WO2010116681A1 - ポリヒドロキシアルカノエートの回収方法 - Google Patents

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WO2010116681A1
WO2010116681A1 PCT/JP2010/002304 JP2010002304W WO2010116681A1 WO 2010116681 A1 WO2010116681 A1 WO 2010116681A1 JP 2010002304 W JP2010002304 W JP 2010002304W WO 2010116681 A1 WO2010116681 A1 WO 2010116681A1
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WO
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polyhydroxyalkanoate
pha
enzyme
surfactant
suspension
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Application number
PCT/JP2010/002304
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English (en)
French (fr)
Inventor
柳田義文
山口貴生
滝田昌輝
Original Assignee
株式会社カネカ
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Publication date
Application filed by 株式会社カネカ filed Critical 株式会社カネカ
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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/62—Carboxylic acid esters
    • C12P7/625—Polyesters of hydroxy carboxylic acids

Definitions

  • the present invention relates to a method for recovering polyhydroxyalkanoate produced by a microorganism.
  • PHA Polyhydroxyalkanoate
  • PHA Polyhydroxyalkanoate
  • a thermoplastic polyester that is produced and stored as an energy storage substance in the cells of many microbial species.
  • PHA produced by microorganisms using natural organic acids and oils and fats as a carbon source is completely biodegraded by microorganisms in soil and water and taken into the natural carbon cycle process. Therefore, it can be said that it is an environmentally conscious plastic material that has almost no adverse effects on the ecosystem.
  • synthetic plastics have become serious social problems from the viewpoint of environmental pollution, waste disposal, and petroleum resources, and PHA has been attracting attention as an environmentally friendly green plastic, and its practical use is eagerly desired.
  • biocompatible plastics such as implant materials and drug carriers that do not require collection, and is expected to be put to practical use.
  • PHA produced by microorganisms is normally accumulated in microbial cells as granules, in order to use PHA as plastic, a process of separating and removing PHA from the microbial cells is required.
  • Known methods for separating and purifying PHA from microbial cells include a method for extracting PHA from microbial cells using an organic solvent in which PHA is soluble, and cell components other than PHA by chemical treatment or physical treatment. It is divided into a method of separating PHA by solubilizing or removing by crushing.
  • Non-patent Document 1 discloses that microbial cell components other than PHA can be treated by treating the microbial cell suspension with sodium hypochlorite. A method for solubilizing and separating PHA is described. In this method, since significant decomposition of PHA is caused simultaneously with solubilization of microbial cell constituents other than PHA, processing into a product is limited. Further, since chlorine that cannot be ignored remains in the PHA, it is not suitable for practical use because it is not preferable as a polymer product.
  • Patent Document 6 discloses a method for recovering PHA using a heat treatment at 100 ° C. or more and a digestion treatment using a proteolytic enzyme or a surfactant.
  • the suspension becomes very viscous due to the liberated nucleic acid. Therefore, the suspension is heated in advance at 100 ° C. or higher to decompose the nucleic acid.
  • heating at 100 ° C. or higher significantly reduces the molecular weight of PHA, making it impossible to apply to products.
  • this method is very complicated and requires many steps, the purity of the obtained PHA is about 88% and about 97% at the maximum.
  • the nucleic acid released from the bacterial cells is treated with hydrogen peroxide at 80 ° C. for 3 hours to decompose and isolate 99% purity PHA (see Patent Document 7) ) And a method of separating PHA after heating the cell suspension to 50 ° C. or higher under strong acidity of less than pH 2 (see Patent Document 8). Under these heat treatment conditions, the molecular weight of PHA is remarkably lowered, so that even if the purity is improved, it cannot be applied to products.
  • Non-Patent Document 2 describes that after adding alkali to a poly-3-hydroxybutyrate (PHB) -containing cell suspension, the pH is returned to neutral and then high-pressure crushing is performed. Although there is no description of the polymer purity or recovery rate in this document, it is expected that the bacterial cell constituents remain in the PHB fraction because of high-pressure crushing under neutral conditions, and the purity is not high.
  • PHB poly-3-hydroxybutyrate
  • Patent Document 9 discloses a method in which an alkali is added to bacterial cells, heated to 80 ° C. and stirred for 1 hour, and then the polymer is recovered by centrifugation.
  • Patent Document 10 discloses a method of high-pressure crushing at 70 ° C. .
  • patent document 11 the method of performing high pressure crushing at 70 degreeC or more after adding an alkali is disclosed. In these methods, since the treatment is performed at a high temperature, the molecular weight of PHA tends to be remarkably lowered depending on the conditions, and the polymer purity is as low as about 66 to 85%.
  • Patent Document 12 and Non-Patent Document 3 disclose a method of separating a polymer by crushing a microbial cell and then treating it with a combination of an enzyme and a surfactant. Therefore, it cannot be applied to an actual industrial process.
  • the object of the present invention is to solve the above-mentioned problems in the prior art, and from a PHA-containing microbial cell with a high purity from a PHA-containing microbial cell by a simple and inexpensive method suitable for industrial production and with a small number of steps without causing a significant decrease in molecular weight. It is to provide a PHA recovery method capable of separating PHA.
  • the present inventors have performed an enzyme treatment on an aqueous suspension of microbial cells containing PHA, and then, under basic conditions, in the presence of a surfactant.
  • a surfactant By performing physical crushing treatment at a relatively low temperature, the crushing effect is dramatically improved, and the recovered PHA is found to have a reduced molecular weight and high purity, thereby completing the present invention. It came to.
  • the first aspect of the present invention is a method for recovering polyhydroxyalkanoate produced by a microorganism from the inside of a microbial cell, comprising the step (a): an aqueous suspension of a polyhydroxyalkanoate-containing microbial cell, an enzyme, And a step of performing an enzyme treatment by adding an alkali and / or a surfactant to obtain an enzyme treatment solution, step (b): physical treatment in the presence of a surfactant under basic conditions with respect to the enzyme treatment solution.
  • step (c) Performing a disruptive treatment to disrupt the cells and solubilize or emulsify cellular substances other than the polyhydroxyalkanoate in the cells to obtain a polyhydroxyalkanoate suspension, step (c): And a step of separating the polyhydroxyalkanoate from the polyhydroxyalkanoate suspension.
  • the enzyme in step (a) is preferably a proteolytic enzyme and / or a cell wall degrading enzyme.
  • the physical crushing treatment is preferably performed with a high-pressure homogenizer.
  • the alkali used in step (a) and / or (b) is preferably at least one selected from the group consisting of sodium hydroxide, sodium carbonate, potassium hydroxide and lithium hydroxide.
  • step (c) the pH of the suspension when the polyhydroxyalkanoate is separated from the suspension is preferably adjusted to 8.0 to 13.0.
  • the surfactant used in the step (a) and / or (b) is at least one selected from the group consisting of an anionic surfactant, a cationic surfactant, an amphoteric surfactant and a nonionic surfactant.
  • the polyhydroxyalkanoate is 3-hydroxybutyrate, 3-hydroxyvalerate, 3-hydroxypropionate, 4-hydroxybutyrate, 4-hydroxyvalerate, 5-hydroxyvalerate, 3-hydroxypentenoate Copolymerizing at least two monomers selected from the group consisting of 3-hydroxyhexanoate, 3-hydroxyheptanoate, 3-hydroxyoctanoate, 3-hydroxynonanoate and 3-hydroxydocanoate A formed copolymer is preferable.
  • a second aspect of the present invention is a polyhydroxyalkanoate obtained by the polyhydroxyalkanoate recovery method, wherein a sheet having a thickness of 0.5 mm obtained from the polyhydroxyalkanoate by pressing at 160 ° C. is 15 Relates to polyhydroxyalkanoates having a yellowness index (YI value) of less than or equal to.
  • YI value yellowness index
  • a PHA recovery method capable of separating high-purity PHA from PHA-containing microbial cells by a simple and inexpensive method suitable for industrial production and with a small number of steps without causing a significant decrease in molecular weight.
  • the method for recovering a polyhydroxyalkanoate according to the present invention is a method for recovering a polyhydroxyalkanoate produced by a microorganism from the inside of a microbial cell, comprising the step (a): converting the polyhydroxyalkanoate-containing microbial cell into an aqueous suspension.
  • step (b) presence of a surfactant under basic conditions with respect to the enzyme-treated solution
  • step (c) Separating the polyhydroxyalkanoate from the polyhydroxyalkanoate suspension.
  • the enzyme treatment is performed in the presence of an alkali and / or a surfactant before the physical disruption treatment is performed on the PHA-containing microbial cells, and the subsequent physical disruption treatment is performed under a basic condition.
  • the agent By carrying out in the presence of the agent, cell disruption is achieved, and cells other than PHA are solubilized or emulsified to obtain an aqueous PHA suspension. PHA can be easily separated from the aqueous PHA suspension.
  • PHA is a general term for hydroxyalkanoate polymers.
  • the hydroxyalkanoate is not particularly limited, and examples thereof include 3-hydroxybutyrate (3HB), 3-hydroxyvalerate (3HV), 3-hydroxypropionate, 4-hydroxybutyrate, 4-hydroxyvalerate, 5 -Hydroxyvalerate, 3-hydroxypentenoate, 3-hydroxyhexanoate (3HH), 3-hydroxyheptanoate, 3-hydroxyoctanoate, 3-hydroxynonanoate, 3-hydroxydocanoate, etc. It is done.
  • the PHA in the present invention may be a homopolymer composed of only one of these hydroxyalkanoates, or may be a copolymer formed by copolymerizing two or more hydroxyalkanoates.
  • PHBV which is a homopolymer of 3HB
  • PHBV which is a binary copolymer of 3HB and 3HV
  • PHBH of 3HB and 3HH
  • Japanese Patent No. 2777757 3HB, 3HV and 3HH
  • PHBHV see Japanese Patent No. 277757
  • the copolymer tends to decrease in molecular weight due to hydrolysis due to heating or the like, the present invention having the advantage that the molecular weight hardly decreases as will be described later is significant in recovering the copolymer. .
  • a copolymer having 3HH as a monomer unit is preferable, and PHBH is more preferable from the viewpoint of degradability as a biodegradable polymer and soft properties.
