KR101529390B1

KR101529390B1 - 투실라곤을 유효성분으로 포함하는 수지상세포의 성숙화 억제용 조성물

Info

Publication number: KR101529390B1
Application number: KR1020130113962A
Authority: KR
Inventors: 한상배; 황방연; 김영수; 홍진태; 박윤수
Original assignee: 충북대학교 산학협력단
Priority date: 2013-09-25
Filing date: 2013-09-25
Publication date: 2015-06-16
Also published as: KR20150033978A

Abstract

본 발명은 투실라곤의 수지상세포 성숙화 및 활성화 억제의 신규 용도에 관한 것이다. 본 발명의 투실라곤은 성숙화 유도된 수지상세포에서 발생되는 NO(nitric oxide) 생성, MHC-I, MHC-II, CD40, CD80, CD86 등의 세포 표면 분자의 발현, 식세포작용, IL-12, TNF-α, IL-1β, IFN-α, IFN-β와 같은 사이토카인의 생성, 림프절로의 이동능, MAPK (mitogen activated protein kinase) 활성화, 및 림프절에서의 T 림프구 활성화 유도능 등을 효과적으로 억제한다. 본 발명의 투실라곤은 수지상세포의 성숙화 및 활성화 억제 활성을 가지므로 면역억제제 및 자가면역질환 치료제로 개발될 수 있다.

Description

투실라곤을 유효성분으로 포함하는 수지상세포의 성숙화 억제용 조성물{Composition for Suppression of Dendritic Cell Maturation Comprising Tussilagone As Active Ingredient}

본 발명은 투실라곤을 유효성분으로 포함하는 수지상세포의 성숙화 또는 활성화 억제용 조성물에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 투실라곤을 유효성분으로 포함하는 면역억제제 및 자가면역질환 치료, 예방 또는 개선용 조성물에 관한 것이다.

수지상세포(dendritic cell, DC)는 T 림프구에 의한 면역반응을 가장 효과적으로 유도할 수 있는 기능을 가진 세포로 알려지면서 항-종양 면역력을 유도할 수 있는 매우 중요한 세포로 인식되고 있다. 수지상세포는 탐식작용 등을 통해 항원을 획득하고, 세포내에서 처리하여, MHC에 항원 펩티드를 탑재하여 표현함으로써 항원특이 T 세포 수용체를 가진 T 림프구의 활성화를 강력히 유도한다. 또한 활성화된 수지상세포는 IL-12, TNF-α, IL-1등의 사이토카인을 발현하여 T 림프구의 자멸사(apoptosis)를 막고 T 림프구의 분화와 CTL 활성을 유도할 뿐 아니라 자연살해세포의 활성을 증가시켜 항-종양 면역력을 높이는 것으로 알려져 있다.

수지상세포는 면역반응을 유발하는 기능 외에도 다양한 기전을 통해 면역관용(immune tolerance)을 유발하는 것으로 알려져 있다. 최근 연구결과에 따르면 수지상세포의 지속적인 성숙화 및 활성화가 전신 홍반성 낭창(루푸스) 및 쇼그렌 증후군과 같은 자가면역질환에 관여한다고 보고되었다. 따라서 수지상세포의 성숙을 억제하는 것이 이러한 자가면역질환들의 치료에 유용할 것이라고 생각되고 있다.

관동(Tussilago farfara L.)은 북아시아, 서남아시아, 유럽, 북아프리카, 북아메리카 등 세계적으로 폭넓게 분포되어 있는 국화과의 다년생 식물로 국내에서 자생하지 않고 약용으로만 재배된다. 종자와 지하경을 이용하여 번식하며, 개화기는 2월부터 3월까지이다. 민들레와 유사한 형태의 밝은 노란색의 꽃을 피우며, 둥글고 넓은 형태의 잎을 가진다. 개화줄기의 길이는 5-30cm 정도까지 자라며, 이른 봄에 잎이 나기 전에 꽃이 먼저 피는 특징을 가지고 있다. 관동은 폐가 건조한 것을 적시어주며 기를 아래로 내려 가래를 삭히고 기침을 멎게 하는 효능이 있는 것으로 알려져 있으며, '관동화'라 불리는 관동의 꽃봉오리는 동양의학에서 오랫동안 천식이나 기관지염 등 호흡기 질환에 대한 기침억제제로 사용되어 왔다. 관동은 거담작용, 항염증작용, 진해작용, 중추신경흥분작용, 혈관수축작용, 윤폐작용, 기관지 이완작용 등의 효능이 있다고 알려져 있으며, 한의학에서는 거담, 염좌, 기침, 가래, 천식, 기관지염을 다스리는 생약으로 사용하고 있다. 관동의 추출물은 클로로겐산, 루틴, 투실라곤 등의 유효성분을 포함하고 있으며, 이 중 투실라곤은 대식세포의 활성화 및 염증성 사이토카인의 분비를 억제하여 항염작용을 한다고 보고되어 있다. 그러나 투실라곤과 수지상세포의 활성에 관한 연구는 아직 보고된 바 없다.

