WO2011160425A1 - 一种大蒜辣素注射液的制备方法及其低温连续搅拌超滤装置 - Google Patents

一种大蒜辣素注射液的制备方法及其低温连续搅拌超滤装置 Download PDF

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allicin
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alliin
argon
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陈坚
李新霞
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新疆埃乐欣药业有限公司
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    • C12Y404/01—Carbon-sulfur lyases (4.4.1)
    • C12Y404/01004—Alliin lyase (4.4.1.4)

Definitions

  • the present invention relates to the field of pharmacy, and in particular to a method for preparing an anti-tumor and anti-infective allicin injection and a low-temperature continuous stirring ultrafiltration device. Background technique
  • Garlic Alliium sativun L.
  • Garlic Alliium sativun L.
  • its preparations have been included in the United States, the European Union Pharmacopoeia. It is confirmed that alliin and allicin are the main functional ingredients. However, the content of alliin or allicin, which is currently marketed at home and abroad, is very low. The development of safe, effective and quality-controlled garlic high-efficiency new preparations has become a research hotspot of pharmacies in various countries.
  • a method for preparing alliin from fresh garlic (ZL 001012444) and a production process for preparing alliin from fresh garlic (ZL 03100420 ⁇ 2): Garlic according to the Pharmacopoeia, washed with peeling and pure water Invigorate the garlic enzyme by microwave irradiation for 5-10 minutes or boiling water for 5-10 minutes. Beatin, pure water or 5-70% ethanol extraction, concentration, fine filtration, ion exchange column adsorption, ammonia elution, concentration, spray drying, recrystallization, etc., to prepare the alliin bulk drug. The content was determined by HPLC to be 90%.
  • the production process of garlic enzyme from fresh garlic (ZL 03100419 * 9): Garlic in accordance with the Pharmacopoeia in the low temperature workshop (0-3 ° C), peeled, washed with pure water, colloidal broken wall The paddy and buffer solution were used to extract the garlic enzyme, and the garlic enzyme was precipitated by (NH4)2S04 or PEG-4000 ⁇ 8000, and the precipitate was collected by a continuous cryogenic tube centrifuge, and the buffer solution was reconstituted. The two groups of ultrafiltration devices remove macromolecules and small molecules, freeze-dry, and obtain the garlic enzyme bulk drug. Using garlicin as a substrate, the activity of garlic enzyme was 1000 IU/g as determined by HPLC.
  • the object of the present invention is to provide a method for preparing an anti-tumor and anti-infective allicin injection in order to achieve the advantages of reasonable formulation, simple preparation, high purity and stable performance.
  • a method for preparing an anti-tumor and anti-infective garlicin injection which is divided into two steps:
  • the first step is to extract the garlic, the steps are:
  • the garlic glucoside extracted in the first step is diluted with a solvent precooled to 0-4 ° C to obtain a garlic savory solution;
  • the above-mentioned allicin solution is filled with different conditions of garlic glucoside injection according to the need of nitrogen or argon-filled ampoule for intravenous infusion to treat diseases such as sepsis or tumor.
  • the concentration of the garlicin is: 1. 0 mg/ml, 2. 0 mg/ml, 2. 5 mg/ml, 5. 0 mg/ml; Specifications: lml/Amp, 2ml/Amp 5ml/Amp and 10ml /Amp. Stored in brown, 0 ⁇ -20 °C, shelf life 6-12 months.
  • the solvent is one of deoxygenated pure water, deoxygenated pure water containing antifreeze ethanol, and deoxygenated pure water containing propylene glycol.
  • the alliin purity is greater than 90%.
  • the garlic enzyme activity is greater than 1000 IU/g.
  • stirring speed is 60 to; I20 rpm.
  • the deoxidized pure water is freshly boiled and purified, and the bottom is filled with high-purity nitrogen or argon for 1 hour/10L to remove dissolved oxygen present in the water.
  • Another object of the present invention is to provide a low-temperature continuous stirring ultrafiltration device for anti-tumor and anti-infective allicin injection, comprising a wide-mouth container provided with a heat-insulating cover and a cooling platform, wherein the wide-mouth container is placed On the refrigeration platform, the cross section of the wide mouth container is divided into upper and lower parts by an ultrafiltration membrane, the upper part of the wide mouth container is provided with a stirring device, and an air inlet is arranged, the high purity nitrogen or argon gas The mouth is entered; the lower part of the wide mouth container is provided with a liquid taking device, and the aqueous solution of the garlic sulphate after removing the garlic enzyme can be extracted.
