CN1157373C - 从大蒜中提取蒜氨酸的方法 - Google Patents
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Abstract
一种从大蒜中提取蒜氨酸的方法，其通过以下步骤来实现的：第一步进行有机物提取，以冻干蒜粉为原料，用60%至90%的乙醇作为溶剂进行渗漉，并将所得渗漉液进行浓缩后进行醇沉，然后将上清液进行浓缩得到浓缩浸膏；第二步采用硅胶柱层析法进行分离得到含蒜氨酸的固形物，还可对固形物进行进一步纯化。利用本发明可有效地从大蒜中提取蒜氨酸，从而解决了从大蒜中得到蒜氨酸的难题，并且可使纯度达到99.7%。
Description
本发明涉及从植物中提取有机物质的方法，是一种从大蒜中提取蒜氨酸的方法。
蒜氨酸[Alliin，3-(Propenylsulfinyl)alanine，s-Allyl-L-cysteine，S-烯丙基-L半胱氨酸亚砜]，C6H11NO3S，分子量：177.22，熔点：163～165℃。以无臭的形式存在于大蒜鳞芽中。蒜氨酸性质不稳定，常温下在蒜酶(Allinase)和水作用下，迅速转化为大蒜辣素(Allicin)，产生丙酮和氨。其中大蒜辣素还将进一步分解成多种含硫化合物。
在大蒜多种含硫有机化合物之中，蒜氨酸被看作是大蒜的主要功效成分，与蒜酶分别独立的存在于大蒜的鳞茎中，捣碎后这两种物质相互接触，迅速发生分解反应。因此用一般方法无法从大蒜中提取到蒜氨酸。
鉴于上述存在的问题，本发明的目的在于提供一种从大蒜中提取蒜氨酸的方法。
本发明的目的是通过以下步骤来实现的：
第一步进行有机物提取，以冻干蒜粉为原料，每千克冻干蒜粉用1000至20000毫升的60％至90％的乙醇作为溶剂进行渗漉，并将所得渗漉液进行浓缩至没有液体流出为止而得到浓缩液，然后采用95％的乙醇或无水乙醇对浓缩液进行醇沉，在0至10℃下放置6至12小时，将上清液倾出，进行浓缩至没有液体流出为止而得到浓缩浸膏；
第二步采用硅胶柱层析法进行分离得到蒜氨酸，其中，上述浓缩浸膏采用硅胶粉拌样得到蒜硅胶粉，采用160至200目的硅胶装柱，采用干法装柱或湿法装柱，流动相采用正丙醇与水的配比为9比1，将所得到的蒜氨酸流份进行浓缩至没有液体流出为止而得到含蒜氨酸的固形物。
其中：所采用的浓缩方法为薄膜浓缩方法。或者所采用的浓缩方法为旋转蒸发浓缩方法；其中：对乙醇时，在60至80℃下浓缩至没有液体流出为止；对于正丙醇时，在70至90℃下浓缩至没有液体流出为止。在硅胶柱层析法中柱直径与柱长比最佳为1比20；在硅胶柱层析法中每千克冻干蒜粉每次收集流份量为100至500毫升。在第一次硅柱层析法后再采用第二次硅胶柱层析法来提高蒜氨酸纯度。在将硅胶柱层析法得到的蒜氨酸加入75％乙醇中，所需要的乙醇量以在50至90℃下使蒜氨酸完全溶解，然后在室温下结晶并过滤和洗涤后得到进一步纯化的蒜氨酸结晶物。
本发明的目的还可通过以下步骤来实现的：
第一步进行有机物提取，以冻干蒜粉为原料，每千克冻干蒜粉用1000至20000毫升的60％至90％的乙醇作为溶剂进行渗漉，并将所得渗漉液进行浓缩至没有液体流出为止而得到浓缩液，然后采用95％的乙醇或无水乙醇对浓缩液进行醇沉，在0至10℃下放置6至12小时，将上清液倾出，进行薄膜浓缩至没有液体流出为止而得到浓缩浸膏；