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.

대한민국 공개특허 제10-2007-0008228호

본 발명자들은 강력한 항원제시세포인 수지상세포의 활성화 및 성숙화를 억제하는 활성을 통해 면역억제제 및 자가면역질환 치료제로 개발될 수 있는 후보물질을 천연물로부터 발굴하기 위해 연구 노력하였다. 그 결과, 관동에서 추출한 투실라곤이 수지상세포의 성숙화 및 활성화를 효과적으로 억제한다는 사실을 실험적으로 증명함으로써 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 투실라곤을 유효성분으로 포함하는 수지상세포 성숙화 또는 활성화 억제용 조성물을 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적은 투실라곤을 유효성분으로 포함하는 면역억제제를 제공하는데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 투실라곤을 유효성분으로 포함하는 자가면역질환의 치료, 예방 또는 개선용 조성물을 제공하는데 있다.

본 발명의 목적 및 장점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구의 범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 투실라곤을 유효성분으로 포함하는 수지상세포의 성숙화 또는 활성화 억제용 조성물을 제공한다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 투실라곤을 유효성분으로 포함하는 면역억제제를 제공한다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 투실라곤을 유효성분으로 포함하는 자가면역질환의 치료, 예방, 또는 개선용 조성물을 제공한다.

본 발명은 투실라곤이 미성숙 수지상세포의 성숙 수지상세포로의 성숙화 및 활성화를 효과적으로 억제한다는 사실을 실험적으로 증명한 것에 기초한다.

본 발명의 유효성분인 투실라곤(Tussilagone)은 하기 화학식 1로 표시되는 화합물이다.

본 발명 조성물의 유효성분인 투실라곤은 천연물 예컨대 관동으로부터 추출된 것일 수 있으며, 화학적으로 합성된 것일 수도 있다. 화학적으로 합성된 투실라곤도 천연물로부터 추출된 것과 동일한 활성을 갖는다는 것은 당업자에게 자명하다.

본 명세서에서 용어 "수지상세포(dendritic cell, DC)"는 항원을 세포내부로 흡수하고 이를 처리하여 항원 또는 항원으로부터 유래된 펩타이드를 MHC (major histocompatibility complex) class I 복합체 또는 MHC class Ⅱ 복합체와 함께 제시하는 전문적 항원 제시 세포(professional antigen presenting cell)를 의미한다. 본 발명에서의 수지상세포는 Steinman 등(Annual Rev. Immunol. 9:271-296, 1991 및 Banchereau and Steinman Nature 392:245-252, 1998)에 의해 제시된 수지상세포의 전형적인 표현형과 특성을 갖는 세포를 의미한다. 수지상세포는 면역성(immunogenic) 및 면역관용성(immuno tolerogenic) 항원 제시 세포를 모두 포함하며, 성숙도에 따라 미성숙 수지상세포(immature DC), 준성숙 수지상세포(semimature DC) 및 성숙 수지상세포(mature DC)로 분류할 수 있다.

본 명세서에서 용어 "수지상세포의 성숙화 또는 활성화"는 수지상세포가 전문적 항원제시세포로서의 능력을 획득하는 과정을 의미한다.

수지상세포의 성숙은 세균 또는 바이러스와 같은 병원체로부터 유래되는 분자 예컨대, LPS, CpG DNA, 및 dsRNA와 이를 인식할 수 있는 다양한 종류의 TLR 수용체간의 상호 작용에 의해 이루어진다.

