WO2010095463A1 - 免疫増強組成物及びそれを製造する方法 - Google Patents

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御手洗薫
長濱陽二
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Definitions

  • the present invention relates to a composition that enhances antibacterial action, antiviral action, anti-inflammatory action, and anticancer action by stimulating innate immunity, and affects lymphocyte immune system to suppress inflammation.
  • the composition according to the present invention stimulates innate immunity receptors such as TLR, NLR and RIG, followed by innate immune response cells including macrophages, natural killer cells, and natural killer T cells. It activates and activates lymphoid immunity linked to innate immunity such as Th17 and Th1, or Treg.
  • innate immunity receptors such as TLR, NLR and RIG
  • innate immune response cells including macrophages, natural killer cells, and natural killer T cells.
  • lymphoid immunity linked to innate immunity such as Th17 and Th1, or Treg.
  • the anticancer action, antibacterial action, antiviral action, and anti-inflammatory action are enhanced, resulting from CTL runaway Reduces autoimmunity.
  • vertebrate innate immune receptors include TLR (Toll-like-receptor), NLR (Nod-like-receptor), and RLR (RIG-like-receptor) inside and outside the cell
  • TLR Toll-like-receptor
  • NLR Nod-like-receptor
  • RLR RLR
  • ligands substances produced by the decomposition of bacteria and viruses
  • pattern recognition ligands
  • Multiple ligands are generated depending on the type of bacteria or virus to be decomposed. Generally, the generated substances and their concentrations are different, so the patterns recognized by the combination of these ligand groups are slightly different and identified. Have been immune response.
  • TLR-1 & 2 TLR-6 & 2, TLR-4 & MD-2, and TLR-5 act on the cell membrane and are degraded by lysosomal enzymes in endosomes and phagocytes.
  • Degraded fragments of bacterial and viral nucleic acids DNA and RNA
  • TLR-3, TLR-7, TLR-8, and TLR-9 TLR-3, TLR-7, TLR-8, and TLR-9.
  • NLR receptors that detect low molecular weight degradation products of bacteria such as NOD1, NOD2, NALP3, NAIP5, and IPAF, which are receptors that detect low molecular weight degradation products of bacteria. Detecting RIG and MDA-5 are working.
  • innate immunity receptors are interleukins for various antibacterials and I-type interferons (IFN- ⁇ family, INF- ⁇ and INF- ⁇ ), or a similar substance, is released to allow neighboring cells to sense. And the cell group that senses it protects the ally cell group from external enemies by simultaneously releasing antibacterial substances such as defensin, cathelicidin, dermicidin and hundreds of antiviral substances called ISG. .
  • IFN- ⁇ family INF- ⁇ and INF- ⁇
  • the second role of innate immune receptors is to activate phagocytic cells present in multicellular organisms with intestinal tracts. Phagocytic cells develop as cells that are responsible for moving innate immunity, and macrophages and neutrophils play a role in humans. Macrophages in particular play an important role as immunity commanders. When the receptors, which are innate immunity sensors, are stimulated, macrophages, neutrophils, and their friends are activated and fight against external enemies such as bacteria and viruses.
  • lymphoid immune system In vertebrates other than lampreys and white eels, an immune system that distinguishes self and non-self in the lymphocyte system has developed and reinforces the immune system. Particularly in mammals, this lymphoid immune system has been enhanced and strengthened on the basis of the complement system. On the other hand, he suffered from allergic diseases and autoimmune diseases.
  • IL-12 which differentiates T cells
  • Interleukins such as IL-6, IL-4, and TGF- ⁇ and IL-1 ⁇ that activates differentiated T cells, IL-23, IL-2, and IL-2 that suppresses the activity of differentiated T cells, IL- 25, IL-27, IL-6, etc. are secreted according to the results of their pattern recognition.
  • LPS LPS
  • R-848 imidaquinoline
  • flangerin is a ligand that activates TLR5.
  • imidaquinoline and R-848 produce different types of IFN- ⁇ with the same TLR7 activity
  • imidaquinoline is used as a therapeutic agent for HPV (papillomavirus)
  • R-848 is used as a therapeutic agent for HHV (herpeswillis). It has been broken. This shows that the activity of the same receptor varies depending on the ligand.
  • MDP muramyl dipeptide
  • MDP-Lys has become a pharmaceutical as an adjuvant. Recently, it has attracted renewed attention by activating NLR, but it is not used alone, and it has been found that its ligand effect can be enhanced by combining with other ligands such as LPS and lipid A.
  • Patent Document 1 discovered that IL-10 is unexpectedly produced by a complex ligand made from a combination of IL-12-producing bacteria and yeast, and IL-12-nonproducing bacteria and yeast. is doing.
  • the composite ligand brings about a synergistic effect not found in a single ligand, and by dispersing the points of action, if the ligand called LPS (endotoxin) is harmful, the risk can be dispersed.
  • LPS endotoxin
  • the present invention has been made in view of such circumstances, and an object thereof is to provide an effective composition (ligand or adjuvant) having no cytotoxicity. More specifically, to provide a highly safe composition (ligand or adjuvant) having an antibacterial effect that does not induce inflammatory diseases, an antiviral effect, an anticancer effect, and an anti-inflammatory effect including suppression of CTL runaway. Objective.
  • Another object of the present invention is to provide a low molecular composition (low molecular ligand) that can easily penetrate the cell membrane.
  • the ability to easily permeate the cell membrane means that it is possible to complexly stimulate innate immune receptors sterically present on the cell surface, the endosome inside the cell, and the cytoplasm.
  • an object of the present invention is to provide a composition (ligand) that sterically stimulates an innate immune receptor. This is because by realizing a three-dimensional composition (ligand), the synergistic effect can be expected, and the safety can be further enhanced. Furthermore, by reducing the molecular weight, it is possible to provide an immunoactive agent that can be easily absorbed from the intestinal tract and skin. In addition, a composition (ligand) that is not attacked by antibodies because of its low molecular weight can be realized, and can also be used as an injection.
  • an object of the present invention is to provide a composition that can be used as an adjuvant.
  • Mitarai one of the inventors of the present invention, collected aerobic soil fungi in a forest in the mountains near Saiki City, Oita Prefecture, and cultivated for many years. As a result of repeated research and experimentation, the present invention has been completed.
  • the present inventors gave a low molecular weight degradation product obtained by degrading the cells of the symbiotic bacteria group to a diseased HIV patient, the condition was remarkably improved, and CD4, which is an index of the onset of AIDS. It was found that the number of symbiotic fungi increased significantly in a short period of less than one month and all were well.
  • the degradation products of the MRE symbiotic group can enhance innate immunity in the patient and treat the disease. That is, the present invention provides an innate immunity enhancing composition containing a degradation product of the MRE symbiotic bacteria group that can enhance the immunity of a subject.
  • an immunopotentiating composition that enhances immunity of a subject by stimulating innate immunity, comprising Bacillus sp. (Bacillus sp.) (FERM BP-11209), Lysinibacillus fusiformis (FERM BP-11206), Bacillus sonorensis (Bacillus sonorensis), Ricinibacillus sp. (Lysinibacillus sp.) (FERM BP-11207), and Comamonas sp.
  • At least 98% by weight or more of the immunostimulatory substance is a hydrophilic low molecular weight substance having an average molecular weight of 1,000 Da or less.
  • the immunostimulatory substance activates macrophages, natural killer cells, or natural killer T cells.
  • the immunostimulatory substance activates dendritic cells, microglia cells, Langerhans cells, or Kupffer cells.
  • the immunostimulatory substance activates epithelial cells, fibroblasts, keratinocytes, or osteoblasts.
  • the immunostimulatory substance differentiates or activates Th17 or Th1.
  • the immunostimulatory substance enhances IL-21 production.
  • the immunostimulatory substance is a culture condition suitable for growing one or more fungi selected from the MRE symbiotic bacteria group. It is preferable that it is obtained by cultivating under the condition that the obtained culture solution is starved and aerated.
  • the immune enhancement composition in such an immune enhancement composition, is used as an anti-inflammatory agent in a subject suffering from an allergic disease or an autoimmune disease. .
  • the allergic disease or autoimmune disease can be selected from the group consisting of temporomandibular arthritis, ulcerative colitis, atopic dermatitis, and allergic rhinitis.
  • the immunopotentiating composition in such an immunopotentiating composition, is used as an adjuvant of a vaccine against pathogenic bacteria or pathogenic viruses.
  • the pathogenic bacterium or the pathogenic virus can be selected from the group consisting of opportunistic bacteria, HIV, HCV, and HPV.
  • the immune enhancement composition is liver cancer, prostate cancer, colon cancer, rectal cancer, lung cancer, pancreatic cancer, gastric cancer, malignant lymphoma.
  • a medicine or animal medicine for treating or preventing a subject suffering from a disease selected from the group consisting of diabetes, high blood pressure, wound, ligament injury, fracture, low temperature burn, acne, flying mosquito disease, humiliation wound, urticaria It is what is used.
  • the immune enhancing composition in such an immune enhancing composition, is used as a food or feed.
  • a method for producing an immune enhancing composition that enhances immunity of a subject by stimulating innate immunity comprising Bacillus sp. (Bacillus sp.) (FERM BP-11209), Lysinibacillus fusiformis (FERM BP-11206), Bacillus sonorensis (Bacillus sonorensis), Ricinibacillus sp. (Lysinibacillus sp.) (FERM BP-11207), and Comamonas sp.
  • the decomposing step includes culturing the prepared one or more fungi under culture conditions suitable for growth, and obtaining the obtained culture. This is done by placing the liquid in a starved state and performing aeration.
  • a method for treating or preventing a mammal suffering from a disease related to innate immunity comprising Bacillus sp. (Bacillus sp.) (FERM BP-11209), Lysinibacillus fusiformis (FERM BP-11206), Bacillus sonorensis (Bacillus sonorensis), Ricinibacillus sp. (Lysinibacillus sp.) (FERM BP-11207), and Comamonas sp.
  • a therapeutically effective immunopotentiating composition having as an active ingredient an immunostimulatory substance produced by degrading one or more fungi selected from the MRE symbiotic fungus group
  • a method comprising the steps of providing an amount and administering to the mammal a therapeutically effective amount of the prepared immune enhancing composition.
  • the mammal in such a method, is a human.
  • the administering step is performed orally.
  • the administering step is performed parenterally.
  • the parenteral administration step is selected from intravascular administration, peri-tissue and intra-tissue injection, subcutaneous injection, ophthalmic administration, nasal administration, transdermal administration, and mucosal administration. It is preferable.
  • the disease associated with innate immunity is allergic disease or autoimmunity including temporomandibular arthritis, ulcerative colitis, atopic dermatitis, allergic rhinitis.
  • Disease opportunistic bacteria, pathogenic bacteria or pathogenic virus related diseases including HIV, HCV, and HPV, liver cancer, prostate cancer, colon cancer, rectal cancer, lung cancer, pancreatic cancer, gastric cancer, malignant lymphoma, diabetes, hypertension, It can be selected from the group consisting of wounds, ligament injuries, fractures, cold burns, acne, mosquitoes, humiliation wounds, urticaria.
  • FIG. 1 is a schematic diagram showing the process by which naive T cells differentiate into Th17, Th1, Th2, and Treg.
  • FIG. 2 is a graph of IL-21 production test using human blood. A comparison is made of IL-21 production concentrations when 5 persons A to E are unstimulated (Control) and a 6% dilution of MRE beverage is added.
  • FIG. 3 is a graph of an IFN- ⁇ production test using human blood. A comparison is made of the production concentration of IFN- ⁇ when AD is added to 4 persons (Control) and 6% dilution of MRE beverage.
  • FIG. 4 is a graph of a TNF- ⁇ production test using macrophages alone.
  • FIG. 5 is a graph of an IFN- ⁇ production test using human blood. A comparison is made of the production concentrations of IFN- ⁇ when AD is added to 4 people's unstimulated (Control) and a 6% dilution of MRE beverage.
  • an immune enhancing composition that effectively enhances immune functions including innate immunity activity using a low molecular weight immunostimulatory substance generated by cell degradation of MRE symbiotic bacteria. can do.
  • the MRE symbiotic bacteria group is Bacillus sp. (Bacillus sp.) (FERM BP-11209), Lysinibacillus fusiformis (FERM BP-11206), Bacillus sonorensis (Bacillus sonorensis), Ricinibacillus sp. (Lysinibacillus sp.) (FERM BP-11207), and Comamonas sp. (Comamonas sp.) (FERM BP-11208), both of which are aerobic bacteria.
  • the “small molecule” used in the present invention means a molecule having a molecular weight that can pass through the cell membrane and affect the inside of the cell.
  • a low molecular weight peptide is obtained by decomposing a MRE symbiotic bacterial group consisting of an aerobic Gram-positive bacterial group and an aerobic Gram-negative bacterial group with a lysosomal enzyme group or a lysosome-like enzyme group.
  • a low-molecular-weight immunostimulatory substance that can permeate into the cell membrane can be obtained, which is composed of a microbial degradation product including a sugar chain, a glycolipid, a low-molecular-weight nucleic acid degradation product, and the like.
  • this immunostimulatory substance can permeate the cell membrane, not only the TLR receptor group existing on the cell membrane surface, but also the internal TLR receptor group existing in the endosome and the food package, and the bacterial sensitive NLR existing deep in the cell Receptors and virus-sensitive RLR receptors are also reached, and deep steric ligand stimulation is given to innate immune response cells.
  • the immunostimulatory substance obtained by microbial decomposition of this MRE symbiotic fungus group is a substance having a hydrophilic molecular weight of 3,000 or less, and an oligopeptide or oligosaccharide chain containing an MDP-like substance and It is composed of components such as single-stranded RNA, and is a low-molecular-weight ligand component having no cytotoxicity that cannot be obtained by a general digestive enzyme such as a so-called protease. Therefore, the immune enhancing composition obtained from this MRE symbiotic fungus group can function as a ligand in vivo.
  • the “immunity enhancing composition” obtained from the MRE symbiotic bacteria group as described above may be referred to as “MRE complex ligand” for convenience.
  • MRE complex ligand both are consent or synonymous.
  • the “ligand” used in the present invention refers to a substance that activates a receptor by specifically binding to an immune receptor or the like, and the composite ligand refers to a mixture or a combination of a plurality of ligands. It shall be said. Moreover, acting as an adjuvant is also included in the “ligand”.
  • the MRE complex ligand (immunity enhancing composition, hereinafter the same) according to the present invention stimulates the innate immune receptor inside and outside the cell, macrophages, dendritic cells, Kupffer cells, microglia cells, Langerhans cells, natural killer cells, natural killer It is possible to activate immune cells of the innate immune system such as T cells and epithelial cells of mucous membranes and skin, fibroblasts, and perine cells present in the intestinal tract.
  • this activation produces type I interferon, and the release of this interferon simultaneously produces antibacterial and antiviral substances from neighboring cells.
  • T cells which are lymphocytes can be differentiated and activated into states of Th1 and TH17 that enhance antibacterial power, antiviral power, and anticancer power.
  • the MRE complex ligand according to the present invention can produce IL-21 having a function of suppressing autoimmunity from TH17 or the like.
  • the present invention can provide an immune enhancement composition having a novel low-molecular-weight immunostimulatory substance having antibacterial, antiviral, anticancer, anti-inflammatory effects and subsequent autoimmune suppression effects, thereby
  • the present invention solves the problems related to the present invention described above.
  • the present invention is a group of MRE symbiotic bacteria that produce an excellent immunostimulatory substance that exhibits a sufficient effect by cell decomposition without culturing at a high concentration as described above.
  • a novel symbiotic group of microorganisms is discovered, and an immune enhancing composition using the same is provided.
  • this MRE symbiotic bacteria group is comprised from five types of bacteria which consist of aerobic gram positive bacteria and aerobic gram negative bacteria. These fungi are not just a mixture of naturally occurring fungi, but have been cultivated for a long time with various soil fungi and fungi attached to marine products. It is a group of symbiotic fungi consisting of five distinctive fungi that have found their role sharing with each other, and have changed and appeared stably with the mutation or evolution of the fungus.
  • Bacillus sp. which is an aerobic Gram-positive bacterium.
  • Bacillus sp. (Accession number FERM BP-11209, Identification number MK-005), Lysinibacillus fusiformis (Accession number FERM BP-11206, Identification number MK-001), Bacillus sonorensis Baconis sulens cis number MK-004), Ricinibacillus sp. (Lysinibacillus sp.) (Accession Number FERM BP-11207, Identification Number MK-002), and the aerobic Gram-negative bacterium Comamonas sp. (Comomanas sp.) (Accession number FERM BP-11208, identification number MK-003).
  • deposit number FERM BP-11206 (transferred from deposit number FERM P-21548 deposited on March 19, 2008), deposit number FERM BP-11207 (deposit deposited on March 19, 2008) No. FERM P-21549), accession number FERM BP-11208 (transferred from deposit number FERM P-21550 deposited on March 19, 2008), accession number FERM BP-11209 (February 2, 2009) (Transferred from deposit number FERM P-21760 deposited on the day) is a bacterium deposited at the biological depository center of the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology.
  • the MRE symbiotic bacteria group according to the present invention can be grown under any conditions as long as they are in an environment in which they can grow.
  • the MRE symbiotic bacteria group can be cultured under conditions normally used in the field of molecular biology. It can grow. For example, as will be described later, in a culture aeration tank, while performing aeration (aeration), in addition to a nutrient source of 10 kg of fish meal, 10 kg of rice bran, 5 kg of oil residue, 1 kg of gravy, and further in the presence of minerals such as magnesium sulfate, The cells can be cultured at a pH of 6.0 to 6.8, a culture temperature of 25 ° C.
  • the nutrient source is 5 kg of fish meal, 5 kg of rice bran, 2.5 kg of oil residue, and 0.5 kg of gravy.
  • the culture conditions of the MRE symbiotic bacteria group according to the present invention are not limited to these setting conditions.
  • MRE symbiotic fungal group proceeds to the stage where gene exchange is activated, and Bacillus sp. It has been mutated and evolved to a mysterious cell that is close to cell fusion.
  • the 16S rDNA of each bacterium constituting the MRE symbiotic bacterium is as follows.
  • these MRE symbiotic bacteria can be cultured by the same method as known aerobic Bacillus bacteria. It is possible even in a culture plate of a general agar medium (Nutrient Aga) or in an aerated liquid container.
  • the first method is a method of obtaining a low-molecular complex ligand by decomposing an MRE symbiotic group with a lysosomal enzyme group.
  • the second method is a method of decomposing by a primitive lysosomal homologous mother cell thawing enzyme group that appears in the spor formation process of the MRE symbiotic bacteria group to obtain a low molecular complex ligand.
  • the reason for adopting these methods is that a normal digestive enzyme or a degrading enzyme such as an ordinary protease cannot obtain a ligand having a molecular weight necessary to permeate the cell membrane.
  • enzymes secreted by animal lysosomes, plant vacuoles and fruits have the ability to break down organelles and high-molecular substances in cells into low molecules in bulk.
  • the lysosomal enzymes are autophagy for decomposing and rejuvenating old organelles in cells, and enzymes that appear at the final stage of apoptosis of cancer cells and virus-infected cells, especially bacteria that have invaded cells. It is known to play an active role in decomposing within the endosome.
  • the homologous enzyme group is known to appear in the process of autophagy and apoptosis of animals, plants and microorganisms. In plants, it is called a processing enzyme, and it is also a group of enzymes that appear in the process of formation of no vacuoles or fruits. These enzyme groups break down the cells into small molecules that can penetrate the cell membrane.
  • the lysosomal enzyme group according to the present invention includes ribonuclease and deoxyribonuclease which are nucleolytic enzymes, cathepsin L which is a collagenase, cathepsin D and cathepsin E which are aspartic proteases, cathepsin K and cathepsin B which are cysteine proteases, In addition to cathepsin S, cathepsin G, which is a serine protease, cathepsin H, which is an aminopeptidase, and other proteolytic enzymes having powerful and multifunctional functions, in addition to arylsulfatase, ⁇ -glucurosidase, esterase, acid phosphatase, For chain degrading enzymes, ⁇ -galactosidase, ⁇ -hexosaminidase A and B, allylsulfatase A, galactositol ceramidase, glucosyl
  • lysosomal enzymes are weakly acidic (PH 6.3 to PH 6.8) and have the property of increasing the activity in a high temperature region (38 ° C. to 42 ° C.) where the activity of normal digestive enzymes is suppressed. Further, many of them have a very high decomposing power, and there are those having a decomposing power 5,000 times to 10,000 times that of a normal digestive enzyme.
  • the first method for obtaining an MRE complex ligand from the MRE symbiotic fungal group according to the present invention is a method using a combination of cell wall degrading enzymes, cathepsins and nucleolytic enzymes from these lysosomal enzyme groups.
  • Muratase, mucopeptide hydrolase and the like are used as cell wall degrading enzymes
  • cathepsin B, cathepsin D, cathepsin L and cathepsin K or hapain are used as cathepsins
  • ribonuclease and deoxyribonuclease are used as nucleases.
  • the These enzymes can be made by gene integration into DNA or plasmids, but they can cause fish (including eels) to self-decompose in a sterile, high-temperature (38-45 ° C), humid environment. Can also be obtained. It can also be obtained by using a group of lysosomal enzymes produced when a fruit such as hapain is ripened.
  • this first method has the advantage that the cell degradation can be adjusted by changing the blend ratio of various enzymes, but at the present time, the enzymes are expensive and difficult to handle, requiring special equipment. Some of them have the disadvantage of high costs.
  • the second method for obtaining a low-molecular complex ligand from the MRE symbiotic fungus group is a method in which a primitive mother cell lytic enzyme released during the formation of spores is used as it is. Although the ratio of the enzyme formulation cannot be changed, mass production at an extremely low cost is possible and an excellent ligand can be obtained.
  • This method is a method for obtaining a low-molecular-weight complex ligand by utilizing a mother cell lytic enzyme group, which is released along with the spore of the MRE symbiotic bacteria group, for cell decomposition.
  • the “maternal cell lytic enzyme group” or “mother cell lytic enzyme” used in the present invention refers to a lysosomal homologous enzyme group produced in the process of forming spores of fungal cells.
  • the MRE symbiotic bacteria group is added to the mixed culture solution, and fish meal, rice bran, oil residue, gravy, etc. and minerals such as magnesium sulfate are added to the nutrients of the fungus.
  • a culture medium culture is performed at a culture pH of 6.0 to 6.8 at a culture temperature of 25 ° C. to 35 ° C. under culture conditions with sufficient aeration (aeration: dissolved oxygen concentration of 0.1 mg / L to 1.0 mg / L). .
  • a digestive enzyme group secreted from the vegetative cell is constructed by constructing a symbiotic relationship between the bacterium and a stable symbiotic vegetative cell state. It is separated into another aeration culture tank together with this culture solution. Continue aeration without giving any nutrients other than silica in this aerated culture tank. Autophagosome homologous mother cell lysis of the symbiotic MRE bacteria group begins, and the lysosomal homologous mother cell thawing enzyme group is released, and the fungal mother cells are decomposed in bulk and disappear.
  • the spores start to precipitate all at once, and a transparent supernatant is obtained.
  • the supernatant thus obtained is filtered under pressure with a 0.2 ⁇ m membrane to remove residual spores, and then fine pores and impurities are further removed with a 0.02 ⁇ m filter.
  • an effective low molecular weight MRE complex ligand can be obtained by utilizing the mother cell thawing enzyme group during the formation of spores of the MRE symbiotic cell group. Also, continuous production is possible by devising the separation process.
  • MRE complex ligand in the MRE symbiotic fungus, a sufficiently effective MRE complex ligand can be obtained without producing a high concentration, but a high concentration production is also possible. In that case, repeated vegetative cell formation and sporing will cause vegetative cells to absorb complex ligands, resulting in poor efficiency and increased antibiotic production. It is. It has already been known that it is more efficient to give silica nourishment during sporation.
  • the low molecular weight complex ligand thus obtained includes oligopeptides having the following molecular weight distribution, single-stranded RNA low molecular weight degradation products, oligosaccharide chains and glycolipids, MDP (muramyl dipeptide) analogues, and Flangelin degradation products are included.
  • the molecular weight distribution of the MRE complex ligand is shown in Table 2 below.
  • the MRE complex ligand of the present invention is less than 1000 hydrophilic low molecular weight substances including oligopeptides, oligosaccharide chains, oligo-level nucleic acids, as well as glycopeptides and glycolipids in the oligo region. It is configured.
  • the small complex ligand thus obtained has no toxicity like endotoxin, and since it is a small molecule, it is not directly attacked by the antibody.
  • the endotoxin test that can detect the presence of LPS and peptidoglycan has shown that the MRE complex ligand does not contain LPS and peptidoglycan, as a result of being below the detection limit.
  • the MRE complex ligand does not contain LPS and peptidoglycan, as a result of being below the detection limit.
  • a ligand with extremely low toxicity can be obtained by lowering the molecular weight in this way, there is an important advantage that it can be absorbed as a beverage because it can be absorbed from the intestinal tract and the mucous membrane. Since it is hydrophilic and has a molecular weight of an oligo region, it can theoretically be absorbed from the skin.
  • human blood immune cell groups (macrophages, dendritic cells, Langerhans cells, NK cells, NKT cells, T cell groups, B cell groups, etc.) are isolated and antibodies are produced for the amount of each cytokine produced by the MRE complex ligand. I investigated using.
  • the MRE complex ligand-containing stock solution used contains 80 ⁇ g / ml of the MRE complex ligand-containing low molecular weight component.
  • the production amount of TNF- ⁇ was measured by real-time PCR, and as shown in Table 3, the result was 90.46 times the normal production.
  • Med means no stimulation.
  • LPSp is endotoxin when stimulated.
  • MRE 1/10 is a 10-fold diluted MRE complex ligand-containing stock solution, which is subsequently diluted 100-fold and 1000-fold.
  • concentration of LPSp for comparison is 100 ng / ml.
  • the amount of TNF- ⁇ produced reached 90.46 times that of normal by stimulation with a 10-fold dilution of the MRE complex ligand-containing stock solution, and 7.5 times as much as that of the comparative LSPs. ing. This indicates that the MRE complex ligand has high macrophage activity (see FIG. 4).
  • TNF- ⁇ is highly productive, it does not mean that it promotes inflammation. This number only indicates a high ability to activate macrophages.
  • the MRE complex ligand can normalize the living body by activating innate immune activity and subsequent immune processes such as antiviral, antibacterial, anti-inflammatory and tissue repair. In other words, it is an innovative ligand or adjuvant.
  • TLR Innate Immune Receptors
  • NLR innate immunity receptors
  • TLR-7 innate immunity receptors
  • TLR-8 NLR-2
  • TLR-2 is a receptor for innate immunity existing on the cell surface, and senses peptidoglycan, riboteichoic acid, riboprotein, viral glycoprotein, fungal polysaccharide, etc. of Gram-positive bacteria.
  • an MDP-like peptidoglycan degradation product having a molecular weight of 1000 or less acts.
  • TLR-7 and TLR-8 are both receptors that exist in the endosomes of cells and sense single-stranded RNA, as well as receptors that sense low molecular weight substances that have been broken down by fungi and viruses. is there.
  • the MRE small molecule complex ligand of the present invention seems to detect single-stranded RNA having a molecular weight of 1000 or less. This fact means that the present invention can be expected to have a high adjuvant effect on RNA viruses.
  • NLRs including NLR-2 are primitive receptors existing inside cells, and can detect bacteria and viruses that have been decomposed by low molecules.
  • NLR-2 is a receptor specifically expressed in APC (antigen presenting cells) such as macrophages, dendritic cells, Langerhans cells, and Kupffer cells.
