WO2019203515A1 - 긴병꽃풀 추출물을 함유하는 벌레물림 치료제 - Google Patents

긴병꽃풀 추출물을 함유하는 벌레물림 치료제 Download PDF

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WO2019203515A1
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WO
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solution
extract
gingiva
flower
minutes
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PCT/KR2019/004507
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English (en)
French (fr)
Inventor
채정우
이진영
Original Assignee
경기도
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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K36/00—Medicinal preparations of undetermined constitution containing material from algae, lichens, fungi or plants, or derivatives thereof, e.g. traditional herbal medicines
    • A61K36/18—Magnoliophyta (angiosperms)
    • A61K36/185—Magnoliopsida (dicotyledons)
    • A61K36/53—Lamiaceae or Labiatae (Mint family), e.g. thyme, rosemary or lavender
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]

Definitions

  • the present invention relates to an insect bite treatment containing a medicinal herb extract.
  • Natural herbal medicines (hereinafter referred to as 'medicinal herbs') have been used effectively for many diseases through pharmacological activities such as anti-inflammatory and analgesic effects for a long time.
  • active ingredients in some herbal medicines activate the complement system of the human immune system. It has a great influence on the homeostasis of the body, such as strengthening the biodefense system against diseases.
  • 'Geumchocho' mentioned in the Chinese medicine literature is overworked in primrose; Lysimachia It is an outpost of christinae hance, and it is used to treat hepatobiliary diseases and stones of the urinary system because it has the effects of detoxification, canning, and small size.
  • Immunity is a kind of protective action for the body to protect itself from the invasion of microorganisms from the outside, where cells, molecules and tissues protect organs against infectious agents.
  • macrophages play a very important role in the immune system as part of the host's defense mechanism.
  • NO nitric oxide
  • PGE 2 phosphaglandin E 2
  • It can improve the production of cytokines and inhibit the growth of cancer cells and various harmful bacteria.
  • persistent and excessive chronic inflammatory reactions cause tissue damage in the body and play an important role as mediators of various diseases including endotoxin stimulation due to inflammatory cytokines or reactive oxygen species.
  • a heterodimer of toll like receptor 4 is converted to lipopolysaccharide (LPS), one of the inflammatory mediators in macrophages, when pathogens penetrate into our bodies.
  • LPS lipopolysaccharide
  • NF- ⁇ B nuclear factor- ⁇ B
  • iNOS inducible Nitric Oxide Synthase
  • COX-2 cyclooxygenase-2
  • cytokines cytokines.
  • Nitric oxide synthase (NOS) is used to synthesize NO as an indicator during L-arginine. NO is absolutely produced by iNOS in NOS. Excessive NO production promotes inflammatory responses, promotes biosynthesis of inflammatory mediators, and intensifies inflammation, resulting in tissue damage, genetic variation, and nerve damage.
  • COX-1 cyclooxygenase
  • COX-2 is expressed in macrophages in response to infection or damage caused by microorganisms and stress of various factors.
  • iNOS and COX-2 expression NO and PGE 2 are representative inflammatory factors of immune cells, and other inflammatory factors are TNF- ⁇ (Tumor necrosis factor), a pro-inflammatory cytokine. - ⁇ ), monocyte chemoattractant protein-1 (MCP-1), interleukin-1beta (IL-1 ⁇ , Interleukin-1 ⁇ ), interleukin-6 (IL-6, Interleukin-6), and the like. .
  • Insect bite treatment agent containing a medicinal herb extract according to an embodiment of the present invention is to include a herbal medicine.
  • the insect bite treatment agent containing the gingiva flower extract according to an embodiment of the present invention is to improve the stability of the therapeutic agent.
  • Insect bite treatment containing a medicinal herb extract according to an embodiment of the present invention is to improve the immune properties.
  • Insect bite treatment containing a gingiva flower extract according to an embodiment of the present invention is to improve the therapeutic properties.
  • Insect bite treatment containing a gingiva flower extract according to an embodiment of the present invention is to suppress inflammation and to relieve itching.
  • Insect bite treatment containing a medicinal herb extract according to an embodiment of the present invention is to improve the stability to temperature.
  • Insect bite treatment agent containing a gingiva flower extract according to an embodiment of the present invention is to inhibit the production of NO.
  • the insect bite treatment agent containing the gingiva flower extract according to an embodiment of the present invention is to suppress the expression of iNOS and COX-2.
  • Insect bite treatment agent containing a gingiva flower extract according to an embodiment of the present invention is to improve the electron donating ability.
  • Insect bite treatment agent containing a medicinal herb extract according to an embodiment of the present invention is to improve the ABTS scavenging properties.
  • the insect bite treatment agent containing the gingiva flower extract according to an embodiment of the present invention is to improve cell viability of the gingiva flower extract.
  • Insect bite treatment agent containing a gingiva flower extract is an extract of Glechoma grandis (A. Gray) Kuprian) as an active ingredient.
  • the pH of the therapeutic agent may be 5 to 8, preferably the pH may be 5 to 5.5.
  • the therapeutic agent may reduce the diameter of the swollen skin within 15 to 30% within 5 to 10 minutes after the insect bites.
  • the gingiva flower extract can inhibit the protein expression of COX-2 and the mRNA expression of COX-2.
  • a method for preparing insect bite treatment includes preparing a solution in which distilled water or cypress water is dispersed by dipping water with hycel (Hycel, Hydroxyethylcellulose), aloe moist and vegetable glycerin in the dispersed solution. (Glycerin) mixing to prepare a first solution, to prepare a gingkole powder, to prepare a second solution by adding a kerba powder to the first solution, and to add oil to the second solution And then mixing to prepare a medicinal herb.
  • hycel Hycel, Hydroxyethylcellulose
  • Distilled water or white water may be included in the 45 to 55 parts by weight, the high cell 0.1 to 2 parts by weight.
  • Aloe moist may contain 10 to 30 parts by weight, and vegetable glycerin (Glycerin) may be included in 1 to 3 parts by weight.
  • Long bottle powder may be included 1 to 5 parts by weight.
  • the method may further include heating the first solution.
  • the method may further include adding at least one of menthol or allantoin.
  • the method may further include mixing in an Agi mixer for 1 to 5 minutes so that no layer is formed in the third solution.
  • oil may be additionally included.
  • the oil may include at least one or more of lime essential oil, neroli essential oil, rosemary essential oil and eucalyptus essential oil, and may further include an emulsifier such as olive liquid, if necessary.
  • Method for producing gingival pulverulent powder, extracting stems and leaves of gingiflora, drying and grinding gingiflora, adding 8 times to 12 times the weight of the pulverized gingiva It may include the step of obtaining the gingiva flower extract, filtering the gingko blotch extract and then concentrating under reduced pressure to remove the solvent, and lyophilizing the kerba extract from which the solvent has been removed.
  • the gingiva flower extract may be extracted using an alcohol having 1 to 5 carbon atoms or a mixture thereof.
  • the gingiva flower extract may be obtained by repeating the step of separating the supernatant and the precipitate after immersing the pulverized gingiva flower sample in alcohol at room temperature for 20 to 30 hours. have.
  • Insect bite treatment agent containing a medicinal herb extract may include a herbal medicine, it may improve the stability of the therapeutic agent.
  • 1 is an image showing a insect bite treatment containing a medicinal herb extract of the present invention.
  • Figure 2 is an image showing the manufacturing process of the insect bite treatment containing a medicinal herb extract of the present invention.
  • Figure 3 is an image showing a clinical experiment of insect bites containing medicinal herbs extract according to the present invention.
  • Figure 4 is a graph showing the average value of skin response change of the experimenter according to Comparative Examples 1 to 3, Example 1.
  • Figure 5 is a graph showing the electron donating ability of the gingiva flower extract according to Example 2.
  • Figure 6 is a graph showing the ABTS scavenging ability of the gingiva flower extract according to Example 2.
  • Figure 7 is a graph showing the pH measurement results of the emulsion of 3% of the gingiva flower extract according to Example 2.
  • Figure 8 shows the cell viability of the gingiva ethanol extract of the present invention on macrophages.
  • Figure 9 is a graph showing the measurement results of NO production inhibition of the ethanol extract of Longfloweria paniculata of the present invention.
  • FIG. 10 is a graph illustrating a result of analyzing protein expression of a gingiva flower extract according to Example 2.
  • Figure 11 is a graph showing the iNOS and COX-2 mRNA expression inhibition results of the gingiva ethanol extract of the present invention in RAW264.7 cells.
  • Insects may include, but are not limited to, for example, mosquitoes, bees, vampire insects, bed bugs, spiders, mites, fleas, teeth, ants, mites, scabies, and the like.
  • distilled water DI water
  • Cyclic water is added to 45 to 55 parts by weight of Hycel (Hycel, Hydroxyethylcellulose) and dispersed.
  • a first solution is prepared by mixing 10 to 30 parts by weight of Aloe Moist and 1 to 3 parts by weight of vegetable glycerin (Glycerin) to this solution.
  • the first solution may include the step of heating by transferring to a water bath (waterbath).
  • the magnetic bar can be stirred into the second solution.
  • the gingiva flower powder is 1 part by weight or less, the effect of the insect bite treatment may not appear, and when 5 parts by weight or more, the gingiva flower powder may not be dissolved in ethanol and residues may remain.
  • a second solution is added to the first solution to prepare a third solution.
  • the third solution can be mixed for about 1 to 5 minutes with an Agi mixer so that no layer is formed.
  • menthol and allantoin as minor additives. 1 to 10 parts by weight of menthol and 5 to 15 parts by weight of allantoin are weighed and prepared, followed by addition of the third solution when mixing with an azi mixer.
  • a fourth solution is prepared by adding vegetable oils to the third solution to maintain skin texture and moisture retention when using the product.
  • Vegetable oils that can be added include 0.1 to 5 parts by weight of lime essential oil, 0.1 to 5 parts by weight of neroli essential oil, 0.1 to 5 parts by weight of rosemary essential oil, and 0.1 to 5 parts by weight of eucalyptus essential oil, followed by mixing to prepare a fourth solution. do.
  • the vegetable oil to add may be selected in whole or in part. If necessary, an emulsifier such as olive liquid may be additionally included, and may be included in an amount of 0.1 to 5 parts by weight.
  • the fourth solution may be prepared in an emulsion form, but is not limited thereto.
  • the fourth solution prepared refers to an insect bite treatment containing a medicinal herb extract.
  • Insect bites containing gingiva flower extract can relieve itching and reduce the diameter of swollen skin when bitten by insects.
  • the diameter may be reduced by about 15 to 40% compared to the state of bulging most within 3 to 20 minutes after being bitten by insects, and on average, the diameter may be reduced by more than 30% within 10 minutes, but is not limited thereto. Do not.
  • the insect bite treatment agent containing the gingiva flower extract according to the embodiment may exhibit a pH of about 5 to 8, preferably about 5 to 5.5 in pH.
  • Herbal extract according to the embodiment may be extracted by ethanol, preferably may be extracted by 70% (v / v) of ethanol.
  • the stem and leaves of the gingiflora are collected and hot-air dried (or natural shade dried or lyophilized) and then ground to prepare a sample.
  • An alcohol corresponding to 8 to 12 times the weight of the ground sample is prepared, added to the ground sample, and immersed at room temperature for about 20 to 30 hours to separate the supernatant from the precipitate.
  • the alcohol may be an alcohol having 1 to 5 carbon atoms or a mixture thereof, but is not limited thereto. This separation can be repeated three times in the same manner.
