JP6706920B2 - 液体クロマトグラフ方法及び液体クロマトグラフィ補助装置 - Google Patents

Description

本発明は液体クロマトグラフ方法及び液体クロマトグラフィ補助装置に関するものである。

液体クロマトグラフィにおいては、カラム内に充填された固定相内に、試料が溶解した溶液を通過させる。このとき、カラム内に導入された試料内の各成分は固定相との相互作用や移動相との親和性等により、カラムを通過する時間が異なるため、カラムから排出される時点では各成分が分離される。固定相との相互作用が強い、又は移動相との親和性の弱い物質がカラム中に長く留まり、カラムから遅く排出されることとなる。

このような液体クロマトグラフィにおいては、溶媒種の選択、カラムサイズの選定が重要であり、試料の溶出時間や分離度は、これらの条件と密接に関連する。このため、実際の液体クロマトグラフィを行う前に試験結果を予測することができれば、実験の効率を向上させることができる。

上記液体クロマトグラフィと同じ原理により行われる薄層クロマトグラフィ（ＴＬＣ）がある。薄層クロマトグラフィでは、薄層とされたカラム内の固定相に用いられる物質に試料が垂らされ、この薄層が移動層となる溶離液中に浸漬される。そして、毛管現象により溶離液が薄層に吸い上げられると共に試料が吸い上げられる作用により、試料の溶離液に対する移動度Ｒ_fを求めることができる。このようにして任意の溶媒比の溶離液で行われるＴＬＣにて求められる移動度Ｒ_fと、液体クロマトグラフィの溶出時間との間に相関性があることが知られている。

このようなＴＬＣの結果と液体クロマトグラフィの分離度との相関性を利用して、液体クロマトグラフィの結果をＴＬＣの結果に基づいて事前に予測し、これによって効率よく液体クロマトグラフィを行う液体クロマトグラフィの制御装置について、本出願人は特許文献１を出願した。

特許文献１においては、移動度Ｒ_ｆと溶媒の混合比（Ｂ／Ａ）との関係について、一次関数に基づく近似的な処理が行われている。このような近似によってＴＬＣの結果から液体クロマトグラフィの結果を予測できる点で、極めて産業的に有用なものである。
更に、本発明者は、特願2015-152510において、特許文献１を更に改良し、ｌｏｇｋ‘とｌｏｇＢとの関係に基づいて液体クロマトグラフィの予測を行うことについての技術を開発した。

しかし、サンプルによっては、上述したような方法では、薄層クロマトグラフィの結果に基づいた予測が実際の液体クロマトグラフィによる結果と合致しない場合があった。このようなケースにおいては、これらの先行文献のような方法によるクロマトグラフィ方法がうまく機能せず、予測通りの結果が得られなくなってしまう。
従って、このような場合にも対応できるような、薄層クロマトグラフィの結果に基づいて液体クロマトグラフィの結果を予測する方法についての検討が求められていた。

特許第３４２３７０７号

本発明は上記に鑑み、薄層クロマトグラフィ又はカラムクロマトグラフィの結果を利用して液体クロマトグラフィの結果を幅広い溶媒混合比に対して高精度で予測することができるような方法を見出すことを目的とするものである。
すなわち、これによって、効率の良い液体クロマトグラフィを行うことができる液体クロマトグラフ方法を提供することを目的とするものである。

本発明は、２種類以上の化合物の混合物を分離するための液体クロマトグラフィ方法であって、
混合比が異なる２種以上の混合溶媒又は単独溶媒において薄層クロマトグラフィ又はカラムクロマトグラフィを行う工程（１）、
当該工程（１）の結果に基づいてサンプル中の化合物それぞれについて溶媒の混合比率と溶出度との関係式を作成する工程（２）、及び、
当該関係式に基づいて最適条件を決定して液体クロマトグラフィを行う工程（３）を有することを特徴とする液体クロマトグラフィ方法であり、
Ｒｓ＝（Ｎ ^１／２ ／４）〔（α−１）／α〕〔ｋ’／（ｋ’＋１）〕
（Ｎは、カラムの理論段数、式中、αは以下で定義される。
α＝ｋ’ _１ ／ｋ’ _２
（ｋ’ _１ ，ｋ’ _２ は、分離対象化合物１，２それぞれの保持率）
に基づいてＲｓを算出し、
Ｒｓが１．２以上となるようなαが得られる液体クロマトグラフィ条件で工程（３）を行うことを特徴とする液体クロマトグラフィ方法である。

薄層クロマトグラフィは、二次元展開型薄層クロマトグラフィであることが好ましい。

上記溶媒の混合比率と溶出度との関係は、薄層クロマトグラフィ又はカラムクロマトグラフィの結果に基づいて下記式（１）
ｌｏｇｋ’=ａｌｏｇＢ＋ｂ （１）
（ただし、式中、ｋ’は下記式（２）で算出される保持比である。
ｋ’＝（ｔ_Ｒ-ｔ_０）／ｔ_０ （２）
Ｂ：溶媒比率
ａ：溶出に使用される溶媒系によって決定される定数）
で表される溶離液の混合比又は溶離液の混合比のグラジエントパターンと溶出時間との関係式を作成するものであることが好ましい。

本発明は、混合比が異なる２種以上の混合溶媒又は単独溶媒において行った薄層クロマトグラフィ又はカラムクロマトグラフィの結果に基づいてサンプル中の化合物それぞれについて溶媒の混合比率と溶出度との関係を作成する計算式作成手段、及び
当該計算式作成手段の結果に基づいて、液体クロマトグラフィの最適条件を決定する液体クロマトグラフィ結果予測手段
を有し、
液体クロマトグラフィの最適条件は、
Ｒｓ＝（Ｎ ^１／２ ／４）〔（α−１）／α〕〔ｋ’／（ｋ’＋１）〕
（Ｎは、カラムの理論段数、
αは以下で定義される。
α＝ｋ’ _１ ／ｋ’ _２
（ｋ’ _１ ，ｋ’ _２ は、分離対象化合物１，２それぞれの保持率）
に基づいてＲｓを算出し、
Ｒｓが１．２以上となるようなαが得られる液体クロマトグラフィ条件であることを特徴とする液体クロマトグラフィ補助装置でもある。

