KR101909814B1 - 향나무 추출물 또는 향나무 유래 화합물을 포함하는 파킨슨 병 예방 또는 치료용 약학 조성물 - Google Patents

향나무 추출물 또는 향나무 유래 화합물을 포함하는 파킨슨 병 예방 또는 치료용 약학 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명에서는 향나무 추출물 및 향나무 유래 화합물인 세드롤(cedrol), 위드롤(widdrol)의 신경세포보호 효능을 사람 신경모세포종 SH-SY5Y 세포를 사용하여 확인하였다. 이 때 SH-SY5Y 세포의 독성을 유발하기 위하여 L-글루탐산 및 6-hydroxydopamine (6-OHDA)를 사용하였다. 본 연구 결과를 통해 향나무 추출물 및 향나무 유래 화합물인 세드롤과 위드롤이 파킨슨 병 예방 또는 치료용 약학 조성물로서의 효능을 보유함을 알 수 있었다.

Description

향나무 추출물 또는 향나무 유래 화합물을 포함하는 파킨슨 병 예방 또는 치료용 약학 조성물 {Pharmaceutical composition for preventing or treating Parkinson's disease comprising Juniperus chinensis extract or Juniperus chinensis-derived compound}
본 발명은 향나무 추출물 또는 향나무 유래 화합물을 포함하는 파킨슨 병 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것으로서, 보다 구체적으로는, 향나무 추출물 또는 향나무로부터 분리될 수 있는 위드롤(widdrol) 또는 세드롤(cedrol)을 유효성분으로 포함하는 파킨슨 병 예방 또는 치료용 약학 조성물 또는 건강기능식품에 관한 것이다.
파킨슨 병은 흑질 치밀부(substantia nigra pars compacta, SNc)에서 도파민작동성 뉴런의 신경퇴화가 특징으로써, 이는 선조체(striatum)에서 점차 도파민의 고갈을 일으킨다. 파킨슨 병의 특징은 기저핵 순환의 균형을 망가뜨리고 운동뉴런의 제 기능을 못하게 하여, 경직(rigidity), 진전(tremor), 운동불능(akinesia)를 일으킨다. 50대 이상의 인구의 1~5 %가 두 번째로 가장 흔하게 겪는 신경퇴화 질병이다.
파킨슨 병의 궁극적인 원인은 아직 밝혀지지 않은 상황이나 정상인의 중뇌의 흑질(substantia nigra) 부위의 신경세포에서 만들어지는 뇌의 신경전달 물질인 도파민(dopamine)의 결핍으로 인해 여러 증상들이 나타나는 것으로 알려져있다.
뇌의 흑질에 분포하는 신경세포에서 생성된 도파민은 선조체(corpus striatum)를 포함하는 뇌의 기저핵(basal ganglia)과 연결된다. 기저핵은 뇌의 운동피질 및 기타 여러 부위와 복잡하게 연결되어 있어 인체의 운동을 부드럽고 조화롭게 그리고 정확하게 수행할 수 있도록 해주는 매우 중요한 부위이다. 이러한 도파민성 신경의 손상에 의하여 결과적으로 기저핵 도파민성 신경 말단에서 유리되는 도파민의 결핍이 파킨슨 병에서 나타나는 운동성 장애의 주요 원인이다.
파킨슨 병의 원인, 즉, 무엇 때문에 흑질의 신경세포가 파괴되는가에 대하여 아직 정확한 해답이 없으나, 이를 규명하기 위하여 활발한 연구가 진행되고 있다. 바이러스성 뇌염 등 감염설, 면역기전이 관계된다는 면역설, 선천적으로 그 기질을 타고난다는 유전설, 유리기가 생성되어 신경세포를 파괴한다는 설, 신경독성 물질의 중독설, 그리고 도파민의 생성 및 대사과정에 문제가 있다는 설 등이 있으나 아직 파킨슨 병 전체를 설명하기에는 부족한 점이 많다.
상기 파킨슨 병의 유발 물질로써, 6-히드록시도파민(6-hydroxydopamine, 6-OHDA)과 L-글루탐산(L-glutamic acid)가 알려져 있다.
