KR20150027469A - Nk세포 활성화 작용의 항바이러스 조성물 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 초제 처리한 팥꽃나무 추출물로부터 얻은 유기용매 분획물을 유효성분으로 포함하는 항바이러스 조성물을 제공한다. 본 발명 조성물의 유효성분은 NK 세포로부터 항바이러스 사이토카인인 IFN-γ의 분비량을 현저히 증가시켜 강력한 항바이러스 활성을 나타낸다. 본 발명의 조성물은 바이러스성 질환의 치료 또는 예방용 약제학적 조성물로 제조될 수 있을 뿐만 아니라, 바이러스성 질환의 예방 또는 개선용 기능성 식품 조성물 및 동물 사료 첨가용 조성물로 개발될 수 있다.

Description

NK세포 활성화 작용의 항바이러스 조성물{Antiviral composition showing effects on NK cell activation}
본 발명은 초제(수치) 처리한 팥꽃나무 (Daphne genkwa) 추출물로부터 팥꽃나무 용매 분획물 또는 다프난 타입 디테르펜 (daphnane type diterpene) 화합물을 유효성분으로 포함하는 항 인플루엔자 바이러스 조성물에 관한 것이다.
팥꽃나무(Daphne genkwa) 추출물은 동양 전통의학에서 이뇨제, 진해제, 거담제 및 부종을 치료하는데 사용되어 왔으나, 이의 생물학적 활성은 아직까지 명확히 알려져 있지 않다. 팥꽃나무의 꽃은 '원화', 뿌리는 '원화근'이라하며 모두 약으로 쓴다. 꽃은 봄철 꽃봉오리일 때 채취하여 햇볕에 말려 쓰고, 뿌리는 그대로 썰어서 쓴다. 팥꽃나무는 전라 남북도와 충청남도의 해안을 따라 넓은 지역에서 자생한다. 주의사항으로는 본초강목에서 팥꽃나무 추출물을 감초과 같이 사용하면 이뇨와 사하작용이 모두 억제되고 독성이 증가한다고 보고되어 있으며, 그밖에 설사가 동반되고 독성이 강해 임산부 사용에 주의를 요한다. 반면 팥꽃나무를 초산에 법제(수치)하면 그 독성이 상당량 감소한다고 보고되어 있다.
IFN(interferon)-γ는 면역시스템의 활성화된 T 세포 및 NK 세포가 바이러스, 기생충 및 종양세포와 같은 외부물질에 의한 침입에 대응하여 생성하는 천연 단백질이다. IFN-γ는 사이토카인과 같은 당단백질에 속한다. IFN-γ는 바이러스 감염의 중요 지시자인 이중나선 RNA의 존재에 대응하여 다양한 세포들에 의해 생성된다. IFN-γ는 숙주세포내의 바이러스 복제를 억제하고, NK 세포를 활성화시키며, 림프 세포에 대한 항원 제시를 증가시키고, 숙주세포의 바이러스 감염에 대한 내성을 증가시킴으로써 면역 반응을 돕는다. 항원이 매칭되는 T 세포 및 B 세포에 제시되면 이들 세포들이 증식하여 외부물질을 전략적이면서 특이적인 방법으로 제거한다. 이러한 점에서 항원제시는 면역반응에서 매우 중요한 기작이다.