  • Each sample extract may be filtered and concentrated under reduced pressure to remove the solvent and then freeze-dried, and the sample may be stored at about -20 ° C. At this time, the freeze-dried sample refers to the extract of Longflower.
  • the anti-inflammatory effect of the medicinal herb extract was induced after inducing an inflammatory response using LPS in RAW264.7 cells.
  • RAW264.7 cells do not have a significant effect on the cell death of the ethanol extract of C. erythrophila, and the growth of RAW264.7 cells ( ) Is effective. At this time, the cytotoxicity may be measured by MTT assay of M. ethanol extract.
  • RAW264.7 cells can be used by treatment with dimethylsulfoxide (DMSO) at constant concentration for about 24 hours.
  • DMSO dimethylsulfoxide
  • Type I, II, and III There are three types of NOS in mammals, Type I, II, and III, which are divided into homologous enzymes according to their chemical properties. Unlike neuronal NOS of type I and endothelial NOS of type II, which are always present in cells, type III iNOS is produced only by stimuli such as cytokines, LPS and bacterial toxins in some cells. Can be expressed.
  • COX is a facilitating enzyme for the conversion of arachidonic acid to prostaglandin.
  • COX-1 is involved in the maintenance of body homeostasis, such as gastrointestinal protection and renal function regulation in most tissues. It is divided into COX-2, which increases intracellular expression at the site of inflammation by cleavage factor or cytokine.
  • 70% (v / v) ethanol 70% (v / v) extract according to the embodiment shows a cell viability of about 95.8% at a concentration of about 500 ⁇ g / ml in macrophages (Raw264.7), particularly at a concentration of about 500 ⁇ g / ml
  • the inhibition rate of nitric oxide production was about 37.4%.
  • mRNA expressions of iNOS and COX-2 may be inhibited in the gingiva extract as compared to vitamin C (Vit. C), which is a control group.
  • Echinacea extract can be used as an anti-inflammatory substance.
  • the medicinal herbaceous extract can be used as an immune enhancer to enhance the immune response.
  • the anti-inflammatory activity may show a NO production inhibitory effect. This test was derived from the Griess assay of LPS-stimulated RAW 264.7 cells.
  • the electron donating ability was performed by modifying the (EDA:: Electron donating abilities) Measurement experiment method of Blois (Blois MS 1199-1120 1958. Antioxidant determination by the use of a stable free radical Nature 26%) .
  • the antioxidant capacity measurement using ABTS radical is ABTS + cation decolorization assay method (Roberta R, Nicoletta P, Anna P, Ananth P, Min Y, Catherine RE.Antioxidant acitivity applying an improved ABTS radical cation decolorization assay.Free radical biology & Medicine (1999), 26. 1231-1237. Stability testing with temperature was performed with reference to Wilkinson et al. (Wilkinson JB, Moore RJ (Eds.). 1982.
  • RAW264.7 cells the cell line used in the experiment, were purchased from Korea Cell Line Bank (Dulbecco's modified eagle's medium), FBS (Fetal bovine serum), PBS (Phosphate buffered saline) and penicillin.
  • Penicillin / Streptomycin and Trypsin were purchased from Thermo Scientific Hyclone (USA) and Gibco BRL Co. (Grand Island, USA).
  • 3- [4,5-dimethylthiazol] -2-yl] -2,5-diphenyl-tetrazolium bromide (MTT) used for cytotoxicity measurements was purchased from Sigma-Aldrich Corporation (St. Louis, MO, USA), DMSO (dimethyl sulfoxide) was purchased from BioShop (Canada).
  • Lipopolysaccaride (LPS), grease reagent (gris regent), etc., which are used for anti-inflammatory measurement, are described in Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO, USA).
  • Western blots were purchased from Santa Cruz (CA, USA), with primary antibodies such as ⁇ -actin, iNOS, and COX-2 as primary antibodies and goat anti-rabbit.
  • the GoScript TM Reverse Transcription System for reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR) was purchased from Promega Corporation (Madison, Wisconsin, USA).
  • Rotary vacuum evaporator EYELA, Japan
  • microcentrifuge gyrozen, Korea
  • microscope Olympus, Japan
  • CO2 incubator Vision Scientific, Korea
  • microplate reader Tecan, Austria
  • PCR ASTEC Co, Japan
  • Davinch-Chemi TM imager CAS-400SM system Davinch-Chemi TM imager CAS-400SM system
  • UV transilluminator BioTop, Switzerland
  • mini-PROTEAN®Tetra Cell Bio-Rad, USA
  • mini Trans-Blot® Cell Bio-Rad, USA
  • Hycel Hydroxyethyl Cellulose
  • baekbaek water 1 part by weight of Hycel (Hycel, Hydroxyethyl Cellulose) is dispersed in 50 parts by weight of baekbaek water.
  • the solution is mixed with 20 parts by weight of Aloe Moist and 2 parts by weight of vegetable glycerin (Glycerin), and then transferred to a water bath to prepare a first solution.
  • 3 parts by weight of echinacea powder and 16 parts by weight of ethanol 70% (v / v) were mixed to prepare a second solution. Put a magnetic bar in the second solution and stir.
  • a second solution is added to the first solution, 4 parts by weight of menthol and 10 parts by weight of allantoin are added, followed by stirring while mixing to prepare a third solution.
  • a fourth solution is prepared by adding 0.1 parts by weight of lime essential oil, 0.1 parts by weight of neroli essential oil, 0.4 parts by weight of rosemary essential oil, and 0.4 parts by weight of eucalyptus essential oil to 2 parts by weight of olive liquid.
  • a fourth solution is added to the third solution and mixed with slow stirring to prepare an insect bite treatment containing a gingiva flower extract.
  • An insect bite treatment agent according to Example 1 an insect bite treatment agent of another product was prepared, and an experiment was performed to verify whether the treatment agent showed efficacy in humans.
  • Tables 1 and 2 are tables showing the skin reactions of the test subjects treated with insect bite treatment containing the gingiva flower extract after mosquito bites according to the embodiment.
  • the diameter of the swollen skin was measured when 2 minutes of mosquito bites and 20 minutes after the bite were performed on 2 persons in the experimenter 1 group and 4 persons in the experimenter 2 group.
  • the first and second groups of experimenters divided only the groups, and the experimenters experimented under the same conditions.
  • Example 1 (Experiment 1 group) One 2 Standard Deviation 3 minutes after bite 11.15 12.22 20 minutes after bite 11.07 11.73 Change value -0.08 -0.49 Change value mean -0.285 0.290
  • Example 1 (Experiment 2 group) One 2 3 4 Standard Deviation 3 minutes after bite 11.27 20.87 12.81 13.43 20 minutes after bite 7.55 17.35 12.88 8.74 Change value -3.72 -3.52 0.07 -4.69 Change value mean -2.965 2.087
  • Tables 3 and 4 are tables showing skin reactions of test subjects who did not receive any treatment after being bitten by mosquitoes according to Comparative Example 1. Four people in group 1 and 4 groups in group 2 were measured for 3 minutes after mosquito bite and 20 minutes after bite.
  • the test subjects who did not process any mosquito bites increased their diameter by 14.825 mm on average 20 minutes after the bite after 3 minutes after the bite.
  • the diameter increases by 4.348 mm on average.
  • Tables 5 and 6 are tables showing skin reactions of test subjects scratched after mosquito bites according to Comparative Example 2. Five subjects in group 1 and 2 groups in group 2 were measured for 3 minutes after mosquito bite and 20 minutes after bite.
  • the test subjects who scratched after mosquito bites increased on average 10.898 mm in diameter when 20 minutes passed after the bite after 3 minutes after the bite. In the group, the diameter increased by 2.850 mm on average.
  • Tables 7 and 8 are tables showing skin reactions of test subjects treated with other companies' insect bite treatments after being bitten by mosquitoes according to Comparative Example 3. Three people in Group 1 and 3 in Group 2 of the test subjects measured the diameter of the swollen skin when 3 minutes passed after mosquito bites and 20 minutes after the bite.
  • Comparative Example 3 (Group 1) One 2 3 Standard Deviation 3 minutes after bite 11.08 10.31 11.36 20 minutes after bite 25.92 21.06 32.42 Change value 14.84 10.75 21.06 Change value mean 15.550 5.192
  • Table 9 is a table showing the average value of skin response change of the experimenter according to Comparative Example 1.
  • Table 10 is a table showing the average skin response change value of the experimenter according to Comparative Example 2.
  • Table 11 is a table showing the average value of skin response change of the experimenter according to Comparative Example 3.
  • Table 12 is a table showing the average value of skin response change of the experimenter according to Example 1.
  • Table 13 is a table showing the average of the skin response change value of the experimenters according to Comparative Examples 1 to 3, Example 1 calculated using the following formula 1.
  • Comparative Example 1 showed an increase in diameter by 9.586 mm on average
  • Comparative Example 2 showed an increase in diameter by 8.599 mm on average
  • Comparative Example 3 by 8.575 mm on average
  • the increase in diameter was shown, the average decrease in diameter of Example 1 was -2.072 mm.
  • Comparative Example 2 compared to Comparative Example 1, in Comparative Example 2 was observed to increase the diameter width 25 to 30% swelling than the initial measurement and itching continued. In Comparative Example 3, itching was partially alleviated, but there was no change in diameter. When the therapeutic agent according to Example 1 was used, the itch was relieved, and an effect of reducing the swelling diameter of about 20 to 25% was observed.
  • Example 1 (Experiment 1 group + Experiment 2 groups) One 2 3 4 5 6 Standard Deviation 3 minutes after bite 11.15 12.22 11.27 20.87 12.81 13.43 20 minutes after bite 11.07 11.73 7.55 17.35 12.88 8.74 Change value -0.08 -0.49 -3.72 -3.52 0.07 -4.69 Change value mean -2.072 2.132
  • the gingiva flower extract showed an electron donating ability of about 20% at 500 ⁇ g / ml, it can be seen that the electron donating ability of about 50% at 1000 ⁇ g / ml.
  • ABTS 2,2'-azino-bis (3-ethyl-benzothiazoline-6-sulfonic acid)
  • ABTS + 2,2-azino-bis- (3-ethyl-benzo thiazoline) -6-sulfonic acid
  • 2.45 mM potassium persulfate were mixed and left at room temperature for 24 hours to form ABTS + . Thereafter, diluted with ethanol, 100 ⁇ l of the sample was added to ABTS + 100 ⁇ l, and the absorbance was measured at 700 nm.
  • ABTS scavenging extract began to exhibit ABTS scavenging activity (Inhibitation Rate,%) at 50 ⁇ g / ml concentration, and exhibited an scavenging activity of about 20% or less at 100 ⁇ g / ml concentration and about 80 at 500 ⁇ g / ml concentration. It can be seen that the scavenging ability of% is shown, and the scavenging ability is about 90% or more at 1000 ⁇ g / ml.
  • Example 2 The sample according to Example 2 was prepared, and the sample was stored at predetermined temperature conditions (0, 25, and 40 ° C) according to the stability test method according to the temperature, and the state change according to the change over time was evaluated under the conditions of Table 14. .
  • the average pH was found to be a distribution of 5.17, showing a stable pH without significant change in the value for 30 days.
  • the emulsion added with the gingiva flower extract stored at temperatures of 0, 25 and 40 ° C shows stability at all temperature conditions for 30 days.
  • the appearance of rancidity, discoloration, discoloration, viscosity, evaporation, flotation, precipitation, turbidity (transparency), separation, etc. was observed at high temperature (40 ° C), and coagulation, precipitation, turbidity (transparency), crystal precipitation separation, etc. The chemical and physical changes of were observed.