方法１において、従来のクロマトグラフィ方法において算出した溶媒混合比と溶出度との関係を示す模式図。 方法１において、従来のクロマトグラフィ方法で、予測が困難であった場合の溶媒混合比と溶出度との関係を示す模式図。 方法１において、従来のクロマトグラフィ方法で、予測が困難であった場合の溶媒混合比と溶出度との関係を示す模式図。 図3に示した関係式が得られた場合の好適なグラジエント方法の一例を示す模式図。 図3に示した関係式が得られた場合の好適なグラジエント方法の一例を示す模式図。 方法２において、従来のクロマトグラフィ方法において算出した溶媒混合比と溶出度との関係を示す模式図。 方法２において、従来のクロマトグラフィ方法で、予測が困難であった場合の溶媒混合比と移動度Ｒ_ｆとの関係を示す模式図。 Ｒｓの技術的意義を示す模式図。 サンプル負荷量とＮの関係を示す模式図。 サンプル負荷量とＮの関係を示す模式図。 二次元クロマトグラフィの方法を示す模式図。 薄層クロマトグラフィの一般的な方法を示す模式図。 本発明を実施するために適用することができる液体クロマトグラフ装置を示す模式図。 液体クロマトグラフ装置の画像表示の一例を示す図。 液体クロマトグラフ装置の画像表示の一例を示す図。 実施例において、方法（２）に基づいて作成した関係を示す図。 実施例の方法（２）において、Ｂとαとの関係を示す図。 実施例の方法（２）において、ＢとＲｓとの関係を示す図。 実施例において、方法（１）に基づいて作成した関係を示す図。 実施例の方法（１）において、ｌｎＢとｌｎαとの関係を示す図。

以下に、本発明を詳細に説明する。
例えば、上述した特許文献１及び特願２０１５―１５２５１０に記載した発明においては、薄層クロマトグラフィの結果に基づいてサンプル中の化合物それぞれについて溶媒の混合比率と溶出度との関係を作成するものである。しかし、これらの発明においては、基本的に１種類の溶媒混合比率に対して薄層クロマトグラフィを行い、その結果に基づいて任意の混合比率に対応した溶出度を算出している。

すなわち、引用文献１や特願２０１５―１５２５１０の発明においては、図１に示すように、測定対象となる化学種に関わらず、溶媒の混合比と溶出度を示すグラフは、同一の傾きを有するとの前提に基づいて溶出結果の予測を行ってきた。
このような予測は多くの場合には妥当な溶出結果の予測を行うことができる。しかし、２種以上の分離対象化合物の組み合わせによっては、良好な分離ができない場合があった。

本発明者は、このように引用文献１や特願２０１５―１５２５１０の発明において良好な予測ができない場合について、その原因の検討を行った。
その結果、このような分離ができないのは、図２に示したような分離対象化合物によって微妙に傾きが相違する場合であることが明らかになった。更に、２つの直線が交差する点を有するようなサンプルの場合には、交差点付近の溶媒混合比で液体クロマトグラフィを行うと、全く分離ができなくなってしまう場合がある。

２つの直線が交差する部分を有するようなサンプルの場合、交差する溶媒混合比又はその近傍で液体クロマトグラフィを行うと、満足される程度の分離が得られない。特許文献１や特願２０１５―１５２５１０に記載した方法で１点の薄層クロマトグラフィ又はカラムクロマトグラフィの結果のみに基づいてクロマトグラフィの結果を予測すると、図２に示したような２つの直線が交差する場合が想定されていない。

本発明は、このような点を検討し、薄層クロマトグラフィ又はカラムクロマトグラフィをサンプルに対して２つの混合比の混合溶媒又は単独溶媒に対して行い、これらの２点の結果に基づいて液体クロマトグラフィの結果を予測したり、液体クロマトグラフィを実施したりするものである。

２点の混合溶媒又は単独溶媒に対して薄層クロマトグラフィ又はカラムクロマトグラフィを行う方法は特に限定されず任意の方法で行うことができる。なかでも、二次元薄層クロマトグラフィによって行うことが最も好ましい。

二次元薄層クロマトグラフィは、図１１に記載したような手法である、すなわち、正方形又は長方形の薄層板の隅にサンプリングを行い、図１１のＳＴＥＰ１において一方向への展開を行い、ＳＴＥＰ２において別方向への展開を行う。
そしてこれら２段階の展開において、それぞれ別の混合比の混合溶媒を用いて行う。これによって、簡便に混合比率が異なる２種の混合溶媒についての薄層クロマトグラフィを行うことができる。

図１１の（Ａ）に示したような結果の場合は、最初の展開でＲ_ｆ値が大きかったサンプルが二回目の展開でもより大きいＲ_ｆ値を有することとなる。この場合は、２回のＴＬＣを行った際の２種の溶媒の混合比の間で交点は生じない。
しかし、図１１の（Ｂ）に示した結果の場合、最初の展開でＲｆ値が大きかったサンプルが二回目の展開ではより小さいＲ_ｆ値を有することとなる。このような場合に、溶媒の混合比と溶出度との関係を示すと、図２のように、２回のＴＬＣを行った際の２種の溶媒の混合比の間で二つのグラフの交点がある。このような場合、交点近傍ではサンプルの分離を行うことができない。

本発明においては、カラムクロマトグラフィによって、溶媒混合比と分離度の関係を明らかにすることもできる。ここでのカラムクロマトグラフィは、固定相を充填した通常のカラムを使用して、溶出時間を測定することによって行うことができる。

以上の観点から、２種の混合溶媒についての薄層クロマトグラフィ又はカラムクロマトグラフィを行い、これらをプロットすることで溶媒の混合比と分離度との関係を明確にし、分離対象化合物のそれぞれの関係を明確にすることで、液体クロマトグラフィの適正な条件を知ることができる。

例えば、図２に示したような関係の場合は、２つの直線が交差するＢ_０付近では、分離能が悪くなる。本発明の方法で関係式を作成した場合は、このような図２の場合にも対応することができる。すなわち、図２のグラフから、このＢ_０の値から離れた溶媒混合比での液体クロマトグラフィを行うことが望ましいと明らかになる。更に、図２に示した特定の溶媒混合比に対応するΔに基づいて分離度を評価することもできる。

これによって、従来よりも液体クロマトグラフィの良好な予測を行うことができ、液体クロマトグラフィにおける分離を効率よく行うことができる。

なお、上記薄層クロマトグラフィ又はカラムクロマトグラフィにおいては、固定相としては、実際の液体クロマトグラフィに使用されるカラムの充填剤と同一のものを使用することが望ましい。

本発明における発明を実施する場合、溶媒の混合比と分離度との関係は、公知の任意の方法を使用することができるが、なかでも、特願２０１５―１５２５１０に記載した方法における関係式（方法１）又は上記特許文献１に記載した関係式(方法２)のいずれかであることが好ましい。これらの関係式は、液体クロマトグラフィを行う上で、重要になる式であり、これに上述したような本発明の方法を適用することで、従来以上に液体クロマトグラフィの予測精度が向上する。
以下、これらの方法についてそれぞれ説明する。

