WO2011055979A2 - 유동 또는 백서향 추출물, 또는 이의 분획물을 유효성분으로 함유하는 항바이러스용 조성물 - Google Patents

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김두영
김정희
송재성
강호범
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    • A61P31/22—Antivirals for DNA viruses for herpes viruses

Definitions

  • the present invention relates to an antiviral composition containing Aleurites fordii or Daphne kiusiana extract, or a fraction thereof as an active ingredient.
  • viruses Many infectious diseases that humans suffer from are caused by viruses and cause many serious diseases such as rabies, smallpox, myelitis, hepatitis, yellow fever, immunodeficiency, encephalitis and AIDS. Infectious diseases caused by these viruses are very contagious, such as colds, measles, mumps, and chickenpox, not only show acute symptoms, but also respiratory and digestive disorders, and measles and cytomegalovirus cause congenital abnormalities. Viruses, known as tumor viruses, cause tumors and cancers in the human body. Therefore, researches on antiviral agents have been actively conducted since a long time ago.
  • Antiviral drugs are drugs that weaken or extinguish the action of invading viruses in the human body, such as oseltamivir (tamiflu), zanamivir (relenza), interferon, and immunoglobulin preparations.
  • existing antiviral agents which have been used for the prevention and treatment of diseases caused by viral infections, have problems in their continuous use due to the resistance and side effects of the virus caused by mutant viruses to these drugs. Therefore, there is a need for the development of antiviral agents derived from new natural products that can solve the problems of the conventional antiviral agents, and in particular, the development of non-toxic natural materials suitable for use as pharmaceuticals and food additives.
  • interferon-gamma is produced by activated T cells and natural killer (NK) cells of the immune system in response to invasion of foreign substances such as viruses, parasites and tumor cells. It is a natural protein. IFN- ⁇ is secreted by T-helper 1 (Th1) cells, cytotoxic T (Tc) cells, dendritic cells, or NK cells in response to the presence of double helix RNA, an important indicator of viral infection. As a dimeric cytokine, it belongs to type II interferon.
  • IFN- ⁇ has a strong phagocytic activity inherently called macrophage activator, and has been studied to induce transcriptional changes of about 30 genes, resulting in various immune and cellular responses (presentation of macrophage antigens). Increase, increase and activate lysosome activity in macrophages, inhibit Th2 cell activity, increase expression of class I MHC molecules in normal cells, increase mobility of leukocytes and increase NK cell activity.
  • IFN- [gamma] assists the immune response by inhibiting viral replication in host cells, activating NK cells, increasing antigen presentation to lymphoid cells, and increasing host cell resistance to viral infections. When antigens are presented to matching T and B cells, these cells proliferate to remove foreign material in a strategic and specific manner. In this respect, antigen presentation is a very important mechanism in the immune response.
  • NK cells are known to be involved in innate and acquired immune responses. NK cells mediate their effector function through cytotoxicity and cytokine production and function as cytotoxic effector cells mediated by ligands to receptors and target cells.
  • NK specific receptors for cytotoxicity include NKp46 (Sivori, S. et al., J Exp Med , 186: 1129-1136, 1997), NKp30 (Pende, D), called natural cytotoxic receptors (NCRs). et al., J Exp Med , 190: 1505-1516, 1999) and NKp44 (Cantoni, C. et al., J Exp Med , 189: 787-796, 1999).
  • Ligands for NCRs are hemagglutinin (HA) of influenza virus (IV) and hemagglutinin-neuraminidase (HN) of Sendai virus (SV) ( Arnon, TI et al., Eur J Immunol , 31: 2680-2689, 2001) and membrane-associated heparin sulfate proteoglycans (Bloushtain, N. et al., J Immunol , 173: 2392) -2401, 2004, and the like.
  • HA hemagglutinin
  • HN hemagglutin-neuraminidase
  • SV Sendai virus
  • NK cells play an important role in helping the development of acquired immune responses through the secretion of cytokines such as IFN- ⁇ (Stetson, DB et al., J Exp Med , 198: 1069-1076, 2003), IFN- ⁇ Has been reported to have antiviral activity in murine cytomegalovirus infection.
  • NK cells are involved in both direct innate defense and formation of acquired immune responses.
  • NK cells inhibited tumor development and microbial infection.
  • NK cells play a modulator role by directly killing virus infected cells and producing IFN- ⁇ in the early stages of mouse cytomegalovirus (MCMV) infection.
  • MCMV mouse cytomegalovirus
  • IFN- [gamma] production in NK cells is dependent on the activation of Protein kinase C [theta].
  • Tassi and colleagues report that PKC ⁇ is rapidly activated by the involvement of NK cell receptors that signal through immunoreceptor tyrosine-based activationmotifs (ITAMs).
  • ITAMs immunoreceptor tyrosine-based activationmotifs
  • PLC ⁇ Phospholipase C ⁇
  • Basal levels of IFN- ⁇ were markedly decreased in PLC ⁇ 2-deficient NK cells, and unlike wild-type cells, there was no increase in IFN- ⁇ secretion even by anti-NK1.1 stimulation (Caraux, A. et al., Blood , 107: 994-1002, 2006).
  • PLC ⁇ 2 deficient NK cells have severely impaired the ability to produce IFN- ⁇ or granulocyte-macrophage colony stimulating factor (GM-CSF), and PLC ⁇ 2 plays an important role in NKG2D as well as NK1.1 mediated cytokine production. (Regunathan, J.
  • IFN- [gamma] has antiviral action, antiproliferative action and immunomodulatory action, and thus has been used for the treatment of hepatitis, various viral infectious diseases and cancer.
  • Aleurites fordii is a deciduous arborescent tree of the dicotyledonous rats and the larvae. Its scientific name is Aleurites fordii and is also called oil paulownia. It is native to China and grows in the southern coast of Korea. The height of the tree grows up to about 7.5-10 m, the bark is grayish brown, corrugated, and thick branches spread all around. The leaves grow alternately and grow in the shape of a heart or a circle. The flowers bloom in reddish white in May. Fruits are capsules, mature in September, round, with three seeds. In the south, the flow is planted with green or garden water, and oil is harvested from seeds, which are called "oil.” In the Orient, copper oil has traditionally been used to light fires, and it is also important for industrial use in modern times.
  • the fruit of the fruit has the efficacy of whole-style poems, small poisons, and diarrhea in oriental traditional medicine, and has been used to treat wind picks (laryngeal tuberculosis, laryngeal syphilis, etc.), improvement, solitary, burns, pustules, food dressings, and faeces.
  • Root has the effect of news, Isu, hwadam, insecticide, and was used to treat food obesity, tree species, Gochang, Hyocheon, Nagyeo, roundworm.
  • the leaves were used for sowing and detoxification, so they were used for the treatment of swelling, solitary, humchang, alumni, improvement, and dysentery (Information Seop, Shin Mingyo, Dohae Hyangdae, Yeonglimsa, Seoul, pp.741-742, 1998).
  • 12-O-Palmitoyl-16-hydroxyphorbol 13-acetate 12-O-palmitoyl-4-dioxy-4 ⁇ -16-hydroxy 12-O-palmitoyl-4-deoxy-4 ⁇ -16-hydroxyphorbol 13-acetate has been shown to be as toxic to fish as rotenone (Hiroto, M. et al. , Agricultural and Biological Chemistry 43, 2523-2529, 1979; Okuda, T. et al., Phytochemistry 14, 2513-2514, 1975; Shichijo, S. et al, Journal of Clinical + Laboratory Immunology 27, 183-189, 1988; Matsuda, S. et al., International Journal of Cancer 38, 859-865, 1986; Shichijo, S. et al., Arerugi 34, 190-197, 1985; Ito, Y. et al., Cancer letters 18, 87-95, 1983).
  • Daphne kiusiana is an evergreen broad-leaved shrub of the dicotyledonite Azalea, and its scientific name is Daphne kiusiana and is also known as white cedar. It is native to Korea and grows mainly at the foot of the seashore, which is 50 ⁇ 1,300 m above sea level in Geoje, Gyeongsangnam-do, Heuksan and Jeonnam, and is about 1 m high. Leaves grow alternately, elliptical or inverted bar-shaped, about 3 to 8 cm long, about 1.2 to 3.5 cm wide, with flat edges, glossy, and narrow underneath, contiguous with short petioles.
  • White flowers have been used in oriental traditional medicine to treat sore throat, toothache, rheumatism, headache, early mammary cancer, roots for the treatment of sore throats, leaves for the treatment of wounds, gout, and chronic dermatitis. It is not known yet (Jung-Seop et al., Dohae Hyangjeomsa Dictionary, Younglimsa, Seoul, pp.741-742, 1998). It has been reported that the white scent contains anthocyanin and coumarin compounds (Ishikura, N, I. Botanical Magazine , 88: 41-45, 1975; Nakabayashi, T, Yakugaku Zasshi , 74: 192-) . 193, 1954).
  • the present inventors while researching to find an antiviral material from a natural extract derived from a plant, which can solve the problems of the conventional antiviral agent, the leaves, stems and fruit extracts of the flow, the leaves, stems of white paper,
  • the present invention is completed by confirming that flower and root extracts, or fractions thereof, have antiviral efficacy by significantly increasing the secretion of interferon-gamma (IFN- ⁇ ) in natural killer (NK) cells. It was.
  • IFN- ⁇ interferon-gamma
  • An object of the present invention is to provide an antiviral composition containing Aleurites fordii or Daphne kiusiana extract, or a fraction thereof as an active ingredient.
  • Still another object of the present invention is to improve a viral disease comprising administering to a subject suffering from a viral disease a composition comprising a pharmaceutically effective amount of a flow or white scent extract or a fraction thereof as an active ingredient. Provide a method of treatment.
  • Another object of the present invention to provide a method for preventing a viral disease comprising administering to a subject a composition containing a pharmaceutically effective amount of a flow or white scent extract, or a fraction thereof as an active ingredient.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for the prevention and treatment of viral diseases containing Aleurites fordii or Daphne kiusiana extract as an active ingredient.
  • the present invention also provides a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of viral diseases containing the organic solvent fraction prepared by additionally extracting the flow or white scent extract with an organic solvent as an active ingredient.
  • the present invention provides a health food for the prevention or improvement of viral diseases containing a flow or white scent extract, or a fraction thereof as an active ingredient.
  • the present invention also provides a feed additive for the prevention or improvement of viral diseases containing a flow or white scent extract, or a fraction thereof as an active ingredient.
  • the present invention also provides a method for improving or treating a viral disease, comprising administering to a subject suffering from a viral disease a composition comprising a pharmaceutically effective amount of a flow or white scent extract or a fraction thereof as an active ingredient. do.
  • the present invention also provides a method for preventing a viral disease comprising administering to a subject a composition containing a pharmaceutically effective amount of a flowing or white scent extract, or a fraction thereof as an active ingredient.
  • the present invention also provides a use of the flow or white scent extract, or a fraction thereof, in the manufacture of a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of viral diseases.
  • the present invention provides a use of the flow or white baekhyang extract, or fractions thereof for the production of health foods for the prevention or improvement of viral diseases.
  • the present invention provides a use of the flow or white baekhyang extract, or fractions thereof for the production of feed additives for the prevention or improvement of viral diseases.
  • Aleurites fordii or Daphne kiusiana extract, or fractions thereof, of the present invention induce secretion of interferon-gamma (IFN- ⁇ ), an immune-related cytokine in natural killer (NK) cells It has a strong antiviral activity through sex and has an excellent effect on viral diseases, so it can be usefully used as an active ingredient for antiviral compositions.
  • IFN- ⁇ interferon-gamma
  • NK natural killer
  • 1 is a graph analyzing the secretion amount of IFN- ⁇ after NK92 cells were treated with methanol extracts, n-hexane, ethyl acetate, butanol or water fractions from each of the flow leaves, stems and fruits:
  • FIG. 2 is a graph analyzing the secretion amount of IFN- ⁇ after NK92 cells were treated with a fraction obtained by extracting the extract of each of the flow leaves, stems and fruits:
  • Figure 3 is a graph measuring the secretion amount of IFN- ⁇ after NK92 cells were treated with methanol extract, white n-hexane, ethyl acetate, butanol or water fractions from white leaves, stems, flowers and roots:
  • A an organic solvent fraction of white scent methanol extract (DKCS: white stalk cultivation stem; and DKCL: white scent cultivation leaf);
  • 5 is a graph analyzing the secretion amount of IFN- ⁇ after treating the methanol extract of each of the flow leaves, stems and fruits to NK92 cells by concentration.
  • Figure 6 is a graph measuring the lowest active concentration of IFN- ⁇ production capacity of white baekhyang extract.
  • Figure 7 is a figure confirming the expression of IFN- ⁇ mRNA in the flow extract treated NK92 cells by RT-PCR for each time zone.
  • FIG. 8 is a diagram confirming the expression of IFN- ⁇ and ⁇ mRNA in each time zone through the RT-PCR in NK92 cells treated with white baekhyang extract.
  • Figure 9 is a diagram showing the change in IFN- ⁇ production induced by the flow extract according to the treatment of Bay-ll (NF- ⁇ B activity inhibitor) or roterin (PKC activity inhibitor).
  • Figure 10 is a picture of FACS analysis of changes in the expression of cell surface material involved in the activity of NK92 cells treated with flow or white baekhyang extract.
  • FIG. 11 is a diagram confirming the mRNA expression of IFN- ⁇ and ⁇ by the treatment of flow extract in lung epithelial cell line A549 cells infected with influenza virus by RT-PCR.
  • extract has the meaning commonly used in the art as a crude extract, but broadly includes the following fractions.