  • the composition ratio of each monomer unit constituting PHBH is not particularly limited, but from the viewpoint of showing good processability, the content of 3HH units with respect to the total units is preferably 1 to 99 mol%, more preferably. 3 to 30 mol%.
  • the composition ratio of each monomer unit constituting PHBHV is not particularly limited.
  • the content of 3HB units is 1 to 95 mol% with respect to the total units, and the content of 3HV units is 1 to 96 mol%, 3HH units.
  • the content of is preferably 1 to 30 mol%.
  • the weight average molecular weight of PHA using polystyrene as a molecular weight standard is required to be 10,000 or more by gel chromatography. It is preferably 50,000 or more, more preferably 100,000 or more, further preferably 200,000 or more, particularly preferably 200,000 to 2,000,000, very preferably 200,000 to 1,500,000, most preferably 200,000 to 1,000,000. When the molecular weight exceeds 2 million, fluidity may be lowered when melted and processed, and handling may be poor.
  • the microorganism used in the present invention is not particularly limited as long as it is a microorganism that generates PHA in cells.
  • a microorganism isolated from nature, a microorganism deposited at a depositary of a strain (for example, IFO, ATCC, etc.), or a mutant or transformant that can be prepared from them can be used.
  • the genus Capriavidus, the genus Alcaligenes, the genus Ralstonia, the genus Pseudomonas, the genus Bacillus, the genus Azotobacter, the genus Nocardia Examples include bacteria.
  • strains such as A. lipolytica, A. latus, Aeromonas caviae, A.
  • hydrophila, C. necator, etc. is preferred.
  • a transformant obtained by introducing a target PHA synthase gene and / or a mutant thereof into the microorganism can also be used.
  • the PHA synthase gene used for the preparation of such a transformant is not particularly limited, but a PHA synthase gene derived from Aeromonas caviae is preferred. By culturing these microorganisms under appropriate conditions, microbial cells in which PHA is accumulated in the cells can be obtained.
  • the culture method is not particularly limited, and for example, the method described in JP-A No. 05-93049 is used.
  • the present invention aims to recover PHA from microbial cells, it is preferable that the PHA content in the cultured microbial cells is high. In industrial level application, it is preferable that 50% by weight or more of PHA is contained in the dried cells, and the PHA content is preferably 60% by weight or more in consideration of the subsequent separation operation, the purity of the separated polymer, etc. More preferably, it is 70 weight% or more.
  • the PHA produced by the microorganism is recovered by the steps including the following steps (a), (b) and (c).
  • Step (a) in the present invention is a step of performing enzyme treatment by adding an enzyme and an alkali and / or a surfactant to an aqueous suspension of PHA-containing microbial cells. By this step, an enzyme treatment solution is obtained.
  • the PHA-containing microbial cells used in the step (a) may be a culture broth itself containing PHA-containing microbial cells after completion of the culture.
  • the cells are similarly collected.
  • an aqueous suspension of PHA-containing microbial cells can be prepared by adding water or the like.
  • the temperature for heating the culture broth is preferably 50 ° C. to 80 ° C.
  • step (a) in the present invention before the physical disruption treatment in the step (b), an enzyme and an alkali and / or a surfactant are added to the aqueous suspension of PHA-containing microbial cells to carry out the enzyme treatment. It is important to do.
  • the enzyme treatment of the PHA-containing microbial cells before the physical disruption treatment, the cell wall can be decomposed in advance and a higher disruption effect can be obtained by the next physical disruption treatment.
  • the enzyme used in the step (a) is not particularly limited as long as it can be used for industrial products, but for the purpose of degrading the cell wall to obtain a higher crushing effect, a proteolytic enzyme (protease) Cell wall degrading enzymes are preferred. In terms of supply stability and cost, industrially, a proteolytic enzyme is more preferable. Only one type of enzyme may be used, or two or more types may be used in combination. One of proteolytic enzymes and cell wall degrading enzymes may be used, or both enzymes may be used in combination.
  • proteolytic enzymes include alcalase, pepsin, trypsin, papain, chymotrypsin, aminopeptidase, carboxypeptidase and the like.
  • cell wall degrading enzymes include lysozyme, amylase, cellulase, maltase, saccharase, ⁇ and ⁇ -glycosinase.
  • an enzyme composition containing an enzyme stabilizer, a surfactant, or a recontamination preventive agent in addition to the enzyme may be used, and the enzyme composition is not limited to the use of only the enzyme.
  • commercially available enzyme detergents for laundry can be used.
  • lysozyme is preferable from the viewpoint of lysis effect.
  • proteolytic enzymes include, for example, “Protease A”, “Protease P”, “Protease N” (above, manufactured by Amano Enzyme), “Alcalase”, “Esperase”, “Zabinase”, “Everase” (above) , Manufactured by Novozymes) and the like can be used industrially, and can also be preferably used from the viewpoint of decomposition activity.
  • Specific cell wall degrading enzymes include, for example, “lysozyme” (manufactured by Huayuan Economic Trade, Shandongzhou), “biozyme A”, “cellulase A“ Amano ”3”, “cellulase T“ Amano ”4”, “ ⁇ -Glucosidase “Amano” (above, Amano Enzyme), "Tarmamyl”, “Cellsoft” (above, Novozymes) etc. can be used industrially.
  • the treatment with these enzymes is preferably performed in the presence of a surfactant in that a higher purification effect can be obtained.
  • the enzyme treatment is preferably performed at the optimum temperature and pH of the enzyme used.
  • temperature: 50-60 ° C. and pH: 8-9 are preferable
  • Esperase manufactured by Novozymes
  • temperature: 55-65 ° C., pH: 8-10 are preferable.
  • lysozyme is used, the temperature is preferably 40-50 ° C. and the pH is 6-7.
  • the enzyme treatment is preferably continued until the required degree of treatment is achieved, and this time is usually 0.5 to 8 hours.
  • the amount of enzyme added depends on the type and activity of the enzyme.
  • the enzyme treatment is preferably performed while stirring the aqueous suspension.
  • step (a) the pH of the aqueous suspension of PHA-containing microbial cells is adjusted to the optimum pH of the enzyme, and / or the cell walls of the PHA-containing microorganisms are destroyed to bring the PHA in the cells out of the cells.
  • an alkali to the aqueous suspension and perform the enzyme treatment in the presence of the alkali.
  • Alkali means a substance whose aqueous solution is basic when dissolved in water. Both organic and inorganic compounds are included.
  • the alkali that is an inorganic compound is not particularly limited, but examples thereof include alkali metal hydroxides such as sodium hydroxide, potassium hydroxide, and lithium hydroxide, alkali metal carbonates such as sodium carbonate and potassium carbonate, and sodium hydrogen carbonate.
  • Alkali metal hydrogen carbonates such as potassium hydrogen carbonate, organic metal alkali metal salts such as sodium acetate and potassium acetate, alkali metal borates such as borax, trisodium phosphate, disodium hydrogen phosphate, phosphorus
  • alkali metal phosphates such as tripotassium acid and dipotassium hydrogen phosphate
  • alkaline earth metal hydroxides such as barium hydroxide, and aqueous ammonia.
  • step (a) sodium hydroxide, sodium carbonate, potassium hydroxide, and lithium hydroxide are preferable in terms of industrial production and price.
  • the amount of alkali added in step (a) can be appropriately determined in consideration of the optimum pH of the enzyme used. If the pH of the aqueous suspension is already within the optimum pH range of the enzyme used before adding the alkali, it is not necessary to add the alkali in step (a). In addition, in the step (a), the pH of the aqueous suspension varies as the enzyme treatment proceeds, and therefore it is preferable to carry out the enzyme treatment while controlling the pH to be within the optimum pH range.
  • the temperature of the aqueous suspension when adding alkali to the aqueous suspension is desirably around the optimum temperature of the enzyme used. Specifically, a range of 20 to 60 ° C. is preferable. When alkali is added at a temperature higher than 60 ° C., the molecular weight of PHA may be significantly reduced. If an alkali is added at a temperature lower than 20 ° C., the viscosity of the aqueous suspension may be improved and stirring may be difficult.
  • the step (a) in order to destroy the cell wall of the PHA-containing microorganism and facilitate the outflow of PHA in the cell, and / or to wash and remove proteins, fatty acids, fats and oils contained in the cell, PHA In order to improve the purity, it is preferable to add a surfactant to the aqueous suspension and perform the enzyme treatment in the presence of the surfactant.
  • the alkali and the surfactant may be used together or may not be used together.
  • the surfactant used in the present invention include an anionic surfactant, a cationic surfactant, an amphoteric surfactant, and a nonionic surfactant.
  • anionic surfactants and / or nonionic surfactants are preferred.
  • anionic surfactant for the purpose of washing and removing proteins and the like, it is preferable to use an anionic surfactant, and for the purpose of washing and removing fatty acids and fats and oils, it is preferable to use a nonionic surfactant.
  • the weight ratio of the anionic surfactant / nonionic surfactant is preferably from 1/100 to 100/10, more preferably from 5/100 to 100/20, and from 5/100 to 100/100. Further preferred is 5/100 to 50/100.
  • anionic surfactant examples include alkyl sulfates, alkylbenzene sulfonates, alkyl or alkenyl sulfate sulfates, alkyl or alkenyl ether sulfates, ⁇ -olefin sulfonates, ⁇ -sulfo fatty acid salts or esters thereof. , Alkyl or alkenyl ether carboxylates, amino acid type surfactants, N-acyl amino acid type surfactants, and the like.
  • alkyl sulfates having an alkyl group having 12 to 14 carbon atoms linear alkylbenzene sulfonates having an alkyl group having 12 to 16 carbon atoms, alkyl sulfate esters or alkyl ethers having an alkyl group having 10 to 18 carbon atoms.
  • Sulfuric acid ester salts are preferred.
  • the counter ion contained in the anionic surfactant is preferably an alkali metal such as sodium or potassium, an alkaline earth metal such as magnesium, or an alkanolamine such as monoethanolamine, diethanolamine or triethanolamine.
