mmol / L C12py 1.6g / L 1,2-Benzisothiazol-3 (2H) -one 0.4 g / L Calcium chloride dihydrate 10mmol / L Thermolysin 1800kU / L Peroxidase 40 kU / L
  • Second reagent ADA (pH 7.0) 50 mmol / L FPOX-CE 6kU / L DA-67 60 ⁇ mol / L
  • An HbA1c measurement kit comprising the following first reagent and second reagent was prepared.
  • First reagent Bis-Tris (pH 6.8) 10 mmol / L C10TMA 16g / L 2-Octyl-4-isothiazolin-3-one 0.2 g / L Calcium chloride dihydrate 10mmol / L Thermolysin 1800kU / L Peroxidase 40 kU / L
  • Second reagent ADA (pH 7.0) 50 mmol / L FPOX-CE 6kU / L DA-67 60 ⁇ mol / L
  • An HbA1c measurement kit comprising the following first reagent and second reagent was prepared.
  • First reagent Bis-Tris (pH 6.8) 10 mmol / L C10TMA 16g / L 1,2-Benzisothiazol-3 (2H) -one 0.2 g / L Calcium chloride dihydrate 10mmol / L Thermolysin 1800kU / L Peroxidase 40 kU / L
  • Second reagent ADA (pH 7.0) 50 mmol / L FPOX-CE 6kU / L DA-67 60 ⁇ mol / L
  • An HbA1c measurement kit comprising the following first reagent and second reagent was prepared.
  • First reagent Bis-Tris (pH 6.8) 10 mmol / L LMT 5g / L 2-Octyl-4-isothiazolin-3-one 0.4 g / L Calcium chloride dihydrate 10mmol / L Thermolysin 1800kU / L Peroxidase 40 kU / L
  • Second reagent ADA (pH 7.0) 50 mmol / L FPOX-CE 6kU / L DA-67 60 ⁇ mol / L
  • An HbA1c measurement kit comprising the following first reagent and second reagent was prepared.
  • First reagent Bis-Tris (pH 6.8) 10 mmol / L LMT 5g / L 1,2-Benzisothiazol-3 (2H) -one 0.2 g / L Calcium chloride dihydrate 10mmol / L Thermolysin 1800kU / L Peroxidase 40 kU / L
  • Second reagent ADA (pH 7.0) 50 mmol / L FPOX-CE 6kU / L DA-67 60 ⁇ mol / L
  • An HbA1c measurement kit comprising the following first reagent and second reagent was prepared.
  • First reagent Bis-Tris (pH 6.8) 10 mmol / L
  • Calcium chloride dihydrate 10mmol / L
  • Thermolysin 1800kU / L Peroxidase 40 kU / L
  • Second reagent ADA (pH 7.0) 50 mmol / L FPOX-CE 6kU / L DA-67 60 ⁇ mol / L
  • An HbA1c measurement kit comprising the following first reagent and second reagent was prepared.
  • First reagent Bis-Tris (pH 6.8) 10 mmol / L
  • Calcium chloride dihydrate 10mmol / L
  • Thermolysin 1800kU / L Peroxidase 40 kU / L
  • Second reagent ADA (pH 7.0) 50 mmol / L FPOX-CE 6kU / L DA-67 60 ⁇ mol / L
  • An HbA1c measurement kit comprising the following first reagent and second reagent was prepared.
  • First reagent Bis-Tris (pH 6.8) 10 mmol / L C12py 1.6g / L 2-Octyl-4-isothiazolin-3-one 0.4 g / L Calcium chloride dihydrate 10mmol / L Thermolysin 1800kU / L DA-67 20 ⁇ mol / L
  • Second reagent ADA (pH 7.0) 50 mmol / L FPOX-CE 6kU / L Peroxidase 120 kU / L
  • An HbA1c measurement kit comprising the following first reagent and second reagent was prepared.
  • First reagent Bis-Tris (pH 6.8) 10 mmol / L C12py 1.6g / L 1,2-Benzisothiazol-3 (2H) -one 0.2 g / L Calcium chloride dihydrate 10mmol / L Thermolysin 1800kU / L DA-67 20 ⁇ mol / L
  • Second reagent ADA (pH 7.0) 50 mmol / L FPOX-CE 6kU / L Peroxidase 120 kU / L
  • HbA1c measurement kit comprising the following first reagent and second reagent was prepared.
  • First reagent Bis-Tris (pH 6.8) 10 mmol / L C10TMA 16g / L 2-Octyl-4-isothiazolin-3-one 0.4 g / L Calcium chloride dihydrate 10mmol / L Thermolysin 1800kU / L DA-67 20 ⁇ mol / L
  • Second reagent ADA (pH 7.0) 50 mmol / L FPOX-CE 6kU / L Peroxidase 120 kU / L
  • An HbA1c measurement kit comprising the following first reagent and second reagent was prepared.
  • First reagent Bis-Tris (pH 6.8) 10 mmol / L C10TMA 16g / L 1,2-Benzisothiazol-3 (2H) -one 0.2 g / L Calcium chloride dihydrate 10mmol / L Thermolysin 1800kU / L DA-67 20 ⁇ mol / L
  • Second reagent ADA (pH 7.0) 50 mmol / L FPOX-CE 6kU / L Peroxidase 120 kU / L
  • An HbA1c measurement kit comprising the following first reagent and second reagent was prepared.
  • First reagent Bis-Tris (pH 6.8) 10 mmol / L LMT 5g / L 2-Octyl-4-isothiazolin-3-one 0.2 g / L Calcium chloride dihydrate 10mmol / L Thermolysin 1800kU / L DA-67 20 ⁇ mol / L
  • Second reagent ADA (pH 7.0) 50 mmol / L FPOX-CE 6kU / L Peroxidase 120 kU / L
  • An HbA1c measurement kit comprising the following first reagent and second reagent was prepared.
  • First reagent Bis-Tris (pH 6.8) 10 mmol / L LMT 5g / L 1,2-Benzisothiazol-3 (2H) -one 0.2 g / L Calcium chloride dihydrate 10mmol / L Thermolysin 1800kU / L DA-67 20 ⁇ mol / L
  • Second reagent ADA (pH 7.0) 50 mmol / L FPOX-CE 6kU / L Peroxidase 120 kU / L
  • An HbA1c measurement kit comprising the following first reagent and second reagent was prepared.
  • First reagent Bis-Tris (pH 6.8) 10 mmol / L Anon BL 5g / L 2-Octyl-4-isothiazolin-3-one 0.4 g / L Calcium chloride dihydrate 10mmol / L Thermolysin 1800kU / L DA-67 20 ⁇ mol / L
  • Second reagent ADA (pH 7.0) 50 mmol / L FPOX-CE 6kU / L Peroxidase 120 kU / L
  • An HbA1c measurement kit comprising the following first reagent and second reagent was prepared.
  • First reagent Bis-Tris (pH 6.8) 10 mmol / L
  • Calcium chloride dihydrate 10mmol / L
  • Thermolysin 1800kU / L DA-67 20 ⁇ mol / L
  • Second reagent ADA (pH 7.0) 50 mmol / L FPOX-CE 6kU / L Peroxidase 120 kU / L
  • An HbA1c measurement kit comprising the following first reagent and second reagent was prepared.
  • First reagent MES pH 6.0
  • 20 mmol / L C12py 1.2g / L 2-Octyl-4-isothiazolin-3-one 0.2 g / L
  • Calcium acetate 10mmol / L Sodium nitrate 100mmol / L Actinase E 340 kU / L DA-67 20 ⁇ mol / L
  • Second reagent ADA (pH 7.0) 50 mmol / L FPOX-CET 2.5 kU / L Triton X-405 7.1g / L Peroxidase 120 kU / L
  • An HbA1c measurement kit comprising the following first reagent and second reagent was prepared.
  • First reagent MES pH 6.5
  • 20 mmol / L C12py 1.6g / L 2-Octyl-4-isothiazolin-3-one 0.2 g / L Calcium nitrate 10mmol / L Sodium nitrate 100mmol / L
  • Second reagent ADA (pH 7.0) 50 mmol / L FPOX-CET 6kU / L Triton X-405 7.1g / L Peroxidase 120 kU / L
  • An HbA1c measurement kit comprising the following first reagent and second reagent was prepared.
  • First reagent MES pH 6.5
  • 20 mmol / L C12py 1.6g / L 4,5-dichloro-2-octyl-4-isothiazolin-3-one 0.04 g / L
  • Sodium nitrate 100mmol / L
  • Second reagent ADA (pH 7.0) 50 mmol / L FPOX-CET 6kU / L Triton X-405 7.1g / L Peroxidase 120 kU / L
  • An HbA1c measurement kit comprising the following first reagent and second reagent was prepared.
  • First reagent MES pH 6.5
  • 20 mmol / L C12py 1.6g / L 2-Octyl-4-isothiazolin-3-one
  • 0.2 g / L Calcium nitrate 10mmol / L Sodium nitrate 100mmol / L Actinase E 340 kU / L DA-67 20 ⁇ mol / L
  • Second reagent ADA (pH 7.0) 50 mmol / L FPOX-CET 6kU / L Triton X-405 7.1g / L Peroxidase 120 kU / L
  • An HbA1c measurement kit comprising the following first reagent and second reagent was prepared.
  • First reagent MES pH 6.5
  • 20 mmol / L C12py 1.6g / L 4,5-dichloro-2-octyl-4-isothiazolin-3-one 0.04 g / L
  • Calcium nitrate 10mmol / L
  • Sodium nitrate 100mmol / L Actinase E 340 kU / L DA-67 20 ⁇ mol / L
  • Second reagent ADA (pH 7.0) 50 mmol / L FPOX-CET 6kU / L Triton X-405 7.1g / L Peroxidase 120 kU / L
  • Example 1 Using the kit of Example 1 as a HbA1c measurement kit and whole blood derived from 10 subjects suspected of having diabetes as a sample, the total hemoglobin concentration (quantity) of HbA1c concentration (quantity) in each sample by the following procedure ) [HbA1c (%)].
  • JDS Japan Diabetes Society
  • each blood cell HbA1c (%) in the fraction was determined by an immunoassay using a determiner L HbA1c (manufactured by Kyowa Medex) according to the method described in the package insert of the determiner L HbA1c.
  • the measurement method using the kit of Comparative Example 1 that does not contain an isothiazolinone derivative is strongly affected by hemoglobin, and accurate measurement of HbA1c is difficult, whereas the kits of Examples 1 and 2 that contain an isothiazolinone derivative are difficult. It has been found that the measurement method of the present invention using HbA1c is not affected by hemoglobin and can accurately measure HbA1c.
  • reaction absorbance for each specimen was measured by the same method using the kits of Examples 9, 10 and Comparative Example 5 instead of the kit of Example 1. The results are shown in FIG.
  • the measurement method using the kit of Comparative Example 5 that does not contain an isothiazolinone derivative is strongly affected by hemoglobin, and it is difficult to accurately measure HbA1c, whereas the kits of Examples 9 and 10 containing an isothiazolinone derivative are difficult. It has been found that the measurement method of the present invention using HbA1c is not affected by hemoglobin and can accurately measure HbA1c.
  • Test Example 2 Effect of isothiazolinone derivative (2) As a kit, the kit of Example 1 is used as a specimen, and the hemolyzed specimen prepared in (1) of Test Example 1 is used as a specimen.
  • the HbA1c concentration ( ⁇ mol / L) in each sample was determined from a calibration curve showing the relationship between the HbA1c concentration ( ⁇ mol / L) and the absorbance.
  • the hemoglobin concentration in each sample was measured using hemoglobin B-Test Wako, and the hemoglobin concentration ( ⁇ mol) in each sample was determined from the obtained measurement value and the calibration curve prepared in Example 9 (1). / L) was determined.
  • HbA1c concentration ( ⁇ mol / L) and hemoglobin concentration ( ⁇ mol / L) in each specimen.
  • JDS Japan Diabetes Society
  • kits of Examples 2 to 13, 15, 17 to 22 and Comparative Examples 1 to 11 instead of the kit of Example 1, and each sample was subjected to each sample.
  • the HbA1c concentration (%) was measured.
  • the HbA1c concentration (%) in the specimen having a hemoglobin concentration of 6 mg / mL was defined as a reference 0, and the difference [ ⁇ HbA1c concentration (%)] of the HbA1c concentration (%) of each specimen from the reference was calculated.
  • the results are shown in Table 2.
  • the ratio (%) of HbA1c to the total hemoglobin is constant regardless of the hemoglobin concentration. Therefore, the closer the ⁇ HbA1c concentration (%) is to 0, the less the HbA1c measurement method is affected by the hemoglobin concentration.
  • Table 2 it was found that the kit of the present invention containing the isothiazolinone derivative was not affected by the hemoglobin concentration as compared with the kit of the comparative example not containing the isothiazolinone derivative.
  • each kit of Examples 15 and 16 and Comparative Example 8 was used as a kit, and the hemolyzed sample prepared in (1) of Test Example 1 was used as a sample.
  • the reaction absorbance for each specimen was measured. The results are shown in FIG.
  • each kit of Examples 21 and 22 and Comparative Example 11 was used as a kit, and the hemolyzed sample prepared in (1) of Test Example 1 was used as a sample.
  • the reaction absorbance for each specimen was measured. The results are shown in FIG.
  • the absorbance of the reaction increased in proportion to the hemoglobin concentration in both the kit of the present invention and the kit of the comparative example, but the kit of the present invention containing the isothiazolinone derivative was used.
  • the reaction absorbance was higher in the hemoglobin sample having the same concentration (that is, the sample having the same concentration of HbA1c) as compared to the case of using the kit of the comparative example not containing isothiazolinone.
  • the hemolyzed specimen used for the measurement is prepared from the same human blood, the HbA1c concentration increases depending on the hemoglobin concentration.
  • the higher the reaction absorbance the higher the reliability as measurement data, without being affected by hemoglobin.
  • the kits of Examples 7 and 8 were used, a higher reaction absorbance was obtained in the specimen having the same concentration of HbA1c than when the kit of Comparative Example 4 was used.
  • kits of Examples 15 and 16 are used, the kit of Examples 21 and 22 is compared with the kit of Comparative Example 11 as compared to the case of using the kit of Comparative Example 8.
  • a high reaction absorbance was obtained in the specimen having the same concentration of HbA1c. Therefore, the measurement method using the kit of the present invention containing an isothiazolinone derivative is less affected by hemoglobin and has a higher sensitivity for the measurement of HbA1c than the measurement method using a comparative kit containing no isothiazolinone derivative. It turned out to be possible.
  • a measurement method, a measurement reagent, and a measurement kit for glycated hemoglobin in a hemoglobin-containing sample which are useful for measurement of glycated hemoglobin useful for diagnosis of diabetes.