  • a medicinal herb extract according to Example 2 was prepared, and cytotoxicity was confirmed, which is shown in FIG. 7.
  • the MTT assay is a test method for measuring the amount of formazan produced by the mitochondrial respiratory chain using a yellow water-soluble substance MTT.
  • the cytotoxicity was measured using the MTT assay.
  • the survival rate was measured as 95.8% in the concentration of 500 ⁇ g / ml. It was confirmed that the toxicity was very low in RAW 264.7 cells. Therefore, the experiment was performed by setting 50, 100, 500 ⁇ g / ml, which does not affect cytotoxicity. At this time, cell viability was measured according to Carmichael's method.
  • FIG. 9 is a graph showing the cell viability of the gingiva ethanol extract for macrophages.
  • the effect of the gingiva flower extract on NO production in Raw264.7 cells was confirmed, and NO production was confirmed in LPS-induced Raw264.7 cells.
  • RAW264.7 cells Cells / wells were treated with 70% ethanol (v / v) extract and LPS (1 ⁇ g / ml) for about 24 hours. NO production is determined as the media supernatant by Griess reagent.
  • the LPS-treated group showed a higher NO expression level than the LPS-untreated group, and the group treated with the Medicinal Herb extract was found to reduce NO expression.
  • the inhibitory rate of 41.2% at a concentration of 500 ⁇ g / ml, overexpressing inflammation with LPS in macrophage cell line, inhibiting the inflammation with excellent results, ethanol extract of longflower plant is effective in inhibiting inflammation could confirm.
  • the amount of NO generated from RAW264.7 cells was measured in the form of NO 2 present in the cell culture solution using a grease reagent according to the method of Green et al. Raw 264.7 cells in 6 well plates The cells were dispensed at cells / ml.
  • a medicinal herb extract according to Example 2 was prepared and analyzed for protein expression, which is shown in FIG. 10. At this time, western blot was experimented to examine the effect of the extract of the gingiva flower on the protein expression of iNOS, COX-2 factor.
  • beta-actin ⁇ -actine
  • a housekeeping gene was used as a positive control in order to compare the amount of protein expression
  • vitamin C vitamin C
  • Figure 10 is a graph showing the iNOS and COX-2 expression rate of the Centella ethanol extract in RAW264.7 cells.
  • the left graph (A) shows the iNOS protein expression rate of the zinnia ethanol extract
  • the right graph (B) shows the COX-2 protein expression rate of the zinnia ethanol extract.
  • RAW264.7 cells Cells / wells were treated with SFM (serum free medium) for 1 hour and then for 24 hours at 50, 100 and 500 ⁇ g / ml. Each figure represents the mean ⁇ of each of the three experiments on average.
  • iNOS and COX-2 showed 92.73% and 26.90% expression levels at 500 ⁇ g / ml, which was the highest concentration of the gingiva flower extract, in the cell group treated with gingiva flower extract.
  • vitamin C which is a control group of iNOS and COX-2
  • the cell line RAW 264.7 was placed in a 100 mm tissue culture dish. Cells were stabilized by incubating for 24 hours after cell seeding with cells / well. After removing the medium, the LPS was treated at 1 ug / ml for 2 hours, and then the extract was incubated with the concentration-treated medium for 24 to 48 hours, and then the medium was removed again and washed twice with PBS. Complete mini 1 tab was dissolved in 10 ml of RIPA (radio-immunoprecipitation assay) buffer at 100 ul and centrifuged at 4, 13,200 rpm for 20 minutes.
  • RIPA radio-immunoprecipitation assay
  • the supernatant obtained by centrifugation was quantified by a BCA protein assay kit, and 20 ul of protein was separated by electrophoresis on a 10% acrylamide gel.
  • the separated protein was transferred to a polyvinylidene fluoride (PVDF) membrane using a transfer instrument (BIORAD) and incubated for 1 hour in a blocking buffer (5% skim milk in TBST) at room temperature.
  • PVDF polyvinylidene fluoride
  • BIORAD transfer instrument
  • Primary antibodies of iNOS, COX-2, and ⁇ -actin were diluted and left overnight at 4 ° C., and washed three times with tris-buffered saline and tween 20 (TBST) at 10 minute intervals.
  • a medicinal herb extract according to Example 2 was prepared, and total RNA isolation and cDNA synthesis analysis were performed.
  • RNA amount was measured.
  • a medicinal herb extract according to Example 2 was prepared, and PCR was performed to examine mRNA expression of iNOS and COX-2, which are shown in FIGS. 11 and 16.
  • the gingival bee extract was treated with 50, 100 and 500 ⁇ g / ml at different concentrations to perform mRNA expression by RT-PCR. Confirmed.
  • GAPDH which is a housekeeping gene, was used as a positive control group, and vitamin C was used as a control group to compare mRNA expression levels.
  • FIG. 11 is a graph showing iNOS and COX-2 mRNA expression rates of Euphorbia ethanol extract in RAW264.7 cells.
  • the left graph (A) shows the iNOS mRNA expression rate of the zinnia ethanol extract, and the right graph (B) shows the COX-2 mRNA expression rate of the zinnia ethanol extract.
  • RAW264.7 cells Cells / wells were treated with SFM (serum free medium) for 1 hour and then for 24 hours at 50, 100 and 500 ⁇ g / ml. Each figure represents the mean ⁇ of each of the three experiments on average.
  • Table 16 shows the sequence of primers via RT-PCR.
  • mRNA expression of iNOS and COX-2 was decreased in the cell group treated with C. eryngii extract, showing 82.08% and 84.61% inhibition at 500 ⁇ g / ml concentration, respectively.
  • the expression of iNOS was found to be significant in the expression of mRNA of the gingiva flower extract and the control group, and the expression of COX-2 was excellent.
  • PCR was performed as follows. First, 5X buffer (green Gotaq flexi buffer), MgCl2, PCR nucleotide mix (10mM), primer, GoTaq DNA polymerase, nuclease free water, synthesis One cDNA was added and mixed well, followed by PCR.
  • GAPDH and iNOS were 2 minutes at 96 ° C, 10 seconds at 96 ° C, 30 seconds at 64 ° C, 1 minute at 72 ° C, 10 minutes at 72 ° C (40 cycles), and COX-2 at 2 ° C at 96 ° C. , 10 seconds at 94 °C, 30 seconds at 51 °C, 1 minute at 72 °C, 10 minutes (72 cycles) at 72 °C.
  • 1.5% agarose gel containing 0.002% ethidium bromide was electrophoresed at 100 ° C for 40 minutes, and then quantified by LAS 4,000. .

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Abstract

본 발명은 긴병꽃풀 추출물을 함유하는 벌레물림 치료제로, 본 발명의 일 실시예에 따른 긴병꽃풀 추출물을 함유하는 벌레물림 치료제는 생약재를 포함할 수 있고, 치료제의 안정성을 향상시킬 수 있다. 또한, 면역 특성을 향상시킬 수 있고, 벌레물림 치료 특성을 향상시킬 수 있으며, 염증 억제, 가려움증 완화, 온도에 대한 안정성을 향상시킬 수 있다. 또한, NO의 활성 저해, iNOS 및 COX-2의 발현 억제, 전자공여능 특성 향상, ABTS 소거능 특성 향상 및 긴병꽃풀 추출물의 세포 생존력을 향상시킬 수 있다. {대표도} 도 1

Description

긴병꽃풀 추출물을 함유하는 벌레물림 치료제
본 발명은 긴병꽃풀 추출물을 함유하는 벌레물림 치료제에 관한 것이다.
천연물 약재(이하 ‘생약재’는 오랜 기간 동안 소염, 진통작용 등의 약리활성을 통해 많은 질병 치료에 효과적으로 사용되어 왔다. 이중 일부 생약재 내의 유효성분은 인체의 면역 시스템 중 보체계(Complement system)를 활성화시켜 질병에 대한 생체방어 시스템을 보강하는 등 인체의 생체 항상성(Homeostasis)에 큰 영향을 미친다.
한국에 분포하는 긴병꽃풀(Glechoma grandis (A. Gray) Kuprian)은 전남, 경남, 경기, 황해 이북에 나는 다년생 초본으로, 한국에서는 금전초의 대용으로도 사용하였다. 한의학 문헌에서 언급되는 ‘금전초’는 앵초과의 과로황; Lysimachia christinae Hance)의 전초이며, 청열해독, 통림, 소종 등의 효능을 가지고 있어 간담질환과 비뇨기계의 결석을 치료하는데 쓰인다.
여름철 모기 등 벌레물림 증상으로 발생되는 피부 가려움은 물린 직후부터 약 7일에서 10일간 이어지는 가려움으로 견디기가 어렵다. 이를 억제하기 위하여 벌레 물림에 관한 의약품을 이용하고 있으나, 이는 생약재를 포함하고 있지 않은 화합물로 이루어져 있거나 기존 비천연 화합물 제품에 천연유래 합성화학물질을 사용한 제품이 대부분으로서 피부가 연약한 이들에게는 적합하지 않을 수 있다.
벌레물림에 의한 가려움은 벌레의 타액에 들어있는 물질에 의해 생기는 염증으로 면역반응의 일종이라고 할 수 있다. 면역이란 인체가 외부로부터 미생물의 침입 과정에서 스스로를 지키기 위한 일종의 보호작용으로 세포, 분자, 조직들이 감염원에 대하여 기관들을 보호하는 것이다. 선천 면역계에서 대식세포는 숙주의 방어기구의 일부로서 면역계에서 매우 중요한 역할을 수행하여 외부물질의 침입으로 대식세포가 활성화되면 산화질소(Nitric Oxide, NO), 포스타글란딘 E2(PGE2)염증성 시토카인(Cytokine) 생성의 향상 및 암세포, 각종 유해균의 성장을 억제할 수 있다. 그러나 지속적이며 과도한 만성 염증반응은 체내의 조직 손상을 유발하며 이와 관련된 염증성 시토카인 또는 활성 산소종으로 인해서 내독소 자극을 포함한 다양한 질병의 매개체로써 중요한 역할을 한다.
염증반응의 대표적 예로서, 병원균이 우리 몸 내부로 침투하였을 때 대식세포에서 염증성 매개물질 중 하나인 지질다당류(Lipopolysaccharide, LPS)를 toll 유사수용체 4(toll like receptor 4, TLR4)의 이형이합체(heterodimerization) 형성으로 인식하고 세포내 전사인 핵인자-κB(nuclear factor-κB, NF-κB)의 활성화를 유도한다. NF-κB가 핵으로 이동 시 염증성 유도체 산화질소(iNOS, inducible Nitric Oxide Synthase), 사이클로옥시게나제-2(COX-2, Cyclooxygenase-2), 시토카인의 유전자 발현을 유도하게 되며, 산화질소 합성효소(NOS, Nitric oxide synthase)에 의해서 염증반응 시 지표물질인 NO가 L-아르기닌(L-arginine)으로부터 합성된다. NO는 NOS 중 iNOS에 의한 생성이 절대적으로 많으며 과도한 NO 생성은 염증반응을 촉진하고 염증 매개체의 생합성을 촉진하며 염증을 심화시켜 조직의 손상, 유전자 변이 및 신경손상 등을 일으킨다.
