WO2010092958A1 - 質量分析技術を用いた免疫分析方法および免疫分析システム - Google Patents

質量分析技術を用いた免疫分析方法および免疫分析システム Download PDF

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immunoassay
measurement object
mass spectrometry
antigen
antibody
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勝弘 神田
真 野上
泉 和氣
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Hitachi High Tech Corp
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Hitachi High Technologies Corp
Hitachi High Tech Corp
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    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6803—General methods of protein analysis not limited to specific proteins or families of proteins
    • G01N33/6848—Methods of protein analysis involving mass spectrometry

Definitions

  • the present invention relates to an immunoassay method and an immunoassay system used for clinical examination.
  • immunization an antibody that specifically recognizes a measurement target component is applied. For example, after a measurement target component in a specimen is captured with an antibody (primary antibody), a secondary antibody that further selectively captures the primary antibody is obtained. Use to detect. For detection at this time, a label is added to the secondary antibody in order to increase sensitivity.
  • the label may be, for example, a fluorescent substance or a substance necessary for enzyme chemiluminescence.
  • the immunization method is a measurement technique that enables simple and sensitive detection, and is therefore suitable for quantitative measurement of trace components in a specimen.
  • the cross-reactivity is a phenomenon in which not only a measurement target component that should be originally recognized by the primary antibody but also a molecule having a similar structure such as a metabolite of the measurement target component. This means that the quantitative result is higher than the true value, and the measurement target component cannot be accurately quantified.
  • mass spectrometry is a measurement technique that can be distinguished from similar structural molecules such as metabolites because measurement is performed based on the mass of the component to be measured.
  • MS / MS analysis and MSn analysis techniques are techniques that enable high-precision identification of similar structural components by fragment ionizing a measurement target component.
  • mass spectrometry does not require preparation of a special reagent such as an antibody, cost and labor can be reduced.
  • JP 2006-126033 A JP 2005-524394 A JP 2005-098830 A JP 2005-291823 A WO 2004-031759
  • the most desirable is a component to be measured labeled with a stable isotope, but its synthesis is not only costly, but there is a problem that a stable isotope labeled product cannot be produced for a component that cannot be synthesized.
  • An object of the present invention is to realize an immunoassay method and an immunoassay system that can eliminate the cross-reactivity of an immunization method and solve the problem of component determination of mass spectrometry.
  • the present invention is configured as follows to achieve the above object.
  • the measurement target in the sample solution is captured using an antibody by pretreatment by the immunoassay, the measurement target component is recovered from the captured measurement target, and the recovered measurement target component Is subjected to mass spectrometry by mass spectrometry, and the components of the measurement object are analyzed.
  • the measurement object in the sample solution is captured using an antibody by pretreatment by the immunoassay method, the captured measurement object is quantified, and the measurement object is quantified.
  • the measurement object is collected from the waste liquid that has been subjected to, the collected measurement object is subjected to mass spectrometry by mass spectrometry, and the components of the measurement object performed by the immunization method are measured.
  • FIG. 1 It is a schematic block diagram of the whole sample immunity analysis system in Example 1 of this invention, and is a figure for showing the flow of a measurement. It is explanatory drawing of the immunity law. It is explanatory drawing of the waste liquid process of the immunity law. It is a figure which shows the cross-reactivity and drug efficacy of tacrolimus. It is a figure which shows the data regarding the measuring object in a patient sample. It is a figure which shows the apparatus structural example of the sample immunity analysis system shown in FIG. It is a figure which shows the other apparatus structural example of the sample immunity analysis system shown in FIG. It is a figure which shows the further another apparatus structural example of the sample immunity analysis system shown in FIG.
  • FIG. It is a figure which shows the further another apparatus structural example of the sample immunity analysis system shown in FIG. It is a schematic block diagram of the whole sample immunity analysis system in Example 2 of this invention, and is a figure for showing the flow of a measurement. It is explanatory drawing of the application in the pretreatment for immunization methods. It is explanatory drawing of measurement object component collection
  • Example 1 of the present invention will be described with respect to an example in which a component of a waste liquid after photometric measurement by immunization is detected by mass spectrometry.
  • FIG. 1 is a schematic configuration diagram of the entire license analysis system 102 according to the first embodiment, and is a diagram for illustrating a flow of measurement.
  • a sample 101 such as patient serum is subjected to pretreatment by an immunological pretreatment apparatus 103 and then photometrically measured by an immunological photometric detection system 104. Subsequently, pretreatment is performed by the mass spectrometry pretreatment device 105, and mass spectrometry is performed by the mass spectrometry detection system 106.
  • These sample immunity analysis system 102, immunization pretreatment device 103, immunization photometric detection system 104, mass spectrometry pretreatment device 105, and mass spectrometry detection system 106 are operated by a personal computer 107 for system control and data processing. The analysis result 108 is controlled and displayed on the display of the personal computer 107.
  • Components to be measured in a sample derived from a living body are first pre-processed by an immunological pretreatment device 103 according to an automatic immunoanalysis method, and the photometric detection system 104 for immunological methods is used. Thus, it is selectively captured by an antibody that specifically recognizes the component to be measured.
  • the antibody is previously bound to the magnetic particles by, for example, an avidin-biotin bond. As shown in FIG.
  • the magnetic particles 201 captured through the antibodies 202, 203, 204, and 206 are collected for the measurement target component 205 by the magnetic force of the magnetic body 210, the surrounding contaminants are washed away, and the labeled anti-antibody
  • the detection target component is detected and quantified by the detector 211 by performing a sandwich assay with the immunoglobulin antibody.
  • This quantitative value includes not only the measurement target component but also the cross-reactivity due to, for example, a structurally similar substance such as a metabolite derived from that component. There is a tendency to show a higher value than the value.
  • the component breakdown (relative ratio) of the substances that show cross-reactivity contained in the sample is obtained by mass spectrometry.
  • the quantitative value of the component captured from the quantitative value obtained by the immunization method is individually calculated as a value close to the true value.
  • the component to be measured is recovered from the sample (waste liquid) used in the immunization method.
  • the waste solution after immunoassay is separated from the antigen-antibody reaction by acid treatment, alkali treatment, ionic strength treatment, etc., and the antigen (component to be measured) is released from the antibody.
  • the magnetic beads are again collected by the magnetic force of the magnetic particles 301, the supernatant is collected, the solvent is replaced, and then supplied to the mass spectrometry detection system 106.
  • the components contained in the supernatant may be separated by a chromatographic technique such as size fractionation, or may be fragmented by enzymatic digestion, if necessary.
  • mass analysis is performed on the components contained in the supernatant.
  • the signal intensity and peak area for each component are obtained from the obtained chromatogram, and the breakdown of quantitative values measured by the immunization method is calculated for each component based on the relative ratio. Then, the quantitative value calculated by the immunization method is multiplied by the component ratio to correct the quantitative value for each component.
  • metabolites of components to be measured are listed as typical examples of structurally similar substances.
  • the component to be measured is a therapeutic drug
  • the concentration of can be calculated according to the present invention.
  • MI 13-o-demethyl type
  • M-II 31-o-demethyl type
  • M- III 15-o-demethyl type
  • M-IV (12-o-hydroxyl type
  • MV 15,31-o-demethyl type
  • M-VI 13,31-o-demethyl type
  • M-VII and M-VIII are known (K. Iwasaki, Drug Metab. Pharmacokinet., 22 (5), 328-335, 2007).
  • the cross-reactivity in the enzyme immunoassay with the monoclonal antibody used for the evaluation was 0%, 109%, 90.5%, 8.8%, 92.2%, 0%, 0%, 0%, respectively. Therefore, for example, when tacrolimus concentration in blood is measured by immunization for tacrolimus administered to a patient after organ transplantation using this antibody, not only tacrolimus but also M-II, M- There is a possibility that measurement is performed including metabolites of III, M-IV, and MV.
  • M-II and M-IV have both cross-reactivity and immunosuppressive properties. This is because when Iwasaki uses the monoclonal antibody used in the experiment to measure tacrolimus by immunization, it is possible to grasp the blood concentrations of M-II and M-IV together with tacrolimus, the drug to be measured. It becomes essential on.
  • FIG. 5 a model for determining each quantitative value of tacrolimus, M-II, and M-IV is shown (FIG. 5).
  • the measured values by immunization method (10 ng / ml) and the peak area relative ratios of each component when measured by MS (tacrolimus 100%, M-II 20%, M-IV 10%) are for explanation of the principle. Shall be provisionally set.
  • FIG. 5 shows a process up to calculation of a corrected quantitative value of a captured component by MS measurement.
  • the measured value when tacrolimus in a patient sample is quantified by immunization is 10 ng / ml
  • the chromatogram shows that M-II and M-IV are 100% of the peak area corresponding to tacrolimus.
  • the breakdown of the three components (tacrolimus, M-II, M-IV) captured by the immunization method is 76.9% for tacrolimus, 15.4% for M-II, and 7.7% for M-IV.
  • the quantitative value 10 ng / ml by immunization method is converted to the breakdown ratio, tacrolimus is 7.7 ng / ml, M-II is 1.5 ng / ml, M-IV is 0.8 ng / ml, and the tacrolimus concentration in the sample is This suggests that the measured value of the immunization method is not 10 ng / ml, but more precisely 7.7 ng / ml excluding the estimated value of the cross-reactive component.