第二步采用硅胶柱层析法进行分离得到蒜氨酸，其中，上述浓缩浸膏采用硅胶粉拌样得到蒜硅胶粉，采用160至200目的硅胶装柱，柱直径与柱长比为1比20，采用干法装柱或湿法装柱，流动相采用正丙醇与水的配比为9比1，每千克冻干蒜粉每次收集流份量为100至500毫升，将所得到的蒜氨酸流份进行浓缩至没有液体流出为止而得到含蒜氨酸的固形物。
本发明的目的也可通过以下步骤来实现的：
第一步进行有机物提取，以冻干蒜粉为原料，每千克冻干蒜粉用1000至20000毫升的60％至90％的乙醇作为溶剂进行渗漉，每次加入量以溶剂能充分浸泡冻干蒜粉为宜，每次充分搅拌振摇，并浸泡放置6至12小时后收集渗漉液，然后将所得渗漉液进行浓缩至没有液体流出为止而得到浓缩液，然后采用95％的乙醇或无水乙醇对浓缩液进行醇沉，在0至10℃下放置6至12小时，将上清液倾出，在60至80℃下旋转蒸发浓缩至没有液体流出为止而得到浓缩浸膏；
第二步采用硅胶柱层析法进行分离得到蒜氨酸，其中，上述浓缩浸膏采用硅胶粉拌样得到蒜硅胶粉，采用160至200目的硅胶装柱，柱直径与柱长比为1比20，采用干法装柱或湿法装柱，流动相采用正丙醇与水的配比为9比1，每千克冻干蒜粉每次收集流份量为100至500毫升，在70至90℃下旋转蒸发浓缩至没有液体流出为止得到固形物，然后加入75％的乙醇，所需要的75％乙醇量以在50至90℃下使固形物完全溶解得到相应的流份；将确定为蒜氨酸的流份进行合并，然后在室温下结晶并过滤和洗涤后得到蒜氨酸粗品；在蒜氨酸粗品加入75％乙醇中，所需要的乙醇量以在50至90℃下使蒜氨酸完全溶解，然后在室温下结晶并过滤和洗涤后得到蒜氨酸结晶物。
在本发明中：在硅胶柱层析法中确定蒜氨酸流份的方法是采用薄层层析法，在该薄层层析法中，薄析板采用硅胶G板，展开剂由正丁醇与醋酸和水的配比为4比1比1配制而成，或者展开剂由乙醇与水的配比为17比5配制而成，或者展开剂由丙醇与水的配比为9比1配制而成；显色剂包括A液和B液，A液由100毫升0.4％茚三酮乙醇溶液与20毫升冰醋酸和4毫升2，4，6-三甲基吡啶配制成混合液，B液为1％硫酸铜乙醇溶液，使用时用50毫升A液与3毫升B液混合，蒜氨酸显色呈桔红色，或者显色剂采用茚三酮，蒜氨酸显色呈蓝色；蒜氨酸的标准溶液为含有蒜氨酸1毫克/毫升75％乙醇溶液，将标准液与各流份点于硅胶板上，点样量为20至70微升，在装有展开剂层析缸中展开至溶剂的前沿距硅胶板上端1至3厘米后，取出，待干后喷雾显色，与标准蒜氨酸斑点相同的流份就被确定为蒜氨酸流份。
下面结合实施例对本发明作进一步描述：
实施例1是按以下步骤进行：
第一步进行有机物提取，以冻干蒜粉为原料，每千克冻干蒜粉用1000至20000毫升的60％至90％的乙醇作为溶剂进行渗漉，并将所得渗漉液进行浓缩至没有液体流出为止而得到浓缩液，然后采用95％的乙醇或无水乙醇对浓缩液进行醇沉，在0至10℃下放置6至12小时，将上清液倾出，进行浓缩至没有液体流出为止而得到浓缩浸膏；
第二步采用硅胶柱层析法进行分离得到蒜氨酸，其中，上述浓缩浸膏采用硅胶粉拌样得到蒜硅胶粉，采用160至200目的硅胶装柱，采用干法装柱或湿法装柱，流动相采用正丙醇与水的配比为9比1，将所得到的蒜氨酸流份进行浓缩至没有液体流出为止而得到含蒜氨酸的固形物。
