WO2011108401A1 - 高速液体クロマトグラフ装置及び高速液体クロマトグラフ装置の液体送液方法 - Google Patents

高速液体クロマトグラフ装置及び高速液体クロマトグラフ装置の液体送液方法 Download PDF

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中川　裕章
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    • G01N30/28—Control of physical parameters of the fluid carrier
    • G01N30/34—Control of physical parameters of the fluid carrier of fluid composition, e.g. gradient

Definitions

  • the present invention relates to a high performance liquid chromatograph apparatus using a gradient elution method.
  • the gradient elution method is used in which the mixture ratio of two or more eluents is changed for the purpose of shortening the measurement time. Is generally done at a constant rate.
  • Patent Document 1 An example of a liquid chromatograph apparatus using a gradient elution method is described in Patent Document 1.
  • the measurement time can be shortened while the peak shape is maintained as the flow rate is increased.
  • the viscosity of each liquid is different, so the pressure value changes depending on the mixing ratio during the measurement.
  • the constant flow rate at this time is adjusted so as not to exceed the pressure resistance of the separation column on the basis of the time when the pressure value becomes highest during the measurement.
  • the object of the present invention is to realize a high-performance liquid chromatograph device capable of obtaining the same separation effect as the constant-speed gradient elution method and shortening the measurement time, and a liquid feeding method for the high-speed liquid chromatograph device It is to be.
  • the present invention is configured as follows.
  • the high performance liquid chromatograph apparatus of the present invention includes a liquid feeding means for feeding an eluent while changing a mixing ratio of two or more kinds of eluents, and a sample injection means for injecting a sample into the fed eluent.
  • a separation column for supplying the eluent into which the sample has been injected and separating the target component in the sample, a detector for analyzing the separated target component, the liquid feeding means, the sample injection means, the separation column, And control means for controlling the operation of the detector.
  • the control means includes a constant speed gradient program storage unit for storing a constant speed gradient program for feeding the eluent at a constant speed while changing a mixing ratio of two or more kinds of eluents, and a constant speed gradient program.
  • a constant pressure gradient program conversion unit for converting to a constant pressure gradient program for sending the eluent at a constant pressure while changing the mixing ratio of two or more kinds of eluents, and elution sent according to the converted constant pressure gradient program
  • a flow rate instruction unit for controlling the flow rate of the liquid.
  • a high-performance liquid chromatograph apparatus that can obtain the same separation effect as the constant-speed gradient elution method and that can shorten the measurement time and a liquid feeding method for the high-speed liquid chromatograph apparatus are realized. can do.
  • FIG. 1 is a schematic configuration diagram of a high performance liquid chromatograph apparatus to which the present invention is applied. It is a figure which shows the example of a display screen of the data processor which performs the setting of the constant pressure gradient program of this invention. It is an internal general
  • FIG. 9 is a diagram in which the constant speed gradient program of FIG. 6 is subdivided and pressure values for each time are extracted from FIG. 8 and described. It is a figure which shows the data which converted the constant-speed gradient program of FIG. 9 into the constant-pressure gradient program. It is a figure which shows the chromatogram when it measures with the constant pressure gradient program of FIG. It is a figure which shows a pressure value trace when it measures with the constant pressure gradient program of FIG. It is a whole operation
  • FIG. 1 is a schematic diagram of a high performance liquid chromatograph apparatus to which the present invention is applied.
  • the eluent A2 and the eluent B3 placed in the reagent rack 1 are sent to the sample injection device 8 by the liquid feeding part A5 and the liquid feeding part B6 incorporated in the liquid feeding pump 4, respectively.
  • a syringe is used as the liquid feeding units 5 and 6.
  • the data processing device 13 is connected to each unit (the liquid feed pump 4, the sample injection device 8, the column oven 9, and the detector 11) by a signal cable 12, and not only the operation control of each unit but also the signal of the detector 11 is connected. The intensity and the pressure value of the pressure sensor 7 are recorded and saved.
  • the data processing device 13 includes a display (display device), and necessary items are displayed on the display.
  • FIG. 2 is a diagram showing a setting screen example of the data processing device 13 when using the constant pressure gradient program.
  • a constant speed gradient program that is arbitrarily input by the user is input to item 1 and item 2.
  • the relationship between the elapse of time between the eluents A and B and the flow rate can be set.
  • the user can select to use the constant pressure gradient program by checking item 3. At the same time, an arbitrary numerical value can be input in item 4 to determine from which stage (time point) of the constant speed gradient program the constant pressure gradient program is applied.
