KR101656252B1 - 면역 증강 조성물 및 그것을 제조하는 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은, 자연면역 및 그에 이어지는 림프구의 면역을 세포의 데미지 없이 활성화시킬 수 있는 효과적인 면역부활물질을 구비하는 면역 증강 조성물을 제공하는 것을 목적으로 하는 것으로서, 바실러스 sp.(Bacillus sp.)(FERM BP-11209), 리시니바실러스 후시폴미스(Lysinibacillus　fusiformis)(FERM　BP-11206), 바실러스 소노렌시스(Bacillus　sonorensis), 리시니바실러스 sp.(LysiniBacillus sp.)(FERM BP-11207) 및 코마모나스 sp.(Comamonas sp.)(FERM BP-11208)로 이루어지는 MRE 공생균군으로부터 선택되는 1 또는 그 이상의 균류를 분해함으로써 발생하는 면역부활물질을 유효성분으로서 구비하는 것을 특징으로 하는 면역 증강 조성물이다.

Description

면역 증강 조성물 및 그것을 제조하는 방법{IMMUNOPOTENTIATING COMPOSITION AND PROCESS FOR PRODUCING SAME}

본 발명은, 자연면역(自然免疫)을 자극함으로써 항균작용, 항바이러스작용, 항염증작용 및 항암작용을 증강시킴과 아울러 림프구계(lymph球系)의 면역 시스템에 영향을 미쳐 염증을 억제시키는 조성물에 관한 것이다.

구체적으로는, 본 발명에 관한 조성물은, 자연면역에 있어서 수용체(受容體)인 TLR이나 NLR 및 RIG 등을 자극하고, 또한 대식세포(macrophage), 내추럴킬러세포(natural killer cell), 내추럴킬러 T세포를 포함하는 자연면역 응답세포를 활성화시킴과 동시에, Th17 및 Th1 또는 Treg 등의 자연면역과 연동(連動)하는 림프구계 면역을 활성화시킨다. 또한 지나친 면역반응을 억제하는 IL-21을 생산하는 일련의 면역 프로세스의 활성을 유도함으로써, 항암작용, 항균작용, 항바이러스작용, 항염증작용을 증강시키고 CTL의 폭주에 기인하는 자가면역작용(自家免疫作用)을 완화시킨다.

최근에 생활 습관의 다양화에 따른 각종 질환의 증가에 비례하여, 자연면역이 맡은 역할의 중요성이 커지고 있다. 미국의 NIH 조성 프로젝트의 하나인, Steven B. Mizel에 의한 연구에서는, 자연면역에 있어서 리간드의 하나인 플라젤린(flagellin)과 페스트균 백신의 결합체에 의해, 백신에 대한 아쥬반트 효과(adjuvant效果)가 약 50만 배로 증강되는 것이 밝혀졌다. 그 성과는 자연면역의 가능성의 크기를 시사하는 것으로서, 자연면역에 있어서 리간드의 아쥬반트 효과에 대한 기대가 커지고 있다(비특허문헌1 및 비특허문헌2 참조).

자연면역에 있어서 수용체 또는 그 유사 센서는 동물, 식물, 미생물에 널리 존재하고 있다. 구체적으로는, 척추동물의 자연면역 수용체로서는 TLR(Toll-like-receptor), NLR(Nod-like-receptor) 및 RLR(RIG-like-receptor)이 세포의 내외에 존재하며, 균이나 바이러스 등이 분해되어서 생긴 물질(리간드)에 의해 균이나 바이러스 등의 외적(外敵)을 감지하고 패턴 인식에 의하여 판별하고 있다. 리간드는 분해되는 균이나 바이러스의 종류에 따라 복수 생성되고, 일반적으로 생성된 물질도 그 농도도 달라지기 때문에, 그들 리간드군의 조합에 의해 인식되는 패턴이 미묘하게 다르게 식별됨으로써 자연면역이 응답되고 있다.

인간의 상피세포 등의 자연면역 응답세포로는, 세포막 상에서 TLR-1&2, TLR-6&2, TLR-4&MD-2, TLR-5가 작용하고, 엔도솜(endosome)이나 식세포의 식포(食胞) 내에서 리소좀 효소군에 의해 분해된 균이나 바이러스의 핵산(DNA나 RNA)의 분해 단편이 TLR-3, TLR-7, TLR-8, TLR-9를 활성화시킨다. 세포질 내에는, 균의 저분자 분해물을 감지하는 수용체인 NOD1, NOD2, NALP3, NAIP5, IPAF 등의 NLR 수용체나, 바이러스의 저분자 분해물이나 핵산을 감지하는 RIG나 MDA-5 등이 작용하고 있다.

이들 자연면역의 센서인 수용체는, 각각의 균이나 바이러스의 분해물을 감지한 조합의 패턴에 따라서, 여러 가지 항균을 위한 인터류킨(interleukin)이나 I형의 인터페론(IFN-α family나 INF-β 그리고 INF-λ), 또는 이들의 유사물질을 방출하여 근린세포에 감지시킨다. 그리고 그것을 감지한 세포군이, 디펜신(defensin), 카텔리시딘(cathelicidin), 데르미시딘(dermicidin) 등의 항균물질이나 ISG라고 불리는 수백 종류에 이르는 항바이러스 물질군을 일제히 방출함으로써, 외적으로부터 자기편의 세포군을 방어하고 있다. 여기에서, 급속하게 변화되어 가는 바이러스에 대항해서 생체가 다수의 항바이러스 물질을 방출하고 있다는 사실은, 본 발명에 관한 조성물을 필요로 하는 이유의 하나가 되고 있다.

자연면역에 있어서 수용체의 제2의 역할은, 장관(腸管)을 가지는 다세포생물에 존재하는 식세포를 활성화하는 것이다. 식세포는 자연면역의 책임이 분담된 움직이는 세포로서 발달하고, 인간에게서는 대식세포나 호중구(好中球) 등이 그 역할을 담당하고 있다. 특히 대식세포는 면역의 사령관으로서 중요한 역할을 담당하고 있다. 자연면역의 센서인 수용체군이 자극되면 대식세포나 호중구와 그 동류(同類)들이 활성화되어, 균이나 바이러스 등의 외적과 싸우는 체제가 된다.

칠성장어와 먹장어(hagfish)를 제외한 척추동물에서는, 림프구계에 있어서 자기(自己), 비자기(非自己)를 식별하는 면역계가 발달해 면역 시스템을 보강하고 있다. 특히 포유류에서는 이 림프구계의 면역 시스템이 보체계(補體系; Complement System)를 기초로 고도화되고 강화되었다. 그러나 그 반면, 알레르기 질환(allergy疾患)이나 자가면역질환으로 괴로워하게 되었다.

특히, 포유류에서는, 대식세포, 수상세포(樹狀細胞), 랑게르한스세포, 마이크로글리아(microglia) 등의 자연면역 응답세포의 수용체가 각각의 리간드(특이적인 자극물)의 존재를 감지하면, T세포가 분화된 IL-12, IL-6, IL-4, TGF-β 등의 인터류킨 및 분화된 T세포를 활성화시키는 IL-1β, IL-23, IL-2 및 분화된 T세포의 활성을 억제하는 IL-2, IL-25, IL-27, IL-6 등이, 그 패턴 인식의 결과에 따라서 분비된다.

이들 프로세스는, Th17 또는 내추럴킬러 T세포로부터 IL-21을 방출시켜, 자기를 공격하는 항체를 가지는 B세포나 기억 T세포를 아포토시스(apoptosis) 또는 억제시킴으로써 자가면역질환에 빠지는 것을 방지하고 있다.

자연면역에 있어서 리간드의 여러 가지 조합, 자연면역에 있어서 리간드와 항원의 조합 등에 의하여 프로세스에 다양한 변화와 작용의 차이를 가져오는 것이, DNA 마이크로어레이(DNA microarray)에 의하여, DNA로부터 발현된 RNA의 동태 분석을 함으로써 밝혀져 왔다. 이것은, DNA나 RNA의 동태 분석 기술의 진보에 의하여, 자연면역이나 림프구계 면역(소위, 획득 면역) 발현의 프로세스, 세포의 아포토시스 경로, 염증 컨트롤(항균, 항암) 경로, 항바이러스 경로로의 스위칭, 염증 및 염증 억제의 프로세스 등의 변화를 시계열적(時系列的)으로 파악할 수 있게 되었기 때문이다.

이러한 자연면역의 TLR, NLR, RLR의 수용체와 그것에 이어지는 생리 프로세스의 해명은, 의료에 혁명을 일으킬 가능성을 품고 있다. 즉, 종래의 의학으로는 치료가 곤란하다고 하는 「각종 암 질환이나 발암 초기단계의 폴립(polyp) 형성」, 「HIV, HCV, HPV, HHV 및 신형 인플루엔자 등의 바이러스 질환」, 「항생 물질에 의한 내성균이나 체내 잠복균」, 「각종 알레르기 질환 등의 염증성의 질환」, 「각종 자가면역에 의한 염증성의 질환」 등에 대한 근본적인 해결의 길이 열릴 것으로 기대되고 있다.

이러한 기술의 흐름을 배경으로서, A. 「자연면역에 있어서 리간드의 효과적 조합」, B. 「자연면역에 있어서 리간드와 항원 백신의 조합」이 극히 중요한 의미를 가지게 되었다.

예를 들면, 종래에 자연면역에 있어서 리간드로서 보급되고 있는 것에는 LPS와 R-848과 이미다조퀴놀린 그리고 플라젤린이 있다. LPS는, TLR4와 MD2를 활성화시키는 리간드이며, 이미다조퀴놀린이나 그 유도체인 R-848은 TLR7을 활성화시키는 리간드이고, 플라젤린은 TLR5를 활성화시키는 리간드이다.

이미다조퀴놀린과 R-848은 같은 TLR7 활성이어도 다른 종류의 IFN-α를 생산시키기 때문에, 이미다조퀴놀린은 HPV(유두종 바이러스(papillomavirus))의 치료약으로서 사용되고 있고, R-848은 HHV(헤르페스 바이러스(herpesvirus))의 치료약으로서 사용되고 있다. 같은 수용체의 활성이어도 리간드의 차이에 의해 그 작용은 달라지는 것을 나타내고 있다.

또한 MDP(무라밀 디펩티드(muramyl dipeptide))와 그 유도체도 1985년대 경부터 주목받은 자연면역 리간드로서, TLR-2를 활성화시킨다. 유도체의 MDP-Lys가 아쥬반트로서 의약품이 되어 있다. 최근에 NLR을 활성화시킴으로써 다시 주목을 받고 있지만, 단독으로 사용되는 일은 없고, LPS나 리피드A(lipid A) 등 다른 리간드와 조합시킴으로써 그 리간드 효과를 높일 수 있다는 것을 알았다.

또한 특허문헌1에서는, IL-12를 생산하는 세균이나 효모와 IL-12를 생산하지 않는 세균이나 효모를 조합시킨 균으로 만들어진 복합 리간드에 의하여, 의외로 IL-10이 생산된다고 하는 것을 발견하였다.

이와 같이, 복합 리간드는 단일 리간드에 없는 상승효과를 가져오고 또한 작용점을 분산시킴으로써, LPS(엔도톡신(endotoxin))라고 하는 리간드에 혹시 폐해가 있다고 하면 그 리스크 분산을 가능하게 할 수 있다. 이러한 이유 때문에, 복합적으로 작용하는 리간드의 개발이 강하게 요구되고 있다. 특히 플라젤린의 강력한 아쥬반트 효과가 발견되고 나서는 중요한 의미를 갖기에 이르렀다.

현재의 의료는 하나의 벽에 부딪치고 있다. 의지하고 있는 항생 물질은, 바이러스에는 듣지 않고 내성균을 생성시킨다고 하는 심각한 문제를 안고 있다. 또한 아나필락시스(anaphylaxis)를 일으킨다고 하는 부작용도 있다. 스테로이드 등의 호르몬제나 면역억제제는 면역의 약체화(弱體化)를 통하여 병원균이나 기회감염균(opportunistic pathogen)에 감염이라고 하는 위험을 증대시키지만, 그 사용으로 인간을 포함하는 생명체를 정상화시킬 수 없다. 또한 인히비터(inhibitor)에 의한 치료도, 생체의 정상의 시스템을 저해하는 것에 의한 폐해가 강하게 지적되고 있다. 근치(根治)하지 못하는 약제를 계속해서 사용하는 것은 의료비의 증대에도 영향을 끼치고 있다. 이 벽을 타파하는 관점으로부터도, 안전하고 우수한 자연면역 활성 리간드의 실현이 요구되고 있다.

특허문헌1 : 일본국 공개특허 특개2008-31153호 공보 특허문헌2 : 일본국 공개특허 특개2006-265212호 공보 특허문헌3 : 일본국 특허공표 특표2007-506789호 공보 특허문헌4 : 일본국 특허공표 특표2006-514601호 공보 특허문헌5 : 일본국 특허공표 특표2005-530716호 공보

비특허문헌1 : Medical Tribune 2005.6.16 비특허문헌2 : Clin Vaccine Immunol. 2009 Jan;16(1):21-8. Epub 2008 Nov5 비특허문헌3 : J.Biol.Chem., Vol.282, Issue48, 34605-34610, November 30, 2007 비특허문헌4 : Nakanishi　K.et.al : Interleukin-18　regulates　both Th1 and Th2 responses. Annu. Rev Immunol19, 423-474, 2001 비특허문헌5 : 의학서원 표준면역학 p209 ∼ p211 비특허문헌6 : 나카니시 켄지(中西憲司) 「IL-18과 슈퍼 Th1형 알레르기 염증」 효고의과대학 비특허문헌7 : Immunity30(1) : 108-119, 2009 비특허문헌8 : Nature　2008년 7월 17일호 Vol.454 No.7202/P.350-352

본 발명은, 이러한 상황을 감안하여 이루어진 것으로서, 세포장애성이 없는 효과적인 조성물(리간드 또는 아쥬반트)을 제공하는 것을 목적으로 한다. 더 상세하게 말하면, 염증질환을 유발하지 않고 항균효과, 항바이러스 효과, 항암효과 및 CTL의 폭주 억제를 포함하는 염증 억제 효과를 구비하는 안정성이 높은 조성물(리간드 또는 아쥬반트)을 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한 본 발명은, 세포막을 용이하게 투과할 수 있는 저분자 조성물(저분자 리간드)을 제공하는 것을 목적으로 한다. 세포막을 용이하게 투과할 수 있는 것은, 세포 표면과 세포 내부의 엔도솜 및 세포질에 입체적으로 존재하는 자연면역 수용체를 복합적으로 자극하는 것이 가능해지는 것을 의미한다.

마찬가지로, 본 발명은 자연면역 수용체를 입체적으로 자극하는 조성물(리간드)을 제공하는 것을 목적으로 한다. 입체적인 조성물(리간드)의 실현에 의하여 그 상승효과를 기대할 수 있고, 안전성을 더 높이는 것이 가능해지기 때문이다. 또한 저분자화에 의하여 장관이나 피부로부터도 용이하게 흡수할 수 있는 면역활성제를 제공하는 것도 가능하게 된다. 또한 저분자이기 때문에 항체에 공격당하지 않는 조성물(리간드)이 실현되고, 주사제(注射劑)로서도 사용 가능하게 된다.

또한 본 발명은, 아쥬반트로서 이용할 수 있는 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명의 발명자의 한 사람인 미타라이 가오루는, 호기성(好氣性)의 토양균류(土壤菌類)를 일본 오이타현 사이키시 근교의 산중의 삼림에서 채취하고 오랜 세월 배양한 결과, 개성이 강하고 안정한 공생균군(共生菌群)을 얻어, 예의 연구·실험을 더욱 거듭한 결과, 본 발명을 완성하기에 이르렀다.

또한 본 발명자들은, 그 공생균군의 균체(菌體)를 분해해서 얻은 저분자 분해물을 발병한 HIV환자에게 주었더니, 그 용태(容態)가 현저하게 개선되고, 에이즈 발병의 지표인 CD4도 1개월 이내라고 하는 단기에 현저하게 증가하여 전원이 건강해지는 것을 알아내고, 이 공생균군을 「MRE 공생균군」이라고 명명했다. 이것은, MRE 공생균군의 분해 생성물이 환자에 있어서 자연면역을 증강시켜, 그 질환을 치료할 수 있는 것을 의미한다. 즉 본원 발명은, 대상이 구비하는 면역을 증강시킬 수 있는, MRE 공생균군의 분해 생성물을 포함하는 자연면역 증강 조성물을 제공하는 것이다.

따라서 본 발명의 제1의 주요한 관점에 의하면, 자연면역을 자극함으로써 대상이 구비하는 면역을 증강시키는 면역 증강 조성물로서, 바실러스 sp.(Bacillus sp.)(FERM BP-11209), 리시니바실러스 후시폴미스(Lysinibacillus　fusiformis)(FERM　BP-11206), 바실러스 소노렌시스(Bacillus　sonorensis), 리시니바실러스 sp.(Lysinibacillus sp.)(FERM BP-11207) 및 코마모나스 sp.(Comamonas sp.)(FERM BP-11208)로 이루어지는 MRE 공생균군으로부터 선택되는 1 또는 그 이상의 균류를 분해함으로써 발생하는 면역부활물질을 유효성분으로서 구비하는 것을 특징으로 하는 면역 증강 조성물이 제공된다.

또한 본 발명의 한 실시형태에 의하면, 이러한 면역 증강 조성물에 있어서, 상기 면역부활물질은 적어도 그 98중량% 이상이 평균분자량 1,000Da 이하의 친수성 저분자 물질이다.

또한 본 발명의 다른 실시형태에 의하면, 이러한 면역 증강 조성물에 있어서, 상기 면역부활물질은 대식세포, 내추럴킬러 세포 또는 내추럴킬러 T세포를 활성화시키는 것이다.

본 발명의 다른 실시형태에 의하면, 이러한 면역 증강 조성물에 있어서, 상기 면역부활물질은 수상세포, 마이크로글리아 세포, 랑게르한스세포 또는 쿠퍼세포(Kupffer's cell)를 활성화시키는 것이다.

또 다른 본 발명의 실시형태에 의하면, 이러한 면역 증강 조성물에 있어서, 상기 면역부활물질은 상피세포, 섬유아세포(纖維芽細胞), 케라틴세포(keratinocyte) 또는 골아세포(骨芽細胞)를 활성화시키는 것이다.

또 다른 본 발명의 실시형태에 의하면, 이러한 면역 증강 조성물에 있어서, 상기 면역부활물질은 Th17 또는 Th1을 분화 또는 활성화시키는 것이다.

또 다른 본 발명의 실시형태에 의하면, 이러한 면역 증강 조성물에 있어서, 상기 면역부활물질은 IL-21의 생산을 증강시키는 것이다.

또한 본 발명의 다른 실시형태에 의하면, 이러한 면역 증강 조성물에 있어서, 상기 면역부활물질은, 상기 MRE 공생균군으로부터 선택되는 1 또는 그 이상의 균류를 생육에 적당한 배양 조건하에서 배양하고, 얻어진 배양액을 기아상태(飢餓狀態)에 두고 에어레이션(aeration)을 함으로써 얻어지는 것이 바람직하다.

또한 본 발명의 다른 실시형태에 의하면, 이러한 면역 증강 조성물에 있어서, 이 면역 증강 조성물은, 알레르기 질환 또는 자가면역질환에 감염된 대상에 있어서 항염증제로서 사용되는 것이다.

이러한 경우에 상기 알레르기 질환 또는 자가면역질환은, 턱관절염, 궤양성 대장염, 아토피성 피부염(atopic dermatitis), 알레르기성 비염으로 이루어지는 군으로부터 선택될 수 있다.

또한 본 발명의 다른 실시형태에 의하면, 이러한 면역 증강 조성물에 있어서, 이 면역 증강 조성물은 병원성 세균 또는 병원성 바이러스에 대한 백신의 아쥬반트로서 사용되는 것이다.