  • APC antigen presenting cells
  • MRE small molecule complex ligand
  • the MRE small molecule complex ligand of the present invention is three-dimensionally sensed by a receptor present on the cell surface, a receptor present on the endosome, a receptor present in the cell and three innate immunity sensors. I understand that.
  • MRE complex ligands confirmed macrophage activity and natural killer cell activity, which are the main role of innate immunity in animals, and IL-8 production from macrophages that induces neutrophil migration.
  • Neutrophils are one of innate immune phagocytes.
  • the NO production ability is 0.446 ⁇ M in the non-stimulated culture solution, whereas the NO production ability is obtained in the 10-fold dilution of the stock solution containing the MRE complex ligand. 24.059 ⁇ M, which is larger than 18.712 ⁇ M with a 0.1 ng / ml solution of LPSp.
  • the number of viable cells decreases as the concentration increases in LPS, whereas the number of viable cells increases as the concentration increases in the MRE complex ligand. This is an excellent point as an MRE complex ligand, which means that it is advantageous because it enhances immunity while increasing the survival rate of immune cells when used as an adjuvant.
  • the plate adhesion rate of macrophages was stained with crystal violet, and the absorbance at 570 nm was used as an indicator of the number of viable cells.
  • natural killer cells also obtained an average of 1.73 times (56.2 / Very High) in the NK activation test of the MRE complex ligand-containing stock solution using human blood.
  • “Process to apoptosis” is a series of apoptosis in which FADD is triggered by apoptosis and caspase 8 enzyme and caspase 10 enzyme are activated to induce a group of apoptotic degradation enzymes such as cathepsin D and cathepsin B which are execution unit enzymes. It is a process that causes
  • the expression of AP1 of the gene group that induces apoptosis is at a normal level, JUN (normally 6.77409 times) that suppresses apoptosis is expressed, and cytochrome C that causes apoptosis is expressed from mitochondria. It was confirmed that the gene SOD2 (a normal 8.9963 times) that protects against release was also expressed to prevent apoptosis.
  • Antiviral substance production process is one of the processes of innate immunity, and TRAM and TRIF are expressed by stimulating TLR3, TLR7, TLR8 and RGR. Followinged by a series of process activities such as IKK activity, IRAK3, IRAK7 activity, etc. As a result, type I INF- ⁇ (now known in 13 types) and INF- ⁇ Is produced and released extracellularly. This process is thought to be a mechanism created in the single-cell era, but in humans and the like, the release of these interferons causes ISG, an antiviral substance, from nearby cells such as epithelial cells and mucosal cells (known in hundreds). Are released all at once.
  • This process is also a natural role of innate immunity, and it is known that the combination of ISG, which is an antiviral substance produced depending on the stimulation pattern, varies.
  • antiviral substances such as IFIT1, G1P3, G1P2, OAS1, M1X1, IFIH1, IFIT3, RIG-I, GBP1, LAMP3, IRF7, ISGF3G, WARS, PSMBS, BTC, SOCS1, and SERPING1 are released. It has an antiviral effect to cope with the mutation.
  • MRE complex ligands prior activation of this process allows for the powerful production of type I interferons immediately upon infection with viruses such as influenza, effectively enhancing antiviral power. In other words, the adjuvant effect is extremely high.
  • Table 6 shows how much the expression of the type I interferon gene is increased by the MRE complex ligand in the absence of viral infection using comprehensive DNA dynamics analysis.
  • the amount of INF- ⁇ produced is further increased in the measurement of type I interferon production by the MRE complex ligand using fresh human blood collected (see FIG. 3).
  • the MRE complex ligand has an effect without side effects even as an adjuvant for an antivirus.
  • dendritic cells that are macrophage siblings, microglial cells, Kupffer cells, Langerhans cells, fibrotic cells, epithelial cells and keratinocytes that express the same innate immune receptors, trachea, digestive tract, and ureter.
  • the activation of innate immune response cells placed in each organ including the same also occurs.
  • E. Inflammation initiation and delayed inflammation suppression process antibacterial, anticancer, inflammatory repair process This process is from the stimulation of innate immune receptors to the production of interleukins that activate T cells. It consists of a process.
  • I- ⁇ B is separated from NF- ⁇ B through activation of MYD88, IRAK1, IRAK4, TRAF6, and the like, and NF- ⁇ B is activated by TLR receptor stimulation.
  • the NLR receptor stimulated by the ligand is paired, and RICK is bound through the NLR CARD. Then, ubiquitination occurs in RICK, and a complex such as TAK1 or MEMO further binds, activates IKK ⁇ , separates I- ⁇ B from NF- ⁇ B, and activates NF- ⁇ B.
  • activated NF- ⁇ B works by binding to DNA together with AP-1 to produce chemokines including IL-1 ⁇ , TNF- ⁇ , and IL-8. Then, at the end of the first stage, the process shifts to the second stage by producing I ⁇ B- ⁇ which is the trigger (trigger) of the second stage.
  • I ⁇ B- ⁇ is added to NF- ⁇ B and AP-1 acting on DNA to produce IL-12p40, IL-6, and others, thereby controlling the immunity of the T lymphocyte system.
  • Table 8 shows the results of gene expression in the first stage process by comprehensive DNA dynamic analysis when stimulated with MRE complex ligand using human macrophages. This result was consistent with the result of real-time PCR analysis.
  • the first-stage activation process by MRE complex ligand captures the moment when chemokines including IL-1 ⁇ , TNF- ⁇ , and IL-8 are actively produced and is delayed in the inflammatory process. This represents a situation in which the gene expression of NF- ⁇ B has decreased due to the increased momentum of the activation of the inflammation-suppressing gene group that suppresses the NF- ⁇ B action that begins.
  • JUN and SOD2 are expressed in order to block the apoptosis induction of their cells by TNA- ⁇ , etc., and SOCS3 prevents excessive progression of inflammation by receiving stimulation more than necessary from innate immune receptors. .
  • PDLIM2 which has the function of ubiquitinating excess NF- ⁇ B and decomposing it with proteasome, does not need to operate, and was a normal value of 1.0721337.
  • Delayed type inflammation suppression The delayed type inflammation suppression gene group which delays to a 1st stage and suppresses inflammation expresses. These genes suppress the functions of NF- ⁇ B and AP-1. That is, it was revealed by this MRE complex ligand analysis that the inflammation suppression process progresses behind the inflammatory process.
  • TNFAIP6 is a gene that strongly suppresses NF- ⁇ B, has a strong anti-inflammatory effect that controls TNF- ⁇ production, and is expressed at a value as high as 37.0424 times.
  • TNFAIP3 is also a gene that suppresses the expression of NF- ⁇ B and AP-1, which is also 18.8308 times higher.
  • JUN, SOD2, and SOCS3 are working.
  • the second stage process is triggered by I- ⁇ B- ⁇ . Since a large number of NF- ⁇ B and AP-1 have already worked by binding to nucleic acids, the delayed inflammation inhibitory gene group is activated and the new supply of NF- ⁇ B and AP-1 is reduced.
  • cytokines that bind to NF- ⁇ B already bound to nucleic acid and control T cells together with AP-1 already bound to nucleic acid triggered by newly created I ⁇ B- ⁇ Is produced and secreted.
  • cytokines such as “IL-12p40”, “IL-6 and IL-23p19” are produced in M1 activity, and “IL-4”, “TGF- ⁇ and IL-2” are produced in M2 activity.
  • IL-12p40 becomes IL-12
  • IL-23p19 becomes IL-23 by binding to p35 that is always produced in the cell.
  • Table 10 shows gene expression at the start of the second stage by MRE complex ligand stimulation.
  • the I- ⁇ B- ⁇ trigger increased rapidly to 20.115 times the normal level, and the production of NF- ⁇ B and AP-1 decreased due to enhanced expression of inflammation-inhibiting genes. is there.
  • IL-6, IL-23p19 and IL-12p40 are expressed by the rapid increase in the expression of I ⁇ B- ⁇ . Production has started, and it has risen to 1.4 to 1.8 times the normal value. As can be seen from this, the MRE complex ligand clearly expresses M1 activity. This is supported by the fact that IL-23 production from human blood using the MRE complex ligand is 2.11 times the normal value, which will be described later.
  • the MRE complex ligand induces macrophages and their siblings microglia, dendritic cells, Langerhans cells, Kupffer cells, etc. to M1 activity and exerts antibacterial and antiviral effects. It also activates phagocytic activity on the remains of apoptotic cancer cells.
  • M1 activity of macrophages is switched to M2 activity using low molecular weight degradation products of bacteria and viruses as signals. It is considered.
  • M2 activity is a post-treatment process that suppresses inflammation and activates fibroblasts to repair tissues destroyed by inflammation and the like. The examples suggest that the MRE complex ligand plays an important role in this M2.
  • the MRE complex ligand is resistant to inflammatory diseases including allergic diseases and autoimmune diseases, apart from the M1 activity process that develops antibacterial, antiviral, or anticancer effects. It has become clear that it has an excellent property of simultaneously proceeding with inflammatory processes.
  • T cells Differentiation of T cells by MRE complex ligand and subsequent process activity As shown in FIG. 1, four groups of cytokines released from activated macrophages and their siblings are T17, Treg, Th1, and Th2. Control 4 states.
  • Macrophage M1 activity induces Th17 and Th1, and macrophage M2 activity induces Treg or Th2.
  • the MRE complex ligand according to the present invention has been found to have a property of inducing Th17 and Treg and suppressing the induction of Th1 and Th2.
  • IL-12p40 and IL-23p19 in a group of cytokines produced through a series of processes by innate immune receptor stimulation bind to p35 resident in the cells, and IL-12 and IL- 23.
  • IL-12 differentiates and activates naive T cells (CD4) into Th1.
  • IL-6 differentiates naive T cells (CD4) into Th17, and IL-23 and IL-1 ⁇ activate Th17.
  • IL-4 differentiates and activates naive T cells (CD4) into Th2.
  • TGF- ⁇ differentiates naive T cells (CD4) into Tregs and IL-2 activates Tregs.
  • Th1 and Th17 processes following the M1 activity have antibacterial, antiviral, anticancer, and allergic effects, and the Th2 following the M2 activity leads to an allergic reaction process. It has the role of repair and autoimmune suppression (immune tolerance).
  • Th1 produces INF ⁇ by the action of IL-12. Activates phagocytosis and migration of macrophages, natural killer cells, and natural killer T cells. Produces free radicals such as NO and enhances intracellular bactericidal power.
  • CTL killer T cell
  • a process of eliminating bacteria and viruses parasitic in the cells is induced. It is mainly an antibacterial and antiviral process independent of antibodies. It is also a process that causes cell-killing autoimmune diseases and delayed allergies.
  • Th2 produces IL-4 and IL-13, and releases IgE antibody from B cells via CD4-T cells.
  • IgE works to eliminate large organisms such as parasites by secreting histamine from mast cells and basophils. It is also known to induce delayed allergic diseases such as nasal congestion by producing IL-5 to release EPO from eosinophils.
  • Th17 produces IL-17A, IL-17F, IL-22, IL-21 and the like by the action of IL-1 and IL-23.
  • it enhances the phagocytosis of neutrophils, releases antibacterial substances such as defensin mainly from epithelial cells and neutrophils, and strengthens the epithelial barrier through the reconstruction of the extracellular matrix.
  • production of IL-21 has been confirmed, and a new process has been elucidated (see Non-Patent Document 3).
  • Treg characterizes intestinal immunity and is considered to be a process induced by TGF- ⁇ to produce IL-10 and induce inflammation suppression and immune tolerance.
  • the intestinal tract with a large number of enteric bacteria is usually kept in a Treg state so that lymphocyte immunity does not run away, and its defense is left to the natural immunity of epithelial cells and percellen cells of the mucosa and secreted through the Bayer plate.
  • IgA a sex antibody, is secreted into the intestinal tract to control enteric bacteria.
  • Treg is also known to suppress inflammation by apoptosis or suppression of B cells secreting Th1 and IgE causing allergy and CTL (killer T cells) causing autoimmune diseases.
  • MRE complex ligand In the MRE complex ligand, IL-23p19 and IL-12p40 increased, IL-4 did not change, and TGF- ⁇ rather decreased, as shown in the results of the previous table, following the process of M1 activity of macrophages. Therefore, Th17 and Th1 were activated, and Th2 and Treg were not activated. In addition, since the MRE complex ligand suppresses inflammation such as ulcerative colitis and Crohn's disease, it is considered that the Treg normalization process by the MRE complex ligand in the actual intestinal tract also contributes to inflammation suppression and immune tolerance. It is done.
  • Table 11 shows the results of measuring the amount of IL-23 produced by stimulating the collected human blood with MRE complex ligand under controlled conditions.
  • the amount of IL-23 produced by the MRE complex ligand-containing solution increased by an average of 1.92 times the average, and the interesting fact is that the older the age, the higher the value of IL-23. Accordingly, the MRE complex ligand increases M1 activity of macrophages and the like, and subsequently activates Th17 and Th1, thereby enhancing cellular immunity and humoral immunity and exerting antibacterial, antiviral, and anticancer effects. This is consistent with clinical trials including those shown in the examples.
  • MRE complex ligands activate genes of inflammatory cytokines such as IL-1 ⁇ , TNF- ⁇ , IL-8 very strongly, and also activate Th17 and Th1 processes Nevertheless, a contradiction has arisen between the data of molecular physiology and clinical observations that why beverages containing MRE complex ligands can significantly improve jaw inflammation, ulcerative colitis, inflammation of atopy, etc.
  • the inventors made extensive studies focusing on the comprehensive DNA dynamics analysis of macrophages using DNA arrays and the time series transition of cytokine production using human blood. As a result, it was confirmed that the MRE complex ligand expresses a new immune process not found in conventional ligands such as LPS. The first point is the inhibitory action of IL-18 production by the MRE complex ligand. According to the DNA dynamic analysis this time, it was found that the MRE complex ligand suppressed IL-18 production as shown in Table 12. This was a remarkable discovery.
  • IL-18 is a cytokine that is deeply involved in inflammatory diseases, and caspase 1 is produced by stimulation of M1 ligands such as conventional LPS, and this caspase 1 cleaves the precursor of IL-18 to produce IL-18 To do.
  • IL-18 acts on Th1 cells and NK cells in the presence of IL-12 to strongly induce INF- ⁇ production. This is because IL-12 increases IL-18 receptor in Th1 cells and NK cells.
  • INF- ⁇ produced by Th1 cells promotes the production of IL-12 and IL-18 from macrophages, which further stimulates Th1 cells to form a cycle that continuously expands inflammation. Become.
  • both IL-12 and IL-18 are elevated.
  • IL-18 As a characteristic of IL-18, it is known that severe production of organ damage and autoimmune diseases occur in the intestine and liver when IL-12, IL-23 and IL-18 are overproduced simultaneously. Conversely, in the presence of IL-2 and IL-18, production of IL-4 and IL-13 is promoted and IgE production occurs due to activation of the Th2 process, and histamine is released from mast cells and basophils. . Subsequently, when IL-5 is produced, EPO is released from eosinophils, which causes inflammatory diseases such as nasal congestion.
  • IL-13 is also known as a cytokine that induces bronchial asthma and pulmonary fibrosis (see Non-Patent Document 4).
  • Non-patent Document 6 Atopic dermatitis due to Staphylococcus aureus is considered to be aggravated by a similar mechanism.
  • IL-18 is considered to switch Th1 cells, Th2 cells, Th17 cells and the like as a trigger to two states of inflammation and non-inflammation.
  • Th1 cells cause autoimmune diseases and Th2 cells cause allergic diseases.
  • the anti-inflammatory activation process accompanied by a decrease in IL-18 enhances cellular immunity such as intracellular antibacterial action, antiviral action, and anticancer action.
  • Th2 cells produce IL-4, IL-13, etc. in the presence of IL-18 to induce allergic diseases.
  • IL-18 is low, secretory immune processes are activated so that IgA is secreted from the intestinal tract or mammary gland.
  • the trigger of IL-18 also appears in Treg cells, causing allergic symptoms by directly stimulating mast cells and eosinophils without IgE.
  • Th17 can also be considered to be branched into a pro-inflammatory process and an anti-inflammatory process using IL-18 as a trigger.
  • IL-18 an increase in IL-18 induces inflammatory IL-17A and IL-22 and activates the process of humoral immunity.
  • excessive production of IL-17A causes inflammation and causes autoimmune diseases such as chronic arthritis, multiple sclerosis, ulcerative colitis, Crohn's disease, and psoriasis.
  • IL-22 is closely related to psoriasis and overproduces hNP-3, which is an ⁇ -defensin.
  • IL-17F and IL-21 which suppress inflammation, are induced, and IL-17F activates humoral immune processes that enhance antibacterial and antiviral power, such as activating antibody production and defensin secretion .
  • IL-17 is known to promote production of ⁇ -defensins such as HNP1-2 and HNP4-6 from neutrophils and ⁇ -defensins of hBD1-4 from epithelial cells (see Non-Patent Document 7). ).
  • MRE complex ligand is expected to suppress inflammation including allergies and autoimmune diseases by suppressing the production of IL-18 that causes inflammation, and is consistent with the results of clinical trials for inflammatory diseases. Yes.
  • IL-21 was increased almost twice as much as usual by the MRE complex ligand in a cytokine test measured by collecting human blood (see FIG. 2).
  • Clinically it has been confirmed by chance that IL-21 in the blood of a non-Hodgkin-type lymphoma patient (62-year-old woman) taking MRE complex ligand is significantly elevated. It was also confirmed that the patient's metastatic cancer was eradicating and that the original lymphoma was also shrinking.
  • IL-21 is a cytokine that enhances the anticancer effect by secreting antiviral substances and proliferating natural killer cells (see Patent Document 4 and Patent Document 5; see Examples 8 to 13). It has been reported that it also has a function of causing apoptosis of T cells and B cells that cause ATP (see Patent Document 3).
  • IL-21 there is a process in which IL-12 is released from macrophage M1 cells, and IL-12 acts directly on NKT cells (natural, killer T cells) to induce IL-21 production. Is known (see Patent Document 2).
  • IL-21 increases as IL-23 increases, and IL-21 may increase in human blood that does not produce IL-12 or IFN- ⁇ . Rather, it was speculated that processes other than the IL-12 to NKT cell activation route mainly worked (see FIGS. 2 and 5). Moreover, in the example of the above-mentioned Patent Document 2, it is used that a single ligand having a large molecular weight acts on a TLR receptor, and the present invention uses a complex low molecular ligand to innate immunity such as NLR inside a cell. It was implied that the principle was completely different from the method of three-dimensional stimulation including receptors.
  • Non-patent Document 3 IL-21 production is induced from Th17 by Th17 activity
  • Non-Patent Document 8 IL-21 promotes differentiation of Th17 cells
  • IL-1 and IL IL-1 and IL
  • the MRE complex ligand mainly produces IL-21 by the non-inflammatory activity of Th17 and also uses the route of IL-21 production by NKT cell activity through IL-12 in an auxiliary manner. Can do. Moreover, vertebrates including actual humans are always stimulated by ligands other than the MRE complex ligand, and the two IL-21 production routes are always changed. In that case, the MRE complex ligand has a strong personality as an adjuvant, and exhibits an excellent effect as the adjuvant.
  • the cathepsin E gene that appears when macrophages suppress inflammation was also expressed 1.2 times as usual.
  • the MRE complex ligand has a surprising function of calming inflammation while maintaining activity in antibacterial, antiviral, and anticancer immune processes.
  • FGF2 one of the cytokines that promotes tissue repair, is expressed 2.525 times as usual, and has the ability to recover tissue damage early, which is also consistent with clinical trials.
  • the MRE complex ligand of the present invention three-dimensionally innate and non-cellular innate immune receptors including macrophages, microglia, dendritic cells, Langerhans cells, Kupffer cells, epithelial cells, keratinoids, and fibrotic cells. When activated, it secretes antibacterial and antiviral substances such as defensin and ISG, and also activates NK cells and NKT cells to cause apoptosis of cancer cells and virus resident cells.
  • the NF- ⁇ B process is activated in two stages to secrete chemokines including IL-1 ⁇ , TNF- ⁇ , and IL-8, and at the same time produce multiple anti-inflammatory substances and mitochondrial SOD to produce TNF- ⁇ , etc. Prevent cell damage. Furthermore, it produces cytokines of T lymphocytes such as IL-6, IL-12 and IL-23, and differentiates and activates naive T cells into Th17 cells and Th1 cells. MRE complex ligands also suppress IL-18, which triggers various inflammatory diseases, and switch Th17 and Th1 activities to induce non-inflammatory processes. Th17 produces IL-21 and IL-17F by this switching.
  • IL-17F activates the humoral immunity process without inflammation to increase antibody production, and also directly secretes innate immunity antibacterial substances, such as defensin and antiviral substances, and has antibacterial and antiviral effects. Demonstrate. Furthermore, the release of IL-12 causes IL-21 to be produced from NKT cells without the production of IFN- ⁇ . These IL-21 directly increases the activity of NK cells and exerts an anticancer effect, and also suppresses autoimmunity by causing apoptosis of T cells and B cells that cause autoimmune diseases.
  • Macrophage activity also activates phagocytosis and promotes removal of waste and foreign substances in blood, lymph and tissue fluids.
  • the characteristic of the ligand which suppresses inflammation of the present invention enables use as an excellent adjuvant having the property of reducing inflammatory side effects of various vaccines.
  • antiviral and antibacterial vaccines such as influenza, vaccine, and plague vaccine, new generation LPS, peptidoglycan, lipoarabinomannan, zymosan, lipopeptide, lipoteico Acid, RSV F protein, fibronectin EDA domain, HSP60, flagellin, unmethylated CpG DNA, double stranded RNA, polyinosin polycytidic acid, imidazoquinoline compound, ⁇ -glucan, Maruyama vaccine, Mycobacterium bovis, and Also included are vaccines of bacterial components comprising a TLR ligand such as OK-432 and a virus associated therewith.
  • MRE complex ligands can be used by blending with other immune ligands and immune adjuvants.
  • it has good compatibility with sugar chain-based immunologically active components, and those containing sugar chain components such as Ganoderma, Cordyceps sinensis, birch, chitin chitosan, himematsutake, etc. are decomposed to a molecular weight of 8000 or less to form MRE complex ligands.
  • an increase in macrophage activity (survival number and NO production) of 49% to 60% was observed. This indicates that the MRE complex ligand can function as an excellent adjuvant.
  • Apoptosis is also extremely effective in combination with substances such as red cedar, resveratrol, and quercetin that revive cancer apoptosis.
  • Real-time PCR was performed under the following conditions. 1. Cells used in the test solution were cultured in RPMI 1640 medium with the addition of antibiotic kanamycin sulfate to fetal bovine serum and ampicillin sodium obtained by deactivating THP-1 cells derived from human peripheral blood monocytes (ECACC No 88081201), The cell concentration was adjusted to 2 ⁇ E6 cells / ml. 2. For cell stimulation, add 1.5 ml each of cell suspension to each well of a 6-well plate as a test solution, determine the negative control and positive control wells, and add the adjusted stimulation sample to the positive control well After shaking well, the mixture was transferred to a 5% carbon dioxide incubator at 37 ° C. and cultured for 3 hours. 3.
  • the MRE complex ligand of the present invention activates the process of innate immunity and subsequent acquired immunity of the lymphocyte system, and has a function of suppressing tissue inflammation and enhancing tissue repair ability. Therefore, the MRE complex ligand of the present invention has an antibacterial action, an anticancer action, an antiviral action, an anti-inflammatory action, a tissue repair action, and a waste removal action.
  • the TNF- ⁇ production test by real-time PCR revealed that the MRE complex ligand of the present invention is 7.54 times more stimulating than LPS (endotoxin), which has strong innate immune activity. It was. At the same time, the appearance of numerous anti-inflammatory components and the production of mitochondrial SOD revealed that TNA ⁇ does not increase and does not cause cell damage in blood. It was also confirmed that the MRE complex ligand has an excellent characteristic that it is not cytotoxic like LPS. In LPS, the number of surviving macrophages decreased with increasing concentration, whereas the number of surviving macrophages increased with increasing MRE complex ligand concentration.
  • the MRE complex ligand of the present invention is an oligo-level small molecule ligand having a low polarity and almost no charge. Therefore, the MRE complex ligand can easily pass through the cell wall, and not only the TRL receptor expressed on the cell surface but also the cell NLR receptors and RLR receptors expressed in the endosomes and present in the cytoplasm can also be stimulated and activated sterically and complexly.
  • Such a low-molecular-weight ligand can be easily absorbed from the intestinal wall, and since it is not attacked by antibodies, it can be used for intravenous injection after purifying the active ingredient. This property provides an excellent property and synergistic effect that other ligands do not have, as well as the ability to protect cells and increase cell survival at increasing concentrations.
  • Macrophage activity Tables 13 and 14 are obtained by diluting the MRE complex ligand-containing stock solution prepared in [Example 1], allowing it to act on human macrophages, and measuring the NO production amount and the number of viable cells of macrophages. is there.
  • the NO production of the MRE complex ligand-containing stock solution shows a larger value than the NO production of LPS, and in particular, the NO production is 2.19 times higher at 300-fold dilution.
  • the MRE complex ligand-containing stock solution although the NO value increased, the macrophage viable cell index of the MRE complex ligand-containing stock solution increased, and the LPS showed a tendency opposite to the decrease. Yes. Although no numerical value is shown here, it is added that cell damage did not occur even when the concentration of the MRE complex ligand-containing stock solution was increased to the osmotic pressure limit. That is, the MRE complex ligand can be said to be an immunoactive agent having a macrophage activity effect that does not cause cell damage but rather increases the survival rate of macrophages.
  • the MRE complex ligand-containing stock solution has no direct bactericidal action. Therefore, it can be said that the MRE complex ligand-containing stock solution does not contain any bactericidal substances including antibiotics, and that all antibacterial effects seen in clinical trials are due to immunity.
  • the antibacterial effect of the MRE complex ligand according to the present invention can be summarized as follows. That is, the first is an antibacterial effect by enhancing the phagocytosis of macrophages, and the second is an antibacterial effect by releasing antibacterial substances including defensins from macrophages, epithelial cells, keratinoids and the like. Specifically, it was confirmed that PTX3, which is an antibacterial substance, was released from macrophages by 7.27 times the usual amount.
  • the third is an antibacterial effect by enhancing the phagocytic activity of neutrophils via Th17 activity, and the phagocytized bacteria are sterilized by HNP1 to 6 which are ⁇ -defensins present in azurophilic granules of neutrophils. Is done. ⁇ -defensins are used exclusively inside neutrophils because they cause cell damage such as hemolysis.
  • hBD1 to 4 as ⁇ -defensins are secreted from epithelial cells and keratinoids by the action of IL-17F produced from Th17 cells.
  • Inflammatory IL-22 secretes hBD3 from keratinoids for antibacterial activity, but in psoriasis, IL-22 and hBD3 are oversecreted. Since the MRE complex ligand has no effect of suppressing IL-22, psoriasis cannot be cured and is consistent with clinical trials.
  • the fifth point is that the CD4 humoral immunity process is activated through the activation of Th17, and IgG is secreted from B cells and IgA is secreted from mucosal epithelial cells, thereby providing an antibacterial effect.
  • IL-23 and IL-1 activate Th17, and when activated with an MRE complex ligand-containing stock solution, IL-1B is 47.64 times as normal and IL-1A is 6.30 times as normal.
  • IL-23A is 1.78 times the normal gene expression (in increasing value). In the production test of IL-23 using selected human blood, 1.92 times the normal secretion was confirmed on average (see Table 11).
  • the antiviral process using MRE complex ligand includes the following processes.