NK(Natural Killer) 세포는 선천 및 획득 면역 반응에 관여하는 것으로 알려져 있다. NK 세포는 세포독성 및 사이토카인 생성을 통해 이의 효능(effector function)을 매개한다. NK 세포는 수용체 및 타겟 세포에 대한 리간드에 의해 매개되는 세포독성 효능 세포로 기능한다. 세포독성에 대한 NK 특이 수용체는 자연 세포독성 수용체(natural cytotoxic receptors, NCRs)로 불리우는 NKp46([Sivori, S. et al, J Exp Med, (1997), 186, 1129-1136]), NKp30([Pende, D. et al, J Exp Med, (1999), 190, 1505-1516]) 및 NKp44 ([Cantoni, C. et al, J Exp Med, (1999), 189, 787-796]) 등이다. NCRs에 대한 리간드로는 인플루엔자 바이러스(IV)의 히마글루티닌(hemagglutinin, HA), 센다이 바이러스(Sendai virus, (SV)의 히마글루티닌-뉴라미니다아제(hemagglutinin-neuraminidase,HN)([Arnon, T. I. et al, Eur J Immunol, (2001), 31, 2680-2689]), 막-결합된 헤파린 설페이트 프로테오글리칸(membrane-associated heparin sulfate proteoglycans)([Bloushtain, N. et al, J Immunol, (2004), 173, 2392-2401]) 등이 알려져 있다. 또한, NK 세포는 IFN-γ와 같은 사이토카인 분비를 통해 획득 면역 반응의 발달을 돕는데 중요한 역할을 한다([Stetson, D. B. et al, J Exp Med, (2003), 198, 1069-1076]). IFN-γ가 뮤린 사이토메갈로바이러스 (murine cytomegalovirus) 감염에서 항-바이러스 활성을 갖는다는 것이 보고되었다. NK 세포의 효능은 직접적인 선천 방어 및 획득 면역 반응의 형성에 모두 관여하고 있다. 몇 가지 마우스 모델에서, NK 세포들이 종양의 발달과 미생물 감염을 억제하였다. 특히, NK 세포는 마우스 사이토메갈로바이러스 (mouse cytomegalovirus, MCMV) 감염의 초기 단계에서 직접 바이러스 감염된 세포를 사멸시키고 IFN-γ를 생성시킴으로써 조절자 역할을 한다. NK 세포내에서 IFN-γ 생성에 대한 주요 경로는 PKCθ의 활성화에 의존한다. Tassi et al은 ITAMs를 통해 신호를 전달하는 NK-세포 수용체가 관여함으로써 PKCθ가 신속하게 활성화된다고 보고하였다. PKCθ 결핍 마우스로부터 NK 세포를 분석한 결과 PKCθ는 ITAM-매개 IFN-γ 분비에서 필수 요소라는 것을 알 수 있었다([Tassi, I. et al, Blood, (2008), 112, 4109-4116]).
PLCγ도 IFN-γ 분비에서 매우 본질적인 기초 인자이다. IFN-γ의 기저수준은 PLCγ2-결핍 NK 세포내에서 현저하게 감소하였고, 야생형 세포와는 달리, 항-NK1.1 에 의한 자극에 의하더라도 IFN-γ 분비가 확대되는 결과를 보이지 않았다([Caraux, A. et al, Blood, (2006), 107, 994-1002]). PLCγ2-결핍 NK 세포들은 IFN-γ 또는 GM-CSF 생성 능력이 심각하게 손상되었고, PLCγ2는 NK1.1-매개 사이토카인 생성 뿐만 아니라 NKG2D에서도 중요한 역할을 한다([Regunathan, J. et al, J Immunol, (2006), 177, 5365-5376]). 마우스내에서, FcRs (FcR)의 γ-사슬을 포함하며, 이 수용체는 결합된 adaptor's ITAMs 의 티로신 잔기 인산화 결과에 이르게 되고, 이는 다시 티로신 키나아제 Syk를 모이게 한다. 이 키나아제는 T 세포 활성화용 링커, 76 kDa, PLC, PI3K 및 Erk 키나아제를 포함하는 다수의 하부의 신호전달 매개자들을 활성화시킨다. 종합적으로 이 신호전달 매개자들은 유전자 전사와, NK 세포가 타겟 세포들을 용해시키는데 사용하는 용해성 과립의 엑소시토시스(exocytosis)를 위한 세포 프로그램을 개시하고, 친-염증성 케모카인 및 사이토카인, 특히 IFN-γ를 생성시킨다([Tassi, I. et al, J Immunol, (2005), 175, 749-754]).
본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조 되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.