이 경우에 상기 병원성 세균 또는 병원성 바이러스는, 기회감염균, HIV, HCV 및 HPV로 이루어지는 군으로부터 선택될 수 있다.

또한 본 발명의 다른 실시형태에 의하면, 이러한 면역 증강 조성물에 있어서, 이 면역 증강 조성물은, 간장암, 전립선암, 대장암, 직장암, 폐암, 췌장암, 위암, 악성 림프종, 당뇨병, 고혈압, 창상, 인대 손상, 골절, 저온 화상, 여드름, 비문증, 욕창, 담마진으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 질환에 걸린 대상을 치료 또는 예방하기 위한 의약 또는 동물약으로서 사용되는 것이다.

본 발명의 다른 실시형태에 의하면, 이러한 면역 증강 조성물에 있어서, 이 면역 증강 조성물은 식품 또는 사료로서 사용되는 것이다.

본 발명의 제2의 주요한 관점에 의하면, 자연면역을 자극함으로써 대상이 구비하는 면역을 증강시키는 면역 증강 조성물을 제조하는 방법으로서, 바실러스 sp.(Bacillus sp.)(FERM BP-11209), 리시니바실러스 후시폴미스(Lysinibacillus　fusiformis)(FERM　BP-11206), 바실러스 소노렌시스(Bacillus　sonorensis), 리시니바실러스 sp.(Lysinibacillus sp.)(FERM BP-11207) 및 코마모나스 sp.(Comamonas sp.)(FERM BP-11208)로 이루어지는 MRE 공생균군으로부터 선택되는 1 또는 그 이상의 균류를 준비하는 공정과, 상기 준비된 1 또는 그 이상의 균류를 분해하는 공정을 구비하는 것을 특징으로 하는 방법이 제공된다.

또한 본 발명의 한 실시형태에 의하면, 이러한 방법에 있어서, 상기 분해하는 공정은, 상기 준비된 1 또는 그 이상의 균류를 생육에 적당한 배양 조건하에서 배양하고, 얻어진 배양액을 기아상태에 두고 에어레이션을 함으로써 이루어지는 것이다.

본 발명의 제3의 주요한 관점에 의하면, 자연면역에 관련되는 질환에 걸린 포유동물을 치료 또는 예방하는 방법으로서, 바실러스 sp.(Bacillus sp.)(FERM BP-11209), 리시니바실러스 후시폴미스(Lysinibacillus　fusiformis)(FERM　BP-11206), 바실러스 소노렌시스(Bacillus　sonorensis), 리시니바실러스 sp.(Lysinibacillus sp.)(FERM BP-11207) 및 코마모나스 sp.(Comamonas sp.)(FERM BP-11208)로 이루어지는 MRE 공생균군으로부터 선택되는 1 또는 그 이상의 균류를 분해함으로써 발생하는 면역부활물질을 유효성분으로서 구비하는 면역 증강 조성물에 있어서 치료상 유효한 양을 준비하는 공정과, 상기 준비한 면역 증강 조성물에 있어서 치료상 유효한 양을 상기 포유동물에 투여하는 공정을 구비하는 것을 특징으로 하는 방법이 제공된다.

또한 본 발명의 한 실시형태에 의하면, 이러한 방법에 있어서, 상기 포유동물은 인간이다.

또한 본 발명의 다른 실시형태에 의하면, 이러한 방법에 있어서, 상기 투여하는 공정은 경구적으로 이루어지는 것이다.

또한 본 발명의 다른 실시형태에 의하면, 이러한 방법에 있어서, 상기 투여하는 공정은 비경구적으로 이루어지는 것이다.

이 경우에 상기 비경구적으로 이루어지는 투여하는 공정은, 혈관 내 투여, 조직 주위 및 조직 내 주사, 피하주사, 점안 투여, 점비 투여, 경피적 투여, 점막 투여로부터 선택되는 것이 바람직하다.

또 다른 본 발명의 실시형태에 의하면, 이러한 방법에 있어서, 상기 자연면역에 관련되는 질환은, 턱관절염, 궤양성 대장염, 아토피성 피부염, 알레르기성 비염을 포함하는 알레르기 질환 또는 자가면역질환, 기회감염균, HIV, HCV 및 HPV를 포함하는 병원성 세균 또는 병원성 바이러스 관련 질환, 간장암, 전립선암, 대장암, 직장암, 폐암, 췌장암, 위암, 악성 림프종, 당뇨병, 고혈압, 창상, 인대손상, 골절, 저온 화상, 여드름, 비문증, 욕창, 담마진으로 이루어지는 군으로부터 선택될 수 있다.

또, 상기한 외의 본 발명의 특징 및 현저한 작용·효과는, 다음의 발명의 실시형태 및 도면을 참조함으로써 당업자에게 있어서 명확해진다.

상기한 바와 같이 본 발명에 의하면, MRE 공생균군의 균체 분해에 의하여 발생하는 저분자의 면역부활물질을 이용해서 자연면역활성을 포함하는 면역기능을 효과적으로 증강시키는 면역 증강 조성물을 제공할 수 있다.

도1은, 나이브 T세포가 Th17, Th1, Th2, Treg로 분화되어 가는 프로세스를 나타낸 개략도이다.
도2는, 인간의 혈액을 사용한 IL-21의 생산 시험의 그래프이다. A ∼E의 5명의 무자극(Control)과 MRE 음료 6% 희석액을 첨가하였을 경우의 IL-21의 생산 농도를 비교하고 있다.
도3은, 인간의 혈액을 사용한 IFN-α의 생산 시험의 그래프이다. A ∼D의 4명의 무자극(Control)과 MRE 음료 6% 희석액을 첨가하였을 경우의 IFN-α의 생산 농도를 비교하고 있다.
도4는, 대식세포 단독으로의 TNF-α 생산 시험의 그래프이다. 무자극(Contol), LPS(엔도톡신)와 MRE 6% 희석액을 대식세포에 첨가하였을 경우의 TNF-α의 생산 농도를 비교하고 있다.
도5는, 인간의 혈액을 사용한 IFN-γ의 생산 시험의 그래프이다. A ∼D의 4명의 무자극(Control)과 MRE 음료 6% 희석액을 첨가하였을 경우의 IFN-γ의 생산 농도를 비교하고 있다.

MRE 공생균군은, 바실러스 sp.(Bacillus sp.)(FERM BP-11209), 리시니바실러스 후시폴미스(Lysinibacillus　fusiformis)(FERM　BP-11206), 바실러스 소노렌시스(Bacillus　sonorensis), 리시니바실러스 sp.(LysiniBacillus sp.)(FERM BP-11207) 및 코마모나스 sp.(Comamonas sp.)(FERM BP-11208)로 이루어지는 것으로서, 모두 호기성(好氣性)의 세균류이다.

또한 본 발명에 있어서 사용되는 「저분자」라는 것은, 세포막을 통과해 세포 내부에 영향을 끼칠 수 있는 분자량을 가지는 분자를 의미하는 것이다.

더 상세하게는, 본 발명에 의하면, 호기성 그람 양성균군과 호기성 그람 음성균군으로 이루어지는 MRE 공생균군을 리소좀 효소군 또는 리소좀 유사 효소군에 의해 균체 분해함으로써, 저분자 펩티드, 당사슬, 당지질, 저분자 핵산 분해물 등을 포함하는 균체 분해 생성물로 이루어지고 세포막 투과 가능한 저분자의 면역부활물질을 얻을 수 있다.

이 면역부활물질은, 세포막을 투과할 수 있기 때문에, 세포막 표면에 존재하는 TLR 수용체군 뿐만 아니라 엔도솜이나 식포에 존재하는 내부의 TLR 수용체군, 그리고 세포 심부(深部)에 존재하는 세균 감수성의 NLR 수용체군이나 바이러스 감수성의 RLR 수용체 등에도 도달하여, 깊이가 있는 입체적인 리간드 자극을 자연면역 응답세포에 주게 된다.

그리고 이 MRE 공생균군의 균체 분해로 얻어진 면역부활물질은, 그 대략 99%가 친수성이고 분자량 3,000 이하의 물질로서, MDP 유사물질을 포함하는 올리고펩티드나 올리고당사슬 및 1개 사슬 RNA 등의 성분으로 구성되어, 소위 프로테아제(protease) 등의 일반적인 소화효소에서는 얻어지지 않는, 세포독성이 없는 저분자 리간드 성분으로 되어 있다. 그 때문에 이 MRE 공생균군으로부터 얻어진 면역 증강 조성물은, 생체 내에 있어서 리간드로서 기능할 수 있다. 또한 복수의 혼재한 균으로부터 얻어진 리간드이기 때문에 다양해서, 자연면역 수용체는 여러 가지 패턴의 인식 자극을 동시에 받게 된다. 이것이, MRE 공생균군으로부터 얻어진 저분자의 면역 증강 조성물의 특징이다.

이하에 설명하는 본원 발명에 관한 실시형태 및 실시예에 있어서는, 상기와 같은 MRE 공생균군으로부터 얻어진 「면역 증강 조성물」을 편의상 「MRE 복합 리간드」라고 부르는 경우가 있지만, 모두 동의(同意) 또는 같은 뜻(同義)이다.

또한 본원 발명에 있어서 사용되는 「리간드」라는 것은, 면역 수용체 등에 특이적으로 결합함으로써 수용체의 활성화를 일으키는 물질을 말하고, 복합 리간드는, 복수의 리간드의 혼합물 또는 결합물을 말하는 것으로 한다. 또한 아쥬반트로서 작용하는 것도 「리간드」에 포함된다.

본원 발명에 관한 MRE 복합 리간드(면역 증강 조성물, 이하 같다)는, 세포 내외의 자연면역 수용체를 자극해서 대식세포, 수상세포, 쿠퍼세포, 마이크로글리아 세포, 랑게르한스세포, 내추럴킬러 세포, 내추럴킬러 T세포 등의 자연면역계의 면역세포 및 점막이나 피부의 상피세포, 섬유아세포, 장관에 존재하는 파네트세포(paneth cell) 등을 활성화시킬 수 있다.

또한 이 활성화에 의해 I형의 인터페론(interferon)이 생산되어, 이 인터페론의 방출에 의해 근린세포로부터 항균, 항바이러스 물질이 일제히 생산된다.

또한 본원 발명에 관한 MRE 복합 리간드에 의한 자연면역계의 면역세포의 활성화에 의하여 인터류킨 등의 물질이 혈액이나 림프액 안으로 분비된다. 이에 따라 림프구인 T세포를, 항균력, 항바이러스력, 항암력이 증강되는 Th1 및 TH17이라는 상태로 분화시켜 활발화 시킬 수 있다.

그리고 이들의 일련의 면역활성화 프로세스에 연속하여, 염증억제, 조직 수복(組織修復)의 프로세스를 시계열적으로 추진하게 된다. 특히, 본원 발명에 관한 MRE 복합 리간드는, TH17 등으로부터 자가면역을 억제하는 기능을 구비하는 IL-21을 생산할 수 있다.

본 발명은 이와 같이, 항균, 항바이러스, 항암, 항염증효과와 그에 연속하는 자가면역억제 효과를 구비하는 신규의 저분자 면역부활물질을 구비하는 면역 증강 조성물을 제공할 수 있고, 이에 따라 상기한 본원 발명에 관한 과제를 해결한다.

여기에서 본 발명을 구체적으로 설명하면, 본원 발명은, 상기한 바와 같이 고농도 배양 없이 균체 분해해서 충분한 효과를 발휘하는 우수한 면역부활물질을 생성하는 MRE 공생균군이라고 하는 신규의 미생물 공생균군을 발견하여, 그것을 이용한 면역 증강 조성물을 제공하는 것이다. 그리고 이 MRE 공생균군은, 호기성 그람 양성균 및 호기성 그람 음성균으로 이루어지는 5종류의 균으로 구성되어 있다. 이들 균군은 단순히 자연에 존재하는 균의 혼합물이 아니라, 여러 가지 토양균과 해산물에 부착된 균을 장기간 계속해서 배양한 결과, 당초의 균의 심한 생존 경쟁을 거치고, 그 경쟁 속에서 상호 역할분담을 찾아내고, 또한 균의 변이 또는 진화에 따라 안정적으로 변화되어 출현한 개성적인 5종류의 균으로 이루어지는 공생균군이다.

이 MRE 공생균을 구성하는 5종류의 균군은, 호기성 그람 양성균인 바실러스 sp.(Bacillus sp.)(수탁번호 FERM　BP-11209, 식별번호 MK-005), 리시니바실러스 후시폴미스(Lysinibacillus　fusiformis)(수탁번호 FERM　BP-11206, 식별번호 MK-001), 바실러스 소노렌시스(Bacillus　sonorensis)(식별번호 MK-004), 리시니바실러스 sp.(LysiniBacillus sp.)(수탁번호 FERM　BP-11207, 식별번호 MK-002) 및 호기성 그람 음성균인 코마모나스 sp.(Comamonas sp.)(수탁번호 FERM　BP-11208, 식별번호 MK-003)로 이루어지는 것이다.

여기에서 수탁번호 FERM　BP-11206(평성20년 3월 19일에 기탁된 수탁번호 FERM P-21548으로부터 이관), 수탁번호 FERM　BP-11207(평성20년 3월 19일에 기탁된 수탁번호 FERM　P-21549로부터 이관), 수탁번호 FERM　BP-11208(평성20년 3월 19일에 기탁된 수탁번호 FERM　P-21550으로부터 이관), 수탁번호 FERM　BP-11209(평성21년 2월 2일에 기탁된 수탁번호 FERM　P-21760으로부터 이관)는, 일본 독립법인산업종합기술연구소의 생물기탁센터에 기탁되어 있는 균이다.

다음에, 본원 발명에 있어서 「공생균군」의 특징에 대해서 설명한다. 복수의 균을 혼합해서 배양하면 주지된 바와 같이 일시적으로 불안정한 상황이 발생한다. 발효에 이용되는 누룩곰팡이와 효모균이나 고초균과 다른 바실러스균과 같이 영양의 서식지 분할(habitat partitioning based on nutrients ; 이종생물군이 생활공간이나 생활시간·시기를 나눠 경쟁을 회피하여 공존하는 현상)도 일어나지만, 한편으로는, 심한 유기물의 쟁탈전이나 프리 라디컬에 의한 상호 공격, 그리고 부영양가 하에서도 일정한 비율로 일어나는 내포자화(內胞子化(endospore化))에 따른 바실러스균에 의한 펩티드형 항생 물질에 의한 공격이나, 최근 해명된 효모균에 의한 항생 물질(펩티드)에 의한 반격 등 심한 생존 경쟁이 벌어진다. 그러한 심한 생존 경쟁의 시기를 거쳐, 영양에 대한 서식지 분할이나 항생 물질에 대한 내성의 획득 그리고 프리 라디컬의 제거능력을 가지는 단쇄 펩티드나 분자 샤페론(molecular chaperone)의 방출에 의한 효소변성에 대한 방어 등에 더하여, 완전히 다른 종의 균끼리로 상호 생존이나, 성장을 돕는 저분자 펩티드를 서로 교환하는 것까지 알려져 있다. 최종적으로는, 플라스미드를 포함하는 유전자의 교환에 의해 상호 능력을 교환함으로써 미생물군의 전체의 공존과 안정성을 꾀하려고 한다.

또한 본원 발명에 관한 MRE 공생균군은, 그들이 생육 가능한 환경하이면 어떠한 조건하에 있어서도 생육될 수 있고, 구체적으로는, 분자생물학 분야에 있어서 보통 사용되는 배양 조건에서 생육 가능하다. 예를 들면 후술하는 바와 같이, 배양폭기조에 있어서, 에어레이션(폭기(曝氣))을 하면서, 어분(魚粉) 10kg, 쌀겨 10kg, 깻묵 5kg, 육즙 1kg의 영양원에 더하여, 또 황산마그네슘 등의 미네랄 등의 존재하에 두고, PH6.0∼6.8, 배양온도 25℃∼35℃ 및 적절한 에어레이션에 의해 배양할 수 있다. 바람직하게는, 상기 영양원은, 어분 5kg, 쌀겨 5kg, 깻묵 2.5kg, 육즙 0.5kg이다. 그러나, 본원 발명에 관한 MRE 공생균군의 배양 조건은, 이들 설정 조건에 한정되는 것은 아니다.

본원 발명에 관한 MRE 공생균군에서는, 유전자 교환을 활발하게 하는 단계까지 진행하고, Bacillus sp.와 같이 균체 융합에 가까운 이상한 균체로까지 변이, 진화하고 있다.

여기에서 MRE 공생균을 구성하는 개개의 균에 대해서 설명한다.

MRE 공생균을 구성하는 각각의 균의 16SrDNA는, 다음과 같다.

본원 발명에 있어서, 이들 MRE 공생균의 배양은, 공지의 호기성Bacillus균과 같은 방법으로 배양할 수 있다. 일반적인 한천배지(Nutrient Aga)의 배양 플레이트에서도 가능하고 폭기한 액체용기 안에서도 가능하다.

[균체 분해의 방법]

여기에서 본원 발명에 관한 MRE 공생균군을 균체 분해하여 저분자의 MRE 복합 리간드를 얻는 2개의 방법을 이하에 설명한다.

제1의 방법은, MRE 공생균군을 리소좀 효소군으로 분해해서 저분자 복합 리간드를 얻는 방법이다.

제2의 방법은, MRE 공생균군의 포자(spore) 형성 과정에서 출현하는, 원시적인 리소좀 상동(相同)의 모세포 융해 효소군으로 분해해서 저분자 복합 리간드를 얻는 방법이다.

이들 방법을 취하는 이유는, 통상의 소화효소나 보통의 프로테아제 등의 분해효소로는 세포막을 투과하는데 필요한 분자량의 리간드가 얻어지지 않기 때문이다.

이에 대하여 동물의 리소좀이나 식물의 액포나 과실 등에서 분비되는 효소군은, 세포 내의 세포소기관(organelle)이나 고분자물질을 일괄해서 벌크(bulk)하게 저분자까지 분해하는 능력을 가지고 있다.

리소좀 효소군은, 세포 내에서 노후화한 세포소기관을 분해해서 젊어지게 하기 위한 자가소화작용(autophagy)이나 암세포나 바이러스 감염 세포가 아포토시스하는 최종단계에서 출현하는 효소군으로서, 특히 세포 내로 침입해 온 세균을 엔도솜 내에서 분해할 때에 활약하는 것이 알려져 있다.

그 상동 효소군은, 동물, 식물, 미생물의 자가소화작용이나 아포토시스의 과정에서 나타나는 것이 알려져 있다. 식물에서는 프로세싱 효소라고 불리고, 액포 내 또는 과실의 형성 과정에서 출현하는 효소군이기도 한다. 이들 효소군에 의해 균체는 세포막을 투과할 수 있을 만큼 작은 저분자로 분해된다.

본원 발명에 관한 리소좀 효소군으로서는, 핵산분해효소인 리보뉴클레아제(ribonuclease), 디옥시리보뉴클레아제(deoxynuclease) 등, 콜라겐(collagen) 분해효소인 카텝신L, 아스파라긴산 프로테아제인 카텝신D 및 카텝신E, 시스테인 프로테아제인 카텝신K, 카텝신B 및 카텝신S, 세린 프로테아제인 카텝신G, 아미노펩티다아제(aminopeptidase)인 카텝신H 등의 강력하고 다기능의 능력을 가지는 단백질분해효소, 또한 아릴설파타아제(arylsulfatase), β글루쿠로시다아제(βglucurosidase), 에스테라아제(esterase), 산성포스파타아제(phosphatase) 등에 더하여, 당사슬 분해효소로는, 스핑고지질(sphingolipid)을 분해하는 α갈락토시다아제(α galactosidase), β헥소사미니다아제(hexosaminidase)A 및 B, 아릴설파타아제A, 갈락토실세라미다아제(galactosylceramidase), 글루코실세라미다아제(glucosylceramidase), 산성 스핑고미엘리나제(酸性 sphingomyelinase), 산성 세라미다아제 등, 당단백을 분해하는 α후코시다아제(α fucosidase), α 및 β만노시다아제(mannosidase), 뉴라미니다아제(neuraminidase), 아스파르틸글루코사미니다아제, α-N-아세틸갈락토사미니다아제 등, 무코다당류(mucopolysaccharide)를 분해하는 α이듀로니다아제(iduronidase), 이듀로네이트설퍼타아제(iduronate sulfatase), 헤파란N설퍼타아제(heparan N sulfatase), α-N-아세틸글루코사미니다아제, 6설퍼타아제, 갈락토오스6-설퍼타아제, β갈락토시다아제, 아릴설파타아제B, β글루쿠로니다아제(βglucuronidase) 등 및 산성리파제(酸性lipase)와 같은 콜레스테릴에스테르(cholesteryl ester)나 지방 분해의 효소, 또 중요한 것으로 병원성의 원핵미생물 등의 세포벽을 형성하는 펩티도글리칸(peptidoglycan) 층을 분해하는 뮤라미다아제(muramidase), 무코펩티드 히드로라아제(mucopeptide hydrolase) 등을 포함하는 50 이상의 분해효소를 사용할 수 있다. 또한 카텝신K에 유사한, 파란 파파야의 리소좀 상동분해효소인 파파인(papain) 등도 이용 가능하다.

