WO2011079621A1 - 依替非巴肽的合成制备方法 - Google Patents

依替非巴肽的合成制备方法 Download PDF

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WO2011079621A1
WO2011079621A1 PCT/CN2010/076628 CN2010076628W WO2011079621A1 WO 2011079621 A1 WO2011079621 A1 WO 2011079621A1 CN 2010076628 W CN2010076628 W CN 2010076628W WO 2011079621 A1 WO2011079621 A1 WO 2011079621A1
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har
gly
mpr
pro
trp
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路杨
杨东晖
徐峰
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江苏诺泰制药技术有限公司
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    • C07K5/0823—Tripeptides with the first amino acid being heterocyclic, e.g. His, Pro, Trp and Pro-amino acid; Derivatives thereof
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    • Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
    • Y02P20/55—Design of synthesis routes, e.g. reducing the use of auxiliary or protecting groups

Definitions

  • the invention relates to a synthetic preparation process of eptifibatide, belonging to the field of biotechnology. Background technique
  • Coronary heart disease is the first cause of death in western developed countries. There are millions of people every year. Although the incidence rate in China is not as good as that of developed countries in the West, there are about 100 to 2 million people every year, and there is a rising trend, although modern technology can Treatment with or without bypass surgery, but the chance of getting sick again after surgery is higher, and medication is also needed.
  • Etifibatide is a highly potent platelet-polypeptide antagonist that directly blocks the binding of platelet glycoprotein receptors to ligands, allowing the heart to supply blood, alleviating or eliminating symptoms of coronary heart disease.
  • the synthesis of this product mainly contains two synthetic solutions.
  • the liquid phase synthesis method and the solid phase synthesis method are respectively, and the liquid phase synthesis method mainly comprises the following synthesis steps through the synthesis of the fragment polypeptide: 1.
  • the tripeptide fragment (Trt) Mpr-LysCTFA is synthesized by the most conventional polypeptide condensation method.
  • -Gly-Ome which is then converted to Har by a thiolation reaction, followed by saponification and acid neutralization to give CTrt)Mpr-Lys TFA)-Gly-OH.
  • the Z-Asp (otbi-OSu) is prepared by the method of activating the ester, and then reacted with the dipeptide Trp-Pro-OH to obtain a polypeptide fragment tripeptide Z-Asp(otbu)-Trp-Pro-OH.
  • the fragment was condensed to obtain a hexapeptide fragment (Trt) Mpr-Har-Gly-Asp(otbu)-Trp-Pro-OH. 4.
  • a hexapeptide fragment (Trt) Mpr-Har-Gly-Asp(otbu)-Trp-Pro-OH is condensed with Cys(Trt)-NH 2 to obtain linear peptide heptapeptide (Trt) Mpr-Har-Gly-Asp(otbu)-Trp- Pro-Cys(Trt)-NH 2 . 5, will
  • the final synthetic route is the combination of Har-Gly-Asp(otbu)-Trp-Pro-Cys(Npys) and Mpr, specifically synthesizing the hexapeptide straight chain (Har-Gly- Asp(otbu)-Trp-Pro-Cys(Npys)-NH 2 ), then synthesizing the sulfur bridge to obtain Har-Gly-Asp(otbu)-Trp-Pro-Cys(NH2)-SS-Mpr, The amide bond is then synthesized and the protecting group is finally removed to give the final product.
  • the caspase protection peptide (acm) Mpr-lys-Gly-Asp-Trp is obtained by cutting the resin
  • the solid phase synthesis method is also reported in the world patent WO2006045483A2, but he uses a method of combining the rings on the resin.
  • Fm 0C -Cy S (tb U )-Sieb er as a starting material, the peptide is obtained by solid phase, thereby obtaining (Mpr)2-Har-Gly-Asp(tbu)-Trp(boc)-Pro- Cys(tbu) -Sieber, after which the removal of the sulfur protecting group was carried out using BU3P, and then the sulfur bridge was synthesized using NMP and 6% DIEA, and finally the product was obtained by cleavage.
  • Solid phase synthesis is also used in the world patent WO2006119388A2 (only mentioned), using Mpr(Trt)-Har-Gly-Asp(tbu)-Trp-Pro-OH on the resin, and Cys ( Acm)-NH 2 is reacted to obtain Mpr(Trt)-Har-Gly-Asp(tbu)-Trp-Pro-Cys(acm)-NH 2 , after which the side chain protecting group is removed using TFA to obtain Mpr-Har-Gly-Asp -Trp-Pro-Cys(acm)-NH 2 , and finally cyclization to obtain the target product.
  • the structure is as follows:
  • a method for synthesizing eptifibatide comprising the steps of:
  • Liquid phase synthetic peptide 1 Mpr(X)-Har(R 4 )-Gly-OH ;
  • Liquid phase synthesis peptide 2 ⁇ 1 - ⁇ 8 ⁇ ( ⁇ 2 )- ⁇ ( ⁇ 3 )- ⁇ 0-0 ⁇ 8( ⁇ )- ⁇ 2 ;
  • R1 is Fmoc -, Z -, or Boc-;
  • Asp(R 2 ) is a side chain R 2 protected aspartyl; R 2 is -Otbu or -Obzl;
  • Trp(R 3 ) is a side chain protected tryptophan; is - Boc or -H;
  • Har(R4) is a high-arginyl group protected by a side chain; 4 is -Pbf, -Mtr, -Mbs. Boc, (Boc) 2
  • Mprpg is a mercapto X-protected mercaptopropionic acid
  • X is -Acm or -Trt
  • Cys(Y)-NH 2 is a mercapto Y-protected cysteine
  • Y is -Acm or -Trt.
  • MprPQ-Har(R4)-Gly-OH MprPQ-Har (R 4 Gly-) was obtained by synthesizing Gly-OMe and then gradually coupling at room temperature using conventional methods and conventional reagents. OMe, after saponification and acidification, gives the final tripeptide of interest.
  • the product Mpr(X)-Har(R4)-Gly-Asp(R) in the previous step can be dissolved in DMF as a solvent.
  • 2 )-Trp(R 3 )-Pro-Cys(Y)-NH 2 remove all protecting groups with strong acid TFA (where X, Y can also be partially removed or not removed), using low polar solvent
  • the precipitated product has a purity of over 90%.
