WO2010012127A1

WO2010012127A1 - 一种中药组合物在制备促进骨髓间质干细胞在体存活和成心肌分化的药物中的应用

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Publication number: WO2010012127A1
Application number: PCT/CN2008/001401
Authority: WO
Inventors: 杨跃进; 钱海燕
Original assignee: 河北以岭医药研究院有限公司
Priority date: 2008-07-29
Filing date: 2008-07-29
Publication date: 2010-02-04
Also published as: EP2324841A4; KR20110042314A; RU2011107255A; RU2475261C2; HUE038785T2; EP2324841B1; US20110135748A1; EP2324841A1

Description

一种中药组合物在制备促进骨髄间质干细胞在体存活和成心肌分化的药物中的应用技术领域

本发明涉及一种中药组合物的新用途，具体地，涉及一种中药组合物在制备促进骨髓间质干细胞在体存活和成心肌分化的药物中的应用。本发明还涉及具有促进骨髓间质干细胞在体存活和成心肌分化作用的中药组合物以及用所述中药组合物治疗或预防心血管疾病的方法。背景技术

心血管疾病每年夺走 1200万人的生命，接近世界人口总死亡的 1/4, 成为人类健康的头号大敌。对于心肌梗死或心力衰竭，传统的治疗方法，包括药物、介入和外科手术均不能使缺失的心肌细胞再生，由于心肌缺失造成不可逆转的心肌重塑过程，终至心力衰竭和死亡。近年来，干细胞再生医学在心血管疾病治疗中取得了突破性进展，该技术又被称为细胞心肌成形术（cellular cardiomyoplasty) , 即通过移植干细胞或心肌细胞，或者动员外周循环血干细胞或骨髓干细胞迁移到心肌受损部位来实现损伤心肌的修复。移植干细胞实施细胞心肌成形术是改善心肌梗死造成的血液动力学和神经体液紊乱的一种可行的方法。各种前期动物实验表明干细胞具有修复心肌细胞的能力，能改善梗死区的灌注和心功能 [Schuster MD, Kocher AA， Seki T， Martens TP, Xiang G, Homma S ， et al. Myocardial neovascularization by bone marrow angioblasts results in cardiomyocyte regeneration. Am J Physiol Heart Circ Physiol 2004; 287: H525 532. ( Schuster MD, Kocher AA, Seki T, Martens TP, Xiang G， Homma S等，骨髄成血管细胞引起的血管新生导致心肌细胞再生.美国生理杂志心脏和循环分册 2004; 287: H525 532. ) ]。尽管干细胞被用于心肌修复的临床研究，但由于缺血 /再灌注及炎性因子等的影响导致在局部缺血心脏的供体细胞死亡，因此细胞心肌成形术的发展因植入细胞存活率低而受到阻碍。研究表明大量细胞在移植入受损的心脏后死亡，其中绝大部分细胞在移植后 24小时内流失， 12周后仅剩下 15%存活 [Muller- Ehmsen J, Whittaker P, Kloner RA， Dow JS, Sakoda T, Long TI, et al. Survival and development of neonatal rat cardiomyocytes transplanted into adult myocardium. J Mol Cell Cardiol 2002; 34: 107 116. [PMID: 11851351] ( Muller- Ehmsen J, Whittaker P, Kloner RA, Dow JS, Sakoda T， Long TI，等.新生大鼠的心肌细胞移植入成年大鼠心肌后的生存和发育. 分子细胞心脏病学杂志， 2002; 34: 107 116. ) ]。

急性心肌梗死会导致严重的局部心肌缺血、炎症反应、氧化应激和凋亡，这将明显降低移植细胞的存活率。因此，保护局部移植的干细胞，减少或避免其死亡对临床应用具有重要意义。目前已有几种可以改善植入细胞存活率的方法：（1) 热休克疗法能改善移植细胞对体内缺血 /再濯注损伤的耐受性，提高植入心脏后的存活率 [Suzuki K, Smolenski RT, Jayakumar J, Murtuza B, Brand NJ, Yacoub MH. Heat shock treatment enhances graft cell survival in skeletal myoblast transplantation to the heart. - Circulat ion 2000; 102: III216 221. [PMID: 11082390]) ( Suzuki K, Smolenski RT, Jayakumar J, Murtuza B, Brand NJ, Yacoub MH.热休克疗法增强骨髓成肌细胞移植到心脏后的存活.循环. 2000; 102: III216 221. )]; (2) Akt修饰的骨髓间质干细胞可以进一步改善梗死心脏功能 [Mangi AA， Noiseux N, Kong D, He H, Rezvani M, Ingwal 1 JS, et al. Mesenchymal stem eel Is modified with Akt prevent remodeling and restore performance of inf arcted hearts. Nat Med 2003; 9: 1195 1201. [PMID: 12910262] (Mangi AA， Noiseux N, Kong D, He H， Rezvani M, Ingwall JS等， Akt修饰的间充质干细胞阻止梗死心脏重构和恢复心脏功能. 自然医学， 2003; 9: 1195 1201. ) ]; ( 3) 在局部缺血心肌注射质粒载体使亚铁血红素加氧酶 -1过度表达，减少单核细胞浸润的数量，下调炎症因子的表达 [Tang YL， Tang Y, Zhang C， Qian KP, Shen LP, Phillips I. Improved graft mesenchymal stem cell survival in ischemic heart with a hypoxia— regulated Heme Oxygenase-1 vector. J Am Coll Cardiol 2005; 46: 1339-1350. [PMID: 1619885]) ( Tang Y， Zhang C, Qian KP, Shen LP, Phillips I. 亚铁血红素加氧酶 -1过度表达的间充质干细胞移植到缺血心脏后生存改善. 美国心脏病学院杂志 2005; 46: 1339-1350. ) ]。但是，以上方法均建立在供体细胞水平的基础上，而决定移植细胞在心脏中的命运之关键是梗死局部心肌的微环境，因此针对梗死心肌微环境进行的干预可能更加有效的促进移植细胞的存活和发挥生物学效应。

本发明是在第 01131203.3号中国专利和第 200410048292.2号专利申请的基础上进行的改进发明，在此全文引用该两专利文件记载的内容。本发明提供了一种中药组合物在制备促进骨髓间质干细胞在体存活和成心肌分化的药物中的新应用，通过干预性治疗改善局部微环境的质量，进而有效促进植入细胞的存活和生物效应。发明内容