  • nonionic surfactant examples include polyoxyethylene alkyl ether, polyoxyethylene alkyl phenyl ether, polyoxyalkylene alkyl ether, fatty acid sorbitan ester, alkyl polyglucoside, fatty acid diethanolamide, alkyl monoglyceryl ether, and the like. .
  • a highly hydrophilic compound and a compound that has a low ability to form a liquid crystal when mixed with water or a compound that does not generate such a liquid crystal are preferable.
  • polyoxyethylene alkyl ether and polyoxyalkylene alkyl ether are preferable from the viewpoint of relatively good biodegradability.
  • Examples of the cationic surfactant include alkyl trimethyl ammonium salts and dialkyl dimethyl ammonium salts.
  • amphoteric surfactant examples include carbobetaine type and sulfobetaine type surfactants.
  • anionic surfactants such as sodium dodecyl sulfate, sodium dodecylbenzenesulfonate, sodium cholate, sodium deoxycholate and sodium oleate, polyoxyethylene alkyl ether as nonionic surfactant And polyoxyalkylene alkyl ethers are preferred from the viewpoints of price, amount used and effect of addition. Two or more of these surfactants may be used in combination.
  • the amount of the surfactant added in the step (a) is not particularly limited, but is preferably 0.001 to 10 parts by weight with respect to 100 parts by weight of the PHA produced by the microorganism, and further 5 parts by weight from the viewpoint of cost. The following is preferred.
  • Step (b) the enzyme-treated solution obtained in the step (a) is subjected to a physical crushing treatment in the presence of a surfactant under basic conditions, and the cells contained in the enzyme-treated solution. And solubilizing or emulsifying cellular substances other than PHA in the cells. This step yields an aqueous PHA suspension.
  • the physical disruption treatment in step (b) is performed by adjusting the enzyme treatment solution to basic conditions in order to dissolve cellular materials other than PHA in the cells in water. For this reason, it is preferable to add an alkali with respect to the enzyme treatment liquid obtained at the process (a).
  • the alkali added in the step (b) the compounds exemplified for the alkali that can be used in the step (a) can be used. Of these, sodium hydroxide, sodium carbonate, potassium hydroxide, and lithium hydroxide are preferred because they are inexpensive and suitable for industrial production. It is preferable to use these alkalis and adjust the enzyme-treated solution obtained in step (a) under basic conditions of pH 8.0 to 13.0.
  • the basic condition is more preferably pH 8.5 to 12.5, and still more preferably pH 9.0 to The basic condition is 12.5, and the basic condition is particularly preferably pH 10.0 to 12.5.
  • the amount of alkali added in step (b) can be appropriately determined in consideration of the pH range. When the pH of the enzyme treatment solution is already within the above pH range before adding the alkali, the alkali addition in the step (b) can be omitted.
  • the temperature of the enzyme treatment solution when adding alkali to the enzyme treatment solution is preferably adjusted to a range of 20 to 40 ° C.
  • the molecular weight of PHA may be significantly reduced.
  • insoluble matter derived from cells may not be solubilized.
  • the physical crushing process in the step (b) is performed in order to destroy the cell wall of the PHA-containing microorganism to facilitate the outflow of the PHA in the cell and / or to wash the protein, fatty acid, fat and oil contained in the cell.
  • the enzyme treatment solution contains a surfactant. If a surfactant has already been added in step (a), the enzyme treatment solution already contains a surfactant, so there is no need to add a new surfactant in step (b). It may be added.
  • the surfactant to be added in the step (b) the compounds exemplified for the surfactant that can be used in the step (a) can be used. Among these, anionic surfactants and / or nonionic surfactants are preferable from the viewpoint of detergency. A preferable addition amount is the same as the range described in the step (a).
  • a physical crushing treatment is performed on the enzyme treatment solution which shows a basic pH and contains a surfactant.
  • a high pressure homogenizer for example, a high pressure homogenizer, an ultrasonic crusher, an emulsification disperser, a bead mill etc. are mentioned.
  • the use of a high-pressure homogenizer is preferable from the viewpoint of crushing efficiency, and a type in which the liquid to be treated is introduced from a pressure-resistant container having a micro-opening and pushed out from the opening by applying high pressure is more preferable.
  • a high-pressure homogenizer model “PA2K type” manufactured by Nirosoavi Co., Ltd. may be mentioned.
  • PA2K type manufactured by Nirosoavi Co., Ltd.
  • a high-pressure homogenizer When a high-pressure homogenizer is used, a large shearing force acts on the microbial cells, so that the microbial cells are efficiently destroyed and the separation of PHA is improved. Since such devices are subjected to high pressure at the opening and instantaneously become high temperature, if necessary, the processing liquid is cooled by a general low-temperature constant temperature circulation tank to prevent the temperature from rising and at 20 to 40 ° C. It is preferable to perform a physical crushing process. In the range of 20 to 40 ° C., the physical crushing treatment can be performed with almost no decrease in the molecular weight of PHA.
  • the crushing pressure during the physical crushing treatment is preferably 30 to 60 MPa. If the pressure is lower than 30 MPa, the crushing efficiency is lowered, and the microbial cells may not be destroyed even if the crushing operation is repeated many times. When the pressure is higher than 60 MPa, the crushing efficiency is increased, but the high-pressure homogenizer becomes an ultra-high pressure specification, and the manufacturing cost increases because the equipment price is expensive.
  • the physical crushing process in step (b) may be performed a plurality of times in order to increase crushing efficiency.
  • Step (c) in the present invention is a step of separating PHA from the PHA aqueous suspension obtained in step (b). Thereby, PHA produced by the microorganism can be recovered.
  • a conventionally known method such as centrifugation or membrane separation can be used.
  • centrifugation is preferable because it can be processed industrially and can be used continuously.
  • a centrifugal sedimentator having a rotating container without holes is preferable, and types include a separation plate type, a cylindrical type, and a decanter type.
  • the PHA particles have a small specific gravity difference with water
  • a separation plate type intermittent discharge type, nozzle discharge type
  • the nozzle discharge type is particularly preferable.
  • the decanter type is generally unsuitable when the acceleration is low and the specific gravity difference between the solid and liquid is small, but the decanter type can also be used by changing the particle diameter of the PHA.
  • the decanter type includes a model having a separation plate and a large separation and sedimentation area. Such a model may be usable without changing the particle diameter.
  • the cellular material other than the PHA contained in the recovered PHA can be removed by suspending the PHA with water and washing with water.
  • the pH at the time of washing with water is preferably 8.0 to 12.5.
  • the pH is lower than 8.0, solubilization of cellular substances as impurities may not proceed, and when the pH is higher than 12.5, the molecular weight reduction of PHA may increase.
  • the temperature of water used for washing at this time is preferably 25 to 40 ° C. When the temperature is lower than 25 ° C, the solubilization of the cellular material does not proceed.
  • the purity of PHA can be improved by performing the above water washing treatment a plurality of times.
  • PHA can be recovered from PHA-containing microbial cells without performing heat treatment at a high temperature.
  • the recovery method of the present invention can be carried out under the condition that the temperature to which PHA is exposed throughout the entire process is 80 ° C. or less, thereby avoiding a significant decrease in molecular weight of PHA.
  • high-purity PHA can be recovered while avoiding a significant decrease in molecular weight of PHA.
  • the PHA recovered by the recovery method of the present invention can be formed into various shapes after drying. For example, it can be melt-pressed at 160 ° C. and formed into a sheet shape. Since the PHA obtained according to the present invention is highly pure, the yellowness index (YI value) of the sheet shows a very low value. Thereby, it turns out that the said PHA is a high quality thing with little coloring.
  • a specific YI value is 15.0 or less when the sheet has a thickness of 0.5 mm.
  • the YI value required for PHA varies depending on the intended use, but the YI value is preferably 15 or less, more preferably 10 or less, and even more preferably 5 or less. When it exceeds 15, coloring will be strong when processed into a transparent sheet or bottle, and the use without coloring will be limited.
  • the protein content remaining in the PHA was evaluated by the amount of residual nitrogen.
  • the crushed liquid sample obtained in the examples was washed with a sufficient amount of water, and then PHBH was collected by centrifugation.
  • the obtained PHBH was dried under reduced pressure and used for measurement of the residual nitrogen amount.
  • the amount of residual nitrogen was calculated by a coloration method. First, 5 M NaOH was added to each sample, and a hydrolysis reaction was performed at 95 ° C. This hydrolyzed solution was neutralized with an equal amount of 60% aqueous acetic acid solution, and an acetic acid buffer solution and a ninhydrin solution were added to perform a color reaction at 100 ° C. The absorbance of this color reaction solution was measured with a ratio beam spectrophotometer “U-1800 type” manufactured by Hitachi, Ltd. The amount of residual nitrogen was calculated by comparing this absorbance with a calibration curve prepared using a leucine sample.
  • ⁇ Measurement of YI value> The dry PHA (3.0 g) obtained in the examples was sandwiched between 15 cm square metal plates, and metal plates with a thickness of 0.5 mm were inserted into the four corners of the metal plate. Company H-15 type). After heating at 160 ° C. for 7 minutes, the sheet was pressed while heating at about 5 MPa for 2 minutes to obtain a sheet having a thickness of 0.5 mm. After pressing, the PHA is cured by allowing it to stand at room temperature, and then, using a color difference meter “SE-2000” (manufactured by Nippon Denshoku), a press sheet is placed using a 30 mm measuring plate, and a white standard plate is placed thereon. The YI value was measured by covering.
  • SE-2000 color difference meter
  • Example 1 Ralstonia eutropha KNK-005 described in [0049] of WO08 / 010296 is cultured by the method described in [0050] to [0053], and 3-hydroxybutyrate and 3-hydroxyhexanoate are cultured. A cell culture broth containing polyhydroxyalkanoate (PHBH) composed of an ate copolymer was obtained. The weight average molecular weight of PHBH at the end of the culture was 1,840,000. Ralstonia and Eutropha are now classified as Capriavidas Necka.
