CN113350232B - 含马齿苋、艾叶及红景天的混合提取物作为有效成分的皮肤保护及刺激缓解用化妆品组合物 - Google Patents

Abstract

本发明涉及包含马齿苋、艾叶及红景天的混合提取物作为有效成分的用于皮肤保护或皮肤刺激缓解的化妆品组合物。在使用包含本发明的马齿苋、艾叶及红景天的混合提取物的组合物的情况下，可以表现出比各单独提取物显著提高的皮肤屏障改善效果、炎症性皮肤疾病改善功效及皮肤镇静效果，可以将上述混合提取物用作皮肤保护、皮肤刺激缓解或皮肤镇静用途的化妆品组合物。

Description

含马齿苋、艾叶及红景天的混合提取物作为有效成分的皮肤 保护及刺激缓解用化妆品组合物

技术领域

本发明涉及包含马齿苋、艾叶及红景天的混合提取物作为有效成分的用于皮肤保护及皮肤刺激缓解的化妆品组合物。

背景技术

皮肤作为存在于人体最外部的器官，起到通过保护体内水分并阻挡来自外部的侵入因子来保护人体的必需的屏障作用。引起皮肤炎症或刺激的因子由物理化学性刺激、过敏原、紫外线、氧化应激、病原菌感染及由此引起的二次生成的炎症相关细胞因子、趋化因子等。若由于这些因子而引起皮肤刺激加重，则会表现出皮肤的炎症反应或者表现出变态反应性或过敏性皮肤的形态。炎症原本是在细胞或组织因某种原因受到损伤时，最小化该反应并将损伤部位恢复原状的一系列防御目的的表现，引起疼痛、浮肿、发红、发热等而导致功能障碍。这样的炎症在通常状态下会在经过初期状态后恢复正常，但若刺激炎症的刺激剂不消失、持续产生炎症反应，则会产生细胞损伤等多种副作用。虽然抗炎剂中有多种物质，但从皮肤安全性的层面或配制化妆品时的稳定性层面来说，无副作用的抗炎物质尤为重要。现在炎症性皮肤疾病治疗剂使用类固醇制剂、局部免疫抑制剂、局部抗生素及抗组胺剂等，但在长期使用上述药物制剂的情况下，会引起皮肤裂开的萎缩纹、皮肤萎缩、毛细血管扩张、类固醇性粉刺、多毛症、紫斑等副作用。尤其是大范围的部位涂抹类固醇剂，药剂会通过皮肤被全身吸收，若是幼儿，则会妨碍发育，若是成人，则会发生骨质疏松症之类的全身性副作用。因此，需要开发源自天然物质的副作用少且对人体安全并对炎症性皮肤疾病的改善效果优良的组合物。

现有技术文献

专利文献

专利文献0001：韩国公开专利第10-2004-0063108号

发明内容

技术问题

本发明人为开发如上述的既具有皮肤保护及皮肤刺激缓解效果又对人体的副作用小的物质而进行了多次的研究努力。通过结果确认到马齿苋、艾叶及红景天的混合提取物比起它们各自的单独提取物，表现出明显提高的皮肤保护及对皮肤刺激的缓解效果，从而完成本发明。

因此，本发明的目的在于，提供一种包含马齿苋、艾叶及红景天的混合提取物作为有效成分的用于皮肤保护及皮肤刺激缓解的化妆品组合物。

解决问题的方案

根据本发明的一实施方式，本发明提供一种包含马齿苋、艾叶及红景天的混合提取物作为有效成分的用于皮肤保护及皮肤刺激缓解的化妆品组合物。

在本说明书中，马齿苋(Portulaca oleracea)为韩国自生的天然物中的属于石竹目马齿苋科的一年生草本植物，又称五行草、五方草、长命菜、马齿菜等。主要在田埂或宅旁园地等处经5个月至9个月的时间自生，在《本草纲目》和《东医宝鉴》等书籍中记载马齿苋多用作虫毒或蛇毒的解毒剂。在阿拉伯半岛，传统上把马齿苋用作防腐剂、抗坏血病制剂、镇痉药、利尿剂、驱虫剂、皮肤镇静剂，此外，据报告还有关于肌肉缓解活性和抗癌效果的研究。上述马齿苋可以为提取物的形态，或者生马齿苋、生药自身的粉碎物、生药的干燥物、生药的干燥粉碎物、马齿苋的发酵物，但不限定于此。并且，在本说明书中所使用的马齿苋，其获取方法不受限制，也可以栽培来使用，或者购入市面贩卖的来使用。

在本说明书中，艾叶是指艾(Artemisia argyi或Artemisia argyi H.Lev.&Vaniot)、魁蒿(A.princeps Pamp.var.orientalis Hara)、山地蒿(A.montana Pampani)、蒙古蒿(A.mongolica)或亚细亚蒿(A.asiatica)的叶或嫩茎，优选地，可以为艾的叶或茎。同时，上述艾叶可以为提取物的形态、生艾叶、生药自身的粉碎物、生药的干燥物、生药的干燥粉碎物、艾叶的发酵物，但不限定于此。并且，在本说明书中，艾叶的获取方法不受限制，也可以栽培来使用，或者购入市面贩卖的来使用，可以使用草本的地上部或者根的一部分或全部。更具体地，可以使用选自由艾叶草本的叶、花、茎、果实、根及它们的组合及草本整体组成的组中的一种以上。本说明书的艾叶不必一定是通过干燥制备的，只要是能够提取艾叶有效成分的适当形态就不受限制。