本发明目的是提供一种中药组合物在制备促进骨髓间质干细胞在体存活和成心肌分化的药物中的应用，所述中药组合物由如下重量份的原料药制成：

人参 3-10 水蛭 3-11 土鳖虫 5-10 乳香（制） 1-5 赤芍 3-9 降香 1-5 檀香 1-5 全蝎 3-9 蝉蜕 3-12 蜈蛤 1-3 水片 1-7 酸枣仁（炒） 3-10；优选地，该中药组合物由如下重量份的原料药制成：人参 6 水蛭 10 土鳖虫 7 乳香（制） 2 赤芍 5 降香 2 檀香 2 全蝎 7 7 蜈蚣 1 水片 5 酸枣仁（炒） 5;

或：

人参 10 水蛭 8 乳香（制） 2 赤芍 5 降香 2 檀香 2 全蝎 9 蜈蚣 1 水片 5 酸枣仁（炒） 5;

或：

人参 6 水蛭 11 土鳖虫 7 乳香 (制） 2 赤芍 5 降香 2 檀香 2 全蝎 3 % 7 蜈蚣 1 冰片 5 酸枣仁（炒） 5;

或：

人参 5. 5 水蛭 10. 375 土鳖虫 6. 875 乳香（制） 2. 25 赤芍 4. 75 降香 2. 375 檀香 2. 25 全蝎 6. 875

蝉蜕 6. 875 蜈蚣 1. 375 冰片 1, 375 酸枣仁（炒）

4. 625;

更优选地，上述中药组合物的活性成分由下列成分组成：

a 平均粒径小于 100 Wn的全蝎、水蛭、蜈蚣、土竖虫、蝉蜕及制乳香药粉；

b 水片药粉；

c 由降香和檀香提取的挥发油；

d 人参用乙醇提取后的醇提液经浓缩后的醇提浸骨；

e 提取成分 c后的降香和檀香药渣的水提液、赤芍和炒酸枣仁加水煎煮后的水提液以及提取成分 d后的人参药渣的水提液过滤、混匀后浓缩成的水提浸骨。

本发明还公开了含有上述中药组合物作为活性组分的药物制剂为胶嚢剂、片剂、丸剂、口服液、软胶囊或滴丸剂。本发明的另一目的是提供上述中药组合物在制备用自体骨髓间质干细胞治疗心血管疾病的药物中的应用，优选地，该心血管疾病为心肌梗塞，特别优选为急性心肌梗塞。

本发明的另一目的是提供促进骨髓间质干细胞在体存活和成心肌分化的上述中药组合物以及联用自体骨髓间质干细胞治疗心血管疾病的上述中药组合物，所述心血药疾病优选为心肌梗塞，更优选为急性心肌梗塞。

本发明中药组合物中，作为活性组分的原料药的拉丁名及其加工方法来自《中药大辞典》（ 1977年 7月，第一版，上海科学技术出版社）和《中国药典》（²005年版，化学工业出版社）。

本发明中药组合物还可以按常规的制剂工艺，例如，范碧亭《中药药剂学》（上海科学出版社 1997年 12月第 1版）记载的制备工艺，制成药剂学可接受的任意常规剂型，例如胶農剂、片剂、丸剂、口服液、软胶袭、滴丸等。

本发明制剂中，还可以含有任选的制剂领域常规的辅料，例如填充剂、崩解剂、粘合剂、助流剂、抗氧化剂、矫味剂、甜味剂、助悬剂等。所述辅料包括例如淀粉、蔗糖、乳糖、糊精、预胶化淀粉，交联聚乙烯吡咯烷酮等或中药药剂学可接受的其它辅料（范碧亭《中药药剂学》，上海科学出版社 1997年 12月第 1版中各剂型记载的辅料）。

本发明制剂优选通过以下制备方法制成：将上述配比的水蛭、全蝎、蝉蜕、土鳖虫、蜈蚣等五味药洗净，低温供干，备用；檀香、降香提取挥发油，药渣及水溶液备用；人参用 70%乙醇加热回流提取二次，第一次 3小时，第二次 2小时，合并提取液，回收乙醇至无醇味；人参药渣与檀香、降香的药渣以水溶液合并，加入赤芍、酸枣仁（炒），加水煎煮二次，第一次 3小时，第二次 2小时，合并煎液，滤过，滤液浓缩至相对密度为 1. 20- 1. 25 ( 60 ) 的清骨，加入上述人参醇提液，混匀，低温干燥，粉碎成细粉；乳香（制）与水蛭等五味共粉碎成细粉；水片研细，分别与上述细粉配研，混勾，喷入挥发油，混勾，装入胶袭，制成 1000粒，即得。

或者，本发明制剂优选通过以下制备方法制成：

a) 原料药的重量比为：人参 3-1 0份、水蛭 3-1 1份、土鳖虫 5-1 0 份、制乳香 1-5份、赤芍 3-9份、降香 1-5份、檀香 1-5份、全蝎 3- 9份、蝉蜕 3-12份、蜈蚣 1-3份、水片 1-7份、炒酸枣仁 3-1 0份；

b) 药材粉碎工艺：

将全蝎、水蛭、蜈蚣、土鳖虫和蝉蜕五种虫药经净选、水洗处理后和净选炮制后的制乳香按处方配料，由粉碎机进行粉碎，药粉细度达到 80目以上；粗粉后的药粉经各种超微粉碎技术进行超微粉碎，使药粉平均粒径小于 1 00 ; 待粉碎的药材经清洗烘干灭菌后，配料； c) 提取浓缩和干燥工艺：

降香和檀香先加水提取挥发油后再用水提取，赤芍和酸枣仁加水煎煮，水提液过滤后，待浓缩成浸骨；人参用乙醇提取后，再用水提取，醇提液回收乙醇后，浓缩成醇提浸骨，水提液过滤与所有的水提液混勾后浓缩成水提浸骨；

d) 制剂工艺：

在沸腾制粒干燥机中加入超微粉碎粉，再将步骤 c ) 所得提取浸膏喷入制粒；将制成的颗粒经整粒，加入冰片细粉，喷入由降香和檀香提取的挥发油，混勾后由胶囊充填机充填，制成胶嚢。