  • calculating the quantitative value for each capture component from the ratio of the capture component by MS measurement is only the sum of multiple components due to cross-reactivity that is a problem in the immunization method.
  • the breakdown of immunological measurement values can be obtained by determining the abundance of each component captured by the immunization method without the internal standard required for quantitative measurement by the MS method. It is possible to obtain a quantitative value for each component by conversion.
  • FIG. 6 is a diagram showing a device configuration example of the sample immunity analysis system 102 shown in FIG.
  • the sample 1032 accommodated in the sample rack 1033 is dispensed into the reaction vial 1034 arranged on the reaction table 1035 by the dispensing mechanism 1031.
  • the reagent contained in the immunological reagent cartridge 1036 is also dispensed into the reaction vial 1034.
  • the reaction vial 1034 is moved from the reaction vial rack 1038 to the reaction table 1035 by the vial moving mechanism 1037.
  • the sample supplied from the immunological pretreatment device 103 passes through the cell 1042 including the magnet 1041, is irradiated with light from the light source 1043, and is measured by the photometer 1044. Quantitative data is detected.
  • the waste liquid from the photometric detection system 104 for immunization is supplied to the pretreatment device 105 for mass spectrometry.
  • the waste liquid from the immunometric photometric detection system 104 is mixed with the dispensed antigen free reagent by the dispensing mechanism 1046, and a free antigen solution is obtained by the action of the magnet 1045.
  • the sample substituted by the buffer replacement reagent is supplied to the mass spectrometry detection system 106.
  • the mass spectrometry system 106 includes an ion source 1061, a mass analysis unit 1062, and a vacuum pump 1063. Then, mass analysis is performed by the mass spectrometric detection system 106 to obtain spectrum data 108.
  • FIG. 7 is a view showing another device configuration example of the immune analysis system 102 shown in FIG.
  • the example shown in FIG. 7 is the same as the example shown in FIG. 6 in the configuration of the pretreatment device for immunization method 103, the pretreatment device for mass spectrometry 105, and the mass spectrometry detection system 106, but the photometry for immunity method.
  • the configuration of the detection system 104 is different.
  • a magnet 1048 is disposed in the vicinity of the reaction vial 1047 with the cell disposed on the reaction table 1035, and the light from the light source 1043 is transmitted in the reaction vial 1047 with the cell.
  • the reagent and the sample are irradiated, and the quantitative data is measured by the photometer 1044.
  • the waste liquid of the photometric detection system 104 for immunization is supplied to the pretreatment device 105 for mass spectrometry.
  • FIG. 8 is a diagram showing still another device configuration example of the immune analysis system 102 shown in FIG.
  • FIG. 8 is the same as the example shown in FIG. 6 in the configuration of the immunological pretreatment device 103 and the mass spectrometry detection system 106, but the immunometric photometric detection system 104 and the mass spectrometry detection system 106 are the same.
  • the configuration of the processing device 105 is different.
  • the sample after the reaction from the immunological pretreatment device 103 is supplied by the dispensing mechanism 1046 to the cell 1042 in which the magnet 1041 is arranged together with the antigen releasing reagent.
  • the sample is irradiated with light from the light source 1043 in the cell 1042 and photometrically measured by the photometer 1044 to detect quantitative data.
  • the waste liquid from the photometric detection system 104 for immunization is replaced with a buffer replacement reagent in the pretreatment apparatus 105 for mass spectrometry and supplied to the mass spectrometry detection system 106.
  • FIG. 9 is a diagram showing still another device configuration example of the immune analysis system 102 shown in FIG.
  • the configuration shown in FIG. 9 is the same as the configuration shown in FIG. 6 in the configuration of the mass spectrometry detection system 106, but the pretreatment device 103 for immunization, the photometric detection system 104 for immunization, and the mass spectrometry detection system
  • the configuration of the processing device 105 is different.
  • the sample held in the sample rack 1033 is transferred to the reaction table 1035 by the dispensing mechanism 1031.
  • the reaction vial 1047 the reagent of the immunological reagent cartridge 1036 is also dispensed.
  • the reaction vial 1047 is moved from the reaction vial rack 1038 to the reaction table 1035 by the vial moving mechanism 1037.
  • a magnet 1048 is disposed in the vicinity of the reaction vial 1047 with the cell, the light from the light source 1043 is irradiated onto the sample in the reaction vial 1047, and quantitative data is obtained by the photometer 1044.
  • a replacement vial 1039 moved from the replacement vial rack 1049 by the vial moving mechanism 1037 is arranged.
  • the sample of the reaction vial with cell 1047 is supplied with an antigen releasing reagent, the free antigen solution is supplied from the reaction vial 1047 to the replacement vial 1039, and the solution substituted with the buffer replacement reagent is supplied to the mass spectrometry detection system 106. Is done.
  • Example 2 of the present invention will be described.
  • Example 2 of the present invention is an example in which a sample for photometric measurement by immunization is applied to component detection by mass spectrometry. Rather than a sandwich assay using a secondary antibody by immunization, a substance to be measured captured by the primary antibody and a similar structural substance such as a metabolite exhibiting cross-reactivity are quantified by mass spectrometry.
  • FIG. 10 is a schematic configuration diagram of the entire sample immunity analysis system 502 according to the second embodiment of the present invention, and is a diagram for illustrating a flow of measurement.
  • the overall operation of the sample analysis system 502 is controlled by a system control and data processing personal computer 506.
  • a component to be measured in a sample 501 derived from a living body is first pretreated by an immunization pretreatment apparatus 503 according to an automatic immunoassay and measured. It is selectively captured by the antibody 604 that specifically recognizes the target component 605.
  • the antibody 604 is previously bound to the magnetic particles by, for example, an avidin-biotin bond (602-603).
  • the magnetic particles 601 captured through the antibody 604 with respect to the component to be measured are collected by the magnetic force of the magnetic body 606, and surrounding impurities and the like are washed away.
  • the captured component includes not only the component to be measured but also the cross-reactivity due to, for example, a structurally similar substance including a metabolite derived from the component, so that only a single component that the antibody should originally recognize is included. Is not limited. Therefore, the component breakdown (relative ratio) in the captured component is determined by mass spectrometry.
  • the component 305 captured by the antigen-antibody reaction is collected by the mass spectrometry pretreatment apparatus 504.
  • the antigen-antibody reaction product is separated from the antibody 304 by acid treatment, alkali treatment, ionic strength treatment, etc., and the antigen (measurement target component 305) is released.
  • the magnetic beads 301 are collected again by magnetic force, and the supernatant is collected and replaced with a solvent, and then supplied to the mass spectrometry detection system 505.
  • the components contained in the supernatant may be separated by a chromatographic technique such as size fractionation, or may be fragmented by enzymatic digestion, if necessary.
  • Mass analysis is performed on the components contained in the supernatant in the mass spectrometry detection system 505.
  • the signal intensity and peak area for each component are obtained from the obtained chromatogram, and the relative ratio is obtained.
  • an internal standard substance may be used to calculate a quantitative value for each component.
  • FIG. 13 is a diagram showing a device configuration example of the sample analysis system 502 shown in FIG.
  • the sample 5032 accommodated in the sample rack 5033 is dispensed into the reaction vial 5034 arranged on the reaction table 5035 by the dispensing mechanism 5031.
  • the reagent contained in the immunological reagent cartridge 5036 is also dispensed into the reaction vial 5034.
  • the reaction vial 5034 is moved from the reaction vial rack 5038 to the reaction table 5035 by the vial moving mechanism 5037.
  • the solution after the immune reaction supplied from the immunotherapy pretreatment device 503 is mixed with the dispensed antigen releasing reagent by the dispensing mechanism 5046, and the magnet 5045 A free antigen solution is obtained by the action, and the sample substituted with the buffer displacement reagent is supplied to the mass spectrometry detection system 505.
  • the mass spectrometry system 505 includes an ion source 5061, a mass analysis unit 5062, and a vacuum pump 5063. Then, mass analysis is performed by the mass spectrometry detection system 505, and spectrum data 507 is obtained.
  • FIG. 14 is a diagram showing still another device configuration example of the analysis system 502 shown in FIG.
  • the sample held in the sample rack 5033 is divided into reaction vials 5034 arranged on the reaction table 5035 by the dispensing mechanism 5031. Noted.
  • the reagent of the immunological reagent cartridge 5036 is also dispensed.
  • the reaction vial 5034 is moved from the reaction vial rack 5038 to the reaction table 5035 by the vial moving mechanism 5037.
  • a magnet 5048 is disposed in the vicinity of the reaction vial 5034.
  • a replacement vial 5039 moved from the replacement vial rack 5049 by the vial moving mechanism 5037 is arranged in the reaction table 5035.
  • the sample in the reaction vial 5034 is supplied with an antigen free reagent, the free antigen solution is supplied from the reaction vial 5034 to the replacement vial 5039, and the solution substituted with the buffer replacement reagent is supplied to the mass spectrometry detection system 505. .
  • the supernatant (reaction solution) when the magnetic beads are captured by the magnet is solid-phase extracted. Only the measurement target component may be extracted by processing.