在本说明书中，红景天(Rhodiola rosea)为广泛分布并栖息于欧洲和亚洲高山地带的植物，在东欧和亚洲，很早以前就用作对神经系统的刺激、抑郁症的减少、操作能力的提高、疲劳恢复、高山病的预防等有效的传统药物。上述红景天可以为提取物的形态、生红景天、生药自身的粉碎物、生药的干燥物、生药的干燥粉碎物、红景天的发酵物，但不限定于此。并且，在本说明书中，红景天的获取方法不受限制，也可以栽培来使用，或者购入市面贩卖的来使用。

本发明所使用的马齿苋、艾叶及红景天提取物可以通过购入或直接提取来获取。在通过使用提取溶剂处理马齿苋、艾叶及红景天来获得本发明的组合物中使用的马齿苋、艾叶及红景天提取物的情况下，可以使用极性溶剂或非极性溶剂等多种提取溶剂。适当的极性溶剂包括：(i)水；(ii)醇类(优选的，甲醇、乙醇、丙醇、丁醇、正丙醇、异丙醇、正丁醇、1-戊醇、2-丁氧基乙醇或者乙二醇)；(iii) 乙酸；(iv)N，N-二甲基甲酰胺(DMFO，dimethyl-formamide)；以及(v)二甲基亚砜(DMSO，dimethylsulfoxide)。适当的非极性溶剂包括：丙酮、乙腈、乙酸乙酯、乙酸甲酯、氟代烷、戊烷、己烷、2，2，4-三甲基戊烷、癸烷、环己烷、环戊烷、二异丁烯、1-戊烯、1-氯丁烷、1-氯戊烷、邻二甲苯、二异丙基乙醚、2- 氯丙烷、甲苯、1-氯丙烷、氯苯、苯、二乙基乙醚、二乙基硫醚、三氯甲烷、二氯甲烷、1，2二氯乙烷、苯胺、二乙胺、乙醚、四氯化碳以及四氢呋喃(THF， Tetrahydrofuran)。

在本发明的一实例中，上述马齿苋、艾叶及红景天的混合提取物通过选自由水、有机溶剂及它们的混合溶剂组成的组中的任一种提取溶剂提取，上述有机溶剂有醇类、石油醚、己烷、苯、三氯甲烷、二氯甲烷、乙醚、乙酸乙酯以及丙酮等。

另一方面，本发明所使用的马齿苋、艾叶及红景天的混合物可以通过混合马齿苋、艾叶及红景天的单独提取物来制备，或者可以通过使用提取溶剂处理马齿苋、艾叶及红景天的混合物来制备。

在本发明的一具体例中，上述醇类选自由甲醇、乙醇、丙醇、丁醇、正丙醇、异丙醇、正丁醇及它们的混合溶剂组成的组中。

上述溶剂的量可以根据提取的马齿苋、艾叶及红景天的量的不同而不同，优选地，可以为马齿苋、艾叶或红景天重量的1倍至20倍的体积，更优选地，可以为2倍至15倍的体积。更具体地，为马齿苋、艾叶或红景天重量的3倍至12倍的体积、4倍至10倍的体积，更具体地，为马齿苋、艾叶或红景天重量的4倍、 5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍的体积，但不限定于此。

在本发明的一具体例中，上述乙醇为60体积百分比至100体积百分比的乙醇溶液。在本发明的更具体的具体例中，上述乙醇可以为60体积百分比至90体积百分比、60体积百分比至80体积百分比、65体积百分比至100体积百分比、 65体积百分比至90体积百分比、65体积百分比至80体积百分比、70体积百分比、80体积百分比、90体积百分比、95体积百分比或100体积百分比，但不限定于此。

本发明的提取物的提取温度不受特别限制，例如，可以为0℃至120℃，具体地，可以为20℃至95℃。更具体地，可以为50℃至70℃，最具体地，可以为 20℃、30℃、40℃、50℃、60℃或者70℃，但不限定于此。

本发明的提取物的提取时间不受特别限制，例如可以为1小时至10天，具体地，可以为1小时至6小时，更具体地，可以为2小时至4小时。

本发明的提取物可以通过公知的提取方法提取。例如，可以通过冷浸提取、热水提取、超声波提取、回流冷却提取、加热提取法来提取，具体地，可以通过热水提取或回流冷却提取法来提取，可以反复提取1次至10次，更具体地，可以反复提取2次至7次。

在本发明的一实例中，相对于艾叶提取物的重量，上述混合提取物中艾叶提取物中ISTP(Isosecotanapartholide)的含量为10重量百分比至20重量百分比。

在本发明的一实例中，相对于红景天提取物，上述混合提取物中红景天提取物中的肉桂醇甙(Rosavin)含量为10重量百分比至20重量百分比。

本发明中的“ISTP(Isosecotanapartholide)”可以包含于多种天然物中。例如，可以包含于茵陈蒿(Artemisia iwayomogi)、艾叶或魁蒿。

在本发明的一实例中，上述混合提取物中的马齿苋、艾叶及红景天提取物的干燥重量比为1～20:1～20:1。在本发明更具体的实例中，马齿苋、艾叶及红景天提取物的干燥重量比可以为1～20:1～20:1、1～20:1～15:1、1～20:1～10:1、1～ 20:1～5:1、1～20:1:1、1～15:1～15:1、1～15:1～10:1、1～15:1～5:1、1～15:1:1、 1～10:1～10:1、1～10:1～5:1、1～10:1～3:1、1～10:1:1，更具体地，可以为10:1:1，但不限定于此.。