이들 리소좀 효소군은, 약산성(PH6.3∼PH6.8)에서 작용하고, 통상의 소화효소의 활동이 억제되는 고온영역(38℃∼42℃)에서 활성이 높아지는 성질이 있다. 또한 그 중에는 분해력이 매우 높은 것이 많은데, 통상의 소화효소의 5,000배로부터 1만배의 분해력을 가지는 것까지 존재한다.

본원 발명에 관한 MRE 공생균군으로부터 MRE 복합 리간드를 얻는 제1의 방법은, 이들 리소좀 효소군 중에서 세포벽 분해효소와 카텝신류 및 핵산분해효소를 조합시켜서 사용하는 방법이다.

세포벽 분해효소로서는 뮤라미다아제, 무코펩티드 히드로라아제 등이 사용되고, 카텝신으로서는 카텝신B, 카텝신D, 카텝신L 및 카텝신K 또는 파파인 등이, 핵산분해효소로서는 리보뉴클레아제, 디옥시리보뉴클레아제 등이 사용된다. 이들의 효소는, DNA나 플라스미드에의 유전자조립에 의해서도 만들 수 있지만, 어류(장어를 포함)를 무균의 상태에서 고온(38℃∼45℃)이고 습기가 많은 환경에서 자기분해(自己分解)시킴으로써 얻을 수도 있다. 과실이 익어질 때에 생산되는 파파인 등의 리소좀 효소군을 사용함으로써 얻을 수도 있다.

그러나 이 제1의 방법은, 여러 가지 효소의 블렌드 비율을 변화시켜서 균체 분해를 조정할 수 있다고 하는 장점이 있는 반면, 현재의 상태에서는 효소가 비싼데다가 취급이 어렵고 특별한 장치를 필요로 하는 것도 있어서, 비용이 많이 든다고 하는 결점이 있다.

MRE 공생균군으로부터 저분자 복합 리간드를 얻는 제2의 방법은, 포자 형성 과정에서 방출되는 원시적인 모세포 융해 효소를 그대로 이용하는 방법이다. 효소배합의 비율은 변경할 수는 없지만, 매우 저비용으로 대량생산이 가능하고 우수한 리간드가 얻어진다. 이 방법은, MRE 공생균군의 포자화에 따라 방출되는 모세포 융해 효소군을 균체 분해에 이용해서 저분자 복합 리간드를 얻는 방법이다.

또, 본원 발명에 있어서 사용되는 「모세포 융해 효소군」 또는 「모세포 융해 효소」라는 것은, 균류세포의 포자 형성 과정에 있어서 생산되는 리소좀 상동효소군을 가리키는 것이다.

본원 발명에 관한 저분자의 MRE 복합 리간드의 제조는, 제1단계에서는 MRE 공생균군을 혼합 배양액에 투입하고, 어분, 쌀겨, 깻묵, 육즙 등 및 황산마그네슘 등의 미네랄을 균의 영양물로 하고, 배양PH6.0∼6.8, 배양온도 25℃∼35℃에서 충분한 에어레이션(폭기 : 용존산소농도 0.1mg/L∼1.0mg/L)을 가한 배양 조건하에서 배양한다. MRE 균군의 증식과 안정화를 기다리며, 일절의 영양을 끊어서 기아상태하에 두고 에어레이션(폭기)을 속행하면 질소성분의 고갈을 트리거로 포자화(내포자화)가 일어난다. 이 경우에 포자화 하기 전의 영양세포를 다른 폭기조로 이동하면 더 안정한 품질의 것이 얻어진다. 이렇게 하여 MRE 공생균의 균체를 저분자까지 분해할 수 있다.

본원 발명에 관한 균체 분해의 과정을 더 상세하게 설명하면, 균 상호의 공생관계를 구축하고, 안정한 균의 공생체(共生體)에 있어서 영양세포 상태에 있는 혼합균을 그 영양세포로부터 분비된 소화효소군을 포함하는 이 배양액과 함께 별도의 폭기배양조에 분별(分別)한다. 이 폭기배양조에서 실리카 이외의 영양을 일절 주지 않고 에어레이션을 속행한다. 공생상태에 있는 MRE 균군의 자가포식소체(autophagosome) 상동의 모세포 융해가 시작되어, 리소좀 상동의 모세포 융해 효소군을 방출하면서 균의 모세포는 벌크하게 분해되어 소멸해 간다. 포자화가 완료된 것을 확인한 뒤에 에어레이션(산소공급)을 멈추면, 포자(스포어)는 일제히 침전을 비롯하여 투명한 상등액을 얻는다. 이렇게 해서 얻어진 상등액을 0.2μm의 멤브레인에 의하여 가압 여과해 잔존 포자를 제거한 후에, 또 0.02μm의 필터로 미소 포자나 불순물을 제거한다. 이렇게 MRE 공생균체군의 포자 형성시의 모세포 융해 효소군을 이용함으로써, 효과적인 저분자 MRE 복합 리간드를 얻을 수 있다. 또한 분별 프로세스를 연구함으로써 연속 생산도 가능해진다.

이와 같이 MRE 공생균에서는, 고농도 생산하지 않아도 충분하게 유효한 MRE 복합 리간드를 얻을 수 있지만, 고농도 생산을 하는 것도 또 가능하다. 그 경우에 영양세포화와 포자화를 반복하면, 영양세포가 복합 리간드를 흡수해버려서 효율이 나빠지고 항생 물질의 생산이 증가하기 때문에, 고밀도 배양한 후에 한 번에 포자화하는 것이 중요하다. 포자화에 있어서 실리카 영양을 줌으로써 효율이 더 좋아지는 것은 이미 알려져 있다.

한 번에 포자화한 것은, 항생 물질도 거의 포함하지 않아 검출 한계 이하였다.

이렇게 하여 얻어진 저분자 복합 리간드는, 다음과 같은 분자량 분포를 가지는 올리고펩티드, 1개 사슬의 RNA저분자 분해물, 올리고당사슬이나 당지질, MDP(무라밀 디펩티드) 유사물질 및 플라젤린 분해물 등이 포함되어 있다.

MRE 복합 리간드의 분자량 분포를 이하에 나타내면 표2와 같다.

이와 같이 본 발명의 MRE 복합 리간드는, 그 98% 이상이 올리고펩티드, 올리고당사슬, 올리고 레벨의 핵산, 그 밖에 올리고 영역의 당펩티드나 당지질을 포함하는 친수성의 1000 이하의 저분자물질로 구성되어 있다. 이렇게 하여 얻어진 저분자 복합 리간드는, 엔도톡신과 같은 독성을 가지지 않고, 또한 저분자이므로 항체에 의하여 직접 공격을 받지 않는다.

또한 MRE 복합 리간드는, LPS나 펩티도글리칸의 존재를 검출할 수 있는 엔도톡신 검사에 의해서도 검출 한계 이하라는 결과가 나오고 있어, LPS나 펩티도글리칸이 포함되어 있지 않은 것이 증명되고 있다. 또한 대식세포나 내추럴킬러 세포 등의 활성을 시험하기 위해서 하는 세포장애시험에 의하여서도, 침투압(浸透壓)에 의해 파괴되는 한계 농도까지 세포장애가 없는 것을 알 수 있다. 또한 토끼를 사용한 급성독성시험도 클리어하고 있다.

이와 같이 저분자화 함으로써 독성이 매우 적은 리간드가 얻어진다고 하는 메리트 이외에, 장관으로부터의 흡수나 점막으로부터의 흡수가 가능하기 때문에 음료로서 고효율로 섭취할 수 있다고 하는 중요한 메리트도 있다. 친수성이고 또한 분자량이 올리고 영역이으므로 이론적으로는 피부로부터의 흡수도 가능하다.

다음에, 본 발명의 MRE 복합 리간드에 의한 자연면역활성과 그에 이어지는 일련의 면역 프로세스 활성을 밝히기 위해서, 인간의 대식세포를 사용하여, DNA마이크로 어레이에 의한 망라적인 DNA 동태 분석과 리얼타임 PCR에 의한 확인 시험을 실시했다.

또한 인간의 혈액의 면역세포군(대식세포, 수상세포, 랑게르한스세포, NK세포, NKT세포, T세포군, B세포군 등)을 분리하여, MRE 복합 리간드에 의한 각 사이토카인(cytokine)의 생산량에 대해서 항체를 이용해서 조사했다.

사용한 MRE 복합 리간드 함유 원액은, MRE 복합 리간드 함유 저분자 성분을 80μg/ml 함유하고 있다.

예비시험으로서, TNF-α의 생산량을 리얼타임 PCR에 의해 측정하여, 표3과 같이 통상의 90.46배의 생산이라고 하는 결과를 얻었다. 여기에서Med는 무자극을 의미한다. LPSp는 엔도톡신으로 자극한 경우. MRE 1/10은 MRE 복합 리간드 함유 원액을 10배 희석한 것, 이하 100배 희석, 1000배 희석한 것이다. 비교를 위한 LPSp의 농도는 100ng/ml이다.

이와 같이 대식세포 단독으로는 MRE 복합 리간드 함유 원액의 10배 희석액에 의한 자극에 의해 TNF-α는 그 생산량이 통상의 90.46배에 달하고, 비교의 LSPs와 비교하여도 7.5배 더 생산하고 있다. 이것은 MRE 복합 리간드가 높은 대식세포 활성력이 있는 것을 나타낸다(도4 참조).

한편, TNF-α의 생산력이 높다고 해서 염증을 촉진하는 것은 아니라는 것에 주의를 할 필요가 있다. 이 수치는, 대식세포 활성능력이 높은 것을 나타내는 것에 지나지 않는다.

왜냐하면, 생명은 염증을 일으키는 물질을 발현하면서 동시에 염증을 억제하는 물질을 약간 내보내는 것과 같이, 항상 균형을 취하면서 파도와 같이 면역 프로세스를 진행시켜 가는 것이 이번의 망라적인 DNA 동태 분석에 의해 드러났다.

그 하나의 증거로 표4에 나타나 있는 바와 같이, 여러 가지 면역세포를 포함하는 인간의 혈액을 사용한, MRE 복합 리간드 함유 원액에 의한 자극에서는, TNF-α를 생산하지 않고, 또한 많은 임상치험(臨床治驗)으로부터도 반대로 항염증작용이 있는 것이 확인되고 있다.

이것은, 면역의 프로세스 전체를 통해서 리간드 효과나 아쥬반트 효과를 평가할 필요가 있고, 단지 어떤 리간드에 의해 어떤 사이토카인이 생산되었기 때문에 효과가 있다고 하는 단순한 이론은 통용되지 않는 것을 나타낸다.

MRE 복합 리간드로는, 자연면역활성과 그에 이어지는 항바이러스, 항균, 항염증, 조직 수복이라고 하는 면역 프로세스를 활성화시켜 생체를 정상화시킬 수 있다. 말하자면, 획기적인 리간드 또는 아쥬반트라고 말할 수 있는 것이다.

이 자연면역활성화로부터 림프구면역 활성화, 그리고 항염증, 조직 수복으로의 프로세스를 시계열순으로 더 상세하게 설명하기로 한다.

A. 자연면역 수용체(TLR, NLR, RLR)의 활성화

이 MRE 복합 리간드는 자연면역에 있어서 수용체인 TLR-2, TLR-7, TLR-8과, NLR-2를 포함하는 NLR군을 활성화시키는 것이, 망라적인 DNA 동태 분석에 의해 확인되었다. TLR-2는, 세포표면에 존재하는 자연면역 수용체로서, 그람 양성균의 펩티도글리칸, 리포테이코산(lipoteichoic acid), 리포프로틴(lipoprotein), 바이러스의 당단백, 진균(眞菌)의 다당류 등을 감지한다. MRE 복합 리간드에서는 분자량 1000 이하의 MDP와 같은 펩티도글리칸 분해물이 작용하고 있다.

TLR-7과 TLR-8은, 둘 다 세포의 엔도솜에 존재하며 1개 사슬 RNA를 감지하는 수용체임과 동시에 균이나 바이러스가 균체 분해된 저분자 물질을 감지하는 수용체이기도 하다. 본 발명의 MRE 저분자 복합 리간드에서는, 분자량 1000 이하의 1개 사슬 RNA를 감지한다고 생각된다. 그리고 이 사실은, 본 발명이 RNA 바이러스에 대한 높은 아쥬반트 효과를 기대할 수 있는 것을 뜻하고 있다.

또한 NLR-2를 포함하는 NLR은 세포 내부에 존재하는 원시적인 수용체로서, 세균이나 바이러스 등이 저분자 분해된 것을 감지할 수 있다. 특히, NLR-2는 대식세포나 수상세포, 랑게르한스세포, 쿠퍼세포 등의 APC(항원 제시 세포)에 특이적으로 발현되고 있는 수용체이다. MRE 저분자 복합 리간드에 의해 활성화되는 이 NLR 수용체군은 MDP 유사물질 등의 저분자 리간드류를 감지할 수 있어, 이것 역시 아쥬반트로서도 매우 유효한 기능을 하는 것을 기대할 수 있다고 할 수 있다.

이와 같이 본 발명의 MRE 저분자 복합 리간드는, 세포표면에 존재하는 수용체, 엔도솜에 존재하는 수용체, 세포 내에 존재하는 수용체와 3개의 자연면역의 센서에 의해 입체적으로 감지되는 것을 알 수 있다.

B. 대식세포 활성과 내추럴킬러 세포 활성화

다음에, MRE 복합 리간드에 의해 동물의 자연면역의 주역인 대식세포 활성과 내추럴킬러 세포 활성 및 호중구 이동(遊走)을 유발하는, 대식세포로부터의 IL-8 생산이 확인되었다. 호중구는 자연면역의 식세포의 하나이다.

여기에서 MRE 복합 리간드에 있어서 대식세포의 활성화 시험의 데이터를 보면, 무자극의 배양액에서는 NO 생산능이 0.446μM인 것에 대해, MRE 복합 리간드 함유 원액의 10배 희석액에서는 NO 생산능이 24.059μM이어서, LPSp의 0.1ng/ml액에 의한 18.712μM보다 큰 값이다.

또한 중요한 것은, 표5에 나타나 있는 바와 같이 LPS에서는 농도가 커지면 생존 세포 수는 저하하는 것에 대해, MRE 복합 리간드에서는 농도가 커지면 생존 세포 수가 증가하는 점이다. 이것은 MRE 복합 리간드의 우수한 점으로서, 아쥬반트로서 이용할 때에도 면역세포의 생존율을 높이면서 면역을 증강시키므로 유리하다는 것을 의미한다.

이 대식세포의 생존 세포 시험은, 대식세포의 플레이트 부착율을, 크리스탈 바이올렛으로 염색해 570nm의 흡광도를 사용해서 생존 세포 수의 지표로서 측정했다.

또한 내추럴킬러 세포에서도, 후술하는 바와 같이 인간의 혈액을 사용한, MRE 복합 리간드 함유 원액의 NK활성화 시험에서, 평균 1.73배(56.2/Very　High)라는 결과를 얻고 있다.

C. 자연면역 수용체 자극으로부터 그 패턴에 따른 스위칭 프로세스

리간드나 아쥬반트가 TLR, NLR, RLR 등의 자연면역 수용체를 자극하면, 세포의 활성화가 유도됨과 아울러, 그 다양한 패턴에 따라 「항바이러스 물질생산 프로세스」, 「염증시작 및 지연적(遲延的) 염증억제 프로세스(항균, 항암, 염증 수복 프로세스)」, 「아포토시스의 프로세스」로 이행하는 3종류의 프로세스로의 스위칭(절환)이 이루어진다.

본 발명에 관한 MRE 복합 리간드가 대상에 작용하면, 전자 2개의 프로세스가 진행하고 「아포토시스의 프로세스」가 저지되고 있는 것이 망라적 DNA 동태 분석으로 밝혀졌다.

「아포토시스로의 프로세스」는, FADD가 아포토시스의 트리거가 되어 카스파아제8(caspase8) 효소나 카스파아제10 효소가 활성화하여, 실행부대효소(實行部隊酵素)인 카텝신D나 카텝신B 등의 아포토시스 분해효소군을 유발하는 일련의 아포토시스를 야기하는 프로세스이다.

본원 발명에 있어서는, 아포토시스를 유도하는 유전자군의 AP1류의 발현은 보통 레벨이고, 아포토시스를 억제하는 유전자인 JUN(통상의 6.77409배)이 발현되어, 아포토시스를 야기하는 시토크롬C(cytochrome C)가 미토콘드리아로부터 방출되지 않도록 방어하고 있는 유전자 SOD2(통상의 8.99963배)도 발현되어서, 아포토시스를 저지하고 있는 것이 확인되었다.

D. 자연면역 수용체 자극으로부터 I형 인터페론의 생산으로의 프로세스

「항바이러스 물질생산 프로세스」는, 자연면역 본래의 프로세스의 하나로서, TLR3, TLR7, TLR8 및 RGR 등의 자극에 의하여 TRAM 및 TRIF의 발현이 일어나고, 그에 계속되어서 IKK의 활성, IRAK3, IRAK7 등의 활성과 같은 일련의 프로세스 활성이 전파되어 가, 그 결과 I형의 INF-α(현재 13종류가 알려져 있다)와 INF-β가 생산되어 세포 밖으로 방출된다. 이 프로세스는 단세포시대에 만들어진 구조라고 생각되지만, 인간 등에게서는 이들 인터페론의 방출에 의해 상피세포나 점막세포 등 근린세포로부터 항바이러스 물질인 ISG(수백 종류가 알려져 있다)가 일제히 방출된다.

이 프로세스는 자연면역 본래의 역할이기도 하며, 자극의 패턴에 의해 생산하는 항바이러스 물질인 ISG의 조합이 달라져 온 것이 알려져 있다. 예를 들면 인플루엔자에는, IFIT1, G1P3, G1P2, OAS1, M1X1, IFIH1, IFIT3, RIG-I, GBP1, LAMP3, IRF7, ISGF3G, WARS, PSMBS, BTC, SOCS1, SERPING1 등의 항바이러스 물질을 방출하여, 바이러스의 변이에 대처한 항바이러스 효과를 발휘하고 있다. MRE 복합 리간드에 있어서는, 이 프로세스의 사전에 활성화함으로써 인플루엔자 등의 바이러스에 감염되었을 때에 바로 강력하게 I형 인터페론을 만들어내는 것이 가능해져, 항바이러스력을 효과적으로 증강시킨다. 즉 아쥬반트 효과가 매우 높아지게 된다.

MRE 복합 리간드에 의한 자연면역 수용체 자극에 의하여, 바이러스가 존재하지 않는 상태에서 실제로 I형 인터페론의 생산이 일어나는 것을 다음과 같이 확인했다.

표6은, 바이러스 감염이 없는 상태에서 MRE 복합 리간드에 의해 I형 인터페론의 유전자의 발현이 어느 정도 증가할지에 대해서, 망라적 DNA 동태 분석을 이용해서 밝힌 것이다.