본 발명자들은 식물로부터 유래된 천연추출물로부터 항바이러스 효능을 발휘할 수 있는 물질을 발굴하기 위해 연구 노력한 결과, 팥꽃나무 추출물과 이로부터 헥산 또는 에틸아세테이트 등 유기용매 가용 분획물이 NK 세포에서 IFN-γ의 분비를 현저히 증가시켜 항바이러스 효능을 나타낼 수 있음을 실험적으로 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 팥꽃나무 유기 용매 가용 분획물을 유효성분으로 포함하는 항바이러스 조성물을 제공하는 것에 있다. 또한, 본 발명의 다른 목적은 디테르펜 화합물 겐크와다프닌(genkwadaphnin) 또는 유안후아신(yuanhuacine)을 유효성분으로 포함하는 항 인플루엔자 바이러스 조성물을 제공하는 것에 있다.
본 발명의 목적 및 장점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구의 범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 팥꽃나무 추출물의 유기용매 가용 분획물을 유효성분으로 포함하는 항바이러스 조성물을 제공한다.
본 발명의 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 화합물을 유효성분으로 포함하는 항 인플루엔자 바이러스 조성물을 제공한다.
[화학식 1]
Figure pat00001
단, 상기 화학식 1에서, R은 -C6H5 또는 -CH=CHCH=CH(CH2)4CH3 이다.
발명자들은 식물로부터 유래된 천연추출물로부터 항바이러스 효능을 발휘할 수 있는 물질을 발굴하기 위해 연구 노력한 결과, 팥꽃나무 추출물의 유기용매 가용 분획물이 NK 세포에서 IFN-γ의 분비를 현저히 증가시켜 항바이러스 효능을 나타낼 수 있음을 실험적으로 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
팥꽃나무(Daphne genkwa)는 한국·중국·일본 등지에 분포하는 낙엽관목으로 바닷가 근처에서 자란다. 높이 1m 내외이고 가지는 검은 갈색이며 누운털이 있다 잎은 마주달리지만 때로는 어긋나게 달리고 긴 타원형 또는 도피침형으로 뒷면에 털이 있으며, 가장자리가 밋밋하다. 꽃은 3-5월에 피고 전년생 가지 끝에 3-7개가 산형 꽃차례로 달리며 연한 자주색이고 지름 10-12㎜이다. 꽃받침은 통처럼 생기고 겉에 잔털이 있으며 끝이 4개로 갈라져서 꽃잎 같이 된다. 열매는 둥글고 투명하며 7월에 익는다. 팥꽃나무는 유독식물로 알려져 있으며, 겐크와닌(genkwanin), 수산화겐크와닌(hydroxy- genkwanin), 아피게닌(apigenin), 시토스테롤(sitosterol)이 들어있다. 한방에서는 꽃을 원화라 하여 약재로 이용한다. 「중약대사전」에 의하면, “맛은 맵고 쓰며, 성질은 따듯하고 독이 있다.”고 언급되며, 원화의 효능은 대극, 감수와 비슷하며 신체 상부에 쌓인 수습을 제거하는 효과가 크다. 때문에 가슴이나 옆구리의 담 또는 수종같은 질병을 치료하고, 기가 위로 치솟하 기침이 나는 증상과 소변과 대변이 잘 통하지 않는 증상에도 유효하다. 뿌리는 원화근이라 하며, 역시 수종, 결핵성경부림프선염, 급성유선염, 옴, 치루 등을 치료하는데 이용한다.
본 발명 조성물의 유효성분인 팥꽃나무 추출물은 당업계에 공지된 다양한 추출방법에 의해 얻을 수 있다. 바람직하게는, 공지된 통상적인 추출용매, 바람직하게는 (a) 물, (b) 탄소수 1-4의 무수 또는 함수 저급 알코올 (메탄올, 에탄올, 프로판올, 부탄올 등), (c) 상기 저급 알코올과 물과의 혼합용매, (d) 아세톤, (e) 에틸 아세테이트, (f) 클로로포름 또는 (g) 1,3-부틸렌글리콜을 이용하여 얻을 수 있다.