  • check item 5 When converting to a constant pressure gradient program based on pressure value traces measured in the past with a constant speed gradient program, check item 5 and select the pressure trace file based on item 6. Next, item 7 or item 8 can be entered to determine the reference pressure value, the highest pressure value in the past pressure trace.
  • FIG. 3 schematically shows the operation function of the embodiment of the present invention inside the data processing device 13.
  • the operation of the converted constant pressure gradient program is executed by the liquid feeding units 5 and 6 via the flow rate instruction unit 13d and the mixing ratio instruction unit 13e.
  • FIG. 4 is a table showing a model in which the constant speed gradient program is subdivided and the pressure values actually measured at each time are described.
  • FIG. 5 is a table showing the model after conversion into the constant pressure gradient program. is there.
  • f m F ⁇ ⁇ (P s or P max) / P m ⁇ ⁇ (1)
  • m is a number of 0 or more
  • F is a constant flow rate
  • any pressure value P s is the determined by the user based on such a column withstand guaranteed
  • P max is the constant speed gradient maximum pressure value in the program
  • P m denotes a pressure value actually measured.
  • n a number of 1 or more
  • T n and T n-1 are time in a constant speed gradient program
  • f n-1 and f n are flow rates after conversion into a constant pressure gradient program. is there.
  • the subdivision of the constant speed gradient program is preferably performed at as short a time interval as possible. Further, segmentation may be performed not only for each time but for each pressure change amount.
  • FIG. 9 is a table in which the constant speed gradient program of FIG. 6 is subdivided at intervals of 0.5 minutes, and the pressure values at that time are extracted from FIG.
  • FIG. 10 shows the result of converting the constant speed gradient program into the constant pressure gradient program using the above formulas (1) and (2) with the highest pressure value in the pressure value trace as a reference after 0.5 minutes. As shown in FIG. 9, the measurement which took 10 minutes in the constant speed gradient program was shortened to 8.15 minutes in the constant pressure gradient program as shown in FIG.
  • the judgment of the end of the measurement in the constant velocity gradient program and the constant pressure gradient program is the time when all of the planned flow rate is flowed.
  • the time when all of the planned flow rate is flowed is 10 minutes for the constant speed gradient program and 8.15 minutes for the constant pressure gradient program.
  • the tables shown in FIGS. 9 and 10 can be displayed on the display of the data processing device 13 so that the measurement elapsed time schedule can be determined when the constant speed gradient program is converted into the constant pressure gradient program.
  • FIG. 11 is a diagram showing a chromatogram when measured with a constant pressure gradient program converted from a constant speed gradient program
  • FIG. 12 is a graph showing a pressure value trace at that time, that is, when measured with a converted constant pressure gradient program. It is. As shown in FIG. 12, although there were some pulsations, the pressure value was almost constant from start to finish, and a separation effect similar to that of the constant speed gradient program (FIG. 11) could be obtained.
  • the liquid feeding amount changes in a quadratic function.
  • solution mixing ratio B between t p and t p + 1 of the pressure gradient program predetermined time interval
  • B x B p + [f p ⁇ (t x ⁇ t p ) + (t x ⁇ t p ) ⁇ ⁇ (f p + 1 ⁇ f p ) / (t p + 1 ⁇ t 1 ) ⁇ ⁇ (t x ⁇ t p ) / 2] / ⁇ F ⁇ (T p + 1 ⁇ T p ) ⁇ ⁇ (B p + 1 ⁇ B p ) (3)
  • B p and B p + 1 are the solution mixing ratio in the constant speed gradient program
  • f p and f p + 1 are the flow velocity after conversion
  • t x is the time at that time
  • T p and T p + 1 are the constant speed gradient.
  • a time t 1 in the program is a time (for example, 0.5 minutes) after a certain time has elapsed since the start of measurement.
  • the current pressure value measured by the pressure sensor 7 shown in FIG. 3 and the information on the constant speed gradient program stored in the constant speed gradient program storage section 13c are transmitted to the constant pressure gradient program conversion section 13b.
  • the constant pressure gradient program conversion unit 13b adjusts the flow rates of the liquid feeding units 5 and 6 through the flow rate instruction unit 13d so that the reference pressure value set in the item 10 or 11 of FIG.
  • the constant pressure gradient program conversion unit 13b calculates the total liquid supply amount after the measurement is started from the number of rotations of the motor of the liquid supply pump 4 and the like. For example, when the total liquid feeding amount is 10 mL, the liquid feeding units 5 and 6 are adjusted via the mixing ratio instructing unit 13 e so that the mixing ratio is 10 minutes with a constant speed gradient program with a flow rate of 1 mL / min. To do.