（方法１について）
特願2015-152510は、液体クロマトグラフィについて、溶媒の混合比と溶出時間との関係について
ｌｏｇｋ’=ａｌｏｇＢ＋ｂ （１）
（ただし、
保持比：ｋ’＝（ｔ_Ｒ-ｔ_０）／ｔ_０ （２）
溶媒比率：Ｂ
溶出に使用される溶媒系によって決定される定数：ａ）
との関係式が成立することを開示している。

特願2015-152510においては、化合物にかかわらず溶媒系が同一であればａは同一になるとの前提で計算を行っているが、本発明においては、化合物によるａの変化も考慮して計算を行う。この場合の具体的な方法について、以下に説明する。

以下に、当該一般式に対して本発明を適用するための具体的な方法について、更に詳細な説明を行う。
当該方法１においては、以下の式（２）
ｋ’＝（ｔ_Ｒ-ｔ_０）／ｔ_０ （２）
によって保持比ｋ’を定義する。
ここで、ｔ_０は溶出溶媒が特定のカラム中を通過するのに必要とされる時間又は非保持サンプルがカラム中を通過するのに必要な時間であり、カラムのサイズ、形状等によって決定されるカラム固有の値である。
ｔ_Ｒは、対象となるサンプルが特定のカラム（上記ｔ_０と同一のカラムである）中を通過するのに必要とされる溶出時間である。ｔ_０はカラム固有の定数であるから、このｋ’によってカラムの長さによらないサンプルの保持力を表すことができる。さらに、ｋ’が明らかになれば、これに基づいてｔ_０が明らかになっているカラムを使用した場合の溶出時間ｔ_Ｒを求めることもできる。

式（１）において、Ｂは、溶媒の混合比であり、例えば、Ｘ，Ｙの２種の溶剤の混合系での液体クロマトグラフィを行う場合、いずれか一方の溶媒の割合を示す値である。当該混合比は、モル分率（ｍｏｌ％）、体積比（ｖｏｌ％）、重量比（ｗｔ％）等のいずれであっても、一定の相関性を示すため、これらのうち、任意のものを使用することができる。

なお、数学的な理論からみて、対数の底がいかなる値であっても、同様の関係が成立するものであることから、本発明の実施において、対数の底は任意のものであってよく、特に限定されるものでない。

本発明においては、化合物毎に上述した一般式で示された式（１）におけるａ，ｂを２つの混合溶媒比に対して薄層クロマトグラフィ又はカラムクロマトグラフィを行うことによって求める。

すなわち、上述した式（１）は、薄層クロマトグラフィのＲ_ｆ値に基づいて算出してもよいし、カラムクロマトグラフィによってｔ_Ｒを測定することによって行ってもよい。カラムクロマトグラフィを行う場合は、その測定結果から直接的にｋ’を算出することができるが、薄層クロマトグラフィの測定結果はＲ_ｆ値として得られるものであるから、これをｋ’に変換する必要がある。

以下、Ｒ_ｆ値とｋ’との関係を説明する。
一般に、薄層クロマトグラフィのＲ_ｆと液体クロマトグラフィにおけるｔ_０とｔ_Ｒの間には、
ｔ_Ｒ＝ｔ_０／Ｒ_ｆ
の関係が成立することが知られている。
このため、Ｒ_ｆを測定すれば、これによって、ｔ_０とｔ_Ｒとの関係が明らかとなり、これを一般式（２）に代入することで、上記一般式のｋ’が求められる。

具体的には、
ｋ’＝（１／Ｒ_ｆ）−１
である。
上記した方法に基づいて、化合物について２点の測定を行った薄層クロマトグラフィ又はカラムクロマトグラフィについての保持比ｋ’、溶媒比率Ｂにより、上記ａ、ｂを化合物毎に算出することができる。これによって、上記各化合物に対して式（１）を容易に得ることができる。

（分離度Ｒｓについて）
このようにして算出された各化合物に対応した上記式（１）を用いることで、特定の液体クロマトグラフィ方法によって、サンプル中に含まれる化合物がどの程度良好に分離できるかの指標として、以下の分離度Ｒｓを算出することができる。すなわち、このＲｓは、特定の液体クロマトグラフィ方法によって２つのサンプルがどの程度良好に分離されるかを示す指標であり、この分離度Ｒｓを算出することで、良好な分離を行えるような分離方法であるか否かを確認できる。よって、これを液体クロマトグラフィ方法の評価の指標とすることができる。このような方法による評価の具体的な算出方法を以下に示す。

化合物１、化合物２が含まれるサンプルについて、薄層クロマトグラフィ又はカラムクロマトグラフィの結果から
ｌｎｋ’_１=ａ_１ｌｎＢ＋ｂ_１ （１−１；化合物１についての関係式）
ｌｎｋ’_２=ａ_２ｌｎＢ＋ｂ_２ （１−２；化合物２についての関係式）
を求めることができる。よって、図１、図２で示されるその差Δに基づいて、
Δ＝ｌｎｋ’_１−ｌｎｋ’_２
＝ｌｎｋ’_１／ｋ’_２
＝ｌｎα
として、αが求められる。

このα＝ｋ’_１／ｋ’_２は、選択性因子と言われるもので、特定の充填剤、溶媒系において２成分が分離される程度〔能力〕を表す値である。全く分離されない場合は、
ｋ’_１＝ｋ’_２
となり、α＝１、Δ＝０となる。
通常は、化合物１の式と化合物２の式においては、同一の充填剤、溶媒系においてはａ_１＝ａ_２であるため2成分は等しい傾きを持ち、αはｂ_１とｂ_２の差のみで決定される値であるが、本発明の場合は、これをより広い範囲に拡張できるよう、ａ_１及びａ_２をそれぞれ、薄層クロマトグラフィ又はカラムクロマトグラフィの結果に基づいて算出する。

当該αは、
ｌｎα＝ｌｎｋ’_１−ｌｎｋ’_２＝（ａ_１−ａ_２）ｌｎＢ＋（ｂ_１−ｂ_２）
α＝ｅｘｐ〔（ａ_１−ａ_２）ｌｎＢ＋（ｂ_１−ｂ_２）〕
となることから、各化合物についての上記関係式に基づいて算出することができる。

更に、分離度Ｒｓとして、下記式（３）
Ｒｓ＝（Ｎ^１／２／４）〔（α−１）／α〕〔ｋ’／（ｋ’＋１）〕 （３）
によって、評価を行うことができる。
ここで、Ｎはカラムの理論段数を示し、αは上述した値である。更に、ｋ’は、化合物１、２のいずれのものか、これらの平均値であることが好ましい。