본 명세서에서, 용어 “팥꽃나무 용매 분획물”은 상기 추출 시 이용하였던 용매와 다른 용매를 이용하여 상기 팥꽃나무 추출물로부터 본 발명에서 목적으로 하는 활성을 분획하여 얻은 활성 분획물(fraction)을 의미한다. 팥꽃나무 용매 분획물을 얻기 위하여 사용되는 용매는 당업계에서 통상적으로 이용되는 어떠한 추출용매도 가능하며, 바람직하게는, (a) 탄소수 1-4의 무수 또는 함수 저급 알코올 (예: 메탄올, 에탄올, 프로판올, 부탄올, 노말-프로판올, 이소-프로판올 및 노말-부탄올 등), (b) 상기 저급 알코올과 물과의 혼합용매, (c) 아세톤, (d) 에틸 아세테이트, (e) 클로로포름, (f) 1,3-부틸렌글리콜, (g) 헥산, (h) 디에틸에테르, 또는 (i) 부틸아세테이트이다.
본 명세서에서 사용되는 용어 “추출물”은 상술한 바와 같이 당업계에서 조추출물(crude extract)로 통용되는 의미를 갖지만, 광의적으로는 상술한 용매 분획물도 포함한다.
본 발명에서 팥꽃나무 추출물은 팥꽃나무의 줄기, 뿌리, 잎, 꽃잎, 꽃 봉오리로부터 얻을 수 있으며, 보다 바람직하게는 팥꽃나무의 꽃잎 또는 꽃 봉오리로부터 얻을 수 있다.
본 발명 조성물에서 유효성분인 상기 화학식 1에서 R= -C6H5인 경우의 화합물은 다프난 타입 디테르펜(daphnane-type diterpene) 화합물로서 IUPAC 체계에 의한 정식 명칭은 12-O-벤조일-5-히드록시-6,7-에폭시-레시니페로놀-9,13,14-오르토벤조에이트(12-O-benzoyl-5-hydroxy-6,7-epoxy-resiniferonol-9,13,14-orthobenzoate)이다. 본 명세서에서는 상기 화합물을 지칭하기 위해 "겐크와다프닌 (genkwadaphnin)"의 용어를 혼용하여 기재한다.
또한, 본 발명 조성물의 다른 유효성분인 상기 화학식 1에서 R= -CH=CHCH=CH(CH2)4CH3인 경우의 화합물을 지칭하기 위해 본 명세서에서 "유안후아신 (yuanhuacine)"의 용어를 사용하여 기재한다.
상기 본 발명 조성물에서 화합물 "겐크와타프닌"또는 "유안후아신"은 IFN-γ 유도 활성을 갖는 것이라면, 화학적으로 합성된 것을 사용할 수도 있으며, 상기 팥꽃나무 추출물 또는 팥꽃나무 용매 분획물로부터 분리 정제한 것을 사용할 수도 있다.
상기 "겐크와다프닌" 또는 "유안후아신"을 팥꽃나무 추출물 또는 용매 분획물로부터 단일 화합물 형태로 분리하기 위해서, 용매 처리하여 수득한 팥꽃나무 추출물 또는 분획물에 추가 정제과정을 행할 수 있다. 예컨대, 일정한 분자량 컷-오프 값을 갖는 한외여과막을 이용한 분리, 다양한 크로마토그래피(크기, 전하, 소수성 또는 친화성에 따른 분리를 위해 제작된 것)에 의한 분리 등, 추가적으로 실시된 다양한 정제 방법을 통해 얻을 수 있다.