  • FIG. This operation is executed by the data processing device 13 instructed to control each unit.
  • step S1 in FIG. 13 data is input to items 1 and 2 in FIG.
  • step S2 it is determined whether or not the constant pressure gradient program is used. If the constant pressure gradient program is not used, the process proceeds to step S12, and the constant speed gradient program is executed.
  • step S2 If the constant pressure gradient program is used in step S2, the process proceeds to step S3, and the data of item 4 shown in FIG. 2 is input.
  • step S4 the past pressure value is converted into the constant pressure gradient program based on the trace. (Item 5) or whether to convert to a constant pressure gradient program based on the pressure value measured in real time (Item 9) is selected.
  • step S4 when the past pressure value is converted to a constant pressure gradient program based on the trace (item 5) is selected, the process proceeds to step S5, the past pressure value trace file is selected, and the selected trace file is selected. Is displayed on the display (step S6), and the pressure value is set (step S7).
  • the constant speed gradient program is converted into a constant pressure gradient program (step S8), and a numerical value (FIG. 10) based on the converted constant pressure gradient program is displayed on the screen.

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Abstract

本発明の高速液体クロマトグラフ装置は、定速グラジエント溶出法と同様の分離効果を得ることができ、かつ、測定時間を短縮することが可能である。データ処理装置（１３）により過去の圧力値をトレースに基づいて定圧グラジエントプログラムに変換する場合は、圧力トレース記憶部（１３ａ）に記憶された圧力値トレースファイルが選択されディスプレイに表示され、圧力値が設定される。定圧グラジエントプログラム変換部（１３ｂ）により定速グラジエントプログラム記憶（１３ｃ）に記憶された定速グラジエントプログラムが定圧グラジエントプログラムに変換され、変換された定圧グラジエントプログラムによる数値が表示される。画面表示された定圧グラジエントプログラムに従って流速指示部（１３ｄ）、混合比率指示部（１３ｃ）により送液ポンプ（４）の送液部（５、６）が制御される。

Description

高速液体クロマトグラフ装置及び高速液体クロマトグラフ装置の液体送液方法
　本発明は、グラジエント溶出法を使用する高速液体クロマトグラフ装置に関する。
　高速液体クロマトグラフでは、測定時間を短縮するなどの目的で、二種類以上の溶離液の混合比率を変化させながら送液するグラジエント溶出法が使用されてきたが、ピーク形状が悪くならないように流速は一般的に一定で行われている。
　グラジェント溶出法を用いた液体クロマトグラフ装置の例は、特許文献１に記載されている。
ＷＯ２００３／０７９０００号公報