  • the linear peptide obtained in the previous step is cyclized with 1 2 at 0 to 35 ° C for 10 to 50 minutes in the case of water as a solvent (or air in the same case).
  • DIEA hydrogen peroxide cyclization
  • HPLC high-purity target product.
  • the invention adopts a method of synthesizing a linear peptide first and then recycling, so that the yield is greatly improved and the cost is lowered.
  • the step (1) is as follows: first synthesizing NH 2 -Gly-Ome, and then reacting with the ⁇ nitrogen-protected Har(R 4 ) to obtain the ⁇ -nitrogen-protected Har(R4)-Gly-Ome de- ⁇ -terminal protection Thereafter, it is reacted with MprPQ-OH to obtain Mpr(X)-Har(R4)-Gly-Ome, and finally subjected to a saponification reaction to obtain Mpr(Trt)-Har(4)-Gly-OH.
  • step (1) as follows: reaction with Mpr (X) -H ar (R 4) of the activated ester with Gly unprotected, to give Mpr (Trt) -Har (R4) -Gly-OH.
  • step (1) is as follows: Mpr(Trt)-Har(R4)-Gly-OH is obtained by reacting an activated ester of Mpr(X) with Har(R4)-Gly-OH.
  • the step (2) is as follows: first synthesize NH 2 -Cys (Yi-NH 2 , and then react with the ⁇ -nitrogen-protected Pro to obtain the ⁇ -terminal protected P r0 -CysO -NH 2 de-alpha nitrogen end protection
  • the ⁇ -nitrogen-protected Trp R 3 reacts to obtain the ⁇ -nitrogen-protected Trp)-Pro-CysC-NH 2 and is reacted with R Asp(R 2 )-OH to obtain - ⁇ 8 ⁇ ( )- ⁇ ( )- ⁇ -. ⁇ 3( ⁇ )- ⁇ 2 .
  • the reagent for protecting the deaza end may be one of the following: (1) ethyl acetate containing 1 ⁇ 6mol/L HCl, or a solution of acetic acid or tetrahydrofuran; (2) DCM or acetic acid solution containing 1 ⁇ 50% TFA (3) DCM or DMF solution containing 1 to 95% piperidine.
  • the oxidation described in the step (4) may be air oxidation, hydrogen peroxide oxidation, iodine oxidation or DIEA oxidation.
  • the intermediates and fragments recommended for use in the synthesis of the present invention are shown in Table 1:
  • XI represents an OSU ester group, a p-nitrophenyl ester group, a 2,4-dinitrophenyl ester group or an OBT ester group.
  • the synthetic route of the invention comprises:
  • the present invention provides a linear compound using a novel fragment synthesis method.
  • the beneficial effects of the invention are mainly embodied in the following steps:
  • the method of synthesizing linear peptides first and then recycling makes the yield greatly improved and the cost is reduced, and is suitable for industrial production.
  • Figure 1 is an HPLC chromatogram of eptifibatide crude peptide
  • Figure 2 is an HPLC chromatogram of eptifibatide. detailed description
  • Example 1 The present invention is further described below in conjunction with specific embodiments, but the scope of protection of the present invention is not limited thereto:
  • Example 1 Example 1:
  • Boc-Pro-Cys(acm)-NH 2 (1.945g) into a 50ml round bottom flask, add 20ml of 6mol/L HC1/THF solution, and react at room temperature for 30 minutes to detect complete reaction.
  • the HC1/THF solution was removed by pressure concentration, and the residue was dissolved in ethyl acetate.
  • the ethyl acetate was concentrated under reduced pressure, and then repeated several times until the HC1 was removed.
  • Boc-Trp-OH 1.515 g
  • NH 2 -Pro-Cys acm
  • HOSU 0.575 g
  • DCC 1.030 g
  • Boc-Trp-Pro-Cys(acm)-NH 2 (2.880 g) into a 50 ml round bottom flask, add 20 ml of 6 mol/L HCl/THF solution, and react at room temperature for 30 minutes to detect the reaction. After completion, the HC 1 /THF solution was concentrated under reduced pressure, and ethyl acetate was evaporated, and ethyl acetate was evaporated.
  • Boc-Asp(OBzl)-OH 1.615 g
  • NH 2 -Trp-Pro-Cys acm-NH 2 (2.380 g)
  • HOSU 0.575 g
  • Boc-Har-OH (1.440 g), NH 2 -Gly-Ome (0.445 g), HOSU (0.575 g) were dissolved in a 50-liter round bottom flask, dissolved in anhydrous DMF 40 ml, and DCC was added in an ice water bath. After (1.030 g), the mixture was stirred at room temperature for 2 hours, and the reaction was confirmed to be complete.
  • Boc-Har-Gly-Ome (1.795 g) was weighed and placed in a 50 ml round bottom flask, and 20 ml of a 6 mol/L HC1/THF solution was added thereto, and reacted at room temperature for 30 minutes. The reaction was completely detected, and concentrated under reduced pressure to remove HC1. /THF solution, the residue was added with ethyl acetate to dissolve, and then concentrated under reduced pressure to remove ethyl acetate, and then repeated several times until the HCl was removed.
  • step a to remove you can also use step b to remove.
  • the side chain protecting group can be removed with strong acid, it is directly removed by step 2.
  • step ⁇ or step ⁇ may be employed; when X and Y are the groups in the examples In the case of the group, step A is used:
  • Loading amount 5g peptide of interest
  • the fraction was concentrated by a rotary evaporator.
  • Freeze dry tray use large iron plate (thickness ⁇ lcm)
  • Pre-freezing time pre-freezing in the cold trap for more than 7h
  • the freeze dryer is lyophilized.