본 발명의 팥꽃나무 추출물, 팥꽃나무 용매 분획물, 겐크와다프닌, 유안후아신은 NK 세포에서 IFN-γ의 분비를 현저히 증가시킴으로써 항 인플루엔자 바이러스 효능을 발휘한다. IFN-γ는 Th1 세포, Tc 세포, 수지상세포 (dendritic cell) 및 NK 세포 등에 의해 분비되는 이량체 사이토카인으로서 타입 II (type II) 인터페론에 속한다. IFN-γ은 본래부터 대식세포(macrophage) 활성자로 불리울 만큼 식세포 활성작용이 강하며, 현재 연구된 바에 의하면 약 30개 정도의 유전자의 전사 변화를 유도하여 하기와 같은 다양한 면역 및 세포 반응을 생성하는 것으로 알려져 있다: ⅰ) 대식세포의 항원제시 증가, ⅱ) 대식세포에서 리소좀(lysosome) 활성 증가 및 활성화, ⅲ) Th2 세포 활성억제, ⅳ) 정상세포에서 클래스 I MHC 분자의 발현증가, ⅴ) 백혈구세포의 이동성 증가, 및 ⅵ) NK 세포 활성의 증가.
본 발명의 조성물의 항바이러스 효능이 적용될 수 있는 바이러스로는 예를 들어, SI (돼지독감), 인플루엔자바이러스(influenza virus), 조류인플루엔자바이러스(avian influenza virus), 리노바이러스(rhinovirus), 아데노바이러스(adenovirus), 코로나바이러스(coronavirus), 파라인플루엔자바이러스(parainfluenza virus), 호흡기 합포체 바이러스(respiratory syncytial virus), 포진 바이러스(Herpesvirus, HSV), 후천성 면역결핍 증후군 바이러스(HIV), 간염바이러스를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 바람직한 구현 예에 의하면, 본 발명의 조성물은 항바이러스용 약제학적 조성물로 제공될 수 있다. 본 발명의 약제학적 조성물은 상기 설명된 유효성분 이외에 약제학적으로 허용되는 담체를 포함한다.
본 발명의 약제학적 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.
본 발명의 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다. 한편, 본 발명의 약제학적 조성물의 경구 투여량은 바람직하게는 1일 당 0.001-50 mg/kg(체중)이다. 본 발명의 약제학적 조성물은 경구 또는 비경구로 투여할 수 있고, 비경구로 투여되는 경우, 정맥내 주입, 피하 주입, 근육 주입, 복강 주입, 경피 투여 등으로 투여할 수 있다. 본 발명의 약제학적 조성물은 적용되는 질환의 종류에 따라, 투여 경로가 결정되는 것이 바람직하다.
본 발명의 약제학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화 함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.
본 발명의 바람직한 구현예에 의하면, 본 발명의 항바이러스용 조성물은 바이러스성 질환 개선용 기능성 식품조성물의 형태로 제공될 수 있다.
본 발명의 기능성 식품 조성물은 식품 제조 시에 통상적으로 첨가되는 성분을 포함하며, 예를 들어, 단백질, 탄수화물, 지방, 영양소 및 조미제를 포함한다.
예컨대, 드링크제로 제조되는 경우에는 유효성분 이외에 향미제 또는 천연 탄수화물을 추가 성분으로서 포함시킬 수 있다. 예를 들어, 천연 탄수화물은 모노사카라이드(예컨대, 글루코오스, 프럭토오스 등); 디사카라이드(예컨대, 말토스, 수크로오스 등); 올리고당; 폴리사카라이드(예컨대, 덱스트린, 시클로덱스트린 등); 및 당알코올(예컨대, 자일리톨, 소르비톨, 에리쓰리톨 등)을 포함한다. 향미제로서 천연 향미제(예컨대, 타우마틴, 스테비아 추출물 등) 및 합성 향미제(예컨대, 사카린, 아스파르탐 등)을 이용할 수 있다.
본 발명의 바람직한 구현 예에 의하면, 본 발명의 조성물은 동물 사료 첨가용 조성물의 형태로 제공될 수 있다. 본 발명의 동물 사료 첨가용 조성물은 항바이러스 효능을 가지므로 가축의 사료에 첨가하면 바이러스성 질환의 예방 또는 개선 효과를 기대할 수 있다. 본 명세서에서 사료는 가축의 생명을 유지하고 젖, 고기, 알, 털가죽 등을 생산하는 데 필요한 유기 또는 무기 영양소를 공급하는 물질을 의미한다. 사료는 영양가, 주성분, 유통, 수분함량 배합상태 및 가공형태 등에 따라 여러 가지로 분류할 수 있으며 본 발명에서 사료는 조사료, 농후사료, 보충사료, 단백질사료, 녹말사료, 지방질사료, 섬유질사료을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다.
i) 본 발명은 초제 처리한 팥꽃나무 추출물로부터 얻은 유기용매 가용 분획물의 새로운 항바이러스 용도를 제시한다.