상기 6-OHDA는 신경독소로서, 도파민과 화학적 구조가 유사하여 도파민 수송체(DAT)에 의해 흡수되며, 자유 라디칼(free radical)을 만들어내므로 도파민 신경세포를 손상시켜 신경세포 사멸을 일으키는 것으로 알려져 있다(Nat Rev Neurosci, 2001, 2(5), 325-334).
상기 L-글루탐산은 정상 농도에서 생리학적으로 중요한 역할을 하지만 과량 분비되면 흥분 독성을 유발하는 아미노산으로 작용하여, 흥분성 신경 전달물질에 의한 흥분 독성을 일으켜 신경세포의 손상 또는 사멸을 유발한다. 그 결과 기억력 감퇴, 인지기능 저하뿐 아니라, 알츠하이머병, 파킨슨 병 등 다양한 신경퇴행성 질환을 야기한다 (Samuel et al., Localization of N-methyl-D-aspartate receptors in the rat striatum: effects of specific lesions on the [3H] 3-(2-carboxypiperazin-4-yl)propyl-1-phosphonic acid binding. J Neurochem 1990; 54: 1926-1933; Weihmuller et al., Elevated NMDA receptors in Parkinsonian striatum. Neuroreport 1992;3: 997-980).
상기 흥분성 신경전달물질 또는 신경독소 등에 의한 신경세포손상은 중추신경계 내 신경세포의 과도한 세포사멸에 의해 나타나며, 따라서 신경세포의 세포사멸을 저해시키는 것은 기억력 감퇴, 인지기능 저하, 나아가서 신경퇴행성 질환으로부터 신경세포를 보호하는데 많은 도움이 될 것이다.
특히 최근에 신경세포 사멸 및 퇴행성 신경질환으로부터 보호하기 위하여 신경전달물질 수용체에 대한 길항제, GABA 효능제, 세포내 칼슘감소제, 유리 라디칼 제거제, 글루타메이트 유리 억제제 등 다양한 약물의 개발이 시도되고 있으나, 대부분이 위험요소와 부작용을 가지고 있어, 각종 천연자원으로부터 보다 안전하고 신경세포 보호효과가 뛰어난 치료제의 개발이 요구된다.
이러한 배경하에서, 본 발명자들은 향나무 추출물 또는 향나무 유래 화합물을 이용하여 파킨슨 병을 예방 또는 치료할 수 있는 약학 조성물을 개발하기 위한 예의 노력한 결과, 향나무 추출물 또는 그로부터 분리한 화합물인 위드롤 또는 세드롤이 신경세포에 대하여 보호효과를 가지는 것을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 하나의 목적은, 향나무 추출물 또는 그로부터 분리한 화합물을 유효성분으로 포함하는, 파킨슨 병 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 다른 목적은, 향나무 추출물 또는 그로부터 분리한 화합물을 유효성분으로 포함하는 약학 조성물을 인간을 제외한 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 파킨슨 병 예방 또는 치료 방법을 제공하는 것이다.
나아가 향나무 추출물 또는 그로부터 분리한 화합물을 유효성분으로 포함하는 파킨슨 병 예방 또는 개선용 건강기능식품을 제공하고,
향나무 추출물 또는 그로부터 분리한 화합물을 유효성분으로 포함하는 파킨슨 병 예방 또는 개선용 의약외품 조성물을 제공하는 것이다.
이를 구체적으로 설명하면 다음과 같다. 한편, 본 발명에서 개시된 각각의 설명 및 실시형태는 각각의 다른 설명 및 실시 형태에도 적용될 수 있다. 즉, 본 발명에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 발명의 범주에 속한다. 또한, 하기 기술된 구체적인 서술에 의하여 본 발명의 범주가 제한된다고 볼 수 없다.
본 발명의 하나의 양태로서, 본 발명은 향나무 추출물 또는 그로부터 분리한 화합물을 유효성분으로 포함하는, 파킨슨 병 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
본 발명에서 용어, "향나무(Juniperus chinensis)"란 천연, 잡종 또는 변종 향나무의 모든 기관, 예를 들어, 뿌리, 가지, 줄기, 잎, 꽃을 모두 포함하여 의미할 수 있다. 상기 향나무는 측백나무과 (Cypressaceae)에 속하는 교목으로 관상용, 약용으로 쓰이고 관상수 및 조각재, 가구재, 향료를 제조하며 민간에서는 잎과 열매를 이뇨, 통경약으로 쓴다 (김태정, 한국의 자원식물, 1 권, pp64, 1996, 서울대학교 출판부, 서울).