　ところで、近年、充填剤の粒子径が従来品よりも小さく、平均粒子径が約２．５マイクロメートル以下の分離カラムが開発された。充填剤の粒子径が大きい（５マイクロメートル程度）従来品は流速を上げるとピーク形状が悪くなるが、充填剤の粒子径が小さい分離カラムはピーク形状がほとんど悪くならないという特徴を持つ。
　充填剤の粒子径が小さい分離カラムは、分離カラムの耐圧を超えない範囲であれば、流速を上げれば上げるほどピーク形状は維持されながら測定時間を短縮することができる。
　しかし、従来技術における分離カラムではカラムごとに最適な流速を設定し、それから大きく離れた流速で使用することはあまりなかった。
　ここで、水溶液と有機溶媒などを溶離液としてグラジエント溶出法を行ったときに、それぞれの液体の粘性が異なるので、測定中は混合比率によって圧力値が変化していく。
　従来技術においても、充填剤の粒子径が小さい分離カラムがグラジエント溶出法に利用されているが、流速は一定で行われている。
　この時の一定流速は、測定中に最も圧力値が高くなる時点を基準として、分離カラムの耐圧を超えないように調整される。
　つまり、従来技術においては、調整された流速以上に流速を上げて測定時間を短縮することは考慮されていなかった。
　本発明の目的は、定速グラジエント溶出法と同様の分離効果を得ることができ、かつ、測定時間を短縮することが可能な高速液体クロマトグラフ装置及び高速液体クロマトグラフ装置の送液方法を実現することである。
　上記目的を達成するため、本発明は次のように構成される。
　本発明の高速液体クロマトグラフ装置は、２種類以上の溶離液の混合比率を変化させながら溶離液を送液する送液手段と、送液された溶離液中に試料を注入する試料注入手段と、試料が注入された溶離液が供給され、試料中の目的成分を分離する分離カラムと、分離された目的成分を分析する検出器と、上記送液手段、上記試料注入手段、上記分離カラム、及び上記検出器の動作を制御する制御手段とを備える。
　上記制御手段は、２種類以上の溶離液の混合比率を変化させながら、一定速度で溶離液を送液するための定速グラジエントプログラムを記憶する定速グラジエントプログラム記憶部と、定速グラジエントプログラムを２種類以上の溶離液の混合比率を変化させながら一定圧力で溶離液を送液するための定圧グラジエントプログラムに変換する定圧グラジエントプログラム変換部と、変換された定圧グラジエントプログラムに従って、送液される溶離液の流速を制御する流速指示部とを有する。
　本発明によれば、定速グラジエント溶出法と同様の分離効果を得ることができ、かつ、測定時間を短縮することが可能な高速液体クロマトグラフ装置及び高速液体クロマトグラフ装置の送液方法を実現することができる。
本発明が適用される高速液体クロマトグラフ装置の概略構成図である。 本発明の定圧グラジエントプログラムの設定を行うデータ処理装置の表示画面例を示す図である。 本発明の定圧グラジエントプログラムを実行するデータ処理装置の内部概略機能構成図である。 本発明に適用される定速グラジエントプログラムのモデルを示す図である。 本発明における定圧グラジエントプログラムのモデルを示す図である。 本発明に用いる定速グラジエントプログラムの例を示す図である。 図６の定速グラジエントプログラムで測定したときのクロマトグラムを示す図である。 図６の定速グラジエントプログラムで測定したときの圧力値トレースである。 図６の定速グラジエントプログラムを細分化して、それぞれの時間毎の圧力値を図８から抽出して記載した図である。 図９の定速グラジエントプログラムを定圧グラジエントプログラムに変換したデータを示す図である。 図１０の定圧グラジエントプログラムで測定したときのクロマトグラムを示す図である。 図１０の定圧グラジエントプログラムで測定したときの圧力値トレースを示す図である。 本願発明の実施例１の全体動作フローチャートである。
　以下、図面に基づいて本発明の実施形態を説明する。
　図１は、本発明が適用される高速液体クロマトグラフの装置の概略図である。図１において、試薬ラック１に置かれた溶離液Ａ２と溶離液Ｂ３はそれぞれ、送液ポンプ４に組み込まれた送液部Ａ５と送液部Ｂ６によって試料注入装置８へ送液される。送液部５、６は、例えばシリンジが使用される。
　グラジエント溶出法を行う場合には、送液部５、６の動作速度を変更させることなどによって混合比率が調整される。通常、送液ポンプ４の吐出側には送液不良や流路内の詰まりを判断するために、圧力センサ７が内蔵されている。試料注入装置８で注入された試料は、一定温度に保つためのカラムオーブン９内に設置された分離カラム１０で目的成分が分離され、それが検出器１１で検知される。