이와 같이, MRE 복합 리간드에 의해서 IFN-α와 INF-β의 의미 있는 증가를 볼 수 있다.

후술하는 바와 같이, 인간의 신선한 혈액을 채혈하여 사용한, MRE 복합 리간드에 의한 I형 인터페론 생산의 측정에서도, INF-α의 생산량이 더 많아지고 있다(도3 참조).

이렇게 MRE 복합 리간드는, 항바이러스를 위한 아쥬반트로서도 부작용이 없는 효과가 있다고 생각된다.

MRE 복합 리간드에 의한 대식세포에의 자극에 의하여, 표7과 같은 항균물질의 유전자가 직접 발현되고 있었다.

이 프로세스는 해명되지 않았지만, Th17 세포를 거치지 않고 직접 항균물질이 방출되는 프로세스도 마찬가지로 활성화된다고 생각된다.

이들 프로세스는, 대식세포의 형제인 수상세포, 마이크로글리아 세포, 쿠퍼세포, 랑게르한스세포, 섬유아세포, 그 밖에 같은 자연면역 수용체가 발현되는 상피세포나 케라틴세포(keratinocyte) 및 기관(氣管), 소화관, 요관(尿管)을 포함하는 각 장기(臟器)에 배치된 자연면역 응답세포의 활성화도 마찬가지로 일어나게 된다.

E. 염증시작 및 지연적 염증억제 프로세스=항균, 항암, 염증 수복 프세스

이 프로세스는, 자연면역에 있어서 수용체 자극으로부터 T세포를 활성화시키는 인터류킨류를 생산할 때까지의 프로세스로서, 다음의 2단계의 프로세스로 이루어져 있다.

제1단계의 프로세스에서는, TLR 수용체의 자극에 의해 MYD88, IRAK1, IRAK4 활성화, TRAF6 등의 프로세스를 거쳐서 NF-κB로부터 I-κB를 분리시켜 NF-κB를 활성화시킨다.

또한 NLR 수용체에서는, 리간드의 자극을 받은 NLR 수용체가 페어가 되고, RICK가 NLR의 CARD를 통하여 결합한다. 그러면, RICK에 유비퀴틴(ubiquitin)화가 일어나서, TAK1이나 MEMO 등의 복합체가 더 결합하여 IKKβ를 활성화해 NF-κB로부터 I-κB를 분리시켜 NF-κB를 활성화시킨다.

이와 같이 하여 활성화한 NF-κB는 AP-1과 함께 DNA에 결합해서 작용하여, IL-1β, TNF-α, IL-8을 포함하는 케모카인(chemokine) 등을 생산한다. 그리고 제1단계의 끝에 제2단계의 트리거(방아쇠)인 IκB-ζ를 생산함으로써 제2단계로 이행한다.

제2단계의 프로세스에서는, DNA상에서 작용하는 NF-κB, AP-1에 IκB-ζ가 가해져 IL-12p40 및 IL-6, 그 밖의 것을 생산하고, T림프구계의 면역을 제어하게 된다.

표8은, 인간 대식세포를 사용해서 MRE 복합 리간드로 자극하였을 경우에 있어서 망라적 DNA 동태 분석에 의한, 제1단계 프로세스의 유전자 발현의 결과를 나타낸 것이다. 이 결과는 리얼타임 PCR 분석의 결과와도 일치하고 있었다.

MRE 복합 리간드에 의한 제1단계 활성화의 프로세스에 있어서, IL-1β와 TNF-α, 그리고 IL-8을 포함하는 케모카인의 생산이 왕성하게 이루어지고 있는 순간을 포착한 것으로서, 염증 프로세스보다 늦게 시작되고 NF-κB의 기능을 억제하는 염증억제 유전자군이 활발하게 증가하고, NF-κB의 유전자 발현이 저하해 가는 상황을 나타내고 있다.

그리고 TNA-α 등에 의한 스스로의 세포 아포토시스 유도를 블록(block)하기 위해서 JUN이나 SOD2가 발현되어, SOCS3에 의해 자연면역 수용체로부터 필요 이상의 자극을 받아서 염증을 과잉으로 진행시키지 않도록 하고 있다.

이 제어계가 잘 기능하고 있기 때문에, 과잉의 NF-κB를 유비퀴틴화해서 프로테아좀(proteasome)에 의하여 분해시키는 기능이 있는 PDLIM2는 가동할 필요가 없어, 1.0721337로 통상의 값이었다.

그리고 이 순간은, 제1단계로부터 제2단계로 이행하는 열쇠를 쥔 IκB-ζ가 급격하게 상승하고 있는 타이밍을 포착한 것이다.

지연형 염증억제

제1단계에 있어서 염증을 억제하는 지연형 염증억제 유전자군이 지연되어 발현된다. 이들 유전자군은 NF-κB와 AP-1의 기능을 억제한다. 즉, 염증 프로세스보다 늦게 염증억제 프로세스가 진행하는 것이 이번의 MRE 복합 리간드에 의한 분석으로 밝혀졌다.

여기에서 표9에 나타나 있는 바와 같이, TNFAIP6은 NF-κB를 강하게 억제하는 유전자로서 TNF-α 생산을 제어하는 강한 항염증작용을 가지고 있으며 37.0424배라고 하는 높은 값으로 발현되고 있다. TNFAIP3도 또한 NF-κB와 AP-1의 발현을 억제하는 유전자로서, 이것도 18.8308배로 높은 값이다. 그 밖에 JUN, SOD2, SOCS3이 작용하고 있는 것은 이미 전술한 바와 같다.

제2단계째의 프로세스는 I-κB-ζ가 트리거(방아쇠)가 되어서 야기된다. NF- κB와 AP-1은 이미 많이 핵산과 결합해서 작용하고 있으므로, 지연 염증억제 유전자군이 활발해져 NF-κB와 AP-1의 새로운 공급은 감소해 간다.

새롭게 만들어진 IκB-ζ가 트리거가 되어, 이미 핵산과 결합하고 있는 NF-κB와 결합하고, 마찬가지로 이미 핵산과 결합하고 있는 AP-1과 함께 T세포를 제어하는 4개 그룹의 사이토카인군을 생산, 분비한다. 대식세포 등에서는, M1활성에 있어서는 「IL-12p40」, 「IL-6 및 IL-23p19」를, M2활성에 있어서는 「IL-4」, 「TGF-β 및 IL-2」 등의 사이토카인을 생산한다. 계속하여 세포 내에 항상 만들어져 있는 p35와 결합하여, IL-12p40은 IL-12가 되고, IL-23p19은 IL-23이 된다.

표10은, MRE 복합 리간드 자극에 의한 제2단계 시작의 유전자 발현의 모습을 나타내고 있다. 이 분석을 할 때에는 I-κB-ζ 트리거가 통상의 20.0115배로 급증하고 있고, NF-κB와 AP-1은 염증억제의 유전자군의 발현강화에 의해 그 생산이 저하되고 있는 상태이다.

그러나 발현이 저하되고 있는 NF-κB나 AP-1은 이미 핵산(DNA)에 결합하고 있으므로, IκB-ζ의 발현이 급상승함으로써 IL-6, IL-23p19, IL-12p40이 생산되기 시작하고, 통상의 1.4배∼1.8배의 값이 되어 상승하기 시작한다.

이것으로부터 알 수 있는 바와 같이, MRE 복합 리간드에서는 분명히 M1활성을 발현하고 있다.

이것은, MRE 복합 리간드를 사용한 사람의 혈액으로부터의 IL-23 생산이 통상의 2.11 배로 되는, 후술하는 사실로부터도 뒷받침된다.

이와 같이, MRE 복합 리간드는 대식세포와 그 형제인 마이크로글리아, 수상세포, 랑게르한스세포, 쿠퍼세포 등을 M1활성으로 유도하여, 항균작용, 항바이러스 작용의 효과를 발휘한다. 또한 아포토시스 된 암세포의 잔해에 대한 탐식활동을 활발하게 시킨다.

보통 M1활성에 의한 항균작용, 항바이러스 작용의 결과, 균체나 바이러스가 저분자 분해되어 제거되면, 대식세포의 M1활성은 균이나 바이러스의 저분자 분해물을 시그널로 하여 M2활성으로 절환된다고 생각되고 있다. M2활성은 염증을 억제하고 섬유아세포를 활성화해서 염증 등으로 파괴된 조직을 수복하는 후처리 프로세스이다. 실시예를 보면, 이 M2에 있어서도 MRE 복합 리간드가 중요한 역할을 달성하고 있는 것을 시사하고 있다.

또한 후술하는 발견에 의하여, MRE 복합 리간드는 종래의 항균, 항바이러스 작용, 또는 항암작용을 발현시키는 M1활성의 프로세스와는 별도로, 알레르기 질환이나 자가면역질환을 포함하는 염증성 질환에 대하여 항염증작용을 가지는 프로세스를 동시에 진행시킨다고 하는 우수한 성질을 가지는 것이 밝혀졌다.

F. MRE 복합 리간드에 의한 T세포의 분화와 그 후의 프로세스 활성

활성화된 대식세포나 그 형제로부터 방출된 4개의 사이토카인군은, 도1에 나타나 있는 바와 같이 Th17, Treg, Th1, Th2라고 하는 T세포의 4개의 상태를 컨트롤한다.

대식세포의 M1활성에서는 Th17 및 Th1을 유도하고, 대식세포의 M2활성에서는 Treg 또는 Th2를 유도한다. 또, 본 발명에 관한 MRE 복합 리간드는, Th17과 Treg를 유도하고, Th1과 Th2의 유도를 억제하는 성질을 구비하는 것이 판명되어 있다.

자연면역에 있어서 수용체 자극에 의한 일련의 프로세스를 거쳐서 생산된 사이토카인군 중의 IL-12p40과 IL-23p19는, 세포 내에 늘 존재하고 있는 p35와 결합하여 각각 IL-12와 IL-23이 된다.

이들 4개의 사이토카인군은, T세포를 다음과 같이 컨트롤한다(도1 참조).

M1활성에서는,

1) IL-12는, 나이브(naive) T세포(CD4)를 Th1로 분화, 활성화시킨다.

2) IL-6은 나이브 T세포(CD4)를 Th17로 분화시키고, IL-23과 IL-1β는 Th17을 활성화시킨다.

M2활성에서는,

3) IL-4는 나이브 T세포(CD4)를 Th2로 분화, 활성화시킨다.

4) TGF-β는 나이브 T세포(CD4)를 Treg로 분화시키고, IL-2는 Treg를 활성화시킨다.

그리고 M1활성에 이어서 Th1과 Th17의 프로세스는 항균, 항바이러스, 항암, 알레르기 억제 등의 기능이 있고, M2활성에 이어서 Th2는 알레르기 반응의 프로세스이고, Treg의 프로세스에는 염증억제와 조직 수복과 자가면역억제(면역관용(immune tolerance))의 기능이 있다.

여기에서 Th1은, IL-12에 의한 작용에 의해 INFγ를 생산한다. 대식세포, 내추럴킬러 세포, 내추럴킬러 T세포 등의 탐식작용이나 유주성(遊走性)을 활성화한다. NO 등의 프리 라디컬을 생산해서 세포 내 살균력을 강화한다. CD8-T세포인 CTL(킬러T세포) 활성을 높여서 암세포나 바이러스 내재 세포를 살상하는 세포성 면역을 증대시킴으로써, 세포 내에 기생하는 세균이나 바이러스를 배제하는 프로세스를 유도한다. 주로 항체에 비의존적인 항균, 항바이러스 프로세스이다. 세포 살상성 자가면역질환이나 지연형 알레르기를 일으키는 프로세스이기도 하다.

Th2는, IL-4, IL-13을 생산하고, CD4-T세포를 통하여 B포로부터 IgE항체를 방출시킨다. IgE에서는 마스트 세포(mast cell)나 호염기구(好鹽基球)로부터 히스타민을 분비함으로써, 기생충 등의 대형의 생물을 배제하기 위해서 작용하고 있다. 또한 IL-5를 생산함으로써 호산구(好酸球)로부터 EPO를 방출하여, 코막힘 등의 지연성의 알레르기 질환을 유발하는 것으로도 알려져 있다.

Th17은, IL-1이나 IL-23의 작용에 의해 IL-17A, IL-17F, IL-22, IL-21 등을 생산한다. 액성 면역(液性免疫; humoral immunity)을 증대함으로써 항체생산을 활발하게 해서 세포 외 세균이나 진균을 배제한다. 또한 호중구의 탐식작용을 증진시키고, 주로 상피세포, 호중구로부터 디펜신 등의 항균물질을 방출시키고, 또 세포 외 매트릭스의 재구축을 통하여 상피 배리어를 강화한다. 최근 IL-21의 생산이 확인되어, 새로운 프로세스가 해명되고 있다(비특허문헌3 참조).

Treg는, 장관면역을 특징 지우는 것으로서, TGF-β에 의해 유도되어 IL-10을 생산하고, 염증억제나 면역관용을 유도하는 프로세스라고 생각되고 있다. 특히 장내 세균이 많은 장관은, 보통은 림프구 면역이 폭주하지 않도록 Treg상태로 유지되고 있고, 그 방어력을 점막의 상피세포나 파네트 세포의 자연면역에 맡김과 아울러, 바이엘판을 통하여 분비성의 항체인 IgA를 장관 내에 분비시켜 장내 세균을 컨트롤하고 있다. 또한 Treg는, 알레르기를 일으키는 Th1이나 IgE를 분비하는 B세포, 그리고 자가면역질환을 일으키는 CTL(킬러T세포)을 아포토시스 또는 억제함으로써 염증을 억제하는 것으로도 알려져 있다.

MRE 복합 리간드에서는, 대식세포의 M1활성의 프로세스에 이어서, 앞의 표의 결과에 나타나 있는 바와 같이, IL-23p19와 IL-12p40이 증가하고 IL-4는 변화되지 않고 TGF-β는 오히려 감소하는 경향이 있는 것으로부터, Th17과 Th1이 활성화되고, Th2와 Treg는 활성화되지 않는 것이 보여졌다. 또한 MRE 복합 리간드가 궤양성 대장염이나 크론병(Crohn's disease) 등의 염증을 억제하는 것으로부터, 실제로 장관에 있어서 MRE 복합 리간드에 의한 Treg 정상화의 프로세스도 또한 염증억제나 면역관용에 기여하고 있는 것으로 생각된다.

이것을 밝히기 위해서, 채취한 사람의 혈액을 관리된 조건하에서 MRE 복합 리간드로 자극해서 생산한 IL-23의 양을 측정한 결과를 표11에 나타냈다.

MRE 복합 리간드 함유액에 의한 IL-23의 생산량은 평균적으로도 통상의 1.92배 증가하고 있고, 흥미를 끄는 사실은 고연령(高年齡)이 될수록 IL-23의 값이 높아지는 경향이 있다는 것이다. 따라서 MRE 복합 리간드는, 대식세포 등의 M1활성을 증가시키고 계속하여 Th17 및 Th1을 활성화시킴으로써, 세포성 면역과 액성 면역을 높여 항균, 항바이러스, 항암효과를 발휘한다. 이것은, 실시예로 나타낸 것도 포함하는 임상치험과도 일치하는 것이다.

새로운 항염증 프로세스의 발견

한편, MRE 복합 리간드가 IL-1β, TNF-α, IL-8 등의 염증성의 사이토카인의 유전자군을 매우 강하게 활성화시키고, 또 Th17 및 Th1의 프로세스를 활성화시킴에도 불구하고, 왜인지 MRE 복합 리간드를 함유하는 음료에 의해 악염(顎炎)이나 궤양성 대장염이나 아토피의 염증 등이 현저하게 개선될까에 대한 분자생리학의 데이터와 임상상의 소견과의 모순이 발생했다.

이 모순을 해결하기 위해서, 발명자들은, DNA어레이를 사용한 대식세포의 망라적 DNA 동태 분석이나 인간의 혈액을 사용한 사이토카인 생산의 시계열 추이에 주목해 예의 검토했다. 그 결과, MRE 복합 리간드가 종래의 LPS 등의 리간드에는 없는 새로운 면역 프로세스를 발현하고 있는 것을 확인했다. 그 제1점은, MRE 복합 리간드에 의한, IL-18 생산의 억제 작용이다. 이번의 DNA 동태 분석에 의하여 표12와 같이 MRE 복합 리간드가 IL-18 생산을 억제하고 있는 것을 찾아내었다. 이것은 주목해야 할 발견이었다.

IL-18은 염증성 질환에 깊게 관여하는 사이토카인으로서, 종래의 LPS 등의 M1리간드의 자극에 의하여 효소인 카스파아제1을 생성하고, 이 카스파아제1이 IL-18의 전구 물질을 절단해서 IL-18을 생산한다. 그리고 IL-18은 IL-12의 존재 하에서 Th1세포나 NK세포에 작용해서 INF-γ 생산을 강력하게 유도한다. 왜냐하면, IL-12가 Th1세포나 NK세포에 IL-18의 리셉터(receptor)를 늘리기 때문이다. 또한 역으로, Th1세포가 생산하는 INF-γ는 대식세포로부터의 IL-12나 IL-18의 생산을 촉진하고, 또한 그것이 Th1세포를 자극함으로써 염증을 지속적으로 확대하는 사이클이 형성된다.

이와 같이, 보통 대식세포의 M1활성을 일으키는 LPS와 같은 리간드에서는 IL-12와 IL-18이 함께 상승하게 된다.

그러나 MRE 복합 리간드에서는, IL-12나 IL-23의 생산을 활발하게 하면서 IL-18 생산을 억제하다고 하는 사실이 밝혀졌다. 이것을 뒷받침하는 사실로서, 카스파아제1을 발현시키는 유전자 CASP1이 통상의 0.67590배로 MRE 복합 리간드에 의해 억제되어 있고, 인간의 혈액을 사용한 IFN-γ 생산 시험에서도 이것을 확인하는 결과가 얻어졌다(도5 참조).

IL-18의 특징으로서, IL-12나 IL-23과 IL-18이 동시에 과잉생산되면 장이나 간장에서 심각한 장기 장애나 자가면역질환이 일어나는 것이 알려져 있다. 또한 반대로 IL-12와 IL-18의 공존 하에서는, IL-4나 IL-13의 생산이 촉진되어 Th2 프로세스의 활성화에 의한 IgE 생산이 일어나서, 비만세포나 호염기구로부터 히스타민이 방출된다. 계속하여 IL-5가 생산되면 호산구로부터 EPO가 방출되어 코막힘 등의 염증성 질환이 야기된다.

또한 IL-18은 비만세포나 호염기구를 단독으로 직접 자극하여 IgE를 통하지 않고 히스타민을 방출하거나, IL-4, IL-13 생산을 유도하거나 하는 것도 밝혀져 있다.

특히, IL-13은 기관지천식이나 폐섬유증을 유발하는 사이토카인으로서도 알려져 있다(비특허문헌4 참조).

또한 Th1세포에 IL-18과 원래 Treg세포를 활성화하는 IL-2가 작용하면, Th1세포가 슈퍼 Th1이라고 불리는 세포로 변하여 원래 Th2의 사이토카인인 IL-13을 방출하여, 기관지천식이나 폐섬유증을 야기한다. 황색 포도구균에 의한 아토피성 피부염도 같은 메커니즘으로 증가 악화가 일어난다고 생각되고 있다(비특허문헌6).

이것은 주목해야 할 사실이다. 왜냐하면, IL-18은 트리거로서, Th1세포, Th2세포, Th17세포 등을 염증과 비염증이라고 하는 2개의 상태로 스위칭 시키고 있다고 생각되기 때문이다.

IL-18의 증가를 수반하는 염증촉진형 활성화 프로세스에 있어서는, Th1세포에서는 자가면역질환을 야기하고, Th2세포에서는 알레르기 질환을 야기한다. IL-18의 감소를 수반하는 염증억제 활성화 프로세스에서는 세포 내 항균작용, 항바이러스 작용, 항암작용 등 세포성 면역을 증강시킨다.