或者，本发明制剂优选通过以下制备方法制成：

a) 原料药的重量比为：人参 3- 1 0份、水蛭 3- 11份、土鳖虫 5-10 份、乳香（制） 1-5份、赤芍 3-9份、降香 1-5份、檀香 1-5份、全蝎 3-9 份、蝉蜕 3- 12份、蜈蚣 1-3份、水片 1-7份、炒酸枣仁 3- 1 0份；

b) 药材粉碎工艺：

将全蝎、水蛭、蜈蚣、土鳖虫和蝉蜕五种虫药经净选、水洗处理后和净选炮制后的制乳香按处方配料，由粉碎机进行粉碎，药粉细度达到 80目以上；粗粉后的药粉经各种超微粉碎技术进行超微粉碎，使药粉平均粒径小于 1 00 Wn; 待粉碎的药材经清洗烘干灭菌后，配料； c) 提取浓缩和干燥工艺：

降香和檀香先加水提取挥发油后再用水提取，赤芍和酸枣仁加水煎煮，水提液过滤后，待浓缩成浸骨；人参用乙醇提取后，再用水提取，醇提液回收乙醇后，浓缩成醇提浸骨，水提液过滤与所有的水提液混勾后浓缩成水提浸骨，将浸骨直接喷雾干燥成喷雾粉；

d) 制剂工艺：

将超微粉碎粉与步骤 c)所得喷雾干燥粉一起加到沸腾制粒干燥机中，再喷溶媒制成颗粒；将制成的颗粒经整粒，加入水片细粉，喷入由降香和檀香提取的挥发油，混勾后由胶囊充填机充填，制成胶囊。

本发明组合物的用量，按活性组分原料药总重量计，为每次 0. 8- 3 克，每日服用 2- 4次，优选为每次 1. 11-2. 22克，每日服用三次。

本发明提供大量试验研究数据表明，使用本发明药物组干预对运用自体骨髓间质干细胞进行细胞心肌成形术起到促进作用。微点阵探测梗塞后心脏的基因表达剖面发现单一使用低剂量本发明药物组可以使基因表达产生积极变化，包括对抗炎、抗凋亡、抗纤维化基因的增量调节，因此，认为使用本发明药物组干预能改善急性心肌梗塞后的局部微环境，从而显著提高植入的骨髓间质干细胞的存活和分化能力。进而，本发明提供的实验数据还证明，使用本发明药物组干预可以有效改善急性心肌梗塞后的局部内环境，对运用自体骨髓间质干细胞进行细胞心肌成形术起到促进作用，从而对骨髓间质干细胞的移植的临床应用具有重要意义。

本发明另一目的是用上述中药组合物治疗或预防心血管病症的方法，包括对需要的患者施用有效量的所述中药组合物。心血管疾病优选为心肌梗塞，更优选为急性心肌梗塞。可以采用本领域常规方法给药。附图说明

图 1 显微镜下四组实验动物梗死区的苏木素 -伊红（HE) 染色和马松（Masson， s ) 三色染色。图片显示，第一组（对照组）、第二组（单一使用低剂量本发明药物干预治疗）、第三组（单一进行骨髓间质干细胞移植干预治疗）均存在严重纤维化和炎性细胞浸润，梗死区基本没有心肌细胞存活；然而，第四组（同时使用骨髓间质干细胞移植和本发明药物干预治疗）梗死区纤维化和炎性细胞浸润较轻。图片 A放大倍数为 400 X , 图片 B放大倍数为 40 χ。

图 2 植入梗死心脏的骨髓间质干细胞的存活能力。图（A)显示，第三组（单一进行骨髓间质干细胞移植干预治疗）几乎观察不到 4'，6 二脒基 -2-苯吲哚盐酸（DAPI ) 标记的移植细胞；第四组（同时使用骨髓间质干细胞移植和本发明药物干预治疗）可以观察到较多 DAPI标记的移植细胞；图（B)显示，第三组（单一进行骨髓间质干细胞移植干预治疗）与第四组（同时使用骨髓间质干细胞移植和本发明药物干预治疗）的细胞存活能力存在显著统计学差异。 ·Ρ<0.0001，图（A) 的放大倍数为 400 X。

图 3 植入体内的骨髓间质干细胞分化为心肌细胞和血管结构。图 (A) 和图（B)显示，部分 DAPI标记的细胞表达 ot-横纹肌肌动蛋白、心脏肌钙蛋白 T; 图（C)显示，部分 DAPI标记的细胞参与血管生成，表达血管平滑肌肌动蛋白和血管内皮细胞特异性的因子覆。图（D) 显示，第三组（单一进行骨髓间质干细胞移植干预治疗）与第四组（同时使用骨髓间质干细胞移植和本发明药物干预治疗） DAPI标记的细胞在心脏中成心肌分化比率的统计学比较，两组植入细胞分化成心肌细胞的能力有显著差异。 'Ρ<0.0001，图（Α) 、图（B)和图（C) 的放大倍数为 400 χ。注：图中 MSCs为骨髄间充质干细胞， VWF为血管性假血友病因子， SM-actin为血管平滑肌肌动蛋白， Overlay表示前三张视野迭加的显色结果。

图 4 活体内植入细胞的细胞间连接蛋白的表达。图（A )显示， DAPI 标记的细胞表达缝隙连接蛋白 43 (Cx43)。图（B ) 显示，第三组（单一进行骨髓间质干细胞移植干预治疗）和第四组（同时使用骨髓间质干细胞移植和本发明药物干预治疗）的缝隙连接蛋白 43表达存在显著差异。 ' Ρ<0. 0001，图（ Α ) 的放大倍数为 400 χ。注：图中 Over lay表示前三张视野迭加的显色结果。

图 5 移植 6周后梗死区及梗死周边区的毛细血管密度。移植 6周后，第二组（单一使用低剂量本发明药物干预治疗）、第三组（单一进行骨髓间质干细胞移植干预治疗）与对照组梗死区及梗死周边区的毛细血管密度无显著差异（' Ρ>0. 05， ·· Ρ>0. 05) , 但均低于第四组（同时使用骨髓间质干细胞移植和本发明药物干预治疗）（分别为 ^# Ρ<0. 0001, " Ρ<0. 0001) ₀

图 6 用单光子发射计算机断层摄影（SPECT )检测移植一周后和移植六周后的心肌灌注缺损面积。图（Α )显示每组的 SPECT代表图形。图（Β )移植一周后初始的 SPECT结果显示四组间灌注缺损面积无显著差异（'Ρ=0. 984)。移植六周后，第四组（同时使用骨髓间质干细胞移植和本发明药物干预治疗）灌注缺损面积显著减少至 22. 1 ± 9. 3%，与对照组、第二组（单一使用低剂量本发明药物干预治疗）、第三组（单一进行骨髓间质干细胞移植干预治疗）相比有显著差异（η=7， ^#Ρ<0. 0001) .