在本发明的另一实例中，以组合物总重量为基准，包含本发明的混合提取物的组合物包含0.1～1.0％(w/w)的马齿苋提取物、0.01～0.1％(w/w)的艾叶提取物、0.01～0.1％(w/w)的红景天提取物。

在本发明的一实例中，相对于本发明组合物的总重量，可以包含0.001重量百分比至3.0重量百分比的上述混合提取物，更具体地，可以包含0.01重量百分比至3.0重量百分比、0.1重量百分比至3.0重量百分比、1.0重量百分比至3.0重量百分比，但不限定于此。相对于组合物总重量，若包含小于0.001重量百分比的上述混合提取物，则效果微乎其微，若大于3.0重量百分比，则存在经济性的问题。

在本发明中，马齿苋、艾叶及红景天的提取物可以使用通过溶剂提取的粗提取物(crude extract)的形态，也可以提纯为高纯度来使用。

如上所述，在本说明书中使用的术语“提取物”虽然具有在本发明所属领域中以粗提取物来通用的含义，但广义上还包括追加分馏(fractionation)提取物而获得的分馏物。即，马齿苋、艾叶及红景天提取物不仅包括通过使用上述提取溶剂来获得的，还包括通过追加采用提纯过程来获得的提取物。例如，将上述提取物通过具有规定分子量临界值的超滤膜来获得的分馏物、通过多种层析(为了根据大小、电荷、疏水性或亲水性来分离而制备的)分离的分离物等、通过追加性地实施多种提纯方法来获得的分馏物也都包括在本发明的马齿苋、艾叶及红景天提取物中。

本发明使用的马齿苋、艾叶及红景天提取物可以通过减压蒸馏及冻结干燥或喷雾干燥等之类的追加过程制备为粉末状态。

在本发明的一实例中，本发明的组合物不仅包含作为有效成分的上述马齿苋、艾叶及红景天的混合提取物，而且还可以包含通常用于化妆品组合物的成分，例如，可以包含抗氧化剂、稳定剂、溶解剂、维生素、颜料以及香料之类的普通辅助剂，而且，还可以包含载体。

作为上述载体，可以使用纯水、一元醇类(乙醇或丙醇)、多元醇类(丙三醇、1，3-丁二醇或丙二醇)、高级脂肪酸类(棕榈酸或亚麻酸)、油脂类(小麦胚油、茶花油、荷荷巴油、橄榄油、角鲨烯、葵花籽油、澳洲坚果花生油、鳄梨油、大豆氢化卵磷脂或脂肪酸甘油酯)等，但不限定于此。并且，还可以根据需要添加表面活性剂、杀菌剂、抗氧化剂、紫外线吸收剂、消炎剂及清凉剂。

表面活性剂可以使用聚氧乙烯、氢化蓖麻油、油醚、聚氧乙烯单油酸酯、单硬脂酸甘油酯、山梨糖醇单硬脂酸酯、山梨聚糖、蔗糖脂肪酸酯、甘油单月桂酸酯、聚氧乙烯还原羊毛脂、乙烯-辛烯共聚物(POE)、甘油焦谷氨酸、异硬脂酸、二脂、N-乙酰谷氨酰胺以及异硬脂酸酯等。

杀菌剂可以使用硫代硫醇、三氯生、洗必泰葡萄糖酸盐、苯氧乙醇、间苯二酚、异丙基甲基苯酚、甘菊环(azulene)、水杨酸以及吡啶硫酮锌等。

抗氧化剂可以使用丁基羟基茴香醚、没食子酸、丙基没食子酸以及异抗坏血酸中的任一种。

紫外线吸收剂可以使用二羟基二苯甲酮等的苯甲酮类、黑色素、对氨基苯甲酸乙酯、对二甲氨基苯甲酸-2-乙基己酯、西诺沙酯、对甲氧基肉桂酸-2-乙基己酯、 2-(2-羟基-5-甲基苯基)苯并三唑、尿刊酸以及金属氧化物的微粒子等。

消炎剂可以使用甘草酸二钾或尿囊素等，清凉剂可以使用辣椒酊或1-薄荷醇等。

在本发明的其他实例中，本发明的化妆品组合物可以制备为选自由溶液、外用软膏、凝胶、霜剂、泡沫、营养化妆水、柔肤化妆水、面膜、柔肤水、乳液、化妆底液、精油、精华液、护发精华素、头皮护理液、头发滋补液、护发素、头发护理液、润发乳、洗发液、护发素、护发素洗发水、毛发营养化妆水、发胶、发蜡、定型剂、染发剂、香皂、液体清洁剂、沐浴剂、防晒霜、防晒油、悬浮液、乳浊液、软膏、护肤液、粉、香皂、含有表面活性剂的清洁剂、油、粉底霜、乳浊液底霜、蜡底霜、化妆片以及喷剂组成的组中的剂型，但不限定于此。

如在下述实施例中证明，给药本发明的马齿苋、艾叶及红景天混合提取物表现出显著降低作为与炎症相关的细胞因子的诱导型一氧化氮合酶(iNOS)、环氧化酶2(COX-2)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素6(IL-6)以及白细胞介素1α(IL-1α)的表达的效果，通过以人类的皮肤为对象的皮肤科评价表现出显著减少经皮水分损失、红斑指数及有关皮肤刺激控制的刺激指数的效果。因此，本发明的组合物的强化皮肤屏障功能、从皮肤刺激中保护皮肤、缓解皮肤刺激的效果显著。