Th2세포에서는, IL-18의 공존 하에서 IL-4나 IL-13 등을 생산해 알레르기 질환을 유발한다. IL-18이 적은 경우에는 장관이나 유선(乳腺)으로부터 IgA를 분비하도록, 분비성의 면역 프로세스가 활성화된다.

Treg세포에서도 마찬가지로 IL-18이라고 하는 트리거의 출현으로, IgE를 수반하지 않고, 비만세포나 호산구를 직접 자극해서 알레르기 증상을 일으키게 된다. Th17에서도 IL-18을 트리거로 하여 염증촉진의 프로세스와 염증억제의 프로세스로 분기된다고 생각할 수 있다.

Th17에서는, IL-18의 증대로 염증성의 IL-17A나 IL-22이 유도되어 액성 면역의 프로세스를 활성화한다. 또한 IL-17A가 과잉으로 생산되면 염증이 왕성해져, 만성관절염, 다발성경화증, 궤양성 대장염, 크론병, 건선(乾癬) 등의 자가면역질환을 야기하는 것이 알려져 있다. IL-22는 건선과 관계가 깊은, α디펜신인 hNP-3을 과잉생산시킨다.

IL-18이 감소하면 염증을 억제하는 IL-17F나 IL-21이 유도되어, IL-17F가 항체생산이나 디펜신 분비를 활발하게 하는 등 항균, 항바이러스력을 높이는 액성 면역 프로세스를 활성화한다. 특히, IL-17은 호중구로부터 HNP1∼2 및 HNP4∼6 등의 α디펜신의 생산을, 상피세포로부터 hBD1∼4의 β디펜신의 생산을 촉진하는 것이 알려져 있다(비특허문헌7 참조).

MRE 복합 리간드의 기능에 있어서 주목해야 할 제2점은, 이 IL-21의 증가 작용이다.

MRE 복합 리간드는, 염증을 야기하는 IL-18의 생산을 억제함으로써 알레르기나 자가면역질환을 포함하는 염증을 억제하는 효과가 기대되고, 실제로 염증성의 질환에서의 임상치험 결과와 일치하고 있다.

또한 후술하는 바와 같이, 인간의 혈액을 채혈해서 측정한 사이토카인 시험에서도, MRE 복합 리간드에 의해 IL-21이 통상의 2배 가까이 증가하는 것이 확인되었다(도2 참조). 임상적으로도, MRE 복합 리간드를 복용하고 있는 비호지킨형 림프종(non-Hodgkin's lymphoma) 환자(62세 여성)의 혈중의 IL-21이 현저하게 상승하고 있는 것을 우연히 확인하였다. 이 환자의 전신으로의 전이암(轉移癌)은 소실하는 경향이 있었고, 원래의 림프종도 축소되는 경향이 있는 것도 또한 확인되었다.

IL-21은, 항바이러스 물질의 분비나 내추럴킬러 세포를 증식시켜서 항암작용을 높이는 사이토카인으로서(특허문헌4 및 특허문헌5 참조. 실시예8∼실시예13 참조), 자가면역질환을 야기하는 T세포와 B세포를 아포토시스 시키는 기능도 있다고 보고되어 있다(특허문헌3 참조).

이 IL-21에 대해서는, 대식세포 M1세포로부터 IL-12가 방출되고, 그 IL-12가 직접 NKT세포(내추럴킬러 T세포)에 작용하여 IL-21의 생산을 유도하는 프로세스가 존재하는 것이 알려져 있다(특허문헌2 참조).

그러나 MRE 복합 리간드에서는, IL-23의 증가에 따라 IL-21이 증가하고 또한 IL-12나 IFN-γ를 생산하지 않고 있는 인간의 혈액 중에도 IL-21이 증가하는 경우도 있는 것이 확인되고 있어, 오히려 IL-12로부터의 NKT세포 활성화의 루트 이외의 프로세스가 주로 작용하고 있는 것이 추측되었다(도2와 도5 참조). 또한 상기한 특허문헌2의 예에서는, 큰 분자량의 단체(單體) 리간드가 TLR리셉터에 작용하는 것을 이용하고 있어, 본 발명이 복합적인 저분자 리간드를 이용해서 세포 내부의 NLR 등의 자연면역 리셉터를 포함하여 입체적으로 자극하는 방법과는 그 원리가 완전히 다른 것이 암시되었다.

그 새로운 원리는, 최근에 Th17활성에 의해 Th17로부터 IL-21의 생산이 유도되는 것이 밝혀졌고(비특허문헌3 참조), 또 그 IL-21이 Th17세포의 분화를 촉진하고 IL-1이나 IL-23의 자극 등에 의하여 IL-21을 분비한다고 하는 사이클을 가지는 것도 밝혀졌다(비특허문헌8).

이와 같이 MRE 복합 리간드는, 주로 Th17의 비염증활성에 의해 IL-21을 생산시킴과 아울러, 보조적으로, IL-12를 통과시킨 NKT세포활성에 의한 IL-21 생산의 루트도 이용하고 있다고 할 수 있다. 또한 실제로 인간을 포함하는 척추동물에서는, MRE 복합 리간드 이외의 리간드의 자극을 항상 받고 있어 이 2개의 IL-21 생산 루트도 항상 변화하게 된다. 그 케이스에서는 MRE 복합 리간드는 아쥬반트로서의 성격이 강해지고, 그 아쥬반트로서의 우수한 효과를 발휘하게 된다.

또한 MRE 복합 리간드로는, 대식세포가 염증을 억제할 때에 출현하는 카텝신E의 유전자도 통상의 1.2배 발현되었다.

이와 같이 MRE 복합 리간드는, 항균, 항바이러스, 항암의 면역 프로세스에의 활성을 유지하면서 염증을 가라앉힌다고 하는 놀랄만한 작용을 하고 있다. 이 사실은, 후술하는 임상치험에서도 확인된다.

종래에 염증을 가라앉히는 의약품인 스테로이드제나 면역억제제는 항균력을 저하시킨다고 하는 중대한 결함이 있었다. 또한 항생 물질은 바이러스에 듣지 않고, 게다가 무서운 내성균을 만든다고 하는 결점이나 아나필락시스라고 하는 호흡곤란 등을 수반하는 부작용도 있었다. MRE 리간드는, 이러한 결점 없이 항균, 항바이러스에도 항염증에도 동시에 효과가 있는 획기적인 면역활성제가 되고 있다.

또한, 조직 수복을 촉진하는 사이토카인의 하나인 FGF2도 통상의 2.525배 발현되고 있어, 조직 손상을 조기에 회복시키는 힘도 있으며, 이것도 임상치험과 일치하고 있다.

본 발명의 MRE 복합 리간드는, 이상과 같이, 대식세포, 마이크로글리아, 수상세포, 랑게르한스세포, 쿠퍼세포, 상피세포, 케타린세포, 섬유아세포 등을 포함하는 세포 내외의 자연면역 수용체를 입체적으로 M1활성화시킴으로써, 디펜신이나 ISG 등의 항균, 항바이러스 물질을 분비시킴과 아울러 NK세포, NKT세포도 활성화해서 암세포나 바이러스 내재 세포를 아포토시스 시킨다. 그에 이어서, NF-κB의 프로세스를 2단계로 활성화해서 IL-1β, TNF-α, IL-8을 포함하는 케모카인을 분비함과 동시에 복수의 염증억제 물질이나 미토콘드리아SOD를 생산해서 TNF-α 등에 의한 세포손상을 저지한다. 또한 IL-6, IL-12나 IL-23 등의 T림프구의 사이토카인을 생산하고, 나이브 T세포를 Th17세포 및 Th1세포로 분화, 활성화시킨다. 또한 MRE 복합 리간드는, 여러 가지 염증질환의 방아쇠를 당기는 IL-18을 억제하고 Th17활성과 Th1활성을 스위칭해서 비염증성 프로세스로 유도한다. Th17은, 이 스위칭에 의해 IL-21 및 IL-17F를 생산한다. 또한 이 IL-21이 나이브 T세포를 비염증성 Th17로 분화하는 사이클이 작용한다. IL-17F는, 염증을 수반하지 않고 액성 면역 프로세스가 활성화해서 항체생산을 높이는 것 이외에, 직접 자연면역의 항균물질인 디펜신이나 항바이러스 물질 등을 분비하여, 항균, 항바이러스력 효과를 발휘한다. 또한 IL-12의 방출에 의하여, IFN-γ의 생산을 거치지 않고 NKT세포로부터 IL-21을 생산시킨다. 이들 IL-21은, 직접 NK세포의 활성을 증대시켜 항암작용을 발휘하는 것 이외에, 자가면역질환을 야기하는 T세포나 B세포를 아포토시스 시켜서 자가면역을 억제한다. 또한 대식세포의 M1활성으로부터 M2활성으로 유도하여 조직 수복이 이루어지는 프로세스를 거치는 경과를 겪으며, 항균작용, 항암작용, 항바이러스 작용, 알레르기 억제, 항염증작용, 조직 수복 작용, 자가면역억제의 작용을 진행한다. 또한 대식세포 활성은, 그 식작용도 활발화 시키고, 혈액이나 림프액 그리고 조직 체액 중의 노폐물, 이물질의 제거도 촉진시킨다.

아쥬반트로서의 유용성

본 발명의, 억제하는 리간드라고 하는 특성은, 여러 가지 백신의 염증성의 부작용을 저감하다고 하는 성질을 가진 우수한 아쥬반트로서의 이용을 가능하게 한다.

MRE 복합 리간드를 아쥬반트로서 조합시켜서 사용하는 백신에는, 인플루엔자 백신이나 페스트균의 백신 등의 항바이러스, 항균 백신 외, 신세대의 LPS, 펩티도글리칸, 리포아라비노마난(lipoarabinomannan), 자이모산(zymosan), 리포펩티드(lipopeptide), 리포테이코산(lipoteichoic acid), RSV　F　단백질, 피브로넥틴EDA도메인, HSP60, 플라젤린, 비메틸화 CpG　DNA, 2개 사슬 RNA, 폴리이노신폴리시티딜산, 이미다조퀴놀린계 화합물, β글루칸, 마루야마 백신, 우형결핵균(소결핵균(mycobacterium bovis)) 및 OK-432 등의 TLR리간드 및 그것과 결합한 바이러스를 포함하는 균체 성분의 백신도 포함된다.

버섯이나 약초의 분해물과의 블렌드

MRE 복합 리간드는, 다른 면역 리간드나 면역 아쥬반트와 블렌드해서 사용 가능하다. 특히 당사슬계의 면역활성성분과는 궁합이 맞아, 영지, 동충하초, 차가버섯, 키틴키토산(chitin chitosan), 아가리쿠스(Agaricus) 등의 당사슬 성분을 함유하는 것을 분자량 8000 이하로 분해해서 MRE 복합 리간드에 가하면, 49%∼60%의 대식세포 활성(생존수와 NO 생산)의 증가가 나타났다. 이것은, MRE 복합 리간드가 우수한 아쥬반트로서 기능할 수 있는 것을 나타낸다.

암을 아포토시스로 유도하는 성분을 포함하는 원료와의 병용

홍두삼(紅豆杉), 레스베라트롤(resveratrol), 케르세틴(quercetin) 등, 암의 아포토시스를 부활시키는 물질과의 병용에 의한 암치료법도 매우 유효하다.

리얼타임 PCR과 DNA마이크로 어레이

DNA마이크로 어레이에 의한 DNA 동태 분석은, 바이오 매트릭스 연구소의 Human Gene 1.0 ST Array에 의하여 이루어졌다.

리얼타임 PCR은, 다음과 같은 조건하에서 실시했다.

1. 피험액에 사용하는 세포는, 인간 말초혈 단구 유래의 THP-1세포(ECACC　No88081201)를 소(牛)의 비동화(非動化; inactivation)한 태아혈청(胎兒血淸)과 암피실린나트륨(ampicillin sodium)에 항생 물질인 황산가나마이신(黃酸kanamycin)을 첨가해서 RPMI1640 배지에서 배양하고, 세포농도를 2×E 6개/ml로 조정해서 사용했다.

2. 세포자극은, 세포현탁액을 1.5ml씩 사전 조정하여 6웰 플레이트의 각 웰에 가해 피검액(被檢液)으로 하고, 음성대조와 양성대조의 웰을 정하고, 양성대조 웰에 조정한 자극 샘플을 첨가하고 잘 흔들어 섞은 후에 37℃의 5% 탄산가스 인큐베이터로 이동해 3시간 배양하였다.

3. 토탈 RNA의 추출은, TRIzol의 순서에 따라서 추출, 조정했다. 각 샘플에 대해서 26G의 주사 바늘을 붙인 1ml의 시린지를 사용해 10스트로크액을 넣었다 꺼내며 DNA를 절단하고, 조정 후에 4℃에서 14000rpm으로 원심분리를 15분간 하여 RNA를 분리 추출했다.

4. 이 RNA를 정제한 후에 아가로스 겔(agarose gel) 전기영동법에 의하여 품질평가를 하였다.

5. 정제 RNA로부터 잔존 DNA를 제거하기 위해서 DNAseI 처리를 하고, cDNA의 합성을 했다.

6. cDNA의 합성에는, Transcriptor　First　cDNA　synthesis　Kit를 사용하고 그 매뉴얼에 따라 합성했다.

7. 이 합성한 cDNA를 주형(鑄型)으로 하여 리얼타임 PCR을 실시해서 데이터를 얻었다.

DNA마이크로 어레이에는 이 순서에 의해 얻어진 RNA를 사용하여 망라적인 유전자 발현을 해석했다.

이와 같이 본 발명의 MRE 복합 리간드는, 자연면역 및 그에 이어지는 림프구계의 후천면역의 프로세스를 활성화시킴과 아울러, 염증을 억제해서 조직 수복력을 높이는 기능을 가지고 있다. 그 때문에 본 발명의 MRE 복합 리간드는, 항균작용, 항암작용, 항바이러스 작용, 항염증작용, 조직 수복 작용, 노폐물제거 작용을 갖고 있다.

앞에서 설명한 바와 같이, 본 발명의 MRE 복합 리간드가, 강력한 자연면역활성력을 가지는 LPS(엔도톡신)의 7.54배의 자극력이 있다는 것이, 리얼타임 PCR에 의한 TNF-α 생산 시험에서 밝혀졌다. 그리고 수많은 항염증 성분의 출현과 미토콘드리아SOD의 생산으로, 혈액 중에는 TNAα는 증가하지 않고 세포장애를 일으키지 않는 것도 밝혀졌다. 그리고 MRE 복합 리간드가 LPS와는 달리 세포독성이 없다고 하는 우수한 특성을 가지는 것도 확인되었다. LPS에서는 그 농도가 늘어남에 따라 대식세포의 생존수가 감소하는 것에 대해, MRE 복합 리간드의 농도가 늘어나면 대식세포의 생존수가 늘어난다고 하는 사실이 드러났다.

본 발명의 MRE 복합 리간드는, 극성이 낮은, 대부분 전하가 없는 올리고 레벨의 저분자 리간드이므로, 세포벽을 용이하게 통과하는 것이 가능하고, 세포표면에 발현되고 있는 TRL 수용체뿐만 아니라, 세포 내의 엔도솜에 발현되고 있거나 세포질에 존재하는 NLR 수용체나 RLR 수용체도 입체적 또한 복합적으로 자극, 활성화할 수 있다. 이러한 저분자의 리간드는 장벽(腸壁)으로부터 용이하게 흡수하는 것이 가능하고, 또한 항체의 공격을 받지 않으므로 유효성분을 정제(精製)한 뒤에 정맥 주사용으로서도 사용 가능하다. 이 성질은, 농도가 커지면 세포를 보호해 세포 생존을 증가시키는 성질과 함께, 다른 리간드에는 없는 우수한 특성과 상승효과를 가져오는 것이다.

이러한 특성을 가지는 본 발명의 MRE 복합 리간드에 의한 다양하고 동적인 면역활성효과를 설명하기로 한다.

대식세포 활성

표13 및 표14는, [실시예1]에 의하여 만들어진 MRE 복합 리간드 함유 원액을 희석하여 인간의 대식세포에 작용시켜서, 그 NO 생산량과 대식세포의 생존 세포 수를 측정한 것이다.

이 측정결과를 보면, MRE 복합 리간드 함유 원액의 NO 생산은 LPS의 NO 생산보다 많은 값을 나타내고, 특히 300배 희석에서는 2.19배나 NO 생산이 높아지고 있다. 한편 MRE 복합 리간드 함유 원액에서는 NO값이 증가하고 있음에도 불구하고, MRE 복합 리간드 함유 원액에 있어서 대식세포 생존 세포지표는 증가하고 있어, LPS에서는 감소하고 있는 것과 반대의 경향을 나타내고 있다. 여기에서는 수치를 나타내지 않았지만, 침투압 한계까지 MRE 복합 리간드 함유 원액의 농도를 증가시켜도 세포장애가 일어나지 않았다. 즉, MRE 복합 리간드는, 세포장애를 일으키지 않고 오히려 대식세포의 생존율을 높이는 대식세포 활성효과가 있는 면역활성제라고 할 수 있다.

항균효과

최초에는 MRE 복합 리간드 함유 원액에 있어서 직접 살균하는 작용이 없는 것을, 대장균, 녹농균, 황색 포도구균, 칸디다, 흑색국균(aspergillus niger)을 사용한 발육저지 확인시험으로 확인했다. 따라서 MRE 복합 리간드 함유 원액에는 항생 물질을 포함하는 살균 물질은 일체 포함되어 있지 않고, 임상치험에서 보여지는 항균효과는 전부 면역력에 의한 것이라고 할 수 있다.

또한 본 발명에 관한 MRE 복합 리간드에 의한 항균효과는, 이하와 같이 정리할 수 있다. 즉, 첫 번째는 대식세포의 탐식작용 증강에 의한 항균효과이며, 두 번째는 대식세포, 상피세포, 케라틴세포 등으로부터 디펜신을 포함하는 항균물질의 방출에 의한 항균효과이다. 구체적으로는 대식세포로부터 항균물질인 PTX3이 통상의 7.27배가 방출되고 있는 것이 확인되었다.

또한 세 번째는 Th17활성을 경유한 호중구의 탐식활성의 증강에 의한 항균효과이며, 탐식된 균은 호중구의 아주르 과립(azur granule)에 존재하는 α-디펜신인 HNP1∼6에 의해 살균된다. α디펜신은 용혈성 등 세포장애를 일으키므로 오로지 호중구의 내부에서 이용된다.

또한 네 번째로서, Th17세포로부터 생산되는 IL-17F의 작용에 의하여 상피세포나 케라틴세포로부터 β디펜신인 hBD1∼4가 분비되는 것을 들 수 있다. 또한 염증성의 IL-22는 케라틴세포로부터 hBD3을 분비시켜 항균하지만, 건선에서는 IL-22와 hBD3이 과잉분비되고 있다. MRE 복합 리간드는 IL-22를 억제하는 효과는 없기 때문에 건선을 치유할 수는 없고 임상치험과도 일치하고 있다.

그리고 다섯 번째는, Th17의 활성화를 통하여 CD4액성 면역 프로세스가 활성화되어 B세포로부터 IgG가, 점막상피세포로부터 IgA가 분비되어 항균효과를 가져오는 점이다. 이 Th17을 활성화하는 것이 IL-23과 IL-1이며, MRE 복합 리간드 함유 원액에 의한 활성화에서는 IL-1B가 통상의 47.64배, IL-1A가 통상의 6.30배 유전자 발현을 하고 있고, 또 IL-23A가 통상의 1.78배(상승 중의 값) 유전자 발현을 하고 있다. 채혈된 인간의 혈액을 사용하여 이루어진 IL-23의 생산 시험에서도 평균적으로 통상의 1.92배의 분비가 확인되었다(표11 참조).

항바이러스 효과

MRE 복합 리간드에 의한, HIV질환이나 HCV질환에서의 바이러스의 불활성화에는 주목할만한 것이 있다.

MRE 복합 리간드에 의한 항바이러스 프로세스에는, 다음의 프로세스가 있다.