수지상세포는 자극물에 대하여 면역체계가 작동하여 염증반응을 유도할 것인가 또는 관용(tolerance)으로 받아들일 것인가를 초기에 결정하고, 이후 미경험 T 림프구(naive T cells)가 어떤 T 림프구로 분화할 것인가를 결정하는데 핵심적인 역할을 한다. 미성숙 수지상세포는 식작용이나 수용체를 통한 세포내이입(endocytosis)을 통하여 항원을 포획하여, 세포내의 일련의 과정을 통하여 항원을 가공후 MHC에 항원 펩티드를 탑재하여 T 림프구에 제시하게 된다. 항원을 가공하는 과정과 함께 수지상세포는 점점 성숙하게 되어 식작용과 세포내이입에 사용되는 수용체를 잃고 MHC class I, MHC class Ⅱ, CD(cluster determinant) 80, CD86 및 CD40과 같은 표면 분자들의 발현이 증가되고, 새로운 사이토카인 수용체를 발현하여 주변 림프절의 T 림프구가 풍부한 지역으로 이동하여 T 림프구에 항원을 제시함으로써 T 림프구 면역반응을 일으키게 된다.

본 발명의 투실라곤은 하기 구체적인 일 실시예에서 입증되는 바와 같이, 리포폴리사카라이드(LPS)에 의해 유발되는 수지상세포의 성숙화 및 활성화를 효과적으로 억제한다. 보다 구체적으로, 투실라곤은 리포폴리사카라이드(LPS) 처리된 수지상세포에서 유도되는 NO(nitric oxide) 생성, MHC-I, MHC-II, CD40, CD80, CD86 등의 세포 표면 분자의 발현, 식세포작용, IL-12, TNF-α, IL-1β, IFN-α, IFN-β와 같은 사이토카인의 생성, 림프절로의 이동능, MAPK (mitogen activated protein kinase) 활성화, 및 림프절에서의 T 림프구 활성화 유도능을 억제한다.

수지상세포의 성숙화 및 활성화는 T 림프구에 의한 면역반응 유도에 필수적이며, 또한 미성숙 상태의 수지상세포가 면역관용을 유도함으로써 면역억제 활성을 나타낸다고 알려져 있으므로, 수지상세포의 성숙화 및 활성화 억제 활성을 갖는 본 발명의 투실라곤은 면역억제제로 유용하게 사용될 수 있다.

본 발명의 투실라곤은 면역억제가 필요한 질환 또는 증상에 사용될 수 있으며, 예컨대, 면역 반응에 의해 매개되는 조직 또는 기관의 이식편 거부(graft rejection)를 방지하기 위한 면역억제제로서 유용하게 사용될 수 있다. 이식편 거부란 이식편(이식되는 생체의 일부로 세포, 조직 또는 장기)의 공여자와 수용자간의 유전적 배경이 상이하여 (1) 공여자의 이식편 유래 면역 세포가 수요자를 외부물질로 인식하여 공격함으로써 유발되는 질환(즉, 이식편 대 숙주질환) 및 (2) 수용자가 공여자의 이식편을 외부물질로 인식하여 공격함으로써 유발되는 질환 (즉, 이식편 거부반응)을 포함한다. 거부 반응을 일으키는 이식된 조직 및 기관의 예로서는 심장, 신장, 간, 연골질, 피부, 각막, 폐, 췌장, 소장, 사지 (limb), 근육, 신경, 십이지장, 소장, 췌장 인슐린 생산세포 등 뿐만 아니라, 연골질 이식에 의해 발생되는 이식편-대-숙주 질환을 들 수 있다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 투실라곤을 유효성분으로 포함하는 자가면역질환의 치료, 예방 또는 개선용 조성물을 제공한다. 수지상세포의 성숙화 및 활성화는 T 림프구에 의한 면역반응 유도에 필수적이며, 또한 미성숙 상태의 수지상세포가 면역관용을 유도함으로써 면역억제 활성을 나타낸다고 알려져 있으므로, 수지상세포의 성숙화 및 활성화 억제 활성을 갖는 투실라곤은 자가면역질환의 치료, 예방 및 개선에 유용하게 사용될 수 있다.

본 명세서에서 용어 "자가면역질환"은 자기의 체조직, 장기조직이나 성분에 대해 항체가 생성되어 발생되는 질환을 의미한다. 본 발명에서 치료, 예방 또는 개선 대상인 자가면역질환은 예를 들어 류마티스 관절염, 다발성 경화증, 타입 I 당뇨병, 중증근무력증, 전신 홍반성 낭창(루푸스), 쇼그렌증후군, 그레이브스병, 막 사구체신염, 건선, 궤양성 대장염, 크론병, 강직성 척추염, 하시모토병, 염증성 장질환, 실험적 자가면역 뇌척수염(experimental autoimmune encephalomyelitis), 및 면역 호중구 감소증 등을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 보다 바람직하게는 상기 자가면역질환은 전신홍반성낭창(루푸스), 또는 쇼그렌증후군이다.