　データ処理装置１３は、それぞれのユニット（送液ポンプ４、試料注入装置８、カラムオーブン９、検出器１１）と信号ケーブル１２で接続され、各ユニットの動作制御だけではなく、検出器１１の信号強度や圧力センサ７の圧力値を記録保存する。また、データ処理装置１３はディスプレイ（表示装置）を備え、このディスプレイに必要な事項が表示される。
　分離カラム１０には、平均粒子径が約２．５マイクロメートル以下の複数の粒子からなる充填材が使用されている。
　図２は、定圧グラジエントプログラムを使用するときのデータ処理装置１３の設定画面例を示す図である。
　図２において、項目１と項目２には、使用者が任意に入力した定速グラジエントプログラムが入力されている。図２に示した例においては、溶離液ＡとＢとの割合の時間経過との関係と、流速とが設定可能となっている。
　使用者が項目３にチェックを入れることで、定圧グラジエントプログラムの利用を選択することができる。同時に、項目４に任意の数値を入力して、定速グラジエントプログラムのどの段階（時点）から定圧グラジエントプログラムを適用させるのかを決定することができる。
　定速グラジエントプログラムで過去に測定したときの圧力値トレースを基に定圧グラジエントプログラムに変換する場合は、項目５にチェックを入れ、項目６に基となる圧力トレースのファイルを選択する。次に、項目７もしくは項目８を入力して、基準となる圧力値、過去の圧力トレース中で最も高い圧力値を決めることができる。
　データ処理装置１３の内部で本発明における実施例の動作機能を模式化したものが図３である。
　図３において、定速グラジエントプログラムで過去に測定したときの圧力値トレースを基に定圧グラジエントプログラムに変換する場合は、圧力値トレース記憶部１３ａに保存されている圧力値トレースと定速グラジエントプログラム記憶部１３ｃに保存されている定速グラジエントプログラムの情報が、定圧グラジエントプログラム変換部１３ｂに伝達される。
　変換された定圧グラジエントプログラムの動作は流速指示部１３ｄと混合比率指示部１３ｅを介して、送液部５、６が実行する。
　図４は、定速グラジエントプログラムを細分化して、その時間毎に実際に測定された圧力値を記載したモデルを示す表であり、図５は定圧グラジエントプログラムに変換した後のモデルを示す表である。
　図４、図５において、まず、定圧グラジエントプログラムの流速ｆｍについて次式（１）を用いて算出する。
　ｆｍ＝Ｆ・｛（Ｐｓ　ｏｒ　Ｐｍａｘ）／Ｐｍ｝　　　・・・（１）
　ただし、上記式（１）において、ｍは０以上の数であり、Ｆは一定流速、Ｐｓはカラム耐圧保証値などを基に使用者が定めた任意の圧力値、Ｐｍａｘは定速グラジエントプログラム中の最大圧力値、Ｐｍは実測した圧力値を示す。
　次に、定圧グラジエントプログラムの時間ｔｎを、次式（２）を用いて算出する。
　ｔｎ＝ｔｎ－１＋Ｆ・（Ｔｎ－Ｔｎ－１）／｛（ｆｎ－１＋ｆｎ）／２｝　・・・（２）
　ただし、上記式（１）において、ｎは１以上の数であり、Ｔｎ、Ｔｎ－１は定速グラジエントプログラムにおける時間、ｆｎ－１、ｆｎは定圧グラジエントプログラムに変換後の流速である。
　定速グラジエントプログラムの細分化は、可能な限り短い時間間隔で行うのが好ましい。また、時間毎だけではなく、圧力変化量毎に細分化を行ってもよい。
　図６は、定速グラジエントプログラムで測定した具体例を示す表であり、図７は図６の定速グラジエントプログラムで測定したクロマトグラムである。そして、図８はその時の圧力値トレースをあらわしている。
　また、図９は０．５分間隔で、図６の定速グラジエントプログラムを細分化して、その時々の圧力値を図８から抽出して記載した表である。
　図１０は０．５分以降を圧力値トレース中で最も高い圧力値を基準として、上記式（１）、（２）を用いて、定速グラジエントプログラムを定圧グラジエントプログラムに変換したものである。図９に示すように定速グラジエントプログラムでは１０分かかっていた測定が、図１０に示すように定圧グラジエントプログラムでは８．１５分に短縮された。
　なお、定速グラジエントプログラム及び定圧グラジエントプログラムでの測定終了の判断は、予定流液量が全て流された時点である。つまり、予定流液量が全て流された時点が、定速グラジエントプログラムでは１０分であり、定圧グラジエントプログラムでは８．１５分である。
　図９、図１０に示した表は、定速グラジエントプログラムを定圧グラジエントプログラムに変換した場合における測定経過時間予定が判断可能なように、データ処理装置１３のディスプレイに表示することができる。
　図１１は定速グラジエントプログラムから変換した定圧グラジエントプログラムで測定したときのクロマトグラムを示す図であり、図１２はその時の、つまり、変換した定圧グラジエントプログラムで測定したときの圧力値トレースを示すグラフである。図１２に示すように、多少の脈動はあるものの圧力値は、終始ほぼ一定で、定速グラジエントプログラムと同様の分離効果（図１１）を得ることができた。
