KR20050034510A - 내성균의 방어를 유도하는 대식세포의 제조법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 항생제 내성세균인 메티실린내성황색포도구균(MRSA) 에 대하여 백신효과를 유도하는 대식세포를 제조하는 방법에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명은 일반적으로 항생제에 내성을 보여주는 내성세균에 대하여 안전한 백신을 개발하기 위하여 대식세포를 인터페론 감마(interferon-r)로 자극을 가하여 활성화를 유도하고 이런 대식세포에 내성세균항원을 가한후에 이 대식세포만을 주사하여 체내에 면역반응을 유도 시켜서 백신효과를 유도하는 신기능 대식세포의 제조의 방법에 관한 것으로서, 본 발명의 조작된 대식세포는 다양한 세균 및 바이러스 의 백신개발에 유용하게 사용될 수 있다.
Description
본 발명은 내성세균에 대한 백신효과를 나타내는 대식세포의 제조기술 및 이를 세균감염에 대한 치료에 사용하는 용도에 관한 것이다.
구체적으로, 본 발명은 생체내에서 세균에 대한 억제기작을 갖고있는 대식세포를 분리 배양하고 배양중에 사이토카인인 인터페론 감마를 세포에 처리하여 대식세포의 기능을 활성화시키고 이에 내성세균인 MRSA 를 감작시켜 체외에서 인공적으로 세균에 대한 면역성을 가지는 대식세포를 제조한후 이를 생체내에 투여하여 생체내에서 세균에 대한 면역기능을 갖도록 하는 방법에 대한 것이다. 본 발명은 다른 종류의 세균감염증의 치료에도 적용하여 유용하게 사용될수 있다.
대식세포는 단핵식균세포들은 면역계를 구성하는 세포들 중에서 두 번째로 주요한 집단으로, 식균작용 (phagocytosis)을 나타내는 세포들이다. 이러한 식균세포 중에 혈액에 있는 세포를 단구 (monocytes)라고 하며, 조직에 존재하는 세포를 대식세포 (macrophage)라고 부른다. 단핵식균세포도 다른 혈구들처럼 골수의 전구세포로부터 분화 성숙되어 만들어진다. 이들 세포들은 특히 임프조직의 망상내피계 (reticuloendothelial system)를 구성하기 때문에 reticular cell (격자세포)이라고 부르기도 한다. 임프조직의 대식세포들이 서로 망모양의 구조를 하고 있는 것은 아마도 항원을 효과적으로 걸러내기 위한 것이다. 일부의 대식세포는 그들이 위치하는 조직에 따라 microglial cell, Kupper's cell등으로 불리기도 한다.
monocyte는 조직으로 이동하여 tissue macrophage 가 되며, 감염부위나 염증부위로 유인되기도 한다. 대식세포는 국소적인 자극에 따라 그들의 표현형이 바뀌거나 새로운 기능을 얻을 수 있는데, 이러한 자극을 대식세포의 활성화라고 부른다. 특별한 자극이 없으면 대식세포는 조용히 조직 내에 존재한다. 이러한 상태의 대식세포를 휴지기 대식세포 (resident macrophage) 라고 한다. 대식세포는 여러 가지 염증반응에 의하여 활성화되면 염증반응 대식세포 (inflammatory macrophage)가 되며, 이들은 여러 가지의 지질매개물질 (lipid derived mediators)이나 보체단백질, cytokine등을 만들어 염증 반응에 관여하기도 하며, 그 결과 조직의 손상을 초래하기도 한다. 또한 대식세포는 T cell이 만들어낸 IFN-γ나 IL-4, GM-CSF등에 의하여 활성화되어 활성화된 대식세포 (activated macrophage)가 되는데, 이들은 미생물이나 암세포들을 효과적으로 파괴하기도 한다. 또한, 대식세포는 섬유아세포(fibroblast)와 혈관내피세포의 성장인자를 생산하여 손상된 조직의 치유에 관여하기도 한다.
대식세포는 식균작용이 있기 때문에 항원을 잡아먹을 수가 있어서 자연면역에서 중요한 기능을 나타낸다. 이들은 미생물, 항원, 죽은 조직, 적혈구등을 식균작용으로 파괴할 수 있다. 대식세포의 식작용과정을 살펴보면, 먼저 대식세포에 의하여 파괴될 입자, 즉 항원 입자는 대식세포의 표면에 결합된 다음, 대식세포의 세포막에 둘러싸이게 된다. 항원 입자는 대식세포에 비특이적으로 결합하기도 하지만, 특이적인 수용체에 의하여 대식세포와 결합할수도 있다. 대식세포에 있는 Fc receptor는 IgG 급의 항체가 결합되어 있는 항원을 인식하게 해주며, C3 receptor는 보체와 결합된 항원을 인식하게 해주어, 이들 단백질이 결합된 항원은 식균작용을 더욱 잘 받게된다 (opsonization). 대식세포의 세포막이 항원을 완전히 둘러싸게 되면 항원은 phagosome이라는 주머니 상태로 대식세포 안으로 들어가게 되며, 이 주머니는 대식세포내의 lysosome과 융합되어 Phagolysosome을 형성하게되며, lysosome이 가지고 있는 여러 가지의 산성가수분해효소의 작용이나 superoxide radical 및 과산화수소와 같은 활성화 산소계 물질 (oxygen radical) 등의 작용에 의하여 항원이 분해되고 죽게되는 것이다.