본 발명의 상기 조성물은 약제학적 조성물의 형태로 제공될 수 있다. 이 경우 본 발명의 약제학적 조성물은 유효성분인 투실라곤 이외에 약제학적으로 허용되는 담체를 포함할 수 있다. 이러한 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.

본 발명의 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다. 한편, 본 발명의 약제학적 조성물의 경구 투여량은 바람직하게는 1일 당 0.001 - 1000 mg/kg(체중)이다.

본 발명의 약제학적 조성물은 경구 또는 비경구로 투여할 수 있다. 비경구로 투여되는 경우, 정맥내 주입, 피하 주입, 근육 주입, 복강 주입, 경피 투여 등으로 투여할 수 있다.

본 발명의 조성물에 포함되는 유효성분의 농도는 치료 목적, 환자의 상태, 필요기간 등을 고려하여 결정할 수 있으며 특정 범위의 농도로 한정되지 않는다.

본 발명의 약제학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캡슐제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.

본 발명의 상기 조성물은 자가면역질환의 개선 용도의 기능성 식품 조성물의 형태로도 제공될 수 있으며, 이 경우 본 발명의 식품 조성물은 상술한 유효성분인 투실라곤 이외에 식품 제조 시에 통상적으로 첨가되는 성분을 포함한다. 예를 들어, 단백질, 탄수화물, 지방, 영양소, 조미제 및 감미제를 포함한다. 상술한 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스, 올리고당 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 사이클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 감미제로서 천연 감미제[타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시리진 등)] 및 합성 감미제(사카린, 아스파르탐 등)를 사용할 수 있다. 예컨대, 본 발명의 식품 조성물이 드링크제로 제조되는 경우에는 본 발명의 유효성분 이외에 구연산, 액상과당, 설탕, 포도당, 초산, 사과산, 과즙, 두충 추출액, 대추 추출액, 감초 추출액 등을 추가로 포함시킬 수 있다.

도 1은 리포폴리사카라이드의 처리에 의해서 유도되는 수지상세포의 NO (nitric oxide) 생성에 대한 투실라곤의 억제효과를 나타내고 있다.
도 2는 리포폴리사카라이드의 처리에 의해서 유도되는 수지상세포의 표현형의 변화에 대한 투실라곤의 억제효과를 나타내고 있다.
도 3은 리포폴리사카라이드의 처리에 의해서 유도되는 수지상세포의 식세포작용의 변화에 대한 투실라곤의 억제 효과를 나타내고 있다.
도 4는 리포폴리사카라이드의 처리에 의해서 유도되는 수지상세포의 사이토카인 분비에 대한 투실라곤의 억제 효과를 나타내고 있다.
도 5는 리포폴리사카라이드의 처리에 의해서 유도되는 수지상세포의 이동능력 변화에 대한 투실라곤의 억제 효과를 나타내고 있다.
도 6은 리포폴리사카라이드의 처리에 의해서 유도되는 수지상세포의 신호전달계의 변화에 대한 투실라곤의 억제 효과를 나타내고 있다.
도 7은 리포폴리사카라이드의 처리에 의해서 유도되는 수지상세포의 T 림프구 활성화능에 대한 투실라곤의 억제 효과를 나타내고 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예

실시예 1. 리포폴리사카라이드에 의해 유도되는 수지상세포 성숙화에 대한 투실라곤의 영향

제조예 1: 실험동물의 준비

실험동물은 체중 18-22g의 C57BL/6 암컷 마우스(대한바이오링크, 충북)를 사용하였고, 동물사육실에서 일정한 조건(온도: 21±2℃, 명암: 12시간 명암주기)에서, 사료와 음수의 자유로운 섭취가 가능하도록 하였으며, 실험시작 전까지 물과 먹이를 충분히 제공하며 실험시작 전에 실험동물을 7일 동안 동물사육실에서 순화시켰다.

제조예 2: 수지상세포의 준비

C57BL/6 마우스로부터 골수세포를 분리한 후 2 X 10⁵ cells/ml 농도로 세포배양을 하였다. 2 ng/ml 농도로 GM-CSF를 첨가하여 8일간 배양하였으며, 이때 생성되는 수지상세포는 미성숙 수지상세포라고 알려져 있다.