　ここで、等加速送液では送液量は二次関数的に変化していく。高速液体クロマトグラフ装置により制御が可能であれば、より厳密に定速グラジエントプログラムから定圧グラジエントプログラムへ変換するために、定圧グラジエントプログラムのｔｐとｔｐ＋１間（所定時間間隔）の溶液混合比率Ｂｘを、例えば、次式（３）で二次関数的に変化させるのが好ましい。
　Ｂｘ＝Ｂｐ＋［ｆｐ・（ｔｘ－ｔｐ）＋（ｔｘ－ｔｐ）・｛（ｆｐ＋１－ｆｐ）／（ｔｐ＋１－ｔ１）｝・（ｔｘ－ｔｐ）／２］／｛Ｆ・（Ｔｐ＋１－Ｔｐ）｝・（Ｂｐ＋１－Ｂｐ）　　　・・・（３）
　ただし、（３）式において、Ｂｐ、Ｂｐ＋１は定速グラジエントプログラムにおける溶液混合比率、ｆｐ、ｆｐ＋１は変換後の流速、ｔｘはその時の時間、Ｔｐ、Ｔｐ＋１は定速グラジエントプログラムにおける時間、ｔ１は測定開始から一定時間経過後の時間（例えば、０．５分）である。
　次に、過去の圧力値トレースデータに基づいて定圧グラジエントプログラムに変換するのではなく、リアルタイムに測定された圧力値に基いて調整する（プログラム変換する）場合について説明する。
　リアルタイムに調整する場合は、図２の項目９にチェックを入れて、項目１０（指定圧力値）もしくは項目１１（測定開始時の圧力値）を入力して基準となる圧力値を決める。
　この場合の動作について説明する。
　図３に示した圧力センサ７で計測している現時点の圧力値と定速グラジエントプログラム記憶部１３ｃに保存されている定速グラジエントプログラムの情報が、定圧グラジエントプログラム変換部１３ｂに伝達される。
　定圧グラジエントプログラム変換部１３ｂは、図２の項目１０もしくは項目１１で設定した基準となる圧力値になるように流速指示部１３ｄを介して、送液部５、６の流速を調整する。
　平行して、定圧グラジエントプログラム変換部１３ｂは、測定を開始してからの総送液量を送液ポンプ４のモーター回転数などから算出する。例えば、総送液量が１０ｍＬの場合には、流速１ｍＬ／ｍｉｎの定速グラジエントプログラムで１０分時の混合比率になるように混合比率指示部１３ｅを介して、送液部５、６を調整する。
　以上の動作の全体動作フローチャートを図１３に示す。この動作は、データ処理装置１３により各部に制御指示され、実行される。
　図１３のステップＳ１において、図２の項目１、２にデータが入力される。次に、ステップＳ２において、定圧グラジエントプログラムを利用するか否かが判断され、定圧グラジエントプログラムを利用しない場合は、ステップＳ１２に進み、定速グラジエントプログラムが実行される。
　ステップＳ２において、定圧グラジエントプログラムを利用する場合は、ステップＳ３に進み、図２に示した項目４のデータが入力され、ステップＳ４において、過去の圧力値をトレースに基づいて定圧グラジエントプログラムに変換するか（項目５）、リアルタイムに測定した圧力値に基づいて定圧グラジエントプログラムに変換するか（項目９）が選択される。
　ステップＳ４において、過去の圧力値をトレースに基づいて定圧グラジエントプログラムに変換する（項目５）が選択された場合は、ステップＳ５に進み、過去の圧力値トレースファイルが選択され、選択されたトレースファイルがディスプレイに表示され（ステップＳ６）、圧力値が設定される（ステップＳ７）。
　次に、定速グラジエントプログラムが定圧グラジエントプログラムに変換され（ステップＳ８）、変換された定圧グラジエントプログラムによる数値（図１０）が画面表示される。
　画面表示された定圧グラジエントプログラムによる数値により実行するか否かが判断され（ステップＳ１０）、実行可能であればステップＳ１１に進み、実行される。
　ステップＳ１０において、表示された数値での実行を望まない場合は、ステップＳ５に戻り、圧力値トレースファイルの選択から再開する。
　ステップＳ４において、項目９が選択された場合は、ステップＳ１３に進み、基準圧力値、測定開始圧力値が入力される。そして、実測が行われ（ステップＳ１４）、実測された結果に基づいて定速グラジエントプログラムが定圧グラジエントプログラムに変換される（ステップＳ１５）。
　そして、ステップＳ１６において、実測値が画面表示され、画面表示された数値により実行するか否かが判断され（ステップＳ１７）、実行可能であればステップＳ１８に進み、実行される。
　ステップＳ１７において、表示された数値での実行を望まない場合は、ステップＳ１３に戻り、基準圧力値等の入力から再開する。