대식세포는 자연면역이나 염증반응에서 중요한 역할을 할 뿐 아니라, 획득면역반응에서도 중요한 역할을 하는 데, 그 대표적인 기능이 T cell에 항원을 보여주는 것이다 (antigen presentation). 대식세포는 식균작용으로 단백질 항원을 받아들이며, 그들을 작은 peptide로 분해하며 (antigen processing), 분해된 peptide를 자신의 MHC와 결합시켜 다시 세포표면에 내보내어, T cell에 의해 인식되게 한다. 대식세포는 T cell에 항원을 제시할 뿐 아니라 IL-1과 같은 cytokine을 분비하여 T cell의 활성화를 촉진할 수 있다. 또한, 대식세포는 면역반응의 시작에 필요한 항원을 제시하는 기능이 외에도, 세포매개성 면역반응과 체액성 면역반응에서 면역작용을 나타내는 중요한 작용세포 (effector cell)로 활동하기도 한다. T cell에 의해 활성화된 대식세포는 지연성과민반응 (delayed type hypersensitivity)에서 항원을 제거하는 기능을 하며, 대식세포는 항체가 결합되어 있는 항원을 식균작용으로 제거하는 기능을 가지고 있다.
인터페론 감작을 이용한 대식세포의 항세균제제 사용법의 이론은 간단한 하다.
즉, 일반적으로 세균에 대한 식균성 및 면역성을 가지고 있는 대식세포를 인터페론 감마를 더하여서 그 식균작용 및 면역성을 증가시킨후 세균과 반응시켜 세균에 대한 식균및 면역성을 더 얻게 만드는 것이다. 이러한 대식세포를 만들기 위해서는 체내에 다량의 인터페론 감마를 투여할경우 체내 심한면역독성이 유도됨으로 현 사이토카인을 이용한 항세균요법을 체내적용에 많은 문제점을 가지고 있다. 이에 대한 대안으로 세포를 이용한 치료제들이 연구되고 있는바 수지상 세포를 이용한 암치료제연구등이 그것이나 세균에 대한 적용은 미미하다. 이 방법의 원리는 체내에서 혈액 또는 골수를 채취하여 이를 체외에서 배양하여 수지상 세포로의 분화를 유도하고 이에 항암항원을 더하여 수지상세포가 항암항원에 대한 면역성을 확보하게 한후 수지상 세포를 다시 체내에 투입하여 항암면역작용을 유도하는 것이다.
본 발명의 목적은 식균작용이 증가된 대식세포를 이용하여 내성세균에 대한 면역효과를 얻는데 있다.
대식세포는 체내에 일반적인 식균작용 및 T 세포에 항원을 전달하여 줌으로 세포성면역과 체액성면역을 유도하는 기능을 가지고 있다. 현재까지의 연구결과로는 외래 세균의 감염시에 대식세포에 의한 1차적인 면역반응이 발생하게 되는데 이때 대식세포의 식균작용의 능력과 세균의 증식능력의 정도의 차이에 따라 세균이 체내 감염이 억제될수도 아니면 감염이 확산될수도 있는 것으로 알려져 있다. 이때 식균작용에 크게 영향을 미치는 사이토카인은 인터페론 감마로써 이 사이토카인의 분비로 인하여 대식세포의 식균작용기능이 활성화 될경우 일반적으로 대식세포안에서 증식하여 감염증을 일으키는 세균의 경우에도 활성화된 대식세포는 세균을 억제 할수 있는 것으로 알려져 있다.
본 발명은 이렇게 항세균요법에 사용될수 있는 상기 대식세포를 분리 배양하여서 체외에서 활성화하는 방법을 제공한다. 구체적으로 본 발명은 내성세균에 대한 면역성을 띄는 대식세포를 만들기 위해서 배양기내에서 대식세포에 대한 인터페론 감마의 감작반응을 유도한후 이에 내정세균항원을 더하여 내성세균에 대한 면역성을 띄는 대식세포를 제조한후 이를 분리하여 세포치료제로 사용하는 것이다.
또한, 본 발명은 상기 대식세포를 내성세균등의 난치성 세균 치료에 사용하는 용도를 제공함에 그 목적이 있다. 본 발명의 대식세포 세포치료제는 특히 내성세균 및 세균무기아 같이 현재의 항생제로서 치료하기 힘든 세균질환등에 매우 유용하게 사용될 수 있다. 구체적으로, 본 발명은 활성화된 대식세포를 인체내에 감염질환의 예방 및 치료용으로 주입하여 세균의 감염증이 진행되는 것을 억제하거나 세균을 사멸시켜 세균감염증을 치료하는 항세균 세포치료제 요법을 제공할 수 있다.