  • the solid phase extraction agent is selected according to the physical properties of the component to be measured. For example, if the measurement target component and the luminescence detection reagent have different molecular sizes, hydrophobicity, and ionicity, they can be separated and recovered by applying extraction modes such as size fractionation, reverse phase separation, and ion exchange separation. Is possible. In order to carry out such a solid phase extraction treatment, conditions such as the composition, concentration, pH, etc. of the supernatant (reaction solution) may be changed as necessary.
  • the immune reaction and solid phase extraction treatment steps are performed in the order shown in FIG.
  • FIG. 15 shows the flow of the immune reaction and solid phase extraction treatment.
  • the immune reaction includes a step of capturing a component to be measured in a specimen by an antigen-antibody reaction using an immunoreagent, a step of washing and removing contaminant components, and a step of releasing the component to be measured from the immunoreagent.
  • solid-phase extraction treatment is a solid-phase extraction packing conditioning process using an organic solvent and H 2 O, a sample test step for the solid-phase extraction packing, and non-specifically adsorbed impurities on the solid-phase extraction packing. And a step of elution and recovery of the target component specifically adsorbed on the solid phase extraction filler.
  • the obtained extract can be used for clinical examination by, for example, testing or mass-identifying the components contained in the mass spectrometer.
  • the solid phase extraction agent conditioning process is performed in parallel during the immune reaction processing, and the measurement target component obtained by applying the immune reaction is roughly collected. It is necessary to match the timing of obtaining a purified solution (antigen extraction solution) with the timing of completion of conditioning of the solid phase extraction agent.
  • the solid phase extraction processing section A starts simultaneously with reaching the immune reaction processing section U.
  • Sample 2 and the subsequent samples are processed in the same manner, and the timing of starting them is executed when the previous sample moves to the section T and the section S is vacant.
  • Fig. 16 shows an example of a top view of a system configuration for automating the solid phase extraction process using a separate solid phase extraction cartridge in which the solid phase extraction column and the recovery device are separated.
  • an immune reaction processing container is arranged in eight sections on the concentric circumference of the turntable (cartridge holding section located in sections S to Z). 191 to 978), 14 solid phase extraction cartridges are arranged on the concentric circumference of the turntable (arranged in cartridge holding portions 901 to 914 located in the sections A to N), and the flow shown in FIG. 15 and FIG.
  • the steps constituting the immune reaction and the solid-phase extraction process are sequentially performed in parallel on the same circumference.
  • a specific operation procedure will be described below by taking blood drug concentration measurement as an example.
  • the system is provided with a monitoring mechanism (938) for monitoring the status of the processing process, and operations such as control of the entire system and data analysis are performed by the PC (937).
  • the immune reaction process is performed according to the following procedure.
  • the immune reaction container is transported to the cartridge holder (971) located in the section S on the turntable by the device moving mechanism.
  • the cartridge moves to the cartridge holder (973) located in the section U on the turntable, and the immunoreagent is added.
  • the cartridge holding part (975) located in the section W on the turntable collects the magnetic beads that have captured the antigen in the sample with a magnet, removes the reaction solution, and after washing the magnetic beads with the washing liquid, the washing liquid Remove.
  • the cartridge holding part (978) located in the section Z on the turntable collects the magnetic beads with a magnet, collects the solution having the released antigen, and conditioned solid phase extraction located in the section F Test the agent.
  • the composition (conditions) of the antigen extraction solution may be appropriately adjusted as necessary.
  • the used immune reaction container is discarded.
  • the solid phase extraction process is performed in the following procedure in parallel with the immune reaction process.
  • the solid phase extraction cartridge moving mechanism (941) transfers one solid phase extraction cartridge from the solid phase extraction cartridge stock mechanism (931) to the turntable (921). ) It is transported to the cartridge holding part (901) located in the upper section A.
  • This solid-phase extraction cartridge will be referred to as C1 for convenience and will be described below.
  • a conditioning organic solvent dispensing mechanism (942) dispenses a certain amount of organic solvent (for example, 100% methanol) to C1.
  • the turntable (921) rotates clockwise by one section, and C1 moves to the cartridge holder (903) located in the section C.
  • C1 By pressurizing C1 with a pressure application mechanism (943), the organic solvent is passed through the solid phase extraction agent. Waste liquid is collected in a drain or waste liquid collection container and then discarded.
  • a conditioning H 2 O dispensing mechanism (942) dispenses a certain amount of H 2 O to C1.
  • the turntable (921) rotates clockwise by one section, and C1 moves to the cartridge holder (905) located in the section E.
  • C1 By pressurizing C1 with a pressure application mechanism (943), the organic solvent is passed through the solid phase extraction agent. Waste liquid is collected in a drain or waste liquid collection container and then discarded.
  • the turntable (921) rotates clockwise by one section, and C1 moves to the cartridge holder (906) located in the section F. Test the antigen extraction solution collected in compartment Z against C1.
  • an internal standard substance dispensing mechanism (942) collects and dispenses a certain amount of internal standard substance from the internal standard substance container placed at the internal standard substance dispensing position of the internal standard substance arrangement mechanism (933). To do.
  • the turntable (921) rotates clockwise by one section, and C1 moves to the cartridge holder (908) located in the section H.
  • the specimen and the internal standard substance are stirred with respect to C1 by the stirring mechanism (944).
  • the turntable (921) rotates clockwise by one section, and C1 moves to the cartridge holder (909) located in the section I.
  • C1 By pressurizing C1 with a pressure applying mechanism (943), the mixed solution of the specimen and the internal standard substance is passed through the solid phase extraction agent. Waste liquid is collected in a drain or waste liquid collection container and then discarded.
  • the turntable (921) rotates clockwise by one section, and C1 moves to the cartridge holder (910) located in the section J.
  • a cleaning liquid dispensing mechanism (942) dispenses a certain amount of cleaning liquid into C1.
  • the turntable (921) rotates clockwise by one section, and C1 moves to the cartridge holder (911) located in the section K.
  • C1 By pressurizing C1 with a pressure applying mechanism (943), the cleaning liquid is passed through the solid phase extraction agent. Waste liquid is collected in a drain or waste liquid collection container and then discarded.
  • the turntable (921) rotates clockwise by one section, and C1 moves to the cartridge holder (912) located in the section L.
  • the eluate dispensing mechanism (942) dispenses a certain amount of eluate to C1.
  • FIG. 17 shows a side view of the system configuration in the partition M.
  • the eluate discharged from the solid-phase extraction cartridge (1001) C1 is collected by the collection container (1002) standing by at a position immediately below the C1 discharge port on the collection container arrangement mechanism (934, 1006).
  • the recovery container (1002) that recovered the eluate is moved to a predetermined position of the recovery container installation mechanism (934, 1006), and then the eluate is analyzed by the mass spectrometer (936, 1007). ) And quantitate while separating the target components in the eluate.
  • a dispensing mechanism absorbs a required amount of the extract and introduces it directly or indirectly (for example, flow injection method) into the ion source of MS. .
  • the turntable (921) rotates clockwise by one section, and C1 moves to the cartridge holder (914) located in the section N.
  • the solid phase extraction cartridge moving mechanism (941) collects C1 from the turntable (921) and discards it in the cartridge discarding unit (935).
  • the recovery container after the solid phase extraction process can be stored by being removed from the turntable by the recovery arm instead of being discarded.
  • the collection container during storage may be capped at the top of the collection container as necessary to avoid drying the extract. Even when dried, re-measurement can be performed by re-dissolving with a solvent.
  • the amount of solvent added at that time is controlled to a value obtained by subtracting the volume consumed for the measurement from, for example, the monitoring value of the liquid level (or volume) of the extract during solid phase extraction.
  • a new solid phase extraction cartridge (1001) C2 ( Tentative name) is input, and processing of the second sample is started by C2 with a delay of one section (work) following C1. Since the third and subsequent samples are similarly processed subsequent to C2, a total of 14 samples corresponding to the number of sections are sequentially processed in parallel on the turntable (921). The case of re-inspection is processed in the same manner.
  • the present invention is effective for improving the accuracy of measurement data by an immunization method, and can be widely applied to various fields such as basic research fields, medical treatment, drug discovery, testing, and diagnosis.
  • the present invention can solve the problems of the immunization method and mass spectrometry by complementing each other, and can provide a highly accurate and highly reliable clinical test result.
  • the deviation from the true value caused by the cross-reactivity is corrected by obtaining the relative ratio of the quantification component breakdown by the mass spectrometry method.
  • the quantitative values of the cross-reaction component and the measurement target component that cannot be obtained by the immunization method are individually obtained.