在本发明的一实例中，本发明的马齿苋、艾叶及红景天的混合提取物的特征在于，抑制作为炎症性反应的指标的诱导型一氧化氮合酶、环氧化酶2、肿瘤坏死因子α、白细胞介素6以及白细胞介素1α的表达，减少经皮水分损失、红斑指数及有关皮肤刺激控制的刺激指数等的对于皮肤刺激的保护、恢复及缓解效果相比于各单独提取物(马齿苋提取物、艾叶提取物以及红景天提取物)更为优秀，其协同效果得到了认证。

发明的效果

本发明的特征及优点主要如下：本发明提供包含马齿苋、艾叶及红景天的混合提取物作为有效成分的用于皮肤保护及皮肤刺激缓解的化妆品组合物。在使用包含本发明的马齿苋、艾叶及红景天的混合提取物的组合物的情况下，表现出比各单独提取物显著提高的皮肤保护及皮肤刺激缓解效果，若使用本发明的组合物，可以制备化妆品或皮肤外用剂。

附图说明

图1为示出利用人永生化表皮细胞(HaCaT)来确认根据本发明的马齿苋、艾叶、红景天提取物的浓度的有无细胞毒性的结果。

图2a及图2b示出根据本发明的马齿苋、艾叶、红景天提取物的混合物浓度的人永生化表皮细胞的存活率的结果。

图3a及图3b示出根据本发明的马齿苋、艾叶、红景天混合物的提取物浓度的人永生化表皮细胞的存活率的结果。

图4示出根据本发明的马齿苋、艾叶、红景天提取物及它们的混合提取物的浓度的诱导型一氧化氮合酶活性及对于Raw264.7细胞的细胞毒性的结果。

图5为示出根据本发明的马齿苋、艾叶、红景天提取物及它们的混合提取物的浓度的对诱导型一氧化氮合酶基因表达的抑制效果的图。

图6为示出根据本发明的马齿苋、艾叶、红景天提取物及它们的混合提取物的浓度的对环氧化酶2基因表达的抑制效果的图。

图7为示出根据本发明的马齿苋、艾叶、红景天提取物及它们的混合提取物的浓度的对肿瘤坏死因子α(TNF-alpha)基因表达的抑制效果的图。

图8为示出根据本发明的马齿苋、艾叶、红景天提取物及它们的混合提取物的浓度的对白细胞介素6基因表达的抑制效果的图。

图9为示出根据本发明的马齿苋、艾叶、红景天提取物及它们的混合提取物的浓度的对白细胞介素1α(IL-1alpha)基因表达的抑制效果的图。

图10为示出根据本发明的马齿苋、艾叶、红景天提取物及它们的混合提取物的浓度的对白细胞介素1α蛋白质表达的抑制效果的图。

图11及图12示出为了确认本发明的混合提取物对皮肤刺激的保护效果而根据包含本发明的混合提取物的霜剂剂型的处置来测定经皮水分损失(TEWL)的结果。

图13及图14示出为了确认本发明的混合提取物对皮肤刺激的保护效果而根据包含本发明的混合提取物的霜剂剂型的处置，通过使用色度计(chromameter) 来测定皮肤红斑的程度的结果。

图15示出为了确认本发明的混合提取物对皮肤刺激的恢复及镇静效果而根据包含本发明的混合提取物的霜剂剂型的处置来测定经皮水分损失的结果。

图16示出为了确认本发明的混合提取物对皮肤刺激的恢复及镇静效果而根据包含本发明的混合提取物的霜剂剂型的处置，通过使用色度计来测定皮肤红斑的程度的结果。

图17为简要示出本发明的马齿苋、艾叶及红景天混合提取物的制备方法的图。

具体实施方式

以下，通过实施例更为详细地说明本发明。这些实施例仅用于更为具体地说明本发明，本发明所属领域的普通技术人员应该明白的是，本发明的范围是依据本发明的要旨，而非以这些实施例为限制。

实施例

在本说明书全文中，除非另有特别说明，否则用来示出特定物质的浓度而使用的“％”表示固体/固体为(重量/重量)％，固体/液体为(重量/体积)％，液体/液体为(体积/体积)％。

实施例1：马齿苋、艾叶、红景天的单一提取物的制备

实施例1-1：马齿苋提取物的制备

向清洗好的1.0kg的马齿苋(生)加入4.0kg的95％(w/w)的乙醇，在50℃～ 60℃的温度下进行3小时以上的加热提取。使用减压浓缩机对利用活性炭(CGSP) 过滤的滤液进行完全浓缩后，使用真空干燥机干燥而获得约50g的马齿苋提取物粉末。

实施例1-2：艾叶提取物的制备

在50℃～60℃的温度下，将1kg的艾叶(干燥，艾)的地上部分在10.0kg 的70％(w/w)的乙醇中浸渍3小时来提取。使用以1:1～1:10(w/w)的比例混合正己烷(n-Hexane)和乙酸乙酯(Ethyl Acetate)的溶剂对过滤提取液而得的液体进行减压浓缩后获得的浓缩液进行分馏来获得乙酸乙酯分馏物，将分馏物减压浓缩后回收240g的粉末。使用正己烷和乙酸乙酯的混合溶剂将上述获取的艾叶乙酸乙酯可溶提取物吸附于填充在色谱柱的二氧化硅，使用正己烷和乙酸乙酯的混合溶剂进行硅胶柱层析。溶出物大体分为3个分层，使用减压浓缩机完全去除2 号溶出物的溶剂后，得到相对于分馏物重量，ISTP(Isosecotanapartholide)的含量为12重量百分比的5g的粉末。