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Description

说明书
依替非巴肽的合成制备方法 技术领域
本发明涉及一种依替非巴肽的合成制备工艺， 属于生物技术领域。 背景技术
冠心病是西方发达国家的第一死亡原因， 每年有数百万人发病， 我国虽然 发病率不如西方发达国家， 但是每年约有 100~200万人， 并且有不断上升的趋 势， 虽然现代技术可以采用成形或者搭桥手术进行治疗， 但是手术后再次生病 的几率比较高， 而且还需要药物治疗。 而依替非巴肽正是一种高效的血小板多 肽拮抗剂， 这种药物要能够直接阻断血小板糖蛋白受体和配体的结合， 从而使 心脏得到供血， 减轻或者消除冠心病的症状。
关于依替非巴肽的合成报道已经有很多， 涉及到固相合成以及部分液相合成 方法。
目前在世界上作为此产品的原研厂商 bechem公司， 对此产品的合成主要包 含两个合成方案。 分别是液相合成法和固相合成法， 液相合成法主要是通过片 段多肽的合成， 包含如下合成步骤： 1、 首先通过最常规的多肽缩合方法， 合成 三肽片段 (Trt)Mpr-LysCTFA)-Gly-Ome,然后通过胍基化反应将 Lys转变为 Har， 之后进行皂化和酸中和得到 CTrt)Mpr-Lys TFA)-Gly-OH。 2、 利用活化酯的方法 制备 Z-Asp(otbi -OSu， 然后与二肽 Trp-Pro-OH 反应， 得到多肽片段三肽 Z-Asp(otbu)-Trp-Pro-OH。 3、 将上述两个片段缩合， 得到六肽片段 (Trt)Mpr-Har-Gly-Asp(otbu)-Trp-Pro-OH 。 4 、 将 六 肽 片 段 (Trt)Mpr-Har-Gly-Asp(otbu)-Trp-Pro-OH与 Cys(Trt)-NH2缩合， 得到线性肽七肽 (Trt)Mpr-Har-Gly-Asp(otbu)-Trp-Pro-Cys(Trt)-NH2 。 5 、 将
(Trt)Mpr-Har-Gly-Asp(otbu)-Trp-Pro-Cys(Trt)-NH2七肽环化成粗产品， 然后纯化 得到高纯度的产品。
而在世界专利 WO2005100381中讲到了 3+3+1片段法， 是 peptisyntha公司 的关于工业范围内多肽 GMP生产会议上提到了 (Trt)Mpr-Har-Gly和 Asp-Trp-Pro 和 Cys(Trt)， 然后专利通过比较和介绍， 最后推出的合成路线是 Har-Gly-Asp(otbu)-Trp-Pro-Cys(Npys)和 Mpr 的合环， 具体是先合成六肽直链 (Har-Gly-Asp(otbu)-Trp-Pro-Cys(Npys)-NH2)， 然后先进行硫桥键的合成， 得到 Har-Gly-Asp(otbu)-Trp-Pro-Cys(NH2)-S-S-Mpr， 之后再合成酰胺键， 最后脱出保 护基， 得到最终产品。
路线如下：
Sequence A
Sequence B
Fmoc-HarOH H-Gly-OtBu
2 3
{ Z-Asp(OtBu)-OSu Η-Τφ-Pro-OH
Fmoc-Har-eiy-OtBu 4 5-6
Figure imgf000004_0001
FmooHar-Gty-OH Z-Asp(OtBu )-Trp-Pro-OH
Figure imgf000004_0002
Fmoc-Har-G !y-OPf H- Asp(OtBu)- Trp- Pro- O H
Figure imgf000004_0003
Fmoc-Har~G y-Asp{O Bu)-Tr:p-Pro-OH Fmoc~Har"Gly-»Asp Oi8u -Trp-Pro-OH H:-Cys{Npys)-NH2 2-6 7
Figure imgf000005_0001
Mpa-OH moc-Har-''Gly-Asp OiBit》-Trp-P'n Gys《Npys)- h½
Figure imgf000005_0002
Precursor A (Fmoc2-7-l)
在 WO2005121164中提到的是固相合成法，采用的是先合成中间体直链七肽
( 米 用 lys ) (acm)Mpr-lys(boc)-Gly-Asp(otbu)-Trp-Pro-Cys(acm)
-resin， 然后才通过切割树脂得到七肽的保护肽 (acm)Mpr-lys-Gly-Asp-Trp
-Pro-Cys(acm)-NH2,这个时候通过胍基化反应将 lys转变为高精氨酸，得到直链
(acm)Mpr-Har-Gly-Asp-Trp-Pro-Cys(acm)-NH2, 最后， 采用碘环化的方法得到硫 桥键， 制得最终产品。
另外， 在世界专利 WO2006045483A2 中也是报导了固相合成法， 但是他采 用的是在树脂上就合环的方法。采用 Fm0C-CyS(tbU)-Sieber为起始原料通过固相 接肽，从而得到 (Mpr)2-Har-Gly-Asp(tbu)-Trp(boc)-Pro- Cys(tbu)-Sieber, 之后使用 BU3P进行硫上保护基的脱除， 然后再使用 NMP和 6%的 DIEA合成 硫桥键， 最后裂解得到产品。 Frnot Cys<S"tBLi "MiH ~ SS ber)
1} 20% Pl eridsF 0 sn P 3 t 15 mm
2) P cashes
lengthening HCTU, e-Gi-HO t, DiEA, MP/DC
Figure imgf000006_0001
4》 N washes
I 5) d rivatlze with (tVips c clizati n on su port
I ―――
C lavage from ttie resin a"Har-Gl -A¾i -Tj -Pro-Cy&-HH2
3„™„™ J