  • PHBH polyhydroxyalkanoate
  • Example 2 1000 ml of the cell culture solution obtained in Example 1 was sterilized at 70 to 75 ° C. for 1 hour, cooled to 50 ° C., sodium hydroxide was added to pH 8.5, and then 2.5 L of Alcalase (Novozymes) Was added so as to be 1.0% by weight of the amount of PHBH contained in the bacterial cell culture solution and stirred for 4 hours while controlling the pH at 8.5. Then, it cooled to 25 degreeC and 20.0g of sodium dodecyl sulfate was added. Sodium hydroxide was added so that the pH was 10.0, and high pressure was controlled while controlling the temperature at 25 to 35 ° C.
  • Alcalase Novozymes
  • Example 1 1000 ml of the cell culture solution obtained in Example 1 was sterilized at 70 to 75 ° C. for 1 hour, cooled to 25 ° C., 4.0 g of sodium dodecyl sulfate was added, and sodium hydroxide was added to adjust the pH to 13.2. Added and stirred for 1 hour. Thereafter, high-pressure crushing was carried out three times with a high-pressure crusher (high-pressure homogenizer model “PA2K type” manufactured by Nirosoavi) at a pressure of 45 to 55 MPa while controlling the temperature at 25 to 35 ° C. The operation of recovering PHBH by centrifuging this crushed liquid and washing with water was repeated three times.
  • a high-pressure crusher high-pressure homogenizer model “PA2K type” manufactured by Nirosoavi
  • Example 2 1000 g of the bacterial cell culture solution obtained in Example 1 was sterilized at 70 to 75 ° C. for 1 hour, cooled to 50 ° C., 4.0 g of sodium dodecyl sulfate was added, and sodium hydroxide was added so that the pH became 8.5. After the addition, 2.5 L of Alcalase (Novozymes) was added so as to be 1.0% by weight of the amount of PHBH contained in the cell culture medium, and the mixture was stirred for 4 hours while controlling at pH 8.5. Then, after cooling to 25 ° C.
  • Alcalase Novozymes
  • Table 1 shows the results of measuring the molecular weight, protein content, and YI value of the press sheet of PHBH obtained in Examples 1 and 2 and Comparative Examples 1 and 2.

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Abstract

　工業生産に適した簡便且つ安価な方法により、少ない工程数で、大幅な分子量低下を起こすことなく、ＰＨＡ含有微生物細胞から高純度のＰＨＡを分離する。ポリヒドロキシアルカノエート含有微生物細胞の水性懸濁液に、酵素、並びに、アルカリ及び／又は界面活性剤を添加して酵素処理を行い、酵素処理液を得る工程（ａ）、前記酵素処理液に対し、塩基性条件下、界面活性剤の存在下で物理的破砕処理を行ない、前記細胞を破砕すると共に、前記細胞中のポリヒドロキシアルカノエート以外の細胞物質を可溶化又は乳化させて、ポリヒドロキシアルカノエート懸濁液を得る工程（ｂ）、前記ポリヒドロキシアルカノエート懸濁液からポリヒドロキシアルカノエートを分離する工程（ｃ）、を行う。

Description

ポリヒドロキシアルカノエートの回収方法
　本発明は、微生物によって生産されるポリヒドロキシアルカノエートの回収方法に関する。
　ポリヒドロキシアルカノエート（以後、ＰＨＡと略す）は、多くの微生物種の細胞内にエネルギー蓄積物質として生成、蓄積される熱可塑性ポリエステルである。微生物によって天然の有機酸や油脂を炭素源に生産されるＰＨＡは、土中や水中の微生物により完全に生分解され、自然界の炭素循環プロセスに取り込まれる。そのため、生態系への悪影響がほとんどない環境調和型のプラスチック材料と言える。近年、合成プラスチックが環境汚染、廃棄物処理、石油資源の観点から深刻な社会問題となるに至り、ＰＨＡが環境に優しいグリーンプラスチックとして注目され、その実用化が切望されている。また、医療分野においても、回収不要のインプラント材料、薬物担体などの生体適合性プラスチックとして利用が可能と考えられており、実用化が期待されている。
　微生物が生産するＰＨＡは、通常顆粒体として微生物細胞内に蓄積されるため、ＰＨＡをプラスチックとして利用するためには、微生物細胞内からＰＨＡを分離して取り出すという工程が必要である。ＰＨＡを微生物細胞から分離精製する既知の方法は、ＰＨＡが可溶である有機溶媒を用いて微生物細胞からＰＨＡを抽出する方法と、化学的処理又は物理的処理によりＰＨＡ以外の細胞構成成分を可溶化又は破砕して除去することによりＰＨＡを分離する方法とに分けられる。
　初期の研究では有機溶媒による抽出を利用したＰＨＡの分離精製方法が多く報告されている（特許文献１～５参照）。これらの報告ではＰＨＡの溶解度が最も高い有機溶媒としてクロロホルムなどのハロゲン化合物が用いられているが、ＰＨＡを該溶剤に溶解すると溶液の粘性が非常に高くなり取り扱いが困難であった。そのためＰＨＡの抽出はポリマー濃度を２～３％程度と極めて低い条件にして行う必要があり、そのため非常に大量の溶媒を必要とした。加えて、溶媒層からＰＨＡを高い回収率で晶析させるためには、上記溶媒の４～５倍容という大量のメタノールやヘキサン等のＰＨＡ貧溶媒が別途必要である。そのため、工業的に生産するには大規模な設備が必要となる。さらには、溶媒の使用量が膨大なため溶媒の回収コストと損失溶媒のコストがかさみ、ＰＨＡを安価に製造できないなどの理由から、この方法は実用化されていない。
　微生物細胞（以下、菌体ということもある）を化学的処理する方法としては、非特許文献１に菌体懸濁液を次亜塩素酸ナトリウムで処理してＰＨＡ以外の菌体構成成分を可溶化し、ＰＨＡを分離する方法が記載されている。この方法では、ＰＨＡ以外の菌体構成成分の可溶化と同時にＰＨＡの著しい分解が引き起こされるため、製品への加工が制限されてしまう。さらに、ＰＨＡ内に無視できない塩素が残るため、ポリマー製品として好ましくないことからも実用には適さないと考えられる。
　特許文献６には、１００℃以上での加熱処理と、蛋白質分解酵素又は界面活性剤を使用した消化処理とを併用したＰＨＡの回収法が開示されている。この方法では、消化処理により菌体を溶解すると、遊離する核酸により懸濁液が非常に粘稠になるため、予め懸濁液を１００℃以上で加熱し核酸を分解する。ところが、１００℃以上での加熱によりＰＨＡは著しく低分子化してしまい、製品への応用ができなくなる。また、この方法は非常に複雑で多くの工程を必要とするにもかかわらず、得られるＰＨＡの純度は概ね８８％、最大でも９７％程度である。
　また、菌体を界面活性剤で処理した後、菌体から放出された核酸を過酸化水素で８０℃、３時間処理して分解し、９９％純度のＰＨＡを分離する方法（特許文献７参照）や、菌体懸濁液をｐＨ２未満の強酸性下で５０℃以上に加熱した後ＰＨＡを分離する方法が提案されている（特許文献８参照）。これらの熱処理条件ではＰＨＡの分子量は著しく低下するため、たとえ純度が向上したとしても製品への応用ができなくなる。
　一方、菌体を物理的処理する方法としては、菌体を高圧破砕する方法や、高圧破砕とアルカリ添加を組み合わせた方法が報告されている（非特許文献２～３、特許文献９～１２参照）。
　非特許文献２には、ポリ－３－ヒドロキシブチレート（ＰＨＢ）含有菌体懸濁液にアルカリを添加した後、ｐＨを中性に戻してから高圧破砕を行うことが記載されている。当該文献ではポリマーの純度や回収率の記載はないが、中性条件下で高圧破砕を行うことから菌体構成成分がＰＨＢ画分中に残存しており純度が高くないことが予想される。