  • the allicin injection prepared by the method of the invention is applied to the clinical pharmacodynamic test: 5. 0 mg/ml garlic glucoside injection is sent to Shanghai Medicilon Biomedical Company and Nanjing Medical University First Clinical Medicine The hospital carried out anti-tumor and anti-pathogenic microorganism experiments, the experimental effect is obvious, Garlicin injection Effective for a variety of pathogenic microorganisms and tumors. Test samples and conditions were prepared for new drug registration and clinical trials. The specific experimental data is as follows:
  • Garlicin has obvious effects on methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA), Acinetobacter, Escherichia coli, Helicobacter pylori and Candida albicans (Bai Nian).
  • MRSA methicillin-resistant Staphylococcus aureus
  • Acinetobacter Escherichia coli
  • Helicobacter pylori and Candida albicans (Bai Nian).
  • the bactericidal activity which is most sensitive to MRSA and Helicobacter pylori. Its MIC value is about 10 ⁇ 30mg/L; secondly, it is also more sensitive to allicin.
  • Garlicin is expected to replace vancomycin as an important drug for the treatment of MRSA infection; Garlicin can be used to treat gastritis and gastric ulcer caused by Helicobacter pylori; Garlicin can also be used as a therapeutic agent for yeast-like fungal infection (either internal or external) ).
  • the invention adopts the inert gas protection and closed type isolated air condition which has not been reported at home and abroad, and the reaction of the garlic enzyme to catalyze the cleavage of alliin to produce allicin; the first ice water bath ultrafiltration and garlic enzyme removal technology. This technique and method reduces the decomposition of allicin with a yield of 90%.
  • the instrument and equipment are set up in a sterile aseptic cabinet (cleanliness: Class 100).
  • the invention relates to a new drug for developing new technologies such as enzyme catalytic kinetics and ultrafiltration.
  • the garlic acid and garlic enzyme extracted from fresh garlic are used as raw materials.
  • argon gas in the biological safety cabinet, it is protected by argon gas (inert gas), and the garlic enzyme catalyzes the cleavage of alliin to form garliculite.
  • the reaction solution was stirred at a low temperature, and the garlicase was removed by an ultrafiltration membrane.
  • the content of allicin was determined by HPLC and quantitatively diluted with deionized water for injection or a special solvent such as ethanol or propylene glycol.
  • the ampoule is filled with nitrogen to form an injection.
  • Garlicin injection has been tested by pharmacodynamics to prove effective against a variety of pathogenic microorganisms and tumors. Test samples and conditions were prepared for new drug registration and clinical trials.
  • Figure 1 is a schematic view showing the apparatus for catalytically cleavage of alliin to produce allicin in the garlic enzyme of the present invention
  • FIG. 2 is a schematic view of a low temperature continuous stirring ultrafiltration device of the present invention
  • Figure 3 is a HPLC chromatogram of the 5. 0 mg/ml allicin injection of the present invention.
  • FIG. 1 to 3 are schematic views of an embodiment of the present invention, and the preparation method of the garlicyrin injection is as follows:
  • deoxygenated pure water is about 500 ⁇ : 1000ml ml, adding a specified amount of alliin 35. 4g, gently shake to dissolve.
  • High purity nitrogen or argon fills the three-port G space.
  • the reaction time is about 30 minutes. Maintaining the chemical stability of allicin is the key to success.
  • This patent uses inert gas protection, the method of isolating air, and the end of the reaction (30 minutes from the dropwise addition of alliin) immediately drops to low temperature (0 ° C).
  • the cryogenically agitated ultrafiltration unit ( Figure 2) is installed in the biosafety cabinet.
  • the liquid take-up pump P sucks up the reaction solution W and transfers it to the ultrafiltration unit.
  • Pressure bottle Adjust the chiller platform T temperature to - 2 °C. Cover the insulation cover C.
  • the solution is passed through an ultrafiltration membrane H having a molecular weight of 5,000 to remove macromolecules such as garlicase, and a solution of the enzyme-containing garlic glucoside A is about 1500 to 3000 ml.
  • the amount of the garlic aqueous solution A after removing the garlic enzyme is taken up, and the content of the garlic is determined by HPLC.
  • the pre-cooled (0 ° C) deoxygenated pure water (or an appropriate amount of antifreeze ethanol or propylene glycol deoxygenated pure water) was diluted and obtained a solution of 10.
  • Omg / ml allicin solution about 1500ml. Or get 5.
  • Omg / ml garlic spicy solution The liquid is about 3000mg.
  • the content was again determined by HPLC and should be from 98% to 102% of the indicated amount.
  • the preparation method of allicin injection is as follows:
  • the garlic glucoside extracted in the first step is diluted with a solvent pre-cooled to 0 ⁇ to obtain a galenic acid solution;
  • the solvent is deoxygenated pure water, deoxygenated pure water containing antifreeze ethanol, and propylene glycol.
  • the deoxygenated pure waters One of the deoxygenated pure waters.