世界专利 WO2006119388A2中也是采用了固相合成法 （仅仅是提到而已）， 采用的是在树脂上合成 Mpr(Trt)-Har-Gly-Asp(tbu)-Trp-Pro-OH， 再和 Cys(acm)-NH2反应得到 Mpr(Trt)-Har-Gly-Asp(tbu)-Trp-Pro -Cys(acm)-NH2, 之后 使用 TFA除去侧链保护基，得到 Mpr-Har-Gly-Asp-Trp- Pro-Cys(acm)-NH2，最后 环化得到目标产品。 欧洲专利 EP1591449B1中主要研究的是多肽中二硫桥键的合成条件， 而且 主要是研究了反应的最佳环化条件和 pH值， 研究结果如下： 通过对于含有巯基 磺酸盐和 -SH (酸不稳定保护基） 的直链肽合成， 之后在无水酸的条件下脱去保 护， 在 30度， pH值 =8.3的情况下得到的产品收率比值为最佳。 通过相关资料 得到环化的两个条件：（1 )、在强力搅拌下，溶剂为 methylene chloride： methano： water = 6.0:2.5:0.42, 2 umol产品在 2.0 ml (或者 0.4ml) 溶剂中， methylene chloride:methanol=8.0: 1.5时， 2.03 mg (8 pmol) 的碘在 2 ml (或者 0.4 ml) 溶液 中。
Mpr-Har-Gly-Asp-Trp-Pro-Cys -NH2
依替非巴肽化学式为:
结构式如下：
Figure imgf000007_0001
固相合成中需要使用大量的昂贵的多肽树脂， 这给企业的大规模生产带来 了成本的压力。 而世界专利 WO2005100381 中提到的液相方法， 在最后环化和 偶联歩骤中的收率不高， 致使未参与反应的六肽原料浪费严重。 发明内容
本发明目的是提供一种收率高、 成本低的依替非巴肽的合成方法。
本发明采用的技术方案是：
一种依替非巴肽的合成方法， 所述方法包括如下步骤：
( 1 ) 液相合成肽段 1 : Mpr(X)-Har(R4)-Gly-OH;
(2 ) 液相合成肽段 2: Κ1-Α8ρ(Κ2)-Τ (Κ3)-ΡΓ0-0γ8(Υ)- Η2;
(3 ) 将肽段 1 和肽段 2 縮合， 制得全保护 的肽段 3 ： Mpr(X)-Har( 4)-Gly-Asp(R2)-Trp(R3)-Pro-Cys(Y)-NH2;
(4) 将 肽 段 3 脱 保 护 基 ， 得 到 线 性 肽 ： Mpr(X)-Har-Gly-Asp-Trp-Pro-Cys(Y)-NH2 (Trt可在酸性条件下脱除， 而 Acm不能在酸性条件下脱除， 因此当 Y、 X都为 Acm时， 可以在酸 性条件下脱除其他保护基， 只留下 X、 Y 保护基）、 或
Mpr(X)-Har-Gly-Asp-Trp-Pro-Cys-NH2 (当 X为 Acm， Y为 Trt时可以 在酸性条件下脱除其他保护基， 只留下 X 保护基）、 或
Mpr-Har-Gly-Asp-Trp-Pro-Cys(Y)-NH2 (当 Y为 Acm， X为 Trt时可以 在酸性条件下脱除其他保护基， 只留下 Y 保护基）、 或
Mpr-Har-Gly-Asp-Trp-Pro-Cys-NH2 (当 Y、 X都为 Trt时可以在酸性条 件下脱除全部保护基）；
( 5 ) 将 线 性 肽 氧 化 合 成 二 硫 桥 键 ， 制 得 环 肽 ： Mpr-Har-Gly-Asp-Trp-Pro-Cys - H2 其中：
R1为 Fmoc -， Z -， 或者 Boc-;
Asp(R2) 为侧链 R2保护的天冬氨酰基； R2为 -Otbu或者 -Obzl;
Trp(R3) 为侧链 保护的色氨酰基； 为- Boc或者 -H;
Har(R4)为侧链 保护的高精氨酰基； 4为 -Pbf、 -Mtr、 -Mbs. Boc, (Boc)2
(表示 2个 Boc基） 或者氢； Mprpg为巯基 X保护的巯基丙酸； X为 -Acm或 -Trt; Cys(Y)-NH2为巯基 Y保护的半胱氨酰胺； Y为 -Acm或 -Trt。 本发明关键在于合成路线的设计， 其中肽段的合成， 可按照本领域常规技术 进行。
对于肽段 1 : MprPQ-Har(R4)-Gly-OH的合成， 通过合成 Gly-OMe， 然后在室 温下采用常规方法和常规的试剂，通过逐步偶联，得到 MprPQ-Har(R4 Gly-OMe， 经过皂化和酸化， 得到最后的目的三肽。
对于肽段 2 : Asp(R2)-Trp(R3)-Pro-CysC -NH2的合成， 主要通过先合成 NH2-Cys(Y)-NH2 , 然后在室温下采用常规方法和常规的试剂， 通过逐步偶联，
Figure imgf000009_0001
即最后的目的四肽。 对于肽段 3： Mpr(X)-Har(R4)-Gly-Asp(R2)-Trp(R3)-Pro-Cys (Y)-NH2的合成， 通过合成步骤一中的两个片段， 然后在室温下采用常规方法和常规的试剂， 缩 合成为 Mpr(X)-Har(R4)-Gly-Asp(R2)-Trp(R3)-Pro-Cys (Y)-NH2，然后通过常规的后 处理得到纯度 90%以上的粗产品。 对于线性肽 Mpr-Har-Gly-Asp-Trp-Pro-Cys-NH2的合成， 可采用在 DMF作为溶 剂， 溶解前一步骤的产品 Mpr(X)-Har(R4)-Gly-Asp(R2)-Trp(R3)-Pro-Cys(Y)-NH2情 况下， 利用强酸 TFA脱除所有保护基 （其中 X， Y也可以部分脱除或者不脱除）， 利用低极性溶剂沉淀产品， 纯度达到 90%以上。
Mpr-Har-Gly-Asp-Trp-Pro-Cys -NH2