상기 향나무 추출물은 물, 에탄올, 메탄올 또는 이들의 혼합물을 용매로 사용하여 추출할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 사용된 용어 '향나무 유래 화합물','향나무 추출물로부터 분리한 화합물' 또는'그로부터 분리한 화합물'은 향나무 추출물로부터 분리한 화합물을 의미한다.
구체적으로, 상기 화합물은 위드롤(widdrol) 또는 세드롤(cedrol)일 수 있다. C15H26O의 일반식을 갖는 상기 위드롤 및 세드롤은 향나무에서 분리될 수 있으며, 파킨슨 병 예방 또는 치료 효과를 나타내는 것에 대해서는 알려진 바가 전혀 없다.
[화학식 1]
Figure 112017034222050-pat00001
본 발명에서 용어, "위드롤(widdrol)"은 상기 화학식 1의 화합물로서 세스퀴테르펜계(Sesquiterpene) 화합물을 의미한다. 그 일반식은 C15H26O로 표시되며, 명칭은 (7S,9aS)-4,4,7,9a-tetramethyl-1,2,3,6,8,9-hexahydrobenzo[7] annulen-7-ol로 표시되고 있다.
[화학식 2]
Figure 112017034222050-pat00002
본 발명에서 용어, "세드롤(cedrol)"은 상기 화학식 2의 화합물로서 세스퀴테르펜계(Sesquiterpene) 화합물을 의미한다. 그 일반식은 C15H26O로 표시되며, 명칭은 (1S,2R,5S,7R,8R)-2,6,6,8-tetramethyltricyclo[5.3.1.01, 5]undecan-8-ol로 표시되고 있다.
본 발명의 상기 위드롤 또는 세드롤은 천연물질, 구체적으로는 식물로부터 분리할 수 있다. 천연, 잡종, 변종 식물의 다양한 기관, 뿌리, 줄기, 잎, 꽃뿐만 아니라 식물 조직 배양물을 추출하여 분리 가능하다. 또한, 당 분야의 공지된 방법으로 화학적 합성이 가능하나, 판매되는 것을 구입하여 사용할 수 있다.
구체적으로, 본 발명의 상기 위드롤 또는 세드롤은 향나무로부터 분리된 것일 수 있다.
식물로부터 위드롤 또는 세드롤을 수득하는 방법은 공지의 다양한 추출방법에 의할 수 있다. 예를 들어, 식물을 분쇄한 뒤 저급 알코올 용매, 예를 들어, 메탄올, 에탄올 등으로 추출한 다음, 이를 증류수에 현탁시켜 비극성 유기 용매, 예를 들어, 노말헥산, 에테르, 디클로로메탄, 클로로포름, 에틸아세테이트 또는 이들의 혼합 용매로 비극성용매 가용층을 추출, 분리하여 수득할 수 있다. 얻은 비극성 유기 용매 분획으로부터 화학식 1의 위드롤을 수득할 수 있다. 추출물을 1회 이상의 크로마토그래피를 수행함으로써 더욱 정제할 수 있고, 이때 칼럼의 종류와 전개 용매는 다양하게 조절될 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서는 분말로 파쇄한 향나무(J. chinensis)에 에탄올을 가하여 에탄올 추출물을 얻었다. 또한 분말로 파쇄한 향나무에 메탄올을 가하여 메탄올 추출물을 얻었으며, 상기 메탄올 추출물을 물층과 디클로로메탄층으로 분획한 후, 상기 디클로로메탄층으로부터 실리카겔 컬럼 크로마토그래피로 위드롤 및 세드롤을 분리하였다 (도 1).
본 발명에서 사용된 용어 '파킨슨 병'은 뇌의 흑질(substantia nigra)에 분포하는 도파민의 신경세포가 점차 소실되어 발생하며 안정떨림, 경직, 운동완만 및 자세 불안정성이 특징적으로 나타나는 신경계의 만성 진행성 퇴행성 질환을 의미한다.