このようにして算出されたＲｓは、特定のカラムを使用して、特定の混合溶媒を使用した場合にどの程度良好に２つのサンプルを分離できるかを示す指標となる。よって、この分離度に基づいて、適正な液体クロマトグラフィ条件を探索することができる。
また、上述した式に基づいて各サンプルについての溶出時間ｔ_ｒ１、ｔ_ｒ２を求めることができる。これによって、溶出時間、分離度の両面から液体クロマトグラフィ条件を評価することができ、実際の液体クロマトグラフィ操作よりも前に最適な液体クロマトグラフィ条件を知ることができる。

さらに、Ｒｓの技術的意義をより明確にするため、図８を参照する。
図８においては、具体的なＲｓの値とサンプルの分離状態を表す模式図を示した。
すなわち、Ｒｓ＝０．８の場合は、溶出曲線において、先に溶出するサンプルの溶出が完全に終了しないうちに次のサンプルが溶出し始める。このため、取得したフラクションのうち溶出曲線が重なった部分においては、両方の化合物が含まれるフラクションが生じ、完全な分離がなされない。

図８において、Ｒｓの値が大きくなるにつれて分離度は向上し、Ｒｓ＝１．２の場合には２つのサンプルの溶出曲線の重なり合う部分は存在せず、これによって良好な分離が図られる。よって、上述したＲｓを算出することで、分離精度を予測することができる。特に、上記式（３）においては、カラムの理論段数Ｎが式中に含まれている。よって、カラム選択に際して、どの程度の理論段数Ｎとすれば、目標とするＲｓ値を達成することができ、良好に分離できるかを知ることができる。

更に、サンプル負荷量と使用カラムとの関係についても判断を行うことができ、分離するサンプルの負荷量に対応できる使用カラムの選択も行うことができる。カラムの理論段数Ｎとサンプルの負荷量ｇとの間には、図９の関係がある。図９に示したグラフは、特定のカラムの特性を示すものであり、特定の理論段数Ｎに対して特定のカラムにおいて適応可能な負荷量の最大値を示すものである。この関係を利用すれば、カラムにチャージ可能なサンプル負荷量がわかる（特許No.4680761)。

一般にサンプルの負荷量が大きいほど、完全な分離を行うためには大きなサイズのカラムを使用する必要が生じる。そして、この負荷量は、理論段数Ｎとの関係を有するものである。よって、特定の分離において、目標とする分離度Ｒｓを達成するためのＮが明らかになれば、このＮに対応可能となる負荷量をカラム毎に明らかにすることができる。これによって、目的とする負荷量に対応したカラム選択を行うことができるものである。

以下に、このような手法について、更に詳細に説明する。
上述したように、Ｒｓは、１．２５程度の値があれば、十分な分離を図ることができる。そして、上記式（３）を用いれば、Ｒｓが１．２５となる場合のＮの値が明らかとなる。そして、このＮに対応した負荷量が図９の関係からさらに明らかになる。
例えば、図１０には、大きいカラムと小さいカラムの2種類のカラムについて、その特性グラフを示した。この関係から、それぞれのカラムを使用した場合にＲｓ１．２５となる分離精度で分離することができるような負荷量が明らかとなる。よって、分離を行うべきサンプル量が明らかとなっていれば、分離を行う際のカラム選択が容易となる。更に、特定のカラムを使用した場合の分離可能な負荷量も明らかにすることができる。

（方法１においてグラジエントを行う場合）
液体クロマトグラフィにおいては、グラジエント（すなわち、時間とともに溶媒の混合比を変化させること）を行いながら分離作業を行う場合がある。本発明の方法は、このようなグラジエントを行う場合にも対応可能である。

すなわち、化合物１，２についての
ｌｎｋ’_１=ａ_１ｌｎＢ＋ｂ_１ （１−１；化合物１についての関係式）
ｌｎｋ’_２=ａ_２ｌｎＢ＋ｂ_２ （１−２；化合物２についての関係式）
の関係が明らかになっていれば、これらの関係式に基づいて、グラジエントの具体的な方法、グラジエントを行った場合の溶出時間を算出することで、クロマトグラフィを行うことができる。

以下、図３に基づいて、グラジエントを行う場合について説明する。
図３の場合、Ｂ＝Ｂ０となる溶媒混合比において、２つのグラフは交差する。
その場合は、交差する溶媒混合比Ｂの近傍を避けるようにしてグラジエントを行うことが好ましい。すなわち、図３に示す場合は、溶媒混合比がＢ１〜Ｂ２の範囲内でのグラジエトとなるよう、溶媒混合比を選択してグラジエントを行うことが好ましい。より具体的には、より二つのグラフが離れている、Ｂ１の溶媒混合比を起点として、Ｂ２までのグラジエントを行い、Ｂ０またはその近傍の地点を通過しないようなグラジエントパターンを選択することが好ましい。

このような場合に好適なグラジエントパターンとしては、例えば、図４、図５に示したようなものがあげられる。これらは、いずれも溶媒の混合比を変化させているものであるが、２つのグラフが重なるＢ０の付近を通らず、ある程度の分離が期待できる溶媒混合比であるＢ１，Ｂ２の範囲内で溶媒混合比を変化させている。

更に、上述した式（１−１）、（１−２）中のＢをグラジエント方法に対応した時間の関数、
Ｂ＝Ｂ（ｔ）
と置き換えて、これを時間で積分することで、グラジエントを行った場合のサンプルごとの溶出時間を知ることができ、これによってなお一層正確な液体クロマトグラフィの結果を予測することができる。

また、このような方法が有効となるのは、２つの化合物についての直線が交差する場合に限らない。交差しない場合でも、傾きの相違が大きい場合は、できるだけ２つの直線が離れた状態となる溶媒混合比を選択し、それに基づいてグラジエント方法を選択することが好ましい。

（ＴＬＣと液体クロマトグラフィの差異の補正）
上述したＴＬＣによって得られた上記一般式（１）と、液体クロマトグラフィにおけるｋ’_ＴとＢ_Ｔとの関係式とは完全には一致しない場合がある。
このため、本発明者らは、このような相違を補正する手段についても、検討を行った。

上述したように、ＴＬＣによって予測した上記関係式（１）のずれが生じている場合、その絶対的な値の補正も重要であるが、二つのグラフの交点Ｂ０が存在する場合は、このＢ０の値のずれについても検討を行うことが重要となる。

このようなＴＬＣと液体クロマトグラフィとの間にずれが生じる場合も、多くの場合は、そのずれは化合物による差はそれほど大きくなく、同程度のずれを生じると推測することができる。このため、ずれの程度が同一であるなら、Ｂ０は、ＴＬＣと液体クロマトグラフィとの間で相違しないものとなる。このため、ＴＬＣの結果に基づいて算出されたＢ０に基づいて液体クロマトグラフィ条件を算出することで、良好な結果を得ることができる。