　特許文献９では、菌体にアルカリを添加後８０℃に加熱し１時間攪拌後ポリマーを遠心分離で回収する方法が開示され、特許文献１０では７０℃で高圧破砕を行う方法が開示されている。特許文献１１では、アルカリを添加後に７０℃以上で高圧破砕を行う方法が開示されている。これらの方法では、高温で処理を行うため条件によってはＰＨＡの分子量が著しく低下する傾向が見られ、さらにポリマー純度も６６～８５％程度と低い。
　特許文献１２及び非特許文献３では、菌体を破砕した後、酵素と界面活性剤を組み合わせて処理することでポリマーを分離する方法が開示されているが、純度が低かったり、極少量の検討であるため、実際の工業化プロセスには応用できない。
　上記のようにこれまでの方法では、培養後の菌体からＰＨＡを、低分子化することなく、且つ高純度で収率良く、工業的に安価に回収することは極めて困難であった。特にＰＨＡが２種以上のモノマー成分からなる共重合体である場合には、単独重合体であるＰＨＢと比べて分子量がより著しく低下する傾向が見られ、安価で効率の良いＰＨＡ回収方法は知られていなかった。
特開昭５５－１１８３９４号公報 特開昭５７－６５１９３号公報 特開昭６３－１９８９９１号公報 特開平０２－６９１８７号公報 特開平０７－７９７８８号公報 特公平０４－６１６３８号公報 特表平０８－５０２４１５号公報 特開平１１－２６６８９１号公報 特開平０７－３１４８７号公報 特開平０７－３１４８８号公報 特開平０７－３１４８９号公報 特開２００８－１９３９４０号公報
J. Gen. Microbiology, 1958年, 第19巻, p.198-209 Bioseparation, 1991年, 第2巻, p.95-105 World J Microbiol Biotechnol, 2008年, 第24巻, p.771-775
　本発明の目的は、従来技術における上記の課題を解決し、工業生産に適した簡便且つ安価な方法により、少ない工程数で、大幅な分子量低下を起こすことなく、ＰＨＡ含有微生物細胞から高純度のＰＨＡを分離することができるＰＨＡ回収方法を提供することである。
　本発明者らは上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、ＰＨＡを含有する微生物細胞の水性懸濁液に対し酵素処理を行った後、塩基性条件下、界面活性剤の存在下で比較的低温で物理的破砕処理を行うことで、破砕効果が飛躍的に向上し、回収されたＰＨＡは分子量低下が抑えられており、かつ高純度であることを見い出し、本発明を完成するに至った。
　即ち、本発明の第一は、微生物により産生したポリヒドロキシアルカノエートを微生物細胞内より回収する方法であって、工程（ａ）：ポリヒドロキシアルカノエート含有微生物細胞の水性懸濁液に、酵素、並びに、アルカリ及び／又は界面活性剤を添加して酵素処理を行い、酵素処理液を得る工程、工程（ｂ）：前記酵素処理液に対し、塩基性条件下、界面活性剤の存在下で物理的破砕処理を行ない、前記細胞を破砕すると共に、前記細胞中のポリヒドロキシアルカノエート以外の細胞物質を可溶化又は乳化させて、ポリヒドロキシアルカノエート懸濁液を得る工程、工程（ｃ）：前記ポリヒドロキシアルカノエート懸濁液からポリヒドロキシアルカノエートを分離する工程、を含むポリヒドロキシアルカノエートの回収方法に関する。本発明では、工程（ａ）における前記酵素が、蛋白質分解酵素及び／又は細胞壁分解酵素であることが好ましい。工程（ｂ）において、前記物理的破砕処理を高圧ホモジナイザーで行うことが好ましい。工程（ａ）及び／又は（ｂ）において使用する前記アルカリが、水酸化ナトリウム、炭酸ナトリウム、水酸化カリウム及び水酸化リチウムからなる群より選択される少なくとも１種であることが好ましい。工程（ｃ）において、前記ポリヒドロキシアルカノエートを前記懸濁液から分離する時の前記懸濁液のｐＨが８．０～１３．０の間に調整されることが好ましい。工程（ａ）及び／又は（ｂ）において使用する界面活性剤が、陰イオン界面活性剤、陽イオン界面活性剤、両性界面活性剤及び非イオン界面活性剤からなる群より選択される少なくとも１種であることが好ましい。前記ポリヒドロキシアルカノエートが、３－ヒドロキシブチレート、３－ヒドロキシバレレート、３－ヒドロキシプロピオネート、４－ヒドロキシブチレート、４－ヒドロキシバレレート、５－ヒドロキシバレレート、３－ヒドロキシペンテノエート、３－ヒドロキシヘキサノエート、３－ヒドロキシヘプタノエート、３－ヒドロキシオクタノエート、３－ヒドロキシノナエート及び３－ヒドロキシドカネートからなる群より選択される少なくとも２種のモノマーを共重合して形成された共重合体であることが好ましい。
　本発明の第二は、前記ポリヒドロキシアルカノエートの回収方法で得られたポリヒドロキシアルカノエートであって、当該ポリヒドロキシアルカノエートから１６０℃でのプレスにより得られる厚み０．５ｍｍのシートが、１５．０以下の黄色度指数（ＹＩ値）を有するポリヒドロキシアルカノエートに関する。
　本発明に従えば、工業生産に適した簡便且つ安価な方法により、少ない工程数で、大幅な分子量低下を起こすことなく、ＰＨＡ含有微生物細胞から高純度のＰＨＡを分離することができるＰＨＡ回収方法を提供することができる。
　以下、本発明につき、さらに詳細に説明する。
　本発明のポリヒドロキシアルカノエートの回収方法は、微生物により産生したポリヒドロキシアルカノエートを微生物細胞内より回収する方法であって、工程（ａ）：ポリヒドロキシアルカノエート含有微生物細胞の水性懸濁液に、酵素、並びに、アルカリ及び／又は界面活性剤を添加して酵素処理を行い、酵素処理液を得る工程、工程（ｂ）：前記酵素処理液に対し、塩基性条件下、界面活性剤の存在下で物理的破砕処理を行ない、前記細胞を破砕すると共に、前記細胞中のポリヒドロキシアルカノエート以外の細胞物質を可溶化又は乳化させて、ポリヒドロキシアルカノエート懸濁液を得る工程、工程（ｃ）：前記ポリヒドロキシアルカノエート懸濁液からポリヒドロキシアルカノエートを分離する工程、を含むものである。
　すなわち本発明では、ＰＨＡ含有微生物細胞に対し物理的破砕処理を行う前に、アルカリ及び／又は界面活性剤の存在下で酵素処理を行うとともに、続く物理的破砕処理を塩基性条件下、界面活性剤の存在下で行うことによって細胞の破砕を達成すると共に、ＰＨＡ以外の細胞を可溶化又は乳化させて、ＰＨＡ水性懸濁液を得る。当該ＰＨＡ水性懸濁液からはＰＨＡを容易に分離することが可能である。
　本発明におけるＰＨＡとは、ヒドロキシアルカノエートの重合体の総称である。ヒドロキシアルカノエートとしては特に限定されないが、例えば、３－ヒドロキシブチレート（３ＨＢ）、３－ヒドロキシバレレート（３ＨＶ）、３－ヒドロキシプロピオネート、４－ヒドロキシブチレート、４－ヒドロキシバレレート、５－ヒドロキシバレレート、３－ヒドロキシペンテノエート、３－ヒドロキシヘキサノエート（３ＨＨ）、３－ヒドロキシヘプタノエート、３－ヒドロキシオクタノエート、３－ヒドロキシノナエート、３－ヒドロキシドカネートなどが挙げられる。
　本発明におけるＰＨＡは、これらヒドロキシアルカノエートのうち１種類のみからなる単独重合体であってもよいし、２種以上のヒドロキシアルカノエートが共重合して形成された共重合体であってもよい。例えば、３ＨＢの単独重合体であるＰＨＢ、３ＨＢと３ＨＶの２成分共重合体であるＰＨＢＶ、３ＨＢと３ＨＨとの２成分共重合体ＰＨＢＨ（特許第２７７７７５７号公報参照）、３ＨＢと３ＨＶと３ＨＨとの３成分共重合体ＰＨＢＨＶ（特許第２７７７５７号公報参照）などが例示できる。特に、共重合体は加熱などによる加水分解などで分子量が低下しやすい傾向にあるため、後述するように分子量がほとんど低下しないという利点を有する本発明を共重合体の回収に適用する意義は大きい。
　特に、生分解性ポリマーとしての分解性と、柔らかい性質を持つ点で、モノマーユニットとして３ＨＨを有する共重合体が好ましく、より好ましくは、ＰＨＢＨである。このときＰＨＢＨを構成する各モノマーユニットの組成比については特に限定されるものではないが、良好な加工性を示す点から、総ユニットに対する３ＨＨユニットの含量は１～９９ｍｏｌ％が好ましく、より好ましくは３～３０ｍｏｌ％である。また、ＰＨＢＨＶを構成する各モノマーユニットの組成比についても特に限定されるものではないが、例えば、総ユニットに対する３ＨＢユニットの含量は１～９５ｍｏｌ％、３ＨＶユニットの含量は１～９６ｍｏｌ％、３ＨＨユニットの含量は１～３０ｍｏｌ％が好適である。
　ＰＨＡを実用化するためには、加工品が使用に耐え得る物性を示す必要がある。この観点から、ゲルクロマトグラフィー法でポリスチレンを分子量標準としたＰＨＡの重量平均分子量が１万以上であることが求められる。好ましくは５万以上、より好ましくは１０万以上、さらに好ましくは２０万以上、特に好ましくは２０万～２００万、極めて好ましくは２０万～１５０万、最も好ましくは２０万～１００万である。分子量が２００万を超えると、溶融して加工する際に流動性が低下し、ハンドリングが悪い場合がある。