　以上のように、本発明の実施例によれば、最適な最大圧力が得られるように溶液の流速を制御しているので、粒子径（平均粒子径約２．５マイクロメートル）が小さな充填剤の分離カラムが用いられた場合、最大圧力内で、溶液の流速を上昇させることができ、分析時間を短縮可能となる。充填剤の粒子径が小さい分離カラムの場合は、分離カラムの耐圧を超えない範囲であれば、流速を上げても、一定以上のピーク形状を維持可能である。
　したがって、本発明の実施例１によれば、定速グラジエント溶出法と同様の分離効果を得ることができ、かつ、測定時間を短縮することが可能な高速液体クロマトグラフ装置及び高速液体クロマトグラフ装置の送液方法を実現することができる。
　なお、分離カラムは使用を続けると、試料や溶離液中のゴミが徐々に詰まり、同じ組成の溶離液を同じ流速で送液しても圧力値は上昇してしまう。
　そのため、リアルタイムで定圧グラジエントプログラムに変換して測定を行っていると、ピークの溶出時間が遅れていく。溶出時間の再現性を得るために、一度目はリアルタイムで変換を行って、その時の流速や混合比率の変化の様子を記録しておき、次回以降からは現時点の圧力値をフィードバックさせず、以前に記録した流速や混合率比率の変化を再現させて測定を行ってもよい。
　また、本発明は、充填剤の粒子径が小さい（平均粒子径約２．５マイクロメートル）分離カラムを使用する高速液体クロマトグラム装置に適用することが最も好ましいが、充填剤の粒子径が通常（平均粒子径約５．０マイクロメートル）の分離カラムを使用する液体クロマトグラム装置にも適用可能である。
　充填剤の粒子径が通常の分離カラムの場合、溶液の流速をあげると、ピーク形状が悪化する可能性はあるが測定時間の短縮は可能である。
　したがって、測定精度が劣っていても、短時間で測定が可能なことを望む場合は、充填剤の粒子径が通常の分離カラムを用いる場合に好適である。
　なお、ピーク形状の悪化は、ソフトウエア処理により改善するように構成することも可能である。
　１・・・試薬ラック、２・・・溶離液Ａ、３・・・溶離液Ｂ、４・・・送液ポンプ、５・・・送液部Ａ、６・・・送液部Ｂ、７・・・圧力センサ、８・・・試料注入装置、９・・・カラムオーブン、１０・・・分離カラム、１１・・・検出器、１２・・・信号ケーブル、１３・・・データ処理装置、１３ａ・・・圧力値トレース記憶部、１３ｂ・・・定圧グラジエントプログラム変換部、１３ｃ・・・定速グラジエントプログラム記憶部、１３ｄ・・・流速指示部、１３ｅ・・・混合比率指示部

Claims (16)

  1. 　高速液体クロマトグラフ装置において、
    　２種類以上の溶離液の混合比率を変化させながら溶離液を送液する送液手段（４）と、
    　上記送液手段（４）から送液された溶離液中に試料を注入する試料注入手段（８）と、
    　上記試料注入手段（８）により試料が注入された溶離液が供給され、試料中の目的成分を分離する分離カラム（１０）と、
    　上記分離カラム（１０）により分離された目的成分を分析する検出器（１１）と、
    　上記送液手段（４）、上記試料注入手段（８）、上記分離カラム（１０）、及び上記検出器（１１）の動作を制御する制御手段（１３）と、
    　を備え、上記制御手段（１３）は、２種類以上の溶離液の混合比率を変化させながら、一定速度で溶離液を送液するための定速グラジエントプログラムを記憶する定速グラジエントプログラム記憶部（１３ｃ）と、上記定速グラジエントプログラムを２種類以上の溶離液の混合比率を変化させながら、一定圧力で溶離液を送液するための定圧グラジエントプログラムに変換する定圧グラジエントプログラム変換部（１３ｂ）と、上記変換部（１３ｂ）により変換された定圧グラジエントプログラムに従って、上記送液手段（４）により送液される溶離液の流速を制御する流速指示部（１３ｄ）とを有することを特徴とする高速液体クロマトグラフ装置。
  2. 　請求項１に記載の高速液体クロマトグラフ装置において、上記送液手段（４）から送液される溶離液の圧力を測定する圧力センサ（７）を備え、上記制御手段（１３）は、上記圧力センサ（７）により測定された圧力値を記憶する圧力値トレース記憶部（１３ａ）を有し、上記制御手段（１３）の上記変換部（１３ｂ）は、上記圧力値トレース記憶部（１３ａ）に記憶された圧力値に基づいて、上記定速グラジエントプログラムを定圧グラジエントプログラムに変換することを特徴とする高速液体クロマトグラフ装置。
  3. 　請求項１に記載の高速液体クロマトグラフ装置において、上記送液手段から送液される溶離液の圧力を測定する圧力センサ（７）を備え、上記制御手段（１３）は、上記圧力センサ（７）により測定された現在の圧力値と、上記送液手段（４）の送液量とに基づいて、上記定速グラジエントプログラムを定圧グラジエントプログラムに変換することを特徴とする高速液体クロマトグラフ装置。