사이클로옥시게나제(COX, Cyclooxygenase)에 대한 연구는 1990년대 초반에 진행되었으며 COX-1, COX-2 두 가지로 나뉜다. COX-1은 대부분의 조직에서 발현되고, 프로스타글란딘(Prostaglandin)을 생산하여 신장의 혈액흐름 조절 또는 위장의 세포를 보호하는 등의 생리적 기능을 조절한다. COX-2의 경우 외부로부터 미생물에 의한 감염이나 손상 및 여러 요인의 스트레스에 반응하는 대식세포에서 발현된다. 즉 iNOS와 COX-2의 발현 및 NO, PGE2는 면역세포의 대표적 염증인자이며, 다른 염증인자로는 전염증성 시토카인(Pro-inflammatory cytokine)인 종양괴사인자-알파(TNF-α, Tumor necrosis factor-α), 단핵구화학주성단백질(MCP-1, Monocyte chemoattractant protein-1), 인터루킨-1베타(IL-1β, Interleukin-1β), 인터루킨-6(IL-6, Interleukin-6) 등이 포함된다.
종래 긴병꽃풀에 대한 선행연구로는 조(Jo)의 긴병풀꽃의 화학조성 분석과 전자공여능 및 아질산염 제거활성에 대한 연구와 김(Kim)의 긴병꽃풀 정유의 제초활성 연구, 박(Park)의 긴병꽃풀을 재배 시 비료 처리에 따른 정유성분을 비교한 연구, 이(Lee)의 긴병풀꽃 추출물이 스트렙토조토신(Streptozotocin)이 유발시킨 당뇨에 미치는 영향에 대한 연구가 있다. 또한, 이(Lee)는 금전초 열수 추출물이 지방다당류(LPS)와 재조합인터페론-감마(rIFN-γ)로 유도한 NO 생성을 농도의존적으로 억제시키며 IL-12, TNF-α, IL-6 등 세포활성물질의 생성을 증가시킨다고 보고하였다.
그러나 에탄올 추출을 이용한 긴병꽃풀 추출물의 염증완화 작용과 벌레물림 관련 연구는 본 발명자 이전에는 시행되지 않았다.
본 발명의 일 실시예에 따른 긴병꽃풀 추출물을 함유한 벌레물림 치료제는 생약재를 포함하기 위한 것이다.
본 발명의 일 실시예에 따른 긴병꽃풀 추출물을 함유한 벌레물림 치료제는 치료제의 안정성을 향상시키기 위한 것이다.
본 발명의 일 실시예에 따른 긴병꽃풀 추출물을 함유한 벌레물림 치료제는 면역 특성을 향상시키기 위한 것이다.
본 발명의 일 실시예에 따른 긴병꽃풀 추출물을 함유한 벌레물림 치료제는 치료 특성을 향상시키기 위한 것이다.
본 발명의 일 실시예에 따른 긴병꽃풀 추출물을 함유한 벌레물림 치료제는 염증을 억제시키고, 가려움증을 완화시키기 위한 것이다.
본 발명의 일 실시예에 따른 긴병꽃풀 추출물을 함유한 벌레물림 치료제는 온도에 대한 안정성을 향상시키기 위한 것이다.
본 발명의 일 실시예에 따른 긴병꽃풀 추출물을 함유한 벌레물림 치료제는 NO의 생성을 저해하기 위한 것이다.
본 발명의 일 실시예에 따른 긴병꽃풀 추출물을 함유한 벌레물림 치료제는 iNOS 및 COX-2의 발현을 억제하기 위한 것이다.
본 발명의 일 실시예에 따른 긴병꽃풀 추출물을 함유한 벌레물림 치료제는 전자공여능 특성을 향상시키기 위한 것이다.
본 발명의 일 실시예에 따른 긴병꽃풀 추출물을 함유한 벌레물림 치료제는 ABTS 소거능 특성을 향상시키기 위한 것이다.
본 발명의 일 실시예에 따른 긴병꽃풀 추출물을 함유한 벌레물림 치료제는 긴병꽃풀 추출물의 세포 생존력을 향상시키기 위한 것이다.
상기 과제 이외에도 구체적으로 언급되지 않은 다른 과제를 달성하는데 본 발명에 따른 실시예가 사용될 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따른 긴병꽃풀 추출물을 함유한 벌레물림 치료제는 긴병꽃풀(Glechoma grandis (A. Gray) Kuprian) 추출물을 유효성분으로 한다.
상기 치료제의 pH는 5 내지 8일 수 있고, 바람직하게는 pH는 5 내지 5.5일 수 있다.
상기 치료제는 벌레에 물린 후 5~10분 이내에 부풀어 오른 피부의 직경을 15 내지 30% 감소시킬 수 있다.
긴병꽃풀 추출물은 COX-2의 단백질 발현 및 COX-2의 mRNA 발현을 억제할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따른 벌레물림 치료제 제조방법은, 증류수 또는 편백워터에 하이셀(Hycel, Hydroxyethylcellulose)을 넣어 분산시킨 용액을 준비하는 단계, 분산시킨 용액에 알로에 모이스트(Aloe Moist) 및 식물성 글리세린(Glycerin)을 혼합하여 제1 용액을 제조하는 단계, 긴병꽃풀 파우더를 제조하는 단계, 제1 용액에 긴병꽃풀 파우더를 첨가하여 제2 용액을 제조하는 단계, 그리고 제2 용액에 오일을 첨가한 후 혼합하여 긴병꽃풀 치료제를 제조하는 단계를 포함한다.
증류수 또는 편백워터는 45 내지 55중량부, 하이셀은 0.1 내지 2 중량부 포함될 수 있다.
알로에 모이스트는 10 내지 30 중량부, 식물성 글리세린(Glycerin)은 1 내지 3 중량부 포함될 수 있다.
긴병꽃풀 파우더는 1 내지 5 중량부 포함될 수 있다.
제1 용액을 제조하는 단계에서, 제1 용액을 가열하는 단계를 더 포함할 수 있다.
제3 용액을 제조하는 단계에서, 멘톨(Menthol) 또는 알란토인(Allantoin) 중 적어도 하나 이상을 첨가하는 단계를 더 포함할 수 있다.
제3 용액을 제조하는 단계에서, 제3 용액에 층이 생기지 않도록 아지 믹서(Agi mixer)로 1 내지 5분간 혼합하는 단계를 더 포함할 수 있다.
긴병꽃풀 치료제를 제조하는 단계에서, 오일이 추가적으로 포함될 수 있다. 상기 오일은 라임 에센셜 오일, 네롤리 에센셜 오일, 로즈마리 에센셜 오일, 유칼립투스 에센셜 오일 중 적어도 하나 이상을 포함할 수 있으며, 필요에 따라 올리브 리퀴드(Olive liquid)와 같은 유화제를 추가적으로 포함할 수 있다.
긴병꽃풀 파우더의 제조방법은, 긴병꽃풀의 줄기 및 잎을 채취하는 단계, 긴병꽃풀을 건조한 후 분쇄하는 단계, 분쇄한 긴병꽃풀 중량의 8배 내지 12배에 해당하는 알코올을 첨가하여 긴병꽃풀 추출물을 얻는 단계, 긴병꽃풀 추출물을 여과한 후 감압 농축하여 용매를 제거하는 단계, 그리고 용매가 제거된 긴병꽃풀 추출물을 동결건조하는 단계를 포함할 수 있다.
긴병꽃풀 추출물은 탄소수 1 내지 5의 알코올 또는 이들의 혼합물을 이용하여 추출한 것일 수 있다.
알코올을 첨가하여 긴병꽃풀 추출물을 얻는 단계에서, 긴병꽃풀 추출물은 분쇄한 긴병꽃풀 시료를 실온에서 20 내지 30시간 동안 알코올에 침지한 후 상등액과 침전물을 분리하는 단계를 반복하여 얻은 것일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따른 긴병꽃풀 추출물을 함유하는 벌레물림 치료제는 생약재를 포함할 수 있고, 치료제의 안정성을 향상시킬 수 있다. 또한, 면역 특성을 향상시킬 수 있고, 벌레물림 치료 특성을 향상시킬 수 있으며, 염증 억제, 가려움증 완화, 온도에 대한 안정성을 향상시킬 수 있다. 또한, NO의 활성 저해, iNOS 및 COX-2의 발현 억제, 전자공여능 특성 향상, ABTS 소거능 특성 향상 및 긴병꽃풀 추출물의 세포 생존력을 향상시킬 수 있다.
도 1은 본 발명의 긴병꽃풀 추출물을 함유한 벌레물림 치료제를 나타내는 이미지이다.
도 2는 본 발명의 긴병꽃풀 추출물을 함유한 벌레물림 치료제의 제조 과정을 나타내는 이미지이다.
도 3은 본 발명에 따른 긴병꽃풀 추출물을 함유한 벌레물림 치료제의 임상실험을 나타내는 이미지이다.
도 4는 비교예 1 내지 3, 실시예 1에 따른 실험자들의 피부 반응 변화 값 평균을 나타내는 그래프이다.
도 5는 실시예 2에 따른 긴병꽃풀 추출물의 전자공여능을 나타내는 그래프이다.
도 6는 실시예 2에 따른 긴병꽃풀 추출물의 ABTS 소거능을 나타내는 그래프이다.
도 7은 실시예 2에 따른 긴병꽃풀 추출물을 3% 첨가한 에멀젼의 pH 측정 결과를 나타내는 그래프이다.
도 8은 대식세포에 대한 본 발명의 긴병꽃풀 에탄올 추출물의 세포 생존 능력을 나타낸 것이다.
도 9는 본 발명의 긴병꽃풀 에탄올 추출물의 NO 생성저해 측정 결과를 나타내는 그래프이다.
도 10은 실시예 2에 따른 긴병꽃풀 추출물을 준비하고, 단백질 발현 분석 결과를 나타내는 그래프이다.
도 11은 RAW264.7 세포에서 본 발명의 긴병꽃풀 에탄올 추출물의 iNOS 및 COX-2 mRNA 발현 억제 결과를 나타내는 그래프이다.
첨부한 도면을 참고로 하여 본 발명의 실시예에 대해 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 상세히 설명한다. 본 발명은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며 여기에서 설명하는 실시예에 한정되지 않는다. 또한 널리 알려져 있는 공지기술의 경우 그 구체적인 설명은 생략한다.
명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성요소를 "포함"한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다.
도 1 및 2를 참조하여, 실시예에 따른 긴병꽃풀 추출물을 함유한 벌레물림 치료제의 제조 방법을 설명한다.
벌레는, 예를 들어, 모기, 벌, 흡혈 곤충, 빈대, 거미, 진드기, 벼룩, 이, 개미, 응애, 옴 등을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
우선, 증류수(DI water) 또는 편백워터 45 내지 55 중량부에 하이셀(Hycel, Hydroxyethylcellulose) 0.1 내지 2 중량부를 넣어 분산시킨다. 이 용액에 알로에 모이스트(Aloe Moist) 10 내지 30 중량부, 식물성 글리세린(Glycerin) 1 내지 3 중량부를 혼합하여 제1 용액을 제조한다. 이때, 제1 용액은 워터배스(waterbath)로 옮겨 담아 가열하는 단계를 포함할 수 있다.
다음으로, 긴병꽃풀 파우더 1 내지 5 중량부와 식물성 에탄올 10 내지 20 중량부를 혼합하여 제2 용액을 제조한다. 이때, 제2 용액에 마그네틱 바를 넣어 교반할 수 있다. 예를 들어, 긴병꽃풀 파우더가 1 중량부 이하일 경우, 벌레물림 치료제의 효과가 나타나지 않을 수 있으며, 5 중량부 이상일 경우, 긴병꽃풀 파우더가 에탄올에 잘 용해되지 않고 찌꺼기가 남을 수 있다.