　本発明に用いる微生物は、細胞内にＰＨＡを生成する微生物である限りにおいて、特に限定されない。天然から単離された微生物や菌株の寄託機関（例えばＩＦＯ、ＡＴＣＣ等）に寄託されている微生物、または、それらから調製し得る変異体や形質転換体等を使用できる。例えばカプリアビダス（Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ）属、アルカリゲネス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）属、ラルストニア（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ）属、シュウドモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属、アゾトバクター（Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ）属、ノカルディア（Ｎｏｃａｒｄｉａ）属、アエロモナス（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ）属の菌等が挙げられる。特に、アルカリゲネス・リポリティカ（Ａ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）、アルカリゲネス・ラトゥス（Ａ．ｌａｔｕｓ）、アエロモナス・キャビエ（Ａ．ｃａｖｉａｅ）、アエロモナス・ハイドロフィラ（Ａ．ｈｙｄｒｏｐｈｉｌａ）、カプリアビダス・ネケータ（Ｃ．ｎｅｃａｔｏｒ）等の菌株が好ましい。また、微生物が、本来ＰＨＡの生産能力を有しない場合、もしくは生産量が低い場合には、該微生物に目的とするＰＨＡの合成酵素遺伝子および/またはその変異体を導入し、得られる形質転換体を用いることもできる。このような形質転換体の作製に用いるＰＨＡの合成酵素遺伝子としては特に限定はないが、アエロモナス・キャビエ由来のＰＨＡ合成酵素の遺伝子が好ましい。これら微生物を適切な条件で培養することで、菌体内にＰＨＡを蓄積させた微生物菌体を得ることができる。その培養方法については特に限定はないが、例えば特開平０５－９３０４９号公報等に挙げられる方法が用いられる。
　本発明は微生物細胞からＰＨＡを回収することを目的とするので、培養後の微生物細胞中のＰＨＡ含有率は、高い方が好ましい。工業レベルでの適用においては乾燥細胞中に５０重量％以上のＰＨＡが含有されているのが好ましく、以後の分離操作、分離ポリマーの純度等を考慮するとＰＨＡ含有率は６０重量％以上が好ましく、さらに好ましくは７０重量％以上である。
　本発明において、微生物により産生したＰＨＡは、以下のような工程（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）を含む工程により回収される。
　＜工程（ａ）＞
　本発明における工程（ａ）は、ＰＨＡ含有微生物細胞の水性懸濁液に、酵素、並びに、アルカリ及び／又は界面活性剤を添加して酵素処理を行う工程である。この工程により、酵素処理液を得る。
　工程（ａ）で使用するＰＨＡ含有微生物細胞は、培養完了後のＰＨＡ含有微生物細胞を含む培養ブロスそのものであってよい。また、前記培養ブロスから遠心分離や膜分離など当業者に周知の方法により菌体を回収した後、又は、前記培養ブロスを加熱することなどにより菌体を死滅させてから同様に菌体を回収した後、水を添加するなどしてＰＨＡ含有微生物細胞の水性懸濁液を調製することもできる。ここで、前記培養ブロスを加熱する場合の温度は５０℃～８０℃が好ましい。
　本発明における工程（ａ）では、工程（ｂ）の物理的破砕処理を行う前に、ＰＨＡ含有微生物細胞の水性懸濁液に酵素並びにアルカリ及び／又は界面活性剤を添加して、酵素処理を行うことが重要である。物理的破砕処理を行う前にＰＨＡ含有微生物細胞を酵素処理することで、細胞壁をあらかじめ分解して次の物理的破砕処理でより高い破砕効果を得ることができる。
　工程（ａ）で使用する酵素としては、工業的な製品に用いられ得るものであれば特に限定はないが、細胞壁を分解してより高い破砕効果を得る目的においては、蛋白質分解酵素（プロテアーゼ）、細胞壁分解酵素が好ましい。供給安定性やコストの面から工業的には蛋白質分解酵素がより好ましい。酵素は１種類のみを用いてもよいし、２種類以上を併用してもよい。また、蛋白質分解酵素、細胞壁分解酵素のうち１種類を使用してもよいし、両酵素を併用してもよい。
　蛋白質分解酵素としては、アルカラーゼ、ペプシン、トリプシン、パパイン、キモトリプシン、アミノペプチダーゼ、カルボキシペプチダーゼなどが例示できる。細胞壁分解酵素としては、リゾチーム、アミラーゼ、セルラーゼ、マルターゼ、サッカラーゼ、α及びβ－グリコシナーゼなどが例示できる。さらには、例えば酵素の他、酵素の安定化剤や界面活性剤、又は再汚染防止剤などを含有する酵素組成物を使用してもよく、酵素のみの使用には限定されない。また、一般に市販されている洗濯用酵素洗剤なども使用できる。上記細胞壁分解酵素の内、溶菌効果の点からリゾチームが好ましい。
　具体的な蛋白質分解酵素としては、例えば「プロテアーゼＡ」、「プロテアーゼＰ」、「プロテアーゼＮ」（以上、天野エンザイム社製）、「アルカラーゼ」、「エスペラーゼ」、「ザビナーゼ」、「エバラーゼ」（以上、ノボザイムズ社製）等が工業的に使用可能であり、分解活性の点からも好適に使用できる。また、具体的な細胞壁分解酵素としては、例えば「リゾチーム」（山東省華源経貿製）、「ビオザイムＡ」、「セルラーゼＡ「アマノ」３」、「セルラーゼＴ「アマノ」４」、「α－グルコシダーゼ「アマノ」」（以上、天野エンザイム社製）、「ターマミル」、「セルソフト」（以上、ノボザイムズ社製）等が工業的に使用可能である。これら酵素による処理は、より高い精製効果が得られる点で界面活性剤の存在下に行うことが望ましい。
　酵素処理は、使用する酵素の至適温度及び至適ｐＨ下で行うのが好ましい。例えば、アルカラーゼ（ノボザイムズ社製）を使う場合は温度：５０～６０℃、ｐＨ：８～９が好ましく、エスペラーゼ（ノボザイムズ社製）を使う場合は温度：５５～６５℃、ｐＨ：８～１０が好ましく、リゾチームを使う場合は温度：４０～５０℃、ｐＨ：６～７が好ましい。酵素処理は所要の処理度が達成されるまで継続することが好ましく、この時間は通常０．５～８時間である。酵素の添加量は、酵素の種類及び活性に依存する。特に限定はされないが、微生物が産生したＰＨＡ１００重量部に対して、０．００１～１０重量部が好ましく、コストの点から０．００１～５重量部がより好ましい。酵素処理は、水性懸濁液を撹拌しながら行うことが好ましい。
　工程（ａ）では、ＰＨＡ含有微生物細胞の水性懸濁液が示すｐＨを酵素の至適ｐＨに調整するため、及び／又は、ＰＨＡ含有微生物の細胞壁を破壊して細胞中のＰＨＡを細胞外に流出しやすくするために、アルカリを水性懸濁液に添加してアルカリの存在下で酵素処理を行うことが好ましい。アルカリとは水に溶解した時にその水溶液が塩基性を示す物質を意味する。有機化合物及び無機化合物の双方が含まれる。無機化合物であるアルカリとしては特に限定されないが、例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化リチウム等のアルカリ金属の水酸化物、炭酸ナトリウム、炭酸カリウム等のアルカリ金属の炭酸塩、炭酸水素ナトリウム、炭酸水素カリウム等のアルカリ金属の炭酸水素塩、酢酸ナトリウム、酢酸カリウム等の有機酸のアルカリ金属塩、ホウ砂等のアルカリ金属のホウ酸塩、リン酸３ナトリウム、リン酸水素２ナトリウム、リン酸３カリウム、リン酸水素２カリウム等のアルカリ金属のリン酸塩、水酸化バリウムなどのアルカリ土類金属の水酸化物あるいはアンモニア水等が挙げられる。この中でも、工業生産に適し、また価格の点で、水酸化ナトリウム、炭酸ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化リチウムが好ましい。工程（ａ）でのアルカリの添加量は、使用する酵素の至適ｐＨを考慮して適宜決定することができる。水性懸濁液が示すｐＨが、アルカリを添加する以前においてすでに使用酵素の至適ｐＨの範囲内にある場合は、工程（ａ）でアルカリを添加しなくともよい。また、工程（ａ）では酵素処理が進行するに従い、水性懸濁液のｐＨが変動するので、これが至適ｐＨの範囲内にあるよう制御しつつ酵素処理を実施するのが好ましい。
　本発明の工程（ａ）において、水性懸濁液にアルカリを添加する際の水性懸濁液の温度は、使用する酵素の至適温度付近が望ましい。具体的には、２０～６０℃の範囲が好ましい。６０℃より高い温度でアルカリを添加すると、ＰＨＡの分子量の著しい低下を招く場合がある。２０℃より低い温度でアルカリを添加すると、水性懸濁液の粘性が向上し撹拌が困難になる場合がある。
　工程（ａ）では、ＰＨＡ含有微生物の細胞壁を破壊して細胞中のＰＨＡを細胞外に流出しやすくするため、及び／又は、細胞に含まれる蛋白質や脂肪酸、油脂等を洗浄、除去してＰＨＡの純度を向上させるために、界面活性剤を水性懸濁液に添加して界面活性剤の存在下で酵素処理を行うことが好ましい。工程（ａ）においてアルカリと界面活性剤は併用してもよいし、併用しなくてもよい。本発明で使用する界面活性剤としては、陰イオン界面活性剤、陽イオン界面活性剤、両性界面活性剤、非イオン界面活性剤が挙げられる。洗浄性の観点からは、陰イオン界面活性剤及び／又は非イオン界面活性剤が好ましい。蛋白質などを洗浄・除去する目的においては、陰イオン界面活性剤を用いることが好ましく、また、脂肪酸や油脂の洗浄・除去を目的とする場合、非イオン界面活性剤を用いることが好ましい。また陰イオン界面活性剤及び非イオン界面活性剤の両方を含有してもよい。両方を含有する場合、陰イオン界面活性剤／非イオン界面活性剤の重量比は１／１００～１００／１０が好ましく、５／１００～１００／２０がより好ましく、５／１００～１００／１００がさらに好ましく、５／１００～５０／１００が特に好ましい。
　前記陰イオン界面活性剤としては、例えば、アルキル硫酸塩、アルキルベンゼンスルホン酸塩、アルキル又はアルケニル硫酸エステル塩、アルキル又はアルケニルエーテル硫酸エステル塩、α－オレフィンスルホン酸塩、α－スルホ脂肪酸塩又はこのエステル、アルキル又はアルケニルエーテルカルボン酸塩、アミノ酸型界面活性剤、Ｎ－アシルアミノ酸型界面活性剤等が挙げられる。中でも、アルキル基の炭素数が１２～１４のアルキル硫酸塩、アルキル基の炭素数が１２～１６の直鎖アルキルベンゼンスルホン酸塩、アルキル基の炭素数が１０～１８のアルキル硫酸エステル塩又はアルキルエーテル硫酸エステル塩が好ましい。陰イオン界面活性剤に含まれる対イオンとしてはナトリウム、カリウム等のアルカリ金属、マグネシウム等のアルカリ土類金属、モノエタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン等のアルカノールアミンが好ましい。