  • replacement vial 1 41, 1045, 1048, 5045, 5048 ... magnet, 1042 ... cell, 1043 ... light source, 1044 ... photometer, 1047 ... reaction vial with cell, 1049, 5049 ... for replacement Vial rack, 1061, 5061 ... ion source, 1062, 5062 ... mass analyzer, 1063, 5063 ... vacuum pump

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Abstract

　免疫法の交差反応性を解消し、質量分析法の成分定量の問題を解決できる免役分析システムを実現する。患者血清等の試料（１０１）は、免疫法用前処理装置（１０３）により、前処理が施された後、免疫法用測光検出系（１０４）により測光される。続いて、質量分析法用前処理装置（１０５）により前処理が行われ、質量分析検出系（１０６）により、質量分析が行われる。質量分析検出系（１０６）において、上清中に含まれている成分を質量分析する。得られたクロマトグラムから成分ごとのシグナル強度やピーク面積を求め、その相対比率に基づいて免疫法で測定した定量値の内訳を成分ごとに算出する。これにより、免疫法では交差反応性等の影響を受けていた測定対象成分の定量値について、真値に近い定量値が求められるとともに、交差反応性の要因となる構造類似物質の内訳も定量的に求めることができる。

Description

質量分析技術を用いた免疫分析方法および免疫分析システム
　本発明は、臨床検査に用いられる免疫分析方法及び免疫分析システムに関する。
　臨床検査における普及した検査手法の一つに免疫法がある。免疫法は、測定対象成分を特異的に認識する抗体を応用し、例えば検体中の測定対象成分を抗体（一次抗体）で捕捉した後に、その一次抗体をさらに選択的に捕捉する二次抗体を利用して検出する。このときの検出は、高感度化を図るために二次抗体に標識を付加している。標識は、例えば蛍光物質の場合や、酵素化学発光に必要な物質等の場合がある。免疫法は、簡便に高感度検出可能な測定技術であることから、検体中の微量成分の定量測定に適している。
　一方、免疫法には交差反応性の問題がある。交差反応性は、一次抗体が本来認識すべき測定対象成分だけでなく、例えば測定対象成分の代謝物のように類似した構造を有する分子をも捕捉してしまう現象である。このことは、定量結果が真値よりも高くなり、測定対象成分を正確に定量できないことを意味している。
　特に、低分子化合物等の場合は交差反応性が顕著になる傾向があり、抗体作製の際に測定対象成分へのキャリアタンパク質の付加により高分子化する必要があるため、その付加位置以外の部位のみエピトープとなり得ることから、位置によっては代謝物との構造差異の識別が不可能となることが原因の一つである。この交差反応性を抑制するためには、各種類似構造分子の差異を識別できる一次抗体の作製が求められるが、作製は困難であるとともにコストと労力がかかるため、非効率的である。
　免疫法に対して質量分析法は、測定対象成分の質量に基づいて測定するため、例えば代謝物等の類似構造分子との識別が可能な測定技術である。特に、ＭＳ／ＭＳ解析やＭＳｎ解析の手法は、測定対象成分をフラグメントイオン化することにより、類似構造成分どうしの高精度識別を可能にする技術である。また、質量分析法は、抗体のような特殊な試薬作製を必要としないため、コストと労力の削減が可能である。
　質量分析によるサンプル解析の前に、別の解析手法や処理を組み合わせた公知例がある。例えば、ウェスタンブロッティング法（特許文献１参照）、磁性ビーズによる標的細菌の回収（特許文献２参照）、プルダウンアッセイ法（特許文献３参照）、有機薄膜上への標的物質の回収（特許文献４参照）、ゲル電気泳動法（特許文献５参照）を質量分析前に実施している。
特開２００６－１２６０１３号公報 特表２００５－５２４３９４号公報 特開２００５－０９８８３０号公報 特開２００５－２９１８２３号公報 ＷＯ　２００４－０３１７５９号公報
　質量分析法は成分の識別検出に優れている反面、その成分の定量を行う場合には内部標準物質等の準備が必要となる。
　また、質量分析法の場合、成分をイオン化する必要があり、そのイオン化効率が定量精度を左右することから、内部標準物質の選定には細心の注意が必要となる。
　最も望ましいのは安定同位体標識した測定対象成分そのものであるが、その合成にはコストがかかるだけでなく、合成できない成分については安定同位体標識物を作製できない問題がある。
　このため、前述した免疫法の交差反応性を解消するとともに、質量分析法の成分定量の問題を解決できる装置及び方法が提供できると、今までにない高精度な臨床検査技術を実現することができる。
　本発明の目的は、免疫法の交差反応性を解消し、質量分析法の成分定量の問題を解決できる免疫分析方法及び免疫分析システムを実現することである。
　本発明は、上記目的を達成するため、次のように構成される。
　免疫分析方法及び免疫分析システムにおいて、免疫分析法による前処理により、試料溶液中の測定対象物を抗体を用いて捕捉し、捕捉した測定対象物から測定対象成分を回収し、回収した測定対象成分を質量分析法により、質量分析を行い、測定対象物の成分の分析を行う。
　好ましくは、免疫分析方法及び免疫分析システムにおいて、免疫分析法による前処理により、試料溶液中の測定対象物を抗体を用いて捕捉し、捕捉した測定対象物の定量を行い、測定対象物の定量を行った廃液から上記測定対象物を回収し、回収した測定対象物を質量分析法により、質量分析を行い、上記免疫法により行った測定対象物の成分を測定する。
　免疫法の交差反応性を解消し、質量分析法の成分定量の問題を解決できる免疫分析方法及び免疫分析システムを実現することができる。
本発明の実施例１における試料免役分析システム全体の概略構成図であり、測定の流れを示すための図である。 免役法の説明図である。 免役法の廃液処理の説明図である。 タクロリムスの交差反応性および薬効を示す図である。 患者検体における測定対象に関するデータを示す図である。 図１に示した試料免役分析システムの装置構成例を示す図である。 図１に示した試料免役分析システムの他の装置構成例を示す図である。 図１に示した試料免役分析システムのさらに他の装置構成例を示す図である。 図１に示した試料免役分析システムのさらに他の装置構成例を示す図である。 本発明の実施例２における試料免役分析システム全体の概略構成図であり、測定の流れを示すための図である。 免疫法向け前処理における応用の説明図である。 免疫法向け前処理産物からの測定対象成分回収の説明図である。 図１０に示した試料免役分析システムの装置構成例を示す図である。 図１０に示した試料免役分析システムの他の装置構成例を示す図である。 免疫反応処理および固相抽出処理フローである。 固相抽出処理に関わるシステム構成（上面図）である。 固相抽出処理に関わるシステム構成（側面図）である。 免疫反応処理および固相抽出処理のシーケンスである。
　以下、本発明の実施例について、添付図面を参照して詳細に説明する。
　本発明の実施例１について、免疫法による測光測定後の廃液を質量分析法による成分検出を行なう例について説明する。
　図１は、実施例１における免役分析システム１０２全体の概略構成図であり、測定の流れを示すための図である。
　患者血清等の試料１０１は、免疫法用前処理装置１０３により、前処理が施された後、免疫法用測光検出系１０４により測光される。続いて、質量分析法用前処理装置１０５により前処理が行われ、質量分析検出系１０６により、質量分析が行われる。これら試料免役分析システム１０２、免疫法用前処理装置１０３、免疫法用測光検出系１０４、質量分析法用前処理装置１０５、質量分析検出系１０６は、システム制御及びデータ処理用パーソナルコンピュータ１０７により動作制御され、分析結果１０８は、パーソナルコンピュータ１０７のディスプレイにより表示される。
　生体由来の試料（例えば、全血、血漿、血清、尿等）中の測定対象成分は、まず免疫自動分析法に従って免疫法用前処理装置１０３にて前処理され、免疫法用測光検出系１０４により、測定対象成分を特異的に認識する抗体により選択的に捕捉される。予め抗体は磁性粒子に対して、例えばアビジン－ビオチン結合等により結合した状態にしておく。図２に示すように、磁性体２１０の磁力により測定対象成分２０５について抗体２０２、２０３、２０４、２０６を介して捕捉した磁性粒子２０１を集め、周囲の夾雑物等を洗い流した後、標識した抗免疫グロブリン抗体によりサンドイッチアッセイを行うことで検出器２１１により測定対象成分の検出および定量を行う。
　この定量値には、測定対象成分だけでなく、例えばその成分に由来する代謝物をはじめとする構造類似物質等による交差反応性を含んだ値であるため、本来求めたい測定対象成分の定量真値よりも高い値を示す傾向がある。