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

　ヘモグロビン含有試料に、界面活性剤存在下に、タンパク質分解酵素を作用させた後、フルクトシルペプチド酸化酵素を作用させる反応において、当該反応をイソチアゾリノン誘導体存在下に行い、生成した過酸化水素を測定することを特徴とする、ヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビンの測定方法。　本発明により、ヘモグロビンの影響を受けることなく、ヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビンを正確、かつ、高感度に測定する方法が提供される。

Description

糖化ヘモグロビンの測定方法
　本発明は、糖化ヘモグロビンの測定方法、測定試薬、及び、測定キットに関する。
　糖化ヘモグロビンは、ヘモグロビンにグルコースが結合した糖化物である。ヘモグロビンはα鎖、β鎖からなる四量体の構造を取っているが、β鎖のＮ末端が糖化したものはヘモグロビンＡ１ｃと呼ばれ、血糖値が高い程、増加することから、糖尿病マーカーとして、臨床検査において測定されている。
　糖化ヘモグロビンの測定方法としては、ＨＰＬＣ法等のクロマトグラフィ法、電気泳動法、ラテックス免疫凝集法など抗体を利用する免疫測定法、糖化タンパク質に作用する酵素と、糖化ペプチド及び／又は糖化アミノ酸に作用する酵素とを用いる酵素測定法等が知られている。
　糖化ヘモグロビンの酵素測定法としては、先ず、ヘモグロビン含有試料中のヘモグロビンを変性剤により変性させ、変性したヘモグロビンにタンパク質分解酵素を作用させ、次いで生成した糖化ペプチドに糖化ペプチド酸化酵素を作用させ、生成した過酸化水素をペルオキシダーゼ等の過酸化活性物質の存在下に、酸化発色型色原体と反応させて色素に導き、生成した色素の吸光度から糖化ヘモグロビンを測定する方法（吸光度法）等が知られている。
　しかしながら、この吸光度法による糖化ヘモグロビンの測定においては、試料中に大量に存在するヘモグロビンの干渉が問題となる。この課題に対する解決手段としては、例えば、カチオン性界面活性剤及び／又は両性界面活性剤を用いる方法（特許文献１）、スルホン化合物及び／又はニトロ化合物を用いる方法（特許文献２、特許文献３）、テトラゾリウム化合物を用いる方法（特許文献４）、ポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸塩類等の特定の陰イオン系界面活性剤を用いる方法（特許文献５）等が知られている。
　しかしながら、これらの方法においても、必ずしもヘモグロビンの影響が回避される訳ではなく、ヘモグロビンの影響を受けない、ヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビンの正確な測定方法が求められている。
特開平３－０１０６９６号公報 ＷＯ２００３／１０７０１１パンフレット 特開２００７－１４７６３０号公報 特開２０００－２１０１００号公報 ＷＯ２００５／０４９８５８パンフレット
　本発明の目的は、ヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビンを、ヘモグロビンの影響を受けることなく、正確、かつ、高感度に測定するための方法及び試薬を提供することにある。
　本発明者らは鋭意検討したところ、界面活性剤存在下に、ヘモグロビン含有試料にタンパク質分解酵素を作用させた後、フルクトシルペプチド酸化酵素を作用させる反応において、当該反応をイソチアゾリノン誘導体存在下に行い、生成した過酸化水素を測定することにより、ヘモグロビンの影響を受けることなく、ヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビンを正確、かつ、高感度に測定できる、という知見を見出し、本発明を完成させた。すなわち、本発明は、以下の［１］～［１５］に関する。
［１］　ヘモグロビン含有試料に、界面活性剤存在下に、タンパク質分解酵素を作用させた後、フルクトシルペプチド酸化酵素を作用させる反応において、当該反応をイソチアゾリノン誘導体存在下に行い、生成した過酸化水素を測定することを特徴とする、ヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビンの測定方法。
［２］　イソチアゾリノン誘導体が、下記式（Ｉ）で表わされる化合物である［１］記載の測定方法。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
　式中、Ａ１は、水素原子、又は、置換若しくは非置換のアルキルを表し、Ａ２とＡ３は、同一又は異なって、水素原子、置換若しくは非置換のアルキル、ハロゲン原子を表すか、または、一緒になって環構造を形成する）
［３］　式（Ｉ）で表わされる化合物が、２－アルキル－４－イソチアゾリン－３－オン、１，２－ベンゾイソチアゾール－３（２Ｈ）－オン、及び、２－アルキル－４，５－ジハロゲノ－４－イソチアゾリン－３－オンからなる群より選ばれるイソチアゾリノン誘導体である［２］記載の測定方法。
［４］　過酸化水素の測定が、過酸化水素測定試薬により行われる、［１］～［３］のいずれかに記載の測定方法。
［５］　過酸化水素測定試薬が、ペルオキシダーゼとロイコ型色原体とを含む試薬である［４］記載の測定方法。
［６］　ヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビンを測定するための試薬であって、タンパク質分解酵素、フルクトシルペプチド酸化酵素、イソチアゾリノン誘導体、及び、界面活性剤を含むことを特徴とする糖化ヘモグロビン測定試薬。
［７］　イソチアゾリノン誘導体が、下記式（Ｉ）で表わされる化合物である［６］記載の測定試薬。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
　式中、Ａ１は、水素原子、又は、置換若しくは非置換のアルキルを表し、Ａ２とＡ３は、同一又は異なって、水素原子、置換若しくは非置換のアルキル、ハロゲン原子を表すか、または、一緒になって環構造を形成する）
［８］　式（Ｉ）で表わされる化合物が、２－アルキル－４－イソチアゾリン－３－オン、１，２－ベンゾイソチアゾール－３（２Ｈ）－オン、及び、２－アルキル－４，５－ジハロゲノ－４－イソチアゾリン－３－オンからなる群より選ばれるイソチアゾリノン誘導体である［７］記載の測定試薬。
［９］　さらに、過酸化水素測定試薬を含む、［６］～［８］のいずれかに記載の測定試薬。
［１０］　過酸化水素測定試薬が、ペルオキシダーゼとロイコ型色原体とを含む試薬である［９］記載の試薬。
［１１］　ヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビンを測定するためのキットであって、タンパク質分解酵素、イソチアゾリノン誘導体、及び、界面活性剤を含む第１試薬と、フルクトシルペプチド酸化酵素を含む第２試薬とを含むことを特徴とする糖化ヘモグロビン測定キット。
［１２］　ヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビンを測定するためのキットであって、タンパク質分解酵素、及び、界面活性剤を含む第１試薬と、フルクトシルペプチド酸化酵素、及び、イソチアゾリノン誘導体を含む第２試薬とを含むことを特徴とする糖化ヘモグロビン測定キット。
［１３］　イソチアゾリノン誘導体が、下記式（Ｉ）で表わされる化合物である［１１］又は［１２］記載の測定キット。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000006
　（式中、Ａ１は、水素原子、又は、置換若しくは非置換のアルキルを表し、Ａ２とＡ３は、同一又は異なって、水素原子、置換若しくは非置換のアルキル、ハロゲン原子を表すか、または、一緒になって環構造を形成する）
［１４］　式（Ｉ）で表わされる化合物が、２－アルキル－４－イソチアゾリン－３－オン、１，２－ベンゾイソチアゾール－３（２Ｈ）－オン、及び、２－アルキル－４，５－ジハロゲノ－４－イソチアゾリン－３－オンからなる群より選ばれるイソチアゾリノン誘導体である［１３］記載の測定キット。
［１５］　さらに、ペルオキシダーゼ及びロイコ型色原体が、それぞれ第１試薬と第２試薬、又は、第２試薬と第１試薬に含まれる、［１１］～［１４］のいずれかに記載の測定キット。
　本発明により、ヘモグロビンの影響を受けることなく、ヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビンを正確、かつ、高感度に測定するための方法、試薬及びキットが提供される。
実施例１、実施例２、及び、比較例１のキットを用いる検体中のヘモグロビンＡ１ｃ（以下、ＨｂＡ１ｃとも記す）の測定における、ヘモグロビン濃度と反応吸光度との関係を示すグラフである。●は、比較例１のキット、△は、実施例１のキット、■は、実施例２のキットを用いた測定をそれぞれ表し、縦軸は反応吸光度（×１０－４Ａｂｓ）を、横軸はヘモグロビン濃度（ｍｇ／ｍＬ）を表す。 実施例９、実施例１０、及び、比較例５のキットを用いる検体中のＨｂＡ１ｃの測定における、ヘモグロビン濃度と反応吸光度との関係を示すグラフである。●は、比較例５のキット、▲は、実施例９のキット、□は、実施例１０のキットを用いた測定をそれぞれ表し、縦軸は反応吸光度（×１０－４Ａｂｓ）を、横軸はヘモグロビン濃度（ｍｇ／ｍＬ）を表す。 実施例７、実施例８、及び、比較例４のキットを用いる検体中のＨｂＡ１ｃの測定における、ヘモグロビン濃度と反応吸光度との関係を示すグラフである。●は、比較例４のキット、△は、実施例７のキット、■は、実施例８のキットを用いた測定をそれぞれ表し、縦軸は反応吸光度（×１０－４Ａｂｓ）を、横軸はヘモグロビン濃度（ｍｇ／ｍＬ）を表す。 実施例１５、実施例１６、及び、比較例８のキットを用いる検体中のＨｂＡ１ｃの測定における、ヘモグロビン濃度と反応吸光度との関係を示すグラフである。●は、比較例８のキット、▲は、実施例１５のキット、■は、実施例１６のキットを用いた測定をそれぞれ表し、縦軸は反応吸光度（×１０－４Ａｂｓ）を、横軸はヘモグロビン濃度（ｍｇ／ｍＬ）を表す。 実施例２１、実施例２２、及び、比較例１１のキットを用いる検体中のＨｂＡ１ｃの測定における、ヘモグロビン濃度と反応吸光度との関係を示すグラフである。●は、比較例１１のキット、■は、実施例２１のキット、▲は、実施例２２のキットを用いた測定をそれぞれ表し、縦軸は反応吸光度（×１０－４Ａｂｓ）を、横軸はヘモグロビン濃度（ｍｇ／ｍＬ）を表す。
（１）ヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビンの測定方法
　本発明の、ヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビンの測定方法は、ヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビンに、界面活性剤存在下に、タンパク質分解酵素を作用させた後、フルクトシルペプチド酸化酵素を作用させる反応において、当該反応をイソチアゾリノン誘導体存在下に行い、生成する過酸化水素を測定する方法である。イソチアゾリノン誘導体は、フルクトシルペプチド酸化酵素を作用させる反応に存在させても、タンパク質分解酵素を作用させる反応とフルクトシルペプチド酸化酵素を作用させる反応の両方の反応に存在させてもよい。
　具体的には、以下の工程を含む測定方法が例示される。
＜測定方法１＞
（１）ヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビンに、界面活性剤存在下に、タンパク質分解酵素を作用させる工程；
（２）工程（１）で得られる反応生成物に、イソチアゾリノン誘導体存在下に、フルクトシルペプチド酸化酵素を作用させ、過酸化水素を生成させる工程；
（３）工程（２）で生成した過酸化水素を測定する工程；及び、
（４）既知濃度の糖化ヘモグロビンを用いて予め作成した、過酸化水素量と糖化ヘモグロビン濃度との関係を表す検量線に基づき、工程（３）で測定した過酸化水素量から、ヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビン濃度を決定する工程。
＜測定方法２＞
（１）ヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビンに、イソチアゾリノン誘導体及び界面活性剤の存在下に、タンパク質分解酵素を作用させる工程；
（２）工程（１）で得られる反応生成物に、フルクトシルペプチド酸化酵素と反応させ、過酸化水素を生成させる工程；
（３）工程（２）で生成した過酸化水素を測定する工程；及び、
（４）既知濃度の糖化ヘモグロビンを用いて予め作成した、過酸化水素量と糖化ヘモグロビン濃度との関係を表す検量線に基づき、工程（３）で測定した過酸化水素量から、ヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビン濃度を決定する工程。
　また、本発明のヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビンの測定方法は、ヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビン量の総ヘモグロビン（すなわち、ヘモグロビンと糖化ヘモグロビンを合わせた総ヘモグロビン）量に対する割合を算出する方法をも包含する。この場合、本発明のヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビンの測定方法は、具体的には、以下の工程を含む測定方法である。
＜測定方法３＞
（１）ヘモグロビン含有試料中の総ヘモグロビン（すなわち、ヘモグロビンと糖化ヘモグロビンを合わせた総ヘモグロビン）量を決定する工程；
（２）ヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビンに、界面活性剤存在下、タンパク質分解酵素を作用させる工程；
（３）工程（２）で得られる反応生成物に、イソチアゾリノン誘導体存在下に、フルクトシルペプチド酸化酵素を作用させ、過酸化水素を生成させる工程；
（４）工程（３）で生成した過酸化水素を測定する工程；及び、
（５）既知量の糖化ヘモグロビンを用いて予め作成した、過酸化水素量と糖化ヘモグロビン量との関係を表す検量線に基づき、工程（４）で測定した過酸化水素量から、ヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビン量を決定する工程；及び、
（６）工程（１）で決定した総ヘモグロビン量と、工程（５）で決定した糖化ヘモグロビン量から、ヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビン量の総ヘモグロビン量に対する割合を算出する工程。
　上記工程（１）の総ヘモグロビン量の決定は、工程（２）の後に行うこともできる。
＜測定方法４＞
（１）ヘモグロビン含有試料中の総ヘモグロビン（すなわち、ヘモグロビンと糖化ヘモグロビンを合わせた総ヘモグロビン）量を決定する工程；
（２）ヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビンに、イソチアゾリノン誘導体と界面活性剤存在下、タンパク質分解酵素を作用させる工程；
（３）工程（２）で得られる反応生成物に、フルクトシルペプチド酸化酵素を作用させ、過酸化水素を生成させる工程；
（４）工程（３）で生成した過酸化水素を測定する工程；及び、
（５）既知量の糖化ヘモグロビンを用いて予め作成した、過酸化水素量と糖化ヘモグロビン量との関係を表す検量線に基づき、工程（４）で測定した過酸化水素量から、ヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビン量を決定する工程；及び、
（６）工程（１）で決定した総ヘモグロビン量と、工程（５）で決定した糖化ヘモグロビン量から、ヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビン量の総ヘモグロビン量に対する割合を算出する工程。
　上記工程（１）の総ヘモグロビン量の決定は、工程（２）の後に行うこともできる。
　本発明の測定方法におけるヘモグロビン含有試料は、ヘモグロビンを含有し、本発明の糖化ヘモグロビンの測定方法が適用可能な試料であれば特に制限はなく、例えば全血、血球、血球に血漿が混在した試料、これらの試料を溶血処理した試料等が挙げられる。溶血処理としては、全血、血球、血球に血漿が混在した試料を溶血させる処理であれば特に制限はなく、例えば物理的方法、化学的方法、生物学的方法等が挙げられる。物理的方法としては、例えば蒸留水等の低張液を用いる方法、超音波を用いる方法等が挙げられる。化学的方法としては、例えばメタノール、エタノール、アセトン等の有機溶媒を用いる方法、ポリオキシエチレン系界面活性剤を用いる方法等が挙げられる。生物学的方法としては、例えば抗体や補体を用いる方法等が挙げられる。
　本発明における糖化ヘモグロビンは、ヘモグロビンにグルコース等の糖が結合して生成したものであり、ヘモグロビンＡ１ａ、ヘモグロビンＡ１ｂ、ヘモグロビンＡ１ｃ等が挙げられ、ヘモグロビンＡ１ｃが好ましい。
　本発明におけるイソチアゾリノン誘導体としては、本発明の糖化ヘモグロビンの測定方法を可能とするイソチアゾリノン誘導体であれば特に制限はないが、例えば、下記式（Ｉ）で表わされる化合物［以下、化合物（Ｉ）という］が挙げられる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000007
（式中、Ａ１は、水素原子、又は、置換若しくは非置換のアルキルを表し、Ａ２とＡ３は、同一又は異なって、水素原子、置換若しくは非置換のアルキル、ハロゲン原子を表すか、または、一緒になって環構造を形成する）
　化合物（Ｉ）におけるＡ１は置換若しくは非置換のアルキルを表し、Ａ２とＡ３は、同一又は異なって、水素原子、置換若しくは非置換のアルキル、ハロゲン原子を表すか、または、一緒になって環構造を形成する。置換若しくは非置換のアルキルにおけるアルキルとしては、例えば炭素数１～２０の直鎖アルキル、炭素数３～２０の分岐アルキル等が挙げられる。炭素数１～２０の直鎖アルキルとしては、例えばメチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル、ノニル、デシル、ウンデシル、ドデシル（ラウリル）、トリデシル、テトラデシル（ミリスチル）、ペンタデシル、ヘキサデシル（セチル）、ヘプタデシル、オクタデシル（ステアリル）、ノナデシル、イコシル等が挙げられる。炭素数３～２０の分岐アルキルとしては、例えばイソプロピル、イソブチル、イソペンチル、イソヘキシル、イソヘプチル、イソオクチル、イソノニル、イソデシル、イソウンデシル、イソドデシル、イソトリデシル、イソテトラデシル、イソペンタデシル、イソヘキサデシル、イソヘプタデシル、イソオクタデシル、イソノナデシル、イソイコシル、オクチルドデシル等が挙げられる。ハロゲン原子としては、例えば塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子等が挙げられる。置換アルキルにおける置換基としては、例えばフェニル基、水酸基、スルホ基、シアノ基、ハロゲン原子等が挙げられる。ハロゲン原子としては、例えば前述のハロゲン原子等が挙げられる。
　Ａ２とＡ３とが一緒になって形成される環構造としては、例えばベンゼン環、ナフタレン環等が挙げられる。