ⅱ) 본 발명 조성물의 유효성분인 팥꽃나무 유기용매 가용 분획물은 NK 세포로부터 IFN-γ의 분비양을 현저히 증가시킨다. 따라서, 본 발명의 조성물은 강력한 항바이러스 활성을 갖는다.
ⅲ) 본 발명의 항바이러스 조성물은 바이러스성 질환의 치료 또는 예방용 약제학적 조성물로 응용될 수 있을 뿐만 아니라, 기능성 식품 조성물과 동물 사료 첨가용 조성물로 개발이 가능하다.
본 발명은 초제 처리한 팥꽃나무 추출물로부터 얻은 유기용매 분획물을 유효성분으로 포함하는 항바이러스 조성물을 제공한다. 본 발명 조성물의 유효성분은 NK 세포로부터 IFN-γ의 분비양을 현저히 증가시켜 강력한 항바이러스 활성을 나타낸다. 본 발명의 조성물은 바이러스성 질환의 치료 또는 예방용 약제학적 조성물로 제조될 수 있을 뿐만 아니라, 바이러스성 질환의 예방 또는 개선용 기능성 식품 조성물 및 동물 사료 첨가용 조성물로 개발될 수 있다.
도 1a는 팥꽃나무 추출물과 그 부탄올 용매 분획물을 농도 별로 NK92 세포에 처리한 후 IFN-γ의 생성을 ELISA 키트(Endogen)를 사용하여 행한 분석결과이다.
도 1b는 상기 도 1a의 사이토카인 분석에 처리된 시료를 고속 액체크로마토 그래피에서 분석한 결과이다.
도 2a는 팥꽃나무 추출물과 그 부탄올, 헥산 용매 분획물을 농도 별로 NK92 세포에 처리한 후 IFN-γ의 생성을 ELISA 키트를 사용하여 행한 분석결과이다.
도 2b는 상기 도 2a의 사이토카인 분석에 처리된 시료를 고속 액체크로마토 그래피에서 분석한 결과이다.
도 3a는 팥꽃나무 추출물과 그 부탄올, 에틸아세테이트, 헥산 용매 분획물을 농도 별로 NK92 세포에 처리한 후 IFN-γ의 생성을 ELISA 키트를 사용하여 행한 분석결과이다.
도 3b는 상기 도 3a의 사이토카인 분석에 처리된 시료를 고속 액체크로마토 그래피에서 분석한 결과이다.
도 4는 팥꽃나무 추출물과 그 에틸아세테이트, 헥산 용매 분획물을 농도 별로 NK92 세포에 처리한 후 IFN-γ의 생성을 ELISA 키트를 사용하여 행한 분석결과이다.
도 5는 팥꽃나무 추출물과 그 부탄올, 에틸아세테이트, 헥산 용매 분획물을 대상으로 고속 액체크로마토 그래피 상 non-polar한 활성분획을 보다 세밀하게 전개하여 유효성분을 분석한 결과이다. 즉, 도 5는 도 3b의 retention time 12분부터 15분 사이를 확대 전개한 것으로 유효성분인 겐크와다프닌(genkwadaphnin)과 유한후아신(yuanhuacine) 피크를 확인하였다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
이하, 본 발명을 실시예, 실험예 및 제조예에 의하여 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예, 실험예 및 제조예는 본 발명을 구체적으로 예시하는 것이며, 본 발명의 내용이 실시예, 실험예 및 제조예에 의해 한정되는 것은 아니다.