对于环肽 I 1 的合成， 利用前一步骤获得的线性 肽， 在水作为溶剂的情况下， 在 0~35°C下， 利用 12进行环化 10~50分钟 （或者同 样情况下用空气， DIEA, 双氧水环化）， 得到目的产品， 之后通过 HPLC纯化得 到高纯度的目标产品。 本发明采用先合成线性肽， 再环化的方法，使得收率大幅度提高，成本降低。 所述步骤 （1 ) 如下： 先合成 NH2-Gly-Ome， 然后和 α氮端保护的 Har(R4) 反应， 得到 α氮端保护的 Har(R4)-Gly-Ome脱 α氮端保护之后与 MprPQ-OH反 应 ， 得到 Mpr(X)-Har(R4)-Gly-Ome ， 最后进行皂化反应 ， 得到 Mpr(Tr t)-Har( 4)-Gly-OH。 或者， 所述步骤 （1 ) 如下： 用未保护的 Gly与 Mpr(X)-Har(R4)的活化酯进 行反应， 得到 Mpr(Trt)-Har(R4)-Gly-OH。 又或者，所述步骤（1 )如下：用 Mpr(X) 的活化酯与 Har(R4)-Gly-OH反应， 得到 Mpr(Trt)-Har(R4)-Gly-OH。 所述步骤 （2) 如下： 先合成 NH2-Cys(Yi-NH2， 然后和 α氮端保护的 Pro 反应， 得到 α氮端保护的 Pr0-CysO -NH2脱 α氮端保护之后与 α氮端保护的 Trp R3)反应， 得到 α氮端保护的 Trp )-Pro-CysC -NH2脱 a氮端保护之后与 R Asp(R2)-OH反应得到 -Α8ρ( )-ΤΓρ( )-ΡΐΌ-。γ3(Υ)-ΝΗ2。
所述脱 a氮端保护所用试剂可为下列之一： （1) 含 l〜6mol/LHCl的乙酸乙 酯、 或醋酸、 或四氢呋喃溶液； （2) 含 1〜50%TFA的 DCM或醋酸溶液； （3) 含 1〜95%哌啶的 DCM或 DMF溶液。
歩骤 （4) 中所述氧化可为空气氧化、 双氧水氧化、 碘氧化或 DIEA氧化。 本发明合成过程中建议使用的中间体和片段见表 1:
表 1
Figure imgf000010_0001
Boc-Cys(Acm) -NH2 Z -Cys(Acm)-NH2
NH2-Cys(Acm) -NH2 Z-Pro-Cys(Acm)-NH2
Boc-Pro-Cys(Acm)-NH2 Fmoc-Pro-Cys(Acm)-NH2
Pro-Cys(Acm) -NH2 Z-Trp(Boc)-Pro-Cys(Acm)-NH2
Boc-Trp(Boc)-Pro-Cys(Acm) -NH2 Fmoc-Trp(Boc)-Pro-Cys(Acm)-NH2
Z-Trp-Pro-Cys(Acm) -NH2 Fmoc-Trp-Pro-Cys(Acm)-NH2
Trp(Boc)-Pro-Cys(Acm) -NH2 Trp-Pro-Cys(Acm)-NH2
Z-Asp(OBzl)-Trp(Boc)-Pro-Cys(Acm)-NH2 Z-Asp(OBzl)-Trp-Pro-Cys(Acm)-NH2
Boc-Asp(OBzl)-Trp(Boc)-Pro-Cys(Acm)-NH2 Boc-Asp(OBzl)-Trp-Pro-Cys(Acm)-NH2
Fmoc-Asp(OBzl)-Trp-Pro-Cys(Acm)-NH2 Fmoc-Asp(OBzl)-Trp(Boc)-Pro-Cys(Acm)
-NH2
Z-Asp(Otbu)-Trp(Boc)-Pro-Cys(Acm) -NH2 Z-Asp(Otbu)-Trp-Pro-Cys(Acm)-NH2
Fmoc-Asp(Otbu)-Trp-Pro-Cys(Acm)-NH2 Fmoc-Asp(Otbu)-Trp(Boc)-Pro-Cys(Acm)
-NH2
Asp(Otbu)-Trp-Pro-Cys(Acm)-NH2 Asp(Otbu)-Trp(Boc)-Pro-Cys(Acm)-NH2
Har(R4)-Gly-OH Har( 4)-Gly-Ome
Mpr(Acm)-Xl Mpr(Acm)-Har(R4)
Mpr(Trt)-Xl Mpr(Trt)-Har(R4)-Xl
Har(R4)-Gly-OH Har( 4)-Gly-Ome
Mpr(Trt)-Har(R4)
其中： XI表示 OSU酯基， 对硝基苯酯基， 2,4-二硝基苯酯基或 OBT酯基。 本发明合成路线包括：
路线 1： Mpr(Acm)-Ha Tr iR^-Pro-Cys (Acm)-NH:
Figure imgf000012_0001
Mpr(Acm)-Har(R4)-Gly-Asp(R2)-Trp(R3)-Pro-Cys (Acm)-NH
Mpr(Acm)-Har-Gly-Asp-Trp-Pro-Cys (Acm)-NH2
Mpr-Har-Gly-Asp-Trp-Pro-Cys -NH
Mpr(Trt)-Har( Trp(R3)-Pro-Cys (Trt)棚 2
Figure imgf000012_0002
Mpr(Trt)-Har(R4)-Gly-Asp(R2)-Trp(R3)-Pro-Cys (Trt)-NH2
Mpr-Har-Gly-Asp-Trp-Pro-Cys -NH:
Mpr-Har-Gly-Asp-Trp-Pro-Cys -NH: 线 3 :
Mpr(Trt)-Har( Trp(R3)-Pro-Cys (Acm)-NH:
Figure imgf000012_0003
Mpr(Trt)-Har(R4)-Gly-Asp(R2)-Trp(R3)-Pro- Cys (Acm)-NH:
Mpr-Har-Gly-Asp-Trp-Pro-Cys(Acm) -NH2 Mpr-Har-Gly-Asp-Trp-Pro-Cys -NH2
Figure imgf000013_0001
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Z99.0/0T0ZN3/X3d ΪΖ96.0/ΪΪ0Ζ OAV Fmoc-P s (Acm)-丽:
Figure imgf000015_0001
Fmoc-Pro-Cys (Acm)-NH2
H2-Pro-C I rp(R3)-OH
Figure imgf000015_0002