　化合物（Ｉ）の具体例としては、例えば２－アルキル－４－イソチアゾリン－３－オン、１，２－ベンゾイソチアゾール－３（２Ｈ）－オン、２－アルキル－４，５－ジハロゲノ－４－イソチアゾリン－３－オン等が挙げられる。市販の化合物（Ｉ）としては、例えば２－オクチル－４－イソチアゾリン－３－オン（東京化成社製）、１，２－ベンゾイソチアゾール－３（２Ｈ）－オン（和光純薬工業社製）、４，５－ジクロロ－２－オクチル－４－イソチアゾリン－３－オン（ハイケム社製）等が挙げられる。
　本発明の糖化ヘモグロビンの測定方法において、イソチアゾリノン誘導体の反応液中の濃度としては、本発明の糖化ヘモグロビンの測定方法を可能とする濃度であれば、特に制限はないが、通常０．００５～２０ｍｍｏｌ／Ｌであり、好ましくは０．０１～１０ｍｍｏｌ／Ｌである。
　本発明における界面活性剤としては、本発明の糖化ヘモグロビンの測定方法を可能とする界面活性剤であれば特に制限はなく、例えば陽イオン性界面活性剤、陰イオン性界面活性剤、両性界面活性剤、非イオン性界面活性剤等が挙げられる。
　陽イオン性界面活性剤としては、例えば第四級アンモニウム塩、ピリジニウム塩、ホスホニウム塩、イミダゾリウム塩、イソキノリニウム塩等が挙げられ、第四級アンモニウム塩、ピリジニウム塩、ホスホニウム塩が好ましい。
　第四級アンモニウム塩としては、炭素数８～２０の直鎖アルキルを少なくとも１つ有する第四級アンモニウム塩が好ましい。炭素数８～２０の直鎖アルキルとしては、例えばオクチル、ノニル、デシル、ウンデシル、ドデシル（ラウリル）、トリデシル、テトラデシル（ミリスチル）、ペンタデシル、ヘキサデシル（セチル）、ヘプタデシル、オクタデシル（ステアリル）、ノナデシル、イコシル等が挙げられる。
　第四級アンモニウム塩の具体例（製品）としては、例えばデシルトリメチルアンモニウム　クロライド、デシルトリメチルアンモニウム　ブロマイド（以下、Ｃ１０ＴＭＡと記す）、ドデシルトリメチルアンモニウム　クロライド、ドデシルトリメチルアンモニウム　ブロマイド、ヘキサデシルトリメチルアンモニウム　クロライド、ヘキサデシルトリメチルアンモニウム　ブロマイド、ジデシルジメチルアンモニウム　クロライド、ジデシルジメチルアンモニウム　ブロマイド、ジドデシルジメチルアンモニウム　クロライド、ジドデシルジメチルアンモニウム　ブロマイド（いずれも、東京化成社製）等が挙げられる。
　ピリジニウム塩としては、以下の一般式（ＩＩ）で表わされるピリジニウム塩［以下、化合物（ＩＩ）という］が使用される。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000008
　式中、Ｒ１は、置換若しくは非置換のアルキル、又は置換若しくは非置換のアルケニル、Ｒａは、水素原子、置換若しくは非置換のアルキル、又は置換若しくは非置換のアルケニル、ｎは、１～５の整数、Ｘ－は、１価のアニオンをそれぞれ表す。
　Ｒ１において、置換若しくは非置換のアルキルにおけるアルキルとしては、例えば炭素数１～２０の直鎖アルキル、炭素数３～２０の分岐アルキル等が挙げられ、炭素数８～２０の直鎖アルキル、炭素数８～２０の分岐アルキルが好ましい。炭素数１～２０の直鎖アルキルとしては、例えばメチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル、ノニル、デシル、ウンデシル、ドデシル（ラウリル）、トリデシル、テトラデシル（ミリスチル）、ペンタデシル、ヘキサデシル（セチル）、ヘプタデシル、オクタデシル（ステアリル）、ノナデシル、イコシル等が挙げられる。炭素数３～２０の分岐アルキルとしては、例えばイソプロピル、イソブチル、イソペンチル、イソヘキシル、イソヘプチル、イソオクチル、イソノニル、イソデシル、イソウンデシル、イソドデシル、イソトリデシル、イソテトラデシル、イソペンタデシル、イソヘキサデシル、イソヘプタデシル、イソオクタデシル、イソノナデシル、イソイコシル、オクチルドデシル等が挙げられる。炭素数８～２０の直鎖アルキルとしては、例えば前述の炭素数８～２０の直鎖アルキル等が挙げられる。炭素数８～２０の分岐アルキルとしては、例えばイソオクチル、イソノニル、イソデシル、イソウンデシル、イソドデシル、イソトリデシル、イソテトラデシル、イソペンタデシル、イソヘキサデシル、イソヘプタデシル、イソオクタデシル、イソノナデシル、イソイコシル、オクチルドデシル等が挙げられる。
　Ｒ１において、置換若しくは非置換のアルケニルにおけるアルケニルとしては、例えば炭素数２～２０のアルケニル等が挙げられ、炭素数８～２０のアルケニルが好ましい。炭素数２～２０のアルケニルとしては、例えばビニル、プロペニル、アリル、ブテニル、ペンテニル、ヘキセニル、ヘプテニル、オクテニル、ノネニル、デセニル、ウンデセニル、ドデセニル、テトラデセニル、ペンタデセニル、ヘキサデセニル、ヘプタデセニル、オクタデセニル、オレイル、ノナデセニル、イコセニル等が挙げられる。炭素数８～２０のアルケニルとしては、例えばオクテニル、ノネニル、デセニル、ウンデセニル、ドデセニル、テトラデセニル、ペンタデセニル、ヘキサデセニル、ヘプタデセニル、オクタデセニル、オレイル、ノナデセニル、イコセニル等が挙げられる。
　Ｒ１において、置換アルキル及び置換アルケニルにおける置換基としては、例えばフェニル基、水酸基、スルホ基、シアノ基、ハロゲン原子等が挙げられる。ハロゲン原子としては、例えば塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子等が挙げられる。
　Ｒａにおいて、置換もしくは非置換のアルキルにおけるアルキルとしては、例えば炭素数１～２０の直鎖アルキル、炭素数３～２０の分岐アルキル等が挙げられる。炭素数１～２０の直鎖アルキルとしては、例えば前述の炭素数１～２０の直鎖アルキル等が挙げられる。炭素数３～２０の分岐アルキルとしては、例えば前述の炭素数３～２０の分岐アルキル等が挙げられる。
　Ｒａにおいて、置換もしくは非置換のアルケニルにおけるアルケニルにとしては、例えば炭素数２～２０のアルケニル等が挙げられる。炭素数２～２０のアルケニルとしては、例えば前述の炭素数２～２０の直鎖アルケニル等が挙げられる。
　Ｒａにおいて、置換アルキル及び置換アルケニルにおける置換基としては、例えばフェニル基、水酸基、スルホ基、シアノ基、ハロゲン原子等が挙げられる。フェニル基置換アルキルとしては、例えばベンジル、１－フェニルエチル等が挙げられる。ハロゲン原子としては、例えば塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子等が挙げられる。
　ピリジン環上に２つ以上の置換基がある場合、置換基は同じであっても異なっていてもよい。化合物（ＩＩ）におけるＸ－は、１価のアニオンを表す。１価のアニオンとしては、例えばハロゲンイオン、OH-、PF6 -、BF4 -、CH3CH2OSO3 -、(CF3SO2)2N-等のアニオンが挙げられる。ハロゲンイオンとしては、例えばCl-、Br-、I-等が挙げられる。
　化合物（ＩＩ）の具体例（製品）としては、例えば１－ドデシルピリジニウムクロライド（以下、Ｃ１２ｐｙと記す；東京化成社製）、１－セチルピリジニウムクロライド、１－セチル－４－メチルピリジニウムクロライド（東京化成社製）、Ｎ－オクタデシル－４－スチルバゾールブロミド（東京化成社製）等が挙げられる。
　ホスホニウム塩としては、以下の一般式（ＩＩＩ）で表わされるホスホニウム塩［以下、化合物（ＩＩＩ）という］が使用される。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000009
　式中、Ｒ２～Ｒ５は、同一又は異なって、置換若しくは非置換のアルキルを表わす、Ｙ－は、１価のアニオンをそれぞれ表す。
　Ｒ２において、置換若しくは非置換のアルキルにおけるアルキルとしては、例えば炭素数８～２０の直鎖アルキル、炭素数８～２０の分岐アルキル等が挙げられる。炭素数８～２０の直鎖アルキルとしては、例えば前述の炭素数８～２０の直鎖アルキル等が挙げられる。炭素数８～２０の分岐アルキルとしては、例えば前述の炭素数８～２０の分岐アルキル等が挙げられる。置換アルキルにおける置換基としては、例えばフェニル基、水酸基、スルホ基、シアノ基、ハロゲン原子等が挙げられる。フェニル基置換アルキルとしては、例えばベンジル、１－フェニルエチル等が挙げられる。ハロゲン原子としては、例えば塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子等が挙げられる。
　Ｒ３～Ｒ５において、置換若しくは非置換のアルキルにおけるアルキルとしては、例えば炭素数１～２０の直鎖アルキル、炭素数３～２０の分岐アルキル等が挙げられる。炭素数１～２０の直鎖アルキルとしては、例えば前述の炭素数１～２０の直鎖アルキル等が挙げられる。炭素数３～２０の分岐アルキルとしては、例えば前述の炭素数３～２０の分岐アルキル等が挙げられる。置換アルキルにおける置換基としては、例えばフェニル基、水酸基、スルホ基、シアノ基、ハロゲン原子等が挙げられる。フェニル基置換アルキルとしては、例えばベンジル、１－フェニルエチル等が挙げられる。ハロゲン原子としては、例えば塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子等が挙げられる。
　Ｙ－は、１価のアニオンを表す。１価のアニオンとしては、例えばハロゲンイオン、OH-、PF6 -、BF4 -、CH3CH2OSO3 -、(CF3SO2)2N-、B(C6H5)4 -、ベンゾトリアゾレート等のアニオンが挙げられる。ハロゲンイオンとしては、例えばCl-、Br-、I-等が挙げられる。
　化合物（ＩＩＩ）の具体例（製品）としては、例えばテトラオクチルホスホニウムブロマイド（東京化成社製）、トリブチルオクチルホスホニウムブロマイド（東京化成社製）、トリブチルドデシルホスホニウムブロマイド、トリブチルヘキサデシルホスホニウムブロマイド等が挙げられる。
　イミダゾリウム塩としては、以下の一般式（ＩＶ）で表わされるイミダゾリウム塩［以下、化合物（ＩＶ）という］が使用される。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000010
　式中、Ｒ６とＲ８は同一又は異なって、置換若しくは非置換のアルキル、置換若しくは非置換のアルケニルを表し、Ｒ７、Ｒ９、Ｒ１０は、水素原子、置換若しくは非置換アルキル、置換若しくは非置換アルケニルを表し、Ｚ－は、１価のアニオンを表す。
　Ｒ６において、置換若しくは非置換のアルキルにおけるアルキルとしては、例えば炭素数８～２０の直鎖アルキル、炭素数８～２０の分岐アルキル等が挙げられる。炭素数８～２０の直鎖アルキルとしては、例えば前述の炭素数８～２０の直鎖アルキル等が挙げられる。炭素数８～２０の分岐アルキルとしては、例えば前述の炭素数８～２０の分岐アルキル等が挙げられる。
　Ｒ６において、置換若しくは非置換のアルケニルにおけるアルケニルとしては、例えば炭素数８～２０のアルケニル等が挙げられる。炭素数８～２０のアルケニルとしては、例えば前述の炭素数８～２０のアルケニル等が挙げられる。
　Ｒ６において、置換アルキル及び置換アルケニルにおける置換基としては、例えばフェニル基、水酸基、スルホ基、シアノ基、ハロゲン原子等が挙げられる。フェニル基置換アルキルとしては、例えばベンジル、１－フェニルエチル等が挙げられる。ハロゲン原子としては、例えば塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子等が挙げられる。
　Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９及びＲ１０において、置換若しくは非置換のアルキルにおけるアルキルとしては、例えば炭素数１～２０の直鎖アルキル、炭素数３～２０の分岐アルキル等が挙げられる。炭素数１～２０の直鎖アルキルとしては、前述の炭素数１～２０の直鎖アルキル等が挙げられる。炭素数３～２０の分岐アルキルとしては、例えば前述の炭素数３～２０の分岐アルキル等が挙げられる。
　Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９及びＲ１０において、置換若しくは非置換のアルケニルにおけるアルケニルとしては、例えば炭素数２～２０のアルケニル等が挙げられる。炭素数２～２０のアルケニルとしては、例えば前述の炭素数２～２０のアルケニル等が挙げられる。
　Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９及びＲ１０において、置換アルキル及び置換アルケニルにおける置換基としては、例えばフェニル基、水酸基、スルホ基、シアノ基、ハロゲン原子等が挙げられる。フェニル基置換アルキルとしては、例えばベンジル、１－フェニルエチル等が挙げられる。ハロゲン原子としては、例えば塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子等が挙げられる。
　Ｚ－は、１価のアニオンを表す。１価のアニオンとしては、例えばハロゲンイオン、OH-、PF6 -、BF4 -、CH3CH2OSO3 -、(CF3SO2)2N-、(CH3O)2P(=O)O-、B(C6H5)4 -、FeCl4 -、CF3BF3 -、CF3SO3 -、(NC)2N-、CH3(OCH2CH2)2OSO3 -、CH3CH2OSO3 -、HSO4 -、p-CH3C6H4SO3 -等のアニオンが挙げられる。ハロゲンイオンとしては、例えばCl-、Br-、I-等が挙げられる。
　化合物（ＩＶ）の具体例（製品）としては、例えば１－メチル－３－オクチルイミダゾリウムブロマイド（東京化成社製）、１－メチル－３－オクチルイミダゾリウムクロライド（東京化成社製）、１－ドデシル－２－メチル－３－ベンジルイミダゾリウムクロライド等が挙げられる。
　イソキノリニウム塩としては、以下の一般式（Ｖ）で表わされるイソキノリニウム塩［以下、化合物（Ｖ）という］が使用される。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000011
　式中、Ｒ１１は、置換若しくは非置換のアルキル、置換若しくは非置換のアルケニルを表し、Ｗ－は、１価のアニオンを表す。
　Ｒ１１において、置換若しくは非置換のアルキルにおけるアルキルとしては、例えば炭素数８～２０の直鎖アルキル、炭素数８～２０の分岐アルキル等が挙げられる。炭素数８～２０の直鎖アルキルとしては、例えば前述の炭素数８～２０の直鎖アルキル等が挙げられる。炭素数８～２０の分岐アルキルとしては、例えば前述の炭素数８～２０の分岐アルキル等が挙げられる。
　Ｒ１１において、置換若しくは非置換のアルケニルにおけるアルケニルとしては、例えば炭素数８～２０のアルケニル等が挙げられる。炭素数８～２０のアルケニルとしては、例えば前述の炭素数８～２０のアルケニル等が挙げられる。
　Ｒ１１において、置換アルキル及び置換アルケニルにおける置換基としては、例えばフェニル基、水酸基、スルホ基、シアノ基、ハロゲン原子等が挙げられる。フェニル基置換アルキルとしては、例えばベンジル、１－フェニルエチル等が挙げられる。ハロゲン原子としては、例えば塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子等が挙げられる。
　Ｗ－は、１価のアニオンを表す。１価のアニオンとしては、例えばハロゲンイオン等のアニオンが挙げられる。ハロゲンイオンとしては、例えばCl-、Br-、I-等が挙げられる。
　化合物（Ｖ）の具体例（製品）としては、例えばＮ－ラウリルイソキノリニウムクロライド（日油社製）、Ｎ－ラルリルイソキノリニウムブロマイド（日油社製）等が挙げられる。
　陰イオン性界面活性剤としては、例えば硫酸エステル塩、カルボン酸塩、スルホン酸塩、リン酸エステル塩、スルホコハク酸塩、Ｎ－メチルタウリン塩、Ｎ－アルカノイル－Ｎ－メチルタウリン塩等が挙げられる。
　両性界面活性剤としては、例えば第三級アミンオキサイド、アルキルカルボキシベタイン等が挙げられる。
　非イオン性界面活性剤としては、例えばポリオキシエチレンアルキルアミン、ポリオキシエチレンアルケニルアミン、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンアルケニルエーテル、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル、エチレンジアミンテトラポリオキシエチレン、ポリグリセリン脂肪酸エステル等が挙げられ、ポリオキシエチレンアルキルアミン、ポリオキシエチレンアルキルエーテルが好ましい。
　ポリオキシエチレンアルキルアミンにおけるアルキルとしては、例えば炭素数８～２０のアルキル等が挙げられる。炭素数８～２０のアルキルとしては、例えばオクチル、ノニル、デシル、ウンデシル、ドデシル（ラウリル）、トリデシル、テトラデシル（ミリスチル）、ペンタデシル、ヘキサデシル（セチル）、ヘプタデシル、オクタデシル（ステアリル）、ノナデシル、イコシル等が挙げられる。
　ポリオキシエチレンアルケニルアミンにおけるアルケニルとしては、例えば炭素数８～２０のアルケニル等が挙げられる。炭素数８～２０のアルケニルとしては、例えばオクテニル、ノネニル、デセニル、ウンデセニル、ドデセニル、テトラデセニル、ペンタデセニル、ヘキサデセニル、ヘプタデセニル、オクタデセニル、オレイル、ノナデセニル、イコセニル等が挙げられる。
　ポリオキシエチレンアルキルエーテルにおけるアルキルとしては、例えば炭素数８～２０のアルキル等が挙げられる。炭素数８～２０のアルキルとしては、例えば前述の炭素数８～２０のアルキル等が挙げられる。
　ポリオキシエチレンアルケニルエーテルにおけるアルケニルとしては、例えば炭素数８～２０のアルケニル等が挙げられる。炭素数８～２０のアルケニルとしては、例えば前述の炭素数８～２０のアルケニル等が挙げられる。
　ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテルにおけるアルキルとしては、例えば炭素数８～２０のアルキル等が挙げられる。炭素数８～２０のアルキルとしては、例えば前述の炭素数８～２０のアルキル等が挙げられる。
　総ヘモグロビン量は、公知の方法、例えばシアンメトヘモグロビン法、オキシヘモグロビン法、ＳＬＳ－ヘモグロビン法等によって決定することができる。総ヘモグロビン量は、ヘモグロビン含有試料そのもののみならず、ヘモグロビン含有試料にイソチアゾリノン誘導体及び／又は界面活性剤を添加して得られる試料、ヘモグロビン含有試料にイソチアゾリノン誘導体及び／又は界面活性剤とタンパク質分解酵素とを添加して得られる試料に対して、シアンメトヘモグロビン法、オキシヘモグロビン法、ＳＬＳ－ヘモグロビン法を適用することによっても決定することができる。
　ヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビンに、上記界面活性剤存在下、タンパク質分解酵素を作用させる反応は、上記界面活性剤存在下にタンパク質分解酵素が糖化ヘモグロビンに作用し得る条件であれば、いかなる条件下でも行うことができる。ヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビンと、タンパク質分解酵素との反応は、水性媒体中で行われることが好ましい。水性媒体としては後述の水性媒体等が挙げられる。ヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビンと、タンパク質分解酵素との反応における反応温度は、通常１０～５０℃であり、２０～４０℃が好ましく、反応時間は、通常１分間～３時間であり、２．５分間～１時間が好ましい。タンパク質分解酵素の濃度としては、ヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビンと、タンパク質分解酵素との反応が進行する濃度であれば特に制限はなく、通常５０～２５０００ｋＵ／Ｌであり、好ましくは２５０～１００００ｋＵ／Ｌである。