　そこで、免疫法で捕捉した試料あるいは免疫法による測定後の廃液を再利用して、そのなかに含まれている交差反応性を示す物質等の成分内訳（相対比率）を質量分析法で求めることにより、免疫法で求めた定量値から捕捉された成分の定量値を真値に近い値で個別に算出する。
　質量分析法用前処理装置１０５において、免疫法で用いた試料（廃液）から、測定対象成分を回収する。例えば、免疫測定後の廃液を酸処理、アルカリ処理、イオン強度処理等により、抗原抗体反応を乖離させ、抗体から抗原（測定対象成分）を遊離させる。そして、図３に示すように、再び磁性粒子３０１の磁力で磁性ビーズを集め、上清を回収し、溶媒置換した後に質量分析検出系１０６に供給する。
　測定対象成分の性状により、必要に応じてサイズ分画等のクロマトグラフィー手法で上清中に含まれている成分を分離したり、酵素消化等により断片化しても構わない。
　そして質量分析検出系１０６において、上清中に含まれている成分を質量分析する。得られたクロマトグラムから成分ごとのシグナル強度やピーク面積を求め、その相対比率に基づいて免疫法で測定した定量値の内訳を成分ごとに算出する。そして、免疫法で算出した定量値に対して上記成分比率を掛け合わせて、成分毎の定量値を補正する。
　これにより、免疫法では交差反応性等の影響を受けていた測定対象成分の定量値について、真値に近い定量値が求められるとともに、交差反応性の要因となる構造類似物質の内訳も定量的に求めることができる。
　特に、構造類似物質の代表例に測定対象成分の代謝物が挙げられる。例えば、測定対象成分が治療薬の場合、測定対象薬剤とともにその代謝物の比率（プロファイル）や定量値を把握することは、投薬管理上重要であり、従来の免疫法では求められなかった代謝物の濃度を本発明により算出することが可能となる。
　例えば、免疫抑制剤の１種であるタクロリムスの場合、図４に示すように、代謝物としてＭ－Ｉ（１３－ｏ－ｄｅｍｅｔｈｙｌ型）、Ｍ－ＩＩ（３１－ｏ－ｄｅｍｅｔｈｙｌ型）、Ｍ－ＩＩＩ（１５－ｏ－ｄｅｍｅｔｈｙｌ型）、Ｍ－ＩＶ（１２－ｏ－ｈｙｄｒｏｘｙｌ型）、Ｍ－Ｖ（１５，３１－ｏ－ｄｉｄｅｍｅｔｈｙｌ型）、Ｍ－ＶＩ（１３，３１－ｏ－ｄｉｄｅｍｅｔｈｙｌ型）、Ｍ－VＩＩ、Ｍ－VＩＩＩが知られている（K. Iwasaki, Drug Metab. Pharmacokinet., 22(5), 328-335, 2007）。これら代謝物について、評価に用いたモノクローナル抗体によるエンザイムイムノアッセイ法における交差反応性は各々０％、１０９％、９０．５％、８．８％、９２．２％、０％、０％、０％であることから、例えば、この抗体を用いて臓器移植後の患者に投与したタクロリムスについて、血液中のタクロリムス濃度を免疫法により測定した場合、定量値にはタクロリムスだけでなくＭ－ＩＩ、Ｍ－ＩＩＩ、Ｍ－ＩＶ、Ｍ－Ｖの各代謝物も含んで測定している可能性がある。
　一方、Ｍ－Ｉ～ＶＩＩＩで示される８種類の代謝物の免疫抑制効果は、M－Ｉ、M－ＩＩ、Ｍ－ＩＶ、Ｍ－ＶＩ、Ｍ－ＶＩＩＩでも認められる。前述の交差反応性を加味すると、Ｍ－ＩＩおよびＭ－ＩＶは交差反応性および免疫抑制効果の両性質を有することが認められる。このことは、Iwasakiが実験に使用したモノクローナル抗体を用いてタクロリムスの免疫法による測定を行う場合、M―ＩＩおよびＭ－ＩＶの血中濃度を測定対象薬剤であるタクロリムスとともに把握することが投薬管理の上で必須となる。
　上記文献を引用し、タクロリムス、Ｍ－ＩＩ、Ｍ－ＩＶの各定量値を求めるモデルを示す（図５）。なお、このモデルにおける、免疫法による測定値（10ng/ml）およびMS測定したときの各成分のピーク面積相対比率（タクロリムス100%、Ｍ－ＩＩ20%、Ｍ－ＩＶ10%）は、原理説明のために仮設定したものとする。
　図５は、ＭＳ測定による捕捉成分の補正定量値算出までのプロセスを示す。患者検体中のタクロリムスを免疫法で定量したときの測定値が10ng/mlと仮定し、そのときのクロマトグラムからタクロリムスに相当するピーク面積を100%としたときのＭ－ＩＩおよびＭ－ＩＶに相当するピーク面積相対値が各々20%および10%と仮定したときの、タクロリムス、Ｍ－ＩＩ、Ｍ－ＩＶの濃度内訳の算出法について示す。この場合、免疫法で捕捉した３成分（タクロリムス、Ｍ－ＩＩ、Ｍ－ＩＶ）の内訳は、タクロリムスが76.9%、Ｍ－ＩＩが15.4%、Ｍ－ＩＶが7.7%となる。したがって、免疫法による定量値10ng/mlは、内訳比率で換算すると、タクロリムスが7.7ng/ml、Ｍ－ＩＩが1.5ng/ml、Ｍ－ＩＶが0.8ng/mlとなり、検体内のタクロリムス濃度は免疫法の測定値10ng/mlではなく、より正確には交差反応成分の推定値を除いた7.7ng/mlになることが示唆されることになる。
　このように、免疫法による測定値に基づいて、ＭＳ測定による捕捉成分の存在比率から捕捉成分ごとの定量値を算出することは、免疫法で問題となる交差反応性による複数成分の総和でしか測定できないことを解消できるだけでなく、ＭＳ法による定量測定で必要となる内部標準物質なしに、免疫法で捕捉された各成分の存在比率をMS測定で求めることによって、免疫法測定値の内訳を換算し、各成分ごとの定量値を求めることが可能となる。
　また、免疫法により捕捉された各成分の定量値を求めるだけでなく、各成分のプロファイル（存在比率のパターン）に基づいて、例えば患者の様態を基準となるプロファイル（例えば、平均的なその疾患特有のプロファイルやその患者の過去のプロファイル等）との乖離から、正常あるいは異常等の判断指標として応用することも可能である。
　このことは、測定対象物質だけでなく薬としての効果を有するような代謝物等を含めた血中濃度を識別して把握することは、より安全かつ効果的な投与設計を行う技術となる。
　例えば、本手法を自動処理するシステムにおいては、薬剤名、薬剤群あるいは疾患等を選択することで、必要な測定を行い、その情報を統合的に自動計算するソフトウェアの搭載が考えられる。
　図６は、図１に示した試料免役分析システム１０２の装置構成例を示す図である。
　図６に示した免疫法用前処理装置１０３において、検体ラック１０３３に収容された試料１０３２は、分注機構１０３１により、反応テーブル１０３５に配置された反応バイアル１０３４に分注される。また、免疫法用試薬カートリッジ１０３６に収容された試薬も、反応バイアル１０３４に分注される。反応バイアル１０３４は、反応バイアルラック１０３８から反応テーブル１０３５にバイアル移動機構１０３７により移動される。
　また、免疫法用測光検出系１０４において、免疫法用前処理装置１０３から供給されたサンプルは、マグネット１０４１を備えるセル１０４２を通過し、光源１０４３からの光が照射され、測光器１０４４により測光されて定量データが検出される。
　そして、免疫法用測光検出系１０４からの廃液が質量分析法用前処理装置１０５に供給される。
　質量分析法用前処理装置１０５において、免疫法用測光検出系１０４からの廃液は、分注機構１０４６により、分注された抗原遊離試薬と混合され、マグネット１０４５の作用により、遊離抗原溶液が得られ、バッファー置換試薬により、置換されたサンプルが、質量分析検出系１０６に供給される。
　質量分析系１０６は、イオン源１０６１と、質量分析部１０６２と真空ポンプ１０６３とを備える。そして、この質量分析検出系１０６により、質量分析され、スペクトルデータ１０８が得られる。
　図７は、図１に示した、免疫分析システム１０２の他の装置構成例を示す図である。
　図７に示した例は、図６に示した例と、免疫法用前処理装置１０３、質量分析法用前処理装置１０５及び質量分析検出系１０６の構成は同等であるが、免疫法用測光検出系１０４の構成が異なっている。
　図７に示した免疫法用測光検出系１０４は、反応テーブル１０３５に配置されたセル付き反応バイアル１０４７に近接してマグネット１０４８が配置され、光源１０４３からの光が、セル付き反応バイアル１０４７内の試薬及び試料に照射され、測光器１０４４で定量データが測定される。
　そして、免疫法用測光検出系１０４の廃液が質量分析法用前処理装置１０５に供給される。
　図８は、図１に示した、免疫分析システム１０２の、さらに他の装置構成例を示す図である。
　図８に示した例は、図６に示した例と、免疫法用前処理装置１０３及び質量分析検出系１０６の構成は同等であるが、免疫法用測光検出系１０４及び質量分析法用前処理装置１０５の構成が異なっている。
　図８に示した免疫法用測光検出系１０４において、免疫法用前処理装置１０３からの反応後の試料は、分注機構１０４６により、抗原遊離試薬と共にマグネット１０４１が配置されたセル１０４２に供給される。
　試料は、セル１０４２において、光源１０４３からの光が照射され、測光器１０４４により測光されて定量データが検出される。
　そして、免疫法用測光検出系１０４からの廃液が質量分析法用前処理装置１０５において、バッファー置換試薬により置換され、質量分析検出系１０６に供給される。
　図９は、図１に示した、免疫分析システム１０２の、さらに他の装置構成例を示す図である。
　図９に示した例は、図６に示した例と、質量分析検出系１０６の構成は同等であるが、免疫法用前処理装置１０３、免疫法用測光検出系１０４及び質量分析法用前処理装置１０５の構成が異なっている。