본 발명에서 사용되는 용어 '예방'은 상기 위드롤 또는 세드롤을 유효성분으로 포함하는 조성물의 투여로 질환을 억제 또는 지연시키는 모든 행위를 의미한다.
본 발명에서 사용되는 용어 '치료'는, 상기 위드롤 또는 세드롤을 유효성분으로 포함하는 조성물의 투여로 질환의 증세가 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다.
본 발명에서 파킨슨 병의 치료는 신경세포 보호, 신경세포의 수 증가에 의한 것일 수 있다.
상기 신경세포는 주요 신경전달물질이 도파민인 신경세포를 의미할 수 있고, 중뇌의 복측피개영역(ventral tegmental area, VTA), 흑질 치밀부(substantia nigra pars compacta), 시상하부 궁상핵(arcuate nucleus of the hypothalamus) 또는 선조체(striatum)에 위치할 수 있다.
구체적인 일 실시예에서, 6-OHDA를 처리한 신경세포에 향나무 추출물, 위드롤 또는 세드롤을 처리한 후, 위드롤 또는 세드롤이 6-OHDA로 유도된 신경세포의 사멸을 회복시킴을 확인하였다 (도 5 및 6).
본 발명의 또 다른 양태로서, 본 발명은 향나무 추출물 또는 그로부터 분리한 화합물을 유효성분으로 포함하는 약학 조성물을 인간을 제외한 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 파킨슨 병 예방 또는 치료 방법을 제공한다.
상기 향나무 추출물, 그로부터 분리한 화합물, 파킨슨 병은 상기 설명한 바와 같다.
본 발명에서 용어, "개체"는 본 발명의 파킨슨 병을 보유하거나 또는 발병한, 인간을 포함한 모든 동물을 의미하며, 인간을 제외한 개체일 수 있다. 본 발명의 약학 조성물을 개체에 투여함으로 파킨슨병의 예방 및 치료 효과를 얻을 수 있다.
상기 본 발명의 약학 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여한다.
본 발명에서 용어, "투여"는 어떠한 적절한 방법으로 대상에게 본 발명의 약학 조성물을 도입하는 것을 말하며, 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 경구 또는 비경구의 다양한 경로를 통하여 투여될 수 있다.
상기 약학 조성물은 목적 또는 필요에 따라 당업계에서 사용되는 통상적인 방법, 투여 경로, 투여량에 따라 적절하게 개체에 투여될 수 있다. 투여 경로의 예로는 경구, 비경구, 피하, 복강 내, 폐 내, 및 비강 내로 투여될 수 있으며, 비경구 주입에는 근육 내, 정맥 내, 동맥 내, 복강 내 또는 피하투여가 포함된다. 또한 당업계에 공지된 방법에 따라 적절한 투여량 및 투여 횟수가 선택될 수 있으며, 실제로 투여되는 본 발명의 약학 조성물의 양 및 투여 횟수는 치료하고자 하는 증상의 종류, 투여 경로, 성별, 건강 상태, 식이, 개체의 연령 및 체중, 및 질환의 중증도와 같은 다양한 인자에 의해 적절하게 결정될 수 있다.
본 발명에서의 용어 "약학적으로 유효한 양"은 의학적 용도에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 혈관 투과성 증가를 억제 또는 완화하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 개체 종류 및 중증도, 연령, 성별, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있다. 그리고 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기 요소를 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태로서, 본 발명은 향나무 추출물 또는 그로부터 분리한 화합물을 유효성분으로 포함하는 파킨슨 병 예방 또는 개선용 건강기능식품을 제공한다.
상기 향나무 추출물, 그로부터 분리한 화합물, 파킨슨 병은 상기 설명한 바와 같다.
본 발명에서 사용된 용어, '건강기능식품'이라 함은 건강기능식품에 관한 법률 제6727호에 따른 인체에 유용한 기능성을 가진 원료나 성분을 사용하여 제조 및 가공한 식품을 의미하며, '기능성'이라 함은 인체의 구조 및 기능에 대하여 영양소를 조절하거나 생리학적 작용 등과 같은 보건 용도에 유용한 효과를 얻을 목적으로 섭취하는 것을 의미한다.
상기 건강기능식품은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다.