  • the above-mentioned allicin solution is filled with different conditions of garlic glucoside injection according to the need of nitrogen or argon-filled ampoule for intravenous infusion to treat diseases such as sepsis or tumor.
  • the concentration of the garlicin is: 1. 0 mg/ml; Specification: lml/Amp. Brown boxed, 0 ⁇ -20 °C preserved, shelf life 6-12 months.
  • a low-temperature continuous stirring ultrafiltration device for allicin injection comprising a wide-mouth container and a cooling platform provided with a heat-insulating cover, the wide-mouth container is placed on the refrigeration platform, and the cross-section of the wide-mouth container is divided into upper and lower parts by an ultrafiltration membrane
  • the upper part of the wide mouth container is provided with a stirring device, and an air inlet is provided,
  • the high-purity nitrogen or argon gas enters through the mouth;
  • the lower part of the wide-mouth container is provided with a liquid-removing device, and the aqueous solution of the garlic sulphate after removing the garlic enzyme can be extracted.
  • the garlic glucoside extracted in the first step is diluted with a solvent pre-cooled to 4 ° C to obtain a galenic acid solution; the solvent is deoxygenated pure water, deoxygenated pure water containing antifreeze ethanol and One of deoxygenated pure water containing propylene glycol.
  • the above-mentioned allicin solution is filled with different conditions of garlic glucoside injection according to the need of nitrogen or argon-filled ampoule for intravenous infusion to treat diseases such as sepsis or tumor.
  • the concentration of the garlicin is: 2. 0 mg/ml; Specification: 2 ml/Amp. Brown boxed, 0 ⁇ -20 °C preserved, shelf life 6-12 months.
  • a low-temperature continuous stirring ultrafiltration device for allicin injection comprising a wide-mouth container and a cooling platform provided with a heat-insulating cover, the wide-mouth container is placed on the refrigeration platform, and the cross-section of the wide-mouth container is divided into upper and lower parts by an ultrafiltration membrane
  • the upper part of the wide mouth container is provided with a stirring device, and an air inlet is provided,
  • the high-purity nitrogen or argon gas enters through the mouth;
  • the lower part of the wide-mouth container is provided with a liquid-removing device, and the aqueous solution of the garlic sulphate after removing the garlic enzyme can be extracted.
  • the garlic glucoside extracted in the first step is diluted with a solvent pre-cooled to 2 ° C to obtain a garlic sulphate solution;
  • the solvent is deoxygenated pure water, deoxygenated pure water containing antifreeze ethanol and One of deoxygenated pure water containing propylene glycol.
  • the above-mentioned allicin solution is filled with different conditions of garlic glucoside injection according to the need of nitrogen or argon-filled ampoules for intravenous infusion to treat diseases such as sepsis or tumor.
  • the concentration of the garlicin is: 2. 5 mg/ml ; specification: 5 ml/Amp. Stored in brown, 0 ⁇ -20 °C, shelf life 6-12 months.
  • a low-temperature continuous stirring ultrafiltration device for allicin injection comprising a wide-mouth container and a cooling platform provided with a heat-insulating cover, the wide-mouth container is placed on the refrigeration platform, and the cross-section of the wide-mouth container is divided into upper and lower parts by an ultrafiltration membrane
  • the upper part of the wide mouth container is provided with a stirring device, and an air inlet is provided,
  • the high-purity nitrogen or argon gas enters through the mouth;
  • the lower part of the wide-mouth container is provided with a liquid-removing device, and the aqueous solution of the garlic sulphate after removing the garlic enzyme can be extracted.