（方法２について）
次いで、特許文献１に示されたような予想方法について、本発明の方法を適用する場合について、説明する。

特許文献１においては、Ｒ_ｆ値と混合溶媒中のＢのｍｏｌ％との関係式によって、液体クロマトグラフィの結果を予測することが行われている。ここでは、下記式（４）
Ｒ_ｆ＝ａＢ＋ｂ （４）
の関係を２点の薄層クロマトグラフィに基づいて得ることができる。
このような方法に対しても、本発明のように溶媒混合比が異なる２つの薄層クロマトグラフィ又はカラムクロマトグラフィの結果を適用して、液体クロマトグラフィの予測を行うこともできる。

この場合も、化合物１、化合物２が含まれるサンプルについて、薄層クロマトグラフィ又はカラムクロマトグラフィの結果から
Ｒ_ｆ１＝ａ_１Ｂ＋ｂ_１ （４−１；化合物１についての関係式）
Ｒ_ｆ２＝ａ_２Ｂ＋ｂ_２ （４−２；化合物２についての関係式）
の２つの関係式を求めることができ、
α＝（ｋ’_１／ｋ’_２）
＝〔Ｒ_ｆ１（１−Ｒ_ｆ２）〕／〔Ｒ_ｆ２（１−Ｒ_ｆ１）〕
として、αを求めることができる。当該αを用いて、上記式（３）を利用して、Ｒｓを算出することができる。
更に、各成分の溶出時間ｔ_ｒ１、ｔ_ｒ２を求めることもできる。更に、分離度Ｒｓに基づいてＮの算出を行い、使用するカラムの選択を行うこともできる。
そして、これらの結果に基づいて上記方法１と同様に、液体クロマトグラフィ方法の評価を行うことができる。

（方法２においてグラジエントを行う場合）
方法２において本発明を適用する場合に、溶媒の混合比においてグラジエントを行う場合も、本質的には上記方法１の場合と同一である。すなわち、各成分について、上述した関係式を作成し、得られた関係式において２つの直線が交差する場合は、その交差する溶媒混合比Ｂ０から離れており、ある程度Ｒ_ｆの値が遠くなるところでグラジエントを行うことが望まれる。さらに、グラジエントを行った場合の溶出時間を算出するには、溶媒混合比の時間に関する関係式を作成し、これを時間積分することで、Ｒ_ｆ値を求めることができ、これに基づいて液体クロマトグラフィを行った場合の溶出時間を得ることができる。

（液体クロマトグラフィ装置の構成について）
本発明は、上述した計算式を用いて、効率よく液体クロマトグラフィを行うものである。このような理論を実際に液体クロマトグラフィに適用するに際しては、液体クロマトグラフィの補助装置、液体クロマトグラフの制御装置、液体クロマトグラフィの実行方法及び液体クロマトグラフの制御プログラム等の装置の形態としてもよい。
すなわち、薄層クロマトグラフィ又はカラムクロマトグラフィの結果に基づいて、上述したような計算を自動で行い、作業者に対して液体クロマトグラフィ方法についての情報を提示するような、液体クロマトグラフィ補助装置を用いて行うものであってもよい。このような、液体クロマトグラフィの補助装置は、薄層クロマトグラフィ又はカラムクロマトグラフィの結果に基づいて上述した方法によって、サンプル中の化合物それぞれについて溶媒の混合比率と溶出度との関係を作成する計算式作成手段、当該計算式作成手段の結果に基づいて、クロマトグラフィの最適条件を決定する液体クロマトグラフィ結果予測手段を有するものである。

また、そのほかに、実測値記憶手段、計算式作成手段、液体クロマトグラフィ結果予測手段、液体クロマトグラフィ条件決定手段、混合比制御手段を備えた液体クロマトグラフィ装置としてもよい。
以下に、これらの各手段について詳述する。

（実測値記憶手段）
上記実測値記憶手段は、上述した工程（１）による薄層クロマトグラフィ又はカラムクロマトグラフィの結果を記憶する手段である。

図１２において、薄層クロマトグラフィ（ＴＬＣ）の模式図を示す。
ＴＬＣでは、まず、図１２（ａ）に示すように、試料３が垂らされた状態のシリカゲル薄層２が、に溶離液４中に浸漬される。すると、毛管現象により混合溶液４がシリカゲル薄層２に吸い上げられてゆく。これに伴い、試料３も上方に移動する。溶離液４及び試料３の移動が終了すると、図１２（ｂ）に示すように、試料３は試料３´の位置に移動する。このとき、試料３の混合溶液４中に浸漬される前の位置から、溶離液４の上端までの距離を１．０として、その１．０に対する試料３´までの距離が移動度Ｒ_fとして求められる。

二次元薄層クロマトグラフィを行う場合は、図１１に示したように、最初に一方向への展開を行った後、もう一方の方向への展開を行う。Ｒ_ｆ値は同様に算出することができる。二次元薄層クロマトグラフィによってＴＬＣを行うと、簡便な操作で２回の測定を行えること、各スポットの対応関係が明確であることから、好ましいものである。更に、図２に示したように、直線同士が交差する場合は、図１１（Ｂ）のような状態となることから、交差するか否かが直ちに明らかとなる点でも好ましい。

この場合、測定後の薄層板から作業者がＲ_ｆ値を読み取り、その値を数値として入力するものであってもよいし、薄層クトマログラフィ板を装置の所定の位置に載置させ、画像解析に基づいてＲ_ｆ値を自動で読み取るものであってもよい。スポットの解析においては、必要に応じて紫外線等の検出光を当てて、これによる発光を利用してスポット位置を読み取る方法等を採用することができる。

実測値記憶手段は、上記薄層クロマトグラフィによって得られたＲ_ｆ値を、溶媒の混合比Ｂと関連付けて記憶する手段である。このようにして記憶した値を以下の計算式作成手段における計算式の作成に利用する。

上述した薄層クロマトグラフィに変えて、カラムクロマトグラフィによってｔ_Ｒを測定し、ｋ’を算出するものであってもよい。この場合、通常のカラムを使用したカラムクロマトグラフィを異なる溶媒混合比において行い、そのカラムにおける目的サンプルの溶出時間ｔ_Ｒを測定する。そして、カラム固有の値であるｔ_０を用いて、上記式（２）に基づいてｋ’を求め、このような値を上記実測値記憶手段において記憶するものであってもよい。

（計算式作成手段）
本発明における計算式作成手段は、上述した薄層クロマトグラフィ又はカラムクロマトグラフィの結果に基づいて、特定の成分についての特定の溶媒系に対する一般式（１）を作成する手段である。

上述した計算式作成手段は、更に、薄層クロマトグラフィと液体クロマトグラフィとの数式の差に考慮して、上述した方法で得られた数式に上述した修正を加えるものであってもよい。更に、この計算に際して必要な数値を計算式作成手段中に保存するものであってもよい。また、一般式（３）も作成し、分離度の評価、カラム選択を容易に行えるようにしてもよい。