그 밖에 천연 과일쥬스 및 과일쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 또한, 건강기능식품은 육류, 소세지, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 과자류, 피자, 라면, 껌류, 아이스크림류, 스프, 음료수, 차, 기능수, 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제 중 어느 하나의 형태일 수 있다.
또한, 상기 건강기능식품은 식품첨가물을 추가로 포함할 수 있으며, '식품첨가물'로서의 적합 여부는 다른 규정이 없는 한 식품의약품안전처에 승인된 식품첨가물공전의 총칙 및 일반시험법 등에 따라 해당 품목에 관한 규격 및 기준에 의하여 판정한다.
상기 '식품첨가물공전'에 수재된 품목으로 예를 들어, 케톤류, 글리신, 구연산칼륨, 니코틴산, 계피산 등의 화학적 합성품, 감색소, 감초추출물, 결정셀룰로오스, 구아검 등의 천연첨가물, L-글루타민산 나트륨제제, 면류첨가 알칼리제, 보존료 제제, 타르색소제제 등의 혼합 제제류들을 들 수 있다.
구체적으로, 본 발명의 향나무 추출물은 6.25 ㎍/ml 이상, 세드롤과 위드롤의 경우는 50 ㎍/ml 이상부터 SH-SY5Y 세포의 생존을 저해한다는 것을 통하여, 독성이 관찰되지 않은 농도(0 내지 3 ㎍/ml)의 향나무 추출물, 위드롤 또는 세드롤을 사용 시 세포 독성이 없는 것을 관찰함으로써 건강기능식품으로 사용 할 수 있다는 것을 확인하였다.
본 발명의 또 다른 양태로서, 본 발명은 향나무 추출물 또는 그로부터 분리한 화합물을 유효성분으로 포함하는 파킨슨 병 예방 또는 개선용 의약외품 조성물을 제공한다.
상기 향나무 추출물, 그로부터 분리한 화합물, 파킨슨 병은 상기 설명한 바와 같다.
본 발명에서 용어, "의약외품"은 사람이나 동물의 질병을 치료, 경감, 처치 또는 예방할 목적으로 사용되는 섬유, 고무제품 또는 이와 유사한 것, 인체에 대한 작용이 약하거나 인체에 직접 작용하지 아니하며, 기구 또는 기계가 아닌 것과 이와 유사한 것, 감염형 예방을 위하여 살균, 살충 및 이와 유사한 용도로 사용되는 제제 중 하나에 해당하는 물품으로서, 사람이나 동물의 질병을 진단, 치료, 경감, 처치 또는 예방할 목적으로 사용하는 물품 중 기구, 기계 또는 장치가 아닌 것 및 사람이나 동물의 구조와 기능에 약리학적 영향을 줄 목적으로 사용하는 물품 중 기구, 기계 또는 장치가 아닌 것을 제외한 물품을 의미한다.
본 발명의 조성물을 의약외품 첨가물로 사용할 경우, 상기 조성물을 그대로 첨가하거나 다른 의약외품 또는 의약외품 성분과 함께 사용할 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용할 수 있다. 유효성분의 혼합량은 사용 목적에 따라 적합하게 결정될 수 있다.
본 발명의 의약외품 조성물은 이에 제한되지는 않으나, 바람직하게는 소독청결제, 샤워폼, 가그린, 물티슈, 세제비누, 핸드워시, 가습기 충진제, 마스크, 연고제 또는 필터충진제일 수 있다.
구체적으로, 상기 기술한 바와 마찬가지로 독성이 관찰되지 않은 농도(0 내지 3 ㎍/ml)의 향나무 추출물, 위드롤 또는 세드롤을 사용 시 세포 독성이 없는 것을 관찰함으로써 의약외품으로 사용 할 수 있다는 것을 확인하였다 (도 3 및 4).
본 발명의 향나무 추출물 또는 그로부터 분리한 화합물 위드롤 또는 세드롤을 유효성분으로 포함하는 조성물은, 신경세포 보호 효과 및 신경세포에서 세포사멸 억제효과를 나타냄을 확인하였는바, 이는 파킨슨 병 예방 또는 치료용 약학물로 유용하게 사용 될 수 있다.