实施例1-3：红景天提取物的制备

将肉桂醇甙含量为0.1％～5.0％的1.0kg的红景天粉末完全溶解于4.0kg的100％(w/w)的甲醇后，加入与红景天提取物粉末同等量的二氧化硅后进行减压浓缩来获得2.0kg的干燥物。使用二氯甲烷(Methylene Chloride)和甲醇(Methanol) 的混合溶剂将上述获得的干燥物吸附于填充在色谱柱的二氧化硅，使用二氯甲烷和甲醇的混合溶剂进行层析。溶出物大体分为3个分层，使用减压浓缩机完全去除2号溶出物的溶剂后，得到相对于分馏物重量，肉桂醇甙的含量为12重量百分比的约80g的粉末。

表1

区分	生药	收率(％)
			实施例1-1	马齿苋	5
实施例1-2	艾叶	0.5
			实施例1-3	红景天	8

实施例2：根据马齿苋、艾叶、红景天单一提取物组合比的混合物的制备

按照下述表2的比例混合上述实施例1中获得的马齿苋、艾叶、红景天提取物粉末。

表2

区分	马齿苋提取物粉末(g)	艾叶提取物粉末(g)	红景天提取物粉末(g)
				实施例2-1	1	1	1
实施例2-2	1	1	10
				实施例2-3	1	10	1
实施例2-4	1	10	10
				实施例2-5	10	1	1
实施例2-6	10	1	10
				实施例2-7	10	10	1

实施例3：马齿苋、艾叶、红景天混合提取物的制备

按照下述表3的比例混合上述实施例1-1至实施例1-3中使用的马齿苋、艾叶、红景天后，加入相当于混合物重量10倍的70％(w/w)～95％(w/w)的乙醇，在50℃～60℃的温度下加热提取3小时以上来获得提取粉末。

表3

实验例1：马齿苋、艾叶及红景天提取物对人永生化表皮细胞的细胞毒性评价

为了确认相当于实施例1至实施例3的提取物的细胞毒性，在人永生化表皮细胞中通过MTT法(MTT Assay)来实施毒性测试。

在24孔培养板接种人永生化表皮细胞并培养24小时后，将已培养的细胞的培养基更换为无血清(serum-free)培养基，按照试样的不同浓度进行处理后培养 24小时。使用2.5mg/ml的MTT溶液更换为已完成培养的细胞的稀释10倍的培养基并进行反应后，将去除上清液后添加1ml的二甲基亚砜二而生成的MTT甲臜(MTT-formazan)结晶体溶解后，使用酶联免疫检测仪(ELISA reader)在570nm 的波长下测定吸光度。在此情况下使用的对照组是将二甲基亚砜用作溶解溶剂。细胞毒性以相对于对照组的吸光度的百分比来表示。毒性测试的结果如表4及图1至图3所示。

表4

如上述表4所示，所有提取物及混合物到3％(120μg/ml)的浓度为止，不显出对人永生化表皮细胞的毒性。

实验例2：马齿苋、艾叶、红景天提取物及它们的混合物的对诱导型一氧化氮合酶活性的抑制及对Raw264.7细胞的细胞毒性确认

使用脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)(Sigma公司，圣路易斯，密苏里州，美国)处理作为小鼠巨噬细胞的Raw264.7细胞来人为地诱发炎症后，为了获知对炎症的抑制效果，测定上述实验例1的结果中没有细胞毒性的实施例1-1、实施例1-2、实施例1-3、实施例2-3、实施例2-5、实施例2-7的对诱导型一氧化氮合酶(iNOS，inducible Nitric OxideSynthase)活性的抑制能力。

将8×10⁵细胞悬浮于10％的胎牛血清-杜尔贝科改良伊戈尔培养基 (FBS-DMEM，Fetal Bovine Serum-Dulbecco’s Modified Eagle Medium)((株) Welgene公司，韩国)培养基后接种并附着在24孔细胞培养板上。一天后，更换为含有1μg/ml的脂多糖的培养基来诱发炎症后，使用实施例1-1、实施例1-2、实施例1-3、实施例2-3、实施例2-5、实施例2-7、实施例3-1、实施例3-3的提取物处理后培养24小时。

之后，回收上清液，96孔培养板上每孔放入100μl，再加入同等量的格里斯试剂(Griess’reagent)(Sigma公司，圣路易斯，密苏里州，美国)后在常温下轻轻晃动10分钟后，在570nm的波长下测定吸光度。

以亚硝酸钠(Sodium Nitrite)(Sigma公司，圣路易斯，密苏里州，美国) 为标准品来制作校准曲线，来求得加入各试样的培养液中的一氧化氮的生成量。以使用脂多糖处理的组的一氧化氮生成量为100％来求出各试样处理组的一氧化氮的％收率。

并且，在去除经过式样处理的培养基后，再使用250μg/ml浓度的MTT溶液处理4小时后，去除MTT溶液后使用二甲基亚砜处理后，在570nm的波长下测定吸光度，根据下述数学式1计算细胞存活率，其结果如下述表5及图4所示。