  • fraction refers to an active fraction obtained by fractionating the activity desired in the present invention using a solvent different from the solvent used for extraction.
  • prevention means any action that inhibits or delays the progression of a viral disease by administration of a composition of the present invention.
  • treatment and “improvement” refer to any action in which the symptoms of a viral disease improve or benefit from administration of a composition of the present invention.
  • administration means providing a subject with a composition of the present invention in any suitable manner.
  • the term "individual” means any animal, such as a human, monkey, dog, goat, pig or rat, having a disease in which the symptoms of a viral disease can be improved by administering the composition of the present invention.
  • feed refers to a substance that supplies the organic or inorganic nutrients necessary to sustain livestock and to produce milk, meat, eggs, fur, and the like.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of viral diseases containing Aleurites fordii or Daphne kiusiana extract as an active ingredient.
  • the flow or white turmeric extract, or fractions thereof, can be obtained by various extraction methods known in the art.
  • the flow or white scent extract is preferably prepared by a manufacturing method comprising the following steps, but not always limited thereto:
  • step 3 drying the filtered extract of step 2) under reduced pressure.
  • the flow or white scent of step 1) can be used without limitation, such as grown or commercially available.
  • the flow can be used for all dried leaves, stems or fruits, and the white paper can be used for dried leaves, stems, flowers or roots.
  • the extraction solvent may be used any extraction solvent commonly used in the art, it is preferable to use water, alcohol or a mixture thereof.
  • the alcohol C 1 to C 2 lower alcohols are preferably used, and as the lower alcohols, ethanol or methanol is preferably used.
  • the extraction method it is preferable to use shaking extraction, reflux extraction, supercritical extraction or subcritical extraction, but not always limited thereto.
  • the extractant is extracted by adding 2 to 20 times the amount of the dried solvent to the dried flow or white paper.
  • Extraction temperature is preferably 20 to 50 °C but is not limited thereto.
  • the extraction time is preferably 10 to 48 hours, more preferably 24 hours is not limited thereto.
  • the number of extraction is preferably 3 to 5 times, more preferably 3 times repeated extraction is not limited thereto.
  • the decompression concentration in step 3) preferably uses a vacuum decompression concentrator or a vacuum rotary evaporator, but is not limited thereto.
  • the drying is preferably reduced pressure drying, vacuum drying, boiling drying, spray drying or freeze drying, but is not limited thereto.
  • the fraction of the flow or white scent extract is prepared by a process comprising the step of adding an organic solvent to the flow or white scent extract to prepare an organic solvent fraction, but not always limited thereto:
  • the organic solvent may be used any extraction solvent conventionally used in the art, C 1 to C 4 anhydrous or hydrous lower alcohols (methanol, ethanol, propanol, butanol, normal-propanol, iso- Propanol or normal-butanol, etc.), a mixed solvent of the lower alcohol and water, acetone, ethyl acetate, chloroform, 1,3-butylene glycol, hexane, diethyl ether or butyl acetate and the like can be used.
  • the organic solvent is preferably hexane, ethyl acetate or butanol, but is not limited thereto.
  • hexane, ethyl acetate, butanol, and water in order from low to high polarity to the flow or white paper extract to obtain a fraction of each organic solvent layer, and the fraction is preferably fractionated using a separatory funnel.
  • a separatory funnel One is not limited thereto.
  • the hexane layer is suspended by distilled water or the extract of white scented distilled water, and the hexane layer is separated, and ethyl acetate is added to the remaining water layer to separate the ethyl acetate layer, and butanol is further added to the remaining water layer to separate the butanol layer. have. All fractions of each organic solvent layer can be used.
  • the flow or white scent extract, or a fraction thereof preferably exhibits antiviral activity through secretory induction of interferon-gamma (IFN- ⁇ ) in natural killer (NK) cells, but is not limited thereto. .
  • IFN- ⁇ interferon-gamma
  • the viral diseases include swine influenza virus (SIV), influenza virus (influenza virus), influenza A virus subtype H1N1, avian influenza virus, rhinovirus (rhinovirus), adeno Adenovirus, coronavirus, parainfluenza virus, respiratory syncytial virus, herpesvirus (HSV), human immunodeficiency virus (HIV), and It is preferable that the disease is infected by any one or more viruses selected from the group consisting of hepatitis virus, but is not limited thereto.
  • composition of the present invention may further contain one or more active ingredients exhibiting the same or similar functions in addition to the above components.
  • composition of the present invention is preferably 0.1 to 50 parts by weight of the flow or white turmeric extract, or a fraction thereof, based on the total weight, but is not limited thereto.
  • composition of the present invention may include a pharmaceutically acceptable carrier in addition to the active ingredient described above.
  • Pharmaceutically acceptable carriers included in the compositions of the present invention are those commonly used in the formulation, lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, starch, acacia rubber, calcium phosphate, alginate, gelatin, calcium silicate , Microcrystalline cellulose, polyvinylpyrrolidone, cellulose, water, syrup, methyl cellulose, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate, mineral oil, and the like. .
  • composition of the present invention may further include lubricants, wetting agents, sweeteners, flavoring agents, emulsifiers, suspending agents, preservatives and the like in addition to the above components.
  • lubricants wetting agents, sweeteners, flavoring agents, emulsifiers, suspending agents, preservatives and the like in addition to the above components.
  • suitable pharmaceutically acceptable carriers and formulations are described in detail in Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995).
  • compositions of the present invention may be prescribed in various ways depending on factors such as the formulation method, mode of administration, age, weight, sex, morbidity of the patient, food, time of administration, route of administration, rate of excretion and response to reaction. have.
  • the oral dosage of the composition of the present invention is preferably 0.0001 ⁇ 100 mg / kg (body weight) per day, but is not limited thereto.
  • composition of the present invention may be administered orally or parenterally, and when administered parenterally, may be administered by intravenous infusion, subcutaneous injection, intramuscular injection, intraperitoneal injection, transdermal administration, or the like. It is preferable that the route of administration is determined according to the kind of the disease to which the composition of the present invention is applied.
  • compositions of the present invention may be prepared in unit dosage form by formulating with a pharmaceutically acceptable carrier and / or excipient, according to methods which can be easily carried out by those skilled in the art. It can be prepared by incorporation into a multi-dose container.
  • the formulation may be in the form of a solution, suspension or emulsion in an oil or an aqueous medium, or may be in the form of extracts, powders, granules, tablets or capsules, and may further include a dispersant or stabilizer.
  • the present inventors have conducted enzyme-linked immunosorbent assays for the induction of interferon-gamma (IFN- ⁇ ) secretion of the flow or white cedar extracts, or fractions thereof. It was confirmed by (enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA). As a result, flow leaf, stem or fruit extracts, or fractions thereof (n-hexane, ethyl acetate or butanol fractions) significantly increased the secretion of IFN- ⁇ in NK cells (see Table 1, Figures 1 and 2), It was confirmed that the secretion of IFN- ⁇ increased depending on the concentration of the flow extract (see Fig. 5).
  • IFN- ⁇ interferon-gamma
  • each white leaf, stem, flower or root extract, or fractions thereof was found to significantly increase the secretion of IFN- ⁇ in NK cells (Table 2, Figure 3). And FIG. 4), it was confirmed that the secretion of IFN- ⁇ was increased depending on the concentration of the extract. MRNA of IFN- [gamma] was also significantly increased in NK92 cells treated with flow or white turmeric extract (see Figures 7 and 8). On the other hand, it was confirmed that the induction of IFN- ⁇ production by flow extract was reduced in NK92 cells by Bay II treatment, confirming that the induction of IFN- ⁇ production by flow extract was mediated by NF- ⁇ B signaling.
  • IFN- ⁇ production was reduced by the treatment of roterin, a PKC signaling inhibitor, confirming that the higher level signaling of NF- ⁇ B signaling was due to PKC activity (FIG. 9).
  • FACS analysis of the effect of flow or white scent extract on the surface material expression of NK92 cells showed a significant increase in the expression of NKG2C and D involved in the activity of NK cells, NKp44 associated with the natural killer activity of NK cells It was confirmed that the expression of significantly increased (see Fig. 10).
  • the flow extract was treated with influenza virus-infected A529 cells to confirm that the increase in IFN- ⁇ expression was faster (see FIG. 11).
  • the IFN- ⁇ is a cytokine known to be strong in phagocytic activity and produce an immune and cellular response, so called macrophage activator in natural killer (NK) cells.
  • NK natural killer
  • the flow or white baek extract of the present invention may be usefully used as a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of viral diseases.
  • the present invention also provides a method for improving or treating a viral disease, comprising administering to a subject suffering from a viral disease a pharmaceutical composition comprising a pharmaceutically effective amount of a flow or white scent extract, or a fraction thereof as an active ingredient. To provide.
  • the present invention also provides a method for preventing a viral disease comprising administering to a subject a pharmaceutical composition containing a pharmaceutically effective amount of a flowing or white scent extract, or a fraction thereof as an active ingredient.
  • the pharmaceutically effective amount is 0.0001 to 100 mg / kg, preferably 0.001 to 10 mg / kg, but is not limited thereto.
  • the dosage may vary depending on the weight, age, sex, health condition, diet, duration of administration, method of administration, elimination rate, severity of disease, and the like of the particular patient.
  • the subject is a vertebrate and preferably a mammal, more preferably an experimental animal such as a rat, rabbit, guinea pig, hamster, dog, cat, and most preferably an ape-like animal such as a chimpanzee or gorilla.
  • an experimental animal such as a rat, rabbit, guinea pig, hamster, dog, cat, and most preferably an ape-like animal such as a chimpanzee or gorilla.
  • the method of administration may be administered orally or parenterally, and during parenteral administration, intraperitoneal injection, rectal injection, subcutaneous injection, intravenous injection, intramuscular injection, intrauterine dural injection, intracerebroventricular injection or intrathoracic injection It can be administered by injection.
  • the viral diseases include swine influenza virus (SIV), influenza virus (influenza virus), influenza A virus subtype H1N1, avian influenza virus, rhinovirus (rhinovirus), adeno Adenovirus, coronavirus, parainfluenza virus, respiratory syncytial virus, herpesvirus (HSV), human immunodeficiency virus (HIV), and It is preferable that the disease is infected by any one or more viruses selected from the group consisting of hepatitis virus, but is not limited thereto.
  • the flow or white scent extract of the present invention exhibits strong antiviral activity through the induction of secretion of immune-related cytokine IFN- ⁇ in natural killer (NK) cells, it has an excellent effect on viral diseases. It can be usefully used for the prevention or treatment of viral diseases.
  • the present invention provides a health food for the prevention or improvement of viral diseases containing a flow or white scent extract, or a fraction thereof as an active ingredient.
  • the viral diseases include swine influenza virus (SIV), influenza virus (influenza virus), influenza A virus subtype H1N1, avian influenza virus, rhinovirus (rhinovirus), adeno Adenovirus, coronavirus, parainfluenza virus, respiratory syncytial virus, herpesvirus (HSV), human immunodeficiency virus (HIV), and It is preferable that the disease is infected by any one or more viruses selected from the group consisting of hepatitis virus, but is not limited thereto.
  • the flow or white turmeric extract of the present invention may be added as it is, or used with other foods or food ingredients, and may be appropriately used according to conventional methods.
  • the health food of the present invention includes ingredients that are commonly added in food production, and include, for example, proteins, carbohydrates, fats, nutrients and seasonings.
  • liquid or white scent extract or fractions thereof include meat, sausage, bread, chocolate, candy, snacks, confectionary, pizza, ramen, other noodles, gums, dairy products including ice cream, various soups , Beverages, tea, drinks, alcoholic beverages and vitamin complexes, etc., and includes all of the health food in the usual sense.
  • the health beverage composition of the present invention may contain various flavors or natural carbohydrates, etc. as additional components, as in the general beverage.
  • the above-mentioned natural carbohydrates are glucose, monosaccharides such as fructose, disaccharides such as maltose and sucrose, and polysaccharides such as dextrin and cyclodextrin, sugar alcohols such as xylitol, sorbitol and erythritol.
  • sweetening agent natural sweetening agents such as tautin and stevia extract, synthetic sweetening agents such as saccharin and aspartame, and the like can be used.
  • the proportion of the natural carbohydrate is generally about 0.01 to 0.04 g, preferably about 0.02 to 0.03 g per 100 ml of the composition of the present invention.
  • the flow or white sesame extract, or fractions thereof of the present invention may be used in various nutrients, vitamins, electrolytes, flavors, colorants, pectic acids and salts thereof, alginic acid and salts thereof, organic acids, protective colloidal thickeners, pH regulators, stabilizers. , Preservatives, glycerin, alcohols, carbonation agents used in carbonated drinks, and the like.
  • the flow or white scent extract of the present invention, or a fraction thereof may contain pulp for the production of natural fruit juice, fruit juice beverage and vegetable beverage. These components can be used independently or in combination. The proportion of such additives is not critical but is generally selected in the range of 0.01 to 0.1 parts by weight per 100 parts by weight of the composition of the present invention.
  • the flow or white scent extract of the present invention or a fraction thereof exhibits strong antiviral activity through secretion induction of the immune-related cytokine IFN- ⁇ in NK cells, it has an excellent effect on viral diseases, thereby preventing or preventing viral diseases. It can be usefully used for improving health food.
  • the present invention also provides a feed additive for the prevention or improvement of viral diseases containing a flow or white scent extract, or a fraction thereof as an active ingredient.
  • the viral diseases include swine influenza virus (SIV), influenza virus (influenza virus), influenza A virus subtype H1N1, avian influenza virus, rhinovirus (rhinovirus), adeno Adenovirus, coronavirus, parainfluenza virus, respiratory syncytial virus, herpesvirus (HSV), human immunodeficiency virus (HIV), and It is preferable that the disease is infected by any one or more viruses selected from the group consisting of hepatitis virus, but is not limited thereto.