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Description

一种大蒜辣素注射液的制备方法及其低温连续搅拌超滤装置
技术领域
本发明涉及制药领域， 具体地， 涉及一种抗肿瘤及抗感染的大蒜辣素注射 液的制备方法及其低温连续搅拌超滤装置。 背景技术
大蒜 （Alliium sativun L. )及其制剂已列入美国、 欧盟药典。 确认蒜氨 酸（Alliin)及大蒜辣素（Allicin)为主要功效成分。 但是目前国内外上市的 大蒜制剂蒜氨酸或大蒜辣素的含量很低。 研发安全、 有效、 质量可控的大蒜高 效新制剂成为各国药学家的研究热点。
1、 蒜氨酸 （Alliin ) 化学名： S-烯丙基 -L-半胱氨酸亚砜 （S- Allyl -L-cysteine)o 熔点： 163- 165°C (分解、 炭化）， [ a ]D = +60o, 白色结粉末， 几乎无臭。
Figure imgf000002_0001
依据发明专利： 从鲜蒜中制备蒜氨酸的方法 （ZL 001012444)及从鲜蒜中 制备蒜氨酸的生产工艺 （ZL 03100420 · 2)： 符合药典规定的大蒜， 经脱皮、 纯 水洗净， 微波照射 5-10分钟或沸水煮沸 5-10分钟使蒜酶灭活。 打浆、 纯水或 5-70%乙醇提取、 浓縮、 精滤、 离子交换柱吸附、 氨水洗脱、 浓缩、 喷雾干燥、 重结晶等步骤， 制备蒜氨酸原料药。 HPLC测定含量 90%。 2、 蒜酶 （Alliinase, EC 4.4.1.4)又名蒜氨酸裂解酶、 烯丙基半胱氨酸 亚砜酶 (Alliin lyase, S-allyl-L- cysteine sulfoxide lyase )0 属二聚体糖 蛋白， 两个亚基分子量均为 51.5 KDa。 结晶呈黄色， 无臭， 等电点 pH:4.9。 依据发明专利： 从鲜蒜中制备蒜酶的生产工艺 （ZL 03100419 * 9): 在低温 车间 （0-3°C)， 符合药典规定的大蒜， 经脱皮、 纯水洗净、 胶体磨破壁打桨、 缓冲保护液提取蒜酶， 经 (NH4)2S04或 PEG- 4000〜8000沉淀蒜酶， 连续式低温 管式离心机收集沉淀， 缓冲保护液复溶。 两组超滤装置除去大分子和小分子， 冷冻干燥， 得到蒜酶原料药。 以蒜氨酸为底物， 经 HPLC测定， 蒜酶活力 1000 IU/g。
3、 大蒜辣素 （Alliicin)化学名： 二烯丙基硫代亚磺酸酯（2- propene-l- sulfinothioic acid S- 2- propenyl ester)。 常温下为淡黄色易挥发粘稠液体， 有浓烈气味。 密度： 1.112g/cm3。 熔点： 25°C (分解）， 微溶于水。 在空气中数 小时即分解变质。 2 + CH3C(0COOH
丙酮酸盐
Figure imgf000003_0001
2 [C6HnN03S] =2 X 177.2二 354.4 [CeH100S2] =162.3 两分子蒜氨酸被蒜酶催化裂解生成一分子大蒜辣素。 即 354.4克蒜氨酸 (2[C6HnN03S]=2X 177.2=354)可生成大蒜辣素 162.3克（[(^1()052]=162)。 加入蒜 氨酸纯度 "C"及反应系数（0.9)。 得到以下关系式：
162
大蒜辣素产量（克） =蒜氨酸重量（克） XCX ---― X0.9
354 发明内容
本发明的目的在于， 针对上述问题， 提出一种抗肿瘤及抗感染的大蒜辣素 注射液的制备方法， 以实现配方合理、 制备简单、 纯度高、 性能稳定的优点。
为实现上述目的， 本发明采用的技术方案是：
一种抗肿瘤及抗感染的大蒜辣素注射液的制备方法， 分两步：
第一步， 提取大蒜辣素， 步骤为：
(1)、 在充满氩气或高纯氮的容器中加入脱氧纯水和蒜酶， 其中脱氧纯水 ： 蒜酶： 1000〜2000 ml : 35. 4g， 此比例可按照产量和浓度的不同要求， 加以扩 大或縮小。 充分搅拌使蒜酶充分溶解， 调节水浴温度至 25- 35°C， 控制 PH值在 6. 5-8. 5范围内;