  • the first is a process in which TLR3, TLR7, TLR9, RIG1, and MAD5, which are innate immune receptors, are stimulated by an MRE complex ligand or the like to directly release INF- ⁇ , INF- ⁇ , and the like.
  • INF- ⁇ is mainly released from macrophages, microglia, etc.
  • INF- ⁇ is mainly released from epithelial cells, fibroblasts, keratinoids, osteoblasts, and the like.
  • These INF- ⁇ and INF- ⁇ are detected by neighboring cells having the INF receptor, and simultaneously release antiviral substances such as ISG to exert an antiviral effect.
  • macrophage interferon gene expression was as shown in Table 15.
  • IFN- ⁇ is an interferon that activates NK cells and functions to increase the ability to attack virus-infected cells.
  • IFN- ⁇ is actually produced on average 2.89 times as much as normal.
  • MRE complex ligands activate non-inflammatory Th17 processes and produce IL-21.
  • This IL-21 activates NK cells and promotes the production of type I IFN from epithelial cells, fibroblasts, keratinocytes, macrophages, etc.
  • IFN- ⁇ and IFN- ⁇ induce antiviral substances from more cells. It works to release.
  • the MRE complex ligand serves as an adjuvant that produces IL-17F from Th17 and activates the process of humoral immunity, and plays a role in enhancing antibody production against viruses when there is actually a viral infection .
  • the fourth is the elimination of virus-infected cells by natural killer cells (NK), natural killer T cells (NKT), and cytotoxic T cells (CTL).
  • natural killer cells are activated as shown in Table 18.
  • the MRE complex ligand activates the Th12 process, it also activates the process of enhancing cellular immunity including CTL and eliminating virus-infected cells and cancer cells.
  • the MRE complex ligand has an excellent antiviral effect by activation of five processes.
  • virus refers to human immunodeficiency virus, hepatitis C virus, influenza virus, human papilloma virus, human herpes virus, hepatitis B virus, and other vertebrates over fish. DNA and RNA viruses are included.
  • Cancer cells generally become cancerous due to apoptotic damage of precancerous cells. Whether it is caused by damage of tumor suppressor genes caused by free radicals, or by P53 degradation promotion by HPV such as cervical cancer, apoptosis inhibition by HSP (heat shock protein) such as stress as in pancreatic cancer Even in this case, there is always an apoptotic disorder that causes canceration.
  • HSP heat shock protein
  • cytotoxic CD8 + T cells CTL
  • NKT cells NKT cells
  • NK cells cytotoxic CD8 + T cells
  • Adhesion to cells and cancer virus-infected cells, perforin punctures cells, and granzyme induces cancer cells to apoptosis, thereby exerting an anticancer effect.
  • TNF- ⁇ also activates the process of inducing cancer cell apoptosis by releasing cytochrome C from mitochondria and activating caspase-8.
  • TNF- ⁇ is known to be a substance that is highly damaging to general cells and triggers the onset of HIV.
  • CTL also activates CTL by enhancing cellular immunity by the Th1 process activated by IL-12.
  • this CTL destroys cells infected with hepatitis C virus and HIV to develop hepatitis and HIV, and also causes cytotoxic autoimmune diseases.
  • the anti-cancer effect of the MRE complex ligand is mainly performed by natural killer cells (NK cells), and CTL cells and NKT cells are added thereto to enhance the anti-cancer effect.
  • NK cells are activated by the MRE complex ligand through the following process and exert anticancer effects.
  • the first is a process in which an effect appears at an early stage in the process of producing type I interferon and directly activating NK cells by stimulation of innate immune receptors.
  • INF- ⁇ (IL-28A), which is known to strongly activate NK cells, is 1.84 times the normal gene expression, and INF- ⁇ , INF -Increases anticancer effect together with ⁇ .
  • CXVR4 a chemokine that metastasizes cancer cells to the lungs and liver, is suppressed to 0.67 times the normal level, suppressing cancer metastasis.
  • the second is the anticancer effect due to the activation of NK cells by IL-21 production through the non-inflammatory Th17 process by the MRE complex ligand.
  • the third is a process in which IL-12 directly acts on NKT cells to produce IL-21 and activates NK cells.
  • IL-12 activates the Th1 process to produce INF ⁇ . It is a process of activating CTLs to enhance the anticancer effect.
  • MRE complex ligands can activate NK cells from three processes.
  • Table 18 is a comparative test of the ability of NK cells to kill cancer cells. The case where no ligand is added is compared with the case where a solution obtained by diluting the MRE complex ligand-containing stock solution prepared in Example 1 is added.
  • NK cell killing ability test method and procedure are as follows.
  • the concentration of the MRE complex ligand-containing stock solution added is the value obtained when 100% of the MRE complex ligand-containing stock solution daily intake is 100 ml and the standard human blood volume of 4,500 ml is absorbed 100% into the blood.
  • the concentration was set based on a concentration of 6.66% (v / v).
  • the amount of Eu 3+ released in each well was measured by time-resolved fluorescence measurement, and the cancer cell killing ability activity of NK cells was calculated.
  • the obtained numerical value represents what percentage of K562 cells that are cancer cells were killed by NK cells.
  • 51 or higher is Very High
  • 42 to 51 is High
  • 24 to 42 is Standard
  • 14 to 24 is Low
  • 14 or less is Very Low.
  • the MRE complex ligand can activate NK cells through various routes, and can lead cancer to apoptosis at the level of Very High.
  • apoptotic debris is rapidly phagocytosed by macrophages and does not necrotize cancer cells like anti-cancer drugs or radiation, so the cancer will naturally shrink without causing inflammation or cachexia. It can be seen.
  • the MRE complex ligand has been successfully used in dialysis patients with canine liver cancer (see Example 8), non-Hodgkin lymphoma (see Example 13), and kidney cancer by intravenous injection (see Example 31). ). This result almost coincides with the clinical result of IL-21 administration (Patent Document 4). The disappearance of polyps, a precancerous symptom of viral cancer, was also observed.
  • the MRE complex ligand has an anticancer effect that reduces cancer cells without inflammation.
  • cancer includes cancer, sarcoma, tumor, epithelioma, leukemia, lymphoma, polyp, and “unusual cells” such as hard cancer, malignant transformation, and neoplasm.
  • NK cells are innate immune cells that select and eliminate only cells that deviate from “normality” (Non-patent Document 5).
  • the MRE complex ligand has excellent properties not found in other ligands, while maintaining the functions of antibacterial action, antiviral action, and anticancer action, and at the same time, functions of anti-inflammatory action and tissue repair action. Anti-inflammatory action is also a notable property of MRE complex ligands.
  • the MRE complex ligand according to the present invention suppresses inflammation by the following process.
  • IL-18 is a trigger (trigger) of inflammatory diseases by the MRE complex ligand.
  • Decreased IL-18 production activates non-inflammatory Th17, non-inflammatory Th1 and non-inflammatory Th2 processes.
  • Th17 secretes IL-17F that activates non-inflammatory humoral immunity and IL-21 that activates NK cells. From Th1, INF- ⁇ is produced to enhance cellular immunity. Both processes function to suppress inflammatory diseases including autoimmunity and allergic diseases by suppressing IL-18 while maintaining antibacterial and antiviral properties.
  • the third is the calming of allergic diseases and autoimmune diseases caused by IL-21 production.
  • the following table shows the results of IL-21 test from human blood with MRE complex ligand.
  • the method and procedure for IL-21 production test of NK cells are as follows.
  • IL-21 As shown in Table 19, the production amount of IL-21 was increased by an average of 2.11 times the average by the MRE complex ligand-containing solution, and it should be noted that IL-21 was originally expressed only at a low level. It can be seen that humans tend to increase significantly.
  • IL-21 is a cytokine that enhances anticancer activity by secreting antiviral components and proliferating natural killer cells, and is also known to have a function of apoptosis of T cells and B cells that cause allergies and autoimmune diseases. ing.
  • the MRE complex ligand was confirmed to actually increase IL-21 significantly in human blood, and clinical trials clearly support its anti-inflammatory effect as in Examples 15 to 20. .
  • the concentration of TNF- ⁇ which is an inflammatory cytokine, averaged 232.8 ng / ml in human blood without any stimulation such as ligand. Even if it gives, it has decreased slightly with an average of 221.8 ng / ml. This result shows that the inflammation-suppressing effect is clear when considered in comparison with normal 37.042-fold gene expression in a single macrophage with the same level of stimulation by the MRE complex ligand (see FIG. 4). .
  • IL-21 production-inducing action by such MRE complex ligands is effective for various immune diseases such as allergic diseases (particularly allergic asthma, hay fever, atopic dermatitis, eczema, food hypersensitivity, urticaria, allergic) IgE-regulated allergic diseases such as rhinitis and allergic conjunctivitis (diseases involving type I allergic reactions)), Autoimmune disease (rheumatoid arthritis, Crohn's disease, systemic lupus erythematosus, scleroderma, polymyositis, polychondritis, nodular periarteritis, ankylosing spondylitis, rheumatic fever, Sjogren's syndrome, Behcet's disease, thyroiditis , Type I diabetes, dermatomyositis, chronic active hepatitis, myasthenia gravis, Graves' disease, multiple sclerosis, primary biliary cirrhosis, autoimmune blood disease
  • tissue repair is performed by a process in which the action of the macrophage is switched from M1 (GM) to M2 (M) to switch from anti-inflammatory state to inflammation suppression and tissue repair.
  • GM M1
  • M2 M2
  • the temperature of the pH is raised locally to make the pH acidic, thereby reducing the activity of bacteria and viruses, and at the same time, creating an environment in which emergency enzyme groups including lysosomal enzymes can easily act. This is the process of the inflammation stage.
  • the fragments of the destroyed bacteria are reduced in molecular weight by lysosomal enzymes, and a part of them is an LHA receptor (APC) LHA receptor (APC) capable of presenting antigens such as macrophages, dendritic cells and vascular endothelial cells.
  • APC LHA receptor
  • APC LHA receptor
  • MHC receptors MHC receptors
  • MHC receptors MHC receptors
  • the other part is detected by the TLR receptor, NLR receptor, and RLR receptor in the innate immune system of macrophages, recognizing the pattern of the antibacterial completion ligand, and macrophages switch from the M1 state to the M2 state. Releases IL-10 and IL-2 and produces FGF that promotes tissue repair to activate fibroblasts, osteoblasts, and the like.
  • the low molecular weight ligand is a signal of the antimicrobial completion pattern.
  • the MRE complex ligand was obtained by decomposing bacterial cells with lysosomes into low molecular weights, and was expected to have a tissue repair effect. And by DNA dynamic analysis by microarray, it was found that FGF2, one of cytokines that promote tissue repair, was expressed 2.525 times as usual. In clinical trials, the tissue repair action of the MRE complex ligand was confirmed (see Examples 25 to 29).
  • Macrophage M1 activation also activates macrophage phagocytic activity. For this reason, in the blood, lymphocytes, and tissues, dead cells, foreign substances, and oxidized toxins such as oxidized LDL are phagocytically decomposed and the residue is discarded into bile to purify the body.
  • the MRE complex ligand that activates M1 has an effect of causing waste removal action through activation of macrophages.
  • the MRE complex ligand has an excellent property of having an anti-inflammatory action, an antibacterial action, an antiviral action, and an anticancer action at the same time. Moreover, since it is a small molecule in the oligo region, it is easily absorbed from the intestine through the mucosa. Furthermore, it can be used as an injection by purifying as a beverage or as an external preparation.
  • the action of the MRE complex ligand according to the present invention as a whole has the property of suppressing lymphocyte immunity and enhancing innate immunity.
  • the immune enhancement composition according to the present invention exhibits various innate immune stimulating effects as described above when administered to mammals including humans and dogs.
  • the administration method is any administration method usually used in the medical or medical field as long as it is administered in such a state that the immunopotentiating composition according to the present invention can exert its function. It may be.
  • it can be administered enterally or orally, or can be performed parenterally.
  • administration methods performed parenterally include intravascular administration, peri-tissue and intra-tissue injection, and subcutaneous injection, and may be applied directly to the skin or mucous membrane. It can also be administered by eye drops, nasal administration, transdermal administration, and mucosal administration.
  • the immunopotentiating composition according to the present invention can be administered in any dosage form that is usually used in the medical or medical field, or in the molecular biology field, as long as it can exert its function.
  • the immune enhancing composition according to the present invention can be administered as a liquid composition, and in this case, it may be a stock solution or a diluted solution.
  • the MRE complex ligand-containing stock solution used in the present invention comprises a digestive enzyme group secreted from vegetative cells of the MRE symbiotic fungal group and a lysosomal enzyme homologous bulk enzyme group released upon endospore formation (spoorization).
  • a digestive enzyme group secreted from vegetative cells of the MRE symbiotic fungal group and a lysosomal enzyme homologous bulk enzyme group released upon endospore formation (spoorization).
  • the MRE bacteria group was cultured by a known general culture method for aerobic Gram-positive bacteria. First, 1000 liters of water was put into a 1.2 m 3 culture aeration tank and aeration (aeration) was performed. The culture aeration tank was fed with 10 kg of fish meal, 10 kg of rice bran, 5 kg of oil residue and 1 kg of gravy as nutrients, and further added appropriate amounts of minerals such as magnesium sulfate and silica. Further, the cells were added, and aeration was performed so that the dissolved oxygen concentration was 0.5 mg / L to 1.2 mg / L under the culture conditions of culture pH 6.0 to 6.8 and culture temperature 25 ° C. to 35 ° C. MRE symbiotic fungi were cultured while adding aeration.
  • the MRE bacteria group in a vegetative cell state is separated into another aerated culture tank together with the culture solution.
  • this culture aeration tank all nutrients of the MRE fungus group are cut off and placed in a starved state, and further aeration is continued under conditions of 25 ° C to 35 ° C. Begins.
  • aeration oxygen supply
  • the endospores start to precipitate all at once and obtain a transparent supernatant.
  • MRE complex ligand-containing stock solution contains 3.6 mg / ml of an organic component, which contains 80 ⁇ g / ml of the MRE complex ligand component.
  • MRE stock solution contains 3.6 mg / ml of an organic component, which contains 80 ⁇ g / ml of the MRE complex ligand component.
  • MRE stock solution contains 3.6 mg / ml of an organic component, which contains 80 ⁇ g / ml of the MRE complex ligand component.
  • MRE stock solution the “MRE complex ligand-containing stock solution” obtained as described above is referred to as “MRE stock solution”, and is expressed as “dilution of MRE complex ligand” unless otherwise specified. Refers to “dilution of stock solution containing MRE complex ligand” or “dilution of MRE stock solution”.
  • Example 3 Hepatitis C (HCV)
  • Male 48 years old With hepatitis C, even after treatment with interferon and ribavirin, the viral load is not so low as 28,000 / ml, ALT (GPT) is 621, and AST (GOT) is 586. In addition to urso, take 50 ml 3 times a day. After 3 months, the amount of virus was measured by PCR and decreased to 12800 / ml. ALT (GPT) was 48 and AST (GOT) was 52, which was remarkably improved.
  • Example 4 [Example 4 / cervical cancer (HPV)] A woman 50 years old. Onset of viral infection of cervix (causal virus HPV of cervical cancer). Take 30 ml of MRE mixed ligand drink twice a day (morning and evening). The examination was improved from class 3a to class 2a after two months.
  • Example 5 Constitution of easy catching cold
  • Example 6 Male 71 years old. I had warts on my fingers, which had hindered my work. 50ml of MRE drink, 2 drinks every day, and shrinked so that warts became inconspicuous in 6 months. Warts are said to be caused by HPV (human papilloma virus).
  • HPV human papilloma virus
  • Example 7 [Example 7 / Shingles] A woman 60 years old. 30ml of MRE complex ligand drink was taken twice a day and applied to the affected area. It improved in 1-2 days. Herpes and shingles are cured quickly when applied simultaneously with drinking.
  • Antibacterial effect [Example 8 / chronic infection] A woman 58 years old. When you get tired due to systemic bacterial infection (opportunistic infection), different parts such as insteps, ankles, ankles and thumbs of your hands are swollen and inflamed every time. Rheumatoid factor is negative, and it has been repeatedly cured by taking antibiotics. Over time, antibiotics stopped working, and I tried 50 ml twice a day to try MRE beverages. As a result, what has been onset 1-3 times a month can only be onset about once every six months. Increased platelets have also decreased.
  • Example 9 Humiliation wound
  • MRE beverage a woman 80 years old. It suppurates by rubbing the floor. After spraying the MRE beverage on the insult wound, it was dipped in gauze and laid down. The suppuration began to subside and the humiliation wound became smaller after one month, and the odor generated from the wound was reduced.
  • Anticancer effect [Example 10 / liver cancer] A 12 year old male dog. He was unable to get water and food due to liver cancer and was unable to move. Since there is no method of treatment, about 15 ml of MRE beverage was injected into the vein as a trial. I got up on the 3rd day and started drinking water, so I added 100 ml of MRE beverage to the water and drank it. A doctor in an animal hospital is said to have completely recovered from cancer.
  • Example 11 / liver cancer A 13-year-old male mixed-breed dog. At the University of Yamaguchi veterinary medicine department, it was diagnosed that "the liver has many malignant tumors and there is no way to do it.” I could't have surgery, so I diluted my MRE drink with water every day. A week later, she revisited the university and was diagnosed with cancer that had not grown. After that, dogs began to drink MRE drinks and recovered daily. After one month, they started running around the house. Three months later, the X-ray screening showed that the cancer had shrunk and became smaller. Going out for a walk and eating back to normal and jumping well.
  • Example 12 Liver cancer
  • ALT (GPT) value is 64 in liver function test. Take 30 ml of MRE ligand drink twice a day. The ALT value is 58 in the test after one month, and the ALT value is 33 in the test after two months.
  • Example 14 Man 61 years old. End-stage prostate cancer with a blood PSA value of 3000 ⁇ g / ml. There is blood from the mouth just before bone metastasis. Surgery is impossible, and anti-androgenic Casodex and female hormone leupurin are injected subcutaneously once every four weeks. Temporarily, the PSA value dropped to 1, but it burned again. Therefore, Casodex is changed to highly effective Odyne. However, Odine can cause severe liver damage. The blood test showed a PSA of 0.92, but AST (GOT) was 56 (normal value 11-30) and ALT (GPT) was increased to 196 (normal value 4-30).
  • Example 15 Male 70 years old. The tumor grows from liver cancer to the stomach. This makes it impossible to eat. Take 30 ml of MRE beverage twice a day with infusion treatment. After one or two months, the stomach and liver tumors began to shrink, and in the fourth month they were able to eat. At the 5th month, it looked almost gone.
  • Example 16 Male 69 years old. Hospitalized for colorectal cancer. Take 80 ml of MRE ligand beverage twice a day. After drinking, the tumor marker begins to drop and the tumor itself becomes smaller after one month. An excision operation was performed, but there was no metastasis to lymph.
  • Example 17 Male 66 years old. I have anticancer drug treatment for pancreatic cancer. In addition, diabetes is also injected with insulin. I've been taking 30ml of MRE ligand drink a day and I feel very good for months.
  • Example 18 [Example 18 / rectal cancer] A 78-year-old woman. A colostomy is attached. The family is sentenced to incurable by the doctor. Take 2 bottles of MRE ligand (1800ml) on the first day, 1 bottle (900ml) on the 2nd day, 1 bottle (900ml) on the 3rd day. Subsequent examinations, including cancer that had spread to the bones, disappeared.
  • Example 19 76 years old male. Metastasis from lung cancer to bones and taking anticancer drug TS-1. At first, it was effective and expected to recover. Treatment with narcotics and constipation drugs in hospice due to severe pain and constipation. Take 30 ml of MRE ligand drink 3 times a day. After 3 weeks, lung cancer disappeared (residual bone). I was able to return to work.
  • Example 20 malignant lymphoma
  • IL-21 in the blood increased remarkably, the metastatic cancer that had metastasized began to shrink, and the tumor in the chin area under the ear became softer.
  • Example 22 [Example 22 / urticaria] A woman 31 years old. Unexplained urticaria-like rash appears throughout the body every day. Have 50ml of MRE drink. After drinking, the itch became lighter after about an hour, so I could endure it. The next day, I had another rash, so I decided to take it twice a day. By the end of the month, the urticaria-like rash stopped.
  • Example 23 / urticaria A woman 54 years old. A 500-yen coin urticaria became smaller than a small finger within 2 days of drinking, and it took about a week to withdraw, but the skin became slippery in 2-3 days.
  • Example 24 ulcerative colitis
  • Inflammation findings in endoscopy about 10 months after I started drinking MRE beverages were lost. After that, continued diet and MRE drinks. Symptoms of ulcerative colitis have not occurred without any medication other than an intestinal agent.
  • Example 25 atopic dermatitis
  • a woman 31 years old It suffers from atopic inflammation accompanied by swelling and itching in the skin of the whole body including the face.
  • spraying MRE beverages like lotion temporarily reduces swelling and itching.
  • eczema became difficult to occur in about 2 months.
  • Example 28 A woman 15 years old. allergic rhinitis. Drink 30 ml of MRE beverage twice a day. Symptoms improved in 3 weeks.
  • Diabetes and hypertension Male 56 years old. With diabetes, the fasting blood glucose level fluctuated in the range of 152 to 396 and did not recover, and A1C exceeded 8.6.
  • the fasting blood glucose level was 90, A1C7.3, in the third month, the fasting blood glucose level was 89, A1C5.8, and in the fourth month, the fasting blood glucose level was 91, and A1C5.0 It became normal value.
  • Example 31 High blood pressure
  • Example 32 High blood pressure
  • Tissue repair effect (recover fractures and wounds)
  • Example 34 Male 42 years old. Even after rehabilitation due to ligament injury of the left knee, it was diagnosed that “walking is possible but running is difficult”. Even after 5 years, running and overdoing the pain in the left foot does not heal. Two weeks after I started drinking MRE beverages, I noticed that I had no longer felt pain in my left foot even if I drove for a long time. When I tried it, it was only 5m but I was able to run. After that, I continued to drink MRE drinks and was able to extend the distance of 10m and 20m. When I stopped drinking for a week, I felt pain after riding for a long time. We are making efforts to extend the distance to run for the 5-km marathon.
  • Example 36 Low-temperature burn of foot
  • Example 37 A woman is 61 years old. When you are a high school student, you can crush the "acne” and create a bumpy "acne mark” on the nose. Drink 50 ml of MRE beverage per day. In about 2 months, the “acne scars” began to decrease, and in the 6th month, the skin unevenness became inconspicuous due to a considerable reduction, although not completely. The texture of the entire skin has also become finer.
  • Example 38 flying mosquito disease after surgery
  • 50 ml of MRE beverage was drunk daily, improvement was seen in 2 weeks, and blood pressure of 150 or more did not exceed 130.
  • Example of test drinking to healthy people [Example 40 / Test drinking to healthy people] A questionnaire was conducted on 72 healthy people who took MRE beverages as test drinks. 58 out of 72 people say that their urine output improved. Also, 41 out of 72 people feel they have stopped catching a cold. 68 out of 72 people had gloss on their skin. There were no side effects, including those who were constipated with medicinal herbs. Rather, there were 12 people who had improved constipation.
  • the present invention can be variously modified, and is not limited to the above-described embodiment, and can be variously modified without changing the gist of the invention.