  • Feeds can be classified into various types according to nutritional value, main ingredient, distribution, moisture content and processing type, and the feed can be used as feed, thick feed, supplementary feed, protein feed, starch feed, fat feed or fiber feed.
  • the present invention is not limited thereto.
  • the feed additive of the present invention contains 0.1 to 20% by weight of the flow or white sesame extract, or fractions thereof, 0.001 to 0.01% by weight of lipolytic enzyme, 1 to 20% by weight of tricalcium phosphate, vitamin E 0.01 to 0.1% by weight of enzyme powder, 1 to 10% by weight of enzyme powder, 0.1 to 10% by weight of lactic acid bacteria, 0.01 to 10% by weight of Bacillus culture medium and 20 to 90% by weight of glucose. It is preferable that there is, but is not particularly limited thereto, and as the feed additive of the present invention, if the flow or white scent extract, or a fraction thereof is added in an effective amount.
  • the effective amount refers to an amount capable of preventing a viral disease or improving a viral disease that has already occurred by allowing poultry, livestock, etc. to be continuously ingested. Moreover, it is preferable that the quantity which does not produce the bad influence beyond the benefit by addition is preferable.
  • the feed additive may additionally contain a carrier that is acceptable to poultry and livestock.
  • the feed additive may be added as it is or a known carrier, stabilizer, etc., and various nutrients such as vitamins, amino acids, minerals, antioxidants, antibiotics, antibacterial agents, and other additives may be added as necessary.
  • the shape may be in a suitable state such as powder, granules, pellets, suspension, or the like.
  • the flow or white scent extract of the present invention or a fraction thereof exhibits strong antiviral activity through secretion induction of the immune-related cytokine IFN- ⁇ in NK cells, it has an excellent effect on viral diseases, thereby preventing or preventing viral diseases. It can be usefully used in feed additives for improvement.
  • the present invention also provides a use of the flow or white scent extract, or a fraction thereof, in the manufacture of a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of viral diseases.
  • the present invention provides a use of the flow or white baekhyang extract, or fractions thereof for the production of health foods for the prevention or improvement of viral diseases.
  • the present invention provides a use of the flow or white baekhyang extract, or fractions thereof for the production of feed additives for the prevention or improvement of viral diseases.
  • the viral diseases include swine influenza virus (SIV), influenza virus (influenza virus), influenza A virus subtype H1N1, avian influenza virus, rhinovirus (rhinovirus), adeno Adenovirus, coronavirus, parainfluenza virus, respiratory syncytial virus, herpesvirus (HSV), human immunodeficiency virus (HIV), and It is preferable that the disease is infected by any one or more viruses selected from the group consisting of hepatitis virus, but is not limited thereto.
  • the flow or white scent extract of the present invention exhibits strong antiviral activity through the induction of secretion of the immune-related cytokine IFN- ⁇ in NK cells, and thus has an excellent effect on viral diseases, thereby preventing viral diseases, It can be usefully used in the manufacture of pharmaceutical compositions for improving or treating, health foods, or feed additives.
  • Aleurites fordii was collected from Seogwipo, Jeju Island, and 4 liters of methanol was added to 2 kg of dried flow leaves, stems, and fruits, and then extracted for 24 hours while circulating at room temperature to recover the filtered supernatant. After extraction, the solvent was concentrated under reduced pressure to give 276 g, 120 g, and 100 g of the methanol extract with the flow leaf, stem and fruit, respectively.
  • Daphne kiusiana was collected from Muan in Jeonnam, 4 L of methanol was added to 1 kg of dried white scent leaves, stems, flowers or roots, and then extracted for 24 hours while circulating at room temperature to recover the filtered supernatant. After extraction, the solvent was concentrated under reduced pressure to give 118 g, 140 g, 80 g and 105 g of methanol extract of white, green leaf, stem, flower and root, respectively.
  • Daphne genkwa (Korean patent application No.:10-2009-0034132 ), which reported anti-influenza virus activity, was collected from Yongin, Gyeonggi-do, and won-methanol extract according to the ⁇ ex. Was prepared.
  • Example ⁇ 1-1> Methanol extract of the flow leaf, stem and fruit obtained in Example ⁇ 1-1> was suspended in 1.5 L of distilled water, 1.5 L of normal-hexane was added thereto, followed by mixing, and then the normal-hexane-soluble fraction and the water-soluble fraction were separated. This process was repeated three times, and the normal-hexane soluble fraction was filtered and concentrated under reduced pressure to obtain 27.6 g, 28 g, and 4 g of the flow leaf, stem, and fruit normal-hexane fractions, respectively.
  • Example ⁇ 2-1-1> The flow leaf, stem and fruit normal-hexane fractions of Example ⁇ 2-1-1> were separated, and 1.5 L of ethyl acetate was added to each of the remaining fractions, followed by mixing. The ethyl acetate fractions were separated. Repeated three times, the ethyl acetate fractions were filtered and concentrated under reduced pressure to give 80 g, 18 g and 40 g of ethyl acetate fractions, respectively.
  • Example ⁇ 2-1-2> The flow leaf, stem and fruit ethylacetate fractions of Example ⁇ 2-1-2> were separated, and 1.5 L of butanol was added to each of the remaining fractions, followed by mixing. The butanol fractions were separated, and the process was repeated three times. The butanol fraction was filtered and concentrated under reduced pressure to obtain 55 g, 24 g, and 12 g of the flow leaf, stem, and fruit butanol fractions, respectively.
  • Example ⁇ 1-2> From the white cedar leaf, stem, flower, and root methanol extracts obtained in Example ⁇ 1-2>, a white cedar normal-hexane fraction was prepared according to the method described in Example ⁇ 2-1-1>, Stem, flower and root normal-hexane fractions were obtained 31 g, 36 g, 21 g and 27 g, respectively.
  • the white cedar ethyl acetate fraction was prepared according to the method described in Example ⁇ 2-1-2> to obtain 7 g, 8.4 g, 5 g and 6 g of the white cedar leaf, stem, flower and root ethyl acetate fractions, respectively.
  • a white algae butanol fraction was prepared according to the method described in Example ⁇ 2-1-3> to obtain 20 g, 24 g, 14 g and 18 g white algae leaves, stems, flowers and root butanol fractions, respectively.
  • Interleukin-2 (IL-2) dependent natural killer (NK) cell line NK92 (human NK lymphoma) was purchased from the American Type Culture Collection (ATCC). NK92 cells contain 20% fetal calf serum (FCS) (HyClone, Logan, UT), 2 mM L-glutamate, 100 ⁇ g / ml penicillin, 100 ⁇ g / ml streptomycin (Life Technologies) and 100 U / mL of IL-2 (Chiron, Emeryville, ⁇ -MEM ( ⁇ -minimal essential medium) with added CA (Life Technologies, Düsseldorf, Germany) at 37 ° C., 5% CO 2 Incubated under conditions.
  • FCS fetal calf serum
  • FCS fetal calf serum
  • ⁇ -MEM ⁇ -minimal essential medium
  • the normal-hexane fraction was about 1.7 to 2.1 ng / ml
  • the ethyl acetate fraction was About 1.5-2.0 ng / ml
  • white baekhyang extract or fractions thereof as shown in Table 2 and Figure 3, about 2.4 ⁇ 2.6 ng / ml IFN in each NK92 cells treated with white baekhyang methanol extract (leaves, stems, flowers or roots) - ⁇ was secreted.
  • the normal-hexane fraction is about 1.7 to 1.8 ng / ml
  • ethyl Acetan fractions showed about 1.4-1.8 ng / ml
  • butanol fractions showed 1.6- 1.9 ng / ml of IFN- ⁇ secretion.
  • the amount of INF- ⁇ secretion according to the concentration of each of the flow leaf, stem and fruit methanol extract, and white fish extract of methanol was performed according to the method of Example ⁇ 3-2>. At this time, the methanol extract was added at a concentration of 0.01, 0.1, 1 or 10 ⁇ g / ml, respectively.
  • the amount of secretion of INF- ⁇ was significantly increased in the flow leaf methanol extract at a concentration of 1 ⁇ g / ml or more, and the secretion of INF- ⁇ at the concentration of 10 ⁇ g / ml in the flow stem or fruit methanol extract. It showed a sharp increase of (Fig. 5).
  • the secretion amount of INF- ⁇ was significantly increased at the concentration of 1 ⁇ g / ml or more of the white west methanol extract (FIG. 6). As a result, it was confirmed that the secretion of INF- ⁇ increased depending on the concentration of the methanol extract of the flow or white paper.
  • RT-PCR was performed to investigate changes in mRNA expression related to IFN- ⁇ and ⁇ induction in NK92 cells.
  • NK92 cells or lung epithelial cell line A549 was incubated for 12 hours with 2 ng of flow or white paper extract. After 15, 30, 45, 1, 4, and 12 hours after incubation, the cells were lysed and RNA was isolated according to a known protocol to analyze IFN- ⁇ mRNA expression via RT-PCR.
  • the primer of IFN- ⁇ used at this time was 5'-TCCCATGGGTTGTGTGTTTA-3 'for the forward primer, and 5'-GTCAGGGTGCAGCCGG-3' for the reverse primer, and GAPDH was used as an internal standard. 3 'and reverse primer 5'-ACAGTCTTCTGGGTGGCAGT-3'.
  • Amplification by PCR reaction was performed using GeneAmp PCR system 2700 (Applied Biosystems, Foster city, CA, USA) under the following conditions; After 25 to 40 cycles of 5 minutes at 94 ° C, followed by 45 seconds at 94 ° C, 45 seconds at 56 ° C, and 1 minute at 72 ° C, the final extension reaction was carried out at 72 ° C for 7 minutes.
  • PCR primers were designed using the Primer3 program and purchased from Bioneer (Daejeon, Korea).
  • PCR products were separated on 1.5% agarose gel and stained with ethidium bromide (EtBr) and visualized with Gel Doc 2000 UV trans-illuminator (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA), followed by Quantity One software Analyzes were performed using (Bio-Rad Laboratories). Each sample was tested three or more times and representative data were presented.
  • EtBr ethidium bromide
  • the transcript of IFN- ⁇ was significantly increased after 2 hours in NK92 cells treated with the flow extract, which means that the response to the flow extract for IFN- ⁇ induction was 1 at the transcription level. It can be seen that induced within 2 hours (Fig. 7).
  • the expression pattern of IFN- ⁇ and IFN- ⁇ mRNA in the NK92 cells treated with white scent and A549 cells, which are lung epithelial cell line, as a result of time zones the transcript of IFN- ⁇ was white worm extract After 3 hours in treated NK92 cells, it was markedly increased, indicating that the response to the white persimmon extract for IFN- ⁇ induction was induced within 3 hours at the transcription level. In A549 cells, white sperm extract was found to increase the expression level of IFN- ⁇ mRNA (FIG. 8).
  • Fluorescence activated cell sorter was used to confirm the change of cell surface material involved in the activity of NK92 cells treated with flow or white scent extract. At this time, the expression of NKG2A, C, and D, NKp30, NKp44, and Nkp46 cell surface related to natural killer activity were analyzed as ligands of NK cells.
  • the flow or white scent extract showed a similar surface material expression pattern of NK92 cells, significantly increased the expression of NKG2C and D involved in the activity of NK cells, natural killer of NK cells The expression of NKp44 associated with activity was also found to be significantly increased (FIG. 10).
  • RT-PCR was processed according to the method of Example ⁇ 3-4> after treating the flow extract on A549 cells, which are lung epithelial cell lines infiltrated with influenza virus. IFN- ⁇ and ⁇ transcriptional activity were confirmed.
  • the flow or white sesame extract of the present invention, or fractions thereof have an excellent effect on antiviral, and thus, development of pharmaceuticals for the prevention and treatment of viral diseases, or health food and feed additives for the prevention and improvement of viral diseases. It can be usefully used for the study of prophylactic or therapeutic methods using these.

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Abstract

본 발명은 유동(Aleurites fordii) 또는 백서향(Daphne kiusiana) 추출물, 또는 이의 분획물을 유효성분으로 함유하는 항바이러스용 조성물에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 유동 또는 백서향 추출물, 또는 이의 분획물은 자연살해(natural killer, NK)세포에서 면역 관련 사이토카인인 인터페론-감마(interferon-γ, IFN-γ)의 분비 유도성을 통해 강력한 항바이러스 활성을 나타내어 바이러스성 질환에 탁월한 효과가 있으므로 항바이러스용 조성물에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

유동 또는 백서향 추출물, 또는 이의 분획물을 유효성분으로 함유하는 항바이러스용 조성물
본 발명은 유동(Aleurites fordii) 또는 백서향(Daphne kiusiana) 추출물, 또는 이의 분획물을 유효성분으로 함유하는 항바이러스용 조성물에 관한 것이다.