Fmoc-Trp(R3)-Pro-Cys (Acm)-皿 2
NH2-Trp(R3)-P I rAsp( 2)-OH
Figure imgf000015_0003
rAsp( 2)-Trp(R3)-Pro-Cys (Acm)-NH2
本 发 明 采用 新 颖 的 片 段合 成法 ， 提 供 了 线 性 化 合物
Mpr(X)-Har(R4)-Gly-Asp(R2)-Trp(R3)-Pro-Cys (Y)-NH2的合成方法和过程，然后用 强酸除去各类保护基团， 最后通过空气，双氧水，碘， DIEA氧化形成二硫桥键，
Mpr-Har-Gly-Asp-Trp-Pro-Cys - H2
得到产品 I 1
本发明的有益效果主要体现在： 采用先合成线性肽， 再环化的方法， 使得 收率大幅度提高， 成本降低， 适用于工业化生产。 附图说明
图 1为依替非巴肽粗肽的 HPLC谱图；
图 2为依替非巴肽精肽的 HPLC谱图。 具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述， 但本发明的保护范围并不 仅限于此： 实施例 1 :
一、 带侧链保护的 Mpr(X)-Har(R4)-Gly-Asp(R2)-Trp(R3)-Pro-Cys(Y)-NH2线性肽 的合成
路线一：
1、 Boc-Pro-Cys (acm)-NH2的合成
在 50 毫升的圆底烧瓶中加入 Boc-Pro-OH ( 1.076g)， NH2-Cys(acm)-NH2 (0.960g) , HOSU (N-羟基琥珀酰亚胺） （0.575g)， 用无水 DMF40亳升溶解， 在冰水浴下加入 DCC ( 1.030g) 后， 在室温下搅拌 2小时， 检测反应完全。 抽 滤除去反应产生的沉淀， 减压浓縮除去 DMF, 之后用大量乙酸乙酯溶解， 依次 用 10%NaHCO3、 15%稀盐酸、 饱和食盐水洗涤， 用无水硫酸钠干燥， 旋干乙酸 乙酯，得到固体 1.760g。 HPLC纯度：大于 92%,收率为 90.5% MS=389(M+l
2、 Boc-Trp-Pro-Cys (acm)-NH2的合成
称取 Boc-Pro-Cys(acm)-NH2(1.945g)置于 50毫升的圆底烧瓶中加入 6mol/L 的 HC1/THF溶液 20毫升， 在室温下反应 30分钟， 检测反应完全， 减压浓缩除 去 HC1/THF溶液， 残留物中加入乙酸乙酷溶解， 再减压浓縮除去乙酸乙酯， 如 此重复数次， 直到除尽 HC1。
在 50毫升的圆底烧瓶中加入 Boc-Trp-OH( 1.515g)， NH2-Pro-Cys (acm)-NH2 ( 1.445g) , HOSU (0.575g) , 用无水 DMF40毫升溶解， 在冰水浴下加入 DCC ( 1.030g)后，在室温下搅拌 2小时，检测反应完全。抽滤除去反应产生的沉淀， 减压浓缩除去 DMF， 之后用大量乙酸乙酯溶解， 依次用 NaHCO3、 稀盐酸、 饱 和食盐水洗涤， 用无水硫酸钠干燥， 旋干乙酸乙酯， 得到固体 2.507g。 HPLC纯 度： 大于 93%， 收率为 87% MS=576(M+1)。 3、 Boc-Asp(OBzl)-Trp-Pro-Cys (acm)-NH2的合成
称取 Boc-Trp-Pro-Cys(acm)-NH2 (2.880g)置于 50毫升的圆底烧瓶中加入 6 mol/L的 HCl/THF溶液 20毫升， 在室温下反应 30分钟， 检测反应完全， 减压 浓缩除去 HC1/THF溶液， 残留物中加入乙酸乙酯溶解， 再减压浓缩除去乙酸乙 酯， 如此重复数次， 直到除尽 HC1。
在 50毫升的圆底烧瓶中加入 Boc-Asp(OBzl)-OH ( 1.615g), NH2-Trp-Pro-Cys (acm)-NH2 (2.380g), HOSU (0.575g) , 用无水 DMF40毫升溶解， 在冰水浴下 加入 DCC ( 1.030g) 后， 在室温下搅拌 2小时， 检测反应完全。 抽滤除去反应 产生的沉淀， 减压浓縮除去 DMF， 之后用大量乙酸乙酯溶解， 依次用 NaHCO3、 稀盐酸、饱和食盐水洗涤，用无水硫酸钠干燥，旋干乙酸乙酯，得到固体 3.315g。 HPLC纯度： 大于 93%， 收率为 83% MS=782(M+1)。
4、 Boc-Har-Gly-Ome的合成
在 50亳升的圆底烧瓶中加入 Boc-Har-OH( 1.440g)，NH2-Gly-Ome(0.445g)， HOSU (0.575g), 用无水 DMF40毫升溶解， 在冰水浴下加入 DCC ( 1.030g)后， 在室温下搅拌 2小时， 检测反应完全。 抽滤除去反应产生的沉淀， 减压浓缩除 去 DMF, 之后用大量乙酸乙酯溶解， 依次用 NaHC03、 稀盐酸、 饱和食盐水洗 涤， 用无水硫酸钠干燥， 旋干乙酸乙酯， 得到固体 1.687g。 HPLC 纯度： 大于 95%, 收率为 94% MS=359(M+)
5、 Mpr(acm)-Har-Gly-Ome的合成
称取 Boc-Har-Gly-Ome(1.795g)置于 50毫升的圆底烧瓶中加入 6mol/L 的 HC1/THF溶液 20毫升， 在室温下反应 30分钟， 检测反应完全， 减压浓缩除去 HC1/THF溶液， 残留物中加入乙酸乙酯溶解， 再减压浓缩除去乙酸乙酯， 如此 重复数次， 直到除尽 HC1。 在 50 毫升的圆底烧瓶中加入 Mpr(acm)-OH ( 0.585g )， NH2-Har-Gly-Ome ( 1.295g) , HOSU (0.575g) , 用无水 DMF40毫升溶解， 在冰水浴下加入 DCC ( 1.030g)后，在室温下搅拌 2小时，检测反应完全。抽滤除去反应产生的沉淀， 减压浓缩除去 DMF， 之后用大量乙酸乙酯溶解， 依次用 NaHCO3、 稀盐酸、 饱 和食盐水洗涤， 用无水硫酸钠干燥， 旋干乙酸乙酯， 得到固体 1.490g。 HPLC纯 度： 大于 92%， 收率为 83% MS=359(M+)