　図９に示した免疫法用前処理装置１０３、免疫法用測光検出系１０４及び質量分析法用前処理装置１０５において、検体ラック１０３３に保持された試料が分注機構１０３１により、反応テーブル１０３５に配置されたセル付き反応バイアル１０４７に分注される。反応バイアル１０４７には、免疫法用試薬カートリッジ１０３６の試薬も分注されている。反応バイアル１０４７は、反応バイアルラック１０３８からバイアル移動機構１０３７により反応テーブル１０３５に移動される。
　セル付き反応バイアル１０４７の近傍にはマグネット１０４８が配置され、光源１０４３からの光が反応バイアル１０４７内の試料に照射され、測光器１０４４により、定量データが得られる。
　反応テーブル１０３５には、置換用バイアルラック１０４９からバイアル移動機構１０３７により移動された置換用バイアル１０３９が配置されている。セル付き反応バイアル１０４７の試料には、抗原遊離試薬が供給され、遊離抗原溶液が反応バイアル１０４７から置換用バイアル１０３９に供給され、バッファー置換試薬により置換された溶液が、質量分析検出系１０６に供給される。
　図６～図９に示した試料免役分析システム１０２のいずれにおいても、上述した本発明の効果を得ることができる。
　次に、本発明の実施例２について説明する。
　本発明の実施例２は、免疫法による測光測定のための試料を質量分析法による成分検出に応用する事例である。免疫法による二次抗体を用いたサンドイッチアッセイではなく、一次抗体で捕捉した測定対象物質および交差反応性を示す代謝物等の類似構造物質を質量分析法で定量するものである。
　図１０は、本発明の実施例２における試料免役分析システム５０２全体の概略構成図であり、測定の流れを示すための図である。試料分析システム５０２全体の動作は、システム制御およびデータ処理用パーソナルコンピュータ５０６により制御される。
　図１０、図１１において、生体由来の試料５０１（例えば、全血、血漿、血清、尿等）中の測定対象成分は、まず免疫法前処理装置５０３により免疫自動分析法に従って前処理され、測定対象成分６０５を特異的に認識する抗体６０４により選択的に捕捉される。予め抗体６０４は磁性粒子に対して、例えば、アビジン－ビオチン結合（６０２－６０３）等により結合した状態にしておく。磁性体６０６の磁力により測定対象成分について抗体６０４を介して捕捉した磁性粒子６０１を集め、周囲の夾雑物等を洗い流す。
　捕捉した成分には、測定対象成分だけでなく、例えばその成分に由来する代謝物をはじめとする構造類似物質等による交差反応性を含んでいるため、抗体が本来認識すべき単一成分のみとは限らない。そこで、捕捉成分中の成分内訳（相対比率）を質量分析法で求める。
　図１２に示すように、質量分析法用前処理装置５０４にて、抗原抗体反応により捕捉した成分３０５を回収する。例えば、抗原抗体反応産物を酸処理、アルカリ処理、イオン強度処理等により、抗原抗体反応を乖離させ、抗体３０４から抗原（測定対象成分３０５）を遊離させる。再び磁力で磁性ビーズ３０１を集め、上清を回収し、溶媒置換した後に質量分析検出系５０５に供給する。
　測定対象成分の性状により、必要に応じてサイズ分画等のクロマトグラフィー手法で上清中に含まれている成分を分離したり、酵素消化等により断片化しても構わない。
　質量分析検出系５０５にて、上清中に含まれている成分を質量分析する。得られたクロマトグラムから成分ごとのシグナル強度やピーク面積を求め、その相対比率を求める。別途、内部標準物質を用い、成分ごとの定量値を算出しても構わない。
　このことは、測定対象物質だけでなく薬としての効果を有するような代謝物等を含めた血中濃度を識別して把握することは、より安全かつ効果的な投与設計を行う技術となる。
　例えば、本手法を自動処理するシステムにおいては、薬剤名、薬剤群あるいは疾患等を選択することで、必要な測定を行い、その情報を統合的に自動計算するソフトウェアの搭載が考えられる。
　図１３は、図１０に示した試料分析システム５０２の装置構成例を示す図である。
　図１３に示した免疫法用前処理装置５０３において、検体ラック５０３３に収容された試料５０３２は、分注機構５０３１により、反応テーブル５０３５に配置された反応バイアル５０３４に分注される。また、免疫法用試薬カートリッジ５０３６に収容された試薬も、反応バイアル５０３４に分注される。反応バイアル５０３４は、反応バイアルラック５０３８から反応テーブル５０３５にバイアル移動機構５０３７により移動される。
　また、質量分析法用前処理装置５０４において、免疫法用前処理装置５０３から供給された免疫反応後の溶液は、分注機構５０４６により、分注された抗原遊離試薬と混合され、マグネット５０４５の作用により、遊離抗原溶液が得られ、バッファー置換試薬により、置換されたサンプルが、質量分析検出系５０５に供給される。
　質量分析系５０５は、イオン源５０６１と、質量分析部５０６２と真空ポンプ５０６３とを備える。そして、この質量分析検出系５０５により、質量分析され、スペクトルデータ５０７が得られる。
　図１４は、図１０に示した、分析システム５０２の、さらに他の装置構成例を示す図である。
　図１４に示した免疫法用前処理装置５０３及び質量分析法用前処理装置５０４において、検体ラック５０３３に保持された試料が分注機構５０３１により、反応テーブル５０３５に配置された反応バイアル５０３４に分注される。反応バイアル５０３４には、免疫法用試薬カートリッジ５０３６の試薬も分注されている。反応バイアル５０３４は、反応バイアルラック５０３８からバイアル移動機構５０３７により反応テーブル５０３５に移動される。
　反応バイアル５０３４の近傍にはマグネット５０４８が配置される。反応テーブル５０３５には、置換用バイアルラック５０４９からバイアル移動機構５０３７により移動された置換用バイアル５０３９が配置されている。反応バイアル５０３４の試料には、抗原遊離試薬が供給され、遊離抗原溶液が反応バイアル５０３４から置換用バイアル５０３９に供給され、バッファー置換試薬により置換された溶液が、質量分析検出系５０５に供給される。
　例えば、免疫法で捕捉した成分を免疫法用試薬に用いられている捕捉器材（例えば磁気ビーズ）から遊離させた後、磁気ビーズをマグネットで捕捉したときの上清（反応溶液）を固相抽出処理することにより、測定対象成分のみを抽出しても構わない。
　固相抽出剤は、測定対象成分の物性に応じて選択する。例えば、測定対象成分と発光検出試薬の分子サイズ、疎水性、イオン性が異なる場合、各々サイズ分画、逆相分離、イオン交換分離等の抽出モードを応用することで、両者を分離回収することが可能となる。このような固相抽出処理を実施するために、必要に応じて上清（反応溶液）の組成、濃度、pH等の条件を変更しても構わない。
　免疫反応および固相抽出処理工程は、図１５に示した順序にしたがって行われる。
　この工程を自動処理するためには、例えばターンテーブル上の区画ごとに免疫反応および固相抽出を実施するための機構を配置することで可能となる（図１６）。以下に、免疫反応および固相抽出を同一ターンテーブル上で自動処理する場合の流れを説明する。
　図１５に免疫反応および固相抽出処理のフローを示す。免疫反応は、免疫試薬を用いた抗原抗体反応による検体中の測定対象成分の捕捉工程、夾雑成分の洗浄除去工程、免疫試薬からの測定対象成分の遊離工程で構成される。一方、固相抽出処理は、有機溶媒とH2Oを用いた固相抽出充填剤のコンディショニング工程、固相抽出充填剤への試料供試工程、固相抽出充填剤に非特異吸着した夾雑物の洗浄除去工程、固相抽出充填剤に特異的に吸着させたターゲット成分の溶出回収工程で構成される。得られた抽出物は、例えば質量分析装置等に供試することにより、それに含まれている成分の同定あるいは定量を行うことで臨床検査に用いることができる。
　同一ターンテーブル上で上記免疫反応および固相抽出処理を行う場合、免疫反応処理中に固相抽出剤のコンディショニング工程を並行して実施し、免疫反応を応用して得られた測定対象成分を粗精製した溶液（抗原抽出溶液）を得るタイミングと固相抽出剤のコンディショニング完了のタイミングを合わせる必要がある。例えば、図１８に示したように、最初のステップとして試料１の免疫反応処理の区画Ｓから始まった場合、免疫反応処理の区画Uに到達したと同時に固相抽出処理の区画Ａが開始し、免疫反応処理の区画Ｚに到達したときに得られる抗原抽出溶液を固相抽出処理の区画Ｆに添加することで、試料１の免疫反応は完了し、残りの固相抽出処理のみ引き続き実行される。
　試料２以降も同様に処理され、それらの開始のタイミングは、前の試料が区画Ｔに移行することで区画Ｓが空いている場合に実行される。
　したがって、区画Ｚから区画Ｆに抗原抽出液を移す場合には、同一の分注機構を兼用することが望ましい。
　固相抽出処理においては、試薬あるいは試料等を固相抽出剤に対して通液させるため、圧力印加を行う（固相抽出カートリッジ上流側の加圧処理あるいは下流側の陰圧処理で実施）。固相抽出剤を通過して排出される溶液は、最終工程の溶出回収工程で得られるもののみを回収して分析に供試するが、それ以外の各工程から排出される溶液はいずれも廃液として処置する。