도 1은, 향나무에서 향나무 추출물 또는 향나무 유래 화합물을 추출 또는 분리하는 과정을 나타낸 모식도이다.
도 2는, 향나무 추출물, 세드롤 및 위드롤의 SH-SY5Y 세포의 생존에 미치는 영향을 나타낸 것이다.
도 3은, 향나무 추출물, 세드롤 및 위드롤의 L-글루탐산이 처리된 SH-SY5Y세포에서 신경세포 보호 효과를 나타낸 것이다.
도 4는, 향나무 추출물, 세드롤 및 위드롤의 6-OHDA가 처리된 SH-SY5Y세포에서 신경세포 보호 효과를 나타낸 것이다.
도 5는, 향나무 추출물, 세드롤 및 위드롤의 L-글루탐산이 처리된 SH-SY5Y세포에서 세포자멸사(apoptosis) 억제 효과를 나타낸 것이다.
도 6는, 향나무 추출물, 세드롤 및 위드롤의 6-OHDA가 처리된 SH-SY5Y세포에서 세포자멸사(apoptosis) 억제 효과를 나타낸 것이다.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 재료 및 방법
1-1. 향나무 추출물 제조 및 향나무 유래 화합물 세드롤(cedrol)과 위드롤(widdrol)의 분리
향나무 에탄올 추출물(향나무 추출물)을 제조하기 위하여 3 Kg의 향나무 분말에 5배의 에탄올을 가하여, 75에서 3회 반복하여 추출하였다. 추출한 시료는 여과 후 농축한 다음 동결건조하였다. 그 결과 에탄올 추출물 181 g을 수득하였다 (수율 6.03%).
또한 향나무 유래 화합물인 세드롤(cedrol)과 위드롤(widdrol)의 분리를 위하여 향나무 메탄올 추출물을 물(H2O) 층과 디클로로메탄(dichloromethane, CH2Cl2) 층으로 분획하였다. 그 결과 디클로로메탄(CH2Cl2)층 분획물 399.36 g과 물층 분획물 313.8 g을 수득하였다.
상기 분획물에서 디클로로메탄층 분획물로 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(Silicagel Column Chromatography)를 수행하였다. 그 결과 단일 화합물인 세드롤(cedrol) 123.8 g과 위드롤(widdrol) 15.88 g을 분리하였다(도 1). 향나무 추출물 및 위드롤, 세드롤은 각각 디메틸설폭시드(DMSO)에 녹여 사용하였다.
1-2. 신경세포주의 배양
사람 신경모세포종 SH-SY5Y 세포는 American Type Culture Collection (ATCC, USA)로부터 구입하여 사용하였으며, 10% fetal bovine serum (FBS) 및 페니실린/스트렙토마이신이 포함된 돌베코수정이글배지(DMEM)를 사용하여 37℃, 5% CO2 조건하에서 배양하였다.
1-3. 추출물 및 화합물의 전처리 및 신경세포 독성 유발
SH-SY5Y 세포(5×104 cells/well) 를 96-well plate에 분주하여 부착시킨 다음, 다양한 농도(0 내지 3 ㎍/ml)의 향나무 추출물, 위드롤 또는 세드롤을 24시간 전처리하였다. 이 후 신경세포 독성을 유발하기 위하여 L-글루탐산 (monosodium salt hydrate, 75 mM) 또는 6-히드록시도파민 (6-hydroxydopamine, 6-OHDA) (100 μM)를 첨가하여 37℃에서 48시간 배양하였다.
실시예 2. 향나무 추출물 및 향나무 유래 화합물의 신경세포에 대한 독성
향나무 추출물 및 향나무 유래 화합물의 신경세포보호 효능을 관찰하기 앞서, 향나무 추출물, 위드롤 또는 세드롤의 신경세포에 대한 직접적 독성 유무 확인을 위하여 WST assay를 이용하여 SH-SY5Y 세포의 생존도를 측정하였다.
먼저, SH-SY5Y 세포(5×104 cells/well) 를 96-well plate에 분주하여 부착시킨 다음, 0 내지 50 ㎍/ml의 향나무 추출물, 위드롤 또는 세드롤을 48시간 처리하였다. 배양이 끝난 SH-SY5Y 세포의 배양액을 제거하고 WST 시약(Daeillab, Korea)이 포함된 배지를 분주한 후 37℃에서 1시간 동안 배양시켰다. 이 후 microplate reader (Molecular Devices, USA)를 사용하여 450 nm에서 흡광도를 측정하였다. 측정값은 3회 반복 실험을 하여 평균값으로 나타내었다.