　タンパク質分解酵素としては、ヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビンに作用し、糖化ヘモグロビンから糖化ペプチドを生成させる酵素であれば特に制限はなく、例えばセリンプロテアーゼ（キモトリプシン、スブチリシン等）、システインプロテアーゼ（パパイン、カスパーゼ等）、アスパラギン酸プロテアーゼ（ペプシン、カテプシンＤ等）、メタロプロテアーゼ（サーモリシン等）、Ｎ－末端スレオニンプロテアーゼ、グルタミン酸プロテアーゼ等が挙げられる。本発明においては、市販のタンパク質分解酵素も使用することができ、市販品としては例えばプロテアーゼＰ「アマノ」３Ｇ、プロテアーゼＫ「アマノ」（以上、天野エンザイム社製）、アクチナーゼＡＳ、アクチナーゼＥ（以上、科研ファルマ社製）、サーモリシン（大和化成社製）、スミチームMP(新日本化学工業社製)等が挙げられる。
　上記タンパク質分解酵素を作用させる反応における界面活性剤の濃度としては、ヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビンと、タンパク質分解酵素との反応が進行する濃度であれば特に制限はなく、通常０．０００１～１０％であり、好ましくは０．０００５～５％である。
　ヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビンと、タンパク質分解酵素との反応により、糖化ペプチドを含む反応生成物が生成する。次いで、この反応生成物中の糖化ペプチドに、フルクトシルペプチド酸化酵素と反応し、過酸化水素が生成する。糖化ペプチドとフルクトシルペプチド酸化酵素との反応は、水性媒体中で行われることが好ましい。水性媒体としては後述の水性媒体等が挙げられる。
　糖化ペプチドとフルクトシルペプチド酸化酵素との反応における反応温度は、通常１０～５０℃であり、２０～４０℃が好ましく、反応時間は、通常１分間～３時間であり、２．５分間～１時間が好ましい。フルクトシルペプチド酸化酵素の濃度としては、糖化ヘモグロビンとフルクトシルペプチド酸化酵素との反応が進行する濃度であれば特に制限はなく、通常０．１～３０ｋＵ／Ｌであり、好ましくは０．２～１５ｋＵ／Ｌである。
　フルクトシルペプチド酸化酵素としては、糖化ペプチドに作用して過酸化水素を生成させる酵素であれば特に制限はなく、例えば糸状菌由来、酵母由来、放線菌由来、バクテリア由来、古細菌由来のフルクトシルペプチド酸化酵素等が挙げられる。本発明においては、市販のフルクトシルペプチド酸化酵素も使用することができ、市販品としては例えばＦＰＯＸ－ＣＥ（キッコーマン社製）、ＦＰＯＸ－ＥＥ（キッコーマン社製）、ＦＰＯＸ－ＣＥＴ（キッコーマン社製）等が挙げられる。
　生成した過酸化水素の測定方法としては、例えば電極を用いる方法、過酸化水素測定用試薬を用いる方法等が挙げられ、過酸化水素測定用試薬を用いる方法が好ましい。過酸化水素測定用試薬は、過酸化水素を検出可能な物質に変換するための試薬である。検出可能な物質としては、例えば色素、光（発光）、蛍光等が挙げられ、色素が好ましい。
　検出可能な物質が色素の場合、過酸化水素測定用試薬は、ペルオキシダーゼ等の過酸化活性物質と酸化発色型色原体を含む試薬等が挙げられる。酸化発色型色原体としては、酸化カップリング型色原体、ロイコ型色原体等が挙げられ、ロイコ型色原体が好ましい。ロイコ型色原体としては、例えばフェノチアジン系色原体、トリフェニルメタン系色原体、ジフェニルアミン系色原体、ｏ－フェニレンジアミン、ヒドロキシプロピオン酸、ジアミノベンジジン、テトラメチルベンジジン等が挙げられ、フェノチアジン系色原体が好ましい。フェノチアジン系色原体としては、例えば１０－Ｎ－カルボキシメチルカルバモイル－３，７－ビス（ジメチルアミノ）－１０Ｈ－フェノチアジン（ＣＣＡＰ）、１０－Ｎ－メチルカルバモイル－３，７－ビス（ジメチルアミノ）－１０Ｈ－フェノチアジン（ＭＣＤＰ）、１０－Ｎ－（カルボキシメチルアミノカルボニル）－３，７－ビス（ジメチルアミノ）－１０Ｈ－フェノチアジン ナトリウム塩（ＤＡ－６７）等が挙げられる。フェノチアジン系色原体の中でも、１０－Ｎ－（カルボキシメチルアミノカルボニル）－３，７－ビス（ジメチルアミノ）－１０Ｈ－フェノチアジン ナトリウム塩（ＤＡ－６７）が特に好ましい。トリフェニルメタン系色原体としては、例えばＮ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’，Ｎ’’，Ｎ’’－ヘキサ（３－スルホプロピル）－４，４’，４’’－トリアミノトリフェニルメタン（ＴＰＭ－ＰＳ）等が挙げられる。ジフェニルアミン系色原体としては、例えばＮ－（カルボキシメチルアミノカルボニル）－４，４’－ビス（ジメチルアミノ）ジフェニルアミン ナトリウム塩（ＤＡ－６４）、４，４’－ビス（ジメチルアミノ）ジフェニルアミン、ビス〔３－ビス（４－クロロフェニル）メチル－４－ジメチルアミノフェニル〕アミン（ＢＣＭＡ）等が挙げられる。
　検出可能な物質が光（発光）の場合、過酸化水素測定用試薬は、ペルオキシダーゼ等の過酸化活性物質と化学発光物質を含む試薬等が挙げられる。化学発光物質としては、例えばルミノール、イソルミノール、ルシゲニン、アクリジニウムエステル等が挙げられる。
　検出可能な物質が蛍光の場合、過酸化水素測定用試薬は、ペルオキシダーゼ等の過酸化活性物質と蛍光物質を含む試薬等が挙げられる。蛍光物質としては、例えば４－ヒドロキシフェニル酢酸、３－（４－ヒドロキシフェニル）プロピオン酸、クマリン等が挙げられる。
（２）ヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビン測定試薬
　本発明の、ヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビン測定試薬は、タンパク質分解酵素、フルクトシルペプチド酸化酵素、イソチアゾリノン誘導体、及び、界面活性剤を含む試薬であり、本発明のヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビンの測定方法に用いられる。本発明の測定試薬は、さらに、過酸化水素測定試薬を含んでいてもよい。
　本発明の測定試薬におけるタンパク質分解酵素、フルクトシルペプチド酸化酵素、イソチアゾリノン誘導体、界面活性剤、及び、過酸化水素測定試薬としては、例えば、それぞれ、前述のタンパク質分解酵素、フルクトシルペプチド酸化酵素、イソチアゾリノン誘導体、界面活性剤、及び、過酸化水素測定試薬等が挙げられる。
　本発明の測定試薬におけるタンパク質分解酵素の濃度は、通常５０～２５０００ｋＵ／Ｌであり、好ましくは２５０～１００００ｋＵ／Ｌである。本発明の測定試薬におけるフルクトシルペプチド酸化酵素の濃度は、通常０．１～３０ｋＵ／Ｌであり、好ましくは０．２～１５ｋＵ／Ｌである。
　本発明の測定試薬におけるイソチアゾリノン誘導体の濃度は、通常０．００５～２０ｍｍｏｌ／Ｌであり、好ましくは０．０１～１０ｍｍｏｌ／Ｌである。
　本発明の測定試薬における界面活性剤の濃度は、通常０．０００１～１０％であり、好ましくは０．０００５～５％である。
　本発明の測定試薬には、必要に応じて、水性媒体、安定化剤、防腐剤、塩類、干渉物質消去剤、有機溶媒等が含有されてもよい。
　水性媒体としては、例えば脱イオン水、蒸留水、緩衝液等が挙げられ、緩衝液が好ましい。
　水性媒体のｐＨは、例えばｐＨ４～１０である。水性媒体として緩衝液を用いる場合には、設定するｐＨに応じた緩衝剤を用いることが望ましい。緩衝液に用いる緩衝剤としては、例えばトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝剤、リン酸緩衝剤、ホウ酸緩衝剤、グッドの緩衝剤等が挙げられる。
　グッドの緩衝剤としては、例えば２－モルホリノエタンスルホン酸（ＭＥＳ）、ビス（２－ヒドロキシエチル）イミノトリス（ヒドロキシメチル）メタン（Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓ）、Ｎ－（２－アセトアミド）イミノ二酢酸（ＡＤＡ）、ピペラジン－Ｎ，Ｎ’－ビス（２－エタンスルホン酸）（ＰＩＰＥＳ）、Ｎ－（２－アセトアミド）－２－アミノエタンスルホン酸（ＡＣＥＳ）、３－モルホリノ－２－ヒドロキシプロパンスルホン酸（ＭＯＰＳＯ）、Ｎ，Ｎ－ビス（２－ヒドロキシエチル）－２－アミノエタンスルホン酸（ＢＥＳ）、３－モルホリノプロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）、Ｎ－〔トリス（ヒドロキシメチル）メチル〕－２－アミノエタンスルホン酸（ＴＥＳ）、２－〔４－（２－ヒドロキシエチル）－１－ピペラジニル〕エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、３－〔Ｎ，Ｎ－ビス（２－ヒドロキシエチル）アミノ〕－２－ヒドロキシプロパンスルホン酸（ＤＩＰＳＯ）、Ｎ－〔トリス（ヒドロキシメチル）メチル〕－２－ヒドロキシ－３－アミノプロパンスルホン酸（ＴＡＰＳＯ）、ピペラジン－Ｎ，Ｎ’－ビス（２－ヒドロキシプロパンスルホン酸）（ＰＯＰＳＯ）、３－〔４－（２－ヒドロキシエチル）－１－ピペラジニル〕－２－ヒドロキシプロパンスルホン酸（ＨＥＰＰＳＯ）、３－〔４－（２－ヒドロキシエチル）－１－ピペラジニル〕プロパンスルホン酸〔（Ｈ）ＥＰＰＳ〕、Ｎ－〔トリス（ヒドロキシメチル）メチル〕グリシン（Ｔｒｉｃｉｎｅ）、Ｎ，Ｎ－ビス（２－ヒドロキシエチル）グリシン（Ｂｉｃｉｎｅ）、Ｎ－トリス（ヒドロキシメチル）メチル－３－アミノプロパンスルホン酸（ＴＡＰＳ）、Ｎ－シクロヘキシル－２－アミノエタンスルホン酸（ＣＨＥＳ）、Ｎ－シクロヘキシル－３－アミノ－２－ヒドロキシプロパンスルホン酸（ＣＡＰＳＯ）、Ｎ－シクロヘキシル－３－アミノプロパンスルホン酸（ＣＡＰＳ）等が挙げられる。
　緩衝液の濃度は、通常０．００１～２．０ｍｏｌ／Ｌであり、０．００５～１．０ｍｏｌ／Ｌが好ましい。
　安定化剤としては、例えばエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、シュークロース、塩化カルシウム、酢酸カルシウム、硝酸カルシウム、フェロシアン化カリウム、牛血清アルブミン（ＢＳＡ）、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル等のポリオキシエチレン系界面活性剤等が挙げられる。防腐剤としては、例えばアジ化ナトリウム、抗生物質等があげられる。塩類としては、例えば塩化ナトリウム、硝酸ナトリウム、硫酸ナトリウム、炭酸ナトリウム、ギ酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、塩化カリウム、硝酸カリウム、硫酸カリウム、炭酸カリウム、ギ酸カリウム、酢酸カリウム、等が挙げられる。干渉物質消去剤としては、例えばアスコルビン酸の影響を消去するためのアスコルビン酸オキシダーゼ等が挙げられる。有機溶媒としては、例えばロイコ型色原体の水性媒体への溶解補助剤のためのジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ジメチルスルホキサイド（ＤＭＳＯ）、ジオキサン、アセトン、メタノール、エタノール等が挙げられる。
（３）ヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビン測定キット
　本発明のヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビン測定試薬は、キットの形態で保存、流通及び使用されてよい。本発明のヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビン測定キットは、本発明のヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビンの測定方法に用いられる。本発明の測定キットとしては、例えば２試薬系のキット、３試薬系のキット等が挙げられ、２試薬系キットが好ましい。
　本発明のヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビン測定キットは、本発明のヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビン測定方法を可能とするキットであれば、特に制限はなく、２試薬系キットの場合は、例えばタンパク質分解酵素を含む第１試薬と、フルクトシルペプチド酸化酵素、イソチアゾリノン誘導体、及び、界面活性剤を含む第２試薬とを含むキットや、タンパク質分解酵素、イソチアゾリノン誘導体、及び、界面活性剤を含む第１試薬と、フルクトシルペプチド酸化酵素を含む第２試薬とを含むキット等が挙げられる。
　さらに、本発明の糖化ヘモグロビン測定キットとして、これらのキットの第１試薬、第２試薬のいずれか又は両方に過酸化水素測定試薬が含まれるキットが挙げられる。特に、過酸化水素測定試薬として、ペルオキシダーゼとロイコ型色原体とを含む試薬を用いる場合は、ペルオキシダーゼとロイコ型色原体とは別々の試薬に含まれることが好ましい。すなわち、ペルオキシダーゼとロイコ型色原体とが、それぞれ第１試薬と第２試薬に、又は、第２試薬と第１試薬に含まれることが好ましい。
　本発明の測定キットを構成する試薬中のタンパク質分解酵素の濃度は、通常１００～３００００ｋＵ／Ｌであり、好ましくは５００～１００００ｋＵ／Ｌである。本発明の測定キットを構成する試薬中のフルクトシルペプチド酸化酵素の濃度は、通常０．５～１００ｋＵ／Ｌであり、好ましくは１～５０ｋＵ／Ｌである。
　本発明の測定キットを構成する試薬中のイソチアゾリノン誘導体の濃度は、通常０．００５～２０ｍｍｏｌ／Ｌであり、好ましくは０．０１～１０ｍｍｏｌ／Ｌである。
　本発明の測定キットを構成する試薬中の界面活性剤の濃度は、通常０．０００１～４０％であり、好ましくは０．０００５～２０％である。
　以下、実施例により本発明をより詳細に説明するが、これらは本発明の範囲を何ら限定するものではない。
　尚、本実施例、比較例及び試験例においては、下記メーカーの試薬及び酵素を使用した。
　Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓ（同仁化学研究所社製）、ＡＤＡ（同仁化学研究所社製）、ＭＥＳ（同仁化学研究所社製）、塩化カルシウム２水和物（和光純薬工業社製）、酢酸カルシウム（和光純薬工業社製）、硝酸カルシウム（和光純薬工業社製）、ＤＡ－６７（和光純薬工業社製）、１－ドデシルピリジニウムクロライド（Ｃ１２ｐｙ）［化合物（ＩＩ）；東京化成社製］、デシルトリメチルアンモニウムブロマイド（Ｃ１０ＴＭＡ）（第四級アンモニウム塩；東京化成社製）、ＮＩＫＫＯＬ　ＬＭＴ（ＬＭＴ）［Ｎ－アルカノイル－Ｎ－メチルタウリン塩（Ｎ－ラウロイル－Ｎ－メチルタウリン　ナトリウム塩）；日光ケミカルズ社製］、アノンＢＬ［アルキルカルボキシベタイン（ラウリルジメチルアミノ酢酸ベタイン）；日本油脂社製］、２－オクチル－４－イソチアゾリン－３－オン（イソチアゾリノン誘導体；東京化成社製）、１，２－ベンゾイソチアゾール－３（２Ｈ）－オン（イソチアゾリノン誘導体；和光純薬工業社製）、４，５－ジクロロ－２－オクチル－４－イソチアゾリン－３－オン（ハイオム社製）、サーモリシン（タンパク質分解酵素；大和化成社製）、アクチナーゼＥ（タンパク質分解酵素；科研ファルマ社製）、ＦＰＯＸ－ＣＥ（フルクトシルペプチド酸化酵素；キッコーマン社製）、ＦＰＯＸ－ＣＥＴ（フルクトシルペプチド酸化酵素；キッコーマン社製）、ペルオキシダーゼ（東洋紡績社製）、トリトンＸ－４０５（ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル；シグマ－アルドリッチ社製）。
　以下の第１試薬及び第２試薬からなるＨｂＡ１ｃ測定キットを調製した。
第１試薬
　Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓ（ｐＨ６．８）　　　　　　　　　１０ｍｍｏｌ／Ｌ
　Ｃ１２ｐｙ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　１．６ｇ／Ｌ
　２－オクチル－４－イソチアゾリン－３－オン　　　０．２ｇ／Ｌ
　塩化カルシウム２水和物　　　　　　　　　　　　　１０ｍｍｏｌ／Ｌ
　サーモリシン　　　　　　　　　　　　　　　　　　１８００ｋＵ／Ｌ
　ペルオキシダーゼ　　　　　　　　　　　　　　　　４０ｋＵ／Ｌ
第２試薬
　ＡＤＡ（ｐＨ７．０）　　　　　　　　　　　　　　５０ｍｍｏｌ／Ｌ
　ＦＰＯＸ－ＣＥ　　　　　　　　　　　　　　　　　６ｋＵ／Ｌ
　ＤＡ－６７　　　　　　　　　　　　　　　　　　　６０μｍｏｌ／Ｌ
　以下の第１試薬及び第２試薬からなるＨｂＡ１ｃ測定キットを調製した。
第１試薬
　Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓ（ｐＨ６．８）　　　　　　　　　１０ｍｍｏｌ／Ｌ
　Ｃ１２ｐｙ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　１．６ｇ／Ｌ
　１，２－ベンゾイソチアゾール－３（２Ｈ）－オン　０．４ｇ／Ｌ
　塩化カルシウム２水和物　　　　　　　　　　　　　１０ｍｍｏｌ／Ｌ
　サーモリシン　　　　　　　　　　　　　　　　　　１８００ｋＵ／Ｌ
　ペルオキシダーゼ　　　　　　　　　　　　　　　　４０ｋＵ／Ｌ
第２試薬
　ＡＤＡ（ｐＨ７．０）　　　　　　　　　　　　　　５０ｍｍｏｌ／Ｌ
　ＦＰＯＸ－ＣＥ　　　　　　　　　　　　　　　　　６ｋＵ／Ｌ
　ＤＡ－６７　　　　　　　　　　　　　　　　　　　６０μｍｏｌ／Ｌ
　以下の第１試薬及び第２試薬からなるＨｂＡ１ｃ測定キットを調製した。
第１試薬
　Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓ（ｐＨ６．８）　　　　　　　　　１０ｍｍｏｌ／Ｌ
　Ｃ１０ＴＭＡ　　　　　　　　　　　　　　　　　　１６ｇ／Ｌ
　２－オクチル－４－イソチアゾリン－３－オン　　　０．２ｇ／Ｌ
　塩化カルシウム２水和物　　　　　　　　　　　　　１０ｍｍｏｌ／Ｌ
　サーモリシン　　　　　　　　　　　　　　　　　　１８００ｋＵ／Ｌ
　ペルオキシダーゼ　　　　　　　　　　　　　　　　４０ｋＵ／Ｌ
第２試薬
　ＡＤＡ（ｐＨ７．０）　　　　　　　　　　　　　　５０ｍｍｏｌ／Ｌ
　ＦＰＯＸ－ＣＥ　　　　　　　　　　　　　　　　　６ｋＵ／Ｌ
　ＤＡ－６７　　　　　　　　　　　　　　　　　　　６０μｍｏｌ／Ｌ
　以下の第１試薬及び第２試薬からなるＨｂＡ１ｃ測定キットを調製した。
第１試薬
　Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓ（ｐＨ６．８）　　　　　　　　　１０ｍｍｏｌ／Ｌ
　Ｃ１０ＴＭＡ　　　　　　　　　　　　　　　　　　１６ｇ／Ｌ
　１，２－ベンゾイソチアゾール－３（２Ｈ）－オン　０．２ｇ／Ｌ
　塩化カルシウム２水和物　　　　　　　　　　　　　１０ｍｍｏｌ／Ｌ
　サーモリシン　　　　　　　　　　　　　　　　　　１８００ｋＵ／Ｌ
　ペルオキシダーゼ　　　　　　　　　　　　　　　　４０ｋＵ／Ｌ
第２試薬
　ＡＤＡ（ｐＨ７．０）　　　　　　　　　　　　　　５０ｍｍｏｌ／Ｌ
　ＦＰＯＸ－ＣＥ　　　　　　　　　　　　　　　　　６ｋＵ／Ｌ