图 7 本发明药物的抗凋亡作用。（Α) 猪心脏梗死周边心肌抗结合蛋白抗体和脱氧核苷酸转移酶介导的脱氧三磷酸尿苷（dUTP)缺口末端标记法（TUNEL )检测胞核内 DNA断裂的凋亡细胞。在考察终点，第 2组（单一使用低剂量本发明药物干预治疗）和第 4组（同时使用骨髓间质干细胞移植和本发明药物干预治疗）梗死周边有较少的凋亡胞核 (红箭头）。放大倍数： x 20. (B) 4组间凋亡指数统计。与对照组比较，第 2组（单一使用低剂量本发明药物干预治疗）凋亡心肌明显减少（'Ρ < 0. 0001)。而且第 4组（同时使用骨髓间质干细胞移植和本发明药物干预治疗）凋亡指数明显少于第 2组（单一使用低剂量本发明药物干预治疗）（^#Ρ < 0. 0001)。但是与对照组比较，第 3组（单一进行骨髓间质干细胞移植干预治疗）凋亡指数没有显著性差异 (·'Ρ=0. 289)。

图 8 实验终点梗死周边心肌氧化应激水平检测。（Α) 第 2组（单一使用低剂量本发明药物干预治疗）和第 4组（同时使用骨髓间质干细胞移植和本发明药物干预治疗）超氧化物歧化酶（SOD ) 活力较对照组显著升高 ΓΡ < 0, 05， ^#P < 0. 05)。但是第 3组（单一进行骨髓间质干细胞移植干预治疗）与对照组比较没有显著性差异（"P = 0. 449)。

(B)第 2组（单一使用低剂量本发明药物干预治疗）和第 4组（同时使用骨髓间质干细胞移植和本发明药物干预治疗）丙二醛（ MDA )含量较对照组显著减少（'Ρ < 0. 05, ^#Ρ < 0. 05)。第 3组（单一进行骨髓间质干细胞移植干预治疗）和对照组之间没有显著性差异（Ρ = 0. 195)。具体实施方式

实施例 1 : 本发明药物的制备

原料药配方为：

人参 55克水蛭 103. 75克土鳖虫 68. 75克乳香（制） 22. 5克赤芍 47. 5克降香 23. 75克檀香 22. 5克全蝎 68. 75克蝉蜕 68. 75克蜈蚣 13. 75克冰片 13. 75克酸枣仁（炒） 46. 25克；

b) 药材粉碎工艺：

将全蝎、水蛭、蜈蚣、土鳖虫和蝉蜕五种虫药经净选、水洗处理后和净选炮制后的制乳香按处方配料，由粉碎机进行粉碎，药粉细度达到 80目以上；粗粉后的药粉经各种超微粉碎技术进行超微粉碎，使药粉平均粒径小于 30-40 Mm;待粉碎的药材经清洗烘干灭菌后，配料； c) 提取浓缩和干燥工艺：

降香和檀香先加水提取挥发油后再用水提取，赤芍和酸枣仁加适量水煎煮二次，每次 3小时，合并水煎液，水提液过滤后，待浓缩成浸膏；人参用适量 70%的乙醇提取二次，每次 3小时，合并提取液，回收乙醇至无醇味，再用水提取，醇提液浓缩成相对密度为 0. 9 ~ 1. 1 (60 °C )醇提浸骨，水提液过滤与上述所有水提液混勾后浓缩至相对密度为 0. 9 ~ 1. 1 (60 ）的清骨，备用；

d) 制剂工艺：

在沸腾制粒干燥机中加入超微粉碎粉，再将步骤 c ) 所得提取浸膏喷入制粒；将制成的颗粒经整粒，加入冰片细粉，喷入由降香和檀香提取的挥发油，混匀后由胶 t充填机充填，制成 1 000粒胶袁。

本发明药物的用量，按活性组分原料药总重量计，为每次 2-4 粒，每日良用三次。实验例本发明药物在运用骨髓间质干细胞的促进作用

材料与方法

实验动物 1 0月龄的中华小型猪，体重（30 kg ± 5kg)，由中国农业大学实验动物中心提供。所有实验动物均受到人道对待，符合美国国立卫生研究院颁布的《实验动物管理和使用指南》。并且，所有实验方案均得到了中国医学科学院实验动物管理委员会和中国协和医科大学阜外心血管病医院实验动物伦理委员会的认可。

猪骨髓间质干细胞的分离和培养

肌肉注射氯胺酮和地西泮对猪进行麻醉，两种药物剂量分别为 25mg/kg和 lmg/kg。在无菌操作下对猪的左髂嵴处备皮、铺单，用含 12 , 500单位肝素的注射器抽取约 50ml骨髓。所有实验动物在送回饲养间之前均肌肉注射丁丙诺啡 0. 3mg止痛。骨髓间质干细胞的分离和培养按照以前报道的方法略作修改。简要的说，抽取的骨髓用磷酸盐緩沖液（PBS)稀释 1倍，加入硅石胶态悬浮液（Percol l分离液， 1. 077g/ml , S i gma公司），在 4 条件下， 800g 离心 30分钟分离出单个核细胞。细胞沉淀物用 PBS沖洗 2次，后以 5 χ 10⁵/cm²的密度铺于正常培养基 [含低葡萄糖 DMEM (G ibco公司）， 10%胎牛血清（Gibco) , 100U/ml青尊素和链霉素]上，置于 37 、含 5%二氧化碳的潮湿培养箱中培养。三天后，通过更换培养基去除造血细胞、成纤维细胞和其它非贴壁细胞。保留下的贴壁的纯化骨髓间质干细胞进一步培养增殖。实验过程中每三天更换一次培养基。经过 10天培养，贴壁细胞形成均一的细胞克隆。当贴壁细胞达到 80%融合后，加入 0. 25%胰酶 -0. 02% EDTA液（S igma)使其重新悬浮，以 1 : 3的比率传代进行进一步培养。