이어서, 제1 용액에 제2 용액을 투입하여 제3 용액을 제조한다. 제3 용액은 층이 생기지 않도록 아지 믹서(Agi mixer)로 약 1 내지 5분간 혼합할 수 있다. 이 단계에서 부 첨가물로 멘톨과 알란토인 첨가가 가능하다. 멘톨(Menthol) 1 내지 10 중량부와 알란토인(Allantoin) 5 내지 15 중량부를 계량하여 각각 준비한 후 제3용액을 아지 믹서로 혼합할 때 첨가하도록 한다.
다음으로, 제3 용액에 제품 사용시 피부 감촉과 보습성을 유지시키기 위한 식물성 오일류를 첨가하여 제4용액을 제조한다. 첨가 가능한 식물성 오일류는 라임 에센셜오일 0.1 내지 5 중량부, 네롤리 에센셜 오일 0.1 내지 5 중량부, 로즈마리 에센셜 오일 0.1 내지 5 중량부, 유칼립투스 에센셜 오일 0.1 내지 5 중량부를 첨가한 후 혼합하여 제4 용액을 제조한다. 첨가하는 식물성 오일은 전체 또는 일부가 선택 가능하다. 필요에 따라 올리브 리퀴드(Olive liquid)와 같은 유화제를 추가적으로 포함할 수 있으며, 0.1 내지 5 중량부로 포함될 수 있다. 이때, 제4 용액은 에멀젼 형태로 제조될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 제조된 제4 용액은 긴병꽃풀 추출물을 함유한 벌레물림 치료제를 말한다. 긴병꽃풀 추출물을 함유한 벌레물림 치료제는 벌레에 물렸을 때, 가려움증을 해소시킬 수 있고, 부풀어오른 피부의 직경을 감소시킬 수 있다. 이때, 직경은 벌레에 물린 후 3분 내지 20분 이내에 가장 많이 부풀어 오른 상태에 비하여 약 15 내지 40% 정도 감소할 수 있고, 평균적으로 10분 이내에 직경이 30%이상 감소할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
실시예에 따른 긴병꽃풀 추출물을 함유하는 벌레물림 치료제는 pH 약 5 내지 8, 바람직하게는 pH로 약 5 내지 5.5를 나타낼 수 있다.
또한, 온도 0℃ 내지 50℃에서, 상대적으로 저온에서는 응고, 침전, 탁도(투명도), 그리고 결정석출 분리 등의 화학적, 물리적 변화가 안정적으로 나타나고, 상대적으로 고온에서는 안정적인 외관의 산패, 변색, 변취, 점도, 증발, 부유, 침전, 탁도(투명도), 그리고 분리 특성이 유지될 수 있다.
실시예에 따른 긴병꽃풀 추출물은 에탄올에 의해 추출될 수 있으며, 바람직하게는 에탄올 70%(v/v)에 의해 추출될 수 있다.
우선, 긴병꽃풀의 줄기와 잎을 채취하여 열풍건조(또는 자연 음지건조 또는 동결건조)한 후 분쇄하여 시료를 준비한다. 분쇄한 시료 중량의 8배 내지 12배에 해당하는 알코올을 준비하여, 분쇄한 시료에 첨가하고, 실온에서 약 20 내지 30시간 침지하여 상등액과 침전물을 분리한다. 이때, 알코올은 탄소수 1 내지 5의 알코올 또는 이들의 혼합물일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 이러한 분리 과정을 동일한 방법으로 3회 반복 추출할 수 있다. 각 시료 추출물은 여과한 후 감압 농축하여 용매를 제거 후 동결 건조할 수 있으며, 이 시료를 약 -20℃ 온도에서 보관할 수 있다. 이때, 동결 건조된 시료는 긴병꽃풀 추출물을 말한다.
실시예에 따른 긴병꽃풀 추출물에 대하여, RAW264.7 세포에서 LPS를 이용하여 염증 반응을 유도한 후 긴병꽃풀 추출물의 항염증 효과를 확인하였다.
도 7을 참조하면, RAW264.7 세포에서 긴병꽃풀 에탄올 추출물의 세포 사멸에 큰 영향을 미치지 않으며, RAW264.7 세포의 성장(
Figure PCTKR2019004507-appb-I000001
)에 효과가 있다. 이때, 세포 독성은 긴병꽃풀 에탄올 추출물의 MTT 분석(MYY assay)에 의해 측정될 수 있다. RAW264.7 세포는 일정 농도에서 약 24시간 동안 디메틸설폭사이드(DMSO) 처리하여 이용될 수 있다.
포유동물에서의 NOS는 타입(Type) Ⅰ, Ⅱ, Ⅲ 이 3가지로 화학적 성상에 따라 동종 효소로 나뉜다. Type Ⅰ인 뉴런의(Neuronal) NOS, 세포 내에 항상 존재하고 있는 type Ⅱ인 내피의(Endothelial) NOS와 달리 type Ⅲ인 iNOS는 일부 세포에서 시토카인(Cytokine), LPS 및 박테리아 독소와 같은 자극들에 의해서만 발현될 수 있다. COX는 아라키돈산(Arachidonic acid)를 포스타글란딘(Prostaglandin)으로 변화시키기 위한 촉진 효소로써, 대부분의 세포조직에서 위장관 보호 및 신장 기능 조절과 같은 신체 항상성 유지에 관여하는 COX-1, 면역반응 시 세포분열인자나 시토카인에 의해 염증의 부위에서 세포 내 발현이 증가하는 COX-2로 나뉜다.
실시예에 따른 긴병꽃풀 에탄올 70%(v/v) 추출물은 대식세포(Raw264.7)에서 약 500 μg/ml 농도에서 약 95.8%의 세포 생존율을 보이며, 특히 약 500 μg/ml의 농도에서 약 37.4%의 NO(Nitric oxide) 생성 저해율을 나타내었다. 웨스턴블랏(Western blot)과 RT-PCR을 이용한 실험에서, 대조군인 비타민C(Vit. C)와 비교하였을 때 긴병꽃풀 추출물에서 iNOS 및 COX-2의 mRNA 발현이 억제될 수 있다. 따라서, 긴병꽃풀 추출물은 항염증 물질로 쓰일 수 있다. 또한, 천연물질인 긴병꽃풀 추출물은 면역 증강제로 쓰여 면역 반응을 강화시킬 수 있다. 이때, 항염증 활성은 NO 생성 억제 효과를 보일 수 있다. 이러한 시험은, LPS로 자극된 RAW 264.7 세포의 NO 생성 저해 시험(Griess assay)으로 도출된 것이다.
이하, 실시예를 들어 본 발명에 대해서 더욱 상세하게 설명할 것이나, 하기의 실시예는 본 발명의 실시예일뿐 본 발명이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예들에서, 전자공여능(EDA: Electron donating abilities) 측정 실험은 Blois의 방법(Blois MS. 1958. Antioxidant determination by the use of a stable free radical. Nature 26: 1199-1120.)을 변형하여 시행하였다. 또한, ABTS radical을 이용한 항산화능력 측정은 ABTS+ cation decolorization assay방법(Roberta R, Nicoletta P, Anna P, Ananth P, Min Y, Catherine RE. Antioxidant acitivity applying an improved ABTS radical cation decolorization assay. Free radical biology & Medicine. (1999). 26. 1231-1237.)에 의하여 측정하였다. 온도에 따른 안정성 시험은 Wilkinson 등의 방법 (Wilkinson JB, Moore RJ (Eds.). 1982. Harry's cosmeticology. Chemical Publishing Co, Inc. New York. 749.)을 참조하여 수행하였다. 또한, 세포 배양은 10% 소태아혈청(FBS)과 1% 페니실린/스테렙토마이신(penicillin/streptomycin)(100 Ｕ/ml)을 첨가한 DMEM 배지를 사용하였으며, 37℃, 5% CO2 인큐베이터(incubator)에 적응시켜 계대 배양하였다. 실험에 사용한 세포주인 RAW264.7 cell은 한국 세포주 은행(Korea Cell Line Bank)으로부터 구입하였으며, 세포 배양에 사용한 DMEM(Dulbecco's modified eagle's medium), FBS(Fetal bovine serum), PBS(Phosphate buffered saline), 페니실린/스테렙토마이신(Penicillin/Streptomycin), 트립신(Trypsin)은 Thermo Scientific Hyclone (USA) 및 Gibco BRL Co.(Grand Island, USA)에서 구입하여 사용하였다. 세포 독성 측정에 사용된 3-[4,5-dimethylthiazol]-2-yl]-2,5-diphenyl-tetrazolium bromide (MTT)는 Sigma-Aldrich Corporation (St. Louis, MO, USA)에서 구입하였으며, DMSO(dimethyl sulfoxide)는 BioShop(Canada)에서 구입하여 사용하였다. 항염증 측정에 사용된 시약인 lipopolysaccaride (LPS), 그리스 시약(griess regent) 등은 Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO, USA)에서 구입하였다. Western blot에 β-actin, iNOS, COX-2의 1차 항체(primary antibody)와 goat anti-rabbit 등의 2차 항체(secondary antibody)는 Santa Cruz (CA, USA)에서 구입하였다. RT-PCR(Reverse transcription-polymerase chain reaction)에 이용한 GoScript™ 역전사시스템(Reverse Transcription System)은 Promega Corporation (Madison, Wisconsin, USA)에서 구입하여 사용하였다. 회전감압농축기(Rotary vacuum evaporator) (EYELA, Japan), 마이크로원심분리기(microcentrifuge) (gyrozen, Korea), 현미경(microscope) (Olympus, Japan), CO2 인큐베이터(incubator) (Vision Scientific, Korea), microplate reader (Tecan, Austria), PCR (ASTEC Co, Japan), Davinch-Chemi™ imager CAS-400SM system (Davinch-K Co, Korea), UV 투과조명기(transilluminator) (BioTop, Switzerland), mini-PROTEAN®Tetra Cell (Bio-Rad, USA), mini Trans-Blot®Cell (Bio-Rad, USA)을 사용하였다.
<실시예 1 - 긴병꽃풀 추출물을 함유한 벌레물림 치료제의 제조>
편백워터 50 중량부에 하이셀(Hycel, Hydroxyethyl Cellulose) 1 중량부를 분산시킨다. 이 용액에 알로에 모이스트(Aloe Moist) 20 중량부와 식물성 글리세린(Glycerin) 2 중량부를 혼합한 후 워터배스(waterbath)에 옮겨 가열하여 제1 용액을 제조한다. 이어서, 긴병꽃풀 파우더 3 중량부와 식물성 에탄올 70%(v/v) 16 중량부를 혼합하여 제2 용액을 제조한다. 제2 용액에 마그네틱 바를 넣어 교반한다.
다음으로, 제1 용액에 제2 용액을 투입하고, 멘톨(Menthol) 4 중량부와 알란토인(Allantoin) 10 중량부를 첨가한 후 층이 생기지 않도록 바로 저어주면서 혼합하여 제3 용액을 제조한다.
이어서, 올리브리퀴드(Olive liquid) 2 중량부에 라임 에센셜 오일 0.1 중량부, 네롤리 에센셜 오일 0.1 중량부, 로즈마리 에센셜 오일 0.4 중량부, 유칼립투스 에센셜 오일 0.4 중량부를 첨가하여 제4 용액을 제조한다.
제3 용액에 제4 용액을 첨가하고 천천히 저어주면서 혼합하여 긴병꽃풀 추출물을 함유한 벌레물림 치료제를 제조한다.