팥꽃나무의 초제
유독식물로 알려져 있는 팥꽃나무의 독성을 낮추기 위하여 초제(수치) 처리한다. 간략히 설명하면, 팥꽃나무를 수세한 뒤 건조 후 분쇄하여 용기에 절반가량 담고 산도 4% 내외의 식용 초산을 적절한 양에 맞춰 30분 버무린다. 이후 2~3시간 숙성시킨 후 원적외선 초제기에 넣고 저온(180도)으로 1시간 초제한다.
팥꽃나무의 추출물 제조
간략히 설명하면, 초제(수치)된 팥꽃나무를 에탄올을 용매로 사용하여 추출한 후, 여과지를 사용하여 에탄올 가용부 만을 회수하였다. 여과물은 동일한 방법으로 2회 더 반복 실시한 후 에탄올 가용부를 모아 감압농축하여 에탄올 추출물을 수득하였다.
세포 배양
IL-2 의존성 NK 세포주 NK92(human NK lymphoma)는 ATCC(American Type Culture Collection) 로부터 구입하였다. NK92 세포는 20％ FCS(HyClone, Logan, UT), 2 mM L-글루타메이트, 100 ug/㎖ 페니실린, 100 ug/㎖ 스트렙토마이신 (Life Technologies)을 포함하고 100 U/㎖의 IL-2 (Chiron, Emeryville, CA)가 첨가된 α-MEM (Life Technologies, Karlsruhe, Germany) 배지에서 유지하였다.
IFN -γ 생성에 대한 ELISA 분석
인간 IFN-γ의 정량은 상업적으로 구입가능한 mAb (Endogen)을 사용하여 제조자의 지시된 프로토콜에 따라 수행하였다. 37℃에서 18 시간 인큐베이션한 후에 세포를 제거하여 상등액을 수집하였다. 결과는 3회 수행한 값의 평균 ± SEM으로 표시하여 하기 표 1~4에 나타내었다.
팥꽃나무 용매 분획물의 IFN-γ 생산 (ELISA)
처리농도 조추출물( Crude ) 부탄올층( Bu ) 수층( Aq ) DMSO
평균 표준편차 평균 표준편차 평균 표준편차 평균
40 ug/ml 0.761 0.092 0.710 0.089 0.091 0.134 0.135
4 ug/ml 0.684 0.078 0.691 0.067 0.112 0.092
표 1에 나타낸 바와 같이, 본 발명자들에 의한 실험결과 팥꽃나무 추출물과 이의 유기용매 부탄올 분획물에서 배양된 NK92 세포에서 사이토카인, 특히 IFN(interferon)-γ의 분비 유도능을 갖고 있음이 확인되었다. 또한 이러한 사이토카인 유도활성은 팥꽃나무 추출물의 부탄올 용매 분획시료에서 나타나며, 수층은 유도활성이 없었다 (도 1a, 1b).
상기 팥꽃나무 추출물을 유기용매 극성에 따라 보다 세분화하여 추출하여 NK92 세포에서 IFN(interferon)-γ의 분비 유도능을 평가한 결과 헥산, 에틸아세테이트 등 보다 비극성에서 용매에서 유도 활성이 증가하였다 (표 2~3, 도 2a, 도 3a).
팥꽃나무 용매 분획물의 IFN-γ 생산 (ELISA)
처리농도
( 헥산층 ) 		조추출물( Crude ) 헥산층( Hx ) 부탄올층( Bu ) 수층( Aq ) DMSO
평균 표준편차 평균 표준편차 평균 표준편차 평균 표준편차 평균
40 ug/ml
(4 ug/m)		 0.740 0.088 0.714 0.071 0.436 0.074 0.107 0.044 0.094
4 ug/ml
(0.4 ug/m)		 0.757 0.141 0.791 0.060 0.118 0.047 0.116 0.102
팥꽃나무 용매 분획물의 IFN-γ 생산 (ELISA)
처리농도
( 헥산층 ) 		조추출물
( Crude ) 		헥산층( Hx ) 에틸아세테이트층( EA ) 부탄올층
( Bu ) 		수층( Aq ) DMSO
40 ug/ml
(4 ug/m)		 평균 평균 평균 평균 평균
40 ug/ml
(4 ug/m)		 0.737 0.769 0.547 0.109 0.088 0.117
4 ug/ml
(0.4 ug/m)		 0.672 0.712 0.250 0.142 0.122
나아가 고속 액체크로마토그래피 분석을 통해 이러한 사이토카인 유도활성은 팥꽃나무 추출물의 non-polar한 부분에서 비롯되며(도 2b, 도 3b), HPLC 상에서 상기의 유효활성 분획을 보다 정밀하게 분석한 결과, 화학식 1에서 언급한 유효성분인 겐크와다프닌(genkwadaphnin)과 유한후아신(yuanhuacine)을 각각 확인하였다 (도 5).