心肌梗塞模型，移植细胞的制备及本发明药物组的促进作用

28头中华小型猪平均分为 4组：第一组为对照组， n=7、第二组（单一使用低剂量本发明药物组干预治疗， n=7 ) 、第三组（单一进行骨髓间质干细胞移植干预治疗， n=7 )和第四组（同时使用骨髓间质干细胞移植和本发明药物组干预治疗， n=7 ) 。

在细胞达到 80%融合后，将其从培养瓶中分离，在含 10%胎牛血清的 DMEM ( GIBC0 ) 培养基中使其重新悬浮，用 4'， 6二脒基 -2-苯吲哚盐酸（DAPI) ( 50 M g/ml , S i gma)在条件下标记 30分钟。将细胞在 PBS液中洗涤 6次去除未结合的 DAPI , 然后每个实验动物选取 3 10^? 个细胞置于温暖的 DMEM中保存数分钟后进行移植。标记过程非常重要，需确保所有的移植细胞核着色。

肌肉注射氯胺酮和地西泮对猪进行麻醉，两种药物剂量分别是 25mg/kg和 lmg/kg，气管插管，连接机械呼吸机进行人工通气，通过血管内注射氯胺酮和地西泮维持麻醉。沿胸骨正中线开胸，分离冠状动脉左前降支（LAD)至第一对角支，并用塑胶套管结扎，确保局部缺血部位的形成。冠脉结扎前静脉注射利多卡因 2mg/kg , 后持续静脉内给药直至手术结束，持续剂量为 0. 5mg/min。阻塞冠状动脉左前降支 (LAD) 90分钟形成心肌梗死 /再灌注模型。

再灌注后 30分钟，在每个实验动物的梗死区及其周边区注入自体骨髓间质干细胞（ 3 X 10⁷个细胞）悬浮液 500 μ 1。对照组动物注入等体积的 DMEM液。

移植结束后，关闭胸腔，同时放置一个 18F纵隔导管以重建胸腔内负压并引流残留血液和灌洗液。此后，停止使用麻醉剂，在适当时候拔除气管插管使伤口愈合。在没有气体渗漏或残余血液的时候拔除胸部导管。所有实验动物术后均接受抗菌治疗，肌肉注射先锋霉素 V 1. 0，每天两次，连续三天；同时肌肉注射丁丙诺啡止痛，每天两次，每次 0. 3mg , 连用三天。

根据既往实验研究确定的剂量，从实施骨髓间质干细胞移植前三天至移植后四天喂养本发明药物进行干预治疗，使用剂量为 0. 05 g · kg · d。

核磁共振影像（MRI )

在细胞移植一周后和六周后分别采用电影 MRI和增强 MRI釆集实猃动物心功能参数。釆用临床使用的配有射频接收线圏的 1. 5T磁共振成像扫描机（西门子，德国（S iemens , Germany ) )进行核磁共振成像。肌肉注射氯胺酮和地西泮对实猃动物进行麻醉，剂量分别是 25mg/kg 和 lmg/kg。 MRI采用无线心电门控自旋回波。电影 MRI和相应的增强 MRI 每 4mm扫描一层，自二尖瓣水平开始，一共 6- 8层。测定横向和矢向视图以确定短轴的正确位面，每 60° 确定一个长轴的影像。联合使用全聚焦稳态快速梯度回波（ TrueFi sp )脉冲序列与敏感度编码（ TSENSE ) 平行成像技术获取电影 MRI影像。典型成像参数如下：循环时间（TR ) =41. 7 ms，回波时间 (TE) = 1. 39 ms，带宽 (BW) = 965 Hz/PX, 翻转角度（FA) = 48° ，影像矩阵 =109 X 192，空间分辨率 = 3. 2mm χ 2. 0 mm, 层厚（SL) = 6.0 mm, 平行因素 -3。采用 TSENSE成像技术的回波成像元件来获取 3-4短轴位的第一次流程灌注图像和一张四室图像（TR=6.0 ms, TE= 1.22 ms，FA= 30° ，空间分辨率 = 2.8mm 2.8mm, SL= 10. Omm, 平行因素 =2,每次心搏 4-5张图像，所有的层面均为一次饱和前脉冲）。第一轮扫描获取约 60个心动周期的图像。将 O. l mmol Gd- DTPA (先灵公司（Schering) )用20 mL 0.9% NaCl沖洗（流速 4mL/s)。灌注后静脉注射 0. lmmol/kg马根维显溶液， 5分钟后静脉注射 0.2mmol/kg 二亚乙基三胺五乙酸钆（Gd-DTPA) ，而后直接进行增强 MRI摄影。使用反转恢复（PSIR) 闪光序列完成 T1加权，运用 PSIR技术对 T1进行调整。典型图像参数如下： TR= 700ms， TE = 4.8ms, BW=130kHz, 平面分辨率 = 1.8 x 1.3mm, 图像矩阵 =156 χ 256， SL=8mm。移植干细胞后 6周再次拍摄所有电影 MRI和增强 MRI图像。根据解剖学定位使此次拍摄的短轴切片与第一次基线拍摄的相对应。另外，为提供健康对照， 5只假手术组动物采用相同的 MRI实猃设计进行研究。

单光子发射计算机断层摄影（SPECT)

为测定心肌灌注缺损面积 , 在细胞移植一周后与六周后对心肌进行单光子发射计算机断层摄影。静注 ⁹ 锝 -曱氧基异丁基异腈 296MBq(8mCi) , 45-60分钟后用 γ照相机进行心肌断层显像。采用低能耗双探头 γ照相机（法瑞克姆，通用公司（Varicum, GE ) ) , 配有 20%能量窗口的高分辨率准直器，置位于到 140KeV_Y峰值。每桢采集 40s、 32个影像，采集矩阵 64 x 64，投照范围从右前斜 45° —左后斜 45 ° , 共 180。。 SPECT重建釆用巴特渥斯（Butterworth) 低滤波，截止频率 0.45，类型为 5，通过对心脏轴进行调整，重建心脏短轴、垂直长轴、水平长轴三个轴面的图像数据。采用闪烁法的牛眼技术计算灌注缺损面积。