　図１６に固相抽出カラムと回収デバイスが分離している個別型の固相抽出カートリッジを用いた場合の固相抽出処理を自動化するためのシステム構成の上面図の事例を示す。臨床検査等で求められる検体あるいは検査項目ごとに対応したランダム性を実現するため、例えば、免疫反応処理容器をターンテーブルの同心円周上に８区画配列し（区画Ｓ～Ｚに位置するカートリッジ保持部９７１～９７８に配置）、固相抽出カートリッジをターンテーブルの同心円周上に14区画配列し（区画Ａ～Ｎに位置するカートリッジ保持部９０１～９１４に配置）、図１５記載のフローおよび図１８記載のシーケンスにしたがって、免疫反応および固相抽出処理を構成する各工程を同円周上で並行して順次実施する仕組みになっている。以下に血中薬物濃度測定を事例にして具体的な操作手順を説明する。なお、システムには処理工程の状況を監視するためのモニタリング機構（９３８）を備え、システム全体の制御およびデータ解析等の演算はPC（９３７）で実施する。
　免疫反応処理は以下の手順で行われる。
　最初にターンテーブル上の区画Ｓに位置するカートリッジ保持部（９７１）に免疫反応容器を器材移動機構により搬送する。
　次に、ターンテーブル上の区画Ｔに位置するカートリッジ保持部（９７２）に移動し、免疫反応容器に検体が添加される。
　次に、ターンテーブル上の区画Uに位置するカートリッジ保持部（９７３）に移動し、免疫試薬が添加される。
　次に、ターンテーブル上の区画Ｖに位置するカートリッジ保持部（９７４）に移動し、容器内の検体と試薬が撹拌される。
　次に、ターンテーブル上の区画Ｗに位置するカートリッジ保持部（９７５）に移動し、検体中の抗原を捕捉した磁性ビーズをマグネットで集め、反応溶液を除去し、洗浄液により磁性ビーズ洗浄後、洗浄液を除去する。
　次に、ターンテーブル上の区画Xに位置するカートリッジ保持部（９７６）に移動し、抗原遊離液が添加される。
　次に、ターンテーブル上の区画Yに位置するカートリッジ保持部（９７７）に移動し、容器内の溶液が撹拌される。
　次に、ターンテーブル上の区画Ｚに位置するカートリッジ保持部（９７８）に移動し、磁性ビーズをマグネットで集め、遊離した抗原を有する溶液を回収し、区画Ｆに位置するコンディショニング済みの固相抽出剤に供試する。その際、必要に応じて抗原抽出溶液の組成（条件）を適宜調整しても構わない。また、使用済みの免疫反応容器を廃棄する。
　固相抽出処理は、免疫反応処理に並行して以下の手順で行われる。
　最初に、免疫反応処理が区画Uに到達したのと同期して、固相抽出カートリッジ移動機構（９４１）が固相抽出カートリッジストック機構（９３１）から1本の固相抽出カートリッジをターンテーブル（９２１）上の区画Ａに位置するカートリッジ保持部（９０１）に搬送する。この固相抽出カートリッジを便宜的にＣ１と仮称して以下を説明する。
　続いて、ターンテーブル（９２１）が時計回りに1区画分回転し、Ｃ１は区画Bに位置するカートリッジ保持部（９０２）に移動する。Ｃ１に対してコンディショニング用有機溶媒分注機構（９４２）が一定量の有機溶媒（例えば１００%メタノール）を分注する。
　続いて、ターンテーブル（９２１）が時計周りに1区画分回転し、Ｃ１は区画Cに位置するカートリッジ保持部（９０３）に移動する。Ｃ１に対して圧力付加機構（９４３）で加圧することにより、有機溶媒を固相抽出剤に通液させる。廃液はドレインあるいは廃液回収容器等で回収した後、廃棄する。
　続いて、ターンテーブル（９２１）が時計周りに1区画分回転し、Ｃ１は区画Dに位置するカートリッジ保持部（９０４）に移動する。Ｃ１に対してコンディショニング用Ｈ２Ｏ分注機構（９４２）が一定量のＨ２Ｏを分注する。
　続いて、ターンテーブル（９２１）が時計周りに1区画分回転し、Ｃ１は区画Ｅに位置するカートリッジ保持部（９０５）に移動する。Ｃ１に対して圧力付加機構（９４３）で加圧することにより、有機溶媒を固相抽出剤に通液させる。廃液はドレインあるいは廃液回収容器等で回収した後、廃棄する。
　続いて、ターンテーブル（９２１）が時計周りに1区画分回転し、Ｃ１は区画Ｆに位置するカートリッジ保持部（９０６）に移動する。Ｃ１に対して、区画Ｚで回収した抗原抽出溶液を供試する。
　続いて、ターンテーブル（９２１）が時計周りに1区画分回転し、Ｃ１は区画Ｇに位置するカートリッジ保持部（９０７）に移動する。Ｃ１に対して、内部標準物質分注機構（９４２）が内部標準物質配置機構（９３３）の内部標準物質分注位置に配置した内部標準物質容器から一定量の内部標準物質を採取して分注する。
　続いて、ターンテーブル（９２１）が時計周りに1区画分回転し、Ｃ１は区画Hに位置するカートリッジ保持部（９０８）に移動する。Ｃ１に対して撹拌機構（９４４）で検体と内部標準物質を撹拌する。
　続いて、ターンテーブル（９２１）が時計周りに1区画分回転し、Ｃ１は区画Ｉに位置するカートリッジ保持部（９０９）に移動する。Ｃ１に対して圧力付加機構（９４３）で加圧することにより、検体と内部標準物質の混合溶液を固相抽出剤に通液させる。廃液はドレインあるいは廃液回収容器等で回収した後、廃棄する。
　続いて、ターンテーブル（９２１）が時計周りに1区画分回転し、Ｃ１は区画Ｊに位置するカートリッジ保持部（９１０）に移動する。Ｃ１に対して洗浄液分注機構（９４２）が一定量の洗浄液を分注する。
　続いて、ターンテーブル（９２１）が時計周りに1区画分回転し、Ｃ１は区画Ｋに位置するカートリッジ保持部（９１１）に移動する。Ｃ１に対して圧力付加機構（９４３）で加圧することにより、洗浄液を固相抽出剤に通液させる。廃液はドレインあるいは廃液回収容器等で回収した後、廃棄する。
　続いて、ターンテーブル（９２１）が時計周りに1区画分回転し、Ｃ１は区画Ｌに位置するカートリッジ保持部（９１２）に移動する。Ｃ１に対して溶出液分注機構（９４２）が一定量の溶出液を分注する。
　続いて、ターンテーブル（９２１）が時計周りに1区画分回転し、Ｃ１は区画Ｍに位置するカートリッジ保持部（９１３）に移動する。Ｃ１に対して圧力付加機構（９４３）で加圧することにより、洗浄液を固相抽出剤に通液させる。図１７に区画Ｍにおけるシステム構成の側面図を示す。固相抽出カートリッジ（１００１）Ｃ１から排出された溶出液は、回収容器配置機構（９３４、１００６）上のＣ１排出口直下の位置に待機している回収容器（１００２）で回収する。また、質量分析工程に移行するために、溶出液を回収した回収容器（１００２）は回収容器設置機構（９３４、１００６）の所定の位置に移動した後、溶出液は質量分析装置（９３６、１００７）にオンラインあるいはオフライン方式により供試され、溶出液中の目的成分を分離しながら定量する。
　例えば、オフライン方式によるＭＳへのサンプル供試事例として、抽出物を分注機構が必要量吸液し、ＭＳのイオン源に直接的あるいは間接的（例えばフローインジェクション方式）に導入することが挙げられる。
　続いて、ターンテーブル（９２１）が時計周りに1区画分回転し、Ｃ１は区画Ｎに位置するカートリッジ保持部（９１４）に移動する。固相抽出カートリッジ移動機構（９４１）がターンテーブル（９２１）からＣ１を回収してカートリッジ廃棄部（９３５）に廃棄する。
　以上がターンテーブル上で行われる一連の作業であり、次にターンテーブル（９２１）が時計周りに1区画分回転すると、Ｃ１廃棄後の空のカートリッジ保持部は区画Ａ（９５１）に戻り、固相抽出処理が1処理分完了となる。
　固相抽出処理後の回収容器は、廃棄する代わりに回収アームによりターンテーブルから取り外されて、保存することも可能である。抽出物を再測定する場合には、保存している回収容器をターンテーブルの空いた区画に設置し、例えば回収容器がバーコード管理されている場合にはそれを自動認識し、その回収容器をＭＳにロードする位置に移動し、再測定を行う。
　保存中の回収容器は、必要に応じて抽出物の乾燥を避けるために回収容器上端に蓋をしても構わない。乾燥した場合であっても、溶媒で再溶解することで再測定を行うことができる。そのときの溶媒添加量は、例えば固相抽出時の抽出物の液面（あるいは容量）のモニタリング値から、測定に消費した容量を差し引いた値に制御する。
　例えば、前述においてＣ１が区画Ｂに位置するカートリッジ保持部（９０２）に移動した後の区画Ａに位置することになる空のカートリッジ保持部には、新たな固相抽出カートリッジ（１００１）としてＣ２（仮称）が投入され、Ｃ２により２検体目の処理がＣ１に続いて1区画（作業）遅れで開始される。３検体目以降も同様にＣ２に引き続いて処理されるため、ターンテーブル（９２１）上では区画数に相当する合計１４検体分の処理が順繰りに並行して行われることになる。再検査の場合も同様に処理される。
　図１３、図１４に示した試料分析システム５０２のいずれにおいても、上述した本発明の効果を得ることができる。
　本発明は、免疫法による測定データの高精度化に有効であり、基礎研究分野、医療、創薬、検査、診断等の各分野に幅広く適用することが可能である。
　本発明は、免疫法および質量分析法が抱えている問題点を相互補完することで解決し、より高精度の信頼性の高い臨床検査結果を提供することができる。