(2)、 配制蒜氨酸溶液， 其中蒜氨酸 ： 脱氧纯水 = 35. 4 ： 500〜1000 ml , 将蒜氨酸溶液缓慢滴加入上述容器， 其中蒜氨酸 ： 蒜酶 = 1 mg : 1〜2 IU, 充分搅拌， 并连续通入氩气或高纯氮使容器内充满高纯氮或氩气；；
(3)、 滴加完毕后继续搅拌， 反应总时间 20〜40分钟。 得到含大蒜辣素等成 分的酶解反应溶液， 立即用冰水置换水浴中的温水， 水浴温度降至 0°C (有过量 冰块)， 最后利用 1000〜5000D超滤膜除去蒜酶得到大蒜辣素水溶液。
第二步， 在洁净生物安全柜 （无菌）环境下， 将步骤一中提取的大蒜辣素 用预冷至 0-4°C的溶剂稀释得到大蒜辣素溶液；
将上述大蒜辣素溶液按照需要充氮或充氩气安瓿灌封成不同规格的大蒜辣 素注射液， 用于静脉滴注， 治疗败血症或肿瘤等疾病。 所述大蒜辣素浓度为： 1. 0 mg/ml、 2. 0 mg/ml、 2. 5 mg/ml、 5. 0 mg/ml ; 规格： lml/Amp、 2ml/Amp 5ml/Amp及 10ml/Amp。 棕色盒装， 0〜- 20°C保存， 保存期 6-12个月。
进一步地， 所述溶剂为脱氧纯水、 含有抗冻剂乙醇的脱氧纯水、 含有丙二 醇的脱氧纯水中的一种。
进一步地， 所述蒜氨酸纯度大于 90%。
进一步地， 所述蒜酶活力大于 1000 IU/g。
进一步地， 所述搅拌速度为 60〜； I20rpm。
进一步地， 所述脱氧纯水是新煮沸放冷的纯水， 底部通入高纯氮或氩气 1 小时 /10L, 脱除水中存在的溶解氧。
本发明的另一目的， 是提供一种抗肿瘤及抗感染的大蒜辣素注射液的低温 连续搅拌超滤装置， 包括设置有保温罩的广口容器和制冷平台， 所述广口容器 放置在制冷平台上， 所述广口容器的横截面通过超滤膜将容器分为上下两部分， 所述广口容器上部设置有搅拌装置， 并设置有一进气口， 所述高纯氮或氩气由 此口进入； 所述广口容器下部配套设置有取液装置， 可将除蒜酶后的大蒜辣素 水溶液抽出。 药效学试验数据
将利用本发明方法制备的大蒜辣素注射液应用在临床上进行药效学试验： 将 5. 0 mg/ml大蒜辣素注射液送上海美迪西生物医药公司及南京医科大学第一 临床医学院进行抗肿瘤及抗病原微生物实验， 实验效果明显， 大蒜辣素注射液 对多种致病微生物及肿瘤有效。为新药注册及临床试验准备了试验样本和条件。 具体实验数据如下：
一、 上海美迪西生物医药公司抗肿瘤实验
表一 IC5。计算结果
结果显示， Taxol对多种细胞的半数抑制浓度在 ΙΟηΜ左右或 ΙΟηΜ以下，根 据抗肿瘤药效学指导原则的标准（植物提取纯品的 IC5Q<10 g/ml或植物粗提 物的 IC5。<20 U g/ml ), 反映其在体外对这几种细胞有显著的杀伤作用。 大蒜辣 素对 13株肿瘤细胞的半数抑制浓度基本在 10 p g/ml以下， 说明大蒜辣素在体 外对这 13株肿瘤细胞有杀伤作用。
二、 南京医科大学第一临床医学院抗病原微生物实验
通过一些列实验， 结果显示： 大蒜辣素对耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌 (MRSA)、 不动杆菌、 大肠埃希菌、 幽门螺杆菌和白色假丝酵母菌（白念）等具 有明显的杀菌活性， 其中以 MRSA和幽门螺杆菌最为敏感。 其 MIC值约在 10〜 30mg/L; 其次白念对大蒜辣素的敏感性亦较高。 大蒜辣素有望替代万古霉素成 为治疗 MRSA感染的重要药物； 大蒜辣素或可用于治疗幽门螺杆菌引起的胃炎和 胃溃疡； 大蒜辣素亦可作为酵母样真菌感染的治疗药物（内服或外用）。
表一 IC50 计算结果
Figure imgf000007_0001
有益效果
本发明通过使用在国内外未见报道的惰性气体保护及封闭式隔绝空气条件 下发生蒜酶催化裂解蒜氨酸产生大蒜辣素的反应； 首创冰水浴超滤除蒜酶技术。 该技术和方法减少了大蒜辣素的分解， 产率 90%。 仪器和设备设置在生物无菌 柜中无菌操作 （洁净度： 100级）。