组织学分析

为检测移植的骨髓间质干细胞成心肌和血管分化潜力，对心肌冰冻组织切片进行荧光免疫分析，以 5μπι厚度连续切片。检测的抗体包括：血管内皮细胞特异性的因子 Vffl ( VWF 1: 50, DAK0) 、 c -血管平滑肌肌动蛋白（SM-actin， 1: 50， DA 0) o -横紋肌肌动蛋白（1: 50， DAK0)、心脏肌钙蛋白 T(cTn-T， 1: 50， Sigma)、缝隙连接蛋白 43 (1: 50, Sigma)。切片经 PBS漂洗后，用罗丹明或异硫氰酸荧光素标记的羊抗鼠或兔 IgG孵育。最后，在激光扫描共聚焦显微镜下观察拍照。

测定体内移植的骨髓间质干细胞的存活和分化能力，自心尖至心底将左心室横断切成 8片，每片随机选取 5张 5- μπι厚的冰冻切片。在荧光显微镜下，每张冰冻切片随机选取 5个视野进行观察并计数对 DAP I和 cTn- T呈阳性的细胞。对 cTn-T呈阳性的细胞被认为是分化的心肌样细胞。在梗死部位随机选取 5张切片测定缝隙连接蛋白 43的细胞间染色密度，并运用图像分析系统进行分析。

测定梗死区及梗死周边区的毛细血管密度，组织制备方法为

Weidner N, Semple JP, Welch WR, Folkman J. Tumor angiogenesis and metastasis -correlation in invasive breast carcinoma. N Engl J Med 1991; 324: 1 8. [PMID: 1701519] (Weidner N, Semple JP, Welch WR, Folkman ： Γ.侵入性乳腺癌中肿瘤血管发生和转移相关性.新格兰医学杂志， 1991; 324: 1 8. )所记载。用 VWF抗体（1: 200, DAK0)对切片进行染色。从每个试检动物的梗死区和梗塞周边区域分别选取 5张和 8张切片，由一名未参与细胞处理的研究人员进行分析，计数阳性染色的血管。从每张选取的切片中随机选取 5个高倍视野进行计数，结果用每个高倍视野下的毛细血管数目来表达。

脱氧核苷酸转移酶介导的脱氧三磷酸尿苷（dUTP)缺口末端标记法 ( TUNEL )检测细胞凋亡

我们用 TUNEL分析法（罗氏，德国）检测心肌组织中细胞凋亡情况，在实验终点时，获取所有动物梗死周边区域的心肌组织切片，石蜡切片用胰酶消化脱蜡，与末端脱氧核苷酸转移酶（TdT) 和荧光素标记的 dUTP 在 37 湿箱中孵育 60分钟。然后与氢化荧光素共轭的碱性磷酸酶特异性抗体孵育 30分钟， TUNEL染色用 3， 3 -二氨基联苯胺（DAB )显色，含有 DNA 断裂片断的胞核被染成蓝色。为了检测切片中凋亡胞核的比例，组织用心肌特异性的结蛋白（Desmin )单克隆抗体复染（1: 100， DAK0) , 组织切片在 400 倍显微镜下观察，最少在 8个高倍视野下计数 100个以上的心肌细胞，凋亡指数（apoptot i c index)为凋亡的心肌细胞占视野中心肌细胞总数的百分比。

抗氧化酶活性和脂质过氧化物

为了检测梗死心肌的氧化应激水平，我们在实验终点时获取梗死周边心肌组织，超氧化物歧化酶用黄嘌呤氧化法检测（南京建成公司），脂质过氧化物用硫代巴比妥酸法检测的心肌丙二醛水平表示（南京建成公司）。

统计分析

连续变量用均数士标准差表示，用卡方检验（ X ² ) 对第三组和第四组分化率的组间差异进行分析。对数据进行方差齐性检验和正态分布评估，而后进行方差分析，确定各组在各个分析阶段（移植后一周为基线检测，移植后六周为终点检测）存在的差异，以移植一周后数据为参照对移植六周后数据进行分析。用最小显著差异法（LSD )检验对两组间的多个参数进行对比。用巴夫罗尼（ Bonf e r ron i )法校正，当尸Ό. 05时，差异有显著意义。所有数据均使用 SPSS13. 0.进行统计分析。

结果

在所有参数成功收集以前，对照组、第二组、第三组中各有一只动物死亡，死亡动物数据未纳入统计分析。

组织学分析

细胞移植 6周后， HE染色显示，对照组梗死部位严重纤维化并出现慢性炎细胞浸润，心肌细胞存活艮少，第二组和第三组情况也同样如此。相比较而言，第四组纤维化和慢性炎细胞浸润现象较轻，同时梗死区有心肌细胞存活（图 1)。

观察发现，第四组 DAPI标记的阳性细胞明显多于第三组（³08.9士 88.2对 73.2士 21.3， AO.0001) (图 2A-B)。

移植六周后，第三组和第四组的免疫荧光分析显示 DAPI标记的阳性细胞表达心肌和微血管特有蛋白，包括 α -横纹肌肌动蛋白、心脏肌钙蛋白1\ 血管性假血友病因子和血管平滑肌肌动蛋白，表明部分植入的骨髓间质干细胞已经分化成心肌和微血管（图 3 A- C)。特别是第四组，其植入的骨髓间质干细胞分化为心肌细胞的效率显著高于第三组（45.8 ± 5.1% 对 8.7 ±2.4%， Ρ<0.0001) (图 3 D) 。

此外，通过检测缝隙连接蛋白 43的表达研究梗死区 DAPI标记的阳性细胞间的胞间连接。结果表明，第四组缝隙连接蛋白 43的表达显著多于第三组（16.1 ± 1.4 对 4.7 ± 1.8， P<0.0001) (图 4 A B)。

毛细血管密度

根据 VWF抗体的免疫组化染色测定梗死区及梗死周边区的毛细血管密度，对照组与第二组、第三组比较，梗死区毛细血管密度无显著差异（1.8 ± 0.5/HPF 对 2.0± 0.6 对 1· 8士 0.8， P> .05) , 然而，与第三组相比，第四组梗死区的毛细血管密度增加了 105% (3.7 土 1.0/HPF, ^0.0001)。第四组梗死周边区的毛细血管密度为 8.9士 1.9/HPF, 显著高于其它三组（4.9 ± 1.3/HPF， 5.1士 0.9， 5.2 ± 1.4, Ρ<ΰ, 0001) (图 5)。