실험예 1: 수지상세포의 NO (nitric oxide) 생성에 미치는 영향

제조예 2와 같은 방법으로 미성숙 수지상세포를 준비하였다. 이들 미성숙 수지상세포를 96 플레이트(plate)에 5 X 10⁵ cells/ml 농도로 분주하고 2시간 안정화시켰다. 분주한 수지상세포에 투실라곤을 1-30 μM의 농도로 첨가하고 리포폴리사카라이드를 1 μg/ml의 농도로 첨가하여 24시간 동안 배양하였다. 배양이 끝난 후 상층액 100 μl에 griess 시약 (griess A : B =1:1) 100 μl를 가해주고 실온에서 10 분간 반응시켜 540 nm에서 흡광도를 측정하여 NO 생성량을 정량하였다.

도 1에서 알 수 있듯이, NO (nitric oxide)의 생성은 대조군의 경우는 4％ 이었고, 리포폴리사카라이드 처리군에서는 100％로 증가하엿으며, 리포폴리사카라이드와 투실라곤을 동시에 처리한 실험군에서는 농도에 따라서 89, 68, 46, 2%로 감소하였다.

실험예 2: 수지상세포의 세포 표면인자 발현에 미치는 영향

제조예 2와 같은 방법으로 미성숙 수지상세포를 준비하였다. 이들 미성숙 수지상세포에 투실라곤을 1-30μM의 농도로 첨가하고 리포폴리사카라이드를 1μg/ml의 농도로 첨가하여 24시간 동안 배양하였다. 배양이 끝난 후 세포를 수거하고 FITC(Fluorescein Isothiocyanate)-MHC I, FITC-MHC II, FITC-CD40, FITC-CD80, FITC-CD86, PE(R-Phycoerythrin)-CD11c 등의 항체로 염색한 후 유세포분석기(flow cytometer)를 이용하여 분석하였으며 Mean Fluorescence Intensity (MFI)로 결과를 표현하였다. MFI 수치가 높을수록 표면인자의 발현이 강함을 의미하며, 또한 수지상세포의 성숙(maturation)도가 증가함을 의미한다. CD11c는 수지상세포에서 선택적으로 발현되는 표면인자이며, MHC-I, MHC-II, CD40, CD80, CD86 등은 수지상세포가 성숙할수록 많이 발현되는 표면 인자이다.

도 2에서 알 수 있듯이, MHC-I의 발현도는 대조군의 경우에는 19.88이었고, 리포폴리사카라이드 처리군에서는 93.89로 증가하였으며, 리포폴리사카라이드와 투실라곤을 동시에 처리한 실험군에서는 농도에 따라서 93.16, 85.97, 79.35, 63.51로 감소하였다. MHC-II의 발현도는 대조군의 경우에는 18.26이었고, 리포폴리사카라이드 처리군에서는 65.51로 증가하였으며, 리포폴리사카라이드와 투실라곤을 동시에 처리한 실험군에서는 농도에 따라서 61.52, 58.46, 52.97, 34.76 으로 감소하였다. CD40의 발현도는 대조군의 경우에는 18.02 였고, 리포폴리사카라이드 처리군에서는 99.75로 증가하였으며, 리포폴리사카라이드와 투실라곤을 동시에 처리한 실험군에서는 농도에 따라서 96.64, 93.71, 72.28, 52.11으로 감소하였다. CD80의 발현도는 대조군의 경우에는 19.11이었고, 리포폴리사카라이드 처리군에서는 35.98로 증가하였으며, 리포폴리사카라이드와 투실라곤을 동시에 처리한 실험군에서는 농도에 따라서 34.66, 34.20, 28.77, 21.16으로 감소하였다. CD86의 발현도는 대조군의 경우에는 19.24였고, 리포폴리사카라이드 처리군에서는 80.58로 증가하였으며, 리포폴리사카라이드와 투실라곤을 동시에 처리한 실험군에서는 농도에 따라서 78.72, 75.84, 65.00, 32.36 으로 감소하였다.

실험예 3: 수지상세포의 항원취득(antigen uptake)에 미치는 영향

미성숙 수지상세포는 항원취득을 잘하지만, 성숙한 수지상세포는 항원취득 능력이 감소한다고 알려져 있다. 투실라곤이 리포폴리사카라이드에 의해 유도되는 수지상세포의 성숙화를 억제하였다면 리포폴리사카라이드의 처리에 의해 감소되는 식세포작용이 상대적으로 적게 감소할 것으로 예상되어, 이를 증명하기 위한 실험을 수행하였다.