팥꽃나무 추출물 용매분획물의 특이활성도(specific activity) 평가를 수행하기 위하여 헥산, 에틸아세테이트 유기용매 분획시료의 농도에 따른 NK92 세포에서 IFN(interferon)-γ의 분비 유도능을 평가한 결과 표 4와 같이 조추출물 5 ug/ml 농도와 헥산추출물의 0.25 ug/ml 농도의 ELISA 값이 유사한 수치를 나타내므로 조추출물 대비 헥산분획물에서 약 20배의 특이활성도를 예상할 수 있다(도 4).
팥꽃나무 용매 분획물의 IFN-γ 생산 (ELISA)
시료 처리농도( ug / ml ) 평균( ng / ml ) 표준편차
DMSO - 0.061 0.003
조추출물(crude) 20 0.780 0.020
10 0.702 0.011
5 0.569 0.034
2.5 0.4215 0.013
1.25 0.233 0.021
헥산층(Hx) 4 1.018 0.088
2 1.0015 0.054
1 0.891 0.030
0.5 0.7215 0.134
0.25 0.5385 0.008
에틸아세테이트층(Ea) 10 0.6935 0.054
5 0.578 0.010
2.5 0.512 0.045
1.25 0.367 0.030
0.63 0.197 0.038
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims (7)

  1. 초제(수치) 처리한 팥꽃나무 (Daphne genkwa) 추출물로부터 그 용매 분획물 또는 다프난 타입 디테르펜 (daphnane type diterpene) 화합물을 유효성분으로 포함하는 항 인플루엔자 바이러스(anti-influenza virus) 조성물.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 팥꽃나무 추출물의 추출용매는 탄소수 1-4의 무수 또는 함수 저급 알코올, 상기 저급 알코올과 물과의 혼합용매, 아세톤, 에틸 아세테이트, 클로로포름, 부틸 아세테이트, 1,3-부틸렌글리콜, 헥산 또는 디에틸에테르인 것을 특징으로 하는 조성물.
  3. 제 1 항에 있어서, 상기 조성물은 바이러스성 질환의 치료 또는 예방용 약제학적 조성물인 것을 특징으로 하는 항 조성물.
  4. 제 1 항에 있어서, 상기 조성물은 바이러스성 질환의 개선 또는 예방용 기능성 식품 조성물인 것을 특징으로 하는 조성물.
  5. 제 1 항에 있어서, 상기 조성물은 바이러스성 질환의 개선 또는 예방을 위한 동물 사료 첨가용 조성물인 것을 특징으로 하는 조성물.
  6. 제 1 항에 있어서, 상기 팥꽃나무 추출물 또는 그 용매 분획물은 NK (Natural Killer) 세포에서 IFN(interferon)-γ의 분비 유도 작용을 통해 항바이러스 활성을 나타내는 것을 특징으로 하는 조성물.
  7. 제 4 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 바이러스성 질환은 인플루엔자바이러스, 조류인플루엔자바이러스, 리노바이러스, 아데노바이러스, 코로나바이러스, 파라인플루엔자바이러스, 호흡기 합포체 바이러스, 포진 바이러스, 후천성 면역결핍 증후군 바이러스, 또는 간염바이러스의 감염에 의한 질환인 것을 특징으로 하는 조성물.
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