　前記非イオン界面活性剤としては、例えば、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル、ポリオキシアルキレンアルキルエーテル、脂肪酸ソルビタンエステル、アルキルポリグルコシド、脂肪酸ジエタノールアミド、アルキルモノグリセリルエーテル等が挙げられる。中でも、親水性の高い化合物、及び、水と混和した際に生じる液晶の形成能が低い又はそのような液晶を生じない化合物が好ましい。特に、生分解性が比較的良好である点から、ポリオキシエチレンアルキルエーテルやポリオキシアルキレンアルキルエーテルが好ましい。
　前記陽イオン界面活性剤としては、例えば、アルキルトリメチルアンモニウム塩、ジアルキルジメチルアンモニウム塩等が挙げられる。
　前記両性界面活性剤としては、例えば、カルボベタイン型、スルホベタイン型等の界面活性剤が挙げられる。
　上述した界面活性剤のうち、陰イオン界面活性剤であるドデシル硫酸ナトリウム、ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム、コール酸ナトリウム、デオキシコール酸ナトリウム及びオレイン酸ナトリウム、非イオン界面活性剤であるポリオキシエチレンアルキルエーテルやポリオキシアルキレンアルキルエーテルが価格、使用量や添加効果の点で好ましい。また、これらの界面活性剤を２種以上併用してもよい。
　以上で例示した全ての界面活性剤は一般に市販されている洗濯用洗剤に含有されているものであることから、適当な洗濯用洗剤を使用することによっても本発明の効果を達成することができる。工程（ａ）での界面活性剤の添加量は、特に限定されないが、微生物が産生したＰＨＡ１００重量部に対して、０．００１～１０重量部が好ましく、さらにはコストの点から、５重量部以下が好ましい。
　＜工程（ｂ）＞
　本発明における工程（ｂ）は、工程（ａ）で得られた酵素処理液に対し、塩基性条件下、界面活性剤の存在下で物理的破砕処理を行い、前記酵素処理液に含まれる細胞を破砕すると共に、前記細胞中のＰＨＡ以外の細胞物質を可溶化又は乳化させる工程である。この工程により、ＰＨＡ水性懸濁液を得る。
　工程（ｂ）の物理的破砕処理は、細胞中のＰＨＡ以外の細胞物質を水に溶解させるために、酵素処理液を塩基性条件に調整して実施する。このために、工程（ａ）で得られた酵素処理液に対しアルカリを添加することが好ましい。工程（ｂ）で添加されるアルカリとしては、工程（ａ）で使用され得るアルカリに関して例示した化合物を使用できる。中でも、低価格で工業生産に適しているため、水酸化ナトリウム、炭酸ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化リチウムが好ましい。これらのアルカリを用い、工程（ａ）で得られた酵素処理液をｐＨ８．０～１３．０の塩基性条件下に調整することが好ましい。ｐＨが８．０より低いと、菌体由来の不溶物を十分に可溶化することができず、回収されたＰＨＡの純度が低く、加工された成形体が不要な着色を帯びることになる。ｐＨが１３．０を超えるとＰＨＡの分子量の低下傾向が激しい場合がある。より効果的に不溶物を可溶化でき、かつＰＨＡ自体には悪影響をあまり与えないという観点から、より好ましくはｐＨ８．５～１２．５の塩基性条件下であり、さらに好ましくはｐＨ９．０～１２．５の塩基条件下であり、特に好ましくはｐＨ１０．０～１２．５の塩基性条件下である。工程（ｂ）でのアルカリの添加量は、上記ｐＨ範囲を考慮して適宜決定することができる。酵素処理液が示すｐＨが、アルカリを添加する以前においてすでに上記ｐＨ範囲内にある場合は、工程（ｂ）でのアルカリ添加を省略することができる。
　工程（ｂ）において、酵素処理液にアルカリを添加する際の酵素処理液の温度は２０～４０℃の範囲に調整することが好ましい。４０℃より高い温度でアルカリを添加すると、ＰＨＡの分子量の著しい低下を招く場合があり、２０℃より低い温度では菌体由来の不溶物を可溶化できない場合がある。
　工程（ｂ）の物理的破砕処理は、ＰＨＡ含有微生物の細胞壁を破壊して細胞中のＰＨＡを細胞外に流出しやすくするため、及び／又は、細胞に含まれる蛋白質や脂肪酸、油脂等を洗浄、除去してＰＨＡの純度を向上させるために、酵素処理液が界面活性剤を含む条件下で実施する。工程（ａ）ですでに界面活性剤を添加している場合は、酵素処理液がすでに界面活性剤を含んでいるので、工程（ｂ）で新たに界面活性剤を添加する必要はないが、添加してもよい。工程（ｂ）で添加する界面活性剤としては、工程（ａ）で使用され得る界面活性剤に関して例示した化合物を使用できる。中でも、洗浄性の観点から、陰イオン界面活性剤及び／又は非イオン界面活性剤が好ましい。好ましい添加量は工程（ａ）で記載した範囲と同じである。
　このように工程（ｂ）では、塩基性のｐＨを示し、かつ界面活性剤を含む酵素処理液に対し物理的破砕処理を実施する。物理的破砕処理の実施に使用する装置としては、特に限定されないが、例えば、高圧ホモジナイザー、超音波破砕機、乳化分散機、ビーズミル等が挙げられる。中でも破砕効率の点から高圧ホモジナイザーの使用が好ましく、処理される液体が微小開口部を有する耐圧性容器に導入され高圧をかけられることにより開口部から押し出されるタイプがより好ましい。このタイプの破砕機としては、例えば、ニロソアビ社製高圧ホモジナイザーモデル「ＰＡ２Ｋ型」が挙げられる。高圧ホモジナイザーを用いると微生物細胞に大きな剪断力が作用するため、微生物細胞は効率的に破壊されＰＨＡの分離性が向上する。このような機器は開口部で高圧がかかり、瞬間的に高温になるため、必要に応じて、一般の低温恒温循環槽により処理液を冷却することで温度の上昇を防ぎ、２０～４０℃で物理的破砕処理を行うことが好ましい。２０～４０℃の範囲では、ＰＨＡの分子量をほとんど低下させることなく物理的破砕処理を行うことができる。
　物理的破砕処理を行う際の破砕圧力は３０～６０ＭＰａが好ましい。３０ＭＰａより低いと破砕効率が低下し、破砕操作を何回も繰り返しても微生物細胞を破壊できない場合がある。６０ＭＰａより高いと破砕効率は上がるが、高圧ホモジナイザーが超高圧仕様となり、装置価格が高価となることから製造コストが上がる。
　工程（ｂ）の物理的破砕処理は、破砕効率を上げるため、複数回実施してもよい。
　＜工程（ｃ）＞
　本発明における工程（ｃ）は、工程（ｂ）で得られたＰＨＡ水性懸濁液からＰＨＡを分離する工程である。これにより微生物が産生したＰＨＡを回収することができる。懸濁液からＰＨＡを分離する方法としては、遠心分離や膜分離など、従来公知の方法を使用できるが、工業的に大量処理が可能で連続使用できるため遠心分離が好ましい。遠心分離機のなかでは、孔なし回転容器をもつ遠心沈降機が好ましく、種類としては分離板型、円筒型、デカンター型などがある。ＰＨＡ粒子は水との比重差が小さいので、分離沈降面積が大きく、高い加速度が得られる分離板型（間欠排出型、ノズル排出型）が好ましい。懸濁液中のＰＨＡ濃度が高い場合は特にノズル排出型が好ましい。また、デカンター型は一般的に加速度が低く、固液の比重差が小さい場合は不向きであるが、ＰＨＡの粒子径を変化させること等によりデカンター型も使用可能である。また、デカンター型には分離板を有し、分離沈降面積を大きくした機種もあり、このような機種であれば特に粒子径を変化させなくても使用可能な場合がある。
　上述した分離方法により、懸濁液からＰＨＡを回収した後、水でＰＨＡを懸濁して水洗することで、回収したＰＨＡに含まれるＰＨＡ以外の細胞物質を除去することができる。この水洗時のｐＨは８．０～１２．５が好ましい。ｐＨが８．０より低いと、不純物である細胞物質の可溶化が進まない場合があり、ｐＨが１２．５より高いとＰＨＡの分子量低下が大きくなる場合がある。また、この時の水洗に用いる水の温度は２５～４０℃が好ましい。２５℃未満では細胞物質の可溶化が進まず、４０℃を超えると分子量低下が大きくなる。以上の水洗処理は複数回実施することによりＰＨＡの純度を向上させることができる。
　本発明の回収方法によると、高温での加熱処理を行うことなく、ＰＨＡ含有微生物細胞からＰＨＡを回収することができる。具体的には本発明の回収方法は、全工程を通じてＰＨＡが曝される温度が８０℃以下という条件で実施できるので、これによりＰＨＡの大幅な分子量低下を回避することができる。本発明によると、ＰＨＡの大幅な分子量低下を回避しつつも、高純度のＰＨＡを回収することができる。
　本発明の回収方法により回収されたＰＨＡは、乾燥後、種々の形状に成形することができる。例えば、１６０℃で溶融プレスしてシートの形状に成形することができる。本発明により取得されたＰＨＡは高純度であるため、前記シートの黄色度指数（ＹＩ値）は極めて低い値を示す。これにより、当該ＰＨＡが、着色の少ない高品質のものであることが分かる。具体的なＹＩ値は、前記シートが厚み０．５ｍｍである場合において１５．０以下である。ＰＨＡに要求されるＹＩ値は使用用途によって異なるが、ＹＩ値は１５以下が好ましく、より好ましくは１０以下、さらに好ましくは５以下である。１５を超えると、透明シートやボトルに加工したときに着色が強く、無着色での用途が限られることになる。
　以下に実施例を示し、本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に何ら限定されるものではない。なお、実施例において「部」や「％」は重量基準である。
　＜ＰＨＡの平均分子量の測定方法＞