实施例2是按以下步骤进行：
第一步进行有机物提取，以冻干蒜粉为原料，每千克冻干蒜粉用1000至20000毫升的60％至90％的乙醇作为溶剂进行渗漉，并将所得渗漉液进行浓缩至没有液体流出为止而得到浓缩液，然后采用95％的乙醇或无水乙醇对浓缩液进行醇沉，在0至10℃下放置6至12小时，将上清液倾出，进行薄膜浓缩至没有液体流出为止而得到浓缩浸膏；
第二步采用硅胶柱层析法进行分离得到蒜氨酸，其中，上述浓缩浸膏采用硅胶粉拌样得到蒜硅胶粉，采用160至200目的硅胶装柱，柱直径与柱长比为1比20，采用干法装柱或湿法装柱，流动相采用正丙醇与水的配比为9比1，每千克冻干蒜粉每次收集流份量为100至500毫升，将所得到的蒜氨酸流份进行浓缩至没有液体流出为止而得到含蒜氨酸的固形物。
实施例3是按以下步骤进行：
第一步进行有机物提取，以冻干蒜粉为原料，每千克冻干蒜粉用1000至20000毫升的60％至90％的乙醇作为溶剂进行渗漉，每次加入量以溶剂能充分浸泡冻干蒜粉为宜，每次充分搅拌振摇，并浸泡放置6至12小时后收集渗漉液 然后将所得渗漉液进行浓缩至没有液体流出为止而得到浓缩液，然后采用95％的乙醇或无水乙醇对浓缩液进行醇沉，在0至10℃下放置6至12小时，将上清液倾出，在60至80℃下旋转蒸发浓缩至没有液体流出为止而得到浓缩浸膏；
第二步采用硅胶柱层析法进行分离得到蒜氨酸，其中，上述浓缩浸膏采用硅胶粉拌样得到蒜硅胶粉，采用160至200目的硅胶装柱，柱直径与柱长比为1比20，采用干法装柱或湿法装柱，流动相采用正丙醇与水的配比为9比1，每千克冻干蒜粉每次收集流份量为100至500毫升，在70至90℃下旋转蒸发浓缩至没有液体流出为止得到固形物，然后加入75％的乙醇，所需要的75％乙醇量以在50至90℃下使固形物完全溶解得到相应的流份；将确定为蒜氨酸的流份进行合并，然后在室温下结晶并过滤和洗涤后得到蒜氨酸粗品；在蒜氨酸粗品加入75％乙醇中，所需要的乙醇量以在50至90℃下使蒜氨酸完全溶解，然后在室温下结晶并过滤和洗涤后得到蒜氨酸结晶物。
在实施例1至3的硅胶柱层析法中确定蒜氨酸流份的方法都是采用薄层层析法：在该薄层层析法中，展开剂由正丁醇与醋酸和水的配比为4比1比1配制而成，或者展开剂由乙醇与水的配比为17比5配制而成，或者展开剂由丙醇与水的配比为9比1配制而成；显色剂包括A液和B液，A液由100毫升0.4％茚三酮乙醇溶液与20毫升冰醋酸和4毫升2，4，6-三甲基吡啶配制成混合液，B液为1％硫酸铜乙醇溶液，使用时用50毫升A液与3毫升B液混合，由于蒜氨酸分子结构中含有亚砜基，而亚砜基氨基酸显桔红色，因此蒜氨酸显色呈桔红色，或者显色剂采用茚三酮，蒜氨酸显色呈蓝色；蒜氨酸的标准溶液为含有蒜氨酸1毫克/毫升75％乙醇溶液，将标准液与各流份点于硅胶板上，点样量为20至70微升，在装有展开剂层析缸中展开至溶剂的前沿距硅胶板上端1至3厘米后，取出，待干后喷雾显色，与标准蒜氨酸斑点相同的流份就被确定为蒜氨蒜流份。
在本发明中所采用的原料冻干蒜粉，可直接从而市场上采购冻干蒜粉，也可利用真空冷冻干燥法自己生产，一般将蒜鳞芽经液氮冷冻后磨成冰粉，然后进行真空干燥得到冻干蒜粉。