　ＤＡ－６７　　　　　　　　　　　　　　　　　　　６０μｍｏｌ／Ｌ
　以下の第１試薬及び第２試薬からなるＨｂＡ１ｃ測定キットを調製した。
第１試薬
　Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓ（ｐＨ６．８）　　　　　　　　　１０ｍｍｏｌ／Ｌ
　ＬＭＴ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　５ｇ／Ｌ
　２－オクチル－４－イソチアゾリン－３－オン　　　０．４ｇ／Ｌ
　塩化カルシウム２水和物　　　　　　　　　　　　　１０ｍｍｏｌ／Ｌ
　サーモリシン　　　　　　　　　　　　　　　　　　１８００ｋＵ／Ｌ
　ペルオキシダーゼ　　　　　　　　　　　　　　　　４０ｋＵ／Ｌ
第２試薬
　ＡＤＡ（ｐＨ７．０）　　　　　　　　　　　　　　５０ｍｍｏｌ／Ｌ
　ＦＰＯＸ－ＣＥ　　　　　　　　　　　　　　　　　６ｋＵ／Ｌ
　ＤＡ－６７　　　　　　　　　　　　　　　　　　　６０μｍｏｌ／Ｌ
　以下の第１試薬及び第２試薬からなるＨｂＡ１ｃ測定キットを調製した。
第１試薬
　Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓ（ｐＨ６．８）　　　　　　　　　１０ｍｍｏｌ／Ｌ
　ＬＭＴ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　５ｇ／Ｌ
　１，２－ベンゾイソチアゾール－３（２Ｈ）－オン　０．２ｇ／Ｌ
　塩化カルシウム２水和物　　　　　　　　　　　　　１０ｍｍｏｌ／Ｌ
　サーモリシン　　　　　　　　　　　　　　　　　　１８００ｋＵ／Ｌ
　ペルオキシダーゼ　　　　　　　　　　　　　　　　４０ｋＵ／Ｌ
第２試薬
　ＡＤＡ（ｐＨ７．０）　　　　　　　　　　　　　　５０ｍｍｏｌ／Ｌ
　ＦＰＯＸ－ＣＥ　　　　　　　　　　　　　　　　　６ｋＵ／Ｌ
　ＤＡ－６７　　　　　　　　　　　　　　　　　　　６０μｍｏｌ／Ｌ
　以下の第１試薬及び第２試薬からなるＨｂＡ１ｃ測定キットを調製した。
第１試薬
　Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓ（ｐＨ６．８）　　　　　　　　　１０ｍｍｏｌ／Ｌ
　アノンＢＬ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　５ｇ／Ｌ
　２－オクチル－４－イソチアゾリン－３－オン　　　０．２ｇ／Ｌ
　塩化カルシウム２水和物　　　　　　　　　　　　　１０ｍｍｏｌ／Ｌ
　サーモリシン　　　　　　　　　　　　　　　　　　１８００ｋＵ／Ｌ
　ペルオキシダーゼ　　　　　　　　　　　　　　　　４０ｋＵ／Ｌ
第２試薬
　ＡＤＡ（ｐＨ７．０）　　　　　　　　　　　　　　５０ｍｍｏｌ／Ｌ
　ＦＰＯＸ－ＣＥ　　　　　　　　　　　　　　　　　６ｋＵ／Ｌ
　ＤＡ－６７　　　　　　　　　　　　　　　　　　　６０μｍｏｌ／Ｌ
　以下の第１試薬及び第２試薬からなるＨｂＡ１ｃ測定キットを調製した。
第１試薬
　Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓ（ｐＨ６．８）　　　　　　　　　１０ｍｍｏｌ／Ｌ
　アノンＢＬ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　５ｇ／Ｌ
　１，２－ベンゾイソチアゾール－３（２Ｈ）－オン　０．４ｇ／Ｌ
　塩化カルシウム２水和物　　　　　　　　　　　　　１０ｍｍｏｌ／Ｌ
　サーモリシン　　　　　　　　　　　　　　　　　　１８００ｋＵ／Ｌ
　ペルオキシダーゼ　　　　　　　　　　　　　　　　４０ｋＵ／Ｌ
第２試薬
　ＡＤＡ（ｐＨ７．０）　　　　　　　　　　　　　　５０ｍｍｏｌ／Ｌ
　ＦＰＯＸ－ＣＥ　　　　　　　　　　　　　　　　　６ｋＵ／Ｌ
　ＤＡ－６７　　　　　　　　　　　　　　　　　　　６０μｍｏｌ／Ｌ
　以下の第１試薬及び第２試薬からなるＨｂＡ１ｃ測定キットを調製した。
第１試薬
　Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓ（ｐＨ６．８）　　　　　　　　　１０ｍｍｏｌ／Ｌ
　Ｃ１２ｐｙ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　１．６ｇ／Ｌ
　２－オクチル－４－イソチアゾリン－３－オン　　　０．４ｇ／Ｌ
　塩化カルシウム２水和物　　　　　　　　　　　　　１０ｍｍｏｌ／Ｌ
　サーモリシン　　　　　　　　　　　　　　　　　　１８００ｋＵ／Ｌ
　ＤＡ－６７　　　　　　　　　　　　　　　　　　　２０μｍｏｌ／Ｌ
第２試薬
　ＡＤＡ（ｐＨ７．０）　　　　　　　　　　　　　　５０ｍｍｏｌ／Ｌ
　ＦＰＯＸ－ＣＥ　　　　　　　　　　　　　　　　　６ｋＵ／Ｌ
　ペルオキシダーゼ　　　　　　　　　　　　　　　　１２０ｋＵ／Ｌ
　以下の第１試薬及び第２試薬からなるＨｂＡ１ｃ測定キットを調製した。
第１試薬
　Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓ（ｐＨ６．８）　　　　　　　　　１０ｍｍｏｌ／Ｌ
　Ｃ１２ｐｙ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　１．６ｇ／Ｌ
　１，２－ベンゾイソチアゾール－３（２Ｈ）－オン　０．２ｇ／Ｌ
　塩化カルシウム２水和物　　　　　　　　　　　　　１０ｍｍｏｌ／Ｌ
　サーモリシン　　　　　　　　　　　　　　　　　　１８００ｋＵ／Ｌ
　ＤＡ－６７　　　　　　　　　　　　　　　　　　　２０μｍｏｌ／Ｌ
第２試薬
　ＡＤＡ（ｐＨ７．０）　　　　　　　　　　　　　　５０ｍｍｏｌ／Ｌ
　ＦＰＯＸ－ＣＥ　　　　　　　　　　　　　　　　　６ｋＵ／Ｌ
　ペルオキシダーゼ　　　　　　　　　　　　　　　　１２０ｋＵ／Ｌ
　以下の第１試薬及び第２試薬からなるＨｂＡ１ｃ測定キットを調製した。
第１試薬
　Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓ（ｐＨ６．８）　　　　　　　　　１０ｍｍｏｌ／Ｌ
　Ｃ１０ＴＭＡ　　　　　　　　　　　　　　　　　　１６ｇ／Ｌ
　２－オクチル－４－イソチアゾリン－３－オン　　　０．４ｇ／Ｌ
　塩化カルシウム２水和物　　　　　　　　　　　　　１０ｍｍｏｌ／Ｌ
　サーモリシン　　　　　　　　　　　　　　　　　　１８００ｋＵ／Ｌ
　ＤＡ－６７　　　　　　　　　　　　　　　　　　　２０μｍｏｌ／Ｌ
第２試薬
　ＡＤＡ（ｐＨ７．０）　　　　　　　　　　　　　　５０ｍｍｏｌ／Ｌ
　ＦＰＯＸ－ＣＥ　　　　　　　　　　　　　　　　　６ｋＵ／Ｌ
　ペルオキシダーゼ　　　　　　　　　　　　　　　　１２０ｋＵ／Ｌ
　以下の第１試薬及び第２試薬からなるＨｂＡ１ｃ測定キットを調製した。
第１試薬
　Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓ（ｐＨ６．８）　　　　　　　　　１０ｍｍｏｌ／Ｌ
　Ｃ１０ＴＭＡ　　　　　　　　　　　　　　　　　　１６ｇ／Ｌ
　１，２－ベンゾイソチアゾール－３（２Ｈ）－オン　０．２ｇ／Ｌ
　塩化カルシウム２水和物　　　　　　　　　　　　　１０ｍｍｏｌ／Ｌ
　サーモリシン　　　　　　　　　　　　　　　　　　１８００ｋＵ／Ｌ
　ＤＡ－６７　　　　　　　　　　　　　　　　　　　２０μｍｏｌ／Ｌ
第２試薬
　ＡＤＡ（ｐＨ７．０）　　　　　　　　　　　　　　５０ｍｍｏｌ／Ｌ
　ＦＰＯＸ－ＣＥ　　　　　　　　　　　　　　　　　６ｋＵ／Ｌ
　ペルオキシダーゼ　　　　　　　　　　　　　　　　１２０ｋＵ／Ｌ
　以下の第１試薬及び第２試薬からなるＨｂＡ１ｃ測定キットを調製した。
第１試薬
　Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓ（ｐＨ６．８）　　　　　　　　　１０ｍｍｏｌ／Ｌ
　ＬＭＴ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　５ｇ／Ｌ
　２－オクチル－４－イソチアゾリン－３－オン　　　０．２ｇ／Ｌ
　塩化カルシウム２水和物　　　　　　　　　　　　　１０ｍｍｏｌ／Ｌ
　サーモリシン　　　　　　　　　　　　　　　　　　１８００ｋＵ／Ｌ
　ＤＡ－６７　　　　　　　　　　　　　　　　　　　２０μｍｏｌ／Ｌ
第２試薬
　ＡＤＡ（ｐＨ７．０）　　　　　　　　　　　　　　５０ｍｍｏｌ／Ｌ
　ＦＰＯＸ－ＣＥ　　　　　　　　　　　　　　　　　６ｋＵ／Ｌ
　ペルオキシダーゼ　　　　　　　　　　　　　　　　１２０ｋＵ／Ｌ
　以下の第１試薬及び第２試薬からなるＨｂＡ１ｃ測定キットを調製した。
第１試薬
　Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓ（ｐＨ６．８）　　　　　　　　　１０ｍｍｏｌ／Ｌ
　ＬＭＴ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　５ｇ／Ｌ
　１，２－ベンゾイソチアゾール－３（２Ｈ）－オン　０．２ｇ／Ｌ
　塩化カルシウム２水和物　　　　　　　　　　　　　１０ｍｍｏｌ／Ｌ
　サーモリシン　　　　　　　　　　　　　　　　　　１８００ｋＵ／Ｌ
　ＤＡ－６７　　　　　　　　　　　　　　　　　　　２０μｍｏｌ／Ｌ
第２試薬
　ＡＤＡ（ｐＨ７．０）　　　　　　　　　　　　　　５０ｍｍｏｌ／Ｌ
　ＦＰＯＸ－ＣＥ　　　　　　　　　　　　　　　　　６ｋＵ／Ｌ
　ペルオキシダーゼ　　　　　　　　　　　　　　　　１２０ｋＵ／Ｌ
　以下の第１試薬及び第２試薬からなるＨｂＡ１ｃ測定キットを調製した。
第１試薬
　Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓ（ｐＨ６．８）　　　　　　　　　１０ｍｍｏｌ／Ｌ
　アノンＢＬ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　５ｇ／Ｌ
　２－オクチル－４－イソチアゾリン－３－オン　　　０．４ｇ／Ｌ
　塩化カルシウム２水和物　　　　　　　　　　　　　１０ｍｍｏｌ／Ｌ
　サーモリシン　　　　　　　　　　　　　　　　　　１８００ｋＵ／Ｌ
　ＤＡ－６７　　　　　　　　　　　　　　　　　　　２０μｍｏｌ／Ｌ
第２試薬
　ＡＤＡ（ｐＨ７．０）　　　　　　　　　　　　　　５０ｍｍｏｌ／Ｌ
　ＦＰＯＸ－ＣＥ　　　　　　　　　　　　　　　　　６ｋＵ／Ｌ
　ペルオキシダーゼ　　　　　　　　　　　　　　　　１２０ｋＵ／Ｌ
　以下の第１試薬及び第２試薬からなるＨｂＡ１ｃ測定キットを調製した。
第１試薬
　Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓ（ｐＨ６．８）　　　　　　　　　１０ｍｍｏｌ／Ｌ
　アノンＢＬ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　５ｇ／Ｌ
　１，２－ベンゾイソチアゾール－３（２Ｈ）－オン　０．４ｇ／Ｌ
　塩化カルシウム２水和物　　　　　　　　　　　　　１０ｍｍｏｌ／Ｌ
　サーモリシン　　　　　　　　　　　　　　　　　　１８００ｋＵ／Ｌ
　ＤＡ－６７　　　　　　　　　　　　　　　　　　　２０μｍｏｌ／Ｌ
第２試薬
　ＡＤＡ（ｐＨ７．０）　　　　　　　　　　　　　　５０ｍｍｏｌ／Ｌ
　ＦＰＯＸ－ＣＥ　　　　　　　　　　　　　　　　　６ｋＵ／Ｌ
　ペルオキシダーゼ　　　　　　　　　　　　　　　　１２０ｋＵ／Ｌ
　以下の第１試薬及び第２試薬からなるＨｂＡ１ｃ測定キットを調製した。
第１試薬
　ＭＥＳ（ｐＨ６．０）　　　　　　　　　　　　　　２０ｍｍｏｌ／Ｌ
　Ｃ１２ｐｙ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　１．２ｇ／Ｌ
　２－オクチル－４－イソチアゾリン－３－オン　　　０．２ｇ／Ｌ
　酢酸カルシウム　　　　　　　　　　　　　　　　　１０ｍｍｏｌ／Ｌ
　硝酸ナトリウム　　　　　　　　　　　　　　　　　１００ｍｍｏｌ／Ｌ
　アクチナーゼＥ　　　　　　　　　　　　　　　　　３４０ｋＵ／Ｌ
　ＤＡ－６７　　　　　　　　　　　　　　　　　　　２０μｍｏｌ／Ｌ
第２試薬
　ＡＤＡ（ｐＨ７．０）　　　　　　　　　　　　　　５０ｍｍｏｌ／Ｌ
　ＦＰＯＸ－ＣＥＴ　　　　　　　　　　　　　　　　２．５ｋＵ／Ｌ
　トリトンＸ－４０５　　　　　　　　　　　　　　　７．１ｇ／Ｌ
　ペルオキシダーゼ　　　　　　　　　　　　　　　　１２０ｋＵ／Ｌ
　以下の第１試薬及び第２試薬からなるＨｂＡ１ｃ測定キットを調製した。
第１試薬
　ＭＥＳ（ｐＨ６．０）　　　　　　　　　　　　　　２０ｍｍｏｌ／Ｌ
　Ｃ１２ｐｙ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　１．２ｇ／Ｌ
　１，２－ベンゾイソチアゾール－３（２Ｈ）－オン　０．０４ｇ／Ｌ
　酢酸カルシウム　　　　　　　　　　　　　　　　　１０ｍｍｏｌ／Ｌ
　硝酸ナトリウム　　　　　　　　　　　　　　　　　１００ｍｍｏｌ／Ｌ
　アクチナーゼＥ　　　　　　　　　　　　　　　　　３４０ｋＵ／Ｌ
　ＤＡ－６７　　　　　　　　　　　　　　　　　　　２０μｍｏｌ／Ｌ
第２試薬
　ＡＤＡ（ｐＨ７．０）　　　　　　　　　　　　　　５０ｍｍｏｌ／Ｌ
　ＦＰＯＸ－ＣＥＴ　　　　　　　　　　　　　　　　２．５ｋＵ／Ｌ
　トリトンＸ－４０５　　　　　　　　　　　　　　　７．１ｇ／Ｌ
　ペルオキシダーゼ　　　　　　　　　　　　　　　　１２０ｋＵ／Ｌ
　以下の第１試薬及び第２試薬からなるＨｂＡ１ｃ測定キットを調製した。
第１試薬
　ＭＥＳ（ｐＨ６．５）　　　　　　　　　　　　　　２０ｍｍｏｌ／Ｌ
　Ｃ１２ｐｙ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　１．６ｇ／Ｌ
　２－オクチル－４－イソチアゾリン－３－オン　　　０．２ｇ／Ｌ
　硝酸カルシウム　　　　　　　　　　　　　　　　　１０ｍｍｏｌ／Ｌ
　硝酸ナトリウム　　　　　　　　　　　　　　　　　１００ｍｍｏｌ／Ｌ
　サーモリシン　　　　　　　　　　　　　　　　　　１８００ｋＵ／Ｌ
　ＤＡ－６７　　　　　　　　　　　　　　　　　　　２０μｍｏｌ／Ｌ
第２試薬
　ＡＤＡ（ｐＨ７．０）　　　　　　　　　　　　　　５０ｍｍｏｌ／Ｌ
　ＦＰＯＸ－ＣＥＴ　　　　　　　　　　　　　　　　６ｋＵ／Ｌ
　トリトンＸ－４０５　　　　　　　　　　　　　　　７．１ｇ／Ｌ
　ペルオキシダーゼ　　　　　　　　　　　　　　　　１２０ｋＵ／Ｌ
　以下の第１試薬及び第２試薬からなるＨｂＡ１ｃ測定キットを調製した。
第１試薬
　ＭＥＳ（ｐＨ６．５）　　　　　　　　　　　　　　２０ｍｍｏｌ／Ｌ
　Ｃ１２ｐｙ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　１．６ｇ／Ｌ
　４，５－ジクロロ－２－オクチル－４－イソチアゾリン－３－オン
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　０．０４ｇ／Ｌ
　硝酸カルシウム　　　　　　　　　　　　　　　　　１０ｍｍｏｌ／Ｌ
　硝酸ナトリウム　　　　　　　　　　　　　　　　　１００ｍｍｏｌ／Ｌ
　サーモリシン　　　　　　　　　　　　　　　　　　１８００ｋＵ／Ｌ
　ＤＡ－６７　　　　　　　　　　　　　　　　　　　２０μｍｏｌ／Ｌ
第２試薬
　ＡＤＡ（ｐＨ７．０）　　　　　　　　　　　　　　５０ｍｍｏｌ／Ｌ
　ＦＰＯＸ－ＣＥＴ　　　　　　　　　　　　　　　　６ｋＵ／Ｌ
　トリトンＸ－４０５　　　　　　　　　　　　　　　７．１ｇ／Ｌ
　ペルオキシダーゼ　　　　　　　　　　　　　　　　１２０ｋＵ／Ｌ
　以下の第１試薬及び第２試薬からなるＨｂＡ１ｃ測定キットを調製した。
第１試薬
　ＭＥＳ（ｐＨ６．５）　　　　　　　　　　　　　　２０ｍｍｏｌ／Ｌ
　Ｃ１２ｐｙ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　１．６ｇ／Ｌ
　２－オクチル－４－イソチアゾリン－３－オン　　　０．２ｇ／Ｌ
　硝酸カルシウム　　　　　　　　　　　　　　　　　１０ｍｍｏｌ／Ｌ
　硝酸ナトリウム　　　　　　　　　　　　　　　　　１００ｍｍｏｌ／Ｌ
　アクチナーゼＥ　　　　　　　　　　　　　　　　　３４０ｋＵ／Ｌ
　ＤＡ－６７　　　　　　　　　　　　　　　　　　　２０μｍｏｌ／Ｌ
第２試薬
　ＡＤＡ（ｐＨ７．０）　　　　　　　　　　　　　　５０ｍｍｏｌ／Ｌ
　ＦＰＯＸ－ＣＥＴ　　　　　　　　　　　　　　　　６ｋＵ／Ｌ
　トリトンＸ－４０５　　　　　　　　　　　　　　　７．１ｇ／Ｌ
　ペルオキシダーゼ　　　　　　　　　　　　　　　　１２０ｋＵ／Ｌ
　以下の第１試薬及び第２試薬からなるＨｂＡ１ｃ測定キットを調製した。
第１試薬
　ＭＥＳ（ｐＨ６．５）　　　　　　　　　　　　　　２０ｍｍｏｌ／Ｌ
　Ｃ１２ｐｙ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　１．６ｇ／Ｌ
　４，５－ジクロロ－２－オクチル－４－イソチアゾリン－３－オン
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　０．０４ｇ／Ｌ
　硝酸カルシウム　　　　　　　　　　　　　　　　　１０ｍｍｏｌ／Ｌ
　硝酸ナトリウム　　　　　　　　　　　　　　　　　１００ｍｍｏｌ／Ｌ
　アクチナーゼＥ　　　　　　　　　　　　　　　　　３４０ｋＵ／Ｌ
　ＤＡ－６７　　　　　　　　　　　　　　　　　　　２０μｍｏｌ／Ｌ
第２試薬
　ＡＤＡ（ｐＨ７．０）　　　　　　　　　　　　　　５０ｍｍｏｌ／Ｌ
　ＦＰＯＸ－ＣＥＴ　　　　　　　　　　　　　　　　６ｋＵ／Ｌ
　トリトンＸ－４０５　　　　　　　　　　　　　　　７．１ｇ／Ｌ
　ペルオキシダーゼ　　　　　　　　　　　　　　　　１２０ｋＵ／Ｌ
　ＨｂＡ１ｃ測定キットとして、実施例１のキットを、試料として、糖尿病が疑われる１０名の被験者由来の全血を用いて、以下の手順により、各試料におけるＨｂＡ１ｃ濃度（量）の総ヘモグロビン濃度（量）に対する割合［ＨｂＡ１ｃ（％）］を決定した。
（１）総ヘモグロビン濃度決定のための検量線の作成
　測定キットとして、総ヘモグロビン測定用キットであるヘモグロビンＢ－テストワコー（ＳＬＳ－ヘモグロビン法）（和光純薬工業社製）を用いて、検体として、ヘモグロビンＢ－テストワコーに付属の標準品（ヘモグロビン濃度：１５．３ｍｇ／ｍＬ）を用いて、ヘモグロビン濃度と吸光度との関係を示す検量線を作成した。
（２）ＨｂＡ１ｃ濃度決定のための検量線の作成
　ラテックス免疫凝集法と、血球画分の総ヘモグロビン値とから、ＨｂＡ１ｃ濃度が２．７７μｍｏｌ／Ｌ、６．３３μｍｏｌ／Ｌと値付けされた２つの血球画分について、実施例１のＨｂＡ１ｃ測定キットを用いて測定し、各血球画分に対する吸光度を測定した。当該血球画分の代わりに生理食塩水を用いて、生理食塩水に対するＨｂＡ１ｃ濃度を測定した。当該血球画分に対するそれぞれの吸光度から、生理食塩水に対する吸光度を差し引いて算出した値を、当該血球画分に対するブランク補正吸光度とした。当該血球画分に対するブランク補正吸光度と、生理食塩水に対するブランク補正吸光度（０ Ａｂｓ）とから、ＨｂＡ１ｃ濃度（μｍｏｌ／Ｌ）と吸光度との間の関係を示す検量線を作成した。
（３）各血球画分におけるヘモグロビン濃度の決定
　各試料に対して、２５℃、３０００ｒｐｍで５分間遠心分離を行い、血球画分を得た。各血球画分について、ヘモグロビンＢ－テストワコーを用いて測定し、得られた測定値と（１）の検量線とから、各血球画分中のヘモグロビン濃度（μｍｏｌ／Ｌ）を決定した。
（４）各血球画分におけるＨｂＡ１ｃ濃度の決定
　各血球画分について、実施例１の測定キットを用いて測定し、得られた測定値と（２）の検量線とから、各血球画分中のＨｂＡ１ｃ濃度（μｍｏｌ／Ｌ）を決定した。