6、 Mpr(acm)-Har-Gly-OH的合成
称取 Mpr(acm)-Har-Gly-Ome(1.795g)置于 50亳升的圆底烧瓶中加入 2 mol/L 的 NaOH/THF溶液 20毫升， 在室温下反应 30分钟， 检测反应完全， 用稀盐酸 调节 pH=6， 出现大量白色沉淀， 过滤， 用无水乙醚固化， 得到白色粉末 Mpr(acm)-Har-Gly-OH , 质量为 1.466g。 HPLC 纯度： 大于 91， 收率为 85 MS=345(M+)
7、 Mpr(acm)-Har-Gly-Asp(OBzl)-Trp-Pro-Cys (acm)-NH2的合成
称取 Boc-Asp(OBzl)-Trp-Pro-Cys(acm)-NH2 (3.995g)置于 50毫升的圆底烧瓶 中加入 6mol/L的 HC1/THF溶液 20毫升，在室温下反应 30分钟，检测反应完全， 减压浓缩除去 HC1/THF溶液， 残留物中加入乙酸乙酯溶解， 再减压浓缩除去乙 酸乙酯， 如此重复数次， 直到除尽 HC1。
在 50 毫升的圆底烧瓶中加入 Mpr(acm)-Har-Gly-OH ( 1.725g ) ， NH2-Asp(OBzl)-Trp-Pro-Cys (acm)-NH2(3.495g)， HOSU(0.575g)，用无水 DMF40 毫升溶解， 在冰水浴下加入 DCC ( 1.030g )后， 在室温下搅拌 12小时， 检测反 应完全。 抽滤除去反应产生的沉淀， 减压浓缩除去 DMF， 之后用大量乙酸乙酯 溶解， 依次用 NaHCO3、稀盐酸、 饱和食盐水洗涤， 用无水硫酸钠干燥， 旋干乙 酸乙酯，得到固体 3.902g。 HPLC纯度：大于 87%，收率为 76% MS=1010 (M+1) 二、带侧链保护的 Mpr(acm)-Har-Gly-Asp(OBzl)-Trp-Pro-Cys(acm)-NH2线性肽的 去侧链保护
当 Mpr(X)-Har(R4)-Gly-Asp(R2)-Trp(R3)-Pro-Cys(Y)-NH2侧链保护基， 与实 施例中一致时， 既可以采用歩骤 a来脱除， 也可以采用步骤 b来脱除。 当侧链 保护基都能用强酸脱除时， 则直接采用步骤 2 脱除。 实施例 Mpr(acm)-Har-Gly-Asp(OBzl)-Trp-Pro-Cys(acm)-NH2合成之后， 去侧链保护基， 采用步骤 1 :
a、称取 Mpr(acm)-Har-Gly-Asp(OBzl)-Trp-Pro-Cys (acm)-NH2 (5.135g)置于 50 毫升的圆底烧瓶中加入 20毫升甲醇，加入 10%Pd/C (O. lg),通入氢气致 0.03MP, 然后在 15°C-30°C之间氢化还原 24小时， 检测反应完全。 滤除 10%Pd/C， 减压 浓缩除去甲醇， 得到油状物， 用无水乙醚固化， 得到白色固体产品 Mpr(acm)-Har-Gly-Asp-Trp-Pro-Cys(acm)-NH24.416g。 HPLC纯度： 大于 96%， 收率为 96% MS=920(M+1)
b、将带侧链保护的 Mpr(acm)-Har-Gly-Asp(OBzl)-Trp-Pro-Cys (acm)-NH2线性 肽 (4.600g)溶解于二甲硫醚 3毫升、 苯甲醚 3毫升、 三氟甲磺酸和三氟乙酸 （体 积比 4: 1 ) 12毫升的混合溶液中， 在室温下反应 1小时， 加入冰乙醚， 得到白色 固体 3.502g (Mpr(acm)-Har-Gly-Asp-Trp-Pro-Cys(acm)-NH2)。 HPLC纯度： 大于 90%, 收率为 84 % MS=920(M+1)
三、 Mpr (Acm) -Har-Gly-Asp-Trp-Pro-Cys (Acm) -NH2线性肽的环化
Mpr-Har-Gly-Asp-Trp-Pro-Cys -NH2
I 1 的合成
当 Mpr(X)-Har-Gly-Asp-Trp-Pro-Cys(Y)-N¾中的 X和 Y都为氢的时候可以 采用步骤 Α或者步骤 Β; 当 X和 Y为实施例中的基团时， 则采用步骤 A:
A、 将 Mpr (Acm) -Har-Gly-Asp-Trp-Pro-Cys (Acm) -NH2 (4.595g)线性肽 溶于 1.5mmol/ml (I2/MeOH ) 溶液 70毫升中， 在室温下反应 10~50分钟， 检测
Mpr-Har-Gly-Asp-Trp-Pro-Cys - H2
反应完全。得到目标产品 I 1 ， 质量为 3.108g。 HPLC 纯度： 大于 91%， 收率为 80% MS=772(M+)。
B、将 Mpr-Har-Gly-Asp-Trp-Pro-Cys-NH2 ( 3.860g)线性肽溶于 70亳升水中， 将 PH调至 6〜9之间， 加入双氧水 2.5毫升， 在室温下反应 10-50分钟， 检测反
Mpr-Har-Gly-Asp-Trp-Pro-Cys -NH2
应完全。 得到目标产品 I 1 ， 质量为 3.282g ( HPLC 谱图见图 1， 图中各峰值数据见表 1 )。 HPLC纯度： 大于 84% , 收率为 85% MS=772(M+)。 表 1
Figure imgf000020_0001
四、 产品的纯化 此过程共分为 4个歩骤： 样品前处理、 纯化、 冻干、 包装。
1、 样品前处理 pH调整： 使用稀 TFA水溶液调整 PH在 1.0~3.5之间； 过 滤： 使用直径 =300mm、 孔径 =0.45um微孔滤膜过滤；
2、 纯化条件
2.1制备柱： 15cm X 30cm柱 Kromasil lOum C18反相色谱填料颗粒 2.2 流动相： A: 0.1%TFA水溶液 B: ACN
时间 （分钟） 流动相：6% 流速 （ml/min)