첫 번째는, 자연면역 수용체인 TLR3, TLR7, TLR9 및 RIG1, MAD5가 MRE 복합 리간드 등에 의해 자극되어서 INF-α나 INF-β 등을 직접 방출하는 프로세스이다. 대식세포, 마이크로글리아 등으로부터는 INF-α가, 상피세포, 섬유아세포, 케라틴세포, 골아세포 등으로부터 INF-β가 주로 방출된다. 이들 INF-α와 INF-β는, INF수용체를 가지는 근린의 세포에 감지되어, ISG 등의 항바이러스 물질을 일제히 방출하여 항바이러스 효과를 발휘한다.

MRE 복합 리간드에 의해서는, 대식세포의 인터페론 유전자의 발현은 표15와 같았다.

MRE 복합 리간드가 자연면역 수용체를 자극함으로써, 직접 IFN-α5가 통상의 1.6배, IFN-α6이 통상의 1.2배, 그리고 INF-β가 통상의 1.4배 발현하고 있다. IFN-λ은 NK세포를 활성화하는 인터페론으로서 바이러스 감염 세포를 공격하는 능력을 높이는 기능을 한다.

이것은, MRE 복합 리간드로 채혈한 인간의 혈액을 자극해서 측정한 I형 IFN-α생산에 의해서도 뒷받침되었다.

표16에 나타내는 바와 같이, 평균적으로 통상의 2.89배의 IFN-α를 실제로 생산하고 있는 것을 알 수 있다.

이것은 어디까지나 리간드로서의 값이며, 실제로 바이러스 감염이 있는 경우에는 MRE 복합 리간드는 아쥬반트로서 작용하여 더 높은 INF-α값을 얻게 된다.

두 번째는, IL-21을 통한 I형의 IFN생산이다. MRE 복합 리간드에 의해서는 비염증성 Th17의 프로세스를 활성화하여 IL-21을 생산한다. 이 IL-21은 NK세포를 활성시킴과 아울러 상피세포, 섬유아세포, 케라틴세포, 대식세포 등으로부터 I형의 IFN생산을 촉진하고, IFN-α나 IFN-β는 더 많은 세포로부터 항바이러스 물질을 방출시키는 기능을 한다.

세 번째는, MRE 복합 리간드가 Th17로부터 IL-17F를 생산해 액성 면역의 프로세스를 활성화하는 아쥬반트로서 작용하고, 실제로 바이러스 감염이 있는 경우에 바이러스에 대한 항체생산을 증강하는 역활을 한다.

네 번째는, 내추럴킬러 세포(NK), 내추럴킬러 T세포(NKT), 그리고 세포장애성 T세포(CTL)에 의하여 바이러스 감염 세포를 배제하는 것이다.

MRE 복합 리간드는 표18과 같이 내추럴킬러 세포를 활성화한다. 또한 MRE 복합 리간드는, Th12 프로세스를 활성함으로써 CTL을 포함하는 세포성 면역을 높여 바이러스 감염 세포나 암세포를 배제하는 프로세스도 활성화하지만, 메인은 아니다.

다섯 번째는, 1990년대에 올리고펩티드에 의한 바이러스의 불활성화가 발견되었고, MRE 복합 리간드에는 올리고펩티드가 90% 이상 차지하고 있기 때문에, 이 프로세스가 작용하고 있는 것을 부정할 수 없다.

이와 같이 MRE 복합 리간드는, 5개의 프로세스의 활성화에 의해 우수한 항바이러스 효과를 가지게 된다.

여기에서 본원 발명에 있어서 「바이러스」는, 인간 면역부전 바이러스, C형간염 바이러스, 인플루엔자 바이러스, 인간 유두종 바이러스, 인간 헤르페스 바이러스, B형간염 바이러스를 비롯하여, 어류 이상의 척추동물이 감염되는 DNA형 및 RNA형 바이러스를 포함하는 것으로 한다.

항암효과

암세포는, 일반적으로 암세포 전(前)의 세포의 아포토시스 장애에 의해 암화한다. 그 원인이, 프리 라디컬에 의한 암 억제유전자의 손상이 원인이거나, 자궁경암과 같이 HPV에 의한 P53 분해 촉진에 의한 것이거나, 췌장암과 같이 스트레스 등의 HSP(열 쇼크 단백질(Heat Shock Protein))에 의한 아포토시스 저해의 경우이거나, 항상 아포토시스 장애가 있어서 암화가 야기된다.

홍두삼이나 케르세틴이나 레스베라트롤과 같이, 불사화(不死化)한 암세포를 다시 아포토시스하는 기능을 회복시키는 물질도 존재하지만, 면역 프로세스에서는, 세포장애성의 CD8+T세포(CTL) 및 NKT세포, 그리고 NK세포가 암세포나 암 바이러스 감염 세포에 접착하여, 퍼포린(perforin)에 의하여 세포에 구멍을 뚫고, 그랜자임(granzyme)으로 암세포를 아포토시스로 유도함으로써 항암효과를 발휘한다.

한편 TNF-α도, 미토콘드리아로부터 시토크롬C를 방출시켜 카스파아제8을 활성화시켜서 암세포를 아포토시스로 유도하는 프로세스를 활성화시킨다. 그러나 TNF-α는, 일반의 세포에 대한 장애성도 높고 HIV 발병의 방아쇠가 되기도 하는 물질로서 알려져 있다.

CTL에 있어서는, IL-12에 의해 활성화된 Th1 프로세스에 의해 세포성 면역이 강화되어서 CTL을 활성화시킨다. 그러나 이 CTL은 C형간염 바이러스나 HIV에 감염된 세포를 파괴해서 간염이나 HIV를 발병시켜, 세포장애성의 자가면역질환도 야기한다.

MRE 복합 리간드의 항암효과는 주로 내추럴킬러 세포(NK세포)에 의해 이루어지고, 거기에 CTL세포나 NKT세포가 더하여져 항암효과를 높인다.

NK세포는, MRE 복합 리간드에 의해 다음의 프로세스를 거쳐서 활성화되어 항암효과를 발휘한다.

첫 번째는, 자연면역 수용체의 자극에 의하여 I형의 인터페론이 생산되어 직접 NK세포를 활성화하는 프로세스로서, 조기에 효과가 나타나는 프로세스이다.

MRE 복합 리간드에서는, 표17과 같이, NK세포를 강하게 활성화하는 것으로 알려져 있는 INF-λ(IL-28A)이 통상의 1.84배나 유전자 발현하고 있어, INF-α, INF-β와 함께 항암효과를 높이고 있다.

또한 폐나 간장에 암세포를 전이시키는 케모카인의 CXVR4는 통상의 0.67배로 억제되어 암의 전이를 억제하고 있다.

두 번째는, MRE 복합 리간드에 의한 비염증성 Th17 프로세스를 통한 IL-21 생산에 따른 NK세포의 활성화에 의한 항암효과이다.

세 번째는, IL-12로부터 직접 NKT세포에 작용해서 IL-21을 생산하고, NK세포를 활성화하는 프로세스이다.

네 번째는, IL-12에 의해 Th1 프로세스를 활성화해서 INFγ를 생산하고, CTL을 활성화해서 항암효과를 높이는 프로세스이다. 이렇게 MRE 복합 리간드에 의해서는, 3개의 프로세스로부터 NK세포를 활성화할 수 있다.

표18은, NK세포의 암세포 살상 능력을 비교 시험한 것이다. 리간드를 일체 첨가하지 않은 경우와 실시예1에서 만들어진 MRE 복합 리간드 함유 원액을 희석한 액을 첨가하였을 경우를 비교하였다.

NK세포의 암세포 살상 능력 시험의 방법과 순서는 다음과 같다.

채혈 후의 30시간 이내의 전혈(全血)을 시험에 사용했다. Ficoll-Conray 비중원심법에 의해 PMBC를 분리한 후에, RPMI　1640(10% FBS 함유)로 세정해 Effector　cell로 하였다. 이것을 이하의 4조건으로 PBMC　4.0×10⁶cells/ml, 24시간 배양하였다(5% CO₂, 37℃).

또, MRE 복합 리간드 함유 원액의 첨가 농도는, MRE 복합 리간드 함유 원액의 1일 섭취 목표량 100ml 및 표준적인 인간의 혈액량 4,500ml로부터 MRE 발효 원액이 혈중에 100% 흡수되었을 경우의 농도 6.66%(v/v)를 기준으로 하여 농도를 설정했다.

(1)Control(=첨가 없음)

(2)MRE 복합 리간드 함유 원액 첨가(배양시 농도 0.06%(v/v))

(3)MRE 복합 리간드 함유 원액 첨가(배양시 농도 0.60%(v/v))

(4)MRE 복합 리간드 함유 원액 첨가(배양시 농도 6.00%(v/v))

배양 후에 Eu^{3 +}에 의해 표지(標識)한 골수성백혈병 유래의 K562세포를 Target cell로서 Effector　cell과 혼합하여 4시간 배양하였다(5% CO₂, 37℃). 이 때에 Effector　cell과 Target　cell의 혼합 비율은 E/T=40:1로 혼합했다. 4시간 배양 후에 각 웰 안에서 유리(遊離)한 Eu^{3 +} 양을 시간 분해 형광 측정에 의해 측정하여, NK세포의 암세포 살상 능력 활성을 산출했다. 얻어진 수치는, 암세포인 K562세포의 몇 %를 NK세포가 살상했는지를 나타낸다.

활성평가의 판정은, 51 이상이 Very　High, 42∼51이 High, 24∼42가 Standard, 14∼24가 Low, 14 이하가 Very　Low로 된다.

이와 같이 MRE 복합 리간드는, NK세포를 다양한 루트로 활성화할 수 있고, 암을 Very　High의 레벨로 아포토시스로 인도할 수 있다.

또한 아포토시스의 잔해는 신속하게 대식세포가 탐식하고, 항암제나 방사선 조사와 같이 암세포를 괴사(necrosis)시키는 일이 없으므로, 염증이나 악액질(惡液質; cachexia)을 야기하지 않고 암은 자연히 축소해 가는 것으로 보여진다.

MRE 복합 리간드는, 정맥 주사를 놓은 개의 간장암(실시예8 참조), 음료를 마신 비호지킨 림프암(실시예13 참조), 신장암의 투석 환자에게서 좋은 결과가 얻어지고 있다(실시예31 참조). 이 결과는, IL-21투여의 임상결과와 대략 일치하고 있다(특허문헌4). 또한 바이러스성의 암의 발암 초기증상인 폴립(polyp)의 소실도 관찰되었다.

그리고 MRE 복합 리간드에 의해서는, 염증을 수반하지 않고 암세포를 축소시키는 제암효과(制癌效果)를 가지는 것이 분명해졌다.

여기에서 암으로는, 암종(癌腫), 육종(肉腫), 종양(腫瘍) , 상피종(上皮腫), 백혈병, 림프종, 폴립 및 경성암(硬性癌), 악성 전환, 신생물(新生物) 등 「정상이지 않은 세포」가 포함되는 것으로 한다.

왜냐하면, NK세포는 「정상성」을 일탈한 세포만을 선택해서 배제하는 자연면역세포이기 때문이다(비특허문헌5).

항염증효과

MRE 복합 리간드는, 항균작용, 항바이러스 작용, 항암작용이라는 기능을 유지하면서 동시에 항염증작용, 조직 수복 작용이라는 기능을 가지다고 하는, 다른 리간드에는 없는 우수한 성질을 가지고 있다. 항염증작용은 MRE 복합 리간드의 주목해야 할 성질이기도 한다.

본원 발명에 관한 MRE 복합 리간드는 다음의 프로세스에 의해 염증을 억제하고 있다.

첫 번째는, 일관적인 면역활성 프로세스를 펄스 모양으로 활성화하기 때문에, 활성화와 그것보다 늦는 억제화가 시간차이로 펄스 모양으로 진행하여, 생명체로서의 균형과 항상성을 유지하고 있는 것을 알 수 있다. TLR, NLR, RLR의 자극으로부터 NF-κB와 AP-1의 활성화를 거쳐 IL-1B(47.641)와 TNFA(21.182) 및 IL-8(20.431)의 유전자 발현이 최대가 되면, 프로세스의 제2단계째의 「방아쇠」가 되는 NFKBIZ(20.011)의 유전자 발현이 왕성하게 되어, 다음 생산물인 IL-6(1.405), IL-12B(1.837), IL-23A(1.784) 등을 생산하기 시작한다. 그와 동시에, 제1단계째의 NF-κB를 강하게 억제하는 TNFAIP6(37.142)과 TNFAIP3(18.830)의 유전자 발현이 현저하게 증대하고, 유리한 NF-κB를 블록해서 불활성화하는 NFKBIA(8.425), NFKBID(2.101), IKBKE(1.447) 등의 유전자가 발현되어, NF-κB의 유전자인 NFKB1(2.794)과 NFKB2(2.534)의 발현이 저하하여 간다, 와 같이 진행해 간다(괄호 내는, 통상과 비교한 유전 발현 배율). 이렇게 MRE 복합 리간드에 의한 프로세스에서는, 불필요한 염증은 억제되어 간다. 만성염증은, 이 억제 과정이 작용하지 않게 되는 상태라고 생각된다. MRE 복합 리간드에 의해 염증성 질환이 회복하는 것이 보여지지만, 이 프로세스의 정상화에도 공헌하고 있다고 생각된다.

두 번째는, MRE 복합 리간드에 의하여 염증성 질환의 트리거(방아쇠)인 IL-18의 생산을 억제한다. IL-18 생산의 감소에 의하여 비염증성의 Th17 프로세스, 비염증성의 Th1 프로세스, 비염증성의 Th2 프로세스가 활성화한다.

MRE 복합 리간드에 의해서는, 비염증성의 Th17 프로세스와 비염증성의 Th1 프로세스가 활성화된다. Th17로부터는, 비염증성의 액성 면역을 활성화시키는 IL-17F와, NK세포를 활성화시키는 IL-21이 분비된다. Th1로부터는 INF-γ가 생산되어 세포성 면역을 높인다. 그리고 쌍방의 프로세스 모두, 항균력 및 항바이러스력을 유지하면서 IL-18의 억제에 의해 자가면역이나 알레르기 질환을 포함하는 염증성 질환을 가라앉히는 기능을 한다.

세 번째는, IL-21 생산에 의하여 알레르기 질환 및 자가면역질환의 침정화(沈靜化)이다.

MRE 복합 리간드에 의한, 인간의 혈액으로부터의 IL-21시험의 결과를 다음 표에 나타냈다.

NK세포의 IL-21 생산 시험의 방법과 순서는 다음과 같다.

채혈 후의 30시간 이내의 전혈을 시험에 사용했다. Ficoll-Conray 비중원심법에 의해 PMBC를 분리 후에, RPMI1640(10% FBS 함유)로 세정해 Effector　cell로 하였다. 이것을 하기의 조건으로 PBMC 4.0×10⁶cells/ml, 24시간 배양하였다(5% CO₂, 37℃). 또, MRE 복합 리간드 함유 원액의 첨가 농도는, MRE 복합 리간드 함유 원액의 1일 섭취 목표량 100ml 및 표준적인 인간의 혈액량 4,500ml로부터 MRE 복합 리간드 함유 원액이 혈중에 100% 흡수되었을 경우의 농도 6.66%(v/v)를 기준으로 하여 농도를 설정했다.

이와 같이 하여 얻은 PBMC에 대하여, 이하의 조건으로 MRE 복합 리간드 함유 원액이 IL-21 생산에 주는 영향을 평가했다.

(A)Control(첨가 없음)

PBMC　1.0×10⁶cells/ml, PHAP-10μg/ml, 24시간 배양(5% CO₂, 37℃)

(B)MRE 복합 리간드 함유 원액 첨가

PBMC　1.0×10⁶cells/ml, PHAP-10μg/ml, MRE 복합 리간드 함유 원액6.00%(v/v), 24시간 배양(5% CO₂, 37℃)

표19와 같이, MRE 복합 리간드 함유액에 의해 IL-21의 생산량은 평균적으로 통상의 2.11배 증가해 있으며, 주목해야 할 것은, 원래 IL-21이 낮은 레벨밖에 발현되지 않고 있었던 사람에게서 현저하게 증가하는 경향이 있는 것을 알 수 있다.

IL-21은, 항바이러스 성분을 분비하거나 내추럴킬러 세포를 증식시켜서 항암작용을 높이는 사이토카인이며, 또한 알레르기나 자가면역질환을 야기하는 T세포와 B세포를 아포토시스 시키는 기능도 있는 것이 알려져 있다.

MRE 복합 리간드에 의해서 이렇게 인간의 혈액 중에서 실제로 IL-21이 현저하게 상승하는 것이 확인되었고, 임상치험에서도 실시예15∼실시예20과 같이 그 항염효과를 분명히 뒷받침하고 있다.

또한 상기의 표4에서도, 염증성 사이토카인인 TNF-α의 농도가 인간의 혈중에서 리간드 등의 자극이 없는 상태에서 평균 232.8ng/ml이지만, MRE 복합 리간드에 의한 자극을 주어도 평균 221.8ng/ml로 미세하게 감소하고 있다. 이 결과는, 단독의 대식세포에 MRE 복합 리간드에 의하여 동일한 레벨로 자극하였을 때에 통상의 37.042배의 유전자가 발현하고 있는(도4 참조) 것과 비교해서 생각할 때, 그 염증억제 효과는 분명하다.

이러한 MRE 복합 리간드에 의한 IL-21 생산 유도 작용은, 다양한 면역질환, 예를 들면 알레르기성 질환(특히 알레르기성 천식, 화분증, 아토피성피부염, 습진, 음식물과민증, 담마진, 알레르기성 비염, 알레르기성 결막염 등등의 IgE 조절 알레르기성 질환(I형 알레르기 반응이 관여하는 질환)),

자가면역질환(만성관절류머티스, 크론병, 전신성 에리테마토데스(Erythematodes), 강피증(强皮症), 다발성근염, 다발성연골염, 결절성동맥주위염(結節性動脈周圍炎), 강직성척추염, 류머티스열(rheumatic fever), 쉐그렌증후군(SjOgren Syndrome), 베체트병(Bechet's disease), 갑상선염, I형당뇨병, 피부근염, 만성활동성간염, 중증근무력증, 그레브스병(Graves' disease), 다발성경화증, 원발성담즙성간경변, 자가면역성혈액질환(용혈성 빈혈, 진성적혈구성 빈혈, 특발성혈소판감소증, 재생불량성 빈혈 등), 건선, 사구체신염, 루프스신염, 베게너육아종증(Wegner's Granulomatosis), 사르코이도시스(sarcoidosis), 하시모토병, 가와사키병, 교원병(膠原病)),

이식에 의한 거부, 염증상태(관절 및 근육에 있어서의 염증 및 동통(만성관절류머티스, 류머티스 골수염(rheumatoid osteomyelitis), 골관절증, 요산성관절염 등), 피부의 염증성 상태(습진 등), 눈의 염증성상(결막염 등), 염증을 수반하는 폐의 장애(천식, 기관지염 등), 염증을 수반하는 소화기의 상태(아프타성궤양, 크론병, 위축성 위염, 사마귀상 위염(verrucous gastritis), 궤양성 대장염, 지방편증, 국한성회장염(regional ileitis), 과민성장증후군 등), 잇몸염, (수술 또는 장애 후의 염증, 동통, 종창), 염증에 관련된 발열이나 동통, 염증성만성신장 상태(사구체신염, 루프스신염, 막성신염(膜性腎炎) 등), 포도막염(uveitis), 접촉피부염 등), 쇼크(패혈성 쇼크, 아나필락시스성 쇼크, 성인형 호흡궁박성 증후군 등), 암(폐암, 위암, 결장암, 간암, 호지킨증 등), 바이러스 질환(간염 등) 등의 예방, 치료에 유용한 것을 나타내고 있다.

조직 수복 작용

일반적으로, 대식세포의 M1(GM)으로부터 M2(M)로의 전환에 의하여 염증항균 상태로부터 염증억제, 조직 수복으로 기능이 절환되는 프로세스에 의해, 조직 수복이 이루어진다고 생각된다.