HPLC测定大蒜辣素含量后配制成大蒜辣素注射液。 采用安瓿充氩气或高纯 氮灌封。 规格： 1. 0〜10. 0mg/ml X 1. 0 ml ; 1. 0〜10. Omg/ml X 2. 0 ml ; 1. 0— 10. 0mg/ml X 5. 0 ml; 1. 0〜 10. Omg/ml X 10. 0 ml。 0〜4°C避光处保存 6个月， 含量无明显改变。加入 20%乙醇及 /或丙二醇抗冻剂， -10°C避光处保存 24个月， 含量无明显改变。
本发明涉及酶催化动力学、 超滤等新技术研发新药。 以鲜蒜中提取的蒜氨 酸及蒜酶为原料， 在生物安全柜中的特殊装置中， 以氩气 （惰性气体）保护， 蒜酶催化裂解蒜氨酸， 生成大蒜辣素。 反应液经低温搅拌， 超滤膜除去蒜酶。 HPLC测定大蒜辣素含量，用脱氧注射用水或乙醇、丙二醇等特殊溶媒定量稀释。 安瓿充氮灌封制成注射液。 大蒜辣素注射液经药效学试验， 证明对多种致病性 微生物及肿瘤有效。 为新药注册及临床试验准备了试验样本和条件。 附图说明
附图用来提供对本发明的进一步理解， 并且构成说明书的一部分， 与本发 明的实施例一起用于解释本发明， 并不构成对本发明的限制。 在附图中：
图 1为本发明的蒜酶催化裂解蒜氨酸产生大蒜辣素装置示意图；
图 2为本发明的低温连续搅拌超滤装置示意图；
图 3为本发明 5. 0 mg/ml大蒜辣素注射液 HPLC色谱图。
结合附图， 本发明实施例中附图标记如下：
A-三口瓶； P-取液泵； M-封闭式搅拌器； I-水浴； G-进气口； R-生物安全 柜（100级洁净、 无菌）； C-保温罩； H-超滤膜； S-搅拌器； T-制冷平台。 具体实施方式
以下结合附图对本发明的优选实施例进行说明， 应当理解， 此处所描述的 优选实施例仅用于说明和解释本发明， 并不用于限定本发明。
实施例一
图 1 - 3为本发明的实施例示意图， 大蒜辣素注射液的制备方法如下：
(1)、 5000 ml硬质三口瓶 A中， 加脱氧纯水约 1000〜2000ml， 投入蒜酶 35. 4g， 搅拌 (M， 60rpm)使溶解。 调节水浴 I温度至 25-35°C， 检査确认 pH值为 6. 5-8. 5。
(2)、 在封闭式刻度分液漏斗中置脱氧纯水约 500〜： 1000ml ml, 加入规定量 蒜氨酸 35. 4g， 轻摇溶解。 高纯氮或氩气充满三口瓶 G空间。
(3)、 不断搅拌 （M，60rpm) 下， 蒜氨酸溶液由封闭式刻度分液漏斗经 B口进 入三口瓶 A， 速度约 50 ml/min。 滴加完毕后继续搅拌 10min， 反应总时间约 30分 钟。 得到含大蒜辣素等成分的酶解反应溶液。 立即用冰水置换水浴 I中的温水， 水浴温度降至 0°C。 装置见图 1。
酶解反应的条件为： 反应器温度 25- 35°C， 水相 pH=6. 5-8. 5。 反应时间约 30分钟。 保持大蒜辣素的化学形治稳定， 是成功的关键。 本专利采用惰性气体 保护， 隔绝空气的方法、 反应结束（从滴加蒜氨酸开始 30分钟）立即降至低温 (0°C )。
低温搅拌超滤装置（图 2) 安装在生物安全柜中。 取液泵 P吸出反应溶液 W， 转移至超滤装置。 的耐压瓶中。 调节制冷机平台 T温度至 - 2°C。 套上保温罩 C。 启动搅拌器 S,高纯高压氮气钢瓶与进气口 G连接。 在规定压力下， 溶液通过分子 量为 5000的超滤膜 H除去蒜酶等大分子， 得到除酶大蒜辣素溶液 A约 1500〜 3000ml。
在洁净生物安全柜中， 吸取除蒜酶后的大蒜辣素水溶液 A适量， HPLC测定大 蒜辣素含量。 加预冷 (0°C)的脱氧纯水 (或加适量抗冻剂乙醇或丙二醇的脱氧纯 水)稀释并得到 10. Omg/ml大蒜辣素溶液约 1500ml。 或得到 5. Omg/ml大蒜辣素溶 液约 3000mg。 HPLC再次测定含量， 应为表示量的 98%- 102%。 实施例二
大蒜辣素注射液的制备方法如下：
(1)、 在容器中加入脱氧纯水和蒜酶， 其中脱氧纯水 ： 蒜酶 = 1000 ml : 35. 4g, 充分搅拌使蒜酶充分溶解， 所述搅拌速度为 60rpm， 调节水浴温度至 25 V， 控制 pH值在 6. 5范围内， 蒜酶活力大于 1000 IU/g; 所述脱氧纯水是新煮 沸放冷的纯水， 底部通入高纯氮或氩气 1小时 /10L, 脱除水中存在的溶解氧。