그 결과, 도 2와 같이 향나무 추출물의 경우는 6.25 ㎍/ml 이상, 세드롤과 위드롤의 경우는 50 ㎍/ml 이상부터 SH-SY5Y 세포의 생존을 저해하였다.
따라서 이하에서 독성이 관찰되지 않은 농도(0 내지 3 ㎍/ml)의 향나무 추출물, 위드롤 또는 세드롤을 사용하여 신경세포보호 효능, 구체적으로 파킨슨 병에 대한 예방 및 치료 효과를 확인하였다.
실시예 3. 향나무 추출물 및 향나무 유래 화합물의 파킨슨 병 치료 효과 확인
3-1. 향나무 추출물 및 향나무 유래 화합물에 의한 신경세포보호 효능
향나무 추출물, 위드롤 또는 세드롤의 L-글루탐산 또는 6-OHDA에 의해 유발된 독성에 대한 SH-SY5Y 세포보호 효능 확인을 위하여 WST assay를 이용하여 SH-SY5Y 세포의 생존도를 측정하였다.
먼저 다양한 농도(0 내지 3 ㎍/ml)의 향나무 추출물, 위드롤, 세드롤 및 양성대조군(ascorbic acid, 75 mM)을 24시간 전처리 한 다음, L-글루탐산(75 mM) 를 48시간 처리하여 신경독성을 유발시켰다. 이후, 추출물 및 화합물에 의해 신경세포 생존율이 증가되는 지 관찰하였다.
그 결과, DMSO 처리에 비해 0.5 ㎍/ml의 향나무 추출물, 위드롤 또는 세드롤을 전처리 한 경우, 세포 생존율이 각각 14.72%, 13.60%, 16.61% 증가하여 양성대조군으로 사용한 ascorbic acid보다 더 높은 증가율을 보였다(도 3).
또한, 다양한 농도(0 내지 3 ㎍/ml)의 향나무 추출물, 위드롤, 세드롤을 24시간 전처리 한 다음, 6-OHDA(100 μM)를 48시간 처리하여 신경세포 보호 효능을 관찰하였다.
그 결과, DMSO 처리에 비해 0.5 ㎍/ml의 향나무 추출물 처리의 경우 SH-SY5Y 세포 생존율이 11.42% 증가하였으며, 0.1 ㎍/ml의 세드롤과 위드롤 전처리에 의해 SH-SY5Y 세포 생존율이 각각 17.46%, 20.20% 증가하였다(도 4).
상기 결과로부터 향나무 추출물, 위드롤 또는 세드롤이 L-글루탐산 또는 6-OHDA에 의해 유발되는 신경세포 독성으로부터 세포생존율을 증가시켜, 신경세포를 보호하고, 파킨슨 병에 대한 치료 효과를 보유함을 확인하였다.
3-2. 향나무 추출물 및 향나무 유래 화합물에 의한 신경세포 세포자멸 사(apoptosis)의 저해
향나무 추출물, 위드롤 또는 세드롤에 의한 신경세포 보호 효능의 기전을 확인하기 위하여 향나무 추출물, 위드롤 또는 세드롤이 L-글루탐산 또는 6-OHDA에 의해 유발되는 신경세포의 세포자멸사를 저해하는지 확인하였다.
SH-SY5Y 세포의 세포자멸사를 측정하기 위하여, Muse™ Annexin V & Dead Cell Kit를 사용하였다. SH-SY5Y 세포를 2×105 cells/well로 24-well plate에 분주한 다음 향나무 추출물, 위드롤 또는 세드롤을 전처리하고 L-글루탐산 또는 6-OHDA를 처리하여 독성을 유도하였다. 이후 배양이 끝난 세포를 회수하고 Muse™ Annexin V & Dead Cell reagent (100 μl)를 첨가하여 실온에서 빛을 차단하여 20분간 염색시킨 다음, 염색된 세포들은 Muse™ Cell Analyzer (Merck Millipore, Germany)를 사용하여 분석하였다.