Abstract

本発明は、自然免疫及びそれに続くリンパ球の免疫を、細胞を痛めつけることなく活性化させることのできる効果的な免疫賦活物質を有する免疫増強組成物を提供することを目的とするものであり、バシラスｓｐ．（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）（ＦＥＲＭ ＢＰ－１１２０９）、リシニバシラスフシフォルミス（Ｌｙｓｉｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｕｓｉｆｏｒｍｉｓ）（ＦＥＲＭ ＢＰ－１１２０６）、バシラスソノレンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｏｎｏｒｅｎｓｉｓ）、リシニバシラスｓｐ．（Ｌｙｓｉｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）（ＦＥＲＭ ＢＰ－１１２０７）、及びコマモナスｓｐ．（Ｃｏｍａｍｏｎａｓ ｓｐ．）（ＦＥＲＭ ＢＰ－１１２０８）から成るＭＲＥ共生菌群から選択される１若しくはそれ以上の菌類を分解することによって生じる免疫賦活物質を有効成分として有するものであることを特徴とする、免疫増強組成物である。

Description

免疫増強組成物及びそれを製造する方法
　本発明は、自然免疫を刺激することによって、抗菌作用、抗ウイルス作用、抗炎症作用、及び抗癌作用を増強させると共に、リンパ球系の免疫システムに影響を与え炎症を抑制させる組成物に関する。
　具体的には、本発明に係る組成物は、自然免疫の受容体であるＴＬＲやＮＬＲおよびＲＩＧなどを刺激し、それに引き続き、マクロファージ、ナチュラルキラー細胞、ナチュラルキラーＴ細胞を含む自然免疫応答細胞を活性化させると共に、Ｔｈ１７およびＴｈ１、或いはＴｒｅｇ等の自然免疫と連動するリンパ球系免疫を活性化させる。また、過剰な免疫反応を抑制するＩＬ－２１を産生させる一連の免疫プロセスの活性を誘導することによって、抗癌作用、抗菌作用、抗ウイルス作用、抗炎症作用を増強させＣＴＬの暴走に起因する自己免疫作用を緩和する。
　近年、生活習慣の多様化に伴う各種疾患の増加に比例して、自然免疫の果たす役割の重要さが増しつつある。米国のＮＩＨ助成プロジェクトの一つＳｔｅｖｅｎＢ．Ｍｉｚｅｌによる研究では、自然免疫のリガンドの一つであるフランジェリンとペスト菌ワクチンとの結合体によりワクチンに対するアジュバンド効果が約５０万倍に増強されることが明らかにされた。その成果は自然免疫の可能性の大きさを示唆するものであり、自然免疫リガンドのアジュバンド効果に期待が寄せられつつある（非特許文献１および非特許文献２参照）。
　自然免疫の受容体またはその類似センサーは、広く動物、植物、微生物に存在している。具体的には、脊椎動物の自然免疫受容体としては、ＴＬＲ（Ｔｏｌｌ－ｌｉｋｅ－ｒｅｃｅｐｔｏｒ）、ＮＬＲ（Ｎｏｄ－ｌｉｋｅ－ｒｅｃｅｐｔｏｒ）、及びＲＬＲ（ＲＩＧ－ｌｉｋｅ－ｒｅｃｅｐｔｏｒ）が細胞の内外に存在し、菌やウイルスなどが分解されてできた物質（リガンド）によって菌やウイルスなどの外敵を検知し、パターン認識で判別している。リガンドは分解される菌やウイルスの種類によって複数生成され、一般的に、生成された物質もその濃度も異なるため、それらのリガンド群の組み合わせにより認識されるパターンが微妙に異なって識別され、自然免疫応答されている。
　ヒトの上皮細胞などの自然免疫応答細胞では、細胞膜上でＴＬＲ－１&２、ＴＬＲ－６&２、ＴＬＲ－４&ＭＤ－２、ＴＬＲ－５が働き、エンドゾームや食細胞の食包内でリソゾーム酵素群により分解された菌やウイルスの核酸（ＤＮＡやＲＮＡ）の分解断片がＴＬＲ－３、ＴＬＲ－７、ＴＬＲ－８、ＴＬＲ－９を活性化させる。細胞質内には菌の低分子分解物を感知する受容体であるＮＯＤ１、ＮＯＤ２、ＮＡＬＰ３、ＮＡＩＰ５、ＩＰＡＦなどの菌の低分子分解物を感知するＮＬＲ受容体やウイルスの低分子分解物や核酸を感知するＲＩＧやＭＤＡ－５などが働いている。
　これら自然免疫のセンサーである受容体は、それぞれの菌やウイルスの分解物を感知した組み合わせのパターンに従って様々な抗菌のためのインターロイキンやＩ型のインターフェロン（ＩＦＮ－αファミリ－やＩＮＦ－βそしてＩＮＦ－λ）、又はこれらの類似物質を放出して、近隣細胞に感知させる。そして、それを感知した細胞群がディフェンシン、カテリシジン、デルミシジンなどの抗菌物質やＩＳＧと呼ばれる数百種類に及ぶ抗ウイルス物質群を一斉に放出することで、外敵から味方の細胞群を防御している。ここで、急速に変化してゆくウイルスに対抗して生体が多数の抗ウイルス物質を放出している事実は、本発明に係る組成物を必要とする理由の一つとなっている。
　自然免疫の受容体の第２の役割は、腸管を持つ多細胞生物に存在する食細胞を活性化することである。食細胞は動く自然免疫の責任分担された細胞として発達し、ヒトではマクロファージや好中球などがその役割を担っている。特にマクロファージは免疫の司令官として重要な役割を担っている。自然免疫のセンサーである受容体群が刺激されるとマクロファージや好中球とその仲間達が活性化し、菌やウイルスなどの外敵と闘う体制になる。
　ヤツメウナギとメクラウナギを除く脊椎動物では、リンパ球系の自己、非自己を識別する免疫系が発達し免疫システムを補強している。特に、哺乳類ではこのリンパ球系の免疫システムが補体系を基礎に高度化し強化された。しかしその反面、アレルギー疾患や自己免疫疾患で苦しむことになった。
　特に、哺乳類では、マクロファージ、樹状細胞、ランゲルハンス細胞、ミクログリアなどの自然免疫応答細胞の受容体がそれぞれのリガンド（特異的な刺激物）の存在を感知すると、Ｔ細胞を分化させるＩＬ－１２、ＩＬ－６、ＩＬ－４、ＴＧＦ－βなどのインターロイキンおよび分化したＴ細胞を活性化させるＩＬ－１β、ＩＬ－２３、ＩＬ－２並びに分化したＴ細胞の活性を抑えるＩＬ－２、ＩＬ－２５、ＩＬ－２７、ＩＬ－６などが、そのパターン認識の結果に従って分泌される。
　これらのプロセスは、Ｔｈ１７またはナチュラルキラーＴ細胞からＩＬ－２１を放出させ自己を攻撃する抗体を持つＢ細胞や記憶Ｔ細胞をアポトーシス又は抑制させて自己免疫疾患に陥ることを防いでいる。
　自然免疫のリガンドの様々な組み合わせ、抗原と自然免疫のリガンドとの組み合わせなどによって、プロセスに多様なると変化と作用の差異をもたらすことがＤＮＡマイクロアレイによるＤＮＡから発現したＲＮＡの動態解析により解明されてきた。これは、ＤＮＡやＲＮＡの動態解析の技術の進歩により、自然免疫やリンパ球系免疫（いわゆる獲得免疫）発現のプロセス、細胞のアポトーシス経路、炎症コントロール（抗菌、抗癌）経路、抗ウイルス経路へのスイッチング、炎症並びに炎症抑制のプロセスなどの変化が時系列で捉えられるようになったためである。
　このような自然免疫のＴＬＲ、ＮＬＲ、ＲＬＲの受容体とそれに続く生理プロセスの解明は、医療に革命をもたらす可能性を秘めている。すなわち、従来の医学では治療が困難とされる「各種の癌疾患や前癌段階のポリープ形成」、「ＨＩＶ、ＨＣＶ、ＨＰＶ、ＨＨＶおよび新型インフルエンザなどのウイルス疾患」、「抗生物質による耐性菌や体内潜伏菌」、「各種アレルギー疾患などの炎症性の疾患」、「各種自己免疫による炎症性の疾患」などへの根本的な解決への道が開けるものと期待されている。
　このような技術の流れを背景として、Ａ．「自然免疫のリガンドの効果的組み合わせ」、Ｂ．「抗原ワクチンと自然免疫のリガンドの組み合わせ」が極めて重要な意味を持つようになった。
　たとえば、従来、自然免疫リガンドとして普及しているものにＬＰＳとＲ－８４８とイミダキノリン、そしてフランジェリンがある。ＬＰＳは、ＴＬＲ４とＭＤ２を活性化するリガンドであり、　イミダキノリンやその誘導体であるＲ－８４８はＴＬＲ７を活性化するリガンドで、フランジェリンはＴＬＲ５を活性化するリガンドである。
　イミダキノリンとＲ－８４８は同じＴＬＲ７活性でも異なる種類のＩＦＮ－αを産生させるため、イミダキノリンはＨＰＶ（パピロ－マウイルス）の治療薬として、Ｒ－８４８はＨＨＶ（ヘルペスウィルイス）の治療薬として使われている。同じ受容体の活性でもリガンドの違いによってその作用は異なってくることを示している。
　また、ＭＤＰ（ムラミルジペプチド）とその誘導体も１９８５年代頃から注目された自然免疫リガンドでＴＬＲ－２を活性化する。誘導体のＭＤＰ－Ｌｙｓがアジュバントとして医薬品となっている。最近、ＮＬＲを活性化することで再注目を浴びているが、単独使用されることはなく、ＬＰＳやリピドＡなど他のリガンドと組み合わせることでそのリガンド効果を高めることができることが分かっている。
　さらに、特許文献１では、ＩＬ－１２産生の細菌や酵母とＩＬ－１２非産生の細菌や酵母を組み合わせた菌から作られた複合リガンドで、意外にもＩＬ－１０を産生するということを発見している。
　このように複合リガンドは、単一リガンドにない相乗効果をもたらし、かつ作用点を分散させることでＬＰＳ（エンドトキシン）というリガンドにもし弊害があるとすればそのリスク分散を可能にすることができる。このような理由から複合的に働くリガンドの開発が強く求められている。特にフランジェリンの強力なアジュバンド効果が発見されてからは重要な意味をもつに至った。
　現在の医療は、一つの壁に突き当たっている。頼りにされている抗生物質は、ウイルスには効かず、耐性菌を生むという深刻な問題を抱えている。また、アナフィラキシーを起こすという副作用もある。ステロイドなどのホルモン剤や免疫抑制剤は免疫の弱体化を通して病原菌や日和見菌への感染という危険を増大させるが、その使用でヒトを含む生命体を正常化することはできない。また、インヒビターによる治療も生体の正常なシステムを阻害することによる弊害が強く指摘されている。根治しない薬剤を使い続けることは医療費の増大にも影響を与えている。この壁を打破する観点からも、安全で優れた自然免疫活性リガンドの実現が求められている。
特開２００８－３１１５３号公報 特開２００６－２６５２１２号公報 特表２００７－５０６７８９号公報 特表２００６－５１４６０１号公報 特表２００５－５３０７１６号公報
Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｔｒｉｂｕｎｅ　２００５．６．１６ Ｃｌｉｎ　Ｖａｃｃｉｎｅ　Ｉｍｍｕｎｏｌ．　２００９　Ｊａｎ；１６（１）：２１－８．　Ｅｐｕｂ　２００８　Ｎｏｖ　５ Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，Ｖｏｌ．２８２，Ｉｓｓｕｅ４８，３４６０５－３４６１０，Ｎｏｖｅｍｂｅｒ３０，２００７ Ｎａｋａｎｉｓｈｉ　Ｋ．ｅｔ．ａｌ：Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ－１８　ｒｅｇｕｌａｔｅｓ　ｂｏｔｈ　Ｔｈ１　ａｎｄ　Ｔｈ２　ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ．Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ　Ｉｍｍｕｎｏｌ１９，４２３－４７４，２００１ 医学書院　標準免疫学ｐ２０９～ｐ２１１ 中西憲司「ＩＬ－１８とスーパーＴｈ１型アレルギー炎症」兵庫医科大学 Ｉｍｍｕｎｉｔｙ３０（１）：１０８－１１９，２００９ Ｎａｔｕｒｅ　２００８年７月１７日号Ｖｏｌ．４５４　Ｎｏ．７２０２／Ｐ．３５０－３５２
　本発明は、このような状況を鑑みてなされたものであり、細胞障害性のない効果的な組成物（リガンドまたはアジュバンド）を提供することを目的とする。さらに詳しく述べれば、炎症疾患を誘発しない抗菌効果、抗ウイルス効果、抗癌効果、及びＣＴＬの暴走抑制を含む炎症抑制効果を有する安全性の高い組成物（リガンドまたはアジュバンド）を提供することを目的とする。
　また、本発明は、細胞膜を容易に透過できる低分子組成物（低分子リガンド）を提供することを目的とする。細胞膜を容易に透過できることは、細胞表面と細胞内部のエンドゾームおよび細胞質に立体的に存在する自然免疫受容体を複合的に刺激することが可能になることを意味する。
　同様に、本発明は、自然免疫受容体を立体的に刺激する組成物（リガンド）を提供することを目的とする。立体的な組成物（リガンド）の実現によって、その相乗効果を期待することができ、安全性をさらに高めることが可能になるからである。さらに、低分子化により、腸管や皮膚からも容易に吸収可能な免疫活性剤を提供することも可能になる。また、低分子であるが故に抗体に攻撃されない組成物（リガンド）が実現でき、注射剤としても使用可能になる。
　さらに、本発明は、アジュバンドとして利用できる組成物を提供することを目的とする。　
　本発明の発明者の一人である御手洗薫は、好気性の土壌菌類を大分県佐伯市近郊の山中の森林で採取し、長年培養した結果、個性の強い安定した共生菌群を得、さらに鋭意研究・実験を重ねた結果、本発明を完成するに至ったものである。
　また、本発明者らは、その共生菌群の菌体を分解して得た低分子分解物を、発病したＨＩＶ患者に与えたところ、その容態が著しく改善し、エイズ発症の指標であるＣＤ４も１ヶ月以内という短期で著しく増加し全員が元気になることを見出し、この共生菌群を「ＭＲＥ共生菌群」と名付けた。このことは、ＭＲＥ共生菌群の分解生成物が、患者における自然免疫を増強させ、その疾患を治療することができるものであることを意味する。すなわち、本願発明は、対象が有する免疫を増強させることができる、ＭＲＥ共生菌群の分解生成物を含む自然免疫増強組成物を提供するものである。
　したがって、本発明の第一の主要な観点によれば、自然免疫を刺激することによって対象が有する免疫を増強させる免疫増強組成物であって、バシラスｓｐ．（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｐ．）（ＦＥＲＭ　ＢＰ－１１２０９）、リシニバシラス　フシフォルミス（Ｌｙｓｉｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ　ｆｕｓｉｆｏｒｍｉｓ）（ＦＥＲＭ　ＢＰ－１１２０６）、バシラス　ソノレンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｏｎｏｒｅｎｓｉｓ）、リシニバシラスｓｐ．（Ｌｙｓｉｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｐ．）（ＦＥＲＭ　ＢＰ－１１２０７）、及びコマモナスｓｐ．（Ｃｏｍａｍｏｎａｓ　ｓｐ．）（ＦＥＲＭ　ＢＰ－１１２０８）から成るＭＲＥ共生菌群から選択される１若しくはそれ以上の菌類を分解することによって生じる免疫賦活物質を有効成分として有するものであることを特徴とする、免疫増強組成物が提供される。
　また、本発明の一実施形態によれば、このような免疫増強組成物において、前記免疫賦活物質は、少なくともその９８重量％以上が、平均分子量１，０００Ｄａ以下の親水性低分子物質である。
　また、本発明の別の実施形態によれば、このような免疫増強組成物において、前記免疫賦活物質は、マクロファージ、ナチュラルキラー細胞、又はナチュラルキラーＴ細胞を活性化させるものである。
　本発明の別の実施形態によれば、このような免疫増強組成物において、前記免疫賦活物質は、樹状細胞、ミクログリア細胞、ランゲルハンス細胞、又はクッパー細胞を活性化させるものである。
　さらに他の本発明の実施形態によれば、このような免疫増強組成物において、前記免疫賦活物質は、上皮細胞、繊維芽細胞、ケラチノサイト、又は骨芽細胞を活性化させるものである。
　さらに他の本発明の実施形態によれば、このような免疫増強組成物において、前記免疫賦活物質は、Ｔｈ１７又はＴｈ１を分化又は活性化させるものである。
　さらに他の本発明の実施形態によれば、このような免疫増強組成物において、前記免疫賦活物質は、ＩＬ－２１産生を増強させるものである。
　また、本発明の別の実施形態によれば、このような免疫増強組成物において、前記免疫賦活物質は、前記ＭＲＥ共生菌群から選択される１若しくはそれ以上の菌類を生育に適した培養条件下で培養し、得られた培養液を飢餓状態におき、エアレーションを行うことによって得られるものであることが好ましい。
　また、本発明の別の実施形態によれば、このような免疫増強組成物において、この免疫増強組成物は、アレルギー疾患又は自己免疫疾患に罹患した対象における抗炎症剤として使用されるものである。
　このような場合、前記アレルギー疾患又は自己免疫疾患は、顎関節炎、潰瘍性大腸炎、アトピー性皮膚炎、アレルギー性鼻炎からなる群から選択されることができる。
　また、本発明の他の実施形態によれば、このような免疫増強組成物において、この免疫増強組成物は、病原性細菌又は病原性ウイルスに対するワクチンのアジュバンドとして使用されるものである。
　この場合、前記病原性細菌又は病原性ウイルスは、日和見感染菌、ＨＩＶ、ＨＣＶ、及びＨＰＶからなる群から選択されることができる。
　また、本発明の別の実施形態によれば、このような免疫増強組成物において、この免疫増強組成物は、肝臓癌、前立腺癌、大腸癌、直腸癌、肺癌、膵臓癌、胃癌、悪性リンパ腫、糖尿病、高血圧、創傷、靭帯損傷、骨折、低温火傷、ニキビ、飛蚊症、辱創、蕁麻疹からなる群から選択される疾患に罹患した対象を治療又は予防するための医薬又は動物薬として使用されるものである。
　本発明の他の実施形態によれば、このような免疫増強組成物において、この免疫増強組成物は、食品若しくは飼料として用いられるものである。
　本発明の第二の主要な観点によれば、自然免疫を刺激することによって対象が有する免疫を増強させる免疫増強組成物を製造する方法であって、バシラスｓｐ．（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｐ．）（ＦＥＲＭ　ＢＰ－１１２０９）、リシニバシラス　フシフォルミス（Ｌｙｓｉｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ　ｆｕｓｉｆｏｒｍｉｓ）（ＦＥＲＭ　ＢＰ－１１２０６）、バシラス　ソノレンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｏｎｏｒｅｎｓｉｓ）、リシニバシラスｓｐ．（Ｌｙｓｉｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｐ．）（ＦＥＲＭ　ＢＰ－１１２０７）、及びコマモナスｓｐ．（Ｃｏｍａｍｏｎａｓ　ｓｐ．）（ＦＥＲＭ　ＢＰ－１１２０８）から成るＭＲＥ共生菌群から選択される１若しくはそれ以上の菌類を用意する工程と、前記用意された１若しくはそれ以上の菌類を分解する工程とを有することを特徴とする、方法が提供される。
　また、本発明の一実施形態によれば、このような方法において、前記分解する工程は、前記用意された１若しくはそれ以上の菌類を生育に適した培養条件下で培養し、得られた培養液を飢餓状態におき、エアレーションを行うことによって行われるものである。
　本発明の第三の主要な観点によれば、自然免疫に関連する疾患に罹患した哺乳動物を治療若しくは予防する方法であって、バシラスｓｐ．（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｐ．）（ＦＥＲＭ　ＢＰ－１１２０９）、リシニバシラス　フシフォルミス（Ｌｙｓｉｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ　ｆｕｓｉｆｏｒｍｉｓ）（ＦＥＲＭ　ＢＰ－１１２０６）、バシラス　ソノレンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｏｎｏｒｅｎｓｉｓ）、リシニバシラスｓｐ．（Ｌｙｓｉｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｐ．）（ＦＥＲＭ　ＢＰ－１１２０７）、及びコマモナスｓｐ．（Ｃｏｍａｍｏｎａｓ　ｓｐ．）（ＦＥＲＭ　ＢＰ－１１２０８）から成るＭＲＥ共生菌群から選択される１若しくはそれ以上の菌類を分解することによって生じる免疫賦活物質を有効成分として有する免疫増強組成物の治療上有効な量を用意する工程と、前記用意した免疫増強組成物の治療上有効な量を前記哺乳動物に投与する工程とを有することを特徴とする、方法が提供される。
　また、本発明の一実施形態によれば、このような方法において、前記哺乳動物はヒトである。
　また、本発明の他の実施形態によれば、このような方法において、前記投与する工程は経口的に行われるものである。
　また、本発明の他の実施形態によれば、このような方法において、前記投与する工程は非経口的に行われるものである。
　この場合、前記非経口的に行われる投与する工程は、血管内投与、組織周囲および組織内注射、皮下注射、点眼投与、点鼻投与、経皮的投与、粘膜投与から選択されるものであることが好ましい。
　さらに別の本発明の実施形態によれば、このような方法において、前記自然免疫に関連する疾患は、顎関節炎、潰瘍性大腸炎、アトピー性皮膚炎、アレルギー性鼻炎を含むアレルギー疾患又は自己免疫疾患、日和見感染菌、ＨＩＶ、ＨＣＶ、及びＨＰＶを含む病原性細菌又は病原性ウイルス関連疾患、肝臓癌、前立腺癌、大腸癌、直腸癌、肺癌、膵臓癌、胃癌、悪性リンパ腫、糖尿病、高血圧、創傷、靭帯損傷、骨折、低温火傷、ニキビ、飛蚊症、辱創、蕁麻疹からなる群から選択されることができる。
　なお、上記した以外の本発明の特徴及び顕著な作用・効果は、次の発明の実施形態の項及び図面を参照することで、当業者にとって明確となる。
図１は、ナイーブＴ細胞がＴｈ１７、Ｔｈ１、Ｔｈ２、Ｔｒｅｇに分化していくプロセスを示した概略図である。 図２は、ヒトの血液を使ったＩＬ－２１の産生試験のグラフである。Ａ～Ｅの５人の無刺激（Ｃｏｎｔｒｏｌ）とＭＲＥ飲料６％希釈液を添加した場合のＩＬ－２１の産生濃度を比較している。 図３は、ヒトの血液を使ったＩＦＮ－αの産生試験のグラフである。Ａ～Ｄの４人の無刺激（Ｃｏｎｔｒｏｌ）とＭＲＥ飲料６％希釈液を添加した場合のＩＦＮ－αの産生濃度を比較している。 図４は、マクロファージ単独でのＴＮＦ－α産生試験のグラフである。無刺激（Ｃｏｎｔｏｌ）、ＬＰＳ（エンドトキシン）とＭＲＥ６％希釈液をマクロファージに添加した場合のＴＮＦ－αの産生濃度を比較している。 図５は、ヒトの血液を使ったＩＦＮ－γの産生試験のグラフである。Ａ～Ｄの４人の無刺激（Ｃｏｎｔｒｏｌ）とＭＲＥ飲料６％希釈液を添加した場合のＩＦＮ－γの産生濃度を比較している。
　上述したように、本発明によれば、ＭＲＥ共生菌群の菌体分解で生じる低分子の免疫賦活物質を利用して自然免疫活性を含む免疫機能を効果的に増強させる免疫増強組成物を提供することができる。
　ここで、前記ＭＲＥ共生菌群は、バシラスｓｐ．（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｐ．）（ＦＥＲＭ　ＢＰ－１１２０９）、リシニバシラス　フシフォルミス（Ｌｙｓｉｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ　ｆｕｓｉｆｏｒｍｉｓ）（ＦＥＲＭ　ＢＰ－１１２０６）、バシラス　ソノレンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｏｎｏｒｅｎｓｉｓ）、リシニバシラスｓｐ．（Ｌｙｓｉｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｐ．）（ＦＥＲＭ　ＢＰ－１１２０７）、及びコマモナスｓｐ．（Ｃｏｍａｍｏｎａｓ　ｓｐ．）（ＦＥＲＭ　ＢＰ－１１２０８）から成るものであり、いずれも好気性の細菌類である。
　また、本発明において使用される「低分子」とは、細胞膜を通過し細胞内部に影響を与えることができる分子量を持つ分子を意味するものである。
　さらに詳しくは、本発明によれば、好気性グラム陽性菌群と好気性グラム陰性菌群とからなるＭＲＥ共生菌群をリソゾーム酵素群またはリソゾーム類似酵素群により菌体分解することによって、低分子ペプチド、糖鎖、糖脂質、低分子核酸分解物などを含む菌体分解生成物からなる細胞膜透過可能な低分子の免疫賦活物質を得ることができる。
　この免疫賦活物質は、細胞膜を透過可能であるため細胞膜表面に存在するＴＬＲ受容体群ばかりでなく、エンドゾームや食包に存在する内部のＴＬＲ受容体群、そして細胞深部に存在する細菌感受性のＮＬＲ受容体群やウイルス感受性のＲＬＲ受容体などにも到達し、深みのある立体的なリガンド刺激を自然免疫応答細胞に与えることになる。
　そして、このＭＲＥ共生菌群の菌体分解で得られた免疫賦活物質は、そのほぼ９９％が親水性の分子量３，０００以下の物質であり、ＭＤＰ類似物質を含むオリゴペプチドやオリゴ糖鎖および一本鎖ＲＮＡなどの成分から構成され、いわゆるプロテアーゼなどの一般的な消化酵素では得られない細胞毒性のない低分子リガンド成分となっている。そのため、このＭＲＥ共生菌群から得られた免疫増強組成物は、生体内においてリガンドとして機能することができる。また、複数の混在した菌から得られたリガンドであるため多様であり自然免疫受容体は様々なパターンの認識刺激を同時に受けることになる。これが、ＭＲＥ共生菌群から得られた低分子の免疫増強組成物の特徴である。
　なお、以下に説明する本願発明に係る実施形態および実施例においては、上記のようなＭＲＥ共生菌群から得られた「免疫増強組成物」を、便宜上、「ＭＲＥ複合リガンド」と呼ぶことがあるが、いずれも同意若しくは同義である。
　また、本願発明において使用される「リガンド」とは、免疫受容体などに特異的に結合することで受容体の活性化を起こす物質をいい、複合リガンドとは、複数のリガンドの混合物または結合物をいうものとする。また、アジュバンドとして働くことも「リガンド」に含まれる。
　本願発明に係るＭＲＥ複合リガンド（免疫増強組成物、以下同）は、細胞内外の自然免疫受容体を刺激してマクロファージ、樹状細胞、クッパー細胞、ミクログリア細胞、ランゲルハンス細胞、ナチュラルキラー細胞、ナチュラルキラーＴ細胞などの自然免疫系の免疫細胞のおよび粘膜や皮膚の上皮細胞、繊維芽細胞、腸管に存在するパ－ネット細胞などを活性化させることができる。