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본 발명은 내성세균에 대한 면역원성을 제공하는 대식세포를 제공한다. 본 발명의 대식세포를 제조하기 위하여 생체내에서 대식세포를 분리하고 이에 사이토카인 인터페론 감마를 자극하여 향상된 식균작용을 보이는 대식세포를 증식시킨후 이에 내성세균의 항원과 반응시켜 내성세균에 대한 항원을 인식한 대식세포를 제조한다.
구체적으로 본 발명은 생체내에서 분리된 자가유래 대식세포를 이용한다. 대식세포를 분리하는 방법은 여러가지 방법이 있을수 있다. 첫째로 복강내에서 유래되는 대식세포를 채취하는 방법과 혈액내의 단핵세포를 분리 배양하여 대식세포를 유도하는 방법이 있다. (도1참조) 분리되어 배양되는 대식세포의 식균작용의 능력을 배가 시키기 위하여 인터페론 감마를 배양기에 처리하여 향상된 대식세포의 기능을 보여주는 대식세포를 제조한다. 이를 내성세균 항원과 배양기내에서 반응시킨후 대식세포만을 분리하여 이를 치료용 대식세포로 사용한다. (도2참조)
상기 대식세포가 면역성을 유도하는 것을 확인하기 위하여 마우스 실험동물모델에 투여하여 내성세균에 대한 항체반응을 마우스 혈청의 항체가를 ELISA를 실시하여 확인한다. (도3참조)
이때 동물모델에 직접적으로 세균을 감염 면역반응을 유도한후 이들에 의한 동물의 생존률을 측정하여 이를 가지고 치사량을 측정하여 이 치료용 대식세포의 효과를 확인한다. (도 4참조)
이하, 본 발명을 실시예에 의해 더욱 상세히 설명한다. 하기 실시예들은 본 발명을 예시하는 것으로, 본 발명의 내용이 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
실시예 1 세포치료제로 사용할 내성세균면역성 대식세포의 제조
세포치료제로 사용할수 있는 내성세균면역성 대식세포를 제조하기위해서 본 연구에서는 대식세포 세포주(J774A1)와 마우스의 복강에서 분리한 대식세포주들을 배양하였다. 이 배양된 세포주에 대하여 배양액중에 인터페론 감마를 5unit/ml 의 비율로 가하여 대식세포의 기능 활성을 유도한후 이 세포주에 내성세균단백항원들을 첨가하여 24시간 배양하여 내성세균항원을 인식하도록 유도하였다. 이후 대식세포주를 분리하여서 이를 동물시험에 사용하였다.
실시예 2 인터페론 감마에 의한 내성세균의 제거효과 분석
실시예 1에서 얻은 대식세포주에 내성세균을 더한후에 24시간 37도에서 반응시킨후 이 응기내에서 세균의 생존률을 배양되는 세균수를 측정하여 분석한다.
실시예 3 세포치료제 대식세포의 항체반응성 분석
실시예 1에서 얻은 대식세포주를 사용하여 이를 마우스(Balb/c)에 2주간격으로 3회 반복적으로 복강으로 투여한후에 2주간격으로 얻은 혈청을 가지고 이에 대해 서 세균에 대한 항체 생성여부를 면역효소측정법(ELISA)을 이용해서 확인하였다.
실시예 4 내성세균의 동물모델을 통한 세포치료제용 대식세포의 치료효과의 분석
실시예 3에서 처럼 대식세포주를 사용하여 2주간격으로 3회 면역주사한후 이에 대하여 10^5 내성세균을 5% HOGMUCIN PBS용액에 희석하여 복강주사하여 내성균에 대한 감염증을 유도하고 이에 대한 생존률변화를 분석하였다.
도 1은 본 발명의 대식세포의 제조방법의 모식도
도 2는 인터페론 감마에 의한 내성세균(MRSA)의 살상효과를 확인
도 3은 본 발명의 대식세포를 주사하여 항체반응이 생성됨을 확인
도 4는 본 발명의 대식세포를 주사한 마우스에 세균을 투여한후 방어효과를 확인
Claims (3)
- 체외에서 배양하여 인터페론 감마를 자극하고 내성세균을 처리한 세포치료제기능의 대식세포
- 제 1항의 대식세포를 내성세균에 대한 백신으로 사용하는 용도
- 제 1항의 대식세포에 다른 항원을 가하여 백신으로 사용하는 용도[참고문헌]
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020030070783A KR20050034510A (ko) | 2003-10-07 | 2003-10-07 | 내성균의 방어를 유도하는 대식세포의 제조법 |
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| KR20050034510A true KR20050034510A (ko) | 2005-04-14 |
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| KR1020030070783A KR20050034510A (ko) | 2003-10-07 | 2003-10-07 | 내성균의 방어를 유도하는 대식세포의 제조법 |
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| KR (1) | KR20050034510A (ko) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP3487511A4 (en) * | 2016-07-25 | 2020-04-01 | Cellular Approaches, Inc. | AUTOLOGOUS AND ALLOGENIC MACROPHAGES AND MONOCYTES FOR USE IN THERAPEUTIC METHODS |
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2003
- 2003-10-07 KR KR1020030070783A patent/KR20050034510A/ko active Search and Examination
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