제조예 2와 같은 방법으로 미성숙 수지상세포를 준비하였다. 이들 미성숙 수지상세포에 1-30μM 농도의 투실라곤과 1μg/ml 농도의 리포폴리사카라이드를 첨가하여 24시간 동안 배양하였다. 배양이 끝난 후 세포를 수거한 후, FITC-dextran 이라는 항원을 0.7 mg/ml의 농도로 세포에 2시간 동안 처리하였다. 세포를 세척하여 여분의 FITC-dextran을 완전히 제거한 후 수지상세포 내부에 유입된 항원의 양을 유세포 분석기를 이용하여 측정하였다. 수지상세포에 선택적으로 결합하는 CD11c-PE 항체를 이용하여 2중 염색을 시도하였으며, 이는 수지상세포를 선택적으로 분리분석한 후 항원취득도를 분석하기 위함이었다.

도 3에서 알 수 있듯이, 37℃에서 2시간 동안 배양할 때 대조군의 항원취득도는 40％ 이었으며, 리포폴리사카라이드가 처리된 수지상세포의 항원취득도는 19％로 감소하였다. 또한, 초기 예상과는 달리 1-30μM 농도의 투실라곤과 1μg/ml 농도의 리포폴리사카라이드를 동시 처리한 실험군에서 농도에 따라서 16, 14, 12, 12％로 항원취득도가 더 감소하였다. 이는 투실라곤이 수지상세포의 고유 기능인 항원취득능력을 억제하는 것을 의미한다. 4℃에서 배양할 경우 세포의 항원취득이 완전히 정지하여 모든 세포에 2-4％의 낮은 항원 취득도를 나타내었다. 이는 항원취득이 능동적으로 일어나는 면역반응임을 의미한다.

실험예 4: 수지상세포의 사이토카인 생성에 미치는 영향

제조예 2와 같은 방법으로 미성숙 수지상세포를 준비하였다. 이들 미성숙 수지상세포에 투실라곤을 1-30μM의 농도로 첨가하고 리포폴리사카라이드를 1μg/ml의 농도로 첨가하여 24시간 동안 배양하였다. 배양이 끝난 후 세포를 수거하여 수지상세포에서 RNA를 분리하여 RT-PCR(Reverse transcription-polymerase chain reaction)로 사이토카인의 발현량을 측정하였으며, 배양액을 수거하여 수지상세포에서 분비된 사이토카인의 양을 면역효소법(enzyme-linked immunoassay)으로 측정하였다. 실험재료는 R&D Systems로부터 구입하였으며, 회사에서 제공하는 시험법에 준하여 실험을 수행하였다.

도 4의 A 패널 및 도 4의 B 패널에서 알 수 있듯이, 대조군은 IL-12, TNF-α, IL-1β, IFN-α, IFN-β의 사이토카인을 거의 분비하지 못하였고, 리포폴리사카라이드 처리군에서는 이들 사이토카인의 분비가 강하게 증가하였지만, 리포폴리사카라이드와 투실라곤을 동시에 처리하였을 경우 농도 의존적으로 사이토카인의 분비가 억제됨을 확인하였다. 이 결과로부터 리포폴리사카라이드에 의한 수지상세포의 성숙화가 투실라곤에 의해서 억제됨을 알 수 있었다.

실험예 5: 수지상세포의 이동능력에 미치는 영향

수지상세포가 항원을 포획하고 성숙화되면 T 세포를 활성화 시키기 위해 T 세포가 있는 림프절(lymph node, LN)로 이동한다. 미성숙한 수지상세포는 염증과 관련된 케모카인 수용체인 CC chemokine receptor(CCR)1과 CCR5를 많이 발현하고 있지만, 성숙화가 진행되면 CCR7의 발현이 증가한다. 수지상세포 표면에 존재하는 케모카인 수용체의 변화는 수지상세포의 이동능력에 영향을 준다. 제조예 2와 같은 방법으로 미성숙 수지상세포를 준비하였다. 이들 미성숙 수지상세포에 투실라곤을 30μM의 농도로 첨가하고 리포폴리사카라이드를 1μg/ml의 농도로 첨가하여 4 시간 동안 배양하였다. 배양이 끝난 후 세포를 수거하여 케모카인 수용체의 발현도를 RT-PCR(Reverse transcription-polymerase chain reaction)로 측정하였다.