(2)、 配制蒜氨酸溶液， 其中蒜氨酸 ： 脱氧纯水 = 35. 4 ： 500 ml的， 将蒜 氨酸溶液缓慢滴加入上述容器， 其中蒜氨酸 ： 蒜酶 = 1 mg : 1 IU， 充分搅拌， 所述搅拌速度为 60rpm， 并连续通入氩气或高纯氮使容器内充满高纯氮或氩气；， 述蒜氨酸纯度大于 90%;
(3)、 滴加完毕后继续搅拌， 反应总时间 20分钟。 得到含大蒜辣素等成分的 酶解反应溶液， 立即用冰水置换水浴中的温水， 水浴温度降至 0°C， 最后利用 1000D超滤膜除去蒜酶得到大蒜辣素水溶液。
第二步，在洁净环境下，将步骤一中提取的大蒜辣素用预冷至 0Ό的溶剂稀 释得到大蒜辣素溶液； 溶剂为脱氧纯水、 含有抗冻剂乙醇的脱氧纯水和含有丙 二醇的脱氧纯水中的一种。
将上述大蒜辣素溶液按照需要充氮或充氩气安瓿灌封成不同规格的大蒜辣 素注射液， 用于静脉滴注， 治疗败血症或肿瘤等疾病。
所述大蒜辣素浓度为： 1. 0 mg/ml; 规格： lml/Amp。 棕色盒装， 0〜- 20°C 保存， 保存期 6-12个月。
大蒜辣素注射液的低温连续搅拌超滤装置， 包括设置有保温罩的广口容器 和制冷平台， 广口容器放置在制冷平台上， 广口容器的横截面通过超滤膜将容 器分为上下两部分， 广口容器上部设置有搅拌装置， 并设置有一进气口， 所述 高纯氮或氩气由此口进入； 广口容器下部配套设置有取液装置， 可将除蒜酶后 的大蒜辣素水溶液抽出。 实施例三
(1)、 在容器中加入脱氧纯水和蒜酶， 其中脱氧纯水 ： 蒜酶 = 2000 ml : 35. 4g, 充分搅拌使蒜酶充分溶解， 所述搅拌速度为 120rpm， 调节水浴温度至 35°C , 控制 PH值在 8. 5范围内， 蒜酶活力大于 1000 IU/g; 所述脱氧纯水是新 煮沸放冷的纯水， 底部通入高纯氮或氩气 1小时 /10L, 脱除水中存在的溶解氧。
(2)、 配制蒜氨酸溶液， 其中蒜氨酸 ： 脱氧纯水 = 35. 4 ： 1000 ml的， 将 蒜氨酸溶液缓慢滴加入上述容器， 其中蒜氨酸 ： 蒜酶 = 1 mg : 2 IU， 充分搅 拌， 所述搅拌速度为 60rpm， 并连续通入氩气或高纯氮使容器内充满高纯氮或氩 气；， 述蒜氨酸纯度大于 90%;
(3)、 滴加完毕后继续搅拌， 反应总时间 40分钟。 得到含大蒜辣素等成分的 酶解反应溶液， 立即用冰水置换水浴中的温水， 水浴温度降至 4°C， 最后利用 5000D超滤膜除去蒜酶得到大蒜辣素水溶液。
第二步，在洁净环境下，将步骤一中提取的大蒜辣素用预冷至 4°C的溶剂稀 释得到大蒜辣素溶液； 溶剂为脱氧纯水、 含有抗冻剂乙醇的脱氧纯水和含有丙 二醇的脱氧纯水中的一种。
将上述大蒜辣素溶液按照需要充氮或充氩气安瓿灌封成不同规格的大蒜辣 素注射液， 用于静脉滴注， 治疗败血症或肿瘤等疾病。
所述大蒜辣素浓度为： 2. 0 mg/ml ; 规格： 2ml/Amp。 棕色盒装， 0〜- 20°C 保存， 保存期 6-12个月。
大蒜辣素注射液的低温连续搅拌超滤装置， 包括设置有保温罩的广口容器 和制冷平台， 广口容器放置在制冷平台上， 广口容器的横截面通过超滤膜将容 器分为上下两部分， 广口容器上部设置有搅拌装置， 并设置有一进气口， 所述 高纯氮或氩气由此口进入； 广口容器下部配套设置有取液装置， 可将除蒜酶后 的大蒜辣素水溶液抽出。 实施例四
(1)、 在容器中加入脱氧纯水和蒜酶， 其中脱氧纯水 ： 蒜酶 = 1500 ml : 35. 4g， 充分搅拌使蒜酶充分溶解， 所述搅拌速度为 60rpm， 调节水浴温度至 35 "C 控制 pH值在 8. 5范围内， 蒜酶活力大于 1000 IU/g; 所述脱氧纯水是新煮 沸放冷的纯水， 底部通入高纯氮或氩气 1小时 /10L, 脱除水中存在的溶解氧。
(2)、 配制蒜氨酸溶液， 其中蒜氨酸 ： 脱氧纯水 = 35. 4 ： 800 ml的， 将蒜 氨酸溶液缓慢滴加入上述容器， 其中蒜氨酸 ： 蒜酶 = 1 mg ： 1. 5 IU, 充分搅 拌， 所述搅拌速度为 60rpm， 并连续通入氩气或高纯氮使容器内充满高纯氮或氩 气；， 述蒜氨酸纯度大于 90%;
(3)、 滴加完毕后继续搅拌， 反应总时间 30分钟。 獰到含大蒜辣素等成分的 酶解反应溶液， 立即用冰水置换水浴中的温水， 水浴温度降至 2°C， 最后利用 5000D超滤膜除去蒜酶得到大蒜辣素水溶液。