数学式1

表5

如上述表5所示，实施例2-5浓度依赖性地阻碍诱导型一氧化氮合酶的活性，对Raw264.7细胞不显出细胞毒性。确认实施例2浓度依赖性地阻碍诱导型一氧化氮合酶活性的效果非常优秀。

实验例3：通过实时聚合酶链式反应(Real-Time PCR)来确认本发明的混合提取物对诱导型一氧化氮合酶、环氧化酶2、肿瘤坏死因子α、白细胞介素6的基因表达的抑制

使用脂多糖处理作为小鼠的巨噬细胞的Raw264.7细胞来增加诱导型一氧化氮合酶、环氧化酶2、肿瘤坏死因子α、白细胞介素6等炎性细胞因子的基因表达后，利用实时聚合酶链式反应测定通过本发明的混合提取物试样的表达抑制。

将2×10⁶个细胞悬浮于10％的胎牛血清-杜尔贝科改良伊戈尔培养基后接种并附着于60mm的培养皿中。一天后，更换为含有1μg/ml的脂多糖的培养基来诱发炎症后，使用不同浓度的混合提取物试样处理后培养24小时。去除细胞的培养基后，添加1ml的Trizol(Invitrogen公司，美国)后，根据Invitrogen公司的核糖核酸(RNA)分离法分离核糖核酸并定量后，使用1μg的核糖核酸合成互补核糖核酸(cRNA)后实施实时聚合酶链式反应。聚合酶链式反应(PCR)使用的引物为Cosmogenetech公司合成的引物，引物序列如下述表6所示。

表6

进行实时聚合酶链式反应来对炎性细胞因子的表达量进行定量分析的结果如表7及图5至图8所示。

表7

如表7及图5至图8所示，在实施例2-5的条件下，炎性细胞因子的基因表达大大减少，具有优秀的炎症缓解效果。

实验例4：通过表面活性剂的皮肤刺激基因表达阻碍实验

以实验例1至实验例3的结果为基础，将无细胞毒性并且抗炎效果突出的实施例2-5的混合提取物与实施例1-1至实施例1-3的单一提取物进行比较来确认皮肤刺激缓解效果。使用各试样处理作为人角质细胞株的人永生化表皮细胞后，使用表面活性剂(十二烷基硫酸钠(SDS，Sodium dodecyl sulfate))处理后，诱发皮肤刺激，利用实时聚合酶链式反应方法测定作为炎性细胞因子的白细胞介素1α的基因表达。

具体地，将约2×10⁶个细胞悬浮于10％的胎牛血清-杜尔贝科改良伊戈尔培养基后接种并附着于60mm的培养皿中。一天后，使用各式样按照不同浓度处理并培养4小时后，使用10μg/ml的表面活性剂处理1天并诱发刺激后，去除培养基后添加1ml的Trizol(Invitrogen公司，美国)后，根据Invitrogen公司的核糖核酸分离法分离核糖核酸并定量后，使用1μg的核糖核酸合成互补核糖核酸后实施实时聚合酶链式反应。聚合酶链式反应使用的引物为Cosmogenetech公司合成的引物，引物序列如下述表8所示。

表8

进行实时聚合酶链式反应来对炎性细胞因子的表达量进行定量分析的结果如表9及图9所示。

表9

如上述表9及图9所示，作为炎症缓解效果最突出的组合条件的实施例2-5 与实施例1-1、实施例1-2及实施例1-3相比，显著减少由表面活性剂诱导的炎性细胞因子的基因表达，具有皮肤刺激缓解效果。

实验例5：通过表面活性剂的皮肤刺激缓解蛋白质分泌实验

使用试样处理作为人角质细胞株的人永生化表皮细胞后，使用表面活性剂 (十二烷基硫酸钠(SDS，Sodium dodecyl sulfate))处理后，诱发皮肤刺激，利用酶联免疫吸附测定(ELISA，Enzyme-linked immune assay)对作为炎性细胞因子的白细胞介素1α的蛋白质分泌进行测定。将约2×10⁵个细胞悬浮于10％的胎牛血清-杜尔贝科改良伊戈尔培养基后接种并附着于24孔培养板中。一天后，使用各式样按照不同浓度处理并培养4小时后，使用10μg/ml的表面活性剂进行处理并诱发刺激。一天后，使用冲洗溶液冲洗酶联免疫吸附测定板2次。将使用稀释剂(assay buffer)与浓度依赖性地稀释的标准溶液以1:1的比例稀释的培养基试样添加到培养板。向培养板加入结合有生物素(biotin)的抗体，在室温下反应 2小时。使用冲洗溶液冲洗培养板2次后，使用链霉亲和素-辣根过氧化物酶 (Streptavidin-HRP)溶液处理培养板后在室温下反应1小时，之后使用冲洗溶液冲洗2次。向培养板加入四甲基联苯胺(tetramethyl benzidine，TMB)铁氧化酶基质。在室温下使培养板反应10分钟，并有规律地晃动。放入终止液终止反应后，在450nm的波长下测定吸光度，对炎性细胞因子蛋白质的分泌量进行定量分析的结果如表10及图10所示。

表10

如上述表10及图10所示，实施例2-5显著减少由表面活性剂诱导的炎性细胞因子蛋白质的分泌，具有皮肤刺激缓解效果。

制备例1：包含马齿苋、艾叶及红景天混合提取物的剂型的制备

以实验例1至实验例3的结果为基础，如表11所示的方法制备了包含3％的混合提取物的霜剂剂型，混合提取物相当于无细胞毒性且抑制诱导型一氧化氮合酶并抑制诱导型一氧化氮合酶、环氧化酶2、肿瘤坏死因子α、白细胞介素6的基因表达的实施例2-5的制备方法及组合。