이 전환이 무엇에 의해 야기되는지는 아직 해명되어 있지 않다. 그러나 현실에서는, 초기단계에 세균이나 바이러스의 침입에 의해 디펜신 등의 항균물질이나 항바이러스 물질 그리고 보체(補體)가 방출되어 살균하고, 또 호중구, 대식세포 등의 식세포가 탐식하여 처리한다.

그 방어망이 돌파되어 호중구가 파괴되면, 호중구 내의 리소좀 효소군이 방출되어 염증이 시작된다. 세균의 파편을 감수(感受)한 수상세포, 대식세포, 상피세포로부터 비상시를 알리는 염증성 사이토카인군이 분비된다. 세균의 수가 많으면 면역세포가 동원되어 조직적인 염증으로 진전되어 간다. 염증부위에서는, 국소적으로 온도를 높이고 PH를 산성 쪽으로 함으로써, 세균이나 바이러스의 활동을 저하시킴과 동시에 리소좀 효소를 포함하는 비상시의 효소군이 활동하기 쉬운 환경을 만든다. 이것이 염증 단계의 프로세스이다.

침입한 세균을 다 파괴하면, 파괴된 세균의 단편은 리소좀 효소에 의해 저분자화되어 그 일부가, 대식세포나 수상세포 및 혈관내피세포 등 항원제시 능력이 있는 세포(APC)의 LHA 수용체(동물에서는 MHC 수용체)에 의하여 감지되어, 그 정보는 기억 T세포와 기억 B세포에 저장된다. 다른 일부는, 대식세포의 자연면역계의 TLR 수용체, NLR 수용체, RLR 수용체에 의하여 감지되어, 그 항균 완료된 리간드의 패턴을 인식해서 대식세포는 M1상태로부터 M2상태로 절환하여 IL-10 및 IL-2를 방출함과 아울러, 조직 수복을 촉진하는 FGF를 생산해서 섬유아세포나 골아세포 등을 활성화한다. 그 때에 저분자 리간드가 항균완료 패턴의 시그널이 된다고도 하고 있다.

MRE 복합 리간드는, 바로 균체를 리소좀에서 저분자 분해해서 얻어진 것으로서, 조직 수복 효과를 기대할 수 있었다. 그리고 마이크로 어레이에 의한 DNA 동태분석에서, 조직 수복을 촉진하는 사이토카인의 하나인 FGF2를 통상의 2.525배 발현하고 있는 것을 찾아냈다.

임상치험에서도 MRE 복합 리간드의 조직 수복 작용을 확인할 수 있었다(실시예25∼실시예29 참조).

노폐물제거 작용

대식세포의 M1활성화는 대식세포의 탐식활동도 활성화한다. 이 때문에, 혈액이나 림프구 및 조직에서 죽은 세포나 이물질 및 산화 LDL과 같은 산화 독소를 탐식 분해하고, 그 잔사를 담즙 중에 버리는 체내정화의 기능을 하고 있다. M1활성화를 하는 MRE 복합 리간드에는, 대식세포의 활성화를 통해서 노폐물제거 작용을 가져오는 효과가 있다.

이와 같이 MRE 복합 리간드는, 항염증작용과 항균작용, 항바이러스 작용, 항암작용을 동시에 가진다고 하는 우수한 성질을 가지고 있다. 또한 올리고 영역의 저분자이기 때문에 장으로부터도 점막으로부터도 용이하게 흡수된다. 또한, 음료로서도 외용제로서도 또 정제함으로써 주사제로서도 이용가능하다.

본원 발명에 관한 MRE 복합 리간드의 기능은, 전체적으로, 림프구면역을 억제하여 자연면역을 증강시키는 성질이 있다고 할 수 있다.

또한 본 발명에 관한 면역 증강 조성물은, 인간 및 개 등을 포함하는 포유동물에 투여됨으로써, 상기한 바와 같은 여러 가지 자연면역자극 효과를 발휘하는 것이다. 또한 이 경우에 투여의 방법은, 본 발명에 관한 면역 증강 조성물이 그 기능을 발휘할 수 있는 상태에서 투여되는 것이면, 의학 또는 의료분야에서 보통 이루어지고 있는 어떠한 투여 방법이어도 좋다. 예를 들면 장(腸)을 통하여 투여되거나 또는 경구적으로 투여될 수 있고, 또는 비경구적으로 이루어지는 것이더라도 좋다. 비경구적으로 이루어지는 투여 방법으로서는, 혈관 내 투여, 조직 주위 및 조직 내 주사, 피하주사 등을 들 수 있고, 피부나 점막에 직접 도포되어도 좋다. 또한 점안 투여(點眼投與), 점비 투여(點鼻投與), 경피적 투여(經皮的投與), 점막 투여(粘膜投與)하는 것도 가능하다.

또한 본원 발명에 관한 면역 증강 조성물은, 그 기능을 발휘할 수 있는 태양이면, 의학 또는 의료분야, 또는 분자생물학분야에 있어서 보통 사용되는 어떠한 제형(劑形)에 의해서도 투여될 수 있다. 예를 들면 본원 발명에 관한 면역 증강 조성물은, 액체의 조성물로서 투여될 수 있지만, 이 경우에 원액이어도 좋고 희석액이어도 좋다.

다음에 본 발명의 효과에 관해서 실시예를 들어서 설명한다. 그러나 본 발명은 이하에 기재된 실시예에 한정되는 것이 아니라, 여러 가지 변경 및 수식이 당업자에 의해 용이하게 되는 것이 이해될 것이다.

MRE 복합 리간드의 제조

[실시예1/MRE 공생균군의 배양과 내포자화에 의한 MRE 복합 리간드 함유 원액의 작성]

본 발명에서 이용되는 MRE 복합 리간드 함유 원액은, MRE 공생균군의 영양세포로부터 분비된 소화효소군과, 내포자화(포자화)에 수반하여 방출되는 리소좀 효소 상동의 벌크형 효소군과의 혼합된 효소군에 의하여, MRE 공생균군이 자신의 균체를 저분자 영역까지 분해해서 만들어진다.

MRE 균군의 배양은, 호기성 그람 양성균에 있어서 공지의 일반적인 배양 방법으로 배양했다. 우선 1.2m³의 배양폭기조에 1000리터의 물을 넣어 에어레이션(폭기)을 하였다. 그 배양폭기조에 어분 10kg, 쌀겨 10kg, 깻묵 5kg, 육즙 1kg을 영양물로서 주고, 황산마그네슘과 실리카 등의 미네랄을 적량(適量) 더 가했다. 균체를 투입하고, 배양PH6.0∼6.8 및 배양온도 25℃∼35℃의 배양 조건하에서, 그리고 용존산소농도 0.5mg/L∼1.2mg/L가 되도록 에어레이션(폭기)을 가하면서 MRE 공생균을 배양했다.

균의 충분한 증식과 안정화를 기다렸다가 영양세포상태에 있는 MRE 균군을 그 배양액과 함께 별도의 폭기식의 배양조에 분별한다. 이 배양폭기조에서 MRE 균군에 일절의 영양을 끊어서 기아상태 하에 두고, 또 25℃∼35℃의 조건하에서 에어레이션을 계속해서 가하면, 질소성분의 고갈을 트리거로 하여 MRE 공생균군의 내포자화가 시작된다. 배양액의 투명도가 단숨에 늘어나는 것을 기다렸다가 에어레이션(산소공급)을 멈추면, 내포자는 일제히 침전을 비롯하여 투명한 상등액을 얻는다.

이와 같이 하여 얻어진 상등액을 0.2미크론의 멤브레인으로 가압 여과하여, 저분자의 MRE 복합 리간드 함유 원액을 얻는다. 이 MRE 복합 리간드 함유 원액에는, 3.6mg/ml의 유기성분이 존재하고 그 중에 MRE 복합 리간드 성분을 80μg/ml 함유하고 있다. 본원 명세서에 있어서, 상술한 바와 같이 해서 얻은 「MRE 복합 리간드 함유 원액」을 「MRE 원액」이라고 부르고, 특별히 언급하는 경우를 제외하고, 「MRE 복합 리간드의 희석」이라고 표현되는 경우에는 「MRE 복합 리간드 함유 원액의 희석」 또는 「MRE 원액의 희석」을 가리키는 것이다.

임상치험예

항바이러스 효과

[실시예2/에이즈(HIV)]

매혈(賣血)에 의해 약 800명의 반수 이상이 HIV에 감염된 아시아의 농촌에서, 발병한 20명을 선택해 의약품은 일절 사용하지 않고 본 발명의 음료를 1일 200ml 1개월 마시게 했다. 음료를 마신 3명과 마시지 않고 에이즈 약을 사용한 1인에 대해서, CD4양성 T세포의 모든 T세포에 대한 비율(CD4+/CD3) 및 혈액 1ml당의 CD4양성 T세포 수를 플로우 사이토메트리(flow cytometry)법으로 측정해 표20과 같은 결과를 얻었다.

본 발명의 음료를 음용한 20명 전원이 1년 후에는 일을 하는 것을 비롯해서 건강하게 일상생활을 보내고 있었다. 부작용의 보고는 하나도 없다.

[실시예3/C형간염(HCV)]

남성 48세. C형간염으로, 인터페론과 리바비린(Ribavirin)의 치료를 해도 바이러스량이 28,000/ml, ALT(GPT)가 621, AST(GOT)가 586으로 별로 내려가지 않아, MRE 음료를 음용하기 시작하였다. 우르소(urso)에 더하여 본원 발명 음료를 50ml를 1일 3회 음용하였다. 3개월 지나서 바이러스량을 PCR로 측정하니, 12800/ml로 내려가 있었다. ALT(GPT)가 48, AST(GOT)가 52로 현저하게 개선되어 있었다.

[실시예4/자궁경암(HPV)]

여성 50세. 자궁경부의 바이러스 감염 발병(자궁경암의 원인 바이러스 HPV). MRE 혼합 리간드 음료 30ml를 1일 2회(아침, 저녁) 섭취. 2개월 후의 검사에서 클래스3a로부터 클래스2a로 개선되었다.

[실시예5/감기에 걸리기 쉬운 체질]

여아 6세. 병약해서 감기에 잘 걸린다. 때때로 38.5도 이상의 고열이 계속된 적도 있었다. MRE 음료 1일 2회 20ml를 계속하여 마시고 3개월 후, 감기에 걸리지 않게 되었다.

[실시예6/사마귀(HPV)]

남성 71세. 손가락에 사마귀가 생겨 일에 지장을 초래하고 있었다. MRE 음료 50ml를 매일 2번 계속해서 마셨더니 6개월 후에 사마귀가 눈에 띄지 않을 만큼 축소되었다. 사마귀는, HPV(인간·파필로마·바이러스)가 원인이라고 하고 있다.

[실시예7/대상포진]

여성 60세. MRE 복합 리간드 음료 30ml를 1일 2회 섭취함과 아울러 환부에 도포. 1∼2일째에 개선되었다. 헤르페스나 대상포진은 음용과 동시에 도포하면 빨리 낫는다.

항균효과

[실시예8/만성감염]

여성 58세. 전신의 균 감염(기회감염균 감염)에 의해 지치면 발등, 발목, 복사뼈, 손가락의 엄지 등과 매회 다른 장소가 붓고 염증을 일으킨다. 류마티즘(rheumatism) 인자는 마이너스이고, 항생 물질을 복용하면 낫는 것을 반복해 왔다. 그러다가 항생 물질이 듣지 않게 되어, MRE 음료를 시험 삼아 1일 50ml를 2회 마시게 되었다. 그 결과, 월 1∼3회 발병하던 것이 약 반년에 1회의 발병으로 끝나고 있다. 증가하고 있었던 혈소판도 감소했다.

[실시예9/욕창]

여성 80세. 욕창으로 화농된다. MRE 음료를 욕창 부분에 스프레이 한 후에 거즈에 적셔서 찜질했다. 화농이 안정되기 시작하고, 1개월 후에는 욕창이 작아져 상처 자리에서 발생하는 냄새도 경감되었다.

항암효과

[실시예10/간장암]

12세 수컷의 고령 개. 간암으로 물도 먹이도 먹을 수 없게 되고, 잘 움직일 수 없는 상태가 되어 있었다. 치료할 방법이 없기 때문에, 시험 삼아 MRE 음료를 약 15ml 정맥에 주사했다. 3일째에 일어나서 물을 마시기 시작했으므로, 물에 MRE 음료 100ml를 가해서 마시게 한 바, 먹이도 먹기 시작하더니 그대로 건강해졌다. 동물병원의 의사도 암은 축소한 것 같고 완치됐다고 하였다.

[실시예11/간장암]

13세 수컷의 고령 잡종개. 일본 야마구치현(山口縣)의 대학의 수의학부에서, 「간장에 악성 종양이 몇 개나 생겨 손댈 방법이 없다.」라고 진단되었다. 수술도 할 수 없는 상태이므로, 매일 MRE 음료를 물에 타 묽게 해서 마시게 했다. 1주 후, 대학에서 재진하였더니 암이 커지지 않고 있다는 진단을 받았다. 그 후에 개가 적극적으로 MRE 음료를 마시기 시작하여 날이 지날수록 건강을 회복하여, 1개월 후에는 집안을 뛰어다니게 되었다. 3개월 후의 뢴트겐 검진에서는, 암이 축소해서 작아져 있었다. 외출시의 산보도 식사도 통상으로 되돌아가서 건강하게 뛰어 놀고 있다.

[실시예12/간장암]

여성 75세. 간장암과 당뇨병이 병발하여, 인슐린 주사를 사용하였다. MRE 음료 50ml를 1일 2회 마셨다. 2개월 정도 지나서, 암세포가 축소하고, 인슐린 주사 전의 혈당값이 저하해 갔다.

[실시예13/간기능 개선]

남성 42세. 간기능 검사에서, ALT(GPT)의 값이 64. MRE 리간드 음료 30ml를 1일 2회 섭취. 1개월 후의 검사에서 ALT값 58, 2개월 후의 검사에서 ALT값이 33으로 정상이 되었다.

[실시예14/전립선암]

남성 61세. 혈액의 PSA값 3000μg/ml를 넘는 말기의 전립선암. 골전이 직전의 상태에서 입로부터 토혈이 있었다. 수술은 불가능해서, 항안드로겐 작용이 있는 카소덱스(Casodex)와 4주간에 1번 여성 호르몬제의 루프린을 피하 주사하였다. 일시적으로 PSA값은 1까지 하강했지만 또 재연되었다. 그래서 카소덱스를 효과가 높은 오다인(플루타미드)으로 변경했다. 그러나 오다인은 심각한 간장애를 일으킬 우려가 있다. 혈액검사에서 PSA는 0.92이었지만, AST(GOT)가 56(정상값 11∼30)으로, ALT(GPT)가 196(정상값 4∼30)으로 상승하였다. 더 이상 이 상태가 계속되면 고통이 따르는 항암제로 이행하기 때문에, MRE 음료를 1일 250ml 매일 계속해서 마셨다. 그 결과, PSA값도 AST, ALT값도 전부 정상적으로 유지할 수 있었다. 맥주를 마시거나 담배를 피면서 주 1∼2회 테니스를 즐기는 것이 가능하게 되었다.

[실시예15/위암]

남성 70세. 간암으로부터 위로 전이되어서 종양(腫瘍)이 커지게 되었다. 그 때문에 식사를 할 수 없게 되었다. 점적(點滴)에 의한 치료와 함께 MRE 음료 30ml를 1일 2회 복용. 1∼2개월 지나자 위와 간장의 종양이 축소되기 시작했고, 4개월째에는 식사를 할 수 있게 되었다. 5개월째의 검사에서는 거의 소멸하고 있는 것처럼 보였다.

[실시예16/대장암]

남성 69세. 대장암으로 입원. MRE 리간드 음료 80ml를 1일 2회 섭취. 음용 후에 종양 마커(marker)가 내려가기 시작해, 1개월 후에 종양 자체도 작아졌다. 적출 수술을 했지만 림프 등으로의 전이는 없었다.

[실시예17/췌장암]

남성 66세. 췌장암으로 항암제치료를 하고 있다. 또한 당뇨병으로 인슐린도 주사하고 있다. MRE 리간드 음료를 1일 30ml 섭취하였더니 몇 개월 지나서 몸상태가 대단히 좋아졌다.

[실시예18/직장암]

여성 78세. 인공항문 장착. 가족은 의사로부터 불치의 선고를 받았다. MRE 리간드 음료를 첫날 2병(1800ml), 2일째 1병(900ml), 3일째 1병(900ml)을 마셨다. 그 후의 검사에서, 뼈까지 전이되고 있었던 암도 포함하여 소실되고 있었다.

[실시예19/폐암]

남성 76세. 폐암으로부터 뼈로 전이되어 항암제의 TS-1을 복용. 당초에는 효과가 있어 회복을 기대했지만, 그 후에 효과가 옅어졌다. 통증·변비가 격렬하여 호스피스 시설에서 마약·변비약에 의한 치료를 받았다. MRE 리간드 음료 30ml를 1일 3회 섭취. 3주 후의 검진에서 폐암이 소실(뼈에는 잔존)되었다. 일에 복귀할 수 있었다.

[실시예20/악성림프종]

여성 62세. 스테이지4의 비호지킨 림프종으로, 전신에 전이되고, 귀 아래의 턱의 부분에 고무 밤송이와 같은 종상을 형성. 항암제 등 일절의 의약품치료를 하지 않고, 의사의 관리를 기초로, 비타민C의 대량 정맥주사와 함께 MRE 음료 50ml를 1일 2회 음용하였다. 3개월 후, 혈중의 IL-21이 현저하게 상승하고, 전이된 전이암의 축소를 비롯하여 귀 아래의 턱의 부분의 종양도 부드러워져 갔다.

항염증효과

[실시예21/턱의 관절염]

남성 64세. 우측의 턱관절의 염증으로 1개월 정도 입이 벌어지지 않는 상태가 되었다. 충치가 원인이지 않을까하고 치아의 치료를 했지만 전혀 낫지 않았다. MRE 음료를 1일 100ml 마시기 시작했다. 다음날에는 턱의 열이 내리고 통증이 가벼워지고, 3일 후에는 입을 벌리는 것이 가능하게 되어 보통으로 식사를 할 수 있을 만큼 회복했다. 약 1주 후에는 정상적으로 되돌아갔다.

[실시예22/담마진]

여성 31세. 원인 불명의 담마진 모양의 발진이 전신에 매일 같이 나타났다. MRE 음료를 50ml 마시게 하였다. 마시면 1시간 정도 가려움이 가벼워져 참을 수 있는 정도가 되었다.

다음날, 또 발진해서 1일 2회 마시게 하였다. 1개월 지날 때쯤에는 담마진 모양의 발진이 나타나지 않게 되었다.

[실시예23/담마진]

여성 54세. 500엔 동전 정도의 크기의 담마진이 음용 2일째에 새끼 손가락 크기로 작아졌고, 움푹 꺼지는 데에 1주 정도 걸렸던 것이 2∼3일이면 꺼지고, 피부가 매끈매끈해 졌다.

[실시예24/궤양성 대장염]

여성 49세. 궤양성 대장염으로 정기적으로 입퇴원을 반복하였다. 펜타사(Pentasa)와 사라조피린(Salazopyrin) 등의 부작용 때문에 상당히 지독한 담마진 모양의 약진(藥疹)이 병발하므로, 스테로이드제를 사용한다. 본 발명의 MRE 음료를 1일 200ml 마시기 시작하고, 약 1개월 후에 약진이 일어나지 않게 되었다. 그 후에 통원과 투약을 중지하였다. MRE 음료를 마시기 시작하고 나서부터 약 10개월째의 내시경 검사에서의 염증소견이 보이지 않게 되었다. 그 후에 식사요법을 하고 MRE 음료를 계속 마셨다. 정장제(整腸劑) 이외의 투약을 일절 하지 않았지만 궤양성 대장염의 증상은 일어나지 않았다.