　また、この活性化によりＩ型のインターフェロンが産生され、このインターフェロンの放出により近隣細胞から抗菌、抗ウイルス物質が一斉に産生される。
　さらに、本願発明に係るＭＲＥ複合リガンドによる自然免疫系の免疫細胞の活性化によって、インターロイキンなどの物質が血液やリンパ液の中に分泌する。これにより、リンパ球であるＴ細胞を、抗菌力、抗ウイルス力、抗癌力を増強するＴｈ１およびＴＨ１７という状態へ分化し活発化させることができる。
　そして、これらの一連の免疫活性化プロセスに引き続き、炎症抑制、組織修復のプロセスを時系列的に推し進めることとなる。特に、本願発明に係るＭＲＥ複合リガンドは、ＴＨ１７等から、自己免疫を抑制する機能を有するＩＬ－２１を産生することができる。
　本発明は、このように、抗菌、抗ウイルス、抗癌、抗炎症効果とそれに引き続く自己免疫抑制効果を有する新規な低分子免疫賦活物質を有する免疫増強組成物を提供することができ、これにより、上述した本願発明に係る課題を解決するものである。
　ここで、本発明を具体的に説明すると、本願発明は、上述したように、高濃度培養することなく菌体分解して十分な効果を発揮する優れた免疫賦活物質を生成するＭＲＥ共生菌群という新規の微生物共生菌群を発見し、それを利用した免疫増強組成物を提供するものである。そして、このＭＲＥ共生菌群は、好気性グラム陽性菌および好気性グラム陰性菌からなる５種類の菌から構成されている。これらの菌群は単なる自然に存在する菌の混合物ではなく、様々な土壌菌と海産物に付着した菌を長期間培養し続けた結果、当初の菌の激しい生存競争を経て、その競争の中で互いの役割分担を見出し、さらに菌の変異または進化に伴って安定的に変化し出現した個性的な５種類の菌から成る共生菌群である。
　このＭＲＥ共生菌を構成する５種類の菌群は、好気性グラム陽性菌であるバシラスｓｐ．（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｐ．）（受託番号ＦＥＲＭ　ＢＰ－１１２０９、識別番号ＭＫ－００５）、リシニバシラス　フシフォルミス（Ｌｙｓｉｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ　ｆｕｓｉｆｏｒｍｉｓ）（受託番号ＦＥＲＭ　ＢＰ－１１２０６、識別番号ＭＫ－００１）、バシラス　ソノレンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｏｎｏｒｅｎｓｉｓ）（識別番号ＭＫ－００４）、リシニバシラスｓｐ．（Ｌｙｓｉｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｐ．）（受託番号ＦＥＲＭ　ＢＰ－１１２０７、識別番号ＭＫ－００２）、及び好気性グラム陰性菌であるコマモナスｓｐ．（Ｃｏｍａｍｏｎａｓ　ｓｐ．）（受託番号ＦＥＲＭ　ＢＰ－１１２０８、識別番号ＭＫ－００３）から成るものである。
　ここで、受託番号ＦＥＲＭ　ＢＰ－１１２０６（平成２０年３月１９日に寄託された受託番号ＦＥＲＭ　Ｐ－２１５４８より移管）、受託番号ＦＥＲＭ　ＢＰ－１１２０７（平成２０年３月１９日に寄託された受託番号ＦＥＲＭ　Ｐ－２１５４９より移管）、受託番号ＦＥＲＭ　ＢＰ－１１２０８（平成２０年３月１９日に寄託された受託番号ＦＥＲＭ　Ｐ－２１５５０より移管）、受託番号ＦＥＲＭ　ＢＰ－１１２０９（平成２１年２月２日に寄託された受託番号ＦＥＲＭ　Ｐ－２１７６０より移管）は、独立法人産業総合技術研究所の生物寄託センターに寄託されている菌である。
　続いて、本願発明における「共生菌群」の特徴について説明する。複数の菌を混合して培養すると周知のように一時的に不安定な状況が生まれる。発酵で利用される麹菌と酵母菌や枯草菌と他のバシラス菌のように栄養の棲み分けも起こるが、一方では激しい有機物の争奪戦やフリーラジカルによる互いの攻撃、そして富栄養価下でも一定の割合で起こる内胞子化に伴うバシラス菌によるペプチド型抗生物質による攻撃や近年解明された酵母菌による抗生物質（ペプチド）による反撃など激しい生存競争が繰り広げられる。そのような激しい生存競争の時期を経て、栄養に対する棲み分けや抗生物質に対する耐性の獲得そしてフリーラジカルの除去能力を持つ短鎖ペプチドや分子シャペロンの放出による酵素変性に対する防御などに加え、まったく異なる種の菌同士で互いの生存や成長を助ける低分子ヘプチドを交換しあうことまで知られている。最終的には、プラスミドを含む遺伝子の交換によって互いの能力を交換することで微生物群の全体の共存と安定性を図ろうとする。
　また、本願発明に係るＭＲＥ共生菌群は、それらが生育可能な環境下であれば如何なる条件下においても生育されることができ、具体的には、分子生物学分野において通常用いられる培養条件で生育可能である。例えば、後述するように、培養曝気槽において、エアレーション（曝気）を行いつつ、魚粉１０ｋｇ、米ぬか１０ｋｇ、油カス５ｋｇ、肉汁１ｋｇの栄養源に加え、さらに硫酸マグネシュウム等のミネラル等の存在下において、ＰＨ６．０～６．８、培養温度２５℃～３５℃、及び適度なエアレーションによって培養することができる。好ましくは、前記栄養源は、魚粉５ｋｇ、米ぬか５ｋｇ、油カス２．５ｋｇ、肉汁０．５ｋｇである。なお、本願発明に係るＭＲＥ共生菌群の培養条件は、これらの設定条件に限定されるものではない。
　本願発明に係るＭＲＥ共生菌群では、遺伝子交換を活発にする段階まで進行し、Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｐ．のように菌体融合に近い不思議な菌体にまで変異、進化している。
　ここでＭＲＥ共生菌を構成する個々の菌について説明する。　
　ＭＲＥ共生菌を構成するそれぞれの菌の１６ＳｒＤＮＡは、次の通りである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000001
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000002
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000003
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000004
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　本願発明において、これらＭＲＥ共生菌の培養は、公知の好気性Ｂａｃｉｌｌｕｓ菌と同じ方法で培養できる。一般的な寒天培地（Ｎｕｔｒｉｅｎｔ　Ａｇａ）の培養プレートでも曝気した液体容器の中でも可能である。
　［菌体分解の方法］
　ここで、本願発明に係るＭＲＥ共生菌群を菌体分解して、低分子のＭＲＥ複合リガンドを得る２つの方法を以下に説明する。
　第一の方法は、ＭＲＥ共生菌群をリソゾーム酵素群で分解して低分子複合リガンドを得る方法である。
　第二の方法は、ＭＲＥ共生菌群のスポア形成過程で出現する原始的なリソゾーム相同の母細胞融解酵素群で分解して低分子複合リガンドを得る方法である。
　これらの方法を取る理由は、通常の消化酵素や普通のプロテアーゼなどの分解酵素では、細胞膜を透過するのに必要な分子量のリガンドが得られないためである。
　これに対して、動物のリソゾームや植物の液胞や果実などで分泌される酵素群は、細胞の内のオルガネラや高分子物質を一括してバルクで低分子まで分解する能力を持っている。
リソゾーム酵素群は、細胞内で老朽化したオルガネラを分解して若返らせるためのオートファジーや癌細胞やウイルス感染細胞がアポトーシスする最終段階で出現する酵素群で、特に細胞内に侵入してきた細菌をエンドゾーム内で分解する際に活躍することが知られている。
　その相同酵素群は、動物、植物、微生物のオートファジーやアポトーシスの過程で顔を出すことが知られている。植物ではプロセシング酵素と呼ばれ、液胞ないまたは果実の形成過程で出現する酵素群でもある。これらの酵素群により菌体は細胞膜を透過できるほど小さい低分子に分解されることになる。
　本願発明に係るリソゾーム酵素群としては、核酸分解酵素であるリボヌクレアーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ等、コラーゲン分解酵素であるカテプシンＬ、アスパラギン酸プロテアーゼであるカテプシンＤ及びカテプシンＥ、システインプロテアーゼであるカテプシンＫ、カテプシンＢ、及びカテプシンＳ、セリンプロテアーゼであるカテプシンＧ、アミノペプチターゼであるカテプシンＨなどの強力で多機能な能力をもつ蛋白質分解酵素、さらにアリールスルファターゼ、βグルクロシダーゼ、エステラーゼ、酸性フォスファターゼなどに加え、糖鎖分解酵素では、スフィンゴ脂質を分解するαガラクトシターゼ、βヘキソサミニダーゼＡおよびＢ、アリルスルファダーゼＡ、ガラクトシトルセラミダーゼ、グルコシルセラミダーゼ、酸性スフィンゴミエリナーゼ、酸性セラミダ－ゼなど、糖蛋白を分解するαフコシダーゼ、αおよびβマンノシダーゼ、ノイラミニダーゼ、アスーパールチルグルコサミニダーゼ、α－Ｎ－アセチルガラクトサミニダーゼなど、ムコ多糖類を分解するαイズロニダーゼ、イズロネート－スルファダーゼ、ヘパランＮスルファターゼ、α－Ｎ－アセチルグルコサミニダーゼ、６スルファターゼ、ガラクトース６－スルファターゼ、βガラクトシターゼ、アリルスルファダーゼＢ、βグルクロニダーゼなど、並びに、酸性リパーゼのようなコレステリルエステルや脂肪分解の酵素、さらに、重要なものに病原性の原核微生物などの細胞壁を形成するペプチドグリカン層を分解するムラミターゼ、ムコペプチドヒドロラーゼなどを含む５０以上の分解酵素を使用することができる。また、カテプシンＫに類似した青パパイヤのリソゾーム相同分解酵素であるパパインなども利用可能である。
　これらのリソゾーム酵素群は、弱酸性（ＰＨ６．３～ＰＨ６．８）で働き、通常の消化酵素の活動が抑制される高温領域（３８℃～４２℃）で活性を高める性質がある。さらに、その中には非常に分解力の高いものが多く通常の消化酵素の５，０００倍から１万倍の分解力をもつものまで存在する。
　本願発明に係るＭＲＥ共生菌群からＭＲＥ複合リガンドを得る第一の方法は、これらのリソゾーム酵素群の中から細胞壁分解酵素とカテプシン類および核酸分解酵素を組み合わせて使う方法である。
　細胞壁分解酵素としては、ムラミターゼ、ムコペプチドヒドロラーゼなどが使用され、カテプシンとしては、カテプシンＢ、カテプシンＤ、カテプシンＬおよびカテプシンＫまたはハパインなどが、核酸分解酵素としては、リボヌクレアーゼ、デオキシリボヌクレアーゼなどが使用される。これらの酵素は、ＤＮＡやプラスミドへの遺伝子組み込みによっても作ることが可能であるが、魚類（ウナギを含む）を無菌の状態で高温（３８℃～４５℃）、湿潤な環境で自己分解させることで得ることもできる。ハパインなどの果実が熟されるときに産生されるリソゾーム酵素群を使用することによって得ることもできる。
　しかし、この第一の方法は、様々な酵素のブレンド割合を変化させて菌体分解を調整できるという長所がある反面、現状では酵素が高価なうえ、扱いが難しく、特別な装置を必要とするものもあるので、コスト高になるという欠点がある。
　ＭＲＥ共生菌群から低分子複合リガンドを得る第二の方法は、スポア形成過程で放出される原始的な母細胞融解酵素をそのまま利用する方法である。酵素配合の割合は変えることはできないが、極めて低コストでの大量生産が可能で優れたリガンドが得られる。この方法は、ＭＲＥ共生菌群のスポア化に伴って放出される母細胞融解酵素群を菌体分解に利用して低分子複合リガンドを得る方法である。
　なお、本願発明において用いられる「母細胞融解酵素群」又は「母細胞融解酵素」とは、菌類細胞のスポア形成過程において産生されるリソゾーム相同酵素群のことを指すものである。
　本願発明に係る低分子のＭＲＥ複合リガンドの製造は、第一段階ではＭＲＥ共生菌群を混合培養液に投入し、魚粉、米ぬか、油カス、肉汁などおよび硫酸マグネシュウムなどのミネラルを菌の栄養物として、培養ＰＨ６．０～６．８、培養温度２５℃～３５℃で、充分なエアレーション（曝気：溶存酸素濃度０．１ｍｇ／Ｌ～１．０ｍｇ／Ｌ）を加えた培養条件下で培養する。ＭＲＥ菌群の増殖と安定化を待って、一切の栄養を絶って飢餓状態下に置き、エアレーション（曝気）を続行すると窒素成分の枯渇をトリガーにスポア化（内胞子化）が起こる。この場合、スポア化する前の栄養細胞を別の曝気槽に移すとさらに品質の安定したものが得られる。このようにして、ＭＲＥ共生菌の菌体を低分子まで分解することが可能になる。
　本願発明に係る菌体分解の過程をさらに詳しく述べると、菌相互の共生関係を構築し、安定した菌の共生体の栄養細胞状態にある混合菌をその栄養細胞から分泌された消化酵素群を含むこの培養液と共に別の曝気培養槽に分別する。この曝気培養槽でシリカ以外の栄養を一切与えずエアレーションを続行する。共生状態にあるＭＲＥ菌群のオートファゴゾーム相同の母細胞融解が始まりリソゾーム相同の母細胞融解酵素群を放出しつつ菌の母細胞はバルク分解し消滅して行く。スポア化が完了したことを確認した上でエアレーション（酸素供給）を止めるとスポア（胞子）は一斉に沈殿を始め透明な上澄み液を得る。こうして得られた上澄み液を０．２μｍのメンブランで加圧ろ過し残存スポアを除去した後、さらに０．０２μｍのフィルターで微小スポアや不純物を除去する。こうして、ＭＲＥ共生菌体群のスポア形成の際の母細胞融解酵素群を利用することにより効果的な低分子のＭＲＥ複合リガンドを得ることができる。また、分別プロセスを工夫することで連続生産も可能になる。
　このようにＭＲＥ共生菌では、高濃度生産しなくても十分に有効なＭＲＥ複合リガンドを得ることができるが、高濃度生産をすることもまた可能である。その場合、栄養細胞化とスポア化を繰り返すと、栄養細胞が複合リガンドを吸収してしまって効率が悪くなることと抗生物質の産生が増えるため、高密度培養した後に一気にスポア化することが大切である。スポア化に際してシリカの栄養を与えることでさらに効率よくなることはすでに公知である。
　一気にスポア化したものは、抗生物質もほとんど含まれず検出限界以下となった。
　このようにして得られた低分子複合リガンドは、次のような分子量分布を持つオリゴペプチド、一本鎖のＲＮＡ低分子分解物、オリゴ糖鎖や糖脂質、ＭＤＰ（ムラミルジペプチド）類似物質およびフランジェリン分解物などが含まれている。
　ＭＲＥ複合リガンドの分子量分布を以下に示すと表２のようになる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　このように本発明のＭＲＥ複合リガンドは、その９８％以上がオリゴペプチド、オリゴ糖鎖、オリゴレベルの核酸の他、オリゴ領域の糖ペプチドや糖脂質を含む１０００以下の親水性の低分子物質で構成されている。このようにして得られた低分子複合リガンドは、エンドトキシンのような毒性を持たず、また、低分子であるので抗体による直接の攻撃を受けない。
　また、ＭＲＥ複合リガンドは、ＬＰＳやペプチドグリカンの存在を検出できるエンドトキシン検査によっても、検出限界以下との結果が出ており、ＬＰＳやペプチドグリカンが含まれていないことが証明されている。また、マクロファージやナチュラルキラー細胞などの活性試験をするために行う細胞障害試験でも浸透圧によって破壊される限界濃度まで細胞障害がないことが分かっている。また、うさぎを使用した急性毒性試験もクリアしている。
　このように低分子化することで、毒性の極めて少ないリガンドが得られるというメリットのほかに、腸管からの吸収や粘膜からの吸収できるので、飲料として高効率に摂取できるという大切なメリットもある。親水性でかつ分子量がオリゴ領域なので理論的には皮膚からの吸収も可能である。
　つぎに、本発明のＭＲＥ複合リガンドによる自然免疫活性とそれに続く一連の免疫プロセス活性を明らかにするために、ヒトのマクロファージを使用したＤＮＡマイクロアレイによる網羅的なＤＮＡ動態解析とリアルタイムＰＣＲによる確認試験を実施した。
　また、ヒトの血液の免疫細胞群（マクロファージ、樹状細胞、ランゲルハンス細胞、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、Ｔ細胞群、Ｂ細胞群など）を分離して、ＭＲＥ複合リガンドによる各サイトカインの産生量について抗体を利用して調べた。
　使用したＭＲＥ複合リガンド含有原液は、ＭＲＥ複合リガンド含有低分子成分を８０μｇ／ｍｌ含有している。
　予備試験として、ＴＮＦ－αの産生量をリアルタイムＰＣＲによって測定し、表３のように通常の９０．４６倍の産生という結果を得た。ここで、Ｍｅｄは無刺激を意味する。ＬＰＳｐは、エンドトキシンで刺激の場合。ＭＲＥ１／１０はＭＲＥ複合リガンド含有原液を１０倍希釈したもの、以下１００倍希釈、１０００倍希釈したものである。比較のためのＬＰＳｐの濃度は１００ｎｇ／ｍｌである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　このようにマクロファージ単独ではＭＲＥ複合リガンド含有原液の１０倍希釈液による刺激によりＴＮＦ－αは、その産生量が平常の９０．４６倍に達し、比較のＬＳＰｓと比べても７．５倍産生している。このことはＭＲＥ複合リガンドが高いマクロファージ活性力があることを示している（図４参照）。
　一方、ＴＮＦ－αの産生力が高いからと言って、炎症を促進するということではないということに注意をする必要がある。この数値は、マクロファージ活性能力が高いことを示しているにすぎない。
　なぜなら、生命は炎症を起こす物質を発現しながら同時に僅かに炎症を抑制する物質を出すというように、常にバランスを取りつつ波のように免疫プロセスを進行させていくことが今回の網羅的なＤＮＡ動態解析により浮かび上がってきた。
　その一つの証拠に、表４に示すように、さまざまな免疫細胞を含むヒトの血液を使用したＭＲＥ複合リガンド含有原液による刺激ではＴＮＦ－αを産生することはなく、また、多くの臨床治験からも反対に抗炎症作用があることが確認されている。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　このことは、免疫のプロセス全体を通じてリガンド効果やアジュバンド効果を評価する必要があり、単にあるリガンドによってあるサイトカインが産生したから効くという単純な理屈は通用しないことを示している。
　ＭＲＥ複合リガンドでは、自然免疫活性とそれに引き続く抗ウイルス、抗菌、抗炎症、組織修復という免疫プロセスを活性化させ生体を正常化させることができる。いわば、画期的リガンドまたはアジュバンドと言えるものである。
　この自然免疫活性化からリンパ球免疫活性化、そして抗炎症、組織修復へのプロセスを時系列順にさらに詳細に説明することにする。
　Ａ．自然免疫受容体（ＴＬＲ、ＮＬＲ、ＲＬＲ）の活性化
　このＭＲＥ複合リガンドは、自然免疫の受容体であるＴＬＲ－２，ＴＬＲ－７，ＴＬＲ－８とＮＬＲ－２を含むＮＬＲ群が活性化させることが網羅的なＤＮＡ動態解析によって確認された。ＴＬＲ－２は、細胞表面に存在する自然免疫の受容体で、グラム陽性菌のペプチドグリカン、リボテイコ酸、リボ蛋白質、ウイルスの糖蛋白、真菌の多糖類などを感知する。ＭＲＥ複合リガンドでは、分子量１０００以下のＭＤＰ様のペプチドグリカン分解物が作用している。
　ＴＬＲ－７とＴＬＲ－８は、両方とも細胞のエンドゾームに存在して、一本鎖ＲＮＡを感知する受容体であるとともに、菌やウイルスが菌体分解された低分子物質を感知する受容体でもある。本発明のＭＲＥ低分子複合リガンドでは、分子量１０００以下の一本鎖ＲＮＡを検知していると思われる。そして、この事実は、本発明がＲＮＡウイルスに対する高いアジュバント効果が期待できることを意味している。
　また、ＮＬＲ－２を含むＮＬＲは、細胞内部に存在する原始的な受容体で、細菌やウイルスなどが低分子分解されたものを検知することができる。特に、ＮＬＲ－２は、マクロファージや樹状細胞、ランゲルハンス細胞、クッパー細胞などのＡＰＣ（抗原提示細胞）に特異的に発現している受容体である。ＭＲＥ低分子複合リガンドにより活性化されるこのＮＬＲ受容体群は、ＭＤＰ類似物質などの低分子リガンド類を検知することができ、これもまたアジュバントとしても非常に有効な働きをすることが期待できると言える。
　このように、本発明のＭＲＥ低分子複合リガンドは、細胞表面に存在する受容体、エンドゾームに存在する受容体、細胞内に存在する受容体と３つの自然免疫のセンサーによって立体的に感知されていることがわかる。
　Ｂ．マクロファージ活性とナチュラルキラー細胞活性化
　つぎに、ＭＲＥ複合リガンドにより動物の自然免疫の主役であるマクロファージ活性とナチュラルキラー細胞活性および好中球遊走を誘発するマクロファージからのＩＬ－８産生が確認された。好中球は自然免疫の食細胞の一つである。
　ここでＭＲＥ複合リガンドのマクロファージの活性化試験のデータを見ると、無刺激の培養液ではＮＯ産生能が０．４４６μＭであるのに対し、ＭＲＥ複合リガンド含有原液の１０倍希釈液ではＮＯ産生能２４．０５９μＭとなり、ＬＰＳｐの０．１ｎｇ／ｍｌ液による１８．７１２μＭより大きい値となっている。
　さらに重要なことに、表５に示すようにＬＰＳでは濃度が上がると生存細胞数は低下するのに対し、ＭＲＥ複合リガンドでは濃度が上がると生存細胞数が増加する点である。これはＭＲＥ複合リガンドとしての優れた点であり、アジュバンドとして利用するときにも免疫細胞の生存率を高めながら免疫増強するので有利であることを意味している。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
　このマクロファージの生存細胞試験は、マクロファージのプレート付着率をクリスタルバイオレットで染色し５７０ｎｍの吸光度を用いて生存細胞数の指標として測定をした。
　また、ナチュラルキラー細胞でも、後述するように、ヒトの血液を用いたＭＲＥ複合リガンド含有原液のＮＫ活性化試験で、平均１．７３倍（５６．２／Ｖｅｒｙ　Ｈｉｇｈ）という結果を得ている。
　Ｃ．自然免疫受容体刺激からそのパターンに従ったスウィッチングプロセス　
　リガンドやアジュバンドがＴＬＲ、ＮＬＲ、ＲＬＲなどの自然免疫受容体を刺激すると、細胞の活性化が誘導されると共にその多様なパターンに従って、「抗ウイルス物質産生プロセス」「炎症開始および遅延的炎症抑制プロセス（抗菌、抗癌、炎症修復プロセス）」「アポトーシスのプロセス」へと移行する３種類のプロセスへのスウィッチング（切り替え）が行われる。
　本発明に係るＭＲＥ複合リガンドが対象において作用すると、前者２つのプロセスが進行し、「アポトーシスのプロセス」が阻止されていることが網羅的ＤＮＡ動態解析であきらかになった。
　「アポトーシスへのプロセス」は、ＦＡＤＤがアポトーシスのトリガーとなって、カスパーゼ８酵素やカスパーゼ１０酵素が活性化し、実行部隊酵素であるカテプシンＤやカテプシンＢなどのアポトーシス分解酵素群を誘発する一連のアポトーシスを引き起こすプロセスである。
　本願発明においては、アポトーシスを誘導する遺伝子群のＡＰ１類の発現は通常レベルにあり、アポトーシスを抑制する遺伝子であるＪＵＮ（通常の６．７７４０９倍）が発現し、アポトーシスを引き起こすチトクロームＣがミトコンドリアから放出されないように防御している遺伝子ＳＯＤ２（通常の８．９９９６３倍）も発現してアポトーシスを阻止していることが確認された。
　Ｄ．自然免疫受容体刺激からＩ型インターフェロンの産生へのプロセス
　「抗ウイルス物質産生プロセス」は、自然免疫本来のプロセスの一つで、ＴＬＲ３、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８およびＲＧＲなどの刺激により、ＴＲＡＭおよびＴＲＩＦの発現が起こり、それに続いてＩＫＫの活性、ＩＲＡＫ３、ＩＲＡＫ７などの活性というように一連のプロセス活性が伝搬してゆき、その結果Ｉ型のＩＮＦ－α（現在１３種類知られている）とＩＮＦ－βが産生され細胞外に放出される。このプロセスは単細胞時代に作られた仕組みと考えられているが、ヒトなどではこれらのインターフェロンの放出によって上皮細胞や粘膜細胞など近隣細胞から抗ウイルス物質であるＩＳＧ（数百種類知られている）を一斉に放出させる。
　このプロセスは自然免疫本来の役割でもあり、刺激のパターンによって産生する抗ウイルス物質であるＩＳＧの組み合わせが異なってくることが知られている。例えばインフルエンザでは、ＩＦＩＴ１、Ｇ１Ｐ３、Ｇ１Ｐ２、ＯＡＳ１、Ｍ１Ｘ１、ＩＦＩＨ１、ＩＦＩＴ３、ＲＩＧ－Ｉ、ＧＢＰ１、ＬＡＭＰ３、ＩＲＦ７、ＩＳＧＦ３Ｇ、ＷＡＲＳ、ＰＳＭＢＳ、ＢＴＣ、ＳＯＣＳ１、ＳＥＲＰＩＮＧ１などの抗ウイルス物質を放出して、ウイルスの変異に対処した抗ウイルス効果を発揮している。ＭＲＥ複合リガンドでは、このプロセスの事前に活性化することにより、インフルエンザなどのウイルスを感染したときに即座に強力にＩ型インターフェロンを作り出すことが可能になり、抗ウイルス力を効果的に増強させる。つまりアジュバンド効果が極めて高いものとなる。
　ＭＲＥ複合リガンドによる自然免疫受容体刺激によって、ウイルスが存在しない状態で、実際にＩ型インターフェロンの産生が起こることを次のように確認した。
　表６は、ウイルス感染のない状態でＭＲＥ複合リガンドによってＩ型インターフェロンの遺伝子の発現がどのくらい増加するかについて網羅的ＤＮＡ動態解析を使って明らかにしたものである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
　このように、ＭＲＥ複合リガンドで、ＩＦＮ－αとＩＮＦ－βの有意な増加がみられている。
　後述するように、採血した新鮮なヒトの血液を使ったＭＲＥ複合リガンドによるＩ型インターフェロン産生の測定でも、ＩＮＦ－αの産生量がさらに多くなっている（図３参照）。
このようにＭＲＥ複合リガンドは、抗ウイルスのためのアジュバンドとしても副作用のない効果をもつと考えられる。