（５）ＨｂＡ１ｃ（％）（＝ＨｂＡ１ｃ濃度のヘモグロビン濃度に対する割合）の決定
　上記（３）で決定した各血球画分におけるヘモグロビン濃度（μｍｏｌ／Ｌ）と、上記（４）で決定した各血球画分におけるＨｂＡ１ｃ濃度（μｍｏｌ／Ｌ）とから、以下の式により、日本糖尿病学会（Japan Diabetes Society；ＪＤＳ）値のＨｂＡ１ｃ（％）を算出した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000012
（６）同一血球画分中のＨｂＡ１ｃ（％）の免疫測定法での決定
　上記（５）でのＨｂＡ１ｃ（％）の決定に使用した血球画分と同一の血球画分を用いて、各血球画分中のＨｂＡ１ｃ（％）を、デタミナーＬ　ＨｂＡ１ｃ（協和メデックス社製）を用いる免疫測定法により、デタミナーＬ　ＨｂＡ１ｃの添付文書に記載の方法に従って決定した。
（７）本発明の測定方法と免疫測定法との相関
　本発明の測定方法を用いて、上記（５）で決定したＨｂＡ１ｃ（％）と、免疫測定法を用いて、上記（６）で決定したＨｂＡ１ｃ（％）とから、本発明の測定方法と免疫測定法との間の相関関係を検証し、相関係数を決定した。
　同様に、実施例１の測定キットの代わりに、実施例２～２２の測定キットを用いて、デタミナーＬ　ＨｂＡ１ｃ（協和メデックス社製）を用いた測定との間の相関係数を決定した。その結果を第１表に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000013
　第１表に示す通り、実施例１～２２の測定キットを用いる本発明の測定方法と、免疫測定法との間に良好な相関関係が認められた。従って、実施例１～２２の測定キットを用いる本発明の測定方法により、試料中のＨｂＡ１ｃを正確、かつ、高感度に測定できることが明らかとなった。
［比較例１］
　以下の第１試薬及び第２試薬からなるＨｂＡ１ｃ測定キットを調製した。
第１試薬
　Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓ（ｐＨ６．８）　　　　　　　　　１０ｍｍｏｌ／Ｌ
　Ｃ１２ｐｙ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　１．６ｇ／Ｌ
　塩化カルシウム２水和物　　　　　　　　　　　　　１０ｍｍｏｌ／Ｌ
　サーモリシン　　　　　　　　　　　　　　　　　　１８００ｋＵ／Ｌ
　ペルオキシダーゼ　　　　　　　　　　　　　　　　４０ｋＵ／Ｌ
第２試薬
　ＡＤＡ（ｐＨ７．０）　　　　　　　　　　　　　　５０ｍｍｏｌ／Ｌ
　ＦＰＯＸ－ＣＥ　　　　　　　　　　　　　　　　　６ｋＵ／Ｌ
　ＤＡ－６７　　　　　　　　　　　　　　　　　　　６０μｍｏｌ／Ｌ
［比較例２］
　以下の第１試薬及び第２試薬からなるＨｂＡ１ｃ測定キットを調製した。
第１試薬
　Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓ（ｐＨ６．８）　　　　　　　　　１０ｍｍｏｌ／Ｌ
　Ｃ１０ＴＭＡ　　　　　　　　　　　　　　　　　　１６ｇ／Ｌ
　塩化カルシウム２水和物　　　　　　　　　　　　　１０ｍｍｏｌ／Ｌ
　サーモリシン　　　　　　　　　　　　　　　　　　１８００ｋＵ／Ｌ
　ペルオキシダーゼ　　　　　　　　　　　　　　　　４０ｋＵ／Ｌ
第２試薬
　ＡＤＡ（ｐＨ７．０）　　　　　　　　　　　　　　５０ｍｍｏｌ／Ｌ
　ＦＰＯＸ－ＣＥ　　　　　　　　　　　　　　　　　６ｋＵ／Ｌ
　ＤＡ－６７　　　　　　　　　　　　　　　　　　　６０μｍｏｌ／Ｌ
［比較例３］
　以下の第１試薬及び第２試薬からなるＨｂＡ１ｃ測定キットを調製した。
第１試薬
　Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓ（ｐＨ６．８）　　　　　　　　　１０ｍｍｏｌ／Ｌ
　ＬＭＴ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　５ｇ／Ｌ
　塩化カルシウム２水和物　　　　　　　　　　　　　１０ｍｍｏｌ／Ｌ
　サーモリシン　　　　　　　　　　　　　　　　　　１８００ｋＵ／Ｌ
　ペルオキシダーゼ　　　　　　　　　　　　　　　　４０ｋＵ／Ｌ
第２試薬
　ＡＤＡ（ｐＨ７．０）　　　　　　　　　　　　　　５０ｍｍｏｌ／Ｌ
　ＦＰＯＸ－ＣＥ　　　　　　　　　　　　　　　　　６ｋＵ／Ｌ
　ＤＡ－６７　　　　　　　　　　　　　　　　　　　６０μｍｏｌ／Ｌ
［比較例４］
　以下の第１試薬及び第２試薬からなるＨｂＡ１ｃ測定キットを調製した。
第１試薬
　Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓ（ｐＨ６．８）　　　　　　　　　１０ｍｍｏｌ／Ｌ
　アノンＢＬ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　５ｇ／Ｌ
　塩化カルシウム２水和物　　　　　　　　　　　　　１０ｍｍｏｌ／Ｌ
　サーモリシン　　　　　　　　　　　　　　　　　　１８００ｋＵ／Ｌ
　ペルオキシダーゼ　　　　　　　　　　　　　　　　４０ｋＵ／Ｌ
第２試薬
　ＡＤＡ（ｐＨ７．０）　　　　　　　　　　　　　　５０ｍｍｏｌ／Ｌ
　ＦＰＯＸ－ＣＥ　　　　　　　　　　　　　　　　　６ｋＵ／Ｌ
　ＤＡ－６７　　　　　　　　　　　　　　　　　　　６０μｍｏｌ／Ｌ
［比較例５］
　以下の第１試薬及び第２試薬からなるＨｂＡ１ｃ測定キットを調製した。
第１試薬
　Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓ（ｐＨ６．８）　　　　　　　　　１０ｍｍｏｌ／Ｌ
　Ｃ１２ｐｙ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　１．６ｇ／Ｌ
　塩化カルシウム２水和物　　　　　　　　　　　　　１０ｍｍｏｌ／Ｌ
　サーモリシン　　　　　　　　　　　　　　　　　　１８００ｋＵ／Ｌ
　ＤＡ－６７　　　　　　　　　　　　　　　　　　　２０μｍｏｌ／Ｌ
第２試薬
　ＡＤＡ（ｐＨ７．０）　　　　　　　　　　　　　　５０ｍｍｏｌ／Ｌ
　ＦＰＯＸ－ＣＥ　　　　　　　　　　　　　　　　　６ｋＵ／Ｌ
　ペルオキシダーゼ　　　　　　　　　　　　　　　　１２０ｋＵ／Ｌ
［比較例６］
　以下の第１試薬及び第２試薬からなるＨｂＡ１ｃ測定キットを調製した。
第１試薬
　Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓ（ｐＨ６．８）　　　　　　　　　１０ｍｍｏｌ／Ｌ
　Ｃ１０ＴＭＡ　　　　　　　　　　　　　　　　　　１６ｇ／Ｌ
　塩化カルシウム２水和物　　　　　　　　　　　　　１０ｍｍｏｌ／Ｌ
　サーモリシン　　　　　　　　　　　　　　　　　　１８００ｋＵ／Ｌ
　ＤＡ－６７　　　　　　　　　　　　　　　　　　　２０μｍｏｌ／Ｌ
第２試薬
　ＡＤＡ（ｐＨ７．０）　　　　　　　　　　　　　　５０ｍｍｏｌ／Ｌ
　ＦＰＯＸ－ＣＥ　　　　　　　　　　　　　　　　　６ｋＵ／Ｌ
　ペルオキシダーゼ　　　　　　　　　　　　　　　　１２０ｋＵ／Ｌ
［比較例７］
　以下の第１試薬及び第２試薬からなるＨｂＡ１ｃ測定キットを調製した。
第１試薬
　Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓ（ｐＨ６．８）　　　　　　　　　１０ｍｍｏｌ／Ｌ
　ＬＭＴ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　５ｇ／Ｌ
　塩化カルシウム２水和物　　　　　　　　　　　　　１０ｍｍｏｌ／Ｌ
　サーモリシン　　　　　　　　　　　　　　　　　　１８００ｋＵ／Ｌ
　ＤＡ－６７　　　　　　　　　　　　　　　　　　　２０μｍｏｌ／Ｌ
第２試薬
　ＡＤＡ（ｐＨ７．０）　　　　　　　　　　　　　　５０ｍｍｏｌ／Ｌ
　ＦＰＯＸ－ＣＥ　　　　　　　　　　　　　　　　　６ｋＵ／Ｌ
　ペルオキシダーゼ　　　　　　　　　　　　　　　　１２０ｋＵ／Ｌ
［比較例８］
　以下の第１試薬及び第２試薬からなるＨｂＡ１ｃ測定キットを調製した。
第１試薬
　Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓ（ｐＨ６．８）　　　　　　　　　１０ｍｍｏｌ／Ｌ
　アノンＢＬ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　５ｇ／Ｌ
　塩化カルシウム２水和物　　　　　　　　　　　　　１０ｍｍｏｌ／Ｌ
　サーモリシン　　　　　　　　　　　　　　　　　　１８００ｋＵ／Ｌ
　ＤＡ－６７　　　　　　　　　　　　　　　　　　　２０μｍｏｌ／Ｌ
第２試薬
　ＡＤＡ（ｐＨ７．０）　　　　　　　　　　　　　　５０ｍｍｏｌ／Ｌ
　ＦＰＯＸ－ＣＥ　　　　　　　　　　　　　　　　　６ｋＵ／Ｌ
　ペルオキシダーゼ　　　　　　　　　　　　　　　　１２０ｋＵ／Ｌ
［比較例９］
　以下の第１試薬及び第２試薬からなるＨｂＡ１ｃ測定キットを調製した。
第１試薬
　ＭＥＳ（ｐＨ６．０）　　　　　　　　　　　　　　２０ｍｍｏｌ／Ｌ
　Ｃ１２ｐｙ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　１．２ｇ／Ｌ
　酢酸カルシウム　　　　　　　　　　　　　　　　　１０ｍｍｏｌ／Ｌ
　硝酸ナトリウム　　　　　　　　　　　　　　　　　１００ｍｍｏｌ／Ｌ
　アクチナーゼＥ　　　　　　　　　　　　　　　　　３４０ｋＵ／Ｌ
　ＤＡ－６７　　　　　　　　　　　　　　　　　　　２０μｍｏｌ／Ｌ
第２試薬
　ＡＤＡ（ｐＨ７．０）　　　　　　　　　　　　　　５０ｍｍｏｌ／Ｌ
　ＦＰＯＸ－ＣＥＴ　　　　　　　　　　　　　　　　２．５ｋＵ／Ｌ
　トリトンＸ－４０５　　　　　　　　　　　　　　　７．１ｇ／Ｌ
　ペルオキシダーゼ　　　　　　　　　　　　　　　　１２０ｋＵ／Ｌ
［比較例１０］
　以下の第１試薬及び第２試薬からなるＨｂＡ１ｃ測定キットを調製した。
第１試薬
　ＭＥＳ（ｐＨ６．５）　　　　　　　　　　　　　　２０ｍｍｏｌ／Ｌ
　Ｃ１２ｐｙ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　１．６ｇ／Ｌ
　硝酸カルシウム　　　　　　　　　　　　　　　　　１０ｍｍｏｌ／Ｌ
　硝酸ナトリウム　　　　　　　　　　　　　　　　　１００ｍｍｏｌ／Ｌ
　サーモリシン　　　　　　　　　　　　　　　　　　１８００ｋＵ／Ｌ
　ＤＡ－６７　　　　　　　　　　　　　　　　　　　２０μｍｏｌ／Ｌ
第２試薬
　ＡＤＡ（ｐＨ７．０）　　　　　　　　　　　　　　５０ｍｍｏｌ／Ｌ
　ＦＰＯＸ－ＣＥＴ　　　　　　　　　　　　　　　　６ｋＵ／Ｌ
　トリトンＸ－４０５　　　　　　　　　　　　　　　７．１ｇ／Ｌ
　ペルオキシダーゼ　　　　　　　　　　　　　　　　１２０ｋＵ／Ｌ
［比較例１１］
　以下の第１試薬及び第２試薬からなるＨｂＡ１ｃ測定キットを調製した。
第１試薬
　ＭＥＳ（ｐＨ６．５）　　　　　　　　　　　　　　２０ｍｍｏｌ／Ｌ
　Ｃ１２ｐｙ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　１．６ｇ／Ｌ
　硝酸カルシウム　　　　　　　　　　　　　　　　　１０ｍｍｏｌ／Ｌ
　硝酸ナトリウム　　　　　　　　　　　　　　　　　１００ｍｍｏｌ／Ｌ
　アクチナーゼＥ　　　　　　　　　　　　　　　　　３４０ｋＵ／Ｌ
　ＤＡ－６７　　　　　　　　　　　　　　　　　　　２０μｍｏｌ／Ｌ
第２試薬
　ＡＤＡ（ｐＨ７．０）　　　　　　　　　　　　　　５０ｍｍｏｌ／Ｌ
　ＦＰＯＸ－ＣＥＴ　　　　　　　　　　　　　　　　６ｋＵ／Ｌ
　トリトンＸ－４０５　　　　　　　　　　　　　　　７．１ｇ／Ｌ
　ペルオキシダーゼ　　　　　　　　　　　　　　　　１２０ｋＵ／Ｌ
［試験例１］　イソチアゾリノン誘導体の効果（１）
（１）溶血検体の調製
　ヒト血液を遠心分離して得られた血球画分を、ヘモグロビン測定試薬であるネスコート　ヘモキット－Ｎ（アルフレッサファーマ社製）を用いて測定し、該血球画分のヘモグロビン濃度を決定した。次いで、この値付けされた該血球画分を精製水で希釈して溶血させ、ヘモグロビン濃度が２ｍｇ／ｍＬ、４ｍｇ／ｍＬ、６ｍｇ／ｍＬ、８ｍｇ／ｍＬ及び１０ｍｇ／ｍＬの各溶血検体を調製した。
（２）溶血検体に対する反応吸光度の測定
　キットとして、実施例１のキットを用いて、検体として、生理食塩水（ヘモグロビン濃度が０ｍｇ／ｍＬ）及び（１）で調製した溶血検体を用いて、以下の方法により、各検体に対する反応吸光度を測定した。
　反応セルへ、検体９．６μＬと、実施例１のキットの第１試薬１２０μＬとを添加し、３７℃で５分間加温し（第一反応）、反応液の吸光度（Ｅ１）を主波長６６０ｎｍ、副波長８００ｎｍで測定し、次いでこの反応液に第２試薬４０μＬを添加しさらに３７℃で５分間加温し（第二反応）、反応液の吸光度（Ｅ２）を主波長６６０ｎｍ、副波長８００ｎｍで測定し、Ｅ２からＥ１を差し引いた吸光度差△Ｅ（＝Ｅ２－Ｅ１）を、各検体に対する反応吸光度とした。
　キットとして、実施例１のキットの代わりに，実施例２及び比較例１の各キットを用いて、同様の方法により、各検体に対する反応吸光度を測定した。その結果を第１図に示す。
　第１図から明らかな様に、イソチアゾリノン誘導体を含む実施例１及び２のキットを用いる本発明の測定方法においては、ヘモグロビン濃度に比例して反応吸光度が上昇したが、イソチアゾリノン誘導体を含まない比較例１のキットを用いる測定方法においては、ヘモグロビン濃度と反応吸光度との間に比例関係が認められなかった。測定に用いた溶血検体は、同一のヒト血液より調製されたものであるため、ＨｂＡ１ｃ濃度はヘモグロビン濃度に依存して高くなる。従って、イソチアゾリノン誘導体を含まない比較例１のキットを用いる測定方法は、ヘモグロビンの影響を強く受け、ＨｂＡ１ｃの正確な測定が困難であるのに対して、イソチアゾリノン誘導体を含む実施例１及び２のキットを用いる本発明の測定方法は、ヘモグロビンの影響を受けず、ＨｂＡ１ｃの正確な測定が可能であることが分かった。
　さらに、キットとして、実施例１のキットの代わりに、実施例９、１０及び比較例５の各キットを用いて、同様の方法により、各検体に対する反応吸光度を測定した。その結果を第２図に示す。
　第２図から明らかな様に、イソチアゾリノン誘導体を含む実施例９及び１０のキットを用いる本発明の測定方法においては、ヘモグロビン濃度に比例して反応吸光度が上昇したが、イソチアゾリノン誘導体を含まない比較例５のキットを用いる測定方法においては、ヘモグロビン濃度と反応吸光度との間に比例関係が認められなかった。測定に用いた溶血検体は、同一のヒト血液より調製されたものであるため、ＨｂＡ１ｃ濃度はヘモグロビン濃度に依存して高くなる。従って、イソチアゾリノン誘導体を含まない比較例５のキットを用いる測定方法は、ヘモグロビンの影響を強く受け、ＨｂＡ１ｃの正確な測定が困難であるのに対して、イソチアゾリノン誘導体を含む実施例９及び１０のキットを用いる本発明の測定方法は、ヘモグロビンの影響を受けず、ＨｂＡ１ｃの正確な測定が可能であることが分かった。
［試験例２］　イソチアゾリノン誘導体の効果（２）
　キットとして、実施例１のキットを、検体として、試験例１の（１）で調製した溶血検体を用いて測定を行い、得られた測定値を基に、実施例９の（２）で作成したＨｂＡ１ｃ濃度（μｍｏｌ／Ｌ）と吸光度との間の関係を示す検量線から、各検体中のＨｂＡ１ｃ濃度（μｍｏｌ／Ｌ）を決定した。一方、各検体中のヘモグロビン濃度を、ヘモグロビンＢ－テストワコーを用いて測定し、得られた測定値と実施例９の（１）で作成した検量線とから、各検体中のヘモグロビン濃度（μｍｏｌ／Ｌ）を決定した。
　決定した各検体中のＨｂＡ１ｃ濃度（μｍｏｌ／Ｌ）とヘモグロビン濃度（μｍｏｌ／Ｌ）とから、以下の式により、日本糖尿病学会（Japan Diabetes Society；ＪＤＳ）値のＨｂＡ１ｃ（％）を算出した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000014
　キットとして、実施例１のキットの代わりに、実施例２～１３、１５、１７～２２及び比較例１～１１の各キットを用いて同様の測定を行い、それぞれのキットに対して、各検体中のＨｂＡ１ｃ濃度（％）を測定した。ヘモグロビン濃度が６ｍｇ／ｍＬである検体でのＨｂＡ１ｃ濃度（％）を基準０とし、その基準からの各検体のＨｂＡ１ｃ濃度（％）の差［△ＨｂＡ１ｃ濃度（％）］を算出した。その結果を第２表に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000015
　前述の通り、測定に用いた溶血検体は、同一のヒト血液より調製されたものであるため、総ヘモグロビンに対するＨｂＡ１ｃの割合（％）は、ヘモグロビン濃度に拠らず一定である。従って、△ＨｂＡ１ｃ濃度（％）が０に近い程、ＨｂＡ１ｃ測定方法がヘモグロビン濃度の影響を受けない、ということになる。第２表から明らかな通り、イソチアゾリノン誘導体を含む本発明のキットでは、イソチアゾリノン誘導体を含まない比較例のキットに比較して、ヘモグロビン濃度の影響を受けないことが判明した。
［試験例３］　イソチアゾリノン誘導体の効果（３）
　キットとして、実施例７，８及び比較例４の各キットを、検体として、試験例１の（１）で調製した溶血検体を用いて、試験例１と同様の方法により、それぞれのキットにおいて、各検体に対する反応吸光度を測定した。その結果を第３図に示す。
　同様に、キットとして、実施例１５、１６及び比較例８の各キットを、検体として、試験例１の（１）で調製した溶血検体を用いて、試験例１と同様の方法により、それぞれのキットにおいて、各検体に対する反応吸光度を測定した。その結果を第４図に示す。
　同様に、キットとして、実施例２１、２２及び比較例１１の各キットを、検体として、試験例１の（１）で調製した溶血検体を用いて、試験例１と同様の方法により、それぞれのキットにおいて、各検体に対する反応吸光度を測定した。その結果を第５図に示す。
　第３図及び第４図から明らかな通り、本発明のキット及び比較例のキットのいずれのキットにおいても、ヘモグロビン濃度に比例して反応吸光度が上昇したが、イソチアゾリノン誘導体を含む本発明のキットを用いる場合は、イソチアゾリノンを含まない比較例のキットを用いる場合に比較して、同一濃度のヘモグロビンの検体（すなわち、同一濃度のＨｂＡ１ｃの検体）において、反応吸光度が高いことが判明した。
　前述の通り、測定に用いた溶血検体は、同一のヒト血液より調製されたものであるため、ＨｂＡ１ｃ濃度はヘモグロビン濃度に依存して高くなる。同一濃度のＨｂＡ１ｃの検体においては、反応吸光度が高い程、ヘモグロビンの影響を受けず、測定データとしての信頼度が高いことになる。特に、低濃度のＨｂＡ１ｃの検体においては、高い反応吸光度が得られることが重要となる。実施例７及び８のキットを用いる場合は、比較例４のキットを用いる場合に比較して、同一濃度のＨｂＡ１ｃの検体において、高い反応吸光度が得られた。同様に、実施例１５及び１６のキットを用いる場合は、比較例８のキットを用いる場合に比較して、実施例２１及び２２のキットを用いる場合は、比較例１１のキットを用いる場合に比較して、同一濃度のＨｂＡ１ｃの検体において、高い反応吸光度が得られた。従って、イソチアゾリノン誘導体を含む本発明のキットを用いる測定方法は、イソチアゾリノン誘導体を含まない比較例のキットを用いる測定方法と比較して、ヘモグロビンの影響を受けず、かつ、高感度なＨｂＡ１ｃの測定が可能となることが判明した。
　本発明により、糖尿病の診断に有用な糖化ヘモグロビンの測定等に有用な、ヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビンの測定方法、測定試薬、及び、測定キットが提供される。
 