[실시예25/아토피성피부염]

여성 31세. 얼굴을 포함해서 전신 각처의 피부에 붓기와 가려움을 동반하는 아토피(atopy) 모양의 염증으로 괴로워했다. MRE 음료를 화장수와 같이 스프레이 했더니 붓기와 가려움이 일시적으로 상당히 경감하는 것을 알아냈다. MRE 음료 30ml를 1일 2회 음용했더니 2개월 정도 후에 습진이 잘 생기지 않게 되었다.

[실시예26/말벌]

남성 65세. 말벌에 찔렸으므로 급하게 MRE 음료를 머리에 발랐더니 붓지 않고 회복했다.

[실시예27/지네]

남성 28세. 지네에 발을 찔려서 4개월이 지나도 붓기가 빠지지 않고 양말의 고무자국이 파고 들어가는 것 같이 선명히 남아 있었다. MRE 음료를 1일 1회 30ml 음용하였더니, 10일째부터 붓기가 빠지기 시작했다. 아직, 깜박해서 마시는 것을 것을 잊으면 붓기가 생기고, 마시면 붓기가 빠지는 상태에 있다.

[실시예28/알레르기성 비염]

여성 15세. 알레르기성 비염. MRE 음료 30ml를 1일 2회 음용. 3주 사이에 증상이 개선되었다.

당뇨병과 고혈압

[실시예29/당뇨병]

남성 56세. 당뇨병으로 공복시 혈당값이 152∼396의 범위에서 변동하며 회복되지 않고 A1C가 8.6을 넘는 값이 되었다. MRE 음료를 1일 180ml 마시기 시작하고 1개월째에, 공복시 혈당값이 134이고 A1C 7.6으로 떨어졌다. 2개월째에는 공복시 혈당값이 90이고 A1C 7.3, 3개월째에는 공복시 혈당값이 89이고 A1C 5.8, 4개월째에는 공복시 혈당값이 91이고 A1C 5.0이 되어 정상값이 되었다.

[실시예30/당뇨병]

남성 68세. 부친도 형도 당뇨병으로 사망. 본인은 인슐린을 맞기 직전까지 악화. MRE 음료를 1년 가까이 계속해서 마셔, 의사가 당뇨병은 좋아졌다고 하였고, 약 복용을 그만둘 수 있었다. 그 이후, 혈당값이 높다고 들은 적이 없고, 본인은 매일 술을 2병 마셔도 쾌조라고 하고 있다.

[실시예31/고혈압]

남성 70세. 최고혈압 160, 최저혈압 98이었지만, MRE 음료 30ml를 1일 2회 음용하고 1개월 후에, 최고혈압 140대, 최저혈압 80대로 내려갔다.

[실시예32/고혈압]

남성 72세. 혈압 160-90. MRE 리간드 음료 50ml를 1일 2회 음용. 1개월 후에 혈압이 130-80. 3cm 정도 있었던 검버섯도 작아졌다.

조직 수복 효과(골절과 상처의 회복)

[실시예33/수술자국의 창상]

남성 61세. 복부를 수술했지만, 당뇨병이 있기 때문에 실밥을 뽑을 때까지 적어도 6개월이 걸린다고 했다. MRE 음료를 1일 1회 50ml 음용하였다. 1주 후에 실밥을 뽑았다.

[실시예34/인대손상]

남성 42세. 왼쪽 무릎의 인대손상으로 리허빌리테이션(rehabilitation)을 해도 「보행은 가능하지만 달리는 것은 곤란 」이라고 진단되었다. 5년 지나도 달리거나 무리를 하거나 하면 왼쪽 다리의 통증이 생기는 상태가 낫지 않았다. MRE 음료를 마시기 시작하고 2주 후, 자전거를 장시간 타도 왼쪽 다리의 통증을 느끼지 않게 된 것을 알아차렸다. 시험 삼아 달려 보았더니 불과 5m였지만 달릴 수 있었다. 그 후에도 MRE 음료를 계속하여 마셔 10m, 20m로 달리는 거리를 연장시킬 수 있었다. 1주간 음용을 중지했더니 장시간의 자전거 운전에 통증을 느끼고, 달려도 위화감을 느꼈다. 5킬로 마라톤을 목표로 달리는 거리를 연장시키는 노력을 하고 있다.

[실시예35/골절]

여성 88세. 골절로, 의사로부터 뼈가 연결될 때까지 반년이 걸린다고 들었다. MRE 음료를 음용하였더니, 1개월만에 뼈가 붙었다.

[실시예36/발의 저온 화상]

여성 73세. 발의 지독한 저온 화상으로 1개월 치료해도 육아(肉芽)가 오르지 않고 회복되지 않았다. MRE 음료 30ml를 1일 2회 음용하였더니, 1주 사이에 육아가 오르기 시작했다.

[실시예37/여드름 자국]

여성 61세. 고등학생 때 「여드름」을 짜서 코에 요철의 「여드름 자국」이 생겼다. MRE 음료를 1일 50ml 마셨다. 약 2개월째에 「여드름 자국」이 작아지기 시작하여, 6개월째에는 완전히 없어지지는 않았지만 상당히 축소해서 피부의 요철이 눈에 띄지 않게 되었다. 전체 피부의 살결도 고와졌다.

[실시예38/수술 후의 비문증]

남성 51세. 망막 박리의 수술 후에 비문증이 되었다. MRE 음료를 1일 50ml 음용하였더니 2주 사이에 개선이 보였고, 혈압도 150 이상이었던 것이 130을 넘는 일이 없어졌다.

[실시예39/신장기능 개선]

남성 51세. 신장 투석을 하고 있는 환자.

표21에 나타나 있는 바와 같이, MRE 음료를 음용하기 전에는 BUN값에 별로 변동이 없었는데, 음용 후 컨트롤 값 이내의 값이기는 하지만, MRE 음료를 마시기 시작해서 서서히 저하해 갔다. 무엇보다도 기운이 생기게 되었다고 기뻐하고 있다. MRE 음료를 복용해서 3개월째의 투석 후의 값이 정상값이 된 것에 주의한다.

그 밖에, 상세한 데이터는 얻어지지 않았지만, MRE 음료를 음용하고 있는 신장투석 환자가 2명 있다. 한 명은 자력으로 요(尿)가 조금 나가게 되었다. 두 명 다 건강해져 농작업이나 직장에 복귀하고 있다.

정상인에의 시험 음용예

[실시예40/정상인에의 시험 음용]

MRE 음료를 시험 음용한 건강한 72명에게 앙케이트를 실시했다. 72명 중의 58명이 요(尿)의 방출이 좋아졌다고 기술하고 있다. 또한 72명 중 41명이 감기에 걸리지 않게 되었다고 느끼고 있다. 피부에 윤기가 나게 된 사람은 72명 중에서 68명에 이르렀다. 약초 등으로 변비가 된 사람을 포함해서 부작용인 듯한 것은 발견되지 않았다. 오히려 변비가 좋아졌다고 하는 사람이 12명 있었다.

그 밖에, 본 발명은 여러 가지로 변형 가능한 것은 말할 필요도 없고, 상기한 한 실시형태에 한정되지 않고, 발명의 요지를 변경하지 않는 범위에서 여러 가지로 변형 가능하다.

<110> MEISHO.Co.,Ltd <120> IMMUNOPOTENTIATING COMPOSITION AND PROCESS FOR PRODUCING SAME <130> P110-89JP <150> JP/2009/061956 <151> 2009-02-20 <160> 5 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 538 <212> DNA <213> Lysinibacillus fusiformis <400> 1 tggagagttt gatcctggct caggacgaac gctggcggcg tgcctaatac atgcaagtcg 60 agcgaacaga gaaggagctt gctccttcga cgttagcggc ggacgggtga gtaacacgtg 120 ggcaacctac cctatagttt gggataactc cgggaaaccg gggctaatac cgaataaytt 180 gtttcacctc atggtgaaac actgaaagac ggtttcggct gtcgctatag gatgggcccg 240 cggcgcatta gctagttggt gaggtaacgg ctcaccaagg cgacgatgcg tagccgacct 300 gagagggtga tcggccacac tgggactgag acacggccca gactcctacg ggaggcagca 360 gtagggaatc ttccacaatg ggcgaaagcc tgatggagca acgccgcgtg agtgaagaag 420 gatttcggtt cgtaaaactc tgttgtaagg gaagaacaag tacagtagta actggctgta 480 ccttgacggt accttattag aaagccacgg ctaactacgt gccagcagcc gcggtaat 538 <210> 2 <211> 538 <212> DNA <213> Lysinibacillus sp. <400> 2 tggagagttt gatcctggct caggacgaac gctggcggcg tgcctaatac atgcaagtcg 60 agcgaacaga gaaggagctt gctcctttga cgttagcggc ggacgggtga gtaacacgtg 120 ggcaacctac cctatagttt gggataactc cgggaaaccg gggctaatac cgaataatyt 180 atttcayctc atggtgaaat actgaaagac ggtttcggct gtcgctatag gatgggcccg 240 cggcgcatta gctagttggt gaggtaaygg ctcaccaagg cgacgatgcg tagccgacct 300 gagagggtga tcggccacac tgggactgag acacggccca gactcctacg ggaggcagca 360 gtagggaatc ttccacaatg ggcgaaagcc tgatggagca acgccgcgtg agtgaagaag 420 gatttcggtt cgtaaaactc tgttgtaagg gaagaacaag tacagtagta actggctgta 480 ccttgacggt accttattag aaagccacgg ctaactacgt gccagcagcc gcggtaat 538 <210> 3 <211> 525 <212> DNA <213> Comamonas denitrificans <400> 3 tggagagttt gatcctggac tcagattgaa cgctggcggc atgccttaca catgcaagtc 60 gaacggtaac aggtctttcg ggatgctgac gagtggcgaa cgggtgagta atacatcgga 120 acgtgcctag tagtggggga taactactcg aaagagtggc taataccgca tgagatctat 180 ggatgaaagc aggggacctt cgggccttgt gctactagag cggccgatgg cagattaggt 240 agttggtggg ataaaagctt accaagccta cgatctgtag ctggtctgag aggacgatca 300 gccacactgg gactgagaca cggcccagac tcctacggga ggcagcagtg gggaattttg 360 gacaatgggg gaaaccctga tccagcaatg ccgcgtgcag gatgaaggcc ttcgggttgt 420 aaactgcttt tgtacggaac gaaaagtctt gggttaatac cctgggatca tgacggtacc 480 gtaagaataa gcaccggcta actacgtgcc agcagccgcg gtaat 525 <210> 4 <211> 538 <212> DNA <213> Bacillus sonorensis <400> 4 tggagagttt gatcctggct caggacgaac gctggcggcg tgcctaatac atgcaagtcg 60 agcgaaccga cgggagcttg ctcccttagg ttagcggcgg acgggtgagt aacacgtggg 120 taacctgcct gtaagactgg gataactccg ggaaaccggg gctaataccg gatgcttgat 180 tgaaccgcat ggttcaatta taaaaggtgg cttttagcta ccacttacag atggacccgc 240 ggcgcattag ctagttggtg aggtaacggc tcaccaaggc gacgatgcgt agccgacctg 300 agagggtgat cggccacact gggactgaga cacggcccag actcctacgg gaggcagcag 360 tagggaatct tccgcaatgg acgaaagtct gacggagcaa cgccgcgtga gtgatgaagg 420 ttttcggatc gtaaaactct gttgttaggg aagaacaagt accgttcgaa cagggcggtg 480 ccttgacggt acctaaccag aaagccacgg ctaactacgt gccagcagcc gcggtaat 538 <210> 5 <211> 539 <212> DNA <213> Bacillus sp <400> 5 tggagagttt gatcctggct caggatgaac gctggcggcg tgcctaatac atgcaagtcg 60 agcgaatgga ttaagagctt gctcttatga agttagcggc ggacgggtga gtaacacgtg 120 ggtaacctgc ccataagact gggataactc cgggaaaccg gggctaatac cggataacat 180 tttgaacygc atggttcgaa attgaaaggc ggcttcggct gtcacttatg gatggacccg 240 cgtcgcatta gctagttggt gaggtaacgg ctcaccaagg caacgatgcg tagccgacct 300 gagagggtga tcggccacac tgggactgag acacggccca gactcctacg ggaggcagca 360 gtagggaatc ttccgcaatg gacgaaagtc tgacggagca acgccgcgtg agtgatgaag 420 gctttcgggt cgtaaaactc tgttgttagg gaagaacaag tgctagttga ataagctggc 480 accttgacgg tacctaacca gaaagccacg gctaactacg tgccagcagc cgcggtaat 539

Claims (22)

1. 자연면역을 자극함으로써 대상이 구비하는 면역을 증강시키는 면역 증강 조성물로서,
   바실러스 sp.(Bacillus sp.)(FERM BP-11209), 리시니바실러스 후시폴미스(Lysinibacillus　fusiformis)(FERM　BP-11206), 바실러스 소노렌시스(Bacillus　sonorensis), 리시니바실러스 sp.(LysiniBacillus sp.)(FERM BP-11207) 및 코마모나스 sp.(Comamonas sp.)(FERM BP-11208)로 이루어지는 MRE 공생균군(共生菌群)으로부터 선택되는 1 또는 그 이상의 균류(菌類)를 분해함으로써 발생하는 면역부활물질을 유효성분으로서 구비하는 것으로서,
   상기 면역부활물질은, 상기 MRE 공생균군으로부터 선택되는 1 또는 그 이상의 균류를 배양하고, 얻어진 배양액을 기아상태에 둠으로써, 상기 균류룰 내포자화(內胞子化) 시키고, 또한 상기 배양액으로부터 상기 내포자화된 균류를 포함하는 불순물을 제거함으로써 얻어지는 것을 특징으로 하는 면역 증강 조성물.
   
2. 제1항에 있어서,
   상기 면역부활물질은, 적어도 그 98중량% 이상이 평균분자량 1,000Da 이하의 친수성 저분자 물질인
   것을 특징으로 하는 면역 증강 조성물.
   
3. 제1항에 있어서,
   상기 면역부활물질은, 대식세포(macrophage), 내추럴킬러세포(natural killer cell), 또는 내추럴킬러 T세포를 활성화시키는 것을 특징으로 하는 면역 증강 조성물.
   
4. 제1항에 있어서,
   상기 면역부활물질은, 수상세포(樹狀細胞), 마이크로글리아세포(microglia cell), 랑게르한스세포(Langerhans' cells), 또는 쿠퍼세포(Kupffer's cell)를 활성화시키는 것을 특징으로 하는 면역 증강 조성물.
   
5. 제1항에 있어서,
   상기 면역부활물질은, 상피세포(上皮細胞), 섬유아세포(纖維芽細胞), 케라틴세포(keratinocyte) 또는 골아세포(骨芽細胞)를 활성화시키는 것을 특징으로 하는 면역 증강 조성물.
   
6. 제1항에 있어서,
   상기 면역부활물질은, Th17 또는 Th1을 분화 또는 활성화시키는 것을 특징으로 하는 면역 증강 조성물.
   
7. 제1항에 있어서,
   상기 면역부활물질은, IL-21 생산을 증강시키는 것을 특징으로 하는 면역 증강 조성물.
   
8. 삭제
9. 제1항에 있어서,
   이 면역 증강 조성물은, 알레르기 질환 또는 자가면역질환에 걸린 대상에 있어서의 항염증제로서 사용되는 것을 특징으로 하는 면역 증강 조성물.
   
10. 제9항에 있어서,
    상기 알레르기 질환 또는 자가면역질환은, 턱관절염, 궤양성 대장염, 아토피성피부염, 알레르기성 비염으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 면역 증강 조성물.
    
11. 제1항에 있어서,
    이 면역 증강 조성물은, 병원성 세균 또는 병원성 바이러스에 대한 백신의 아쥬반트(adjuvant)로서 사용되는 것을 특징으로 하는 면역 증강 조성물.
    
12. 제11항에 있어서,
    상기 병원성 세균 또는 병원성 바이러스는, 기회감염균(opportunistic pathogen), HIV, HCV 및 HPV로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 면역 증강 조성물.
    
13. 제1항에 있어서,
    이 면역 증강 조성물은,
    간암, 전립선암, 대장암, 직장암, 폐암, 췌장암, 위암, 악성 림프종, 당뇨병, 고혈압, 창상, 인대손상, 골절, 저온 화상, 여드름, 비문증, 욕창, 담마진으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 질환에 걸린 대상을 치료 또는 예방하기 위한 의약 또는 동물약으로서 사용되는
    것을 특징으로 하는 면역 증강 조성물.
    
14. 제1항에 있어서,
    이 면역 증강 조성물은, 식품 또는 사료로서 사용되는 것을 특징으로 하는 면역 증강 조성물.
    
15. 자연면역을 자극함으로써 대상이 구비하는 면역을 증강시키는 면역 증강 조성물을 제조하는 방법으로서,
    바실러스 sp.(Bacillus sp.)(FERM BP-11209), 리시니바실러스 후시폴미스(Lysinibacillus　fusiformis)(FERM　BP-11206), 바실러스 소노렌시스(Bacillus　sonorensis), 리시니바실러스 sp.(LysiniBacillus sp.)(FERM BP-11207) 및 코마모나스 sp.(Comamonas sp.)(FERM BP-11208)로 이루어지는 MRE 공생균군으로부터 선택되는 1 또는 그 이상의 균류를 준비하여 배양하는 공정과,
    상기 준비된 1 또는 그 이상의 균류를 분해하는 공정과,
    상기 균류를 배양한 배양액으로부터 불순물을 제거하는 공정
    을 구비하는 것으로서,
    상기 분해하는 공정은, 상기 준비된 1 또는 그 이상의 균류를 배양하고, 얻어진 배양액을 기아상태에 둠으로써 상기 균류를 내포자화 시킴으로써 이루어지는 것을 특징으로 하는 면역 증강 조성물을 제조하는 방법.
    
16. 삭제
17. 자연면역에 관련되는 질환에 감염된 인간을 제외한 포유동물을 치료 또는 예방하는 방법으로서,
    바실러스 sp.(Bacillus sp.)(FERM BP-11209), 리시니바실러스 후시폴미스(Lysinibacillus　fusiformis)(FERM　BP-11206), 바실러스 소노렌시스(Bacillus　sonorensis), 리시니바실러스 sp.(Lysinibacillus sp.)(FERM BP-11207) 및 코마모나스 sp.(Comamonas sp.)(FERM BP-11208)로 이루어지는 MRE 공생균군으로부터 선택되는 1 또는 그 이상의 균류를 분해함으로써 발생하는 면역부활물질을 유효성분으로서 구비하는 면역 증강 조성물의 치료상 유효한 양을 준비하는 공정과,
    상기 준비한 면역 증강 조성물의 치료상 유효한 양을 상기 인간을 제외한 포유동물에 투여하는 공정을
    구비하는 것을 특징으로 하는 방법.
    
18. 삭제
19. 제17항에 있어서,
    상기 투여하는 공정은 경구적(經口的)으로 이루어지는 것을 특징으로 하는 방법.
    
20. 제17항에 있어서,
    상기 투여하는 공정은 비경구적(非經口的)으로 이루어지는 것을 특징으로 하는 방법.
    
21. 제20항에 있어서,
    상기 비경구적으로 이루어지는 투여하는 공정은, 혈관 내 투여, 조직 주위 및 조직 내 주사, 피하주사, 점안투여, 점비투여, 경피적 투여, 점막투여로부터 선택되는 것을
    특징으로 하는 방법.
    
22. 제17항에 있어서,
    상기 자연면역에 관련되는 질환은,
    턱관절염, 궤양성 대장염, 아토피성피부염, 알레르기성 비염을 포함하는 알레르기 질환 또는 자가면역질환,
    기회감염균, HIV, HCV 및 HPV를 포함하는 병원성 세균 또는 병원성 바이러스 관련 질환,
    간암, 전립선암, 대장암, 직장암, 폐암, 췌장암, 위암, 악성 림프종, 당뇨병, 고혈압, 창상, 인대손상, 골절, 저온 화상, 여드름, 비문증, 욕창, 담마진으로
    이루어지는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.

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