下面将上述实施例3所得的蒜氨酸作为测试品(Alliin-XJYB)与Indofinechemical Company，Inc.USA所提供的批号为97112003的标准品(Alliin-USA)进行对比测试如下：
一、熔点测定：按照中华人民共和国药典95版一部附录42页，VII C熔点测定法的第一法操作，测得测试品的蒜氨酸熔点为164～166℃，而标准品的熔点为164～166℃。
二、紫外光谱测定：采用双光束可见-紫外分光光度计(760CRT型，上海第三分析仪器厂制造)，将测试品和标准品的蒜氨酸分别以50％乙醇为溶剂，配制成40.8微克/毫升(Alliin-XJYB)和40.4微克/毫升(Alliin-USA)的供试液；在200～350nm范围内扫描获得紫外吸收光谱，如附图1和2所示；两种供试液的紫外吸收光谱相同，最大吸收波长和吸收度分别为216.8nm、0.357(Alliin-USA)及218.0nm、0.360，计算吸收系数分别为E1％＝88.37(216.8nm)及88.24(218.0nm)，两种供试品的最大吸收波长和吸收系数相同(λmax＝217.4±0.6nm；E1％＝88.30±0.06)。
三、红外光谱测定：采用富丽叶变换红外光谱议-红外显微镜(FTS-135型，Bio-Rad Co.)，采用红外显微镜表面漫反射测定方法，测得标准品和测试品的红外光谱，如附图3和4所示，标准品和测试品的峰位、峰形和峰的相对高度完全一致。
四、薄层色谱分析(I)：按照中华人民共和国药典95版一部附录35页，VI B薄层色谱法操作，将标准品和测试品分别配制成1.00毫克/毫升的试液，分别点样于5×15硅胶G板，点样量为60微升，分别用两种流动相：正丁醇/醋酸/水＝4∶1∶1(I)、乙醇/水＝17∶5(II)展开，茚三酮试液喷显色；两种流动相均得到在相同位置有两个单一斑点的薄层色谱，如附图5所示，标准品和测试品的斑点的比移值值为：比移值＝0.33(展开剂I)，比移值＝0.71(展开剂II)。
五、薄层色谱分析(II)：取20×20硅胶G板，将Alliin-XJYB(1.00毫克/毫升)试液分别点样20、40、60、80、100微升，将Alliin-USA(1.00毫克/毫升)试液分别点样60微升，共6个斑点，同理上述薄层色谱分析(I)的操作，采用正丁醇/醋酸/水＝4∶1∶1的展开剂展开，茚三酮试液喷雾显色，如附图6所示，得到的薄层色谱图显示：1.不同浓度的Alliin-XJYB五个斑点，其比移值值与Alliin-USA斑点的比移值相同，均为0.33；2.Alliin-XJYB在20至100微克范围内均未见杂质斑点出现。
六、高效液相色谱分析：
仪器：岛津-HPLC-10A高效液相色谱议、SDP-10A型紫外检测器、C-R3A积分仪；
Alliin-USA标准对照液配制：Alliin-USA与内标物扑热息痛分别于105℃干燥2小时，分别准确称取适量，用流动相配制含Alliin-USA73.4微克/毫升及扑热息痛11.8微克/毫升的标准对照液；
Alliin-XJYB供试液配制：Alliin-XJYB与内标物扑热息痛分别于105℃干燥2小时，分别准确称取适量，用流动相配制含Alliin-XJYB86.6微克/毫升及扑热息痛10.0微克/毫升的供试液；