먼저, SH-SY5Y 세포에 DMSO를 전처리 한 다음 L-글루탐산을 처리한 경우, Live 세포(Annexin V-/7-AAD- 세포)의 비율이 감소하는 반면, apoptotic 세포(Annexin V+ 세포) 비율이 크게 증가하였으며, 이로부터 L-글루탐산에 의해 SH-SY5Y 세포의 독성이 유발되어 세포자멸사가 일어나는 것을 알 수 있었다(도 5).
반면 추출물과 화합물을 전처리한 결과, L-글루탐산에 의한 신경세포의 apoptotic 세포는 DMSO 전처리 시 28.3%에서 향나무 추출물 (0.1 ㎍/ml), 세드롤(0.5 ㎍/ml), 위드롤(0.1 ㎍/ml) 전처리시 각각 20.7%, 21.55%, 20.8%로 감소하였으며, live 세포는 DMSO 전처리에 비해 증가하는 것을 확인하였다(도 5).
또한, SH-SY5Y 세포에 DMSO를 전처리 한 다음 6-OHDA를 처리한 경우, Live 세포(Annexin V-/7-AAD- 세포)의 비율이 감소하는 반면, apoptotic 세포(Annexin V+ 세포) 비율이 크게 증가하였으며, 이로부터 6-OHDA에 의해 SH-SY5Y 세포의 독성이 유발되어 세포자멸사가 일어나는 것을 알 수 있었다(도 6).
반면 추출물과 화합물을 전처리한 결과, 6-OHDA에 의한 신경세포의 apoptotic 세포는 DMSO 전처리 시 24.7%에서 향나무 추출물 (0.1 ㎍/ml), 세드롤(0.5 ㎍/ml), 위드롤(0.1 ㎍/ml) 전처리시 각각 15.11%, 10.19%, 11.77%로 감소하였으며, live 세포는 DMSO 전처리에 비해 증가하는 것을 확인하였다(도 6).
이러한 결과로부터 향나무 추출물, 위드롤 또는 세드롤에 의한 신경세포 보호 효능 및 파킨슨 병의 치료 효능은 L-글루탐산 또는 6-OHDA에 의해 유발되는 신경세포의 세포자멸사를 저해함으로써 나타나는 것을 알 수 있었다.
이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims (9)

  1. 향나무(Juniperus chinensis) 추출물 또는 그로부터 분리한 화합물인 위드롤(widdrol) 또는 세드롤(cedrol)을 유효성분으로 포함하는, 파킨슨 병 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  2. 삭제
  3. 제1항에 있어서, 상기 향나무 추출물 또는 그로부터 분리한 화합물인 위드롤 또는 세드롤은 0.001 내지 3 ㎍/ml로 포함되는 것인, 조성물.
  4. 제1항에 있어서, 상기 조성물은 L-글루탐산(L-glutamic acid) 또는 6-히드록시도파민 (6-hydroxydopamine, 6-OHDA)에 의한 세포사멸을 억제하는 것인, 조성물.
  5. 제1항에 있어서, 상기 향나무 추출물은 물, 에탄올, 메탄올 또는 이들의 혼합물을 용매로 사용하여 추출하는 것인, 조성물.
  6. 제1항에 있어서, 상기 조성물은 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제를 추가로 포함하는 것인, 조성물.
  7. 향나무(Juniperus chinensis) 추출물 또는 그로부터 분리한 화합물인 위드롤(widdrol) 또는 세드롤(cedrol)을 유효성분으로 포함하는 약학 조성물을 인간을 제외한 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 파킨슨 병 예방 또는 치료 방법.
  8. 향나무(Juniperus chinensis) 추출물 또는 그로부터 분리한 화합물인 위드롤(widdrol) 또는 세드롤(cedrol)을 유효성분으로 포함하는 파킨슨 병 예방 또는 개선용 건강기능식품.
  9. 향나무(Juniperus chinensis) 추출물 또는 그로부터 분리한 화합물인 위드롤(widdrol) 또는 세드롤(cedrol)을 유효성분으로 포함하는 파킨슨 병 예방 또는 개선용 의약외품 조성물.
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