Claims (15)

  1. 　ヘモグロビン含有試料に、界面活性剤存在下に、タンパク質分解酵素を作用させた後、フルクトシルペプチド酸化酵素を作用させる反応において、当該反応をイソチアゾリノン誘導体存在下に行い、生成した過酸化水素を測定することを特徴とする、ヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビンの測定方法。
  2. 　イソチアゾリノン誘導体が、下記式（Ｉ）で表わされる化合物である請求項１記載の測定方法。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
     （式中、Ａ１は、水素原子、又は、置換若しくは非置換のアルキルを表し、Ａ２とＡ３は、同一又は異なって、水素原子、置換若しくは非置換のアルキル、ハロゲン原子を表すか、または、一緒になって環構造を形成する）
  3. 　式（Ｉ）で表わされる化合物が、２－アルキル－４－イソチアゾリン－３－オン、１，２－ベンゾイソチアゾール－３（２Ｈ）－オン、及び、２－アルキル－４，５－ジハロゲノ－４－イソチアゾリン－３－オンからなる群より選ばれるイソチアゾリノン誘導体である請求項２記載の測定方法。
  4. 　過酸化水素の測定が、過酸化水素測定試薬により行われる、請求項１～３のいずれかに記載の測定方法。
  5. 　過酸化水素測定試薬が、ペルオキシダーゼとロイコ型色原体とを含む試薬である請求項４記載の測定方法。
  6. 　ヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビンを測定するための試薬であって、タンパク質分解酵素、フルクトシルペプチド酸化酵素、イソチアゾリノン誘導体、及び、界面活性剤を含むことを特徴とする糖化ヘモグロビン測定試薬。
  7. 　イソチアゾリノン誘導体が、下記式（Ｉ）で表わされる化合物である請求項６記載の測定試薬。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
     （式中、Ａ１は、水素原子、又は、置換若しくは非置換のアルキルを表し、Ａ２とＡ３は、同一又は異なって、水素原子、置換若しくは非置換のアルキル、ハロゲン原子を表すか、または、一緒になって環構造を形成する）
  8. 　式（Ｉ）で表わされる化合物が、２－アルキル－４－イソチアゾリン－３－オン、１，２－ベンゾイソチアゾール－３（２Ｈ）－オン、及び、２－アルキル－４，５－ジハロゲノ－４－イソチアゾリン－３－オンからなる群より選ばれるイソチアゾリノン誘導体である請求項７記載の測定試薬。
  9. 　さらに、過酸化水素測定試薬を含む、請求項６～８のいずれかに記載の測定試薬。
  10. 　過酸化水素測定試薬が、ペルオキシダーゼとロイコ型色原体とを含む試薬である請求項９記載の試薬。
  11. 　ヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビンを測定するためのキットであって、タンパク質分解酵素、イソチアゾリノン誘導体、及び、界面活性剤を含む第１試薬と、フルクトシルペプチド酸化酵素を含む第２試薬とを含むことを特徴とする糖化ヘモグロビン測定キット。
  12. 　ヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビンを測定するためのキットであって、タンパク質分解酵素、及び、界面活性剤を含む第１試薬と、フルクトシルペプチド酸化酵素、及び、イソチアゾリノン誘導体を含む第２試薬とを含むことを特徴とする糖化ヘモグロビン測定キット。
  13. 　イソチアゾリノン誘導体が、下記式（Ｉ）で表わされる化合物である請求項１１または１２記載の測定キット。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
     （式中、Ａ１は、水素原子、又は、置換若しくは非置換のアルキルを表し、Ａ２とＡ３は、同一又は異なって、水素原子、置換若しくは非置換のアルキル、ハロゲン原子を表すか、または、一緒になって環構造を形成する）
  14. 　式（Ｉ）で表わされる化合物が、２－アルキル－４－イソチアゾリン－３－オン、１，２－ベンゾイソチアゾール－３（２Ｈ）－オン、及び、２－アルキル－４，５－ジハロゲノ－４－イソチアゾリン－３－オンからなる群より選ばれるイソチアゾリノン誘導体である請求項１３記載の測定キット。
  15. 　さらに、ペルオキシダーゼ及びロイコ型色原体が、それぞれ第１試薬と第２試薬、又は、第２試薬と第１試薬に含まれる、請求項１１～１４のいずれかに記載の測定キット。
     