　ＭＲＥ複合リガンドによるマクロファージへの刺激により、表７のような抗菌物質の遺伝子が直接発現していた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
　このプロセスは解明されていないが、Ｔｈ１７細胞を経ないで直接抗菌物質を放出されるプロセスも同様に活性化されると思われる。
　これらのプロセスは、マクロファージの兄弟である樹状細胞、ミクログリア細胞、クッパー細胞、ランゲルハンス細胞、繊維化細胞の他、同じ自然免疫受容体を発現する上皮細胞やケラチノサイトおよび気管、消化管、尿管を含む各臓器に配置された自然免疫応答細胞の活性化も同様に起こることになる。
　Ｅ．炎症開始および遅延的炎症抑制プロセス＝抗菌、抗癌、炎症修復プロセス
このプロセスは、自然免疫の受容体刺激からＴ細胞を活性化させるインターロイキン類を産生するまでのプロセスで、つぎの２段階のプロセスからなっている。
　第１段階のプロセスでは、ＴＬＲ受容体の刺激によりＭＹＤ８８、ＩＲＡＫ１、ＩＲＡＫ４活性化、ＴＲＡＦ６などのプロセスを経てＮＦ－κＢからＩ－κＢを分離、ＮＦ－κＢを活性化させる。
　また、ＮＬＲ受容体では、リガンドの刺激を受けたＮＬＲ受容体がペアになって、ＲＩＣＫがＮＬＲのＣＡＲＤを介して結合する。するとＲＩＣＫにユビキチン化が起こり、ＴＡＫ１やＭＥＭＯなどの複合体がさらに結合して、ＩＫＫβを活性化しＮＦ－κＢからＩ－κＢを分離、ＮＦ－κＢを活性化させる。
　こうして活性化したＮＦ－κＢはＡＰ－１と共にＤＮＡに結合して働き、ＩＬ－１β、ＴＮＦ－α、ＩＬ－８を含むケモカインなどを産生する。そして第１段階の終わりに、第２段階のトリガー（引き金）であるＩκＢ－ζを産生することにより第２段階へ移行する。
　第２段階のプロセスでは、ＤＮＡ上で働くＮＦ－κＢ、ＡＰ－１にＩκＢ－ζが加わり、ＩＬ－１２ｐ４０およびＩＬ－６その他を産生し、Ｔリンパ球系の免疫を制御することになる。
　表８は、ヒトマクロファージを使ってＭＲＥ複合リガンドで刺激した場合の網羅的ＤＮＡ動態解析による第一段階プロセスの遺伝子発現の結果を示したものである。この結果は、リアルタイムＰＣＲ分析の結果とも一致しているものであった。
　ＭＲＥ複合リガンドによる第１段階活性化のプロセスでは、ＩＬ－１βとＴＮＦ－α、そしてＩＬ－８を含むケモカインの産生が盛んに行われている瞬間を捉えたものであり、炎症プロセスに遅延して始まるＮＦ－κＢの働きを抑制する炎症抑制遺伝子群が活発化の勢いが増して、ＮＦ－κＢの遺伝子発現が低下してきた状況を表している。
　そして、ＴＮＡ－αなどによる自らの細胞のアポトーシス誘導をブロックするためにＪＵＮやＳＯＤ２が発現し、ＳＯＣＳ３によって自然免疫受容体からの必要以上の刺激を受けて炎症を過剰に進行させないようにしている。
　この制御系がうまく機能しているために、過剰なＮＦ－κＢをユビキチン化してプロテアゾームで分解する働きのあるＰＤＬＩＭ２は稼働する必要はなく１．０７２１３３７と通常の値であった。
　そして、この瞬間では第１段階から第２段階へ移行する鍵をにぎるＩκＢ－ζが急激に上昇しているタイミングを捉えている。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
　遅延型炎症抑制
　第１段階に遅延して炎症を抑える遅延型炎症抑制遺伝子群が発現する。これらの遺伝子群はＮＦ－κＢとＡＰ－１の働きを抑制する。すなわち、炎症プロセスに遅延して炎症抑制プロセスが進行することが、今回のＭＲＥ複合リガンドによる解析で明らかになった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000009
　ここで、表９に示すように、ＴＮＦＡＩＰ６はＮＦ－κＢを強く抑制する遺伝子でＴＮＦ－α産生を制御する強い抗炎症作用をもっていて３７．０４２４倍という高い値で発現している。ＴＮＦＡＩＰ３もまた、ＮＦ－κＢとＡＰ－１の発現を抑制する遺伝子で、これも１８．８３０８倍と高い値である。その他にＪＵＮ、ＳＯＤ２、ＳＯＣＳ３が働いていることはすでに述べた通りである。
　第２段階目のプロセスはＩ－κＢ－ζがトリガー（引き金）になって引き起こされる。ＮＦ－κＢとＡＰ－１は数多くすでに核酸と結合して働いているので、遅延炎症抑制遺伝子群が活発化しＮＦ－κＢとＡＰ－１の新たな供給は減少していく。
　新しく作り出されたＩκＢ－ζがトリガーとなって、すでに核酸と結合しているＮＦ－κＢと結合し、同じくすでに核酸と結合しているＡＰ－１と共にＴ細胞を制御する４つのグループのサイトカイン群を産生、分泌する。マクロファージなどでは、Ｍ１活性では、「ＩＬ－１２ｐ４０」、「ＩＬ－６およびＩＬ－２３ｐ１９」をＭ２活性では「ＩＬ－４」、「ＴＧＦ－βおよびＩＬ－２」などのサイトカインを産生する。続いて、細胞内に常に作られているｐ３５と結合して、ＩＬ－１２ｐ４０はＩＬ－１２へ、ＩＬ－２３ｐ１９はＩＬ－２３になる。
　表１０は、ＭＲＥ複合リガンド刺激による第２段階開始の遺伝子発現の様子を現わしている。この解析の瞬間ではＩ－κＢ－ζトリガーが通常の２０．０１１５倍と急増しており、ＮＦ－κＢとＡＰ－１はその産生が炎症抑制の遺伝子群の発現強化により低下している状態である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000010
　しかし、発現を低下させているＮＦ－κＢやＡＰ－１はすでに核酸（ＤＮＡ）に結合しているので、ＩκＢ－ζの発現が急上昇することによりＩＬ－６、ＩＬ－２３ｐ１９、ＩＬ－１２ｐ４０の産生を開始しており、通常の１．４倍～１．８倍の値となっていて上昇し始めている。
このことから分かるように、ＭＲＥ複合リガンドでは、明らかにＭ１活性を発現している。
このことは、ＭＲＥ複合リガンドを使用した人の血液からのＩＬ－２３産生が通常の２．１１倍になる後述する事実からも裏付けられている。
　このように、ＭＲＥ複合リガンドは、マクロファージとその兄弟であるミクログリア、樹状細胞、ランゲルハンス細胞、クッパー細胞などをＭ１活性に導き、抗菌作用、抗ウイルス作用の効果を発揮する。また、アポトーシスした癌細胞の残骸に対する貪食活動を活発にさせる。
　通常、Ｍ１活性による抗菌作用、抗ウイルス作用の結果、菌体やウイルスが低分子分解を受け除去されると、マクロファージのＭ１活性は菌やウイルスの低分子分解物をシグナルとしてＭ２活性へ切り替わると考えられている。Ｍ２活性は炎症を抑制し、繊維牙細胞を活性化して炎症などで破壊された組織を修復する後処理プロセスである。実施例をみると、このＭ２においてもＭＲＥ複合リガンドが重要な役割を果たしていることを示唆している。
　また、後述する発見により、ＭＲＥ複合リガンドは従来の抗菌、抗ウイルス作用、又は抗癌作用の発現をするＭ１活性のプロセスとは別に、アレルギー疾患や自己免疫疾患を含む炎症性疾患に対して抗炎症作用を持つプロセスを同時進行させるという優れた性質を持つことが明らかになった。
　Ｆ．ＭＲＥ複合リガンドによるＴ細胞の分化とその後のプロセス活性
　活性化されたマクロファージやその兄弟から放出された４組のサイトカイン群は、図１に示すように、Ｔｈ１７、Ｔｒｅｇ、Ｔｈ１、Ｔｈ２というＴ細胞の４つの状態をコントロールする。
　マクロファージのＭ１活性では、Ｔｈ１７およびＴｈ１を誘導し、マクロファージのＭ２活性では、ＴｒｅｇまたはＴｈ２を誘導する。なお、本発明に係るＭＲＥ複合リガンドは、Ｔｈ１７とＴｒｅｇとを誘導し、Ｔｈ１とＴｈ２との誘導を抑制する性質を有するものであることが判明している。
　自然免疫の受容体刺激による一連のフロセスを経て産生されたサイトカイン群の中のＩＬ－１２ｐ４０とＩＬ－２３ｐ１９は、細胞内に常在しているｐ３５と結合して、それぞれＩＬ－１２とＩＬ－２３となる。
　これら４組のサイトカイン群は、Ｔ細胞を次のようにコントロールする（図１参照）。
　Ｍ１活性では、
１） ＩＬ－１２は、ナイーブＴ細胞（ＣＤ４）をＴｈ１へ分化、活性化させる。
２） ＩＬ－６はナイーブＴ細胞（ＣＤ４）をＴｈ１７へ分化させ、ＩＬ－２３とＩＬ－１βは、Ｔｈ１７を活性化させる。
　Ｍ２活性では、
３） ＩＬ－４は、ナイーブＴ細胞（ＣＤ４）をＴｈ２へ分化、活性化させる。
４） ＴＧＦ－βは、ナイーブＴ細胞（ＣＤ４）をＴｒｅｇへ分化させ、ＩＬ－２はＴｒｅｇを活性化させる。
　そして、Ｍ１活性に引き続くＴｈ１とＴｈ１７のプロセスは抗菌、抗ウイルス、抗癌、アレルギー抑制などの働きがあり、Ｍ２活性に引き続くＴｈ２はアレルギー反応のプロセスへ、Ｔｒｅｇのプロセスには、炎症抑制と組織修復と自己免疫抑制（免疫寛容）の働きがある。
　ここで、Ｔｈ１は、ＩＬ－１２による作用によりＩＮＦγを産生。マクロファージ、ナチュラルキラー細胞、ナチュラルキラーＴ細胞などの貪食作用や遊走性を活性化。ＮＯなどのフリーラジカルを産生して細胞内殺菌力を強化。ＣＤ８－Ｔ細胞であるＣＴＬ（キラーＴ細胞）活性を高めて癌細胞やウイルス内在細胞を殺傷する細胞性免疫を増大することにより、細胞内に寄生する細菌やウイルスを排除するプロセスを誘導する。主に抗体に非依存的な抗菌、抗ウイルスプロセスである。細胞殺傷性自己免疫疾患や遅延型アレルギーを起こすプロセスでもある。
　Ｔｈ２は、ＩＬ－４、ＩＬ－１３を産生し、ＣＤ４－Ｔ細胞を介してＢ細胞からＩｇＥ抗体を放出させる。ＩｇＥではマスト細胞や好塩基球からヒスタミンを分泌することにより寄生虫などの大型の生物を排除するために働いている。また、ＩＬ－５を産生することによって好酸球からＥＰＯを放出し鼻づまりなどの遅延性のアレルギー疾患誘発することでも知られている。
　Ｔｈ１７は、ＩＬ－１やＩＬ－２３の作用によりＩＬ－１７Ａ、ＩＬ－１７Ｆ、ＩＬ－２２、ＩＬ－２１などを産生。液性免疫を増大することにより、抗体産生を活発にして細胞外細菌や真菌を排除する。さらに、好中球の貪食作用を増進し、主に上皮細胞、好中球からディフェンシンなどの抗菌物質を放出させ、また、細胞外マトリックスの再構築を通して上皮バリアを強化する。最近ＩＬ－２１の産生が確認され、新たなプロセスが解明されつつある（非特許文献３参照）。
　Ｔｒｅｇは、腸管免疫を特徴付けるものであり、ＴＧＦ－βによって誘導され、ＩＬ－１０を産生し、炎症抑制や免疫寛容を誘導するプロセスと考えられている。特に腸内細菌の多い腸管は、通常はリンパ球免疫が暴走しないようにＴｒｅｇ状態に保たれており、その防御力を粘膜の上皮細胞やパーネット細胞の自然免疫に委ねるとともに、バイエル板を通して分泌性の抗体であるＩｇＡを腸管内に分泌させ腸内細菌をコントロールしている。また、Ｔｒｅｇは、アレルギーを起こすＴｈ１やＩｇＥを分泌するＢ細胞、そして自己免疫疾患を起こすＣＴＬ(キラーＴ細胞)をアポトーシスまたは抑制することで、炎症を抑えることでも知られている。
　ＭＲＥ複合リガンドでは、マクロファージのＭ１活性のプロセスから引き続いて、前表の結果に示されているようにＩＬ－２３ｐ１９とＩＬ－１２ｐ４０が増加しＩＬ－４は変化せずＴＧＦ－βはむしろ減少傾向にあることから、Ｔｈ１７とＴｈ１を活性化し、Ｔｈ２とＴｒｅｇは活性化しないことが示された。また、ＭＲＥ複合リガンドが潰瘍性大腸炎やクローン病などの炎症を抑制することから、実際の腸管においてＭＲＥ複合リガンドによるＴｒｅｇ正常化のプロセスもまた炎症抑制や免疫寛容に寄与しているものと考えられる。
　このことを明らかにするために、採取した人の血液を管理された条件下によりＭＲＥ複合リガンドで刺激して産生してきたＩＬ－２３の量を測定した結果を表１１に示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000011
　ＭＲＥ複合リガンド含有液によってＩＬ－２３の産生量は平均でも通常の１．９２倍に増加しており、興味深い事実は高年齢になるほどＩＬ－２３が高い値になる傾向にある。従って、ＭＲＥ複合リガンドはマクロファージなどのＭ１活性を増加させ、引き続きＴｈ１７およびＴｈ１を活性化させることで、細胞性免疫と液性免疫を高め抗菌、抗ウイルス、抗癌効果を発揮する。このことは、実施例で示したものも含む臨床治験とも一致するものである。
　新たな抗炎症プロセスの発見
　さて他方、ＭＲＥ複合リガンドがＩＬ－１β、ＴＮＦ－α、ＩＬ－８などの炎症性のサイトカインの遺伝子群を極めて強く活性化し、またＴｈ１７およびＴｈ１のプロセスを活性化するにも関わらず、なぜかＭＲＥ複合リガンド含む飲料により顎炎や潰瘍性大腸炎やアトピーの炎症などが著しく改善されるかという分子生理学のデータと臨床上の所見との矛盾が生じた。
　この矛盾を解決するために、発明者らは、ＤＮＡアレイを使用したマクロファージの網羅的ＤＮＡ動態解析やヒトの血液を使ったサイトカイン産生の時系列推移に注目し鋭意検討した。その結果、ＭＲＥ複合リガンドが従来のＬＰＳなどのリガンドにはない新たな免疫プロセスを発現していることを確認した。その第一点は、ＭＲＥ複合リガンドによるＩＬ－１８産生の抑制作用である。今回のＤＮＡ動態解析により、表１２のようにＭＲＥ複合リガンドがＩＬ－１８産生を抑制していることが見出された。これは注目すべき発見であった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000012
　ＩＬ－１８は炎症性疾患に深く関わるサイトカインで、従来のＬＰＳなどのＭ１リガンドの刺激で酵素であるカスパーゼ１を生成、このカスパーゼ１がＩＬ－１８の前駆物質を切断してＩＬ－１８を産生する。そして、ＩＬ－１８はＩＬ－１２の存在下でＴｈ１細胞やＮＫ細胞に作用してＩＮＦ－γ産生を強力に誘導する。なぜなら、ＩＬ－１２がＴｈ１細胞やＮＫ細胞にＩＬ－１８のレセプターを増やすからである。また逆に、Ｔｈ１細胞が産生するＩＮＦ－γはマクロファージからのＩＬ－１２やＩＬ－１８の産生を促し、さらにそれがＴｈ１細胞を刺激することで炎症を持続拡大するサイクルが形成されることになる。
　このように、普通マクロファージのＭ１活性を起こすＬＰＳのようなリガンドでは、ＩＬ－１２とＩＬ－１８が共に上昇することになる。
　しかし、ＭＲＥ複合リガンドでは、ＩＬ－１２やＩＬ－２３の産生を活発化しながら、ＩＬ－１８産生を抑制するという事実があきらかになった。これを裏付ける事実として、カスパーゼ１を発現させる遺伝子のＣＡＳＰ１が通常の０．６７５９０倍とＭＲＥ複合リガンドによって抑制されており、ヒトの血液を使用したＩＦＮ－γ産生試験でもこれを確認する結果が得られている（図５参照）。
　さて、ＩＬ－１８の特徴として、ＩＬ－１２やＩＬ－２３とＩＬ－１８とが同時に過剰産生されると腸や肝臓で重篤な臓器障害や自己免疫疾患が起こることが知られている。また、逆にＩＬ－２とＩＬ－１８の共存下では、ＩＬ－４やＩＬ－１３の産生が促進されＴｈ２プロセスの活性化によるＩｇＥ産生が起こり、肥満細胞や好塩基球からヒスタミンが放出さる。続いて、ＩＬ－５が産生されると好酸球からＥＰＯが放出され鼻閉などの炎症性疾患が引き起こされることになる。
　また、ＩＬ－１８は肥満細胞や好塩基球を単独で直接刺激して、ＩｇＥを介さず、ヒスタミンを放出したり、ＩＬ－４、ＩＬ－１３産生を誘導したりすることも明らかにされている。
　特に、ＩＬ－１３は、気管支喘息や肺線維症を誘発するサイトカインとしても知られている（非特許文献４参照）。
　さらに、Ｔｈ１細胞にＩＬ－１８と本来Ｔｒｅｇ細胞を活性化するＩＬ－２が作用すると、Ｔｈ１細胞がスーパーＴｈ１と呼ばれる細胞に変身して、本来Ｔｈ２のサイトカインであるＩＬ－１３を放出して気管支喘息や肺線維症を引き起こす。黄色ぶどう球菌によるアトピー性皮膚炎も同様なメカニズムで増悪化が起こると考えられている（非特許文献６）。
　このことは注目すべき事実である。なぜなら、ＩＬ－１８は、トリガーとして、Ｔｈ１細胞、Ｔｈ２細胞、Ｔｈ１７細胞などを炎症と非炎症という２つの状態にスウィッチングさせていると考えられるからである。
　ＩＬ－１８の増加を伴う炎症促進型活性化プロセスにおいては、Ｔｈ１細胞では自己免疫疾患を引き起こし、Ｔｈ２細胞ではアレルギー疾患を引き起こす。ＩＬ－１８の減少を伴う炎症抑制活性化プロセスでは細胞内抗菌作用、抗ウイルス作用、抗癌作用など細胞性免疫を増強させる。
　Ｔｈ２細胞では、ＩＬ－１８の共存下でＩＬ－４やＩＬ－１３などを産生しアレルギー疾患を誘発する。ＩＬ－１８が少ない場合は腸管や乳腺からＩｇＡ分泌するように、分泌性の免疫プロセスが活性化する。
　Ｔｒｅｇ細胞でも同様にＩＬ－１８というトリガーの出現で、ＩｇＥを伴わず、肥満細胞や好酸球を直接刺激してアレルギー症状を起こすことになる。Ｔｈ１７でもＩＬ－１８をトリガーとして炎症促進のプロセスと炎症抑制のプロセスへと分岐されると考えることができる。
　Ｔｈ１７では、ＩＬ－１８の増大で炎症性のＩＬ－１７ＡやＩＬ－２２が誘導され液性免疫のプロセスを活性化する。また、ＩＬ－１７Ａが過剰に産生されると炎症を盛んにして慢性関節炎、多発性硬化症、潰瘍性大腸炎、クローン病、乾癬などの自己免疫疾患を引き起こすことが知られている。ＩＬ－２２は乾癬との関係が深くαディフェンシンであるｈＮＰ－３を過剰産生させる。
　ＩＬ－１８が減少すると炎症を抑制するＩＬ－１７ＦやＩＬ－２１が誘導され、ＩＬ－１７Ｆが抗体産生やディフェンシン分泌を活発にするなど抗菌、抗ウイルス力を高める液性免疫プロセスを活性化する。特に、ＩＬ－１７は好中球からＨＮＰ１～２およびＨＮＰ４～６などのαディフェンシンの産生を、上皮細胞からｈＢＤ１～４のβディフェンシンの産生を促すことが知られている（非特許文献７参照）。
　注目すべきＭＲＥ複合リガンドの働きの第二点目は、このＩＬ－２１の増加作用である。
ＭＲＥ複合リガンドは、炎症を引き起こすＩＬ－１８の産生を抑制することで、アレルギーや自己免疫疾患を含む炎症を抑制する効果が期待され、実際に炎症性の疾患での臨床治験結果と一致している。
　さらに、後述するように、ヒトの血液を採血して測定したサイトカイン試験でもＭＲＥ複合リガンドによりＩＬ－２１が通常の２倍近く増加することが確認された（図２参照）。臨床的にもＭＲＥ複合リガンドを服用している非ホジキン型のリンパ種の患者（６２歳女性）の血中のＩＬ－２１が著しく上昇しているのを偶然確認している。この患者の全身への転移癌は消失傾向にあり、元々のリンパ腫も縮小傾向にあることもまた確認された。
　ＩＬ－２１は、抗ウイルス物質の分泌やナチュラルキラー細胞を増殖させて抗癌作用を高めるサイトカインで（特許文献４および特許文献５参照。実施例８～実施例１３参照）、別に、自己免疫疾患を引き起こすＴ細胞とＢ細胞をアポトーシスさせる働きもあると報告されている（特許文献３参照）。
　このＩＬ－２１については、マクロファージＭ１細胞からＩＬ－１２が放出され、そのＩＬ－１２が直接ＮＫＴ細胞（ナチュラル、キラーＴ細胞）に作用して、ＩＬ－２１を産生誘導するプロセスが存在することが知られている（特許文献２参照）。
　しかし、ＭＲＥ複合リガンドでは、ＩＬ－２３の増加に伴いＩＬ－２１が増加し、かつＩＬ－１２やＩＦＮ－γを産生していないヒトの血液中でもＩＬ－２１が増加している場合もあることが確認されており、むしろＩＬ－１２からＮＫＴ細胞の活性化のルート以外のプロセスが主に働いていることが推測された（図２と図５参照）。また、上記の特許文献２の例では、大きな分子量の単体リガンドがＴＬＲレセプターに作用することを利用しており、本発明が複合的な低分子リガンドを利用して細胞内部のＮＬＲなどの自然免疫レセプターを含めた立体的に刺激する方法とはその原理を全く異なることが暗示された。
　その新しい原理とは、最近、Ｔｈ１７活性によりＴｈ１７からＩＬ－２１が産生誘導されることが解明され（非特許文献３参照）、さらにそのＩＬ－２１がＴｈ１７細胞の分化を促しＩＬ－１やＩＬ－２３の刺激などでＩＬ－２１を分泌するというサイクルを持つことも明らかになってきた（非特許文献８）。
　このようにＭＲＥ複合リガンドは、主にＴｈ１７の非炎症活性によりＩＬ－２１を産生させると共に、補助的にＩＬ－１２を通したＮＫＴ細胞活性によるＩＬ－２１産生のルートも利用しているということができる。しかも、実際のヒトを含む脊椎動物では、ＭＲＥ複合リガンド以外のリガンドの刺激を常に受けており、この２つのＩＬ－２１産生ルートも常に変化することになる。そのケースでは、ＭＲＥ複合リガンドはアジュバンドとしての性格が強くなり、そのアジュバンドとしての優れた効果を発揮することとなる。
　また、ＭＲＥ複合リガンドでは、マクロファージが炎症を抑制するときに出現するカテプシンＥの遺伝子も通常の１．２倍発現していた。
　このように、ＭＲＥ複合リガンドは、抗菌、抗ウイルス、抗癌の免疫プロセスへの活性を保ちながら、炎症を静めるという驚くべき働きをしている。これらの事実は、後に述べる臨床治験でも確認されている。
　従来の炎症を静める医薬品であるステロイド剤や免疫抑制剤は抗菌力を低下させるという重大な欠陥があった。また、抗生物質はウイルスに効かず、また、恐ろしい耐性菌を作るという欠点やアナフィラキシーという呼吸困難などを伴う副作用もあった。ＭＲＥリガンドは、これらの欠点を持たず抗菌、抗ウイルスにも抗炎症にも同時に効果のある画期的な免疫活性剤となっている。
　さらに、組織修復を促すサイトカインの一つＦＧＦ２も通常の２．５２５倍発現しており、組織損傷を早期に回復させる力もありこれも臨床治験と一致している。
　本発明のＭＲＥ複合リガンドは、以上のように、マクロファージ、ミクログリア、樹状細胞、ランゲルハンス細胞、クッパー細胞、上皮細胞、ケラチノイド、繊維化細胞などを含む細胞内外の自然免疫受容体を立体的にＭ１活性化することにより、ディフェンシンやＩＳＧなどの抗菌、抗ウイルス物質を分泌させると共に、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞も活性化して癌細胞やウイルス内在細胞をアポトーシスさせる。それに引き続き、ＮＦ－κＢのプロセスを２段階に活性化してＩＬ－１β、ＴＮＦ－α、ＩＬ－８を含むケモカインを分泌すると同時に複数の炎症抑制物質やミトコンドリアＳＯＤを産生してＴＮＦ－αなどによる細胞損傷を阻止。さらにＩＬ－６、ＩＬ－１２やＩＬ－２３などのＴリンパ球のサイトカインを産生、ナイーブＴ細胞をＴｈ１７細胞およびＴｈ１細胞に分化、活性化させる。また、ＭＲＥ複合リガンドは様々な炎症疾患の引き金になるＩＬ－１８を抑制して、Ｔｈ１７活性とＴｈ１活性をスイッチングして非炎症性プロセスへと誘導する。Ｔｈ１７は、このスイッチングによってＩＬ－２１およびＩＬ－１７Ｆを産生。さらにこのＩＬ－２１がナイーブＴ細胞を非炎症性Ｔｈ１７へ分化するサイクルが働く。ＩＬ－１７Ｆは、炎症を伴わずに液性免疫プロセスが活性化して抗体産生を高めるほか、直接自然免疫の抗菌物質であるディフェンシンや抗ウイルス物質などを分泌して、抗菌、抗ウイルス力効果を発揮する。さらに、ＩＬ－１２の放出により、ＩＦＮ－γの産生を経ずにＮＫＴ細胞からＩＬ－２１を産生させる。これらのＩＬ－２１は、直接ＮＫ細胞の活性を増大させ抗癌作用を発揮するほか、自己免疫疾患を引き起こすＴ細胞やＢ細胞をアポトーシスさせて、自己免疫を抑制する。さらに、マクロファージのＭ１活性から、Ｍ２活性へと誘導され組織修復が行われるプロセスを経る経過を辿り、抗菌作用、抗癌作用、抗ウイルス作用、アレルギー抑制、抗炎症作用、組織修復作用、自己免疫抑制の作用が進行する。また、マクロファージ活性は、その食作用も活発化し、血液やリンパ液そして組織体液中の老廃物、異物の除去を促進する。
　アジュバンドとしての有用性
　なお、本発明の炎症を抑制するリガンドという特性は、様々なワクチンの炎症性の副作用を低減するという性質をもった優れたアジュバントとしての利用を可能にする。
ＭＲＥ複合リガンドをアジュバンドとして組み合わせて用いるワクチンには、インフルエンザ、ワクチンやペスト菌のワクチンなどの抗ウイルス、抗菌ワクチンの他、新世代のＬＰＳ、ペプチドグリカン、リポアラビノマンナン、ザイモザン、リポペプチド、リポテイコ酸、ＲＳＶ　Ｆ　タンパク質、ファイブロネクチンＥＤＡドメイン、ＨＳＰ６０、フラジェリン、非メチル化ＣｐＧ　ＤＮＡ、二本鎖ＲＮＡ、ポリイノシンポリシチジン酸、イミダゾキノリン系化合物、βグルカン、丸山ワクチン、マイコバクテリウムボビス、及びＯＫ－４３２などのＴＬＲリガンドおよびそれと結合したウイルスを含む菌体成分のワクチンも含まれる。
　キノコや薬草の分解物とのブレンド
　ＭＲＥ複合リガンドは、他の免疫リガンドや免疫アジュバンドとブレンドして使用可能である。特に、糖鎖系の免疫活性成分とは相性がよく、霊芝、夏虫冬草、白樺茸、キチンキトサン、ヒメマッタケなどの糖鎖成分を含有するものを分子量８０００以下に分解してＭＲＥ複合リガンドに加えると４９％～６０％のマクロファージ活性（生存数とＮＯ産生）の増加が見られた。これは、ＭＲＥ複合リガンドが優れたアジュバンドとして機能し得ることを示している。
　癌をアポトーシス誘導する成分を含む原料との併用
　紅豆杉、レスベラトロール、ケルセチンなどの癌のアポトーシスを復活させる物質との併用による癌治療法も極めて有効である。
　リアルタイムＰＣＲとＤＮＡマイクロアレイ
　なお、ＤＮＡマイクロアレイによるＤＮＡ動態解析は、バイオマトリックス研究所のＨｕｍａｎ　Ｇｅｎｅ　１．０　ＳＴ　Ａｒｒａｙで行った。
　リアルタイムＰＣＲは、次のような条件下で実施した。　
１．被験液に用いる細胞は、ヒト末梢血単球由来のＴＨＰ－１細胞（ＥＣＡＣＣ　Ｎｏ８８０８１２０１）を非動化した牛胎児血清とアンピシリンナトリウムに抗生物質の硫酸カナマイシンを添加してＲＰＭＩ１６４０培地にて培養し、細胞濃度を２×Ｅ６個／ｍｌに調整して使用した。
２．細胞刺激は、細胞懸濁液を１．５ｍｌずつ事前調整した６穴プレートの各ウェルに加え被検液とし、陰性対照と陽性対照のウェルを決めて、陽性対照ウェルに調整した刺激サンプルを添加し、よく振り混ぜた後、３７℃の５％炭酸ガスインキュベータに移し３時間培養を行った。
３．トータルＲＮＡの抽出は、ＴＲＩｚｏｌの手順に従って抽出、調整した。各サンプルについて２６Ｇの注射針を付けた１ｍｌのシリンジを使い１０ストローク液を出し入れしてＤＮＡの切断を行い、調整後４℃で１４０００ｒｐｍの遠心分離を１５分間行いＲＮＡを分離抽出した。