인류가 앓고 있는 많은 감염성 질환은 바이러스에 의한 것으로, 광견병, 천연두, 척수염, 간염, 황열, 면역 결핍증, 뇌염 및 에이즈 등 여러 가지 심각한 질병의 원인이 된다. 이러한 바이러스에 의한 감염성 질환은 감기, 홍역, 볼거리 및 수두 등과 같이 매우 전염성이 강하며 급성 증세를 나타낼 뿐만 아니라 호흡기, 소화기 장애를 나타내기도 하고, 홍역 및 사이토메갈로바이러스와 같은 것은 선천성 이상을 유발하며, 종양 바이러스로 알려진 바이러스는 인체에 종양 및 암을 유발한다. 따라서 항바이러스제에 대한 연구는 오래전부터 현재까지 활발하게 진행되고 있다. 항바이러스제(antiviral drug)는 인체내에 침입한 바이러스의 작용을 약화시키거나 소멸하게 하는 약제로 오셀타미비르(타미플루), 자나미비르(릴렌자), 인터페론, 면역 글로불린 제제 등이 있다. 그러나 바이러스 감염에 따른 질병의 예방 및 치료에 사용되어 온 기존의 항바이러스제들은 이들 약물에 대한 돌연변이 바이러스에 의한 바이러스의 내성 및 부작용으로 지속적인 사용에 문제가 있다. 따라서 상기 종래 항바이러스제가 갖는 문제점을 해결할 수 있는 새로운 천연물 유래의 항바이러스제의 개발이 요구되고 있으며, 특히 의약품 및 식품 첨가물로서 사용하기에 적합하도록 독성이 없는 천연소재 개발이 요구되고 있다.
한편, 인터페론-감마(interferon-γ, IFN-γ)는 면역시스템의 활성화된 T 세포 및 자연살해(natural killer, NK)세포가 바이러스, 기생충 및 종양세포와 같은 외부물질의 침입에 대응하여 생성하는 천연 단백질이다. IFN-γ는 바이러스 감염의 중요 지시자인 이중나선 RNA의 존재에 대응하여 T-헬퍼1(Th1) 세포, 세포독성 T(cytotoxic T, Tc)세포, 수지상세포(dendritic cell) 또는 NK세포 등에 의해 분비되는 이량체 사이토카인으로서, 타입 II(type II) 인터페론에 속한다. IFN-γ는 본래부터 대식세포(macrophage) 활성자로 불릴 만큼 식세포 활성작용이 강하며, 현재 연구된 바에 의하면 약 30개 정도의 유전자의 전사 변화를 유도하여 다양한 면역 및 세포 반응(대식세포의 항원제시 증가, 대식세포에서 리소좀(lysosome) 활성 증가 및 활성화, Th2 세포 활성억제, 정상세포에서 클래스 I MHC 분자의 발현증가, 백혈구세포의 이동성 증가 및 NK세포 활성의 증가)을 생성하는 것으로 알려져 있다. IFN-γ는 숙주세포내의 바이러스 복제를 억제하고, NK세포를 활성화시키며, 림프세포에 대한 항원제시를 증가시키고, 숙주세포의 바이러스 감염에 대한 내성을 증가시킴으로써 면역 반응을 돕는다. 항원이 매칭되는 T 세포 및 B 세포에 제시되면 이들 세포들이 증식하여 외부물질을 전략적이고 특이적인 방법으로 제거한다. 이러한 점에서 항원제시는 면역반응에서 매우 중요한 기작이다.
NK 세포는 선천 및 획득 면역 반응에 관여하는 것으로 알려져 있다. NK세포는 세포독성 및 사이토카인 생성을 통해 이의 효능(effector function)을 매개하고, 수용체 및 표적세포에 대한 리간드에 의해 매개되는 세포독성 효능 세포로 기능한다. 세포독성에 대한 NK 특이 수용체로는 자연 세포독성 수용체(natural cytotoxic receptors, NCRs)로 불리는 NKp46(Sivori, S. et al., J Exp Med, 186: 1129-1136, 1997), NKp30(Pende, D. et al., J Exp Med, 190: 1505-1516, 1999) 및 NKp44(Cantoni, C. et al., J Exp Med, 189: 787-796, 1999) 등이 있다. NCRs에 대한 리간드는 인플루엔자 바이러스(influenza virus, IV)의 헤마글루티닌(hemagglutinin, HA), 센다이 바이러스(Sendai virus, SV)의 헤마글루티닌-뉴라미니다아제(hemagglutinin-neuraminidase, HN)(Arnon, T. I. et al., Eur J Immunol, 31: 2680-2689, 2001) 및 막-결합된 헤파린 설페이트 프로테오글리칸(membrane-associated heparin sulfate proteoglycans)(Bloushtain, N. et al., J Immunol, 173: 2392-2401, 2004) 등이 알려져 있다. 또한, NK세포는 IFN-γ와 같은 사이토카인 분비를 통해 획득 면역 반응의 발달을 돕는데 중요한 역할을 하며(Stetson, D. B. et al., J Exp Med, 198: 1069-1076, 2003), IFN-γ가 쥐 사이토메갈로바이러스(murine cytomegalovirus) 감염에서 항바이러스 활성을 갖는다는 것이 보고되었다. NK세포는 직접적인 선천 방어 및 획득 면역 반응의 형성에 모두 관여하고 있다. 몇 가지 마우스 모델에서 NK세포가 종양의 발달과 미생물 감염을 억제하였다. 특히, NK세포는 마우스 사이토메갈로바이러스(mouse cytomegalovirus, MCMV) 감염의 초기 단계에서 직접 바이러스 감염된 세포를 사멸시키고 IFN-γ를 생성시킴으로써 조절자 역할을 한다. NK세포내에서 IFN-γ 생성에 대한 주요 경로는 프로테인키나제Cθ(Protein kinase C, PKCθ)의 활성화에 의존한다. Tassi 연구진은 면역수용체 타이로신 활성화 부위(immunoreceptor tyrosine-based activationmotif, ITAMs)를 통해 신호를 전달하는 NK세포 수용체가 관여함으로써 PKCθ가 신속하게 활성화된다고 보고하였다. PKCθ 결핍 마우스로부터 NK세포를 분석한 결과, PKCθ는 ITAM 매개 IFN-γ 분비에서 필수 요소라는 것이 밝혀졌다(Tassi, I. et al., Blood, 112: 4109-4116, 2008).
포스포리파제Cγ(phospholipase Cγ, PLCγ)는 IFN-γ 분비에서 매우 본질적인 기초 인자이다. IFN-γ의 기저수준은 PLCγ2-결핍 NK세포내에서 현저하게 감소하였고, 야생형 세포와는 달리, 항NK1.1에 의한 자극에 의해서도 IFN-γ 분비가 증가되는 결과를 보이지 않았다(Caraux, A. et al., Blood, 107: 994-1002, 2006). PLCγ2 결핍 NK세포들은 IFN-γ 또는 과립구-마크로파지 콜로니자극인자(granulocyte-macrophage colony stimulating factor, GM-CSF) 생성 능력이 심각하게 손상되었고, PLCγ2는 NK1.1 매개 사이토카인 생성뿐만 아니라 NKG2D에서도 중요한 역할을 한다(Regunathan, J. et al.,J Immunol, 177: 5365-5376, 2006). 마우스내에서 Fc수용체(FcRs)의 γ-사슬을 포함하며, 이 수용체는 결합된 어답터 ITAMs(adaptor's ITAMs)의 티로신 잔기 인산화 결과에 이르게 되고, 이는 다시 비장 티로신 키나제(spleen tyrosine kinase, Syk)를 모이게 한다. 상기 키나제는 T 세포 활성화용 링커, 76 kDa, PLC, PI3K 및 Erk 키나제를 포함하는 다수의 하부 신호전달 매개자들을 활성화시킨다. 종합적으로 이 신호전달 매개자들은 유전자 전사, NK세포가 표적세포들을 용해시키는데 사용하는 용해성 과립의 엑소사이토시스(exocytosis)를 위한 세포 프로그램을 개시하고, 친염증성 케모카인 및 사이토카인, 특히 IFN-γ를 생성시킨다(Tassi, I. et al., J Immunol, 175: 749-754, 2005). 상기와 같이, IFN-γ는 항바이러스 작용, 항증식작용 및 면역조절작용을 하므로, 간염, 다양한 바이러스 감염성 질환 및 암 치료에 이용되고 있다.
한편, 대부분의 바이러스는 숙주의 IFN 반응에 대하여 자신을 보호하기 위해, 면역 회피 전략을 나타낸다. 특히, 바이러스에 의한 IFN-γ 신호 억제에 대한 다양한 기작이 보고되고 있다. 예를 들면, 엡슈타인-바(Epstein-barr) 바이러스는 IFN-γ 수용체 유전자 발현을 저해하여 항바이러스성 IFN 반응을 막고(Morrison, T. E., et al., Immunity 15:787-799, 2001), 인간 종양-유도 헤르페스 바이러스(herpesvirus)에 의해 IFN-γ 수용체 1이 저해(Li, Q., J Virol 81, 2117-2127, 2007)된다고 알려져 있다. 그러므로, IFN의 분비 및 활성을 촉진시켜 항바이러스 활성 및 면역 활성을 높일 수 있는 물질의 개발이 필요하다.
유동(Aleurites fordii)은 쌍떡잎식물 쥐손이풀목 대극과의 낙엽교목으로 학명은 Aleurites fordii이고, 흔히 기름오동나무라고도 한다. 중국이 원산지이며 한국의 남부해안지방에서도 자란다. 나무의 높이는 약 7.5 ~ 10 m까지 자라고, 나무껍질은 잿빛을 띄는 갈색이고 피목이 있으며 굵은 가지가 사방으로 퍼진다. 잎은 어긋나서 자라고 심장 모양 또는 동그란 모양이며 꽃은 5월에 붉은빛이 도는 흰색으로 핀다. 열매는 삭과로서 9월이면 성숙하는데 둥글고 세 개의 종자가 들어있다. 남부지방에서는 유동을 녹음수나 정원수로 심으며, 종자에서는 기름을 채취하는데, 이 기름을 "동유"라고 한다. 동양에서는 동유를 전통적으로 불을 밝히는데 썼으며, 현대에도 산업용으로 중요하게 이용되고 있다.
유동의 열매는 동양 전통의학에서 통토풍담, 소종독, 이이 변의 효능이 있으며, 풍담후비(후두결핵, 후두매독 등), 개선, 단독, 화상, 농포창, 식적복창, 대소변 불리를 치료하는데 사용되었다. 뿌리는 소식, 이수, 화담, 살충의 효능이 있으며, 식적비만, 수종, 고창, 효천, 나력, 회충증을 치료하는데 사용되었다. 잎은 소종, 해독의 효능이 있어 옹창, 단독, 겸창, 동창, 개선, 이질 치료에 사용하였다(정보섭, 신민교, 도해향약대사전, 영림사, 서울, pp.741-742, 1998).
유동의 화학성분연구를 통해 유동에 디터피노이드에스터(diterpenoid esters), 스테롤(sterols), 탄닌(tannins), 오일(oil), 쿠마린(coumarin), 쿠마로리그난(coumarolignan)계 화합물들이 함유되어있다는 연구결과가 알려져 있다(Ishikura, N. et al., I. Botanical Magazine, 88: 41-45, 1975; Nonaka, G. et al., Chem. Pharm. Bull. 38: 861-865, 1990; Fozdar, B. I. et al., Phytochemistry 28, 2459-2461, 1989; Hiroto, M. et al., Agricultural and Biological Chemistry 43, 2523-2529, 1979; Okuda, T. et al., Phytochemistry 14, 509-515, 1975). 유동에 대한 생리활성 연구로는 인간 다형핵 백혈구 활성 인자(human polymorphonuclear leukocyte activating factor), 인간 호중구 활성 인자(human neutrophil-activating factor) 등이 밝혀졌으며, 유동의 추출물 및 디테르펜에스터(diterpene esters)에 의해 엡스타인-바 바이러스(Epstein-Barr virus) 활성이 유도된다고 보고되었다. 또한, 유동의 12-O-헥사데카노일-16-하이드록시포볼 13-아세테이트(12-O-hexadecanoyl-16-hydroxyphorbol 13-acetate)는 인간 T-림프구친화성 바이러스 타입 I(human T-lymphotrophic virus type I, HTLV-I)에 의해 유도되는 림프구의 콜로니 형성을 증대시키는 효능이 있다고 보고되었다. 유동의 12-O-팔미토일-16-하이드록시포볼 13-아세테이트(12-O-Palmitoyl-16-hydroxyphorbol 13-acetate), 12-O-팔미토일-4-디옥시-4β-16-하이드록시포볼 13-아세테이트(12-O-palmitoyl-4-deoxy-4β-16-hydroxyphorbol 13-acetate)는 어류에 대한 독성이 로테논(rotenone)과 유사한 정도라는 것이 밝혀졌다(Hiroto, M. et al., Agricultural and Biological Chemistry 43, 2523-2529, 1979; Okuda, T. et al., Phytochemistry 14, 2513-2514, 1975; Shichijo, S. et al, Journal of Clinical + Laboratory Immunology 27, 183-189, 1988; Matsuda, S. et al., International Journal of Cancer 38, 859-865, 1986; Shichijo, S. et al., Arerugi 34, 190-197, 1985; Ito, Y. et al., Cancer Letters 18, 87-95, 1983).
한편, 백서향(Daphne kiusiana)은 쌍떡잎식물 도금양목 팥꽃나무과의 상록활엽관목으로, 학명은 Daphne kiusiana이고 흰서향나무라고도 한다. 원산지는 한국이며 경남 거제도와 전남 흑산도, 제주도의 표고 50 ~ 1,300 m인 바닷가의 산기슭에서 주로 자라고 그 높이는 약 1 m이다. 잎은 어긋나 자라고 타원형 또는 거꾸로 선 바소꼴이며 길이는 약 3 ~ 8 ㎝, 너비는 약 1.2 ~ 3.5 ㎝ 정도로, 가장자리가 밋밋하고 윤이 나며 밑부분이 좁아져 짧은 잎자루와 연속된다. 꽃은 암수딴그루이고 2 ~4월에 백색으로 피며, 가지 끝에 모여 달리고 향기가 진하다. 포는 넓은 피침형이고 꽃자루는 짧으며 백색 잔털이 있고 꽃받침도 잔털이 있으며 4개로 갈라져 있다. 열매는 장과로서 달걀처럼 생긴 공모양이고 길이는 8 ㎜ 정도이다. 5 ~ 6월에 주홍색으로 익는다. 줄기는 직립하고 청감색으로 가지가 많이 나와 피복형의 수형을 이룬다.