第二步，在洁净环境下，将步骤一中提取的大蒜辣素用预冷至 2°C的溶剂稀 释得到大蒜辣素溶液； 溶剂为脱氧纯水、 含有抗冻剂乙醇的脱氧纯水和含有丙 二醇的脱氧纯水中的一种。
将上述大蒜辣素溶液按照需要充氮或充氩气安瓿灌封成不同规格的大蒜辣 素注射液， 用于静脉滴注， 治疗败血症或肿瘤等疾病。
所述大蒜辣素浓度为： 2. 5 mg/ml; 规格： 5ml/Amp。 棕色盒装， 0〜- 20°C 保存， 保存期 6-12个月。
大蒜辣素注射液的低温连续搅拌超滤装置， 包括设置有保温罩的广口容器 和制冷平台， 广口容器放置在制冷平台上， 广口容器的横截面通过超滤膜将容 器分为上下两部分， 广口容器上部设置有搅拌装置， 并设置有一进气口， 所述 高纯氮或氩气由此口进入； 广口容器下部配套设置有取液装置， 可将除蒜酶后 的大蒜辣素水溶液抽出。
最后应说明的是： 以上所述仅为本发明的优选实施例而已， 并不用于限制 本发明， 尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明， 对于本领域的技术 人员来说， 其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改， 或者对其 中部分技术特征进行等同替换。 凡在本发明的精神和原则之内， 所作的任何修 改、 等同替换、 改进等， 均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

权 利 要 求 书
1. 一种抗肿瘤及抗感染的大蒜辣素注射液的制备方法， 其特征在于， 分两 步- 第一步， 提取大蒜辣素， 步骤为：
(1)、 在充满氩气或高纯氮的容器中加入脱氧纯水和蒜酶， 其中脱氧纯水 ： 蒜酶： 1000〜2000 ml : 35. 4g,充分搅拌使蒜酶充分溶解，调节水浴温度至 25-35 °C， 控制 pH值在 6. 5-8. 5范围内；
(2)、 配制蒜氨酸溶液， 其中蒜氨酸 ： 脱氧纯水 = 35. 4 ： 500〜1000 ml, 将蒜氨酸溶液缓慢滴加入上述容器， 其中蒜氨酸 ： 蒜酶 = 1 mg ： 1〜2 IU, 充分搅拌， 并连续通入氩气或高纯氮使容器内充满高纯氮或氩气；
(3)、 滴加完毕后继续搅拌， 反应总时间 20〜40分钟。 得到含大蒜辣素等成 分的酶解反应溶液， 立即用冰水置换水浴中的温水， 水浴温度降至 0°C (有过量 冰块)， 最后利用 1000〜5000D超滤膜除去蒜酶得到大蒜辣素水溶液。
第二步， 在洁净生物安全柜环境下， 将步骤一中提取的大蒜辣素用预冷至 0 - 4°C的溶剂稀释得到大蒜辣素溶液；
将上述大蒜辣素溶液按照需要充氮或充氩气安瓿灌封成不同规格的大蒜辣 素注射液， 用于静脉滴注， 治疗败血症或肿瘤等疾病。
2. 根据权利要求 1所述的大蒜辣素注射液的制备方法， 其特征在于， 所述 溶剂为脱氧纯水、 含有抗冻剂乙醇的脱氧纯水、 含有丙二醇的脱氧纯水中的一 种。
3. 根据权利要求 1所述的大蒜辣素注射液的制备方法， 其特征在于， 所述 蒜氨酸纯度大于 90%。
4. 根据权利要求 1所述的大蒜辣素注射液的制备方法， 其特征在于， 所述 蒜酶活力大于 1000 IU/go
5. 根据权利要求 1所述的大蒜辣素注射液的制备方法， 其特征在于， 所述 搅拌速度为 60- 120rpm。
6. 根据权利要求 1所述的大蒜辣素注射液的制备方法， 其特征在于， 所述 脱氧纯水是新煮沸放冷的纯水， 底部通入高纯氮或氩气 1 小时 /10 脱除水中 存在的溶解氧。
7. 权利要求 1所述的大蒜辣素注射液的低温连续搅拌超滤装置， 其特征在 于， 包括设置有保温罩的广口容器和制冷平台， 所述广口容器放置在制冷平台 上， 所述广口容器的横截面通过超滤膜将容器分为上下两部分， 所述广口容器 上部设置有搅拌装置， 并设置有一进气口， 所述高纯氮或氩气由此口进入； 所 述广口容器下部配套设置有取液装置。
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