PCT/JP2011/068103 2010-08-11 2011-08-09 糖化ヘモグロビンの測定方法 WO2012020744A1 (ja)

Priority Applications (7)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201180038629.XA CN103124793B (zh) 2010-08-11 2011-08-09 糖化血红蛋白的测定方法
CA2806261A CA2806261A1 (en) 2010-08-11 2011-08-09 Method for measuring glycated hemoglobin
US13/811,911 US20130171676A1 (en) 2010-08-11 2011-08-09 Method for measuring glycated hemoglobin
EP11816408.6A EP2604698A4 (en) 2010-08-11 2011-08-09 METHOD FOR MEASURING GLYCED HEMOGLOBIN
KR1020137002549A KR20130107268A (ko) 2010-08-11 2011-08-09 당화 헤모글로빈의 측정 방법
BR112013001398A BR112013001398A2 (pt) 2010-08-11 2011-08-09 método, reagente e kit para medir hemoglobina glicada
JP2012528677A JP5871800B2 (ja) 2010-08-11 2011-08-09 糖化ヘモグロビンの測定方法

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2010-180562 2010-08-11
JP2010180562 2010-08-11

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2012020744A1 true WO2012020744A1 (ja) 2012-02-16

Family

ID=45567707

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2011/068103 WO2012020744A1 (ja) 2010-08-11 2011-08-09 糖化ヘモグロビンの測定方法

Country Status (8)

Country Link
US (1) US20130171676A1 (ja)
EP (1) EP2604698A4 (ja)
JP (1) JP5871800B2 (ja)
KR (1) KR20130107268A (ja)
CN (1) CN103124793B (ja)
BR (1) BR112013001398A2 (ja)
CA (1) CA2806261A1 (ja)
WO (1) WO2012020744A1 (ja)

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2013118743A1 (ja) * 2012-02-09 2013-08-15 協和メデックス株式会社 アスコルビン酸の影響抑制方法
WO2015020200A1 (ja) 2013-08-09 2015-02-12 キッコーマン株式会社 改変型アマドリアーゼ及びその製造法、並びにアマドリアーゼの界面活性剤耐性向上剤及びこれを用いたＨｂＡ１ｃ測定用組成物
US11198852B2 (en) 2014-11-07 2021-12-14 Kikkoman Corporation Amadoriase having enhanced anionic surfactant tolerance
JP2021535380A (ja) * 2018-08-22 2021-12-16 クエスト ダイアグノスティクス インベストメンツ エルエルシー 糖尿病におけるマイクロサンプリング検出

Families Citing this family (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP3020825B1 (en) 2013-07-09 2020-02-19 Hitachi Chemical Diagnostics Systems Co., Ltd. Method for measuring glycated hemoglobin
KR102228913B1 (ko) * 2013-12-10 2021-03-17 삼성전자주식회사 미세유동장치 및 검사장치
BR112016019822B1 (pt) 2014-05-06 2023-11-14 Diasys Diagnostic Systems Gmbh Método para determinar a quantidade de hemoglobina glicosilada (hba1c) em uma amostra e kit de reagentes
WO2016186521A1 (en) * 2015-05-15 2016-11-24 Canterbury Scientific Limited Haemolysis stabilising composition
JP7020413B2 (ja) * 2016-07-29 2022-02-16 ミナリスメディカル株式会社 糖化ヘモグロビンの測定方法
EP3589948A4 (en) * 2017-03-03 2020-12-30 Polymer Technology Systems, Inc. SYSTEMS AND METHODS FOR ENZYMATIC A1C DETECTION AND QUANTIFICATION
US11703513B2 (en) 2017-08-07 2023-07-18 Polymer Technology Systems, Inc. Systems and methods for enzymatic A1C detection and quantification
MX2019010428A (es) * 2017-12-12 2020-01-09 Polymer Technology Systems Inc Sistemas y métodos para la preparación de muestras para la detección y cuantificación enzimáticas de a1c.
EP3887398A4 (en) * 2018-11-29 2022-10-19 Polymer Technology Systems, Inc. SYSTEMS AND METHODS OF ELECTROCHEMICAL POINT OF HEMOGLOBIN DETECTION
CN110297048A (zh) * 2019-07-12 2019-10-01 上海交通大学 一种抗干扰的糖化血红蛋白同系物相对含量的测定方法
CN110687306B (zh) * 2019-10-30 2023-04-25 深圳上泰生物工程有限公司 一种直接机上溶血酶法双试剂糖化血红蛋白检测试剂盒

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH0310696A (ja) 1989-06-09 1991-01-18 Wako Pure Chem Ind Ltd 体液成分の測定方法
JP2000210100A (ja) 1998-11-17 2000-08-02 Kdk Corp 酸化還元反応を用いた測定方法
WO2003107011A1 (ja) 2002-06-14 2003-12-24 アークレイ株式会社 スルホン酸化合物およびニトロ化合物を用いた測定方法
WO2005049858A1 (ja) 2003-11-19 2005-06-02 Daiichi Pure Chemicals Co., Ltd. ヘモグロビン含有試料中の基質の測定方法
JP2007147630A (ja) 2002-06-14 2007-06-14 Arkray Inc スルホン酸化合物およびニトロ化合物を用いた測定方法

Family Cites Families (22)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB8530188D0 (en) * 1985-12-06 1986-01-15 Unilever Plc Enzymatic liquid detergent composition
US6174728B1 (en) * 1998-04-03 2001-01-16 Avl Medical Instruments Ag Control or calibration standard for use with instruments for optical measurement of hemoglobin concentration in blood samples
US20020098589A1 (en) * 2001-01-19 2002-07-25 Crews Harold Richardson Multi-purpose reagent system and method for enumeration of red blood cells, white blood cells and thrombocytes and differential determination of white blood cells
JP3949854B2 (ja) * 1999-10-01 2007-07-25 キッコーマン株式会社 糖化蛋白質の測定方法
DE602004025735D1 (de) * 2003-12-12 2010-04-08 Arkray Inc Verfahren zur messung von saccharifiziertem amin
WO2005088300A1 (en) * 2004-03-16 2005-09-22 Fuji Photo Film Co., Ltd. Assay chip
US20070178547A1 (en) * 2004-03-17 2007-08-02 Daiichi Pure Chemicals Co., Ltd. Method of measuring glycated protein
WO2006013921A1 (ja) * 2004-08-05 2006-02-09 Asahi Kasei Pharma Corporation プロテアーゼ反応促進剤及び／又は色素の安定化剤を含む試薬
US20080193482A1 (en) * 2004-09-21 2008-08-14 Woodward John R Method of cancer screening; method of cancer treatment; and method of auto-immune disease treatment
US20100028326A1 (en) * 2004-12-07 2010-02-04 Ohio University Diagnosis of hyperinsulinemia and type ii diabetes and protection against same based on proteins differentially expressed in serum
US7541190B2 (en) * 2005-02-07 2009-06-02 Beckman Coulter, Inc. Method of measurement of cellular hemoglobin
US20090117660A1 (en) * 2005-04-30 2009-05-07 Oakville Hong Kong Co., Limited Devices and methods for sample collection and analysis
US8062901B2 (en) * 2005-04-30 2011-11-22 Alere Switzerland Gmbh Devices and methods for sample collection and analysis
KR101017031B1 (ko) * 2006-04-03 2011-02-23 베이징 티안큉 케미컬스 컴퍼니 리미티드 Ｎ－치환 이소치아졸리논 유도체의 제조 방법
CA2649633C (en) * 2006-06-06 2012-11-27 F. Hoffmann-La Roche Ag Differential hemolysis of a whole blood sample
AU2007277201B2 (en) * 2006-07-25 2014-01-09 Diazyme Laboratories, Inc. Methods for assaying percentage of glycated hemoglobin
US7521244B2 (en) * 2006-10-26 2009-04-21 Bionostics, Inc. Standard reference solutions
US20090186819A1 (en) * 2007-12-11 2009-07-23 Marieve Carrier Formulation of insulinotropic peptide conjugates
US7968279B2 (en) * 2008-08-13 2011-06-28 Beckman Coulter, Inc. Reference control for cell by cell analysis
WO2010148130A1 (en) * 2009-06-17 2010-12-23 Maine Standards Company, Llc Method for measuring lipoprotein-specific apolipoproteins
US20130281394A1 (en) * 2010-10-19 2013-10-24 Elcelyx Therapeutics, Inc. Chemosensory Receptor Ligand-Based Therapies
US20130303466A1 (en) * 2010-10-19 2013-11-14 Elcelyx Therapeutics, Inc. Chemosensory Receptor Ligand-Based Therapies

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH0310696A (ja) 1989-06-09 1991-01-18 Wako Pure Chem Ind Ltd 体液成分の測定方法
JP2000210100A (ja) 1998-11-17 2000-08-02 Kdk Corp 酸化還元反応を用いた測定方法
WO2003107011A1 (ja) 2002-06-14 2003-12-24 アークレイ株式会社 スルホン酸化合物およびニトロ化合物を用いた測定方法
JP2007147630A (ja) 2002-06-14 2007-06-14 Arkray Inc スルホン酸化合物およびニトロ化合物を用いた測定方法
WO2005049858A1 (ja) 2003-11-19 2005-06-02 Daiichi Pure Chemicals Co., Ltd. ヘモグロビン含有試料中の基質の測定方法

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
CHEW, A.L. ET AL.: "1,2-Benzisothiazolin-3-one (Proxel): irritant or allergen? A clinical study and literature review.", CONTACT DERMATITIS, vol. 36, no. 3, March 1997 (1997-03-01), pages 131 - 136, XP055070562 *
HIROKAWA, K. ET AL.: "An enzymatic method for the determination of hemoglobinAlC.", BIOTECHNOL. LETT., vol. 27, no. 14, July 2005 (2005-07-01), pages 963 - 968, XP019230894 *
KOZO HIROKAWA: "Development of novel enzymes applied to clinical diagnosis for diabetes", BIO INDUSTRY, vol. 26, no. 1, 12 January 2009 (2009-01-12), pages 73 - 80, XP009175348 *
See also references of EP2604698A4
THORMANN, J.: "Contact dermatitis to a new fungicide, 2-n-octyl-4-isothiazolin-3-one.", CONTACT DERMATITIS, vol. 8, no. 3, May 1982 (1982-05-01), pages 204, XP055070551 *

Cited By (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2013118743A1 (ja) * 2012-02-09 2013-08-15 協和メデックス株式会社 アスコルビン酸の影響抑制方法
JPWO2013118743A1 (ja) * 2012-02-09 2015-05-11 協和メデックス株式会社 アスコルビン酸の影響抑制方法
WO2015020200A1 (ja) 2013-08-09 2015-02-12 キッコーマン株式会社 改変型アマドリアーゼ及びその製造法、並びにアマドリアーゼの界面活性剤耐性向上剤及びこれを用いたＨｂＡ１ｃ測定用組成物
US10619183B2 (en) 2013-08-09 2020-04-14 Kikkoman Corporation Modified amadoriase and method for producing the same, agent for improving surfactant resistance of amadoriase and composition for measuring HbA1c using the same
EP3760717A1 (en) 2013-08-09 2021-01-06 Kikkoman Corporation Amadoriase and method for producing the same, agent for improving surfactant resistance of amadoriase and composition for measuring hba1c using the same
US11549134B2 (en) 2013-08-09 2023-01-10 Kikkoman Corporation Modified amadoriase and method for producing the same, agent for improving surfactant resistance of amadoriase and composition for measuring HbA1c using the same
US11198852B2 (en) 2014-11-07 2021-12-14 Kikkoman Corporation Amadoriase having enhanced anionic surfactant tolerance
JP2021535380A (ja) * 2018-08-22 2021-12-16 クエスト ダイアグノスティクス インベストメンツ エルエルシー 糖尿病におけるマイクロサンプリング検出

Also Published As

Publication number Publication date
BR112013001398A2 (pt) 2016-05-24
JPWO2012020744A1 (ja) 2013-10-28
JP5871800B2 (ja) 2016-03-01
EP2604698A4 (en) 2014-02-19
CN103124793B (zh) 2014-12-31
KR20130107268A (ko) 2013-10-01
CA2806261A1 (en) 2012-02-16
US20130171676A1 (en) 2013-07-04
EP2604698A1 (en) 2013-06-19
CN103124793A (zh) 2013-05-29

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP5871800B2 (ja) 糖化ヘモグロビンの測定方法
JP6236318B2 (ja) 糖化ヘモグロビンの測定方法、測定試薬、及び、測定キット
JP5955220B2 (ja) 糖化ヘモグロビンの測定方法
JP7020413B2 (ja) 糖化ヘモグロビンの測定方法
JP6144208B2 (ja) アスコルビン酸の影響抑制方法
KR20140114267A (ko) 측정 대상 성분의 측정 방법
JP7195847B2 (ja) 糖化蛋白質の測定
WO2021192465A1 (ja) 異常ヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビンの測定方法
WO2021192466A1 (ja) ヘモグロビンの影響軽減方法、糖化ヘモグロビンの測定方法、糖化ヘモグロビン測定試薬、及び糖化ヘモグロビン測定キット
EP3636767A1 (en) Method for measuring glycated hemoglobin

Legal Events

Date Code Title Description
WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 201180038629.X

Country of ref document: CN

121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 11816408

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2012528677

Country of ref document: JP

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2806261

Country of ref document: CA

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 13811911

Country of ref document: US

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 20137002549

Country of ref document: KR

Kind code of ref document: A

REEP Request for entry into the european phase

Ref document number: 2011816408

Country of ref document: EP

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2011816408

Country of ref document: EP

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

REG Reference to national code

Ref country code: BR

Ref legal event code: B01A

Ref document number: 112013001398

Country of ref document: BR

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 112013001398

Country of ref document: BR

Kind code of ref document: A2

Effective date: 20130118