백서향 꽃은 동양 전통의학에서 인후동통, 치통, 류머티즘통, 두창, 초기 유선암을 치료하는데 사용되었고, 뿌리는 인후염 치료에, 잎은 창상, 통풍, 만성피부염을 치료하는데 사용되어 왔으나, 이의 생물학적 활성은 아직까지 명확히 알려져 있지 않았다(정보섭 외, 도해향약대사전, 영림사, 서울, pp.741-742, 1998). 백서향의 화학성분연구에 의해 백서향에 안토시아닌계 및 쿠마린계 화합물이 함유되어 있다고 보고되었다(Ishikura, N, I. Botanical Magazine, 88: 41-45, 1975; Nakabayashi, T, Yakugaku Zasshi, 74: 192-193, 1954).
그러나 아직 상기 유동 또는 백서향의 항바이러스 활성 및 면역 활성 작용에 관하여 보고된 바는 없다.
이에, 본 발명자들은 종래 항바이러스제가 갖는 문제점을 해결할 수 있는, 식물로부터 유래된 천연 추출물로부터 항바이러스용 물질을 발굴하기 위해 연구하던 중, 유동의 잎, 줄기 및 열매 추출물, 백서향의 잎, 줄기, 꽃 및 뿌리 추출물, 또는 이들의 분획물이 자연살해(natural killer, NK)세포에서 인터페론-감마(interferon-γ, IFN-γ)의 분비를 현저히 증가시켜 항바이러스 효능을 가짐을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 유동(Aleurites fordii) 또는 백서향(Daphne kiusiana) 추출물, 또는 이의 분획물을 유효성분으로 함유하는 항바이러스용 조성물을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 또 다른 목적은 약학적으로 유효한 양의 유동 또는 백서향 추출물, 또는 이의 분획물을 유효성분으로 함유하는 조성물을 바이러스성 질환에 걸린 개체에 투여하는 단계를 포함하는 바이러스성 질환의 개선 또는 치료 방법을 제공한다.
아울러, 본 발명의 또 다른 목적은 약학적으로 유효한 양의 유동 또는 백서향 추출물, 또는 이의 분획물을 유효성분으로 함유하는 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 바이러스성 질환의 예방 방법을 제공한다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 유동(Aleurites fordii) 또는 백서향(Daphne kiusiana) 추출물을 유효성분으로 함유하는 바이러스성 질환의 예방 또한 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 유동 또는 백서향 추출물을 추가적으로 유기용매로 추출하여 제조된 유기용매 분획물을 유효성분으로 함유하는 바이러스성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 유동 또는 백서향 추출물, 또는 이의 분획물을 유효성분으로 함유하는 바이러스성 질환의 예방 또는 개선용 건강식품을 제공한다.
또한, 본 발명은 유동 또는 백서향 추출물, 또는 이의 분획물을 유효성분으로 함유하는 바이러스성 질환의 예방 또는 개선용 사료첨가제를 제공한다.
또한, 본 발명은 약학적으로 유효한 양의 유동 또는 백서향 추출물, 또는 이의 분획물을 유효성분으로 함유하는 조성물을 바이러스성 질환에 걸린 개체에 투여하는 단계를 포함하는 바이러스성 질환의 개선 또는 치료 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 약학적으로 유효한 양의 유동 또는 백서향 추출물, 또는 이의 분획물을 유효성분으로 함유하는 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 바이러스성 질환의 예방 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 유동 또는 백서향 추출물, 또는 이의 분획물을 바이러스성 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물의 제조에 이용하는 용도를 제공한다.
또한, 본 발명은 유동 또는 백서향 추출물, 또는 이의 분획물을 바이러스성 질환 예방 또는 개선용 건강식품의 제조에 이용하는 용도를 제공한다.
아울러, 본 발명은 유동 또는 백서향 추출물, 또는 이의 분획물을 바이러스성 질환 예방 또는 개선용 사료첨가제의 제조에 이용하는 용도를 제공한다.
본 발명의 유동(Aleurites fordii) 또는 백서향(Daphne kiusiana) 추출물, 또는 이의 분획물은 자연살해(natural killer, NK)세포에서 면역 관련 사이토카인인 인터페론-감마(interferon-γ, IFN-γ)의 분비 유도성을 통해 강력한 항바이러스 활성을 나타내어 바이러스성 질환에 탁월한 효과가 있으므로, 항바이러스용 조성물의 유효성분으로 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 유동 잎, 줄기 및 열매 각각의 메탄올 추출물, 이로부터 분획한 n-헥산, 에틸아세테이트, 부탄올 또는 물 분획물을 NK92세포에 처리한 후, IFN-γ의 분비량을 분석한 그래프이다:
M: 유동 메탄올 추출물;
H: 유동 n-헥산 분획물;
E: 유동 에틸아세테이트 분획물;
B: 유동 부탄올 분획물;
W: 유동 물 분획물;
NC: 음성대조군; 및
PC: 양성대조군.
도 2는 유동 잎, 줄기 및 열매 각각의 추출물을 분획한 분획물을 NK92 세포에 처리한 후, IFN-γ의 분비량을 분석한 그래프이다:
A: 유동 잎 노르말 헥산 분획물;
B: 유동 열매 노르말 헥산 분획물;
C: 유동 줄기 노르말 헥산 분획물; 및
D: 유동 열매 에틸아세테이트 분획물.
도 3은 백서향 잎, 줄기, 꽃 및 뿌리 각각의 메탄올 추출물, 이로부터 분획한 n-헥산, 에틸아세테이트, 부탄올 또는 물 분획물을 NK92세포에 처리한 후, IFN-γ의 분비량을 측정한 그래프이다:
A: 백서향 메탄올 추출물; 및
B: 백서향 메탄올 추출물의 유기용매 분획물:
M: 백서향 메탄올 추출물;
H: 백서향 n-헥산 분획물;
E: 백서향 에틸아세테이트 분획물;
B: 백서향 부탄올 분획물;
W: 백서향 물 분획물;
NC: 음성대조군; 및
PC: 양성대조군.
도 4는 백서향 잎, 줄기, 꽃 및 뿌리 각각의 추출물을 분획한 분획물을 NK92 세포에 처리한 후, IFN-γ의 분비량을 분석한 그래프이다:
A: 백서향 메탄올 추출물의 유기용매 분획물(DKCS: 백서향 재배시료 줄기; 및 DKCL: 백서향 재배시료 잎);
B: 백서향 재배시료 잎의 n-헥산 분획물; 및
C: 백서향 재비시료 잎의 에틸아세테이트 분획물.
도 5는 유동 잎, 줄기 및 열매 각각의 메탄올 추출물을 NK92세포에 농도별로 처리한 후, IFN-γ의 분비량을 분석한 그래프이다.
도 6은 백서향 추출물의 IFN-γ 생성능력의 최저활성 농도를 측정한 그래프이다.
도 7은 유동 추출물이 처리된 NK92 세포에서 IFN-γ mRNA의 발현을 RT-PCR을 통해 시간대별로 확인한 그림이다.
도 8은 백서향 추출물이 처리된 NK92 세포에서 IFN-α 및 γ mRNA의 발현을 RT-PCR을 통해 시간대별로 확인한 그림이다.
도 9는 Bay-ll(NF-κB 활성 억제자) 또는 로테린(PKC 활성억제자)의 처리에 따라 유동 추출물에 의해 유도되는 IFN-γ 생성 변화를 나타낸 그림이다.
도 10은 유동 또는 백서향 추출물이 처리된 NK92 세포의 활성에 관여하는 세포표면물질의 발현 변화를 FACS로 분석한 그림이다.
도 11은 인플루엔자 바이러스가 감염된 폐 상피세포주 A549 세포에서 유동 추출물의 처리에 의한 IFN-α 및 β의 mRNA 발현을 RT-PCR을 통해 확인한 그림이다.
이하, 본 발명에서 사용한 용어를 설명한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "추출물"은 당업계에서 조추출물(crude extract)로 통용되는 의미를 갖지만, 광의적으로는 하기 분획물도 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "분획물"은 추출 시 이용한 용매와 다른 용매를 이용하여 본 발명에서 목적으로 하는 활성을 분획하여 얻은 활성 분획물(fraction)을 의미한다.
본 발명에서 사용되는 용어 "예방"은 본 발명의 조성물의 투여로 바이러스성 질환을 억제시키거나 진행을 지연시키는 모든 행위를 의미한다.
본 발명에서 사용되는 용어 "치료" 및 "개선"은 본 발명의 조성물의 투여로 바이러스성 질환의 증상이 호전 또는 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다.
본 발명에서 사용되는 용어 "투여"는 임의의 적절한 방법으로 개체에 소정의 본 발명의 조성물을 제공하는 것을 의미한다.
본 발명에서 사용되는 용어 "개체"는 본 발명의 조성물을 투여하여 바이러스성 질환의 증상이 호전될 수 있는 질환을 가진 인간, 원숭이, 개, 염소, 돼지 또는 쥐 등 모든 동물을 의미한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "사료"는 가축의 생명을 유지하고 젖, 고기, 알, 털가죽 등을 생산하는 데 필요한 유기 또는 무기 영양소를 공급하는 물질을 의미한다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 유동(Aleurites fordii) 또는 백서향(Daphne kiusiana) 추출물을 유효성분으로 함유하는 바이러스성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
상기 유동 또는 백서향 추출물, 또는 이의 분획물은 당업계에 공지된 다양한 추출방법에 의해 수득할 수 있다.
상기 유동 또는 백서향 추출물은 하기의 단계들을 포함하는 제조방법에 의해 제조되는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다:
1) 유동(Aleurites fordii) 또는 백서향(Daphne kiusiana)에 추출용매를 가하여 추출하는 단계;
2) 단계 1)의 추출물을 식힌 후 여과하는 단계; 및
3) 단계 2)의 여과한 추출물을 감압농축한 후 건조하는 단계.
상기 방법에 있어서, 단계 1)의 유동 또는 백서향은 재배한 것 또는 시판되는 것 등 제한 없이 사용할 수 있다. 상기 유동은 건조된 잎, 줄기 또는 열매가 모두 사용가능하고, 상기 백서향은 건조된 잎, 줄기, 꽃 또는 뿌리가 모두 사용가능하다.
상기 추출용매는 당업계에서 통상적으로 이용하는 어떠한 추출용매도 사용가능하며, 물, 알코올 또는 이들의 혼합물을 사용하는 것이 바람직하다. 상기 알코올로는 C1 내지 C2 저급 알코올을 이용하는 것이 바람직하며, 저급 알코올로는 에탄올 또는 메탄올을 이용하는 것이 바람직하다. 추출방법으로는 진탕추출, 환류추출, 초임계추출 또는 아임계추출을 이용하는 것이 바람직하나 이에 한정하지 않는다. 상기 추출용매를 건조된 유동 또는 백서향 분량에 2 내지 20배 첨가하여 추출하는 것이 바람직하다. 추출온도는 20 내지 50℃인 것이 바람직하나 이에 한정하지 않는다. 또한, 추출시간은 10 내지 48시간인 것이 바람직하며, 24시간이 더욱 바람직하나 이에 한정하지 않는다. 아울러, 추출 회수는 3 내지 5회인 것이 바람직하며, 3회 반복 추출하는 것이 더욱 바람직하나 이에 한정하지 않는다.
상기 방법에 있어서, 단계 3)의 감압농축은 진공감압농축기 또는 진공회전증발기를 이용하는 것이 바람직하나 이에 한정하지 않는다. 또한, 건조는 감압건조, 진공건조, 비등건조, 분무건조 또는 동결건조하는 것이 바람직하나 이에 한정하지 않는다.
상기 유동 또는 백서향 추출물의 분획물은 유동 또는 백서향 추출물에 추가로 유기용매를 가하여 유기용매 분획물을 제조하는 단계를 포함하는 제조방법에 의해 제조되는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다:
상기 방법에 있어서, 상기 유기용매는 당업계에서 통상적으로 이용되는 어떠한 추출용매도 사용가능하며, C1 내지 C4의 무수 또는 함수 저급 알코올(메탄올, 에탄올, 프로판올, 부탄올, 노말-프로판올, 이소-프로판올 또는 노말-부탄올 등), 상기 저급 알코올과 물과의 혼합용매, 아세톤, 에틸아세테이트, 클로로포름, 1,3-부틸렌글리콜, 헥산, 디에틸에테르 또는 부틸아세테이트 등을 사용할 수 있다. 상기 유기용매는 헥산, 에틸아세테이트 또는 부탄올인 것이 바람직하나 이에 한정하지 않는다.
상기 유동 또는 백서향 추출물에 극성이 낮은 것부터 높은 것 순으로 헥산, 에틸아세테이트, 부탄올, 물을 순차적으로 가하여 각 유기용매 층의 분획물을 수득하는 것이 바람직하고, 분획물은 분별깔대기를 이용하여 분획하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다. 구체적으로, 유동 또는 백서향 추출물을 증류수에 현탁하고 헥산을 가하여 헥산층을 분리하고, 남은 물층에 다시 에틸아세테이트를 가하여 에틸아세테이트층을 분리하며, 남은 물층에 또 다시 부탄올을 가하여 부탄올 층을 분리할 수 있다. 각 유기용매 층의 분획물을 모두 이용할 수 있다.