４．このＲＮＡを精製した後、アガロースゲル電気泳動法で品質評価を行った。
５．精製ＲＮＡから残存ＤＮＡを除去するためにＤＮＡｓｅＩ処理を行い、ｃＤＮＡの合成をした。
６．ｃＤＮＡの合成には、Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｒ　Ｆｉｒｓｔ　ｃＤＮＡ　ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ　Ｋｉｔを用いて、そのマニュアルに従って合成した。
７．この合成したｃＤＮＡを鋳型にして、リアルタイムＰＣＲを実施してデータを得た。
ＤＮＡマイクロアレイには、この手順によって得られたＲＮＡを使用し、網羅的な遺伝子発現を解析した。
　このように本発明のＭＲＥ複合リガンドは、自然免疫およびそれに引き続くリンパ球系の後天免疫のプロセスを活性化させると共に、炎症を抑制して組織修復力を高める働きを持っている。そのため本発明のＭＲＥ複合リガンドは、抗菌作用、抗癌作用、抗ウイルス作用、抗炎症作用、組織修復作用、老廃物除去作用を持っている。
　先に述べたように、本発明のＭＲＥ複合リガンドが強力な自然免疫活性力を持つＬＰＳ（エンドトキシン）の７．５４倍もの刺激力があることがリアルタイムＰＣＲによるＴＮＦ－α産生試験で明らかにされた。同時に、数々の抗炎症成分の出現とミトコンドリアＳＯＤの産生で、血液中ではＴＮＡαは増加せず細胞障害を起こさないことも明らかにされた。そして、ＭＲＥ複合リガンドがＬＰＳのように細胞毒性がないという優れた特性をもつことも確認された。ＬＰＳでは、その濃度を増すに従ってマクロファージの生存数が減少するのに対し、ＭＲＥ複合リガンドの濃度が増すとマクロファージの生存数が増すという事実が示された。
　本発明のＭＲＥ複合リガンドは、極性の低いほとんど電荷を持たないオリゴレベルの低分子リガンドなので、細胞壁を容易に通過することが可能で、細胞表面に発現しているＴＲＬ受容体だけでなく、細胞内のエンドゾームに発現しているや細胞質に存在するＮＬＲ受容体やＲＬＲ受容体をも立体的かつ複合的に刺激、活性化することができる。このような低分子のリガンドは腸壁から容易に吸収することが可能であり、また、抗体の攻撃を受けないので有効成分を精製した上で静脈注射用としても使用可能である。この性質は、濃度が増すと細胞を保護し細胞生存を増す性質と共に他のリガンドにないという優れた特性と相乗効果をもたらすものである。
　さて、このような特性を持つ本発明のＭＲＥ複合リガンドによる多様で動的な免疫活性効果を説明することにする。
　マクロファージ活性
　表１３および表１４は、［実施例１］で作られたＭＲＥ複合リガンド含有原液を希釈し、ヒトのマクロファージに作用させて、そのＮＯ産生量とマクロファージの生存細胞数を測定したものである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000013
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000014
　この測定結果を見るとＭＲＥ複合リガンド含有原液のＮＯ産生はＬＰＳのＮＯ産生よりも多い値を示し、特に３００倍希釈では、２．１９倍もＮＯ産生が高くなっている。一方、ＭＲＥ複合リガンド含有原液ではＮＯ値が増加しているにも関わらず、ＭＲＥ複合リガンド含有原液のマクロファージ生存細胞指標は増加しており、ＬＰＳでは減少しているのと逆の傾向を示している。ここでは数値を示さなかったが浸透圧限界までＭＲＥ複合リガンド含有原液の濃度を増加させても細胞障害が起こらなかったことを付記する。つまり、ＭＲＥ複合リガンドは、細胞障害を起こさず、むしろマクロファージの生存率を高めるマクロファージ活性効果がある免疫活性剤であると言えるものである。
　抗菌効果
　最初にＭＲＥ複合リガンド含有原液に直接の殺菌作用がないことを大腸菌、緑膿菌、黄色ぶどう球菌、カンジダ、クロコウジカビを使用した発育阻止確認試験で確認した。したがって、ＭＲＥ複合リガンド含有原液には抗生物質を含む殺菌物質は一切含まれておらず、臨床治験で見られる抗菌効果はすべて免疫力によるものだと言うことができる。
　また、本発明に係るＭＲＥ複合リガンドによる抗菌効果は、以下のようにまとめることができる。すなわち、１つ目は、マクロファージの貪食作用増強による抗菌効果であり、２つ目は、マクロファージ、上皮細胞、ケラチノイドなどからのディフェンシンを含む抗菌物質の放出による抗菌効果である。具体的にはマクロファージから抗菌物質であるＰＴＸ３が通常の７．２７倍の放出されていることが確認された。
　また、３つ目は、Ｔｈ１７活性を経由した好中球の貪食活性の増強による抗菌効果であり、貪食された菌は好中球のアズール顆粒に存在するα－ディフェンシンであるＨＮＰ１～６により殺菌される。αディフェンシンは溶血性など細胞障害を起こすので専ら好中球の内部で利用される。
　さらに、４つ目として、Ｔｈ１７細胞から産生されるＩＬ－１７Ｆの作用によって、上皮細胞やケラチノイドからβディフェンシンであるｈＢＤ１～４が分泌されることが挙げられる。また、炎症性のＩＬ－２２はケラチノイドからｈＢＤ３を分泌させて抗菌するが、乾癬ではＩＬ－２２とｈＢＤ３が過剰分泌されている。ＭＲＥ複合リガンドはＩＬ－２２を抑制する効果はないので、乾癬を治癒することはできないし、臨床治験とも一致している。
　そして、５つ目は、Ｔｈ１７の活性化を通してＣＤ４液性免疫プロセスが活性化しＢ細胞からＩｇＧが、粘膜上皮細胞からＩｇＡが分泌され抗菌効果をもたらす点である。このＴｈ１７を活性化するのがＩＬ－２３とＩＬ－１であり、ＭＲＥ複合リガンド含有原液による活性化ではＩＬ－１Ｂが通常の４７．６４倍、ＩＬ－１Ａが通常の６．３０倍の遺伝子発現をしており、またＩＬ－２３Ａが通常の１．７８倍（上昇中の値）の遺伝子発現をしている。採決されたヒトの血液を使ったＩＬ－２３の産生試験でも平均で通常の１．９２倍の分泌が確認されている（表１１参照）。
　抗ウイルス効果
　ＭＲＥ複合リガンドによるＨＩＶ疾患やＨＣＶ疾患でのウイルスの不活性化には注目に値するものがある。
　ＭＲＥ複合リガンドによる抗ウイルスプロセスには、次のプロセスがある。
　１つ目は、自然免疫受容体であるＴＬＲ３、ＴＬＲ７、ＴＬＲ９およびＲＩＧ１、ＭＡＤ５がＭＲＥ複合リガンドなどによって刺激されてＩＮＦ－αやＩＮＦ－βなどを直接放出するプロセスである。マクロファージ、ミクログリアなどからは、ＩＮＦ－αが、上皮細胞、繊維芽細胞、ケラチノイド、骨芽細胞などからＩＮＦ－βが主に放出される。これらＩＮＦ－αとＩＮＦ－βは、ＩＮＦ受容体を持つ近隣の細胞に感知され、ＩＳＧなどの抗ウイルス物質を一斉に放出して抗ウイルス効果を発揮する。
　ＭＲＥ複合リガンドでは、マクロファージのインターフェロン遺伝子の発現は表１５のようであった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000015
　ＭＲＥ複合リガンドの自然免疫受容体刺激により、直接ＩＦＮ－α５が通常の１．６倍、ＩＦＮ－α６が通常の１．２倍、そしてＩＮＦ－βが通常の１．４倍発現している。ＩＦＮ－λはＮＫ細胞を活性化するインターフェロンでウイルス感染細胞を攻撃する能力を高める働きをする。
　このことは、ＭＲＥ複合リガンドで採血したヒトの血液を刺激して測ったＩ型ＩＦＮ－α産生によっても裏付けられた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000016
　表１６で示されたように、平均で通常の２．８９倍ものＩＦＮ－αを実際に産生しているのが分かる。
　これらは、あくまでもリガンドとしての値であり、実際にウイルス感染があった場合には、ＭＲＥ複合リガンドはアジュバンドとして働き、さらに高いＩＮＦ－α値を得ることになる。
　２つ目は、ＩＬ－２１を通したＩ型のＩＦＮ産生である。ＭＲＥ複合リガンドでは、非炎症性Ｔｈ１７のプロセスを活性化し、ＩＬ－２１を産生する。このＩＬ－２１はＮＫ細胞を活性化すると共に、上皮細胞、繊維芽細胞、ケラチノサイト、マクロファージなどからＩ型のＩＦＮ産生を促し、ＩＦＮ－αやＩＦＮ－βはさらに多くの細胞から抗ウイルス物質を放出させる働きをする。
　３つ目は、ＭＲＥ複合リガンドがＴｈ１７からＩＬ－１７Ｆを産生し液性免疫のプロセスを活性化するアジュバンドとして働き、実際にウイルス感染があった場合にウイルスに対する抗体産生を増強する役割を果たす。
　４つ目には、ナチュラルキラー細胞（ＮＫ）、ナチュラルキラーＴ細胞（ＮＫＴ）、そして細胞障害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）によるウイルス感染細胞の排除である。
ＭＲＥ複合リガンドでは、表１８のようにナチュラルキラー細胞の活性化をする。また、ＭＲＥ複合リガンドはＴｈ１２プロセスを活性化することからＣＴＬを含む細胞性免疫を高めウイルス感染細胞や癌細胞を排除するプロセスも活性化するがメインではない。
　５つ目には、１９９０年代にオリゴペプチドによるウイルスの不活性化が発見されており、ＭＲＥ複合リガンドにはオリゴペプチドが９０％以上占めているため、このプロセスが働いていることを否定できない。
　このように、ＭＲＥ複合リガンドは、５つのプロセスの活性化により優れた抗ウイルス効果をもつこととなる。
　ここで、本願発明において、「ウイルス」とは、ヒト免疫不全ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、インフルエンザウイルス、ヒトパピロ－マウイルス、ヒトヘルペスウイルス、Ｂ型肝炎ウイルスを始め、魚類以上の脊椎動物が感染するＤＮＡ型およびＲＮＡ型ウイルスを含むものとする。
　抗癌効果
　癌細胞は、一般に前癌細胞のアポトーシス障害によって癌化する。その原因が、フリーラジカルによる癌抑制遺伝子の損傷が原因でも、子宮頚癌のようにＨＰＶによるＰ５３分解促進によるものでも、膵臓癌のようにストレスなどのＨＳＰ（ヒ－トショック蛋白質）によるアポトーシス阻害の場合でも、常にアポトーシス障害があって癌化が引き起こされる。
　紅豆杉やケフレチンやレスベラトロールのように不死化した癌細胞を再びアポトーシス機能を回復させる物質も存在するが、免疫プロセスでは細胞障害性のＣＤ８＋Ｔ細胞（ＣＴＬ）およびＮＫＴ細胞、そしてＮＫ細胞が癌細胞や癌ウイルス感染細胞に接着し、パーフォリンで細胞に穴を開け、グランザイムで癌細胞をアポトーシスへ誘導することによって抗癌効果を発揮する。
　一方、ＴＮＦ－αも、ミトコンドリアからチトクロームＣを放出させカスパーゼ８を活性化させて癌細胞をアポトーシス誘導するプロセスを活性化させる。しかしＴＮＦ－αは、一般の細胞への障害性も高く、ＨＩＶ発症の引き金にもなる物質として知られている。
またＣＴＬは、ＩＬ－１２によって活性化されたＴｈ１プロセスにより細胞性免疫が強められてＣＴＬを活性化させる。しかし、このＣＴＬはＣ型肝炎ウイルスやＨＩＶに感染した細胞を破壊して肝炎やＨＩＶを発症させ、細胞障害性の自己免疫疾患も引き起こす。
ＭＲＥ複合リガンドの抗癌効果は、主にナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）によって行われ、それにＣＴＬ細胞やＮＫＴ細胞が加わり抗癌効果を高める。
　ＮＫ細胞は、ＭＲＥ複合リガンドにより次のプロセスを経て活性化され抗癌効果を発揮する。
　１つ目は、自然免疫受容体の刺激により、Ｉ型のインターフェロンを産生させ直接ＮＫ細胞を活性化するプロセスで早期に効果が現れるプロセスである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000017
　ＭＲＥ複合リガンドでは、表１７のようにＮＫ細胞を強く活性化することで知られているＩＮＦ－λ（ＩＬ－２８Ａ）が通常の１．８４倍も遺伝子発現しており、ＩＮＦ－α、ＩＮＦ－βと共に抗癌効果を高めている。
　また、肺や肝臓に癌細胞を転移されるケモカインのＣＸＶＲ４は通常の０．６７倍と抑制され癌の転移を抑えている。
　２つ目は、ＭＲＥ複合リガンドによる非炎症性Ｔｈ１７プロセスを通じたＩＬ－２１産生によるＮＫ細胞の活性化による抗癌効果である。
　３つ目は、ＩＬ－１２から直接ＮＫＴ細胞に作用してＩＬ－２１を産生し、ＮＫ細胞を活性化するプロセスである。
　４つ目は、ＩＬ－１２によりＴｈ１プロセスを活性化してＩＮＦγを産生。ＣＴＬを活性化して抗癌効果を高めるプロセスである。このようにＭＲＥ複合リガンドでは、３つのプロセスからＮＫ細胞を活性化できる。
　表１８は、ＮＫ細胞の癌細胞殺傷能力を比較試験したものである。リガンドを一切添加しないの場合と実施例１で作られたＭＲＥ複合リガンド含有原液を希釈した液を添加した場合を比較している。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000018
　ＮＫ細胞の癌細胞殺傷能力試験の方法と手順は次の通りである。
　採血後３０時間以内の全血を試験に使用した。Ｆｉｃｏｌｌ－Ｃｏｎｒａｙ比重遠心法によりＰＭＢＣを分離後、ＲＰＭＩ　１６４０（１０％ＦＢＳ含有）にて洗浄しＥｆｆｅｃｔｏｒ　ｃｅｌｌとした。これを以下の４条件でＰＢＭＣ　４．０×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌ、２４時間培養した（５％ＣＯ２、３７℃）。
　なお、ＭＲＥ複合リガンド含有原液添加濃度は、ＭＲＥ複合リガンド含有原液の１日摂取目安量１００ｍｌおよび標準的なヒトの血液量４，５００ｍｌから、ＭＲＥ発酵原液が血中に１００％吸収された場合の濃度６．６６％（ｖ／ｖ）を基準として濃度設定した。
（１）Ｃｏｎｔｒｏｌ（＝添加なし）
（２）ＭＲＥ複合リガンド含有原液　添加（培養時濃度０．０６％（ｖ／ｖ））
（３）ＭＲＥ複合リガンド含有原液　添加（培養時濃度０．６０％（ｖ／ｖ））
（４）ＭＲＥ複合リガンド含有原液　添加（培養時濃度６．００％（ｖ／ｖ））
　培養後、Ｅｕ３＋により標識した骨髄性白血病由来Ｋ５６２細胞をＴａｒｇｅｔ　ｃｅｌｌとしてＥｆｆｅｃｔｏｒ　ｃｅｌｌと混合し、４時間培養した（５％ＣＯ２、３７℃）。このときＥｆｆｅｃｔｏｒ　ｃｅｌｌとＴａｒｇｅｔ　ｃｅｌｌの混合比率はＥ／Ｔ＝４０：１で混合した。４時間培養後、各ウェル中に遊離したＥｕ３＋量を時間分解蛍光測定により測定し、ＮＫ細胞の癌細胞殺傷能力活性を算出した。得られた数値は、癌細胞であるＫ５６２細胞の何％をＮＫ細胞が殺傷したかを表している。
　活性評価の判定は、５１以上がＶｅｒｙ　Ｈｉｇｈ、４２～５１がＨｉｇｈ、２４～４２がＳｔａｎｄａｒｄ、１４～２４がＬｏｗ、１４以下がＶｅｒｙ　Ｌｏｗとなっている。
　このように、ＭＲＥ複合リガンドは、ＮＫ細胞を多様なルートで活性化することができ、癌をＶｅｒｙ　Ｈｉｇｈのレベルでアポトーシスに導くことができる。
　しかも、アポトーシスの残骸は、速やかにマクロファージが貪食し、抗癌剤や放射線照射のように癌細胞をネクローシスさせることがないので、炎症や悪液体質を引き起こさずに癌は自然に縮小してゆくのが見られる。
　ＭＲＥ複合リガンドは、静脈注射により犬の肝臓癌（実施例８参照）、飲料による非ホジキンリンパ癌（実施例１３参照）、腎臓癌の透析患者で良い結果が得られている（実施例３１参照）。この結果は、ＩＬ－２１投与の臨床結果とほぼ一致している（特許文献４）。また、ウイルス性の癌の前癌症状であるポリープの消失も観察された。
　そして、ＭＲＥ複合リガンドでは、炎症を伴わず癌細胞を縮小させる制癌効果をもつことが明らかとなった。
　ここで、癌とは、ガン腫、肉腫、腫瘍、上皮腫、白血病、リンパ腫、ポリープ、および硬性ガン、悪性転換、新生物など「正常でない細胞」が含まれるものとする。
なぜなら、ＮＫ細胞は、「正常性」を逸脱した細胞のみを選んで排除する自然免疫細胞だからである（非特許文献５）。
　抗炎症効果
　ＭＲＥ複合リガンドは、抗菌作用、抗ウイルス作用、抗癌作用という働きを維持しながら、同時に抗炎症作用、組織修復作用という働きを持つという他のリガンドにはない優れた性質をもっている。抗炎症作用は、ＭＲＥ複合リガンドの注目すべき性質でもある。
　また、本願発明に係るＭＲＥ複合リガンドは、次のプロセスによって炎症を抑制している。
　１つ目は、一貫した免疫活性プロセスをパルス状に活性化するために、活性化とそれに遅延した抑制化が時間差でパルス状に進行し、生命体としてのバランスと恒常性を保っていることが分かる。ＴＬＲ、ＮＬＲ、ＲＬＲの刺激からＮＦ－κＢとＡＰ－１の活性化を経て、ＩＬ１Ｂ（４７．６４１）とＴＮＦＡ（２１．１８２）およびＩＬ－８（２０．４３１）の遺伝子発現が最大になると、プロセスの第２段階目の「引き金」となるＮＦＫＢＩＺ（２０．０１１）の遺伝子発現が盛んになり、次の産生物であるＩＬ－６（１．４０５）、ＩＬ－１２Ｂ（１．８３７）、ＩＬ－２３Ａ（１．７８４）などを産生し始める。それと同時に、第１段階目のＮＦ－κＢを強く抑制するＴＮＦＡＩＰ６（３７．１４２）とＴＮＦＡＩＰ３（１８．８３０）の遺伝子発現が著しく増大し、遊離ＮＦ－κＢをブロックして不活化するＮＦＫＢＩＡ（８．４２５）、ＮＦＫＢＩＤ（２．１０１）、ＩＫＢＫＥ（１．４４７）などの遺伝子が発現、ＮＦ－κＢの遺伝子であるＮＦＫＢ１（２．７９４）とＮＦＫＢ２（２．５３４）の発現が低下していく、というように進行していく（カッコ内は、通常と比べた遺伝発現倍率）。このようにＭＲＥ複合リガンドによるプロセスでは、不必要な炎症は抑制されていく。慢性炎症では、この抑制過程が働かなくなる状態と考えられる。ＭＲＥ複合リガンドによって炎症性疾患が回復するのが見られるが、このプロセスの正常化も貢献していると考えられている。
　２つ目は、ＭＲＥ複合リガンドによる炎症性疾患のトリガー（引き金）であるＩＬ－１８の産生を抑制する。ＩＬ－１８産生の減少によって、非炎症性のＴｈ１７プロセス、非炎症性のＴｈ１プロセス、非炎症性のＴｈ２プロセスが活性化する。
　ＭＲＥ複合リガンドでは、非炎症性のＴｈ１７プロセスと非炎症性のＴｈ１プロセス活性化される。Ｔｈ１７からは、非炎症性の液性免疫を活性化させるＩＬ－１７ＦとＮＫ細胞を活性化させるＩＬ－２１が分泌される。Ｔｈ１からは、ＩＮＦ－γが産生され細胞性免疫を高める。そして、双方のプロセスとも抗菌力および抗ウイルス力を保持しながらＩＬ－１８の抑制によって自己免疫やアレルギー疾患を含む炎症性疾患を鎮める働きをする。
　３つ目は、ＩＬ－２１産生によるアレルギー疾患および自己免疫疾患の沈静化である。
次表に、ＭＲＥ複合リガンドによるヒトの血液からのＩＬ－２１試験の結果を示した。
　ＮＫ細胞のＩＬ－２１産生試験の方法と手順は次の通りである。
　採血後３０時間以内の全血を試験に使用した。Ｆｉｃｏｌｌ－Ｃｏｎｒａｙ比重遠心法によりＰＭＢＣを分離後、ＲＰＭＩ１６４０（１０％ＦＢＳ含有）にて洗浄しＥｆｆｅｃｔｏｒ　ｃｅｌｌとした。これを下記の条件でＰＢＭＣ４．０×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌ、２４時間培養した（５％ＣＯ２、３７℃）。なお、ＭＲＥ複合リガンド含有原液添加濃度は、ＭＲＥ複合リガンド含有原液の１日摂取目安量１００ｍｌおよび標準的なヒトの血液量４，５００ｍｌから、ＭＲＥ複合リガンド含有原液が血中に１００％吸収された場合の濃度６．６６％（ｖ／ｖ）を基準として濃度設定した。
　こうして得たＰＢＭＣに対し、以下の条件でＭＲＥ複合リガンド含有原液のＩＬ－２１産生に与える影響を評価した。
（Ａ）Ｃｏｎｔｒｏｌ（添加なし）
ＰＢＭＣ　１．０×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌ、ＰＨＡＰ－１０μｇ／ｍｌ、２４時間培養（５％ＣＯ２、３７℃）
（Ｂ）ＭＲＥ複合リガンド含有原液添加
ＰＢＭＣ　１．０×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌ、ＰＨＡＰ－１０μｇ／ｍｌ、ＭＲＥ複合リガンド含有原液６．００％（ｖ／ｖ）、２４時間培養（５％ＣＯ２、３７℃）
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000019
　表１９のように、ＭＲＥ複合リガンド含有液によってＩＬ－２１の産生量は平均でも通常の２．１１倍に増加しており、注目すべきは元々ＩＬ－２１が低レベルにしか発現していないヒトの方が著しい増加をしている傾向にあることが分かる。
　ＩＬ－２１は、抗ウイルス成分の分泌やナチュラルキラー細胞を増殖させて抗癌作用を高めるサイトカインで、また、アレルギーや自己免疫疾患を引き起こすＴ細胞とＢ細胞をアポトーシスさせる働きもあることが知られている。
　ＭＲＥ複合リガンドでは、このようにヒトの血液中で実際にＩＬ－２１を著しく上昇することが確認され、臨床治験でも実施例１５～実施例２０のようにその抗炎効果をはっきりと裏付けている。
　また、前述の表４でも、炎症性サイトカインであるＴＮＦ－αの濃度が、ヒトの血中で、リガンドなどの刺激のない状態で平均２３２．８ｎｇ／ｍｌであるものが、ＭＲＥ複合リガンドによる刺激を与えても平均２２１．８　ｎｇ／ｍｌ　と微減少している。この結果は、単独のマクロファージにＭＲＥ複合リガンドによる同レベルの刺激で、通常の３７．０４２倍遺伝子発現している（図４参照）ことと比較して考えるとき、その炎症抑制効果は明らかである。
　このようなＭＲＥ複合リガンドによるＩＬ－２１産生誘導作用は、種々の免疫疾患、例えば、アレルギー性疾患（特にアレルギー性喘息、花粉症、アトピー性皮膚炎、湿疹、食物過敏症、蕁麻疹、アレルギー性鼻炎、アレルギー性結膜炎等などのＩｇＥ調節アレルギー性疾患（Ｉ型アレルギー反応が関与する疾患））、
自己免疫疾患（慢性関節リウマチ、クローン病、全身性エリテマトーデス、強皮症、多発性筋炎、多発性軟骨炎、結節性動脈周囲炎、強直性脊椎炎、リウマチ熱、シェーグレン症候群、ベーチェット病、甲状腺炎、Ｉ型糖尿病、皮膚筋炎、慢性活動性肝炎、重症筋無力症、グレーブス病、多発性硬化症、原発性胆汁性肝硬変、自己免疫性血液疾患（溶血性貧血、真性赤血球性貧血、特発性血小板減少症、再生不良性貧血等）、乾癬、糸球体腎炎、ループス腎炎、ウェゲナー肉芽腫症、サルコイドーシス、橋本病、川崎病、膠原病）、
移植による拒絶、炎症状態（関節及び筋肉における炎症及び疼痛（慢性関節リウマチ、リウマチ様骨髄炎、骨関節症、尿酸性関節炎等）、皮膚の炎症性状態（湿疹等）、眼の炎症性状（結膜炎等）、炎症を伴う肺の障害（喘息、気管支炎等）、炎症を伴う消化器の状態（アフタ性潰瘍、クローン病、萎縮性胃炎、いぼ状胃炎、潰瘍性大腸炎、脂肪便症、限局性回腸炎、過敏性腸症候群等）、歯肉炎、（手術又は障害後の炎症、疼痛、腫脹）、炎症に関連した発熱や疼痛、炎症性慢性腎状態（糸球体腎炎、ループス腎炎、膜性腎炎等）、ぶどう膜炎、接触皮膚炎等）、ショック（敗血性ショック、アナフィラキシー性ショック、成人型呼吸窮迫性症候群等）、癌（肺癌、胃癌、結腸癌、肝癌、ホジキン症等）、ウイルス疾患（肝炎等）等の予防、治療に有用であることを示している。
　組織修復作用
　一般的にマクロファージのＭ１（ＧＭ）からＭ２（Ｍ）への転換によって、炎症抗菌状態から炎症抑制、組織修復へと働きが切り替わるプロセスにより組織修復が行われると考えられている。
　この転換は何によってもたらされるかはいまだ解明されていない。しかし、現実には細菌やウイルスの侵入によりディフェンシンなどの抗菌物質や抗ウイルス物質そして補体が放出され殺菌、さらに好中球、マクロファージなどの食細胞が貪食して処理する初期段階。
その防御網が突破され、好中球が破壊されると、好中球内のリソゾーム酵素群が放出され炎症が始まる。細菌の破片を感受した樹状細胞、マクロファージ、上皮細胞から非常時をしらせる炎症性サイトカイン群が分泌される。さらに細菌の数が多いと免疫細胞が動員され組織的な炎症へと進展していく。炎症部位では、局所的に温度を上げＰＨを酸性側にすることで細菌やウイルスの活動を低下させると同時にリソゾーム酵素を含む非常時の酵素群が活動しやすい環境をつくる。これが炎症の段階のプロセスである。
　侵入した細菌を破壊尽くすと破壊した細菌の断片はリソゾーム酵素により低分子化され、その一部がマクロファージや樹状細胞および血管内皮細胞などの抗原提示能力のある細胞（ＡＰＣ）のＬＨＡ受容体（動物ではＭＨＣ受容体）で感知されその情報は記憶Ｔ細胞と記憶Ｂ細胞に格納される。他の一部は、マクロファージの自然免疫系のＴＬＲ受容体、ＮＬＲ受容体、ＲＬＲ受容体で感知され、その抗菌完了のリガンドのパターンを認識してマクロファージはＭ１状態からＭ２状態へ切り替えをして、ＩＬ－１０およびＩＬ－２を放出するとともに、組織修復を促すＦＧＦを産生して線維芽細胞や骨芽細胞などを活性化する。その際に低分子リガンドが抗菌完了パターンのシグナルになるとも言われている。
　ＭＲＥ複合リガンドは、まさに菌体をリソゾームで低分子分解して得られたものであり、組織修復効果を期待できた。そして、マイクロアレイによるＤＮＡ動態分析で、組織修復を促すサイトカインの一つＦＧＦ２が通常の２．５２５倍発現しているのを見いだした。
臨床治験でもＭＲＥ複合リガンドの組織修復作用を確認できた（実施例２５～実施例２９参照）。
　老廃物除去作用
　マクロファージのＭ１活性化は、マクロファージの貪食活動も活性化する。このため血液やリンパ球および組織の中で、死んだ細胞や異物および酸化ＬＤＬのような酸化毒素を貪食分解して、その残渣を胆汁の中に捨てる体内浄化の働きをしている。Ｍ１活性化をするＭＲＥ複合リガンドには、マクロファージの活性化を通じて老廃物除去作用をもたらす効果がある。
　このようにＭＲＥ複合リガンドは、抗炎症作用と抗菌作用、抗ウイルス作用、抗癌作用を同時に持つという優れた性質をもっている。しかも、オリゴ領域の低分子であるがゆえに腸から粘膜からも容易に吸収される。さらに、飲料としても外用剤としてもまた精製することで注射剤としても利用可能である。
　本願発明に係るＭＲＥ複合リガンドの働きは、全体として、リンパ球免疫を抑制して、自然免疫を増強する性質を持つということができる。