色谱条件：Spherisorb Sum C18柱(4.6×200毫米，大连化物所)，由甲醇与水的配比为60比40作为流动相，流率为0.8毫升/min，214nm检测，Alliin-USA标准对照液和Alliin-XJYB供试液分别进样20微升，根据色谱曲线，由内标对比法计算得到Alliin-XJYB含量，如附图7和8所示，显示：
1.在上述实验条件下，理论塔板数(以蒜氨酸计算)≥3000，与内标扑热息痛的分离度为1.3；
2.Alliin-XJYB供试液和Alliin-USA标准对照液色谱曲线的蒜氨酸与内标扑息痛的保留时间(tR)和峰面积(A)如附图7和8所示；
3.以Alliin-USA标准对照品的含量即纯度为99.5％计算，Alliin-XJYB的蒜氨酸的含量应为99.7％。
其中上述附图分别为：
附图1为Alliin-XJYB的紫外吸收光谱图，
附图2为Alliin-USA的紫外吸收光谱图，
附图3为Alliin-USA的红外吸收光谱图，
附图4为Alliin-XJYB的红外吸收光谱图，
附图5为Alliin-USA与Alliin-XJYB的TLC色谱图，
附图6为不同点样量Alliin-XJYB与Alliin-USA的TLC色谱图，
附图7和8为Alliin-USA与Alliin-XJYB的HPLC色谱图。
综上所述，得到以下结论：
1.根据熔点、紫外光谱测定、及红外光谱测定的结果确证：测试品(Alliin-XJYB)与标准品(Alliin-USA)同为蒜氨酸；
2.根据薄层色谱、熔点、红外、及紫外光谱测定结果的综合分析，未见有杂质的存在；
3.HPLC内标法测定蒜氨酸含量，测试品(Alliin-XJYB)含蒜氨酸为99.7％，高于标准品(Alliin-USA)的纯度。
因此，利用本发明可有效地从大蒜中提取蒜氨酸，从而解决了从大蒜中得到蒜氨酸的难题，并且可使纯度达到99.7％，高于Indofine chemical Company，Inc.USA所提供的批号为97112003的标准品(Alliin-USA)的纯度。
Claims (9)
1.一种从大蒜中提取蒜氨酸的方法，其特征在于按以下步骤进行：
第一步进行有机物提取，以冻干蒜粉为原料，每千克冻干蒜粉用1000至20000毫升的60％至90％的乙醇作为溶剂进行渗漉，并将所得渗漉液进行浓缩至没有液体流出为止而得到浓缩液，然后采用95％的乙醇或无水乙醇对浓缩液进行醇沉，在0至10℃下放置6至12小时，将上清液倾出，进行浓缩至没有液体流出为止而得到浓缩浸膏；
第二步采用硅胶柱层析法进行分离得到蒜氨酸，其中，上述浓缩浸膏采用硅胶粉拌样得到蒜硅胶粉，采用160至200目的硅胶装柱，采用干法装柱或湿法装柱，流动相采用正丙醇与水的配比为9比1，将所得到的蒜氨酸流份进行浓缩至没有液体流出为止而得到含蒜氨酸的固形物。
2.根据权利要求1所述的从大蒜中提取蒜氨酸的方法，其特征在于所采用的浓缩方法为薄膜浓缩方法。
3.根据权利要求1所述的从大蒜中提取蒜氨酸的方法，其特征在于所采用的浓缩方法为旋转蒸发浓缩方法；其中，对乙醇时，在60至80℃下浓缩至没有液体流出为止；对于正丙醇时，在70至90℃下浓缩至没有液体流出为止。