도 5의 A 패널에서 알 수 있듯이, CCR1과 CCR5 유전자의 경우 대조군에서 강하게 발현되었으며 리포폴리사카라이드 처리군에서는 발현량이 감소하였다. 하지만 투실라곤과 리포폴리사카라이들 동시 처리한 군에서에는 CCR1과 CCR5유전자의 발현량이 농도 의존적으로 증가하였다. 반면에 CCR7 유전자는 대조군에서는 거의 발현되지 않고 리포폴리사카라이드 처리군에서는 강하게 발현되었으며, 투실라곤을 동시 처리한 군에서는 CCR7 유전자의 발현이 농도 의존적으로 감소하였다.

다음으로 트랜스웰(transwell)을 이용하여 수지상세포의 이동능력의 변화를 확인하였다. 제조예 2와 같은 방법으로 미성숙 수지상세포를 준비하였다. 이들 미성숙 수지상세포에 투실라곤을 30μM의 농도로 첨가하고 리포폴리사카라이드를 1μg/ml의 농도로 첨가하여 24시간 동안 배양하였다. 배양이 끝난 후 세포를 수거하여 수지상세포를 2 X 10⁶ cells/ml 농도로 상부 챔버(upper chamber)에 분주하고 하부 챔버(lower chamber)에는 CCR5의 리간드인 RANTES와 CCR7의 리간드인 MIP-3β를 각각 30-300 ng/ml의 농도로 첨가한 후 37℃ 배양기에서 6시간 반응시켰다. 그 후 하부 챔버(lower chamber)로 이동된 세포수는 유세포분석기를 이용하여 측정하였다.

도 5의 B 패널에서 알 수 있듯이, 대조군의 경우 MIP-3β에 의한 움직임의 변화가 나타나지 않았고 RANTES의 농도에 의존적으로 움직임이 증가하였다. 리포폴리사카라이드 처리군에서는 대조군과는 반대로 MIP-3β의 농도에 의존적으로 움직임이 증가하였으며 RANTES에 의한 움직임의 변화는 나타나지 않았다. 투실라곤과 리포폴리사카라이드 동시처리한 군에서는 MIP-3β와 RANTES 모두에 대하여 움직임이 증가하였지만 MIP-3β보다 RANTES의 농도에 의존적으로 움직임이 증가하였다. 이 결과로부터 리포폴리사카라이드에 의한 수지상세포의 이동능력의 변화가 투실라곤에 의해서 억제됨을 알 수 있었다.

실험예 6: 수지상세포의 신호전달계에 미치는 영향

수지상세포는 성숙과정 중에 ERK, JNK, p38 등의 mitogen-activated protein kinases가 활성화된다고 알려져 있다. 제조예 2와 같은 방법으로 미성숙 수지상세포를 만든 후 1-30μM 농도의 투실라곤과 1μg/ml의 리포폴리사카라이드를 20분간 처리하였으며, 세포를 파괴하여 단백질을 모두 분리하였다. 인산화되어 있는 ERK, JNK, p38의 단백질양은 특정항체를 이용하는 웨스턴 블랏팅(western blooting) 방법으로 측정하였다.

도 6의 A 패널과 같이 인산화되어 있는 p-JNK, p-p38의 양이 리포폴리사카라이드의 처리군에서는 증가하였지만 리포폴리사카라이드와 투실라곤의 동시처리군에서는 농도 의존적으로 감소하였다. p-ERK의 양은 감소하지 않았다.

수지상세포는 성숙하는 도중에 NF-κB(nuclear factor-kappa B)가 활성화된다고 알려져 있다. 제조예 2와 같은 방법으로 미성숙 수지상세포를 만든 후 리포폴리사카라이드와 투실라곤을 20분 처리하였으며, 세포의 핵을 분리한 후 파괴하여 단백질을 모두 분리하였다. 핵내의 NF-κB의 양은 NF-κB의 서브유닛(subunit)인 p65로 확인하였으며 웨스턴 블랏팅(western blooting) 방법으로 측정하였다.

도 6의 B 패널과 같이 핵내의 p65의 양이 대조군에 비해 리포폴리사카라이드 처리군에서는 증가하였지만 리포폴리사카라이드와 투실라곤의 동시처리군에서는 투실라곤의 농도 의존적으로 감소하는 것을 확인하였다.