　また、本発明に係る免疫増強組成物は、ヒト及びイヌ等を含む哺乳動物に投与されることによって、上述したような様々な自然免疫刺激効果を発揮するものである。また、この場合、投与の方法は、本発明に係る免疫増強組成物がその機能を発揮し得るような状態で投与されるものであれば、医学又は医療分野で通常行われている如何なる投与方法であっても良い。例えば、経腸的または経口的に投与されることができ、または非経口的に行われるものであっても良い。非経口的に行われる投与方法としては、血管内投与、組織周囲および組織内注射、皮下注射等が挙げられ、皮膚や粘膜に直接塗布されても良い。また、点眼投与、点鼻投与、経皮的投与、粘膜投与されることもできる。
　また、本願発明に係る免疫増強組成物は、その機能を発揮し得るような態様であれば、医学又は医療分野、若しくは分子生物学分野において通常用いられる如何なる剤形によっても投与されることができる。例えば、本願発明に係る免疫増強組成物は、液体の組成物として投与されることができるが、この場合、原液であっても、希釈液であっても良い。
　次に、本発明の効果に関して実施例を示して説明する。しかし、本発明は以下に記載された実施例に限定されるものではなく、様々な変更及び修飾は当業者によって容易になされることが理解されるであろう。
　ＭＲＥ複合リガンドの製造
　［実施例１／ＭＲＥ共生菌群の培養と内胞子化によるＭＲＥ複合リガンド含有原液の作成］
　本発明で利用されるＭＲＥ複合リガンド含有原液は、ＭＲＥ共生菌群の栄養細胞から分泌された消化酵素群と内胞子化（スポア化）に伴って放出されるリソゾーム酵素相同のバルク型酵素群との混合された酵素群によって、ＭＲＥ共生菌群の自身の菌体を低分子領域まで分解して作られる。
　ＭＲＥ菌群の培養は、好気性グラム陽性菌の公知の一般的な培養方法で培養した。まず１．２ｍ３の培養曝気槽に１０００リットルの水を入れエアレーション（曝気）を行った。その培養曝気槽に魚粉１０ｋｇ、米ぬか１０ｋｇ、油カス５ｋｇ、肉汁１ｋｇを栄養物として与え、さらに硫酸マグネシュウムとシリカなどのミネラルを適量加えた。さらに菌体を投入し、培養ＰＨ６．０～６．８および培養温度２５℃～３５℃の培養条件下で、かつ溶存酸素濃度０．５ｍｇ／Ｌ～１．２ｍｇ／Ｌになるようにエアレーション（曝気）を加えながらＭＲＥ共生菌培養した。
　菌の十分な増殖と安定化を待って栄養細胞状態にあるＭＲＥ菌群をその培養液と共に別の曝気式の培養槽に分別する。この培養曝気槽でＭＲＥ菌群の一切の栄養を絶って飢餓状態下に置き、さらに２５℃～３５℃の条件下でエアレーションを加え続けると窒素成分の枯渇オートリガーにＭＲＥ共生菌群の内胞子化が始まる。培養液の透明度が一気に増すのを待ってエアレーション（酸素供給）を止めると、内胞子は一斉に沈殿を始め透明な上澄み液を得る。
　こうして得られた上澄み液をさらに０．２ミクロンのメンブレンで加圧ろ過し、低分子のＭＲＥ複合リガンド含有原液を得る。このＭＲＥ複合リガンド含有原液には、３．６ｍｇ／ｍｌの有機成分が存在し、その中にＭＲＥ複合リガンド成分を８０μｇ／ｍｌ含有している。なお、本願明細書において、上述のようにして得た「ＭＲＥ複合リガンド含有原液」を「ＭＲＥ原液」と呼び、特別に言及する場合を除いて、「ＭＲＥ複合リガンドの希釈」と表現される場合には、「ＭＲＥ複合リガンド含有原液の希釈」又は「ＭＲＥ原液の希釈」を指すものである。
　臨床治験例
　抗ウイルス効果
　［実施例２／エイズ（ＨＩＶ）］
　売血によって約８００人の半数以上がＨＩＶに感染したアジアの農村で、発症した２０人を選び医薬品は一切使用せず本発明の飲料１日２００ｍｌを１カ月飲んでもらった。飲料を飲んだ３人と飲まないでエイズ薬を使用した１人について、ＣＤ４陽性Ｔ細胞の全Ｔ細胞に対する割合（ＣＤ４＋／ＣＤ３）および血液１ｍｌ当たりのＣＤ４陽性Ｔ細胞数をフローサイトメトリー法で測定し表２０のような結果を得た。
　本発明の飲料を飲用した２０名全員が１年後には仕事を含めて元気に日常生活を送っている。副作用の報告は一つもない。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000020
　［実施例３／Ｃ型肝炎（ＨＣＶ）］　
　男性４８歳。Ｃ型肝炎で、インターフェロンとリバビリンの治療をしてもウイルス量が２８，０００／ｍｌ、ＡＬＴ（ＧＰＴ）が６２１、ＡＳＴ（ＧＯＴ）が５８６とあまり下がらず、ＭＲＥ飲料を飲用し始める。ウルソに加えて５０ｍｌを１日３回飲用する。３か月経てウイルス量をＰＣＲで測定し、１２８００／ｍｌに下がっていた。ＡＬＴ（ＧＰＴ）が４８、ＡＳＴ（ＧＯＴ）が５２と著しく改善されていた。
　［実施例４／子宮頸がん（ＨＰＶ）］　
　女性５０歳。子宮頸部のウイルス感染発症(子宮頚癌の原因ウイルスＨＰＶ）。ＭＲＥ混合リガンド飲料３０ｍｌを１日２回（朝晩）摂取。２か月後の検査でクラス３ａからクラス２ａへ改善された。
　［実施例５／かぜを引きやすい体質］
　女児６歳。病弱でよく風邪を引く。時折３８．５度以上の高熱が続くこともあった。ＭＲＥ飲料１日２回２０ｍｌを飲み続けて３か月、風邪を引かなくなった。
　［実施例６／いぼ（ＨＰＶ）］　
　男性７１歳。手の指にイボができ仕事に支障をきたしていた。ＭＲＥ飲料５０ｍｌ毎日２飲み続けて６か月でイボが目立たなくなるほど縮小していった。イボは、ＨＰＶ（ヒト・パピローマ・ウイルス）が原因と言われている。
　［実施例７／帯状疱疹］　
　女性６０歳。ＭＲＥ複合リガンド飲料３０ｍｌを１日２回摂取と共に患部へ塗布。１～２日で改善した。ヘルペスや帯状疱疹には飲用と同時に塗布すると治りが速い。
　抗菌効果
　［実施例８／慢性感染］　
　女性５８歳。全身の菌感染（日和見感染）により疲れてくると足の甲、足首、くるぶし、手の親指などと毎回異なった個所が腫れて炎症を起こす。リューマチ因子はマイナスで、抗生物質を服用すると治るということを繰り返してきた。そのうち抗生物質が効かなくなり、ＭＲＥ飲料を試しに１日５０ｍｌを２回飲ようになった。その結果、月１～３回発症していたものが、約半年に１回の発症で済んでいる。増加していた血小板も減少してきた。
　［実施例９／辱創］　
　女性８０歳。床擦れで化膿する。ＭＲＥ飲料を辱創部分にスプレーした後、ガーゼに浸して湿布した。化膿が治まり始め、１か月後には辱創が小さくなり、傷口から発生する臭いも軽減した。
　抗癌効果
　［実施例１０／肝臓癌］　
　１２歳オスの高齢犬。肝癌で水も餌も取れなくなり、ベターっと動けない状態になっていた。治療の方法がないので、試しにＭＲＥ飲料を約１５ｍｌ静脈に注射した。３日目に起き上がり水を飲み始めたので、水にＭＲＥ飲料１００ｍｌを加えて飲ませたところ餌も食べ始めそのまま元気になる。動物病院の医師からも癌は縮小したようだ完治ですと言われる。
　［実施例１１／肝臓癌］　
　１３歳オスの高齢雑種犬。山口県の大学の獣医学部にて、「肝臓に悪性腫瘍がいくつもできており手の施しようがない。」と診断された。手術もできない状態なので、毎日ＭＲＥ飲料を水に薄めて飲ませた。１週間後、大学で再診、癌が大きくなっていないとの診断を受ける。その後、犬が積極的にＭＲＥ飲料を飲み始め日増しに元気を回復し、１か月後には家の中を走り回るようになった。３か月後のレントゲン検診では、癌が縮小して小さくなっていた。外出の散歩も食事も通常に戻って元気に飛び跳ねている。
　［実施例１２／肝臓癌］　
　女性７５歳。肝臓癌と糖尿病を併発、インシュリン注射を使用。ＭＲＥ飲料５０ｍｌを１日２回飲む。２か月ほどで、癌細胞が縮小し、インシュリン注射前の血糖値が低下してきた。
　［実施例１３／肝機能改善］　
　男性４２歳。肝機能検査で、ＡＬＴ（ＧＰＴ）の値が６４。ＭＲＥリガンド飲料３０ｍｌを１日２回摂取。１か月後の検査でＡＬＴ値５８、２か月後の検査でＡＬＴ値が３３と正常になる。
　［実施例１４／前立腺癌］　
　男性６１歳。血液のＰＳＡ値３０００μｇ／ｍｌを越える末期の前立腺癌。骨転移寸前の状態で口からの吐血がある。手術は不能で、抗アンドロゲン作用のあるカソデックスと４週間に１度女性ホルモン剤のリュープリンを皮下注射する。一時、ＰＳＡ値は１にまで下降したが、また再燃する。そこで、カソデックスを効果の高いオダインに変更する。しかし、オダインは重篤な肝障害を起こす恐れがある。血液検査でＰＳＡは０．９２であったが、ＡＳＴ（ＧＯＴ）が５６（正常値１１～３０）で、ＡＬＴ（ＧＰＴ）が１９６（正常値４～３０）に上昇。これ以上この状態が続くと苦痛を伴う抗癌剤に移行するため、ＭＲＥ飲料を１日２５０ｍｌ毎日飲み続けた。その結果、ＰＳＡ値もＡＳＴ、ＡＬＴ値もすべて正常に保つことができた。ビールや煙草を飲みながら週に１～２回テニスを楽しむことができるようになった。
　［実施例１５／胃癌］　
　男性７０歳。肝臓癌から胃に転移して腫瘍が大きくなる。そのため食事が取れなくなる。点滴による治療と共に、ＭＲＥ飲料３０ｍｌを１日２回服用。１～２か月すると、胃と肝臓の腫瘍が縮小し始め、４か月目には食事ができるようになった。５カ月目の検査ではほとんど消滅しているように見えた。
　［実施例１６／大腸癌］　
　男性６９歳。大腸癌で入院。ＭＲＥリガンド飲料８０ｍｌを１日２回摂取。飲用後、腫瘍マーカーが下がりだし、１カ月後腫瘍自体も小さくなる。摘出手術を行ったがリンパなどへの転移はない。
　［実施例１７／膵臓癌］　
　男性６６歳。膵臓癌で抗癌剤治療をしている。また、糖尿病でインシュリンも注射している。ＭＲＥリガンド飲料１日３０ｍｌを摂取していて数カ月たつが体調がとてもよい。
　［実施例１８／直腸癌］　
　女性７８歳。人工肛門装着。家族は医師から不治の宣告を受ける。ＭＲＥリガンド飲料を初日２本（１８００ｍｌ）、２日目１本（９００ｍｌ）、３日目１本（９００ｍｌ）を飲む。その後の検査で、骨まで転移していた癌も含めて消失していた。
　［実施例１９／肺癌］　
　男性７６歳。肺癌から骨に転移して抗癌剤のＴＳ－１を服用。当初は効果があり回復を期待したが、その後効果が薄れてきた。痛み・便秘が激しくホスピスで麻薬・便秘薬による治療を行う。ＭＲＥリガンド飲料３０ｍｌを１日３回摂取。３週間後の検診で肺癌が消失（骨には残存）。仕事に復帰できた。
　［実施例２０／悪性リンパ腫］　
　女性６２歳。ステージ４の非ホジキンリンパ腫で、全身に転移し、耳の下のあごの部分にゴム毬のような腫瘍を形成。抗癌剤など一切の医薬品治療をせず、ドクタ－の管理のもとに、ビタミンＣの大量静注、と共にＭＲＥ飲料５０ｍｌを１日２回飲用する。３か月後、血中のＩＬ－２１が著しく上昇し、転移した転移癌が縮小を始め耳の下のあごの部分の腫瘍も柔らかくなってきた。
　抗炎症効果
　［実施例２１／顎の関節炎］　
　男性６４歳。右側の顎関節の炎症で１か月ほど口が開けられない状態となる。虫歯が原因ではないかと歯の治療をしたが、まったく治らず。ＭＲＥ飲料１日１００ｍｌを飲みはじめた。翌日には顎の熱が引き、痛みが軽くなり、３日後には口を開けることが可能になり普通に食事ができるほど回復した。約１週間後には正常に戻った。
　［実施例２２／蕁麻疹］　
　女性３１歳。原因不明の蕁麻疹様の発疹が全身に毎日のように出る。ＭＲＥ飲料を５０ｍｌ飲んでもらう。飲むと１時間ほどでかゆみが軽くなり我慢できる程度になった。
翌日、また発疹したので１日２回飲んでもらうことにした。１か月過ぎる頃には、蕁麻疹様の発疹が出なくなった。
　［実施例２３／蕁麻疹］　
　女性５４歳。５００円玉くらいの大きさの蕁麻疹が飲用２日で小指大に小さくなり、引っ込むのに１週間くらいかかっていたのが２～３日で引っ込み、肌がつるつるしてきた。
　［実施例２４／潰瘍性大腸炎］　
　女性４９歳。潰瘍性大腸炎で定期的に入退院を繰り返す。ペンタサとサラソーピリンなどの副作用のためかなりひどい蕁麻疹様の薬疹を併発するためステロイド剤を使用する。本発明のＭＲＥ飲料を１日２００ｍｌ飲み始め、約１か月後に薬疹が起こらなくなる。その後、通院と投薬を中止。ＭＲＥ飲料を飲み始めてから約１０か月目の内視鏡検査での炎症所見が見られなくなった。その後、食事療法とＭＲＥ飲料を継続。整腸剤以外の投薬を一切せずに潰瘍性大腸炎の症状は起きていない。
　［実施例２５／アトピー性皮膚炎］　
　女性３１歳。顔を含めて全身各所の皮膚に腫れと痒みを伴うアトピー様の炎症で苦しむ。ＭＲＥ飲料を化粧水のようにスプレーすると腫れと痒みが一時的にかなり軽減することを見出した。ＭＲＥ飲料３０ｍｌを１日２回飲用すると２か月ほどで湿疹が出にくくなってきた。
　［実施例２６／スズメ蜂］　
　男性６５歳。スズメ蜂に刺されたので、急いでＭＲＥ飲料を頭にかけたら、腫れることなく回復した。
　［実施例２７／ムカデ］　
　男性２８歳。ムカデに足を刺されて４か月経っても腫れが引かず靴下のゴム跡が食い込むようにくっきりと残っていた。ＭＲＥ飲料１日１回３０ｍｌを飲用したところ、１０日目から腫れが引いてきた。まだ、うっかりして飲むのを忘れると腫れが出て、飲むと腫れが引く状態にある。
　［実施例２８／アレルギー性鼻炎］　
　女性１５歳。アレルギー性鼻炎。ＭＲＥ飲料３０ｍｌを１日２回飲用。３週間で症状が改善した。
　糖尿病と高血圧
　［実施例２９／糖尿病］　
　男性５６歳。糖尿病で空腹時血糖値が１５２～３９６の範囲を変動し回復せず、Ａ１Ｃが８．６を超える値となった。ＭＲＥ飲料を１日１８０ｍｌ飲み始めて、１か月目に空腹時血糖値が１３４でＡ１Ｃ７．６に下がる。２か月目には空腹時血糖値が９０でＡ１Ｃ７．３、３か月目には空腹時血糖値が８９でＡ１Ｃ５．８、４か月目には空腹時血糖値が９１でＡ１Ｃ５．０となり正常値になった。
　［実施例３０／糖尿病］　
　男性６８歳。父親も兄も糖尿病で死亡。本人は、インシュリンを打つ寸前まで悪化。ＭＲＥ飲料を１年近く飲み続け、医師より糖尿病は良くなっていると言われ、薬を止めることができた。それ以後、血糖値が高いと言われたことはなく、本人は毎日酒を２合飲んで快調と言っている。
　［実施例３１／高血圧］　
　男性７０歳。最高血圧１６０、最低血圧９８であったが、ＭＲＥ飲料３０ｍｌを１日２回飲用。１か月後に、最高血圧１４０台、最低血圧８０台に下がった。
　［実施例３２／高血圧］　
　男性７２歳。血圧１６０－９０。ＭＲＥリガンド飲料５０ｍｌを１日２回飲用。１ヵ月後に血圧が１３０－８０。３ｃｍくらいあったシミも小さくなる。
　組織修復効果（骨折と傷の回復）
　［実施例３３／手術跡の創傷］　
　男性６１歳。腹部の手術をしたが、糖尿病があるため抜糸するまでに少なくとも６か月掛かかると言われた。ＭＲＥ飲料１日１回５０ｍｌを飲用。１週間で抜糸できた。
　［実施例３４／靭帯損傷］　
　男性４２歳。左膝の靭帯損傷でリハビリを行っても「歩行は可能だけれども走るのは困難」と診断された。５年経ても走ったり無理をしたりすると左足の痛みが起こる状態が治らず。ＭＲＥ飲料を飲み始めて２週間後、自転車を長時間運転しても左足の痛みを感じなくなっているのに気が付く。試しに走ってみたら僅か５ｍだが走ることができた。その後もＭＲＥ飲料を飲み続けて１０ｍ、２０ｍと走る距離を伸ばすことができた。１週間飲用を中止したら長時間の自転車運転に痛みを感じ、走っても違和感を覚えた。５キロマラソンを目標に走る距離を伸ばす努力をしている。
　［実施例３５／骨折］　
　女性８８歳。骨折で医師から繋がるまで半年かかると言われた。ＭＲＥ飲料を飲用したところ、１か月で骨が繋がった。
　［実施例３６／足の低温火傷］　
　女性７３歳。ひどい足の低温火傷で１カ月治療しても肉芽が上がらず回復せず。ＭＲＥ飲料３０ｍｌを１日２回飲用。１週間で肉芽が上がり始めた。
　［実施例３７／にきび跡］　
　女性６１歳。高校生のとき「にきび」を潰して鼻に凸凹の「にきび跡」ができる。ＭＲＥ飲料を１日５０ｍｌ飲む。約２ヵ月目に「にきび跡」が小さくなりはじめ、６か月目には完全ではないがかなり縮小して皮膚の凸凹が目立たなくなってきた。全体の皮膚の肌理も細かくなった。
　［実施例３８／手術後の飛蚊症］　
　男性５１歳。網膜剥離の手術後飛蚊症になった。ＭＲＥ飲料を１日５０ｍｌ飲用したところ２週間で改善が見られ、血圧も１５０以上あつたものが１３０を越えることがなくなった。
　［実施例３９／腎機能改善］　
　男性５１歳。腎臓透析をしている患者。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000021
　表２１に示すように、ＭＲＥ飲料を飲用する以前にはＢＵＮ値にあまり変動がなかったのが、飲用後コントロール値以内の値ではあるが、ＭＲＥ飲料を飲み始めて徐々に低下してきた。なによりも元気が出てきたと喜んでいる。ＭＲＥ飲料を服用して３か月目の透析後の値が正常値になってきたことに注意。
　詳細なデータは得られていないが、他に、ＭＲＥ飲料を飲用している腎臓透析患者が２人いる。一人は自力で尿が少しでるようになってきた。２人とも元気になり農作業や職場へ復帰している。
　健常者への試験飲用例
　［実施例４０／健常者への試験飲用］　
　ＭＲＥ飲料を試験飲用した健康な７２人にアンケートを実施した。７２人中の５８人が尿の出が良くなったと記述している。また、７２人中４１人がかぜを引かなくなったと感じている。肌に艶が出てきた人は７２人中６８人に上った。薬草などで便秘になる人を含めて、副作用らしいものは見当たらなかった。むしろ便秘がよくなったという人が１２人いた。
　その他、本発明は、さまざまに変形可能であることは言うまでもなく、上述した一実施形態に限定されず、発明の要旨を変更しない範囲で種々変形可能である。

Claims (22)

  1. 　自然免疫を刺激することによって対象が有する免疫を増強させる免疫増強組成物であって、
    　バシラスｓｐ．（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｐ．）（ＦＥＲＭ　ＢＰ－１１２０９）、リシニバシラス　フシフォルミス（Ｌｙｓｉｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ　ｆｕｓｉｆｏｒｍｉｓ）（ＦＥＲＭ　ＢＰ－１１２０６）、バシラス　ソノレンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｏｎｏｒｅｎｓｉｓ）、リシニバシラスｓｐ．（Ｌｙｓｉｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｐ．）（ＦＥＲＭ　ＢＰ－１１２０７）、及びコマモナスｓｐ．（Ｃｏｍａｍｏｎａｓ　ｓｐ．）（ＦＥＲＭ　ＢＰ－１１２０８）から成るＭＲＥ共生菌群から選択される１若しくはそれ以上の菌類を分解することによって生じる免疫賦活物質
    　を有効成分として有するものであることを特徴とする、免疫増強組成物。
  2. 　請求項１記載の免疫増強組成物において、
    　前記免疫賦活物質は、少なくともその９８重量％以上が、平均分子量１，０００Ｄａ以下の親水性低分子物質である
    　ことを特徴とする、免疫増強組成物。
  3. 　請求項１記載の免疫増強組成物において、
    　前記免疫賦活物質は、マクロファージ、ナチュラルキラー細胞、又はナチュラルキラーＴ細胞を活性化させるものである
    　ことを特徴とする、免疫増強組成物。
  4. 　請求項１記載の免疫増強組成物において、
    　前記免疫賦活物質は、樹状細胞、ミクログリア細胞、ランゲルハンス細胞、又はクッパー細胞を活性化させるものである
    　ことを特徴とする、免疫増強組成物。
  5. 　請求項１記載の免疫増強組成物において、
    　前記免疫賦活物質は、上皮細胞、繊維芽細胞、ケラチノサイト、又は骨芽細胞を活性化させるものである
    　ことを特徴とする、免疫増強組成物。
  6. 　請求項１記載の免疫増強組成物において、
    　前記免疫賦活物質は、Ｔｈ１７又はＴｈ１を分化又は活性化させるものである
    　ことを特徴とする、免疫増強組成物。
  7. 　請求項１記載の免疫増強組成物において、
    　前記免疫賦活物質は、ＩＬ－２１産生を増強させるものである
    　ことを特徴とする、免疫増強組成物。
  8. 　請求項１記載の免疫増強組成物において、
    　前記免疫賦活物質は、前記ＭＲＥ共生菌群から選択される１若しくはそれ以上の菌類を生育に適した培養条件下で培養し、得られた培養液を飢餓状態におき、エアレーションを行うことによって得られるものである
    　ことを特徴とする、免疫増強組成物。
  9. 　請求項１記載の免疫増強組成物において、この免疫増強組成物は、
    　アレルギー疾患又は自己免疫疾患に罹患した対象における抗炎症剤として使用されるものである
    　ことを特徴とする、免疫増強組成物。
  10. 　請求項９記載の免疫増強組成物において、
    　前記アレルギー疾患又は自己免疫疾患は、顎関節炎、潰瘍性大腸炎、アトピー性皮膚炎、アレルギー性鼻炎からなる群から選択されるものである
    　ことを特徴とする、免疫増強組成物。
  11. 　請求項１記載の免疫増強組成物において、この免疫増強組成物は、
    　病原性細菌又は病原性ウイルスに対するワクチンのアジュバンドとして使用されるものである
    　ことを特徴とする、免疫増強組成物。
  12. 　請求項１１記載の免疫増強組成物において、
    　前記病原性細菌又は病原性ウイルスは、日和見感染菌、ＨＩＶ、ＨＣＶ、及びＨＰＶからなる群から選択されるものである
    　ことを特徴とする、免疫増強組成物。
  13. 　請求項１記載の免疫増強組成物において、この免疫増強組成物は、
    　肝臓癌、前立腺癌、大腸癌、直腸癌、肺癌、膵臓癌、胃癌、悪性リンパ腫、糖尿病、高血圧、創傷、靭帯損傷、骨折、低温火傷、ニキビ、飛蚊症、辱創、蕁麻疹からなる群から選択される疾患に罹患した対象を治療又は予防するための医薬又は動物薬として使用されるものである
    　ことを特徴とする、免疫増強組成物。
  14. 　請求項１記載の免疫増強組成物において、この免疫増強組成物は、
    　食品若しくは飼料として用いられるものである
    　ことを特徴とする、免疫増強組成物。
  15. 　自然免疫を刺激することによって対象が有する免疫を増強させる免疫増強組成物を製造する方法であって、
    　バシラスｓｐ．（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｐ．）（ＦＥＲＭ　ＢＰ－１１２０９）、リシニバシラス　フシフォルミス（Ｌｙｓｉｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ　ｆｕｓｉｆｏｒｍｉｓ）（ＦＥＲＭ　ＢＰ－１１２０６）、バシラス　ソノレンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｏｎｏｒｅｎｓｉｓ）、リシニバシラスｓｐ．（Ｌｙｓｉｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｐ．）（ＦＥＲＭ　ＢＰ－１１２０７）、及びコマモナスｓｐ．（Ｃｏｍａｍｏｎａｓ　ｓｐ．）（ＦＥＲＭ　ＢＰ－１１２０８）から成るＭＲＥ共生菌群から選択される１若しくはそれ以上の菌類を用意する工程と、
    　前記用意された１若しくはそれ以上の菌類を分解する工程と
    　を有することを特徴とする、方法。
  16. 　請求項１５記載の方法において、
    　前記分解する工程は、前記用意された１若しくはそれ以上の菌類を生育に適した培養条件下で培養し、得られた培養液を飢餓状態におき、エアレーションを行うことによって行われるものである
    　ことを特徴とする、方法。
  17. 　自然免疫に関連する疾患に罹患した哺乳動物を治療若しくは予防する方法であって、
    　バシラスｓｐ．（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｐ．）（ＦＥＲＭ　ＢＰ－１１２０９）、リシニバシラス　フシフォルミス（Ｌｙｓｉｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ　ｆｕｓｉｆｏｒｍｉｓ）（ＦＥＲＭ　ＢＰ－１１２０６）、バシラス　ソノレンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｏｎｏｒｅｎｓｉｓ）、リシニバシラスｓｐ．（Ｌｙｓｉｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｐ．）（ＦＥＲＭ　ＢＰ－１１２０７）、及びコマモナスｓｐ．（Ｃｏｍａｍｏｎａｓ　ｓｐ．）（ＦＥＲＭ　ＢＰ－１１２０８）から成るＭＲＥ共生菌群から選択される１若しくはそれ以上の菌類を分解することによって生じる免疫賦活物質を有効成分として有する免疫増強組成物の治療上有効な量を用意する工程と、
    　前記用意した免疫増強組成物の治療上有効な量を前記哺乳動物に投与する工程と
    　を有することを特徴とする、方法。
  18. 　請求項１７記載の方法において、
    　前記哺乳動物はヒトである
    　ことを特徴とする、方法。
  19. 　請求項１７記載の方法において、
    　前記投与する工程は経口的に行われるものである
    　ことを特徴とする、方法。
  20. 　請求項１７記載の方法において、
    　前記投与する工程は非経口的に行われるものである
    　ことを特徴とする、方法。
  21. 　請求項２０記載の方法において、
    　前記非経口的に行われる投与する工程は、血管内投与、組織周囲および組織内注射、皮下注射、点眼投与、点鼻投与、経皮的投与、粘膜投与から選択されるものである
    　ことを特徴とする、方法。
  22. 　請求項１７記載の方法において、
    　前記自然免疫に関連する疾患は、顎関節炎、潰瘍性大腸炎、アトピー性皮膚炎、アレルギー性鼻炎を含むアレルギー疾患又は自己免疫疾患、日和見感染菌、ＨＩＶ、ＨＣＶ、及びＨＰＶを含む病原性細菌又は病原性ウイルス関連疾患、肝臓癌、前立腺癌、大腸癌、直腸癌、肺癌、膵臓癌、胃癌、悪性リンパ腫、糖尿病、高血圧、創傷、靭帯損傷、骨折、低温火傷、ニキビ、飛蚊症、辱創、蕁麻疹からなる群から選択されるものである
    　ことを特徴とする、方法。
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