<실험예 1 - 치료제 임상 실험>
실시예 1에 따른 벌레물림 치료제, 타 제품의 벌레물림 치료제를 준비하고, 치료제가 사람에게 효능을 발휘하는지 검증하는 실험을 수행하였다.
일시: 2018.05.31. 10:00 ~ 14:00
실험자 : 2인
선행결과: 개발된 긴병꽃풀 모기약은 제품 제작 완료 후 안정성 실험을 통하여 제품을 검증하고, 그 후 생활 환경에서 모기에 물렸을 때 ‘가려움증과 부풀어 오름 감소’효과를 입증하였다. 그러나 정확한 개선 수치 및 타 제품 및 아무 조치를 취하지 않은 비교예들과의 비교 실험을 위하여 인체 검증실험을 실시하였다.
실험방법: 부산 고신대학교 이동규교수 연구실에서 ‘무바이러스, 무균형태로 증식된 흰줄숲모기’120마리를 분양하였다. 각 시험자는 양 팔에 4가지의 조건 시험구(비교예 1: 무처리구, 비교예 2: 물린 후 물린 부위를 긁은 실험구, 비교예 3: 물린 후 타 회사 판매 제품 처리구, 실시예 1: 물린 후 개발된 긴병꽃풀 추출물을 함유한 벌레물림 치료제 처리구)로 구분하고, 케이지에 팔을 넣어 3분간 모기를 물림을 수행하였다. 그 후 3분 경과 후 최초 부풀어 오르는 직경을 측정하였다. 각 시험구별로 조건을 처리한 후 20분 후 다시 측정하여 결과값을 도출하였다.
표 1 및 2는 실시예에 따른 모기에 물린 후 긴병꽃풀 추출물을 함유한 벌레물림 치료제를 처리한 실험자들의 피부 반응을 나타내는 표이다. 실험자 1군의 2명, 실험자 2군의 4명을 대상으로 모기에 물린 후 3분 경과, 물린 후 20분 경과하였을 때, 부풀어 오르는 피부의 직경을 측정하였다. 이때, 실험자 1군과 2군은 군만 나누었을 뿐, 같은 조건에서 실험한 실험자들이다.
도 3, 표 1 및 2를 참조하면, 실험자 1군에서 모기에 물린 후 실시예 1에 따른 벌레물림 치료제를 처리한 실험자들은 모기에 물린 후 물린 후 3분이 지난 상태에 비하여 물린 후 20분이 지났을 때, 평균적으로 -0.285 mm만큼 직경이 감소하였으며, 실험자 2군에서는 평균적으로 -2.965 mm만큼 직경이 감소하는 것을 확인할 수 있다.
실시예 1(실험자 1군)
1 2 표준편차
물린 후 3분 11.15 12.22
물린 후 20분 11.07 11.73
변화 값 -0.08 -0.49
변화 값 평균 -0.285 0.290
실시예 1(실험자 2군)
1 2 3 4 표준편차
물린 후 3분 11.27 20.87 12.81 13.43
물린 후 20분 7.55 17.35 12.88 8.74
변화 값 -3.72 -3.52 0.07 -4.69
변화 값 평균 -2.965 2.087
<비교예 1 - 무처리군 실험자>
무바이러스, 무균형태로 증식된 흰줄숲모기 120마리를 준비하고, 실험자 1군과 실험자 2군으로 나누어 케이지에 팔을 넣어 3분간 모기를 물린 후 아무 처리를 하지 않은 실험자들의 피부 반응을 살펴보았으며, 이를 표 3 및 표 4에 나타냈다. 이때, 실험자 1군과 2군은 군만 나누었을 뿐, 같은 조건에서 실험한 실험자들이다.
표 3 및 4는 비교예 1에 따른 모기에 물린 후 아무 처리를 하지 않은 실험자들의 피부 반응을 나타내는 표이다. 실험자 1군의 4명, 실험자 2군의 4명을 대상으로 모기에 물린 후 3분 경과, 물린 후 20분 경과하였을 때, 부풀어 오르는 피부의 직경을 측정하였다.
표 3 및 4를 참조하면, 실험자 1군에서 모기에 물린 후 아무 처리를 하지 않은 실험자들은 모기에 물린 후 물린 후 3분이 지난 상태에 비하여 물린 후 20분이 지났을 때, 평균적으로 14.825 mm만큼 직경이 증가하고, 실험자 2군에서는 평균적으로 4.348 mm만큼 직경이 증가하는 것을 확인할 수 있다.
비교예 1(실험자 1군)
1 2 3 4 표준편차
물린 후 3분 6.39 6.05 8.00 12.35
물린 후 20분 17.86 21.21 31.53 21.49
변화 값 11.47 15.16 23.53 9.14
변화 값 평균 14.825 6.310
비교예 1(실험자 2군)
1 2 3 4 표준편차
물린 후 3분 4.56 10.05 7.39 9.79
물린 후 20분 8.84 13.04 14.28 13.02
변화 값 4.28 2.99 6.89 3.23
변화 값 평균 4.348 1.785
<비교예 2 - 벌레에 물린 후 긁기를 수행한 실험자>
무바이러스, 무균형태로 증식된 흰줄숲모기 120마리를 준비하고, 실험자 1군과 실험자 2군으로 나누어 케이지에 팔을 넣어 3분간 모기에 물린 후 긁은 실험자들의 피부 반응을 살펴보았으며, 이를 표 5 및 6에 나타내었다. 이때, 실험자 1군과 2군은 군만 나누었을 뿐, 같은 조건에서 실험한 실험자들이다.
표 5 및 6은 비교예 2에 따른 모기에 물린 후 긁은 실험자들의 피부 반응을 나타내는 표이다. 실험자 1군의 5명, 실험자 2군의 2명을 대상으로 모기에 물린 후 3분 경과, 물린 후 20분 경과하였을 때, 부풀어 오르는 피부의 직경을 측정하였다.
표 5 및 6을 참조하면, 실험자 1군에서 모기에 물린 후 긁은 실험자들은 모기에 물린 후 물린 후 3분이 지난 상태에 비하여 물린 후 20분이 지났을 때, 평균적으로 10.898 mm만큼 직경이 증가하고, 실험자 2군에서는 평균적으로 2.850 mm만큼 직경이 증가하는 것을 확인할 수 있었다.
비교예 2(실험군 1)
1 2 3 4 5 표준편차
물린 후 3분 9.49 12.44 10.64 9.75 8.23
물린 후 20분 24.16 26.17 16.00 24.96 13.75
변화 값 14.67 13.73 5.36 15.21 5.52
변화 값 평균 10.898 5.011
비교예 2(실험군 2)
1 2 표준편차
물린 후 3분 11.60 10.71
물린 후 20분 15.62 12.39
변화 값 4.02 1.68
변화 값 평균 2.850 1.655
<비교예 3 - 타 사의 벌레 물림 치료제를 처리한 실험자>
무바이러스, 무균형태로 증식된 흰줄숲모기 120마리를 준비하고, 실험자 1군과 실험자 2군으로 나누어 케이지에 팔을 넣어 3분간 모기에 물린 후 타 사의 벌레 물림 치료제를 처리한 실험자들의 피부 반응을 살펴보았으며, 이를 표 7 및 8에 나타내었다. 이때, 실험자 1군과 2군은 군만 나누었을 뿐, 같은 조건에서 실험한 실험자들이다.
표 7 및 8은 비교예 3에 따른 모기에 물린 후 타 사의 벌레 물림 치료제를 처리한 실험자들의 피부 반응을 나타내는 표이다. 실험자 1군의 3명, 실험자 2군의 3명을 대상으로 모기에 물린 후 3분 경과, 물린 후 20분 경과하였을 때, 부풀어 오르는 피부의 직경을 측정하였다.
표 7 및 8을 참조하면, 실험자 1군에서 모기에 물린 후 타 사의 벌레 물림 치료제를 처리한 실험자들은 모기에 물린 후 물린 후 3분이 지난 상태에 비하여 물린 후 20분이 지났을 때, 평균적으로 15.550 mm만큼 직경이 증가하고, 실험자 2군에서는 평균적으로 1.600 mm만큼 직경이 증가하는 것을 확인할 수 있었다.
비교예 3(실험자 1군)
1 2 3 표준편차
물린 후 3분 11.08 10.31 11.36
물린 후 20분 25.92 21.06 32.42
변화 값 14.84 10.75 21.06
변화 값 평균 15.550 5.192
비교예 3(실험자 2군)
1 2 3 표준편차
물린 후 3분 13.70 9.03 7.55
물린 후 20분 13.77 11.66 9.65
변화 값 0.07 2.63 2.10
변화 값 평균 1.600 1.351
<실험예 2 - 실험자 평균 및 표준편차>
실시예 1, 비교예 1 내지 3에 따른 실험자들의 데이터를 종합하여 평균 및 표준편차를 계산하였으며, 이를 표 9 내지 13, 도 4에 나타내었다.
표 9는 비교예 1에 따른 실험자들의 피부 반응 변화 값 평균을 나타내는 표이다.
표 10은 비교예 2에 따른 실험자들의 피부 반응 변화 값 평균을 나타내는 표이다.
표 11은 비교예 3에 따른 실험자들의 피부 반응 변화 값 평균을 나타내는 표이다.
표 12는 실시예 1에 따른 실험자들의 피부 반응 변화 값 평균을 나타내는 표이다.
표 13은 하기 식 1을 이용하여 계산한 비교예 1 내지 3, 실시예 1에 따른 실험자들의 피부 반응 변화 값 평균을 나타내는 표이다.
<식 1>
Figure PCTKR2019004507-appb-I000002
표 9 내지 12를 참고하면, 비교예 1에서는 평균적으로 9.586 mm만큼의 직경 증가 변화를 보였으며, 비교예 2에서는 평균적으로 8.599 mm만큼의 직경 증가 변화를 보이고, 비교예 3에서는 평균적으로 8.575 mm만큼의 직경 증가 변화를 보였으나, 실시예 1에서는 평균적으로 -2.072 mm만큼의 직경 감소 변화를 나타내었다.
표 13 및 도 4를 참고하면, 비교예 1에 비하여, 비교예 2에서는 최초 측정시보다 25~30% 부풀어 오르는 직경 너비 증가를 관찰 할 수 있었으며 가려움증이 지속되었다. 비교예 3의 경우, 가려움증은 일부 완화가 되었으나 직경의 변화는 없었다. 실시예 1에 따른 치료제를 이용한 경우, 가려움증이 해소되었으며, 약 20~25% 가량의 부풀어 오르는 직경의 감소 효과가 관찰할 수 있었다.