核磁共振影像与单光子发射计算机断层摄影

每组共取 36个节段进行分析，计数运动障碍节段以分析室壁增厚率。移植一周后，对照组、第二组、第三组、第四组的 36个节段中运动障碍节段分别为 8.2士 3.0、 8.3士 3.1、 8.7士 3.9、 8.9 ± 3.6, 分别占各组总数的 22.8%、 23.1%、 24.2%与 24.7%，各组间无显著差异 00.983)。所有的运动障碍节段被用来计量局部的室壁增厚率。移植一周后，其它参数，包括局部室壁增厚率（ *=(). 91 5)、左心室射血分数（LVEF, O. 996)、梗死面积（ =0. 991)、左室舒张末期容积（EDV, «=0. 852)、左室收缩末期容积（ESV, ^0. 990) , 左室质量指数（LVma s s i ndex, P=0. 791) , 在 4组间比较无显著差异。移植 6周后，与对照组相比，第四组的心功能各项参数除 EDV和 ESV外均有显著改善 (尸 < 0. 0001)。各组左室功能及心室几何结构的改变见表 1。表 1 移植一周后与六周后左室功能和结构的 MRI结果

1 2 3 4

分组基线 4*.占、、基线 -'ί <占·、、基线占基线占左室射血 42. 6 43. 9 ± 43. 3 44. 8 43. 5 45. 7 土 42. 7 ± 50. 0 士分数 (%) 土 7. 6 土土土 9. 6# 7. 6* 10. 1##

7. 9 7. 9 8. 5 10. 0

EDV 57. 8 66. 2 土 58. 2 65. 8 56. 8 63. 5 ± 55. 1 士 64. 6 士

(ml) ± 5. 8 6. 8 土士土 6. 9 6. 3 # 8. 2 * 7. 5 * *

5. 8 5. 6

ESV 33. 5 37. 3 士 33. 3 36. 7 32. 7 35. 0 士 32. 1 士 32. 8 士

(ml) 土 7. 5 土土 ± 9. 6 9. 5 # 9. 2 * 10. 1 **

7. 6 7. 7 8. 3

运动障 8. 2 土 7. 7 士 8. 3 土 7. 5 士 8. 7 土 7. 8 士 8. 9 ± 4. 9 土碍节段 3. 0 2. 4 3. 0 2. 3 3. 9 3. 4 # 3. 6 * 1. 8 Μ 室壁 -25. 5 -27. 5 -27. 2 -25. 7 -23. 0 -20. 2 -25. 9 35. 9 土厚度 (%) 土士 15. 7 士士士土士 10. 8

17. 2 15. 6 14. 0 14. 5 12. 8 # 14. 1 * 梗塞面 6. 6 土 6. 7 土 7. 0 土 7. 1 士 6. 8 士 7. 0 ± 6. 5 土 3. 3 士积 (cm ) 2. 0 2. 1 2. 2 2. 3 2. 1 2. 1 # 2. 3 * 1. 8 左心室 64. 7 77. 8 ± 63. 2 76. 2 60. 2 76. 0 土 60. 8 ± 66. 4 ± 质量指数土 8. 1 土土 ± 7. 9 5. 4 # 8. 4 * 8. 1 ##

(g/ 6. 3 8. 1 8. 1 基线表示移植一周后；终点表示移植六周后； LVEF表示左室射血分数； EDV 表示左室舒张末期容积； ESV表示左室收缩末期容积；运动障碍节段 ( Dysk ine t i c segment s ) ；室壁增厚率（Wa l l thi ckening)；梗死面积 (Infarct size) ) ；左心室质量指数（ LV mass indes ) ； ·Ρ>0.05 (移植一周后四组间比较）； *Ρ>0.05(移植六周后对照组与第二组间比较）； '·Ρ>0· 05(移植六周后第二组、第三組的舒张末期容积和收缩末期容积与对照组比较）； " Ρ<0.0001 (移植六周后第二组、第三组与对照组间比较）图 6包含了移植一周后和移植六周后用来检测港注缺损面积的典型的 SPECT图像。最初的移植一周后的 SPECT结果显示四组间无显著差异（分别为 50.7 ± 14.5%对 52.7 ± 15.5%对 51.8 ± 16.5%对 49.4士 16.0% ^0.984)。移植 6周后，实验终点 SPECT显示对照组、第二组、第三组的平均灌注缺损面积分别变为 47.8 ± 11.1%、 50.7土 12.5%、 47.3土 13.2%(n=6, ^=0.899) , 而第四组的平均灌注缺损面积为 22.1 ± 9.3%, 较前三组显著减少（n=7， AO.0001) 。

梗死心肌周围细胞凋亡

通过对肌细胞特异标记物结合蛋白和 DNA末端标记相伴染色，与对照组比较本发明药物组，包括第 2组和第 4组，梗死左心室凋亡细胞显著减少，（凋亡指数 6.1 士 1.4， 2.4 士 0.9 对 10.1 士 1.8， P< 0.0001) , 而且第 4组的凋亡指数也显著少于第 2组（户< 0.0001) 。然而第 3组的凋亡指数与对照组比较无显著性差异 00.289) (图 7) 氧化应激水平的评估

在实验终点，第 2组和第 4组梗死周边心肌 SOD活性显著高于对照组，（98.7 ± 9.8， 105.1 士 7.0 对 83.4 士 8.8 U/mg 蛋白， P 0.05) , 表明本发明药物组用药能增强自由基清除能力，然而第 3组和对照组之间无显著性差异（87.4 ± 10.2 U/mg 蛋白， = 0.449) . 与之对应的是，第 2组和第 4组梗死心肌 MDA含量较对照组明显减少（6.1 士 0.7， 6.0 ± 0.6对 9.0 士 0.8 nmol/mg蛋白， P 0.05)，提示本发明药物组能显著减轻脂质过氧化及其引起的细胞损害，对照组与第 3组之间没有显著性差异（8.5 士 0.8 nmol/mg 蛋白，户 = 0.195) (图 8) .