0 10% 400
10 10% 400
100 35% 400
2.3 上样
平衡： 用约 2个柱体积 10%B流动相， 平衡柱子 10分钟
上样量： 5g目的肽
上样流速： 400ml/min
检测波长： 230nm
同时监测压强
2.4 收样
执行梯度洗脱， 当主峰流出时开始收集馏分， 直到检测器吸光度小于 0.1AU 时或者主峰流出后达到主要拐点时停止。 同时用反向 HPLC监测各馏分纯度。 本方法得到的产品纯度达到 99.1%以上纯度。
2.5 浓縮
通过旋转蒸发仪浓缩馏分。
3、 冻干
冻 干盘: 使用大铁盘 （厚度 <lcm)
预冻时间： 在冷阱中预冻 7h以上
冷冻干燥机冻干。
4、 包装
冻干成干粉后， 分装于洁净容器内。 纯化后的依替非巴肽精肽的 HPLC谱图 见图 2， 图中各峰值数据见表 2:
Figure imgf000022_0001
实施例涉及合成路线如下：
Fmoc-Har(R4)-OH NH2-Gly-OMe Fmoc-Pro-OH H2-Cys (Acm)-NH2
Fmoc-Pro-Cys (Acm)-NH2
Fmoc-Har(R4)-Gly-OMe
Fmoc-Trp(R3)-OH H2-Pro-Cys (Acm)-NH2
NH2-Har( 4)-Gly-OMe Mpr(Acm)-OH
Fmoc-Trp(R3)-Pro-Cys (Acm)-NH2 Mpr(Acm)-Har(R4)-Gly-OMe |
RrAsp(R2)-OH NH2-Trp(R3)-Pro-Cys (Acm)-NH2
Mpr(Acm)-Har( 4)-Gly-OH
RrAsp(R2)-Trp(R3)-Pro-Cys (Acm)- H-
Mpr(Acm)-Har(R4)-Gly-Asp(R2)-Trp(R3)-Pro-Cys (Acm)-NH:
Mpr(Acm)-Har-Gly-Asp-Trp-Pro-Cys(Acni) -NH2
Mpr-Har-Gly-Asp-Trp-Pro-Cys -NH2

Claims

权利要求书
1. 一种依替非巴肽的合成制备工艺， 所述方法包括如下步骤：
( 1 ) 液相合成肽段 1 : Mpr(X)-Har(R4)-Gly-OH;
(2 ) 液相合成肽段 2 : Κ1-Α8ρ(Κ2)-Τ (Κ3)-ΡΓ0-0γ8(Υ)- Η2;
(3 ) 将肽段 1 和肽段 2 縮合 ， 制得全保护 的肽段 3 ： Mpr(X)-Har(R4)-Gly-Asp(R2)-Trp(R3)-Pro-Cys(Y)-NH2;
(4 ) 将 肽 段 3 脱 保 护 基 ， 得 到 线 性 肽 ： Mpr(X)-Har-Gly-Asp-Trp-Pro-Cys(Y)-NH2 、 或 Mpr(X)-Har-Gly-Asp-Trp-Pro-Cys-NH2 、 或 Mpr-Har-Gly-Asp-Trp-Pro-Cys(Y)-NH2 、 或 Mpr-Har-Gly- Asp-Trp-Pro-Cys-NH2；
Mpr-Har-Gly-Asp-Trp-Pro-Cys - H2
( 5 ) 将线性肽氧化合成二硫桥键，制得环肽： I ' 其中：
R1为 Fmoc-， Z-， 或者 Boc-;
Asp(R2) 为侧链 R2保护的天冬氨酰基； R2为- Otbu或者 -Obzl; Trp(R3) 为侧链 保护的色氨酰基； 为- Boc或者 -H; Har(R4)为侧链 保护的高精氨酰基； ！^为-Pbf、 -Mtr、 -Mbs、 -Boc, (Boc)2或者氢；
Mpr(X)为巯基 X保护的巯基丙酸； X为 -Acm或 -Trt; Cys(Y)-NH2为巯基 Y保护的半胱氨酰胺； Y为 -Acm或 -Trt。
2. 如权利要求 1 所述依替非巴肽的合成制备工艺， 其特征在于所述步骤 （1 ) 如下： 先合成 NH2-Gly-Ome， 然后和 α氮端保护的 Har^R^反应， 得到 [氮 端保护的 Har(R4)-Gly-Ome 脱 ct氮端保护之后与 Mpr(X)-OH 反应， 得到 Mpr(X)-Har(R4)-Gly-Ome ， 最 后 进 行 皂 化 反 应 ， 得 到 Mpr(Trt)-Har(R4)-Gly-OH。
3. 如权利要求 1 所述依替非巴肽的合成制备工艺， 其特征在于所述步骤 （1) 如下： 用未保护的 Gly 与 MprPO-HarR 的活化酯进行反应， 得到 Mpr(Trt)-Har(R4)-Gly-OH。
4. 如权利要求 1 所述依替非巴肽的合成制备工艺， 其特征在于所述步骤 （1) 如下 ： 用 Mpr(X) 的 活化酯与 Har(R4)-Gly-OH 反应 ， 得到 Mpr(Trt)-Har(R4)-Gly-OH。
5. 如权利要求 1 所述依替非巴肽的合成制备工艺， 其特征在于所述步骤 （2) 如下： 先合成 NH2-CysC -NH2， 然后和 a氮端保护的 Pro反应， 得到 α氮端 保护的 Pro-Cys -NH2脱 α氮端保护之后与 α氮端保护的 Trp R 反应， 得 到 α氮端保护的 Trp(R3)-Pro-CysO -NH2脱 α氮端保护之后与
Figure imgf000025_0001
反应得到 -Α8ρ( )-Τφ( )-ΡΓ0-〇γ8(Υ)-ΝΗ2。
6. 如权利要求 2或 5所述依替非巴肽的合成制备工艺， 其特征在于所述脱 α氮 端保护所用试剂为下列之一： （1)含 l~6mol/LHCl的乙酸乙酯、或醋酸、 或 四氢呋喃溶液； （2)含 1~50%TFA的 DCM或醋酸溶液； （3)含 1~95%哌啶 的 DCM或 DMF溶液。
7. 如权利要求 1 所述依替非巴肽的合成制备工艺， 其特征在于步骤 （4) 中所 述氧化为空气氧化、 双氧水氧化、 碘氧化或 DIEA氧化。
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