4.根据权利要求1所述的从大蒜中提取蒜氨酸的方法，其特征在于硅胶柱层析法中柱直径与柱长比为1比20。
5.根据权利要求1所述的从大蒜中提取蒜氨酸的方法，其特征在于硅胶柱层析法中每千克冻干蒜粉每次收集流份量为100至500毫升。
6.根据权利要求1所述的从大蒜中提取蒜氨酸的方法，其特征在于将硅胶柱层析法得到的蒜氨酸加入75％乙醇中，所需要的乙醇量以在50至90℃下使蒜氨酸完全溶解，然后在室温下结晶并过滤和洗涤后得到蒜氨酸结晶物。
7.根据权利要求1所述的从大蒜中提取蒜氨酸的方法，其特征在于按以下步骤进行：
第一步进行有机物提取时，所采用的浓缩方法为薄膜浓缩方法；
第二步采用硅胶柱层析法进行分离得到蒜氨酸时，柱直径与柱长比为1比20，每千克冻干蒜粉每次收集流份量为100至500毫升。
8.根据权利要求1所述的从大蒜中提取蒜氨酸的方法，其特征在于按以下步骤进行：
第一步进行有机物提取，以冻干蒜粉为原料，每千克冻干蒜粉用1000至20000毫升的60％至90％的乙醇作为溶剂进行渗漉，每次加入量以溶剂能充分浸泡冻干蒜粉为宜，每次充分搅拌振摇，并浸泡放置6至12小时后收集渗漉液，然后将所得渗漉液进行浓缩至没有液体流出为止而得到浓缩液，然后采用95％的乙醇或无水乙醇对浓缩液进行醇沉，在0至10℃下放置6至12小时，将上清液倾出，在60至80℃下旋转蒸发浓缩至没有液体流出为止而得到浓缩浸膏；
第二步采用硅胶柱层析法进行分离得到蒜氨酸，其中，上述浓缩浸膏采用硅胶粉拌样得到蒜硅胶粉，采用160至200目的硅胶装柱，柱直径与柱长比为1比20，采用干法装柱或湿法装柱，流动相采用正丙醇与水的配比为9比1，每千克冻干蒜粉每次收集流份量为100至500毫升，在70至90℃下旋转蒸发浓缩至没有液体流出为止得到固形物，然后加入75％的乙醇，所需要的75％乙醇量以在50至90℃下使固形物完全溶解得到相应的流份；将确定为蒜氨酸的流份进行合并，然后在室温下结晶并过滤和洗涤后得到蒜氨酸粗品；在蒜氨酸粗品加入75％乙醇中，所需要的乙醇量以在50至90℃下使蒜氨酸完全溶解，然后在室温下结晶并过滤和洗涤后得到蒜氨酸结晶物。
9.根据权利要求1或7或8所述的从大蒜中提取蒜氨酸的方法，其特征在于硅胶柱层析法中确定蒜氨酸流份的方法是采用薄层层析法，在该薄层层析法中，薄析板采用硅胶G板，展开剂由正丁醇与醋酸和水的配比为4比1比1配制而成，或者展开剂由乙醇与水的配比为17比5配制而成，或者展开剂由丙醇与水的配比为9比1配制而成；显色剂包括A液和B液，A液由100毫升0.4％茚三酮乙醇溶液与20毫升冰醋酸和4毫升2，4，6-三甲基吡啶配制成混合液，B液为1％硫酸铜乙醇溶液，使用时用50毫升A液与3毫升B液混合，蒜氨酸显色呈桔红色，或者显色剂采用茚三酮，蒜氨酸显色呈蓝色；蒜氨酸的标准溶液为含有蒜氨酸1毫克/毫升75％乙醇溶液，将标准液与各流份点于硅胶板上，点样量为20至70微升，在装有展开剂层析缸中展开至溶剂的前沿距硅胶板上端1至3厘米后，取出，待干后喷雾显色，与标准蒜氨酸斑点相同的流份就被确定为蒜氨酸流份。
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