비교예 1(실험자 1군+실험자 2군)
1 2 3 4 5 6 7 8 표준편차
물린 후 3분 6.39 6.05 8.00 12.35 4.56 10.05 7.39 9.79
물린 후 20분 17.86 21.21 31.53 21.49 8.84 13.04 14.28 13.02
변화 값 11.47 15.16 23.53 9.14 4.28 2.99 6.89 3.23
변화 값 평균 9.586 7.057
비교예 2(실험자 1군+실험자 2군)
1 2 3 4 5 6 7 표준편차
물린 후 3분 9.49 12.44 10.64 9.75 8.23 11.60 10.71
물린 후 20분 24.16 26.17 16.00 24.96 13.75 15.62 12.39
변화 값 14.67 13.73 5.36 15.21 5.52 4.02 1.68
변화 값 평균 8.599 5.711
비교예 3(실험자 1군+실험자 2군)
1 2 3 4 5 6 표준편차
물린 후 3분 11.08 10.31 11.36 13.70 9.03 7.55
물린 후 20분 25.92 21.06 32.42 13.77 11.66 9.65
변화 값 14.84 10.75 21.06 0.07 2.63 2.10
변화 값 평균 8.575 8.360
실시예 1(실험자 1군+실험자 2군)
1 2 3 4 5 6 표준편차
물린 후 3분 11.15 12.22 11.27 20.87 12.81 13.43
물린 후 20분 11.07 11.73 7.55 17.35 12.88 8.74
변화 값 -0.08 -0.49 -3.72 -3.52 0.07 -4.69
변화 값 평균 -2.072 2.132
비교예 1 비교예 2 비교예 3 실시예 1
실험자1군 14.825 10.898 15.550 0.285
실험자2군 4.348 2.850 1.600 -2.965
실험자 평균 9.586 8.599 8.575 -2.072
표준편차 7.057 5.711 8.360 2.132
<실시예 2 - 긴병꽃풀 추출물 제조>
긴병꽃풀의 줄기와 잎 5kg 을 채취하여 열풍건조 또는 자연 음지건조 또는 동결 건조후 분쇄하였다. 분쇄한 시료에 시료 중량의 10배 양의 에탄올 70%(v/v)을 가하여 실온에서 약 24시간 침지한 후 상등액과 침전물을 분리하여 동일한 방법으로 3회 반복 추출하였다. 각 시료 추출물은 여과지(Whatman No.2)를 이용하여 여과한 후 EYELA 증발기(evaporator)로 감압 농축하여 용매를 제거 후 동결 건조하였으며, 이 시료를 -20℃ 온도에서 보관하였다. 이때, 긴병꽃풀은 오산 일원에서 채취된 것일 수 있다.
<실험예 3 - 전자공여능 측정>
실시예 2에 따른 시료를 준비하고, 에탄올에 용해한 0.2mM DPPH용액 60μl와 농도 별로 조제한 시료용액 120μl를 96well plate에 넣어 실온에서 15분 반응시킨 후 microplate reader를 이용하여 517nm에서의 흡광도를 측정하였으며, 이를 도 5에 나타내었다. 이때, 전자공여능은 시료첨가군과 무첨가군의 흡광도 감소율로 나타내었다.
Figure PCTKR2019004507-appb-I000003
도 5를 참고하면, 긴병꽃풀 추출물은 500μg/ml에서 전자공여능 약 20%를 나타내었으며, 1000μg/ml에서 약 50%의 전자공여능을 나타내는 것을 확인할 수 있다.
<실험예 4 - ABTs+양이온 라디칼 소거 활성 에세이(cation radical scavenging activity assay) 측정>
실시예 2에 따른 시료를 준비하고, 7mM 2,2'- 아지노 - 비스 (3- 에틸-벤조 티아졸린-6-술폰산)(ABTS, 2,2-azino-bis-(3-ethyl-benzo thiazoline-6-sulfonic acid))와 2.45mM 과황산칼륨(potassium persulfate)을 혼합하여 실온에서 24시간 동안 방치하여 ABTS+를 형성시킨다. 이 후 에탄올(ethanol)로 희석하여 ABTS+100μl에 시료 100μl를 가하여 700nm에서 흡광도를 측정하였으며, 이를 도 6에 나타내었다.
도 6을 참고하면, 긴병꽃풀 추출물 50μg/ml농도에서 ABTS 소거능(Inhibitation Rate, %)을 나타내기 시작했으며, 100μg/ml농도에서 약 20% 이하의 소거능을 보이다가 500μg/ml농도에서 약 80%의 소거능을 나타내고, 1000μg/ml에 약 90% 이상의 소거능을 나타내는 것을 확인할 수 있다.
Figure PCTKR2019004507-appb-I000004
<실험예 5 - 온도에 따른 안정성 시험>
실시예 2에 따른 시료를 준비하고, 온도에 따른 안정성 시험법에 따라 소정의 온도조건(0, 25, 40℃)에서 시료를 보관하여 경시적 변화에 따른 상태변화를 표 14의 조건으로 평가하였다.
온도 기간(일) 점검 사항(Check points)
0℃ 1 분리(Separation)침적(Precipitation)변색(Discoloration)pHetc.
3
25℃ 5
7
40℃ 15
30
실시예 2에 따른 긴병꽃풀 추출물을 3% 첨가한 에멀젼의 pH 측정 결과를 도 7에 나타내었다.
도 7을 참조하면, 평균 pH가 5.17의 분포로 나타났으며, 30일 동안 수치상의 큰 변화 없이 안정적인 pH를 나타내었다.
또한, 실시예 2에 따른 긴병꽃풀 추출물을 3% 첨가한 에멀젼의 화학적, 물리적 변화를 알아보기 위해서 온도(Incubation) 안정성 평가를 실시하였으며, 이를 표 15에 나타내었다.
표 15를 참조하면, 0, 25, 40℃의 온도에 보관한 긴병꽃풀 추출물을 첨가한 에멀젼은 30일 동안 모든 온도 조건에서 안정성을 나타내는 것을 확인할 수 있다. 이때, 고온(40℃)에서는 외관의 산패, 변색, 변취, 점도, 증발, 부유, 침전, 탁도(투명도), 분리 등을 관찰하였고, 저온에서는 응고, 침전, 탁도(투명도), 결정석출 분리 등의 화학적, 물리적 변화를 관찰하였다.
0℃ 25℃ 40℃
1일 안정 안정 안정
3일 안정 안정 안정
5일 안정 안정 안정
7일 안정 안정 안정
15일 안정 안정 안정
30일 안정 안정 안정
<실험예 6 - MTT assay에 의한 세포 생존율 분석>
실시예 2에 따른 긴병꽃풀 추출물을 준비하고, 세포 독성을 확인하였으며, 이를 도 7에 나타냈다.
MTT assay란 노란색을 띄는 수용성 물질 MTT를 이용하여 미토콘드리아의 호흡연쇄에 의해 생성되는 포르마잔(formazan)의 양을 측정하는 검사법이다.
도 8을 참조하면, MTT 분석을 이용하여 세포 독성을 측정한 결과 긴병꽃풀 추출물을 RAW 264.7에 처리하였을 때 농도가 500 μg/ml 구간에서 생존율은 95.8%로 측정됨에 따라 세포의 생존율에 영향을 미치지 않았기 때문에 RAW 264.7 세포에 독성이 매우 낮다는 것을 확인 할 수 있었다. 따라서 세포 독성이 영향을 미치지 않는 구간인 50, 100, 500 μg/ml을 설정하여 실험을 진행하였다. 이때, 세포 생존율 측정은 Carmichael의 방법에 따라 측정하였다. RAW 264.7 세포를 96 웰플레이트(well plate)에
Figure PCTKR2019004507-appb-I000005
세포/웰(cells/well)이 되게 0.18 ml 분주하고, 시료를 농도별로 조제하여 0.02 ml 첨가한 후 37℃, 5% CO2인큐베이터에서 24시간 배양하였다. 대조군은 시료와 동량의 증류수를 첨가하여 동일한 조건으로 배양하였다. 여기에 2.5 mg/ml 농도로 제조한 MTT 용액 0.04 ml를 첨가하여 4시간 배양한 후 배양액을 제거하고 각 well당 DMSO 0.15 ml를 가하여 실온에서 30분간 반응시킨 뒤 ELISA 판독기(reader)로 540 nm에서 흡광도를 측정하였다. 세포 생존율 측정은 시료용액의 첨가군과 무첨가군의 흡광도 감소율로 나타내었다.
Figure PCTKR2019004507-appb-I000006
<실험예 7 - NO 생성 억제 활성 분석>
실시예 2에 따른 긴병꽃풀 추출물을 준비하고, 염증 유발에 중요한 역할을 하는 것으로 알려진 NO 생성에 대한 긴병꽃풀 추출물의 효과를 확인하였으며, 이를 도 9에 나타냈다.
도 9는 긴병꽃풀 에탄올 추출물의 대식세포에 대한 세포 생존 능력을 나타내는 그래프이다. Raw264.7 세포에서 NO 생산에 대한 긴병꽃풀 추출물의 효과를 확인하였으며, LPS 유도된 Raw264.7 세포에서 NO 생성을 확인하였다. 이때, RAW264.7 세포(
Figure PCTKR2019004507-appb-I000007
cells/well)들은 에탄올 70%(v/v) 추출물 및 LPS(1 μg/ml)가 약 24시간동안 처리되었다. NO 생성은 Griess 시약에 의해 배지 상등액으로 결정된다.
도 9를 참조하면, LPS 처리군은 LPS 무처리군에 비해 높은 NO 발현량을 보였으며, 긴병풀꽃 추출물을 처리한 군은 NO 발현을 감소시키는 것을 확인할 수 있었다. 특히 500 μg/ml의 농도에서 41.2%의 저해율을 나타낸 것을 확인하였으며, 대식 세포주에서의 LPS로 염증을 과발현 시켰으며, 이를 우수한 결과로 염증을 억제시킴으로써 긴병꽃풀 에탄올 추출물이 염증억제에 효과가 있음을 확인할 수 있었다. 이때, RAW264.7 cell로부터 생성된 NO의 양은 Green 등의 방법에 따라 그리스 시약을 이용하여 세포배양액 중에 존재하는 NO2의 형태로 측정하였다. 6 well plate에 Raw 264.7 cell을
Figure PCTKR2019004507-appb-I000008
cells/ml로 분주하였다. 37℃, CO2인큐베이터에서 24시간 배양한 이후 1X PBS로 2번 세척한다. LPS 10ug/ml을 normal 실험군을 제외하고 처리한 후 2시간 이후 농도 별로 조제한 시료용액을 처리하여 24시간 배양한 후 상등액을 얻은 후, 동량의 griess 시약을 첨가하여 96 well plate에서 10분 반응시킨 후 540 nm에서의 흡광도를 측정하였다. NO 억제 활성 측정은 시료첨가군과 무첨가군의 흡광도 감소율로 나타내었다.
Figure PCTKR2019004507-appb-I000009
<실험예 8 - Western blot을 통한 단백질 발현 분석>
실시예 2에 따른 긴병꽃풀 추출물을 준비하고, 단백질 발현 분석을 실시하였으며, 이를 도 10에 나타냈다. 이때, 긴병꽃풀 추출물이 iNOS, COX-2인자의 단백질의 발현에 미치는 영향을 알아보기 위해서 western blot을 이용하여 실험하였다. 이때, 단백질 발현양을 비교하기 위하여 하우스키핑 유전자(housekeeping gene)인 베타-액틴(β-actine)을 양성 대조군(positive control)으로 사용하였고, 대조구로서는 비타민 C(vitamin C)를 사용하였다.
도 10은 RAW264.7 세포에서 긴병꽃풀 에탄올 추출물의 iNOS 및 COX-2 발현 속도를 나타내는 그래프이다. 왼쪽 그래프(A)는 긴병꽃풀 에탄올 추출물의 iNOS 단백질 발현율을 나타내고, 오른쪽 그래프(B)는 긴병꽃풀 에탄올 추출물의 COX-2 단백질 발현율을 나타낸다. RAW264.7 세포(
Figure PCTKR2019004507-appb-I000010
cells/well)들은 SFM(serum free medium) 배지에서 1 시간 동안 처리한 후 24시간 동안 긴병꽃풀 추출물을 50, 100 및 500 μg/ml로 처리한다. 각각의 수치는 평균 세 번의 실험 각각의 평균±로 나타낸다.