상기 유동 또는 백서향 추출물, 또는 이의 분획물은 자연살해(natural killer, NK)세포에서 인터페론-감마(interferon-γ, IFN-γ)의 분비 유도 작용을 통해 항바이러스 활성을 나타내는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
상기 바이러스성 질환은 돼지인플루엔자바이러스(Swine Influenza virus, SIV), 인플루엔자바이러스(influenza virus), 신종인플루엔자A(Influenza A virus subtype H1N1), 조류인플루엔자바이러스(avian influenza virus), 리노바이러스(rhinovirus), 아데노바이러스(adenovirus), 코로나바이러스(coronavirus), 파라인플루엔자바이러스(parainfluenza virus), 호흡기 합포체 바이러스(respiratory syncytial virus), 포진 바이러스(Herpesvirus, HSV), 후천성 면역결핍 증후군 바이러스(human immunodeficiency virus, HIV) 및 간염바이러스로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 바이러스에 의해 감염되는 질환인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 조성물은 상기 성분에 추가로 동일 또는 유사한 기능을 나타내는 유효성분을 1종 이상 함유할 수 있다.
본 발명의 조성물은 총 중량에 대하여 상기 유동 또는 백서향 추출물, 또는 이의 분획물은 0.1 내지 50 중량부인 것이 바람직하나 이에 한정하지 않는다.
본 발명의 조성물은 상기 설명된 유효성분 이외에 약제학적으로 허용되는 담체를 포함할 수 있다. 본 발명의 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정하지 않는다. 본 발명의 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences(19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.
본 발명의 조성물의 적절한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다. 한편, 본 발명의 조성물의 경구 투여량은 1일 당 0.0001 ~ 100 ㎎/㎏(체중)인 것이 바람직하나 이에 한정하지 않는다.
본 발명의 조성물은 경구 또는 비경구로 투여할 수 있고, 비경구로 투여되는 경우, 정맥내 주입, 피하 주입, 근육 주입, 복강 주입, 경피 투여 등으로 투여할 수 있다. 본 발명의 조성물은 적용되는 질환의 종류에 따라, 투여 경로가 결정되는 것이 바람직하다.
본 발명의 조성물은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.
본 발명자들은 유동 또는 백서향 추출물 또는 이의 분획물의 항바이러스 활성을 알아보기 위해, 유동 또는 백서향 추출물, 또는 이들의 분획물의 인터페론-감마(interferon-γ, IFN-γ) 분비 유도능을 효소결합면역흡수분석(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)을 통하여 확인하였다. 그 결과, 유동 잎, 줄기 또는 열매 추출물, 또는 이의 분획물(n-헥산, 에틸아세테이트 또는 부탄올 분획물)은 NK세포에서 IFN-γ의 분비를 현저히 증가시켰고(표 1, 도 1 및 도 2 참조), 유동 추출물의 농도에 의존적으로 IFN-γ의 분비가 증가함을 확인하였다(도 5 참조). 또한, 각각의 백서향 잎, 줄기, 꽃 또는 뿌리 추출물, 또는 이의 분획물(n-헥산, 에틸아세테이트 또는 부탄올 분획물)은 NK세포에서 IFN-γ의 분비를 현저히 증가시키는 것으로 나타났고(표 2, 도 3 및 도 4 참조), 백서향 추출물의 농도에 의존적으로 IFN-γ의 분비가 증가함을 확인하였다(도 6 참조). IFN-γ의 mRNA 또한 유동 또는 백서향 추출물이 처리된 NK92 세포에서 현저하게 증가하였다(도 7 및 도 8 참조). 한편, 유동 추출물에 의한 IFN-γ 생성의 유도는 BayⅡ 처리에 의해 NK92 세포내에서 감소되는 것을 확인함으로써, 유동 추출물에 의한 IFN-γ 생성의 유도가 NF-κB 신호전달에 의해 매개된다는 것을 확인하였고, PKC 신호전달 억제자인 로테린의 처리에 의해 IFN-γ 생성이 감소됨으로써 NF-κB 신호전달의 상위신호전달자는 PKC의 활성에 의한 것임을 확인하였다(도 9). 유동 또는 백서향 추출물이 NK92 세포의 표면물질의 발현에 미치는 영향을 FACS 분석을 통해 확인한 결과, NK 세포의 활성에 관여하는 NKG2C 및 D의 발현이 현저하게 증가하였고, NK 세포의 자연살해 활성과 관련된 NKp44의 발현이 현저히 증가한 것으로 확인되었다(도 10 참조). 아울러, 유동 추출물을 인플루엔자 바이러스가 감염된 A529 세포에 처리함으로써 IFN-β 발현의 증가가 더욱 빨라지는 것을 확인하였다(도 11 참조). 이때, 상기 IFN-γ는 자연살해(natural killer, NK)세포에서 대식세포(macrophage) 활성자로 불릴 만큼 식세포 활성작용이 강하고, 면역 및 세포 반응을 생성하는 것으로 알려진 사이토카인이다. 이에, 유동 또는 백서향 추출물, 또는 이의 분획물이 IFN-γ의 분비를 유도함으로써 강력한 항바이러스 활성을 가짐을 확인하였다.
따라서 본 발명의 유동 또는 백서향 추출물, 또는 이의 분획물은 바이러스성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물로 유용하게 이용될 수 있음을 알 수 있다.
또한, 본 발명은 약학적으로 유효한 양의 유동 또는 백서향 추출물, 또는 이의 분획물을 유효성분으로 함유하는 약학적 조성물을 바이러스성 질환에 걸린 개체에 투여하는 단계를 포함하는 바이러스성 질환의 개선 또는 치료 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 약학적으로 유효한 양의 유동 또는 백서향 추출물, 또는 이의 분획물을 유효성분으로 함유하는 약학적 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 바이러스성 질환의 예방 방법을 제공한다.
상기 약학적으로 유효한 양이란 0.0001 내지 100 ㎎/㎏이고, 바람직하게는 0.001 내지 10 ㎎/㎏이나 이에 한정하지 않는다. 투여량은 특정 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여기간, 투여방법, 제거율, 질환의 중증도 등에 따라 변화될 수 있다.
상기 개체는 척추동물이고 바람직하게는 포유동물이며, 그보다 바람직하게는 쥐, 토끼, 기니아피크, 햄스터, 개, 고양이와 같은 실험동물이고, 가장 바람직하게는 침팬지, 고릴라와 같은 유인원류 동물이다.
상기 투여 방법은 경구 또는 비경구 투여할 수 있으며, 비경구 투여시 복강내주사, 직장내주사, 피하주사, 정맥주사, 근육내 주사, 자궁내 경막 주사, 뇌혈관내(intracerebroventricular) 주사 또는 흉부내 주사에 의해 투여될 수 있다.
상기 바이러스성 질환은 돼지인플루엔자바이러스(Swine Influenza virus, SIV), 인플루엔자바이러스(influenza virus), 신종인플루엔자A(Influenza A virus subtype H1N1), 조류인플루엔자바이러스(avian influenza virus), 리노바이러스(rhinovirus), 아데노바이러스(adenovirus), 코로나바이러스(coronavirus), 파라인플루엔자바이러스(parainfluenza virus), 호흡기 합포체 바이러스(respiratory syncytial virus), 포진 바이러스(Herpesvirus, HSV), 후천성 면역결핍 증후군 바이러스(human immunodeficiency virus, HIV) 및 간염바이러스로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 바이러스에 의해 감염되는 질환인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 유동 또는 백서향 추출물, 또는 이의 분획물은 자연살해(natural killer, NK)세포에서 면역 관련 사이토카인인 IFN-γ의 분비 유도성을 통해 강력한 항바이러스 활성을 나타내어 바이러스성 질환에 탁월한 효과가 있으므로, 바이러스성 질환의 예방 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있다.
또한, 본 발명은 유동 또는 백서향 추출물, 또는 이의 분획물을 유효성분으로 함유하는 바이러스성 질환의 예방 또는 개선용 건강식품을 제공한다.
상기 바이러스성 질환은 돼지인플루엔자바이러스(Swine Influenza virus, SIV), 인플루엔자바이러스(influenza virus), 신종인플루엔자A(Influenza A virus subtype H1N1), 조류인플루엔자바이러스(avian influenza virus), 리노바이러스(rhinovirus), 아데노바이러스(adenovirus), 코로나바이러스(coronavirus), 파라인플루엔자바이러스(parainfluenza virus), 호흡기 합포체 바이러스(respiratory syncytial virus), 포진 바이러스(Herpesvirus, HSV), 후천성 면역결핍 증후군 바이러스(human immunodeficiency virus, HIV) 및 간염바이러스로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 바이러스에 의해 감염되는 질환인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 유동 또는 백서향 추출물, 또는 이의 분획물을 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다.
본 발명의 건강식품은 식품 제조 시에 통상적으로 첨가되는 성분을 포함하며, 예를 들어, 단백질, 탄수화물, 지방, 영양소 및 조미제를 포함한다.
상기 식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 상기 유동 또는 백서향 추출물, 또는 이의 분획물을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소시지, 빵, 초콜릿, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알코올음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 건강식품을 모두 포함한다.
본 발명의 건강음료 조성물은 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물은 포도당, 과당과 같은 모노사카라이드, 말토스, 슈크로스와 같은 디사카라이드, 및 덱스트린, 사이클로덱스트린과 같은 폴리사카라이드, 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 감미제로서는 타우마틴, 스테비아 추출물과 같은 천연 감미제나, 사카린, 아스파르탐과 같은 합성 감미제 등을 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100 ㎖당 일반적으로 약 0.01 ~ 0.04 g, 바람직하게는 약 0.02 ~ 0.03 g 이다.
상기 외에 본 발명의 유동 또는 백서향 추출물, 또는 이의 분획물은 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그 밖에 본 발명의 유동 또는 백서향 추출물, 또는 이의 분획물은 천연 과일주스, 과일주스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 혼합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 크게 중요하진 않지만 본 발명의 조성물 100 중량부당 0.01 ~ 0.1 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.
본 발명의 유동 또는 백서향 추출물, 또는 이의 분획물은 NK 세포에서 면역 관련 사이토카인인 IFN-γ의 분비 유도성을 통해 강력한 항바이러스 활성을 나타내어 바이러스성 질환에 탁월한 효과가 있으므로, 바이러스성 질환의 예방 또는 개선용 건강식품에 유용하게 사용될 수 있다.
또한, 본 발명은 유동 또는 백서향 추출물, 또는 이의 분획물을 유효성분으로 함유하는 바이러스성 질환의 예방 또는 개선용 사료첨가제를 제공한다.
상기 바이러스성 질환은 돼지인플루엔자바이러스(Swine Influenza virus, SIV), 인플루엔자바이러스(influenza virus), 신종인플루엔자A(Influenza A virus subtype H1N1), 조류인플루엔자바이러스(avian influenza virus), 리노바이러스(rhinovirus), 아데노바이러스(adenovirus), 코로나바이러스(coronavirus), 파라인플루엔자바이러스(parainfluenza virus), 호흡기 합포체 바이러스(respiratory syncytial virus), 포진 바이러스(Herpesvirus, HSV), 후천성 면역결핍 증후군 바이러스(human immunodeficiency virus, HIV) 및 간염바이러스로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 바이러스에 의해 감염되는 질환인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
상기 사료첨가제는 항바이러스 효능을 가지므로 가금류, 가축 등에게 꾸준히 섭취하게 함으로써 바이러스성 질환을 예방할 수 있고, 이미 발생한 바이러스성 질환을 개선시킬 수 있다. 사료는 영양가, 주성분, 유통, 수분함량 배합상태 및 가공형태 등에 따라 여러 가지로 분류할 수 있으며, 상기 사료는 조사료, 농후사료, 보충사료, 단백질사료, 녹말사료, 지방질사료 또는 섬유질사료가 사용가능하나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 사료첨가제에는 유동 또는 백서향 추출물, 또는 이의 분획물이 0.1 ~ 20% 중량부, 지방분해효소(Lipase)가 0.001 ~ 0.01% 중량부, 제 3 인산칼슘이 1 ~ 20% 중량부, 비타민E가 0.01 ~ 0.1% 중량부, 효소분말이 1 ~ 10% 중량부, 유산균이 0.1 ~ 10% 중량부, 바실러스(Bacillus) 배양액이 0.01 ~ 10% 중량부 및 포도당은 20 ~ 90% 중량부로 구성되어 있는 것이 바람직하나, 특별히 이에 한정하는 것은 아니며, 유동 또는 백서향 추출물, 또는 이의 분획물이 유효량으로 첨가되어 있다면, 본 발명의 사료첨가제로서 가능하다.
상기 유효량이란, 가금류, 가축 등이 꾸준히 섭취하게 함으로써 바이러스성 질환을 예방하거나, 이미 발생한 바이러스성 질환을 개선할 수 있는 양을 의미한다. 또한, 첨가에 의한 이익을 넘는 악영향이 생기지 않는 양이 바람직하다.
또한 상기 사료첨가제는 추가적으로 가금류 및 가축 등에 허용되는 담체를 함유할 수 있다. 본 발명에 있어서는 상기 사료첨가제를 그대로 또는 공지의 담체, 안정제 등을 가할 수 있으며, 필요에 따라 비타민, 아미노산류, 미네랄 등의 각종 양분, 항산화제, 항생물질, 항균제 및 기타의 첨가제 등을 가할 수도 있으며, 그 형상으로서는 분체, 과립, 펠릿, 현탁액 등의 적당한 상태일 수 있다. 본 발명의 사료첨가제를 공급하는 경우는 가금류 및 가축 등에 대하여 단독으로 또는 사료에 혼합하여 공급할 수 있다.