（液体クロマトグラフィ結果予測手段）
分離が必要なすべてのサンプルについて一般式（１）が決定されると、溶離液の混合比及び使用するカラムに対応した溶出時間が予測できる状況ができあがる。また、例えば、図２に示したようなグラフが作成されれば、これに基づいて作業者は良好な混合溶媒比を容易に推測することができる。更に、具体的な液体クロマトグラフィ条件を入力すると、これに応じた溶出時間を提示することもできる。更に、上述した分離度Ｒｓを表示するものとすることもできる。作業者は、これらの情報を見ることによって、複数種の液体クロマトグラフィ条件の良否を容易に判断することができる。これによって、容易に最適な液体クロマトグラフィ条件（溶媒混合比、使用するカラム等）を実験前に選択することができることとなる。

このような液体クロマトグラフィ結果予測手段は、上述した計算式を作業者に提供するものである。更には、上述した計算式に基づいて液体クロマトグラフィの結果を予測し、予測された結果を作業者が一目で条件の適否を判断することができるように、表示手段上に表示するものであることが好ましい。

このような液体クロマトグラフィ結果予測の作成、通常のコンピュータによって行うことができ、結果の表示は液晶ディスプレイに代表される一般的な表示装置上に行うことができる。

このような液体クロマトグラフィ結果予測の提示としては、例えば、図１４、図１５に示したように、具体的な数値として、溶出時間及び分離度を画像に示すものであってもよいし、図８に示したような溶出曲線を表示するものであってもよい。
そして、幾つかの測定条件に対応したこれらの値を比較することで、作業者は最適な液体クロマトグラフィ方法を知ることができる。

なお、クロマトグラフィ条件の決定においては、カラムの選定も重要な要素となる。上述したように、カラム選定においては、サンプル負荷量も重要な要素となる。すなわち、分離するサンプルの量が多ければ、より大きなカラムが必要となる。このような目的のために必要な情報を画像に示すものであってもよい。

すなわち、図９，１０に示したようなＮと負荷量との関係についても、必要に応じて画像として表示し、作業者がカラムを選択する場合の助けとしてもよい。図８、１４，１５に示したような情報を提供するには、Ｎの値を決定することが必要であり、このＮを決定するには、図９，１０に示したような使用カラムにおけるＮと負荷量との関係を知ることが重要となる。よって、液体クロマトグラフィ結果予測を得るための手段は、これらの情報を総合的に有するものであることが好ましい。

（クロマトグラフィ条件決定手段）
本発明は、このようにして、液体クロマトグラフィ結果予測手段を利用しながら作業者は自らが作成した又は装置によって推奨された液体クロマトグラフィ条件の評価を行い、最終的に液体クロマトグラフィ条件を決定するものである。

（混合比制御手段）
本発明は、上述した液体クロマトグラフィ条件決定手段による決定に基づいて、液体クロマトグラフィが行われるものであってもよい。混合比制御手段は、前記液体クロマトグラフィ条件決定手段に基づいて作業者によって選択された液体クロマトグラフィ条件に基づいて、カラムに送液される前記溶離液の混合比又は溶離液の混合比のグラジエントパターンを制御する制御信号を出力するための手段である。なお、当該混合比制御手段は、公知のものを使用することができ、例えば、特許文献１に開示されたようなものを使用することができる。

（液体クロマトグラフの制御装置）
以下、図に基づいて本発明の液体クロマトグラフの制御装置の態様の一例を更に詳細に説明する。なお、本発明は以下に示す図面に記載されたものに限定されるものではない。
本発明は、必要な要素を備えた液体クロマトグラフィ装置及びこれを制御するコンピュータによって、上述したような各手段によって液体クロマトグラフィを制御する制御装置に関するものであってもよい。
上述したような手法を実際の装置として運用する上での態様の一例について、以下詳述する

図１３において、液体クロマトグラフ装置１１を示す。液体クロマトグラフ装置１１は、溶媒Ａが貯留された容器１２と、溶媒Ｂが貯留された容器１３と、溶媒Ａと溶媒Ｂとが連結された位置に設けられた電磁弁１４と、溶離液４が貯留される混合器１５と、ポンプ１６と、インジェクター１７と、カラム１８と、検出器１９と、フラクションコレクター２０とが、この順に配置され経路が形成されている。そして、電磁弁１４に液体クロマトグラフ制御装置２１が接続されている。

容器１２には溶媒Ａが、容器１３には溶媒Ｂが貯留されている。尚、用いられる溶媒は２種類に限定されず、使用状態・目的に応じて数を増やしてもよい。一般に、溶媒Ａ・溶媒Ｂには、非極性分子と極性分子との組合せで用いられる。

ポンプ１６は、液体クロマトグラフ装置１１の回路において、容器１５・電磁弁１４を介して溶媒Ａ・溶媒Ｂを汲み上げる。電磁弁１４は、液体クロマトグラフ制御装置２１からの制御信号により、汲み上げられる溶媒を溶媒Ａ又は溶媒Ｂから選択する。電磁弁１４での各溶媒の選択時間に応じて混合器１５内での溶媒Ａ、Ｂの混合比が決定される。混合器１５は、汲み上げられた溶媒Ａ及び溶媒Ｂが一旦貯留され、溶離液１０とされる。この溶離液１０は、後述するように、算出された混合比を有するものである。

インジェクター１７は、試料３を有しており、溶離液１０が通過することで試料３が送出されるようになっている。尚、インジェクター１７は１本に限定されず、選択的に経路を選ぶことができる並設された複数のインジェクターとし、複数の試料について連続的に作業を行うことも可能である。

カラム１８には固定相が充填されており、混合溶媒１０が通過することで液体クロマトグラフが行われる。この固定相としては、図１２におけるシリカゲル薄層板２を形成するシリカゲルが用いられている。尚、カラムは１本に限定されず、選択的に経路を選ぶことができる並設された複数のカラムとし、複数種類の液体クロマトグラフィを行うことも可能である。

検知器１９は、カラム１８にて行われる液体クロマトグラフの結果の検出を行う。そして、フラクションコレクター２０は、複数の試験管を有しており、検知器１９の分析結果により、試料３に含まれる成分毎に各試験管に分取されるようになっている。

上記液体クロマトグラフィ制御装置は、図１３に示したような液体クロマトグラフィを制御するための装置であり、上述したような実測値記憶手段、計算式作成手段、液体クロマトグラフィ結果予測手段、液体クロマトグラフィ条件決定手段、混合比制御手段を内部ハードディスクに有するコンピュータであるか、これらの手段を行うために必要な情報が保管されたサーバーに接続するクライアントコンピュータであることが好ましい。