도 10을 참조하면, 긴병꽃풀 추출물을 처리한 세포군에서 긴병꽃풀 추출물의 최고 농도인 500 μg/ml에서 iNOS와 COX-2는 각각 92.73%, 26.90%의 발현 정도를 보였고 농도가 증가함에 따라 iNOS와 COX-2의 대조군인 비타민 C와 비교했을 때 iNOS의 단백질 발현과 유의한 결과를 나타냄을 확인할 수 있었으며, COX-2는 대조군보다 우수함을 나타내었다.
iNOS, COX-2의 활성을 확인하기 위하여 세포주(cell line) RAW 264.7을 100 mm 조직 배양 그릇(tissue culture dish)에
Figure PCTKR2019004507-appb-I000011
cells/well로 세포 시딩(cell seeding) 후 24시간 동안 배양하여 세포를 안정화시켰다. 배지를 제거한 후 LPS를 1 ug/ml 농도로 2시간 처리해준 후 추출물을 농도별로 처리한 배지로 24∼48시간 배양한 후 다시 배지를 제거하고 PBS로 2번 세척해주었다. Complete mini 1 tab을 가한 100 ul로 RIPA (radio-immunoprecipitation assay) 버퍼(buffer) 10 ml에 용해하여 4℃, 13,200 rpm에서 20분간 원심 분리하였다. 원심 분리하여 얻은 상층액은 BCA 단백질 분석 키트(protein assay kit)로 정량하였으며 20 ul의 단백질을 10% 아크릴아마이드 젤(acrylamide gel)에서 전기 영동하여 분리하였다. 분리된 단백질은 트랜스퍼(transfer) 기기(BIORAD)를 이용하여 PVDF (polyvinylidene fluoride) 멤브레인(membrane)에 옮긴 다음 실온에서 blocking buffer (5% skim milk in TBST)에서 1시간 배양시켰다. iNOS, COX-2, β-actin의 1차 항체를 희석하여 4℃에서 밤새(over night) 둔 다음, 다시 10분 간격으로 TBST(tris-buffered saline and tween 20)로 3회 세척하였다. iNOS와 COX-2의 2차 항체는 안티-레빗(anti-rabbit) IgG-HRP, β-actin의 2차 항체는 안티 마우스(anti-mouse) IgG-HRP를 사용하고 1:1,000으로 희석하여 실온에서 2시간 배양하였다. 3회 세척한 후 이미지 분석(image quant) LAS 4,000 (GE Healthcare Bio-Sciences AB, Sweden) 기기를 이용하여 밴드 확인 및 정량하였다.
<실험예 9 - Total RNA 분리 및 cDNA 합성>
실시예 2에 따른 긴병꽃풀 추출물을 준비하고, Total RNA 분리 및 cDNA 합성 분석을 실시하였다.
세포를 100 mm culture dish에
Figure PCTKR2019004507-appb-I000012
cells/well로 세포 시딩(cell seeding)한 뒤 24시간 동안 배양한 후 LPS를 1 ug/ml 농도로 2시간 동안 처리해준 후 추출물을 농도별로 처리하여 24시간 동안 배양하였다. 배지 상등액을 제거한 후 트리졸 라이시스 버퍼(trizol lysis buffer)를 웰(well)에 1 ml 분주하여 세포를 용해(lysis) 한 후 chloroform 200 ul를 분주하여 20초간 위아래로 흔들어주었다. 그 후 4℃, 13,200 rpm에서 20분간 원심 분리하여 상층액을 아이소프로판올(isopropanol) 500 ul가 들어있는 튜브에 옮겨 섞었다. 다시 13,200 rpm에서 20분간 원심 분리하였고, 그 상층액을 제거한 후 75% DEPC 수(EtOH-diethylpyrocarbonate water)를 각 튜브에 1 ml씩 분주하여 4℃, 13,200 rpm에서 5분간 원심분리한 뒤 상층액을 제거한 뒤 실온에서 건조시켰다. DEPC-처리된 물(DEPC-treated water)을 50 ul씩 분주하여 녹인 후 96 웰 플레이트(well plate)에 RNA 용액 5 ul와 멸균수 195 ul를 첨가하여 260 nm, 280 nm에서 각각 흡광도를 측정하여 total RNA양을 측정하였다. Oligo (dT) 15 프라이머(primer) (500 ug/ml) 1 ul, 추출한 RNA (2 ug)와 자유물양성자(nuclease free water)로 10 ul를 맞추고 75℃에서 5분간 반응시킨 후 5X 반응 버퍼(reaction buffer), MgCl2, PCR 뉴클레오티드 믹스(nucleotide mix), 리보뉴클라아제 억제제(rnasin inhibitor), 역전사효소(reverse transcriptase), 자유물양성자(nuclease free water)를 첨가하여 25℃에서 5분, 42℃에서 60분, 70℃에서 15분간 반응시켜 cDNA를 합성시켰다.
<실험예 10 - Reverse transcription-PCR>
실시예 2에 따른 긴병꽃풀 추출물을 준비하고, iNOS, COX-2의 mRNA 발현을 알아보기 위하여 PCR을 실시하였으며, 이를 도 11 및 표 16에 나타냈다. 이때, 긴병꽃풀 추출물이 iNOS와 COX-2 인자의 mRNA 발현에 어떠한 영향을 미치는지 알아보기 위하여 긴병꽃풀 추출물을 농도별로 50, 100, 500 μg/ml 처리하여 RT-PCR을 진행하여 mRNA 발현을 확인하였다. 이 때, mRNA 발현양을 비교하기 위하여 하우스키핑 유전자(housekeeping gene)인 GAPDH를 양성대조군으로 사용하였으며, 대조군으로써 비타민 C를 사용하였다.
도 11은 RAW264.7 세포에서 긴병꽃풀 에탄올 추출물의 iNOS 및 COX-2 mRNA 발현 속도를 나타내는 그래프이다. 좌측 그래프(A)는 긴병꽃풀 에탄올 추출물의 iNOS mRNA 발현율을 나타내고, 우측 그래프(B)는 긴병꽃풀 에탄올 추출물의 COX-2 mRNA 발현율을 나타낸다. RAW264.7 세포(
Figure PCTKR2019004507-appb-I000013
cells/well)들은 SFM(serum free medium) 배지에서 1 시간 동안 처리한 후 24시간동안 긴병꽃풀 추출물을 50, 100 및 500 μg/ml로 처리한다. 각각의 수치는 평균 세 번의 실험 각각의 평균±로 나타낸다.
표 16은 RT-PCR을 통해 프라이머(primer)들의 서열(sequence)을 나타낸 표이다.
도 11 및 표 16을 참조하면, 긴병꽃풀 추출물을 처리한 세포군에서 iNOS와 COX-2의 mRNA 발현 양이 감소하여 500 μg/ml 농도에서 각각 82.08%, 84.61%의 발현 억제를 보여주었고 대조군인 비타민 C와 비교해 보았을 때 긴병꽃풀 추출물과 대조군의 mRNA 발현이 iNOS의 발현은 유의함을 나타내었고, COX-2는 발현이 우수함을 확인할 수 있었다. 이때, PCR은 다음과 같이 수행하였다. 우선, PCR 튜브(tube)에 5X 버퍼(green Gotaq flexi buffer), MgCl2, PCR 뉴클레오티드 믹스(nucleotide mix) (10mM), primer, GoTaq DNA 중합효소(polymerase), 자유물양성자(nuclease free water), 합성한 cDNA를 첨가하여 잘 섞은 후 PCR을 실행하였다. 이 후, GAPDH, iNOS는 96℃에서 2분, 96℃에서 10초, 64℃에서 30초, 72℃에서 1분, 72℃에서 10분(40 cycles), COX-2는 96℃에서 2분, 94℃에서 10초, 51℃에서 30초, 72 ℃에서 1분, 72℃에서 10분(40 cycles)을 하였다. 이어서, PCR로 합성시킨 후 0.002% 브롬화에티듐(ethidium bromide)를 첨가한 1.5% 아가로오스 젤(agarose gel)을 100Ｖ에서 40분간 전기영동 한 후 LAS 4,000을 이용하여 밴드를 확인하여 분석 정량하였다.
유전자(Gene) 프라이머(Primer) 서열(Sequence, 5'→3')
GAPDH sense TGA AGG TCG GTG TGA ACG GAT TTG GC
anti-sense CAT GTA GGC CAT GAG GTC CAC CAC
COX-2 sense GGA GAG ACT ATC AAG ATA GT
anti-sense ATG GTC AGT AGA CTT TTA CA
iNOS sense AAT GGC AAC ATC AGG TCG GCC ATC ACT
anti-sense GCT GTG TGT CAC AGA AGT CTC GAA CTC
이상에서 본 발명의 바람직한 실시예에 대하여 상세하게 설명하였지만 본 발명의 권리범위는 이에 한정되는 것은 아니고 다음의 청구범위에서 정의하고 있는 본 발명의 기본 개념을 이용한 본 발명자의 여러 변형 및 개량 형태 또한 본 발명의 권리범위에 속하는 것이다.
서열목록 전자파일 첨부

Claims (6)

  1. 긴병꽃풀{Glechoma grandis (A. Gray) Kuprian} 추출물을 유효성분으로 함유하는 벌레물림 치료제.
  2. 제1항에 있어서, 상기 치료제의 pH는 5 내지 8인 벌레물림 치료제.
  3. 제1항에 있어서, 상기 치료제는 벌레에 물린 후 5~10분 이내에 부풀어 오른 피부의 직경을 15 내지 30% 감소시키는 벌레물림 치료제.
  4. 제1항에 있어서, 상기 긴병꽃풀 추출물은 COX-2의 단백질 발현 및 COX-2의 mRNA 발현을 억제하는 벌레물림 치료제.
  5. 증류수 또는 편백워터에 하이드록시에틸셀룰로오스를 넣어 분산시킨 용액을 준비하는 단계,
    상기 분산시킨 용액에 알로에 모이스트 및 식물성 글리세린을 혼합하여 제1 용액을 제조하는 단계,
    긴병꽃풀 파우더를 제조하는 단계,
    상기 제1 용액에 상기 긴병꽃풀 파우더를 첨가하여 제2 용액을 제조하는 단계,
    상기 제2 용액 및 멘톨과 알란토인을 첨가하여 제3 용액을 제조하는 단계,
    식물성 오일류에 유화제를 첨가하여 제4 용액을 제조하는 단계, 그리고
    상기 제4 용액에 상기 제3 용액을 혼합하는 단계를 포함하는
    벌레물림 치료제 제조방법.
  6. 제5항에 있어서, 긴병꽃풀 파우더의 제조방법은,
    긴병꽃풀의 줄기 및 잎을 채취하는 단계,
    상기 긴병꽃풀을 열풍건조한 후 분쇄하는 단계,
    상기 분쇄한 긴병꽃풀에 알코올을 첨가하여 긴병꽃풀 추출물을 얻는 단계,
    상기 긴병꽃풀 추출물을 여과한 후 감압 농축하여 용매를 제거하는 단계, 그리고 상기 용매가 제거된 긴병꽃풀 추출물을 동결건조하는 단계를 포함하는
    벌레물림 치료제 제조방법.
PCT/KR2019/004507 2018-04-18 2019-04-15 긴병꽃풀 추출물을 함유하는 벌레물림 치료제 WO2019203515A1 (ko)

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LEE, JIN YOUNG ET AL.: "Verification of Anti-inflammatory Activities of the Ethanol Extracts of Glechoma hederacea var. longituba in Raw 264.7 Cells", JOURNAL OF LIFE SCIENCE, vol. 28, no. 4, 30 April 2018 (2018-04-30), pages 429 - 434, XP053038351 *

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