　すなわち、免疫法による測定対象成分の定量を行った際に、交差反応性によって生じる真値からの乖離を、質量分析法による定量成分内訳の相対比率を求めることにより補正する。このことにより、内訳を構成している成分ごとの定量値に換算することで、免疫法では得られない交差反応成分と測定対象成分の定量値を個別に求めることにある。
　また、合わせて各内訳成分の薬効に関する相対値に基づいて、例えば代謝物を含む正確な薬効を求めることもできる。免疫法の簡便かつ高速な測光定量と質量分析法による内訳成分の相対値算出の両方を活かすことにより、両測定手法のデメリット、すなわち免疫法の交差反応性および質量分析法の定量性能を相互補完し、今までにない簡便かつ高精度な臨床検査技術を実現することができる。
　１０１、５０１、１０３２・・・試料、　１０２、５０２・・・免役分析システム、　１０３、５０３・・・免疫法用前処理装置、　１０４・・・免疫法用測光検出系、　１０５、５０４・・・質量分析法用前処理装置、　１０６、５０５・・・質量分析検出系、　１０７、５０６・・・システム制御およびデータ処理用パーソナルコンピュータ、　１０３１、１０４６、５０３１、５０４６・・・分注機構、　１０３３、５０３３・・・検体ラック、　１０３４、５０３４・・・反応バイアル、　１０３５・・・反応テーブル、　１０３６、５０３６・・・免疫法用試薬カートリッジ、　１０３７、５０３７・・・バイアル移動機構、　１０３８、５０３８・・・反応バイアルラック、　１０３９、５０３９・・・置換用バイアル、　１０４１、１０４５、１０４８、５０４５、５０４８・・・マグネット、　１０４２・・・セル、　１０４３・・・光源、　１０４４・・・測光器、　１０４７・・・セル付き反応バイアル、　１０４９、５０４９・・・置換用バイアルラック、　１０６１、５０６１・・・イオン源、　１０６２、５０６２・・・質量分析部、　１０６３、５０６３・・・真空ポンプ

Claims (24)

  1. 　免疫分析法による前処理により、試料溶液中の測定対象物（１０１、５０１、１０３２）を抗体を用いて捕捉し、
    　捕捉した測定対象物（１０１、５０１、１０３２）の定量を行い、
    　測定対象物の定量を行った廃液から上記測定対象物（１０１、５０１、１０３２）を回収し、
    　回収した測定対象物を質量分析法により、質量分析を行い、上記免疫法により行った測定対象物の成分を測定することを特徴とする免疫分析方法。
  2. 　請求項１記載の免疫分析方法において、免疫分析法による前処理（１０３）により、試料溶液中の測定対象物を一次抗体（２０４）、二次抗体（２０６）及び磁性粒子（２０１）を用いて捕捉し、捕捉した測定対象物に光を照射して測定対象物の定量を行うことを特徴とする免疫分析方法。
  3. 　請求項２記載の免疫分析方法において、上記定量が行われた測定対象物の回収は、一次抗体（２０４）、二次抗体（２０６）及び磁性粒子（２０１）を用いて回収することを特徴とする免疫分析方法。
  4. 　請求項２記載の免疫分析方法において、上記質量分析法により、上記免疫法により行った測定対象物の成分比率を算出し、上記免疫法で算出した定量値に対して上記成分比率を掛け合わせることにより、成分毎の定量値を補正することを特徴とする免疫分析方法。
  5. 　請求項１記載の免疫分析方法において、上記測定対象物の定量を行った廃液から抗原抗体反応により抗原を捕捉し、捕捉した抗原を遊離化した後に回収し、回収した測定対象物を質量分析法により、質量分析を行うことを特徴とする免疫分析方法。
  6. 　免疫分析法による前処理（１０３）により、試料溶液中の測定対象物（１０１、５０１、１０３２）を抗体を用いて捕捉し、
    　捕捉した測定対象物から測定対象成分を回収し、
    　回収した測定対象成分を質量分析法により、質量分析を行い、測定対象物の成分の分析を行うことを特徴とする免疫分析方法。
  7. 　請求項６記載の免疫分析方法において、免疫分析法による前処理（１０３）により、試料溶液中の測定対象物を一次抗体（２０４）、二次抗体（２０６）及び磁性粒子（２０１）を用いて捕捉することを特徴とする免疫分析方法。
  8. 　請求項７記載の免疫分析方法において、上記測定対象物からの測定対象成分の回収は、一次抗体（２０４）、二次抗体（２０６）及び磁性粒子（２０１）を用いて回収することを特徴とする免疫分析方法。
  9. 　請求項７記載の免疫分析方法において、上記測定対象物から抗原抗体反応により抗原を捕捉し、捕捉した抗原を遊離化した後に回収し、回収した測定対象成分を質量分析法により、質量分析を行うことを特徴とする免疫分析方法。
  10. 　請求項９記載の免疫分析方法において、上記測定対象物から抗原抗体反応により抗原を捕捉し、捕捉した抗原を遊離化した後に回収する工程を固相抽出処理で行うことを特徴とする免疫分析方法。
  11. 　免疫分析システムにおいて、
    　免疫分析法による前処理により、試料溶液中の測定対象物を抗体を用いて捕捉する免疫法用前処理手段（１０３）と、
    　捕捉した測定対象物の定量を行う免疫法用検出手段（１０４）と、
    　測定対象物の定量を行った廃液から上記測定対象物を回収する質量分析法用前処理手段（１０５）と、
    　回収した測定対象物を質量分析法により、質量分析を行い、上記免疫法により行った測定対象物の成分を測定する質量分析手段（１０６）と、
    　を備えることを特徴とする免疫分析システム。
  12. 　請求項１１記載の免疫分析システムにおいて、上記免疫法用前処理手段（１０３）は、試料溶液中の測定対象物を一次抗体（２０４）、二次抗体（２０６）及び磁性粒子（２０１）を用いて捕捉し、上記免疫法用検出手段（１０４）は、捕捉した測定対象物に光を照射して測定対象物の定量を行うことを特徴とする免疫分析システム。
  13. 　請求項１２記載の免疫分析システムにおいて、上記質量分析法用前処理手段（１０５）は、測定対象物を、一次抗体（２０４）、二次抗体（２０６）及び磁性粒子（２０１）を用いて回収することを特徴とする免疫分析システム。
  14. 　請求項１２記載の免疫分析システムにおいて、上記質量分析手段（１０６）は、上記免疫法により行った測定対象物の成分比率を算出し、上記免疫法用検出手段（１０４）が算出した定量値に対して上記成分比率を掛け合わせることにより、成分毎の定量値を補正することを特徴とする免疫分析システム
  15. 　請求項１１記載の免疫分析システムにおいて、上記質量分析法用前処理手段（１０５）は上記免疫法用検出手段（１０４）が測定対象物の定量を行った廃液から抗原抗体反応により抗原を捕捉し、捕捉した抗原を遊離化した後に回収することを特徴とする免疫分析システム。
  16. 　免疫分析システムにおいて、
    　免疫分析法による前処理により、試料溶液中の測定対象物を抗体を用いて捕捉する免疫法用前処理手段（１０３）と、
    　捕捉した測定対象物から上記測定対象物を回収する質量分析法用前処理手段（１０５）と、
    　回収した測定対象物を質量分析法により、質量分析を行い、上記免疫法により行った測定対象物の成分を測定する質量分析手段（１０６）と、
    　を備えることを特徴とする免疫分析システム。
  17. 　請求項１６記載の免疫分析システムにおいて、上記免疫法用前処理手段（１０３）は、試料溶液中の測定対象物を一次抗体（２０４）、二次抗体（２０６）及び磁性粒子（２０１）を用いて捕捉することを特徴とする免疫分析システム。
  18. 　請求項１７記載の免疫分析システムにおいて、上記質量分析法用前処理手段（１０５）は、測定対象物を、一次抗体（２０４）、二次抗体（２０６）及び磁性粒子（２０１）を用いて回収することを特徴とする免疫分析システム。
  19. 　請求項１６記載の免疫分析システムにおいて、上記質量分析法用前処理手段（１０５）は上記測定対象物から抗原抗体反応により抗原を捕捉し、捕捉した抗原を遊離化した後に回収することを特徴とする免疫分析システム。
  20. [規則91に基づく訂正 11.06.2010]　
    請求項１９記載の免疫分析システムにおいて、上記測定対象物から抗原抗体反応により抗原を捕捉し、捕捉した抗原を遊離化した後に回収する工程を固相抽出処理で行うことを特徴とする免疫分析システム。
  21. 請求項２０記載の免疫分析システムにおいて、固相抽出処理を無限軌道上で自動処理することを特徴とする免疫分析システム。
  22. 請求項２０記載の免疫分析システムにおいて、目的が異なる複数の処理工程として、固相抽出処理および免疫反応処理を、同一の無限軌道上で並行して自動処理することを特徴とする免疫分析システム。
  23. 請求項２０記載の免疫分析システムにおいて、免疫反応により粗精製した抗原を遊離回収した溶液を得る工程と、その溶液をコンディショニング済みの固相抽出剤に供試することが同期することを特徴とする免疫分析システム。
  24. 請求項２０記載の免疫分析システムにおいて、免疫反応により粗精製した抗原を遊離回収した溶液を回収する分注機構と、その溶液をコンディショニング済みの固相抽出剤に供試する分注機構が同一であることを特徴とする免疫分析システム。
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