これによって、上述したような計算を行い、液体クロマトグラフィを制御することによって、良好な液体クロマトグラフィを行うものである。

（液体クロマトグラフィの実行方法）
上述したような実測値記憶手段、計算式作成手段、液体クロマトグラフィ結果予測手段、液体クロマトグラフィ条件決定手段、混合比制御手段を用いて、液体クロマトグラフィを実行することができる。

このような液体クロマトグラフィの実行方法は、実測値記憶手段、計算式作成手段、液体クロマトグラフィ結果予測手段、液体クロマトグラフィ条件決定手段、混合比制御手段を備えた液体クロマトグラフの制御装置を用いて、液体クロマトグラフィを実行する方法であり、このような液体クロマトグラフィの制御装置を使用して、各手段の機能を利用することで液体クロマトグラフィを行う方法である。

（液体クロマトグラフの制御プログラム）
本発明は、上述したような実測値記憶手段、計算式作成手段、液体クロマトグラフィ結果予測手段、液体クロマトグラフィ条件決定手段、混合比制御手段を有し、これらによってコンピュータを機能させるための液体クロマトグラフィの制御プログラムでもある。

すなわち、上述したような実測値記憶手段、計算式作成手段、液体クロマトグラフィ結果予測手段、液体クロマトグラフィ条件決定手段、混合比制御手段の各手段は、通常、コンピュータによって実行されるものである。本発明は、これらをコンピュータによって実行するための制御プログラムでもある。

以下、実施例によって本発明をさらに詳細に説明する。

（実施例１；特許文献１の関係式による検討）
カフェインとカイネチンの薄層クロマトグラフィを酢酸エチル：メタノールの混合比（体積比）９５：５および８０：２０で行った。カフェインはそれぞれ０．２７、０．４６、カイネチンは０．２３、０．５４とＲ_ｆ値が得られた。この２サンプルのＲ_ｆ値を縦軸に、溶出力のより強いメタノールの比率（＝Ｂ％）を横軸にしたグラフにプロットした。結果を図１６に示す。

この２成分においてカイネチンの保持比を変化させたときの分離係数αおよび分離度Ｒｓを図１６中の計算式に基づいて算出した。結果を表１に示す。更に、溶媒混合比Ｂとαの関係を図１７に示し、ＢとＲｓとの関係を図１８に示した。
Ｒｓ は式（３）より（カラム効率の指標である理論段数Ｎを１００として）算出した。）
２成分の交差する点Ｂ０=1０% でα＝１すなわちＲｓ=0となり、２成分が同時に溶出される（＝分離しない）Ｂ% を読み取ることができる。

従来一様に保持比k’=3を溶出位置のねらいとしてきたが、これは分離度と溶出位置（クロマトグラフィの実施にかかる時間あるいは消費溶媒量と言い換えても良い）の関係がバランス良く、満足される分離度が比較的短い時間、少ない消費溶媒量で達成されるので十分根拠のあることであった。

しかし本実施例にあるようにＲ_ｆ値とＢ%の関係が化合物毎に相違している場合、ｋ’＝３の溶出位置でαが２成分の分離に十分高くないこのような場合では保持比を低く設定した溶出条件、たとえばｋ’=４〜５、あるいはそれよりも大きく保持を取ってクロマトグラフィを行うことでより高い分離度を達成できる。ただしこの保持比を長めに設定するときでもｋ’＝６程度を上回ればサンプルの溶出は通常予測されるよりも著しく遅れ長時間を要し溶媒量も多く、また溶出されないこともありうるので設定にはｋ’=６程度の上限を設けておくことが望ましい。

同時に表１のαから、式（３）にもとづいて、特定の溶媒混合比に対応した各ｋ’（Ｂ%）におけるＲｓ=１．２５（一般にベースライン分離と認められる値である）を達成する必要理論段数Ｎがわかる。更に、カラムの理論段数Ｎとサンプルの負荷量ｇとの間の図９，１０の関係を参照すれば、カラムにチャージ可能なサンプル負荷量がわかる。

すなわち、特定のカラムを使用した場合の各Ｂ% において分離できる負荷量がわかる。表１中のＲｓにおいては、ベースライン分離１．２５は達成されていない。しかし、サンプル負荷量を減らしていき、分離に必要なＮを十分にとれるサンプル量でクロマトグラフィを行えば目的の分離度を得ることができる。サイズの大きなカラムは理論段数Ｎとサンプルの負荷量ｇの線形関係がより高いところにあるので（図１０）、ある決まった量のサンプルの分離を試みるとき適切なカラムサイズを選択することも容易に行える。

酢酸エチル：メタノールの混合比９５：５で薄層クロマトグラフィを行うと２成分は分離しており、また８０：２０で行っても分離しているが２成分の交差する点９０：１０のアイソクラッティック溶出や９０：１０の比率を含むグラジエント溶出をカラムクロマトグラフィに適用すると予測される分離は得られなかった。

（実施例２；特願2015-152510の関係式による検討）
上記横軸Ｂ％をＢｍｏｌ％に換算しその自然対数をとった値を横軸に、縦軸Ｒ_ｆ値を式（２）よりｋ’に換算しその自然対数をとった値を縦軸にプロットし直線で結んでそれらの直線の一次式とともに描いた。結果を図１９に示す。
図１９を利用した場合も分離に不利になる溶媒比率がわかりこの比率を避けたカラムクロマトグラフィを行うことでより高い分離度が達成される。
この２成分においてカイネチンの保持比を変化させたときの分離係数αは表２になる。

従来、一様に保持比ｋ’＝３を溶出位置のねらいとしてきたが、これは分離度と溶出位置（クロマトグラフィの実施にかかる時間あるいは消費溶媒量と言い換えても良い）の関係がバランス良く、満足される分離度が比較的短い時間、少ない消費溶媒量で達成されるので十分根拠のあることであった。しかしこの例にあるようにｌｎｋ’とｌｎＢｍｏｌ%の関係が一定でなければ（αが一定でない）k’=3の溶出位置では、αが２成分の分離に十分高くないこともありうる。ｋ’＝３で交差するような場合でのアイソクラティッククロマトグラフィでは分離は達成できない。このような場合では保持比を低く設定した溶出条件、たとえばｋ’＝４，５、あるいはそれよりも大きく保持を取ってクロマトグラフィを行うことでより高い分離度を達成できる。ただしこの保持比を長めに設定するときでもｋ’=６程度を上回ればサンプルの溶出は通常予測されるよりも著しく遅れ長時間を要し溶媒量も多く、また溶出されないこともありうる。よって、設定にはk’=６程度の上限を設けておくことが望ましい。