讨论

本试验研究表明：（1 ) 急性心肌梗死 /再灌注后立即心肌内注射自体骨髓间质干细胞，移植细胞在活体内存活、分化能力有限，未对梗死后心脏产生显著的功能学获益；（2 )短期内单一使用低剂量本发明药物也不会对梗死后心脏产生显著的功能学获益，然而，在使用本发明药物组的基础上，急性心肌梗死 /再漼注后立即心肌内注射骨髓间质干细胞，移植细胞在活体内的生存和分化能力较单纯移植组显著增强，同时本发明药物和干细胞移植联合还能减少梗死面积、促进血管生成、改善心肌功能、逆转心室重构。

本实验最重要的发现是：在短期内使用低剂量本发明药物组干预的基础上，急性心肌梗死及再濯注后立即心肌内注射骨髓间质干细胞，植入细胞在活体内的生存和分化能力较单一植入的骨髓间质干细胞显著增强，同时对改善心功能具有显著作用。这表明，干细胞的移植、存活和分化对急性心肌梗死后的心肌微环境有很强的依赖性。

本实验表明，与单纯移植骨髄间质干细胞组相比，联合使用本发明药物和骨髓间质干细胞移植组植入细胞的存活和分化显著提高，此外，单纯使用低剂量本发明药物组未显著改善心功能。基于上述实验结果，我们可以推断，本发明药物组对急性心肌梗死后局部微环境的改善提高了植入细胞的存活率和生物活性。尽管单纯使用低剂量本发明药物本身不会产生明显的疗效，但它能显著提高植入的骨髓间质干细胞的存活和分化能力。本实验结果表明，短期内使用低剂量本发明药物组干预对运用自体骨髓间质干细胞进行细胞心肌成形术起到促进作用。微阵列基因芯片技术探测梗死后心脏的基因表达谱发现单一使用低剂量本发明药物组可以使基因表达产生积极变化，包括对抗炎、抗凋亡、抗纤维化基因的上调（数据未显示）。基于以上研究，我们认为短期内使用低剂量本发明药物能改善急性心肌梗死后的局部微环境，从而使植入的骨髓间质干细胞稳定存活和分化。

综上所述，我们首次发现短期内使用低剂量本发明药物可以有效改善急性心肌梗死后的局部微环境，对运用自体骨髓间质干细胞进行细胞心肌成形术起到促进作用，对骨髓间质干细胞的移植的临床应用具有重要意义。

Claims

权利要求

1. 一种中药组合物在制备促进骨髓间质干细胞在体存活和成心肌分化的药物中的应用，其特征在于所述中药组合物由如下重量份的原料药制成：

人参 3-10 水蛭 3-11 土鳖虫 5-10 乳香（制） 1-5 赤芍 3-9 降香 1-5 檀香 1-5 全蝎 3-9 蝉蜕 3-12 蜈蚣 1-3 水片 1-7 酸枣仁（炒） 3-10。

2. 如权利要求 1所述的应用，其特征在于所述中药组合物由如下重量份的原料药制成：

人参 6 水蛭 10 土鳖虫 7 乳香（制） 2 赤芍 5 降香 2 檀香 2 全蝎 7 蝉蜕 7 蜈蚣 1 冰片 5 酸枣仁 (炒） 5。

3. 如权利要求 1所述的应用，其特征在于所述中药组合物由如下重量份的原料药制成：

人参 10 水蛭 8 土鳖虫 7 乳香（制） 2 赤芍 5 降香 2 檀香 2 全蝎 9 蝉蜕 7 蜈蚣 1 水片 5 酸枣仁 (炒） 5。

4. 如权利要求 1所述的应用，其特征在于所述中药组合物由如下重量份的原料药制成：

人参 6 水蛭 11 土鳖虫 7 乳香（制） 2 赤芍 5 降香 2 檀香 2 全蝎 3 蝉蜕 7 蜈蚣 1 水片 5 酸枣仁 (炒） 5。

5. 如权利要求 1所述的应用，其特征在于所述中药组合物由如下重量份的原料药制成：

人参 5. 5 水蛭 10. 375 土鳖虫 6. 875 乳香（制） 2. 25 赤芍 4. 75 降香 2. 375 檀香 2. 25 全蝎 6. 875 蝉蜕 6. 875 蜈蚣 1. 375 水片 1. 375 酸枣仁（炒） 4. 625。

6. 如权利要求 1-5中任一项所述的应用，其特征在于所述中药组合物的活性成分由下列成分组成：

a 平均粒径小于 100 μπι的全蝎、水蛭、蜈蚣、土鳖虫、蝉蜕及制乳香药粉；

b 冰片药粉；

c 由降香和檀香提取的挥发油；

d 人参用乙醇提取后的醇提液经浓缩后的醇提浸骨；

7. 一种中药组合物在制备促进骨髓间质干细胞在体存活和成心肌分化的药物中的应用，其特征在于含有权利要求 1 - 6中任一项中药组合物作为活性组分的药物制剂为胶嚢剂、片剂、丸剂、口服液、软胶嚢剂或滴丸剂。

8. 如权利要求 1-7中任一项所述的应用，其特征在于所述中药组合物在制备用自体骨髓间质干细胞治疗心血管疾病的药物中的应用。

9. 如权利要求 8所述的应用，其特征在于，所述心血管疾病为心肌梗塞。

1 0. 如权利要求 8所述的应用，其特征在于，所述心血管疾病为急性心肌梗塞。

1 1. 具有促进骨髓间质干细胞在体存活和成心肌分化作用的权利要求 1-7任一项中所述的中药组合物。

12. 用于同自体骨髓间质干细胞联合治疗心血管疾病的权利要求 1-7任一项中所述的中药组合物。

1 3. 权利要求 12所述的中药组合物，其中所述心血管疾病为心肌梗塞，优选急性心肌梗塞。

14. 一种治疗或预防心血管疾病的方法，包括对需要的患者施用权利要求 1-7任一项中所述的中药组合物和骨髄间质干细胞。

1 5. 权利要求 1 3的方法，其中所述心血管疾病为心肌梗塞，优选急性心肌梗塞。

16. 权利要求 14的方法，其中所述骨髓间质干细胞为自体骨髓间质干细胞。