　実施例で得られた乾燥ＰＨＡ１０ｍｇを、クロロホルム５ｍｌに溶解した後、不溶物を濾過により除いた。この溶液をサンプルとして、「Ｓｈｏｄｅｘ　Ｋ８０５Ｌ（３００ｘ８ｍｍ、２本連結）」（昭和電工社製）を装着した島津製作所製ＧＰＣシステムを用い、クロロホルムを移動相としてＰＨＡの重量平均分子量を測定した。分子量標準サンプルには市販の標準ポリスチレンを用いた。
　＜蛋白質含量の測定方法＞
　ＰＨＡ中に残存する蛋白質含量を、残存窒素量で評価した。実施例で得られる破砕液サンプルを十分量の水で洗浄した後、遠心分離でＰＨＢＨを回収し、得られたＰＨＢＨを減圧乾燥して残存窒素量測定に用いた。
　残存窒素量は呈色法により算出し、呈色法は、まず各サンプルに対して５ＭのＮａＯＨを添加し、９５℃で加水分解反応を実施した。この加水分解液を等量の６０％酢酸水溶液で中和し、酢酸緩衝液とニンヒドリン溶液を添加し１００℃で呈色反応を行った。この呈色反応液の吸光度を日立製作所社製レシオビーム分光光度計「Ｕ－１８００形」により測定した。この吸光度と、ロイシン試料を用いて作成した検量線とを比較することで、残存窒素量を算出した。
　＜ＹＩ値の測定＞
　実施例で得られた乾燥ＰＨＡ３．０ｇを、１５ｃｍ四方の金属板で挟み、さらに金属板の四隅に厚さ０．５ｍｍの金属板を挿入して、これを実験用小型プレス機（高林理化株式会社製Ｈ－１５型）にセットした。１６０℃にて７分間加温後、約５Ｍｐｓにて２分間加熱しながらプレスして厚み０．５ｍｍのシートを得た。プレス後は室温に放置してＰＨＡを硬化させた後、色差計「ＳＥ－２０００」（日本電色社製）にて、３０ｍｍ測定板を使ってプレスシートを載せ、その上に白色標準板を被せてＹＩ値を測定した。
　（実施例１）
　国際公開第０８／０１０２９６号の［００４９］に記載のラルストニア・ユートロファＫＮＫ－００５株を、同［００５０］～［００５３］に記載の方法で培養し、３－ヒドロキシブチレートと３－ヒドロキシヘキサノエートの共重合体からなるポリヒドロキシアルカノエート（ＰＨＢＨ）を含有する菌体培養液を得た。培養終了時点でのＰＨＢＨの重量平均分子量は１８４万であった。なお、ラルストニア・ユートロファは、現在では、カプリアビダス・ネケータに分類されている。
　得られた菌体培養液１０００ｇを７０～７５℃で１時間滅菌し、５０℃に冷却後、ドデシル硫酸ナトリウムを４．０ｇ添加し、ｐＨ８．５になるように水酸化ナトリウムを添加した後、アルカラーゼ２．５Ｌ（ノボザイムズ社）を菌体培養液に含まれるＰＨＢＨ量の１．０重量％となるよう添加して、ｐＨ８．５にコントロールしながら４時間撹拌した。その後、２５℃に冷却してｐＨ１２．０になるように水酸化ナトリウムを添加した後、高圧破砕機（ニロソアビ社製高圧ホモジナイザーモデル「ＰＡ２Ｋ型」）で４５～５５ＭＰａの圧力にて、温度を２５～３５℃にコントロールしながら高圧破砕を３回行った。この破砕液を温度３０℃、ｐＨ１２．０に調整して約１０分撹拌した後、遠心分離によりＰＨＢＨを回収し、水を加えてＰＨＢＨを懸濁した。この破砕液のｐＨ調整からＰＨＢＨを懸濁するまでの操作を３回繰り返した。この後、懸濁液のｐＨを４．５～５．０に調整して約１時間撹拌した。この調整液より遠心分離によりＰＨＢＨを回収した。得られたＰＨＢＨを４０℃で１２時間減圧乾燥させ、精製ＰＨＢＨを得た。ＰＨＢＨの回収率は９８％であった。
　（実施例２）
　実施例１で得られた菌体培養液１０００ｍｌを７０～７５℃で１時間滅菌し、５０℃に冷却後、ｐＨ８．５になるように水酸化ナトリウムを添加した後、アルカラーゼ２．５Ｌ（ノボザイムズ社）を菌体培養液に含まれるＰＨＢＨ量の１．０重量％となるよう添加して、ｐＨ８．５にコントロールしながら４時間撹拌した。その後、２５℃に冷却してドデシル硫酸ナトリウムを２０．０ｇ添加した。ｐＨ１０．０になるように水酸化ナトリウムを添加して、高圧破砕機（ニロソアビ社製高圧ホモジナイザーモデル「ＰＡ２Ｋ型」）で４５～５５ＭＰａの圧力にて、温度を２５～３５℃にコントロールしながら高圧破砕を３回行った。この破砕液を温度３０℃、ｐＨ１２．０に調整して約１０分撹拌した後、遠心分離によりＰＨＢＨを回収し、水を加えてＰＨＢＨを懸濁した。この破砕液のｐＨ調整からＰＨＢＨを懸濁するまでの操作を３回繰り返した。この後、懸濁液のｐＨを４．５～５．０に調整して約１時間撹拌した。この調整液より遠心分離によりＰＨＢＨを回収した。得られたＰＨＢＨを４０℃で１２時間減圧乾燥させ、精製ＰＨＢＨを得た。ＰＨＢＨの回収率は９８％であった。
　（比較例１）
　実施例１で得られた菌体培養液１０００ｍｌを７０～７５℃で１時間滅菌し、２５℃に冷却後、ドデシル硫酸ナトリウムを４．０ｇ添加し、ｐＨ１３．２になるように水酸化ナトリウムを添加して１時間撹拌した。その後、高圧破砕機（ニロソアビ社製高圧ホモジナイザーモデル「ＰＡ２Ｋ型」）で４５～５５ＭＰａの圧力にて、温度を２５～３５℃にコントロールしながら高圧破砕を３回行った。この破砕液を遠心分離によりＰＨＢＨを回収し、水洗する操作を３回繰り返した。この後、排除した上清と同量の水を添加して懸濁し、ｐＨ４．５～５．０に調整して約１時間撹拌した。この調整液より遠心分離によりＰＨＢＨを回収した。得られたＰＨＢＨを４０℃で１２時間減圧乾燥させ、精製ＰＨＢＨを得た。ＰＨＢＨの回収率は９８％であった。
　（比較例２）
　実施例１で得られた菌体培養液１０００ｇを７０～７５℃で１時間滅菌し、５０℃に冷却後、ドデシル硫酸ナトリウムを４．０ｇ添加し、ｐＨ８．５になるように水酸化ナトリウムを添加した後、アルカラーゼ２．５Ｌ（ノボザイムズ社）を菌体培養液に含まれるＰＨＢＨ量の１．０重量％量となるよう添加して、ｐＨ８．５にコントロールしながら４時間撹拌した。その後、２５℃に冷却してｐＨ７．０になるように硫酸を添加した後、高圧破砕機（ニロソアビ社製高圧ホモジナイザーモデル「ＰＡ２Ｋ型」）で４５～５５ＭＰａの圧力にて、温度を２５～３５℃にコントロールしながら高圧破砕を３回行った。この破砕液を温度３０℃、ｐＨ１２．０に調整して約１０分撹拌した後、遠心分離によりＰＨＢＨを回収し、水を加えてＰＨＢＨを懸濁した。この破砕液のｐＨ調整からＰＨＢＨを懸濁するまでの操作を３回繰り返した。この後、懸濁液のｐＨを４．５～５．０に調整して約１時間撹拌した。この調整液より遠心分離によりＰＨＢＨを回収した。得られたＰＨＢＨを４０℃で１２時間減圧乾燥させ、精製ＰＨＢＨを得た。ＰＨＢＨの回収率は９８％であった。
　表１に実施例１、２と比較例１、２で得られたＰＨＢＨの、分子量、蛋白質含量、プレスシートのＹＩ値を測定した結果を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　以上の結果より、酵素処理後に物理的破砕処理を行った実施例１及び２では、酵素処理を行わずに物理的破砕処理を行った比較例１、及び、中性条件下で物理的破砕処理を行った比較例２と比較して、ＰＨＢＨの分子量の低下が抑制されており、蛋白質含量は低くＹＩ値も小さいものであったので、ＰＨＢＨが高純度であることが分かった。

Claims (8)

  1. 　微生物により産生したポリヒドロキシアルカノエートを微生物細胞内より回収する方法であって、
    　工程（ａ）：ポリヒドロキシアルカノエート含有微生物細胞の水性懸濁液に、酵素、並びに、アルカリ及び／又は界面活性剤を添加して酵素処理を行い、酵素処理液を得る工程、
    　工程（ｂ）：前記酵素処理液に対し、塩基性条件下、界面活性剤の存在下で物理的破砕処理を行ない、前記細胞を破砕すると共に、前記細胞中のポリヒドロキシアルカノエート以外の細胞物質を可溶化又は乳化させて、ポリヒドロキシアルカノエート懸濁液を得る工程、
    　工程（ｃ）：前記ポリヒドロキシアルカノエート懸濁液からポリヒドロキシアルカノエートを分離する工程、
    　を含むポリヒドロキシアルカノエートの回収方法。
  2. 　工程（ａ）における前記酵素が、蛋白質分解酵素及び／又は細胞壁分解酵素である請求項１に記載のポリヒドロキシアルカノエートの回収方法。
  3. 　工程（ｂ）において、前記物理的破砕処理を高圧ホモジナイザーで行う請求項１又は２に記載のポリヒドロキシアルカノエートの回収方法。
  4. 　工程（ａ）及び／又は（ｂ）において使用する前記アルカリが、水酸化ナトリウム、炭酸ナトリウム、水酸化カリウム及び水酸化リチウムからなる群より選択される少なくとも１種である請求項１～３の何れかに記載のポリヒドロキシアルカノエートの回収方法。
  5. 　工程（ｃ）において、前記ポリヒドロキシアルカノエートを前記懸濁液から分離する時の前記懸濁液のｐＨが８．０～１３．０の間に調整される請求項１～４の何れかに記載のポリヒドロキシアルカノエートの回収方法。
  6. 　工程（ａ）及び／又は（ｂ）において使用する界面活性剤が、陰イオン界面活性剤、陽イオン界面活性剤、両性界面活性剤及び非イオン界面活性剤からなる群より選択される少なくとも１種である請求項１～５の何れかに記載のポリヒドロキシアルカノエートの回収方法。
  7. 　前記ポリヒドロキシアルカノエートが、３－ヒドロキシブチレート、３－ヒドロキシバレレート、３－ヒドロキシプロピオネート、４－ヒドロキシブチレート、４－ヒドロキシバレレート、５－ヒドロキシバレレート、３－ヒドロキシペンテノエート、３－ヒドロキシヘキサノエート、３－ヒドロキシヘプタノエート、３－ヒドロキシオクタノエート、３－ヒドロキシノナエート及び３－ヒドロキシドカネートからなる群より選択される少なくとも２種のモノマーを共重合して形成された共重合体である請求項１～６の何れかに記載のポリヒドロキシアルカノエートの回収方法。
  8. 　請求項１～７の何れかに記載のポリヒドロキシアルカノエートの回収方法で得られたポリヒドロキシアルカノエートであって、
    　当該ポリヒドロキシアルカノエートから１６０℃でのプレスにより得られる厚み０．５ｍｍのシートが、１５．０以下の黄色度指数（ＹＩ値）を有するポリヒドロキシアルカノエート。
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