투실라곤이 NF-κB p65의 핵 내로 이동을 억제했기에 상위 단계인 IkB 분해에 대해서도 억제효과가 있는지 실험하였다. 제조예 2와 같은 방법으로 미성숙 수지상세포를 만든 후 1-30μM 농도의 투실라곤과 1μg/ml의 리포폴리사카라이드를 20분간 처리하였으며, 세포를 파괴하여 단백질을 모두 분리하였다. IκB-α, IκB-β의 분해를 웨스턴 블랏팅(western blotting) 방법으로 측정하였다.

도 6의 C 패널과 같이 IκB-α, IκB-β의 양은 대조군에서 많이 존재하였지만, 리포폴리사카라이드를 처리하였을 때 분해되어 양이 감소하였으며, 리포폴리사카라이드와 투실라곤을 동시처리한 군에서는 투실라곤의 농도 의존적으로 분해가 억제되는 것을 확인하였다.

실시예 2: 리포폴리사카라이드에 의해 유도되는 수지상세포의 T 림프구 활성화능에 대한 투실라곤의 영향

실험예 1: 수지상세포의 T림프구 활성화능에 미치는 영향

성숙화된 수지상세포의 가장 중요한 면역기능은 T 림프구를 활성화하는 것이다. 미성숙한 수지상세포는 항원을 취득하고, 성숙화과정을 거치고, T 세포가 있는 면역기관으로 이동하고, T 세포를 활성화한다. 수지상세포에 의해 활성화된 T 세포는 활발하게 증식(proliferation)하고 사이토카인을 분비하게 된다.

제조예 2와 같은 방법으로 준비한 미성숙 수지상세포에 투실라곤 30μM과 리포폴리사카라이드 1μg/ml을 처리한 후 24 시간 동안 배양하였다. 배양이 끝난 후 세포를 수거하고 동종(allogeneic) T 세포와 3일 동안 혼합배양하였다. 세포배양 마지막 16시간 동안 [³H]-티미딘(thymidine)을 처리하여 증식하는 T 세포의 DNA 내로 방사능물질을 유입하여 세포증식도를 측정하였다.

도 4의 A 패널과 같이 리포폴리사카라이드를 처리한 수지상세포는 강한 T 림프구 증식능을 보였으나 리포폴리사카라이드와 투실라곤을 같이 처리한 수지상세포는 T림프구 증식능이 억제됨을 확인할 수 있었다. 또한 T 세포에서 분비되는 사이토카인인 IFN-γ와 IL-2의 양을 측정하였다. 도 4의 B 패널과 도 4의 C 패널에서 볼 수 있듯이 리포폴리사카라이드를 처리한 수지상세포와 공동배양한 T 림프구에서는 사이토카인 생성량이 강하게 증가하였지만, 리포폴리사카라이드와 투실라곤을 같이 처리한 수지상세포와 공동배양한 T 림프구는 사이토카인 생성이 억제되었다. 이 결과는 투실라곤을 처리하였을 경우 리포폴리사카라이드에 의한 수지상세포의 성숙화가 억제되며 수지상세포에 의한 T 림프구 활성화능도 억제됨을 의미한다.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims

삭제
하기 화학식 1로 표시되는 투실라곤을 유효성분으로 포함하는 면역억제제.
[화학식 1]
제 2 항에 있어서, 상기 투실라곤은 수지상세포의 성숙화 또는 활성화를 억제하는 것을 특징으로 하는 면역억제제.
하기 화학식 1로 표시되는 투실라곤을 유효성분으로 포함하는 자가면역질환의 치료 또는 예방용 약제학적 조성물로서, 상기 자가면역질환은 다발성 경화증, 중증근무력증, 전신홍반성낭창(루푸스), 쇼그렌증후군, 그레이브스병, 크론병, 하시모토병, 또는 면역 호중구 감소증인 것을 특징으로 하는 조성물.
[화학식 1]
삭제
제 4 항에 있어서, 상기 투실라곤은 수지상세포의 성숙화 또는 활성화를 억제하는 것을 특징으로 하는 조성물.
삭제
하기 화학식 1로 표시되는 투실라곤을 유효성분으로 포함하는 자가면역질환의 개선용 기능성 식품 조성물로서, 상기 자가면역질환은 다발성 경화증, 중증근무력증, 전신홍반성낭창(루푸스), 쇼그렌증후군, 그레이브스병, 크론병, 하시모토병, 또는 면역 호중구 감소증인 것을 특징으로 하는 조성물.
[화학식 1]