  4. 　請求項２に記載の高速液体クロマトグラフ装置において、上記定速グラジエントプログラム記憶部（１３ｃ）は、複数の定速グラジエントプログラムを記憶し、上記制御手段（１３）は、複数の定速グラジエントプログラムのうちの一つと流速とが指定される指定部（１３ｄ）を有し、上記変換部（１３ｂ）は、指定部（１３ｄ）により指定された定速グラジエントプログラムと流速とに基づいて、定速グラジエントプログラムを定圧グラジエントプログラムに変換することを特徴とする高速液体クロマトグラフ装置。
  5. 　請求項４に記載の高速液体クロマトグラフ装置において、上記指定部（１３ｄ）には、定圧グラジエントプログラムが適用される時間が指定され、上記制御手段（１３）は、指定された時間以降に上記変換した定圧グラジエントプログラムに従って、上記送液手段（４）により送液される溶離液の流速を制御することを特徴とする高速液体クロマトグラフ装置。
  6. 　請求項２に記載の高速液体クロマトグラフ装置において、上記制御手段（１３）は、表示部を有し、変換した定圧グラジエントプログラムに従った経過時間と、溶離液混合比率及び流速との関係を示すデータを上記表示部に表示させることを特徴とする高速液体クロマトグラフ装置。
  7. 　請求項３に記載の高速液体クロマトグラフ装置において、上記制御手段（１３）は、表示部を有し、上記圧力センサ（７）により測定された現在の圧力値を上記表示部に表示させることを特徴とする高速液体クロマトグラフ装置。
  8. 　請求項１に記載の高速液体クロマトグラフ装置において、上記分離カラム（１０）の充填剤は、平均粒子径が約２．５マイクロメートル以下の複数の粒子であることを特徴とする高速液体クロマトグラフ装置。
  9. 　２種類以上の溶離液の混合比率を変化させながら溶離液を送液し、上記送液された溶離液中に試料を注入し、分離カラム（１０）に上記試料が注入された溶離液が供給され、試料中の目的成分を分離し、分離された目的成分を検出器（１１）により分析する　高速液体クロマトグラフ装置の液体送液方法において、
    　２種類以上の溶離液の混合比率を変化させながら、一定速度で溶離液を送液するための定速グラジエントプログラムを記憶し、上記定速グラジエントプログラムを２種類以上の溶離液の混合比率を変化させながら、一定圧力で溶離液を送液するための定圧グラジエントプログラムに変換し、変換した定圧グラジエントプログラムに従って、送液される溶離液の流速を制御することを特徴とする高速液体クロマトグラフ装置の液体送液方法。
  10. 　請求項９に記載の高速液体クロマトグラフの送液方法において、送液される溶離液の圧力を測定し、測定された圧力値を記憶し、記憶された圧力値に基づいて、上記定速グラジエントプログラムを定圧グラジエントプログラムに変換することを特徴とする高速液体クロマトグラフ装置の液体送液方法。
  11. 　請求項９に記載の高速液体クロマトグラフ装置の送液方法において、上記送液される溶離液の圧力を測定し、測定された現在の圧力値と、送液量とに基づいて、上記定速グラジエントプログラムを定圧グラジエントプログラムに変換することを特徴とする高速液体クロマトグラフ装置の送液方法。
  12. 　請求項１０に記載の高速液体クロマトグラフ装置の送液方法において、複数の定速グラジエントプログラムを記憶し、複数の定速グラジエントプログラムのうちの一つと流速とが指定され、指定された定速グラジエントプログラムと流速とに基づいて、定速グラジエントプログラムを定圧グラジエントプログラムに変換することを特徴とする高速液体クロマトグラフ装置の送液方法。
  13. 　請求項１２に記載の高速液体クロマトグラフ装置の送液方法において、定圧グラジエントプログラムが適用される時間が指定され、指定された時間以降に上記変換した定圧グラジエントプログラムに従って、送液手段（４）により送液される溶離液の流速を制御することを特徴とする高速液体クロマトグラフ装置の送液方法。
  14. 　請求項１０に記載の高速液体クロマトグラフ装置の送液方法において、変換した定圧グラジエントプログラムに従った経過時間と、溶離液混合比率及び流速との関係を示すデータを表示部に表示させることを特徴とする高速液体クロマトグラフ装置の送液方法。
  15. 　請求項１１に記載の高速液体クロマトグラフ装置の送液方法において、測定された現在の圧力値を表示部に表示させることを特徴とする高速液体クロマトグラフ装置の送液方法。
  16. 　請求項９に記載の高速液体クロマトグラフ装置の送液方法において、上記分離カラム（１０）の充填剤は、平均粒子径が約２．５マイクロメートル以下の複数の粒子であることを特徴とする高速液体クロマトグラフ装置の送液方法。
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