表11

成分	含量(重量百分比)
		水(Water)	69.95
混合提取物	3.00
		Microcare Emollient PTG	5.00
Amigum	0.30
		Dermofeel GSC SG	4.50
Myritol 312	15.00
		Nafol 1618	2.25
合计	100

实验例6：利用包含马齿苋、艾叶以及红景天的混合提取物的剂型的对皮肤刺激的保护效果

使用将上述实施例2-5中制备的混合提取物按照制备例1的内容制备的营养霜，以30名健康的成人男女为对象进行对人体皮肤刺激的效果试验，试验方法如下。

首先以2mg/cm²的量使用制备例1的剂型在作为试验部位的前臂内侧处理4 ×5cm²的大小后，用水冲洗前臂内侧后，在恒温恒湿室(温度：22±2℃，相对湿度：50±7.5％)中待30分钟，之后，实施对前臂内侧面试验部位的经皮水分损失测定(TEWL，Transepidermalwater loss，TM 300型)和红斑仪器测定(Erythema，Skin color a*，色度计(Chromameter)CR 400型)以及皮肤科评价(肉眼评价)(基准点，baseline)。

之后，以2mg/cm²的量使用制备例1的剂型在作为试验部位的前臂内侧处理 4×5cm²的大小，15分钟后，将5％的十二烷基硫酸钠单一贴片在每个人的试验部位适用约24小时。适用贴片后，在约24小时去除贴片，使用纸巾小心地进行擦拭。一天后，使受试者在恒温恒湿室(温度：22±2℃，相对湿度：50±7.5％)中待30分钟，之后，实施对前臂内侧面试验部位的经皮水分损失测定(TEWL， Transepidermal water loss，TM 300型)和红斑仪器测定(Erythema， Skin color a*，色度计(Chromameter)CR 400型)以及皮肤科评价(第三天 (DAY3))。

单位面积蒸发的水分量(g/(m²h))如表12及图11所示，其变化量如图 12所示。

如表12、图11及图12所示，使用制备例1的剂型处理的组比无处置组或安慰剂组表现出更低的经皮水分损失，该结果在统计学上有意义。

表12

使用色度计测定的皮肤发红程度(skin color a*)如表13及图13所示，其变化量如图14所示。

观察表13、图13及图14所示的结果，使用制备例1的剂型处理的组相比于无处置组或安慰剂组，红斑症状得到缓解，该结果在统计学上有意义。

表13

以30人为对象的皮肤科评价(肉眼评价)的测定值如表14所示，表中的值表示表现出各个反应的人员数。皮肤科评价(肉眼评价)是通过经过训练的评分者(grader)(皮肤科医生)按照以下的标准对各个测试区域的客观皮肤状态进行评价。评价标准：0表示无刺激(No reaction)，0.5表示非常弱的刺激(very slight)， 1表示低刺激(slight)，2表示中刺激(Moderate)，3表示高刺激(Strong)。

观察表14所示的结果，使用3％的混合提取物处理的组相比于无处置组及安慰剂组，产生的对皮肤刺激的反应更弱。

表14

*第一天的评价定义为基准点。

**表中的值表示表现出反应的人员数。

如上述表12至表14及图11至图14所示，涂敷本发明的3％的混合提取物时，保护皮肤屏障，由十二烷基硫酸钠刺激引起的经皮水分损失及对皮肤刺激的反应(红斑)的表现减少。

因此，由上述效果可知，本发明的马齿苋、艾叶及红景天的混合提取物具有减少对皮肤刺激的反应的皮肤保护功效。

实验例7：利用马齿苋提取物、艾叶提取物及红景天提取物的混合提取物的对皮肤刺激的恢复及镇静效果

利用按照上述制备例1中记载的方法制备的剂型，以30名健康的成人男女为对象进行对皮肤刺激的恢复及镇静效果试验，实验方法如下。

首先，对于大小为4×5cm²的作为试验部位的前臂内侧，将0.5％的十二烷基硫酸钠单一贴片在每个人的试验部位适用约24小时。适用贴片后，在约24小时去除贴片，使用纸巾小心地进行擦拭。一天后，使受试者在恒温恒湿室(温度： 22±2℃，相对湿度：50±7.5％)中待30分钟，之后，实施对前臂内侧面试验部位的经皮水分损失测定(TEWL，Transepidermal water loss，TM 300 型)和红斑仪器测定(Erythema，Skincolor a*，色度计(Chromameter)CR 400 型)以及皮肤科评价(肉眼评价)(基准点，baseline)(第三天(DAY)，baseline)。之后，以2mg/cm²的量使用制备例1的剂型在指定的部位应用2天。两天后，使受试者在恒温恒湿室(温度：22±2℃，相对湿度：50±7.5％)中待30分钟，之后，实施对前臂内侧面试验部位的经皮水分损失测定(TEWL，Transepidermalwater loss，/>TM 300型)和红斑仪器测定(Erythema，Skin color a*，色度计(Chromameter)CR 400型)以及皮肤科评价(第五天(DAY5))。再以2mg/cm²的量使用制备例1的剂型在指定的部位适用3天后，使受试者在恒温恒湿室(温度：22±2℃，相对湿度：50±7.5％)中待30分钟，之后，实施对前臂内侧面试验部位的经皮水分损失测定(TEWL，Transepidermal water loss，/>TM 300型)和红斑仪器测定(Erythema，Skincolor a*，色度计(Chromameter)CR 400 型)以及皮肤科评价(第八天(DAY8))。单位面积蒸发的水分量(g/(m²h)) 如表15所示，其恢复量如图15所示。