また式（３）から各Ｂｍｏｌ%のときの分離度Ｒｓ（カラム効率の指標である理論段数Ｎを100として）が算出されたので、その結果も表２に示した。この分離度ＲｓとＢｍｏｌ%の関係は図２０となり、２成分の交差する点Ｂ０=１８．２% でＲｓ=０となり、２成分が同時に溶出される（＝分離しない）Ｂｍｏｌ% を読み取ることができる。

式（３）において各ｋ’（Ｂｍｏｌ%) における一般にベースライン分離と認められるＲｓ=1.25を達成する必要理論段数Ｎがわかる。カラムの理論段数Ｎとサンプルの負荷量ｇとの間には図９，１０の関係がある。個々の大きさのカラムについて図９，１０の関係のデータを用いれば、カラムにチャージ可能なサンプル負荷量がわかる。すなわち各Ｂｍｏｌ% において分離できる負荷量がわかる。例として挙げた表２の分離度はＢｍｏｌ%（ｋ’）をどう変化させて、ベースライン分離１．２５は達成されていないが、図９の関係からサンプル負荷量を減らしていき、分離に必要なＮを十分にとれるサンプル量でクロマトグラフィを行えば目的の分離度は達成できる。サイズの大きなカラムは理論段数Ｎとサンプルの負荷量ｇの線形関係がより高いところにあるので（図１０）、ある決まった量のサンプルの分離を試みるとき適切なカラムサイズを選択することも容易に行える。

上記の例は２成分が交差するものを挙げたが、交差せずともＬｎαとＬｎＢｍｏｌ％の関係において２線が平行（同じ傾きを持つ）でなければαは一定ではないので分離に有利な溶媒比率と保持比ｋ’(溶出位置)を事前に予測し、その比率でカラムクロマトグラフィを行うことでより高い分離度を達成することが可能となる。

本発明の液体クロマトグラフの制御装置は、有機化学の分野における分離操作のための液体クロマトグラフィにおいて、好適に行うことができる。特に実験・研究における分離操作において、効率よく分離を行うために使用することができる。

１ ＴＬＣ装置
２ シリカゲル薄層板
３ 試料
４ 溶離液
５ 容器
６ 検出器
１１ 液体クロマトグラフ装置
１２、１３ 容器
１４ 電磁弁
１５ 混合器
１６ ポンプ
１７ インジェクター
１８ カラム
２０ フラクションコレクター

Claims (7)

1. ２種類以上の化合物の混合物を分離するための液体クロマトグラフィ方法であって、
   混合比が異なる２種以上の混合溶媒又は単独溶媒において薄層クロマトグラフィ又はカラムクロマトグラフィを行う工程（１）、
   当該工程（１）の結果に基づいてサンプル中の化合物それぞれについて溶媒の混合比率と溶出度との関係式を作成する工程（２）、及び、
   当該関係式に基づいて最適条件を決定して液体クロマトグラフィを行う工程（３）を有し、
   Ｒｓ＝（Ｎ^１／２／４）〔（α−１）／α〕〔ｋ’／（ｋ’＋１）〕
   （Ｎは、カラムの理論段数、式中、αは以下で定義される。
   α＝ｋ’_１／ｋ’_２
   （ｋ’_１，ｋ’_２は、分離対象化合物１，２それぞれの保持率）
   に基づいてＲｓを算出し、
   Ｒｓが１．２以上となるようなαが得られる液体クロマトグラフィ条件で工程（３）を行うことを特徴とする液体クロマトグラフィ方法。
2. 前記工程（３）における最適条件の決定は、工程（２）によって得られた関係式から、溶出時間及び分離度を算出することによって行う請求項１記載の液体クロマトグラフィ方法。
3. 薄層クロマトグラフィは、二次元展開型薄層クロマトグラフィである請求項１又は２記載の液体クロマトグラフィ方法。
4. 溶媒の混合比率と溶出度との関係は、薄層クロマトグラフィ又はカラムクロマトグラフィの結果に基づいて下記式（１）
   ｌｏｇｋ’=ａｌｏｇＢ＋ｂ （１）
   （ただし、式中、ｋ’は下記式（２）で算出される保持比である。
   ｋ’＝（ｔ_Ｒ-ｔ_０）／ｔ_０ （２）
   Ｂ：溶媒比率
   ａ：溶出に使用される溶媒系によって決定される定数）
   で表される溶離液の混合比又は溶離液の混合比のグラジエントパターンと溶出時間との関係式を作成するものである請求項１、２又は３記載の液体クロマトグラフィ方法。
5. ２種類以上の化合物の混合物を分離するための液体クロマトグラフィにおける情報提供方法であって、
   混合比が異なる２種以上の混合溶媒又は単独溶媒において薄層クロマトグラフィ又はカラムクロマトグラフィを行う工程（１）、
   当該工程（１）の結果に基づいてサンプル中の化合物それぞれについて溶媒の混合比率と溶出度との関係式を作成する工程（２）、及び、
   当該関係式に基づいてクロマトグラフィに関する情報を提供する工程（３）を有し、
   クロマトグラフィに関する情報は、
   Ｒｓ＝（Ｎ^１／２／４）〔（α−１）／α〕〔ｋ’／（ｋ’＋１）〕
   （Ｎは、カラムの理論段数、
   αは以下で定義される。
   α＝ｋ’_１／ｋ’_２
   （ｋ’_１，ｋ’_２は、分離対象化合物１，２それぞれの保持率）
   に基づいてＲｓを算出し、
   Ｒｓが１．２以上となるようなαが得られる液体クロマトグラフィ条件である
   ことを特徴とする情報提供方法。
6. 工程（３）は、α＝ｋ’_１／ｋ’_２で表される選択性因子αを算出し、これに基づいてクロマトグラフィの結果予測情報を提供するものである請求項５記載の情報提供方法。
7. 混合比が異なる２種以上の混合溶媒又は単独溶媒において行った薄層クロマトグラフィ又はカラムクロマトグラフィの結果に基づいてサンプル中の化合物それぞれについて溶媒の混合比率と溶出度との関係を作成する計算式作成手段、及び
   当該計算式作成手段の結果に基づいて、液体クロマトグラフィの最適条件を決定する液体クロマトグラフィ結果予測手段
   を有し、
   液体クロマトグラフィの最適条件は、
   Ｒｓ＝（Ｎ^１／２／４）〔（α−１）／α〕〔ｋ’／（ｋ’＋１）〕
   （Ｎは、カラムの理論段数、
   αは以下で定義される。
   α＝ｋ’_１／ｋ’_２
   （ｋ’_１，ｋ’_２は、分離対象化合物１，２それぞれの保持率）
   に基づいてＲｓを算出し、
   Ｒｓが１．２以上となるようなαが得られる液体クロマトグラフィ条件であることを特徴とする液体クロマトグラフィ補助装置。