본 발명의 유동 또는 백서향 추출물, 또는 이의 분획물은 NK 세포에서 면역 관련 사이토카인인 IFN-γ의 분비 유도성을 통해 강력한 항바이러스 활성을 나타내어 바이러스성 질환에 탁월한 효과가 있으므로, 바이러스성 질환의 예방 또는 개선용 사료첨가제에 유용하게 사용될 수 있다.
또한, 본 발명은 유동 또는 백서향 추출물, 또는 이의 분획물을 바이러스성 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물의 제조에 이용하는 용도를 제공한다.
또한, 본 발명은 유동 또는 백서향 추출물, 또는 이의 분획물을 바이러스성 질환 예방 또는 개선용 건강식품의 제조에 이용하는 용도를 제공한다.
아울러, 본 발명은 유동 또는 백서향 추출물, 또는 이의 분획물을 바이러스성 질환 예방 또는 개선용 사료첨가제의 제조에 이용하는 용도를 제공한다.
상기 바이러스성 질환은 돼지인플루엔자바이러스(Swine Influenza virus, SIV), 인플루엔자바이러스(influenza virus), 신종인플루엔자A(Influenza A virus subtype H1N1), 조류인플루엔자바이러스(avian influenza virus), 리노바이러스(rhinovirus), 아데노바이러스(adenovirus), 코로나바이러스(coronavirus), 파라인플루엔자바이러스(parainfluenza virus), 호흡기 합포체 바이러스(respiratory syncytial virus), 포진 바이러스(Herpesvirus, HSV), 후천성 면역결핍 증후군 바이러스(human immunodeficiency virus, HIV) 및 간염바이러스로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 바이러스에 의해 감염되는 질환인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 유동 또는 백서향 추출물, 또는 이의 분획물은 NK 세포에서 면역 관련 사이토카인인 IFN-γ의 분비 유도성을 통해 강력한 항바이러스 활성을 나타내어 바이러스성 질환에 탁월한 효과가 있으므로, 바이러스성 질환의 예방, 개선 또는 치료용 약학적 조성물, 건강식품, 또는 사료첨가제의 제조에 유용하게 사용될 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예 및 제조예에 의하여 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예 및 제조예는 본 발명을 구체적으로 예시하는 것이며, 본 발명의 내용이 실시예 및 제조예에 의해 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1> 유동 또는 백서향 추출물의 제조
<1-1> 유동( Aleurites fordii ) 잎, 줄기 또는 열매 메탄올 추출물의 제조
유동(Aleurites fordii)은 제주도 서귀포에서 채취하여, 건조된 유동 잎, 줄기 및 열매 각각 2 ㎏에 메탄올 4 ℓ를 가한 후, 상온에서 순환시키면서 24시간 동안 추출하여 여과 상층액을 회수하였다. 추출 후, 용매를 감압농축하여 유동 잎, 줄기 및 열매 메탄올 추출물을 각각 276 g, 120 g 및 100 g 수득하였다.
<1-2> 백서향 잎, 줄기, 꽃 또는 뿌리 메탄올 추출물
백서향(Daphne kiusiana)은 전남 무안에서 채취하여, 건조된 백서향 잎, 줄기, 꽃 또는 뿌리 각각 1 ㎏에 메탄올 4 ℓ를 가한 후, 상온에서 순환시키면서 24시간 동안 추출하여 여과 상층액을 회수하였다. 추출 후, 용매를 감압농축하여 백서향 잎, 줄기, 꽃 및 뿌리 메탄올 추출물을 각각 118 g, 140 g, 80 g 및 105 g 수득하였다.
<비교예 1> 원화 메탄올 추출물의 제조
항인플루엔자 바이러스 활성이 보고된 원화(Daphne genkwa)(대한민국 특허 출원번호:10-2009-0034132)는 경기도 용인에서 채취하였고, 원화 건조물을 사용하여 상기 <실시예 1> 추출물 제조방법에 따라 원화 메탄올 추출물을 제조하였다.
<실시예 2> 유동 또는 백서향 추출물로부터 분획물의 제조
<2-1> 유동 분획물의 제조
<2-1-1> 유동 노르말-헥산 분획물
상기 실시예 <1-1>에서 수득한 유동 잎, 줄기 및 열매 메탄올 추출물을 각각 증류수 1.5 ℓ에 현탁시키고, 노르말-헥산 1.5 ℓ를 가하여 혼합 후, 노르말-헥산가용성 분획부와 물가용성 분획부를 분리하였으며, 이 과정을 3회 반복 실시하여 노르말-헥산가용성 분획부를 여과, 감압농축하여 유동 잎, 줄기 및 열매 노르말-헥산 분획물을 각각 27.6 g, 28 g 및 4 g 수득하였다.
<2-1-2> 유동 에틸아세테이트 분획물
상기 실시예 <2-1-1>의 유동 잎, 줄기 및 열매 노르말-헥산 분획물을 분리하고 남은 각각의 나머지 분획부에 에틸아세테이트 1.5 ℓ를 가하여 혼합 후, 에틸아세테이트 분획부를 분리하였으며, 이 과정을 3회 반복 실시하여 에틸아세테이트 분획부를 여과, 감압농축하여 유동 잎, 줄기 및 열매 에틸아세테이트 분획물을 각각 80 g, 18 g 및 40 g 수득하였다.
<2-1-3> 유동 부탄올 분획물
상기 실시예 <2-1-2>의 유동 잎, 줄기 및 열매 에틸아세테이트 분획물을 분리하고 남은 각각의 나머지 분획부에 부탄올 1.5 ℓ를 가하여 혼합 후, 부탄올 분획부를 분리하였으며, 이 과정을 3회 반복 실시하여 부탄올 분획부를 여과, 감압농축하여 유동 잎, 줄기 및 열매 부탄올 분획물을 각각 55 g, 24 g, 및 12 g 수득하였다.
<2-2> 백서향 분획물의 제조
<2-2-1> 백서향 노르말-헥산 분획물
상기 실시예 <1-2>에서 수득한 백서향 잎, 줄기, 꽃 및 뿌리 메탄올 추출물로부터, 상기 실시예 <2-1-1>에 기재된 방법에 따라 백서향 노르말-헥산 분획물을 제조하여, 백서향 잎, 줄기, 꽃 및 뿌리 노르말-헥산 분획물을 각각 31 g, 36 g, 21 g 및 27 g 수득하였다.
<2-2-2> 백서향 에틸아세테이트 분획물
상기 실시예 <2-1-2>에 기재된 방법에 따라 백서향 에틸아세테이트 분획물을 제조하여, 백서향 잎, 줄기, 꽃 및 뿌리 에틸아세테이트 분획물을 각각 7 g, 8.4 g, 5 g 및 6 g 수득하였다.
<2-2-3> 백서향 부탄올 분획물의 제조
상기 실시예 <2-1-3>에 기재된 방법에 따라 백서향 부탄올 분획물을 제조하여, 백서향 잎, 줄기, 꽃 및 뿌리 부탄올 분획물을 각각 20 g, 24 g, 14 g 및 18 g 수득하였다.
<실시예 3> 유동 또는 백서향 추출물, 또는 이의 분획물의 인터페론-감마(interferon-γ, IFN-γ) 분비 유도 활성 확인
<3-1> 자연살해(natural killer, NK)세포의 배양
인터루킨-2(interleukin-2, IL-2) 의존성 자연살해(natural killer, NK)세포주 NK92(human NK lymphoma)는 미국 미생물보존센터(American Type Culture Collection, ATCC)로부터 구입하였다. NK92세포는 20% 우태아혈청(fetal calf serum, FCS)(HyClone, Logan, UT), 2 mM L-글루타메이트(glutamate), 100 ㎍/㎖ 페니실린(penicillin), 100 ㎍/㎖ 스트렙토마이신(streptomycin)(Life Technologies)을 포함하고 100 U/㎖의 IL-2(Chiron, Emeryville, CA)가 첨가된 α-MEM(α-minimal essential medium)(Life Technologies, Karlsruhe, Germany) 배지에서 37℃, 5% CO2 조건하에서 배양하였다.
<3-2> 효소결합면역흡수분석(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)을 통한 유동 또는 백서향 추출물, 또는 이의 분획물의 인터페론-감마(interferon-γ, IFN-γ) 분비 유도성 확인
상기 실시예 <3-1>에 따라 배양한 NK92 세포의 세포 배양액에 2 ㎍/㎖의 유동 잎, 줄기 또는 잎 추출물, 또는 이들의 분획물(노르말-헥산, 에틸아세테이트, 부탄올 또는 물 분획물), 또는 백서향 잎, 줄기, 꽃 또는 뿌리 추출물, 또는 이들의 분획물을 각각 처리하여 37℃에서 18시간 동안 배양한 후, 세포를 제거하고 상등액을 수득하였다. 각각의 NK92 세포의 세포 배양액에 존재하는 인간 IFN-γ의 정량은 상업적으로 구입가능한 모노클로날 항체(mAb)(Endogen)를 사용하여 제조자가 지시한 프로토콜에 따라 효소결합면역흡수분석(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)을 수행하였다. 이때, 원화 추출물 및 디메틸설폭사이드(Dimethylsulfoxide, DMSO)를 각각 양성(PC) 및 음성(NC)대조군으로 사용하였다. IFN-γ의 정량값은 3회 분석한 값의 평균±표준편차로서 표시하였다.
그 결과, 유동 추출물 또는 이의 분획물의 경우, 표 1 및 도 1에 나타낸 바와 같이, 유동 잎, 줄기 및 열매 메탄올 추출물을 처리한 각각의 NK92 세포에서는 약 1.7 ~ 2.0 ng/㎖의 IFN-γ가 분비되었다. 유동 잎, 줄기 또는 열매 추출물의 분획물인, 물층을 제외한 유기용매 분획물(노르말-헥산, 에틸아세테이트 또는 부탄올)을 처리한 경우에는, 노르말-헥산 분획물은 약 1.7 ~ 2.1 ng/㎖, 에틸아세테이트 분획물은 약 1.5 ~ 2.0 ng/㎖, 부탄올 분획물은 약 1.2 ~ 1.7 ng/㎖의 IFN-γ가 분비되었다. 유동 물 분획물은 약 0.3 ~ 0.4 ng/㎖의 IFN-γ를 분비하여, 유동 추출물 또는 유기용매 분획물에 비해 현저히 낮은 분비량을 보여 IFN-γ 분비 유도성이 거의 없는 것으로 나타났다. 유동 추출물 또는 이의 분획물을 처리한 세포는 모두 음성대조군(0.3 ng/㎖)에 비해 현저히 높은 IFN-γ 분비량을 나타냈다(표 1 및 도 1). 또한, 도 2에 나타낸 바와 같이, 유동 잎, 줄기 또는 열매 추출물의 분획물의 IFN-γ 분비 효과를 확인하였다(도 2). 이에, 유동 잎, 줄기 또는 열매 추출물, 또는 이의 분획물은 NK세포에서 IFN-γ의 분비 유도 활성을 가짐을 확인하였다.
한편, 백서향 추출물 또는 이의 분획물의 경우, 하기 표 2 및 도 3에 나타낸 바와 같이, 백서향 메탄올 추출물(잎, 줄기, 꽃 또는 뿌리)로 처리한 각각의 NK92 세포에서는 약 2.4 ~ 2.6 ng/㎖의 IFN-γ가 분비되었다. 백서향 잎, 줄기, 꽃 및 뿌리 추출물의 분획물인, 물층을 제외한 각각의 유기용매 분획물(노르말-헥산, 에틸아세테이트 또는 부탄올)을 처리한 경우에는 노르말-헥산 분획물이 약 1.7 ~ 1.8 ng/㎖, 에틸아세테이트 분획물이 약 1.4 ~ 1.8 ng/㎖, 부탄올 분획물이 1.6 ~ 1.9 ng/㎖의 IFN-γ 분비효과가 나타났다. 물 분획물의 경우에는 약 0.2 ~ 0.4 ng/㎖의 IFN-γ를 분비하여, IFN-γ 분비 유도성이 거의 없는 것으로 나타났다. 백서향 추출물 또는 분획물을 처리한 세포는 모두 음성대조군(0.3 ng/㎖)에 비해 현저히 높은 IFN-γ 분비량을 나타냈다(표 2 및 도 3). 또한, 도 4에 나타낸 바와 같이, 백서향 잎, 줄기 꽃 또는 뿌리 추출물의 분획물의 IFN-γ 분비 효과를 확인하였다(도 4). 이에, 백서향 잎, 줄기, 꽃 또는 뿌리 추출물, 또는 이의 분획물은 NK세포에서 IFN-γ의 분비를 촉진함을 확인하였다.
표 1
시료(2 ㎍/㎖) IFN-γ 분비량(ng/㎖)
유동 잎 메탄올 추출물　 1.7
노르말-헥산 분획물 2.0
에틸아세테이트 분획물 1.5
부탄올 분획물 1.2
물 분획물 0.4
유동 줄기 메탄올 추출물　 2.0
노르말-헥산 분획물 2.1
에틸아세테이트 분획물 1.9
부탄올 분획물 1.7
물 분획물 0.3
유동 열매 메탄올 추출물　 2.0
노르말-헥산 분획물 1.7
에틸아세테이트 분획물 2.0
부탄올 분획물 1.7
물 분획물 0.3
원화 메탄올 추출물 (양성대조군) 2.0
DMSO 음성대조군 0.3
표 2
시료(2 ㎍/㎖) IFN-γ 분비량(ng/㎖)
백서향 잎 메탄올 추출물　 2.5
노르말-헥산 분획물 1.7
에틸아세테이트 분획물 1.4
부탄올 분획물 1.6
물 분획물 0.4
백서향 줄기 메탄올 추출물　 2.6
노르말-헥산 분획물 1.8
에틸아세테이트 분획물 1.7
부탄올 분획물 1.8
물 분획물 0.5
백서향 꽃 메탄올 추출물　 2.4
노르말-헥산 분획물 1.8
에틸아세테이트 분획물 1.7
부탄올 분획물 1.7
물 분획물 0.3
백서향 뿌리 메탄올 추출물　 2.4
노르말-헥산 분획물 1.7
에틸아세테이트 분획물 1.8
부탄올 분획물 1.9
물 분획물 0.3
원화 메탄올 추출물 (양성대조군) 2.0
DMSO 음성대조군 0.3
<3-3> ELISA 분석을 통한 유동 또는 백서향 추출물의 농도에 따른 인터페론-감마(interferon-γ, IFN-γ) 분비 유도 활성 확인
유동 잎, 줄기 및 열매 메탄올 추출물, 백서향 메탄올 추출물 각각의 농도에 따른 INF-γ 분비량을 상기 실시예 <3-2>의 방법에 따라 수행하였다. 이때, 메탄올 추출물은 각각 0.01, 0.1, 1 또는 10 ㎍/㎖의 농도로 첨가하였다.