如表15、图15所示，使用所制备的剂型处理的组比无处置组或安慰剂组表现出更高的经皮水分损失的恢复量。

表15

使用色度计测定的皮肤发红程度如表16所示，其恢复量如图16所示。

观察表16所示的结果，使用所制备的剂型处理的组相比于无处置组或安慰剂组，红斑症状得到缓解。

表16

皮肤科评价(肉眼评价)测定值如表17所示。

表17

*第三天的评价定义为基准点。

如上述表15至表17以及图15至图16所示，由十二烷基硫酸钠引起皮肤刺激后涂敷本发明的3％混合提取物，恢复皮肤屏障，从而表现出恢复经皮水分损失及对皮肤刺激的反应(红斑)。

因此，由上述效果可知本发明的马齿苋、艾叶及红景天的混合提取物具有皮肤屏障强化乃至对皮肤刺激的恢复以及皮肤镇静效果。

序列表

<110> 株式会社现代百朗德

<120>含马齿苋、艾叶及红景天的混合提取物作为有效成分的皮肤保护及刺激缓解用化妆品组合物

<130> PU210007CN

<160> 14

<170> KoPatentIn 3.0

<210> 1

<211> 21

<212> 脱氧核糖核酸（DNA）

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 诱导型一氧化氮合酶正义引物（iNOS sense primer）

<400> 1

cattgctccc ttccgaagtt t 21

<210> 2

<211> 19

<212> 脱氧核糖核酸（DNA）

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 诱导型一氧化氮合酶反义引物（iNOS Anti-sense primer）

<400> 2

gcctcctttg agccctttg 19

<210> 3

<211> 22

<212> 脱氧核糖核酸（DNA）

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 环氧化酶2正义引物（COX-2 Sense primer）

<400> 3

ggccatggag tggacttaaa tc 22

<210> 4

<211> 23

<212> 脱氧核糖核酸（DNA）

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 环氧化酶2反义引物（COX-2 Anti-sense primer）

<400> 4

aaggcgcagt ttatgttgtc tgt 23

<210> 5

<211> 23

<212> 脱氧核糖核酸（DNA）

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 肿瘤坏死因子α正义引物（TNF-alpha Sense primer）

<400> 5

tctcatcagt tctatggccc aga 23

<210> 6

<211> 22

<212> 脱氧核糖核酸（DNA）

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 肿瘤坏死因子α反义引物（TNF-alpha Anti-sense primer）

<400> 6

caggcttgtc actcgaattt tg 22

<210> 7

<211> 21

<212> 脱氧核糖核酸（DNA）

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 白细胞介素6正义引物（IL-6 Sense primer）

<400> 7

tcggcaaacc tagtgcgtta t 21

<210> 8

<211> 24

<212> 脱氧核糖核酸（DNA）

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 白细胞介素6反义引物（IL-6 Anti-sense primer）

<400> 8

tttctgacca cagtgaggaa tgtc 24

<210> 9

<211> 21

<212> 脱氧核糖核酸（DNA）

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 甘油醛-3-磷酸脱氢酶正义引物（GAPDH Sense primer）

<400> 9

ggcatcttgg gctacactga g 21

<210> 10

<211> 22

<212> 脱氧核糖核酸（DNA）

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 甘油醛-3-磷酸脱氢酶反义引物（GAPDH Anti-sense primer）

<400> 10

ggaagagtgg gagttgctgt tg 22

<210> 11

<211> 20

<212> 脱氧核糖核酸（DNA）

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 白细胞介素1α正义引物（IL-1 alpha Sense primer）

<400> 11

tgaatgacgc cctcaatcaa 20

<210> 12

<211> 21

<212> 脱氧核糖核酸（DNA）

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 白细胞介素1α反义引物（IL-1 alpha Anti-sense primer）

<400> 12

tatgtaatgc agcagccgtg a 21

<210> 13

<211> 19

<212> 脱氧核糖核酸（DNA）

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> β肌动蛋白正义引物（Beta-actin sense primer）

<400> 13

ggcacccagc acaatgaag 19

<210> 14

<211> 21

<212> 脱氧核糖核酸（DNA）

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> β肌动蛋白反义引物（Beta-actin Anti-sense primer）

<400> 14

ccgatccaca cggagtactt g 21

Claims (4)

1.马齿苋、艾叶及红景天的混合提取物在制备用于皮肤保护或皮肤刺激缓解的化妆品组合物中的用途，

其中上述混合提取物中马齿苋、艾叶及红景天的混合重量比为1～10:1～10:1，

其中上述马齿苋的提取物和艾叶的提取物使用水和乙醇的混合溶剂来提取，

其中上述红景天的提取物使用甲醇来提取，

其中上述艾叶的提取物中异断短舌匹菊内酯ISTP的含量为10％(w/w)～20％(w/w)，且

其中上述红景天的提取物中肉桂醇甙的含量为10％(w/w)～20％(w/w)。

2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，相对于组合物总重量，包含0.001重量百分比至3.0重量百分比的上述混合提取物。

3.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，上述组合物通过抑制炎性细胞因子的表达来缓解皮肤刺激及炎症。

4.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，上述组合物减少因皮肤刺激引起的红斑。