그 결과, 도 5에 나타낸 바와 같이, 유동 잎 메탄올 추출물은 1 ㎍/㎖ 이상의 농도에서 INF-γ의 분비량이 현저히 증가하였고, 유동 줄기 또는 열매 메탄올 추출물에서는 10 ㎍/㎖의 농도에서 INF-γ분비의 급격한 증가를 나타냈다(도 5). 또한, 도 6에 나타낸 바와 같이, 백서향 메탄올 추출물은 1 ㎍/㎖ 이상의 농도에서 INF-γ의 분비량이 현저히 증가하였다(도 6). 이에, 유동 또는 백서향 메탄올 추출물의 농도에 의존적으로 INF-γ 분비가 증가하는 것을 확인하였다.
<3-4> 인터페론-감마 분비 유도에 관련된 유전자 발현에 대한 유동 또는 백서향 추출물 또는 이의 분획물의 효과
NK92 세포에서 IFN-α 및 γ 유도에 관련된 mRNA 발현의 변화를 알아보기 위하여, RT-PCR을 수행하였다. NK92 세포 또는 폐 상피세포주인 A549를 2 ng의 유동 또는 백서향 추출물로 12 시간 동안 배양하였다. 배양 후 15분, 30분, 45분, 1시간, 4시간, 및 12시간 뒤에 세포를 용해시킨 후에 공지된 프로토콜에 따라 RNA를 분리하여 RT-PCR을 통해 IFN-γ mRNA 발현을 분석하였다. 이때 사용한 IFN-γ의 프라이머는 정방향 프라이머가 5'-TCCCATGGGTTGTGTGTTTA-3'이었고 역방향 프라이머는 5'-GTCAGGGTGCAGCCGG-3'이었으며, GAPDH를 내부 표준으로서 사용하였는데 이때 사용된 GAPDH 정방향 프라이머는 5'-CCATCACCATCTTCCAGGAG-3'이었고 역방향 프라이머는 5'-ACAGTCTTCTGGGTGGCAGT-3'을 사용하였다.
상기 RT-PCR 반응은 상기 프라이머쌍과 Taq 폴리머라아제(Takara, Shiga, Japan)를 사용하여 수행하였다. 총 RNA는 표준 프로토콜에 따라 분리하였고, cDNA는 제조자의 지시에 따라 AccuScript High Fidelity 1st Strand cDNA Synthesis Kit (Stratagene)를 사용하여 합성하였다. 합성한 1 ㎕의 cDNA 를 0.5 U ExTaq DNA 폴리머라아제, 1×buffer 및 1mM dNTP mix(Takara)와 상기 프라이머 쌍으로 이루어진 20 ㎕의 PCR 반응에 사용하였다. PCR 반응에 의한 증폭은 다음과 같은 조건에서 GeneAmp PCR system 2700(Applied Biosystems, Foster city, CA, USA)을 사용하여 수행하였다; 94℃에서 5분, 이어서 94℃에서 45초, 56℃에서 45초 및 72℃에서 1 분을 25 내지 40 사이클 행한 후, 최종 연장반응은 72℃에서 7분간 수행하였다. PCR 프라이머는 Primer3 프로그램을 사용하여 디자인하였으며 Bioneer사(대한민국, 대전)로부터 구입하였다. PCR 생성물은 1.5％ 아가로즈젤상에서 분리하여 브롬화 에티듐(ethidium bromide, EtBr)으로 염색하여 Gel Doc 2000 UV trans-illuminator (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA)로 시각화한 후에, Quantity One software(Bio-Rad Laboratories)를 사용하여 분석하였다. 각 샘플들은 3회 이상 테스트하였으며 대표 데이터를 제시하였다.
그 결과, 도 7에 나타낸 바와 같이, IFN-γ의 전사체는 유동 추출물이 처리된 NK92 세포에서 2시간 후에 현저하게 증가하였고, 이는 IFN-γ 유도를 위한 유동추출물에 대한 반응은 전사 수준에서 1 내지 2 시간 이내에 유도되었음을 알 수 있었다(도 7). 한편, 도 8에 나타낸 바와 같이, 백서향이 처리된 NK92 세포 및 폐 상피세포주인 A549 세포에서 IFN-γ 및 IFN-α mRNA 의 발현 양상을 시간대별로 확인한 결과, IFN-γ의 전사체는 백서향 추출물이 처리된 NK92 세포에서 3시간 후부터 현저하게 증가하였고, 이는 IFN-γ 유도를 위한 백서향 추출물에 대한 반응은 전사 수준에서 3시간 이내에 유도되었음을 알 수 있었다. A549 세포에 있어서는 백서향 추출물이 IFN-α mRNA의 발현 수준을 증가시키는 것으로 나타났다(도 8).
<실시예 4> 유동 추출물의 IFN-γ 생성 유도 효과에 대한 NF-κB 신호전달 경로 의존성 확인
유동 추출물의 IFN-γ 생성 유도 효과가 NF-κB 신호전달 경로에 의존적이라는 것을 입증하기 위하여, NF-κB 억제자인 BayII, 또는 PKC 신호전달 억제자인 로테린(Rotterin)을 유동 추출물과 함께 NK92 세포에 처리하였다.
그 결과, 도 9에 나타낸 바와 같이, 유동 추출물에 의한 IFN-γ 생성의 유도는 BayⅡ 처리에 의해 NK92 세포내에서 감소되었고, 이는 BayⅡ 농도에 의존적이었다. 이에, 유동 추출물에 의한 IFN-γ 생성의 유도가 NF-κB 신호전달에 의해 매개된다는 것을 알 수 있었다. 또한, PKC 신호전달 억제자인 로테린의 처리에 의해 IFN-γ 생성이 감소됨으로써 NF-κB 신호전달의 상위신호전달자는 PKC의 활성에 의한 것임을 알 수 있었다(도 9).
<실시예 5> 유동 또는 백서향 추출물의 세포표면물질에 대한 영향 확인
유동 또는 백서향 추출물이 처리된 NK92 세포의 활성에 관여하는 세포표면물질의 변화를 확인하기 위하여, 형광활성세포분류기(Fluorescence activated cell sorter, FACS)로 분석하였다. 이때, NK 세포의 활성 리간드(ligand)로 작용하는 NKG2A, C, 및 D, 자연살해활성과 관련된 NKp30, NKp44 및 Nkp46 세포표면물질의 발현을 분석하였다.
그 결과, 도 10에 나타낸 바와 같이, 유동 또는 백서향 추출물은 비슷한 NK92 세포의 표면물질 발현 양상을 나타냈고, NK 세포의 활성에 관여하는 NKG2C 및 D의 발현이 현저하게 증가하였으며, NK 세포의 자연살해 활성과 관련된 NKp44의 발현도 현저히 증가한 것으로 확인되었다(도 10).
<실시예 6> 바이러스가 감염된 폐 상피세포주에 대한 유동 추출물의 영향 확인
인플루엔자 바이러스가 감염된 세포에 대한 유동 추출물의 효과를 확인하기 위하여, 인플루엔자 바이러스가 침투된 폐 상피세포주인 A549 세포에 유동 추출물을 처리한 후 상기 실시예 <3-4>의 방법에 따라 RT-PCR을 실시하여 IFN-α 및 β 전사 활성도를 확인하였다.
그 결과, 도 11에 나타낸 바와 같이, 인플루엔자 바이러스가 처리된 A549 세포에서 24시간 후에 IFN-α 및 β의 발현이 나타났고, 유동 추출물을 상기 바이러스가 처리된 A529 세포에 처리함으로써 IFN-α의 발현량은 감소하였고, IFN-α 발현의 증가가 더욱 빨라지는 현상을 나타냈다(도 11).
상기와 같이, 본 발명의 유동 또는 백서향 추출물, 또는 이의 분획물은 항바이러스에 탁월한 효과가 있으므로 바이러스성 질환의 예방 및 치료용 약제, 또는 바이러스성 질환의 예방 및 개선용 건강식품 및 사료첨가제의 개발과 이들을 이용한 예방 또는 치료 방법 연구에 유용하게 이용될 수 있다.

Claims (17)

  1. 유동(Aleurites fordii) 또는 백서향(Daphne kiusiana) 추출물을 유효성분으로 함유하는 바이러스성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 유동 또는 백서향 추출물은 유동 또는 백서향 건조물을 물, C1~C2의 저급 알코올 또는 이들의 혼합용매로 추출한 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  3. 제 2항에 있어서, 상기 유동 건조물은 유동 잎, 줄기 또는 열매인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  4. 제 2항에 있어서, 상기 백서향 건조물은 백서향 잎, 줄기, 꽃 또는 뿌리인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  5. 제 2항에 있어서, 상기 저급 알코올은 에탄올 또는 메탄올인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  6. 제 1항의 유동 또는 백서향 추출물을 추가적으로 유기용매로 추출하여 제조된 유기용매 분획물을 유효성분으로 함유하는 바이러스성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  7. 제 6항에 있어서, 상기 유기용매는 헥산, 에틸아세테이트 또는 부탄올인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  8. 제 1항 또는 제 6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 바이러스성 질환은 돼지인플루엔자바이러스(Swine Influenza virus, SIV), 인플루엔자바이러스(influenza virus), 신종인플루엔자A바이러스(Influenza A virus subtype H1N1), 조류인플루엔자바이러스(avian influenza virus), 리노바이러스(rhinovirus), 아데노바이러스(adenovirus), 코로나바이러스(coronavirus), 파라인플루엔자바이러스(parainfluenza virus), 호흡기 합포체 바이러스(respiratory syncytial virus), 포진 바이러스(Herpesvirus, HSV), 후천성 면역결핍 증후군 바이러스(human immunodeficiency virus, HIV) 및 간염바이러스로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 바이러스에 의해 감염되는 질환인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  9. 유동 또는 백서향 추출물, 또는 이의 분획물을 유효성분으로 함유하는 바이러스성 질환의 예방 또는 개선용 건강식품.
  10. 제 9항에 있어서, 상기 바이러스성 질환은 돼지인플루엔자바이러스(Swine Influenza virus, SIV), 인플루엔자바이러스(influenza virus), 신종인플루엔자A바이러스(Influenza A virus subtype H1N1), 조류인플루엔자바이러스(avian influenza virus), 리노바이러스(rhinovirus), 아데노바이러스(adenovirus), 코로나바이러스(coronavirus), 파라인플루엔자바이러스(parainfluenza virus), 호흡기 합포체 바이러스(respiratory syncytial virus), 포진 바이러스(Herpesvirus, HSV), 후천성 면역결핍 증후군 바이러스(human immunodeficiency virus, HIV) 및 간염바이러스로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 바이러스에 의해 감염되는 질환인 것을 특징으로 하는 건강식품.
  11. 유동 또는 백서향 추출물, 또는 이의 분획물을 유효성분으로 함유하는 바이러스성 질환의 예방 또는 개선용 사료첨가제.
  12. 제 11항에 있어서, 상기 바이러스성 질환은 돼지인플루엔자바이러스(Swine Influenza virus, SIV), 인플루엔자바이러스(influenza virus), 신종인플루엔자A바이러스(Influenza A virus subtype H1N1), 조류인플루엔자바이러스(avian influenza virus), 리노바이러스(rhinovirus), 아데노바이러스(adenovirus), 코로나바이러스(coronavirus), 파라인플루엔자바이러스(parainfluenza virus), 호흡기 합포체 바이러스(respiratory syncytial virus), 포진 바이러스(Herpesvirus, HSV), 후천성 면역결핍 증후군 바이러스(human immunodeficiency virus, HIV) 및 간염바이러스로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 바이러스에 의해 감염되는 질환인 것을 특징으로 하는 사료첨가제.
  13. 약학적으로 유효한 양의 유동 또는 백서향 추출물, 또는 이의 분획물을 유효성분으로 함유하는 약학적 조성물을 바이러스성 질환에 걸린 개체에 투여하는 단계를 포함하는 바이러스성 질환의 개선 또는 치료 방법.
  14. 약학적으로 유효한 양의 유동 또는 백서향 추출물, 또는 이의 분획물을 유효성분으로 함유하는 약학적 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 바이러스성 질환의 예방 방법.
  15. 유동 또는 백서향 추출물, 또는 이의 분획물을 바이러스성 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물의 제조에 이용하는 용도.
  16. 유동 또는 백서향 추출물, 또는 이의 분획물을 바이러스성 질환 예방 또는 개선용 건강식품의 제조에 이용하는 용도.
  17. 유동 또는 백서향 추출물, 또는 이의 분획물을 바이러스성 질환 예방 또는 개선용 사료첨가제의 제조에 이용하는 용도.
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