CN103845441B - 一种治疗冠心病的中药组合物制剂指纹图谱测定方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种治疗冠心病的中药组合物制剂指纹图谱测定方法，该方法采用超高压液相色谱法测定该中药组合物制剂的指纹图谱，该方法符合药物制剂质量控制的要求，可有效控制该中药组合物制剂的质量。

Description

一种治疗冠心病的中药组合物制剂指纹图谱测定方法

技术领域

本发明涉及到一种治疗冠心病的中药组合物制剂指纹图谱测定方法，属于中药制药领域。

背景技术

超高效液相色谱（UPLC）是分离科学中的一个全新类别，UPLC借助于HPLC（高效液相色法）的理论及原理，涵盖了小颗粒填料、非常低系统体积及快速检测手段等全新技术，增加了分析的通量、灵敏度及色谱峰容量。UPLC的速度、灵敏度及分离度分别是HPLC的9倍、3倍及1.7倍，它缩短了分析时间，同时减少了溶剂用量降低了分析成本。

超高效液相色谱仪尤其对中药研究领域的发展是一个极大的促进。中药的组分复杂，分离困难等问题都可以通过超高效液相色谱法逐渐解决。在同样条件下，UPLC能分离的色谱峰比HPLC多出一倍还多。在同样条件下，UPLC的分辨率能够认出更多的色谱峰。中药指纹图谱是指中药经适当处理后，采用一定的分析手段，得到的能够标示该中药材特性的共有峰的图谱。指纹图谱应该具备指纹性，即：（1）专属性强。指所制订的指纹图谱应该是该中药所独有的、能与其它中药相区别的，其反映的化学信息是具有高度的选择性的；（2）稳定性好。即中药的指纹图谱应该是从某中药的多批次中归纳出的共性，图谱中的共有峰或特征峰应相对稳定；（3）重现性好。所制订的指纹图谱在规定条件下应能再现指纹特征（如共有峰数目、大小、位置等），其误差应在允许的范围内。只有这样，所制订的指纹图谱才具有实用价值，才可以有效控制药品的质量。采用UPLC 指纹图谱方法控制药品质量具有灵敏、快速、简便、准确等特点，通过优选色谱条件测定药品制剂的指纹图谱，可以很好控制药品质量。

发明内容

本发明的目的是提供一种治疗冠心病的中药组合物制剂指纹图谱测定方法

该中药组合物由如下重量份的原料药制成：人参3-10、水蛭3-11、土鳖虫5-10 、乳香1-5 、赤芍3-9 、降香1-5、檀香1-5、全蝎3-9、蝉蜕3-12、蜈蚣1-3、冰片1-7、酸枣仁 3-10，指纹图谱测定方法的参数为：色谱条件：色谱柱为C₁₈柱，柱温20-50℃，流速0.2-0.8 ml/min，检测波长201-205nm，流动相B为乙腈，A为0.2%磷酸；梯度洗脱：0～2min，1%B；2～3min，1%～9%B；3～5min，9%～13%B；5～20min，13%～36%B；20～23min，36%～60%B；23～35min，60%～100%B；35～36min，100%B；

供试品溶液的配制： 称该中药组合物0.05-0.5 g ，加入50-80%的甲醇 1-20.0ml超声提取 30-120 min 滤过，即得；

测定法：精密吸取供试品溶液各0.1-1.5μl，注入超高压液相色谱仪，记录色谱图，即得。

指纹图谱测定方法的参数优选为：色谱柱为Waters ACQUIT UPLC BEH C₁₈；规格为100 mm×2.1 mm,1.7 μm；流速：0.45 ml/min；柱温：30℃；检测波长为 203 nm；

供试品溶液的配制：称取该中药组合物0.15 g 置 10 ml离心管中，加入70%的甲醇 5.0 ml 密封超声提取 60 min 后以 4500 r/min 离心 20 min，用 0.20 μm 滤膜滤过，即得；

测定法：精密吸取供试品溶液和对照品溶液各0.4μl，注入超高压液相色谱仪，记录色谱图，即得。

本发明治疗冠心病的中药组合物制剂的指纹图谱测定方法中，适用的中药组合物制剂原料药的重量比例优选为：

人参 6 、 水蛭 10 、 土鳖虫 7 、 乳香 2 、 赤芍 5 、 降香 2 、

檀香 2 、 全蝎 7 、 蝉蜕 7 、 蜈蚣 1 、 冰片 5、 酸枣仁5。

本发明治疗冠心病的中药组合物制剂的指纹图谱测定方法中，适用的中药组合物制剂原料药的重量比还例优选为：

人参 10 、 水蛭 8 、 土鳖虫 7、 乳香 2 、 赤芍 5、 降香 2、

檀香 2 、 全蝎 9 、 蝉蜕 7 、 蜈蚣 1 、 冰片 5 、 酸枣仁5。

本发明治疗冠心病的中药组合物制剂的指纹图谱测定方法中，适用的中药组合物制剂原料药的重量比还例优选为：

人参 6、 水蛭 11 、 土鳖虫 7、 乳香 2 、 赤芍 5、 降香 2、

檀香 2、 全蝎 3 、 蝉蜕 7 、 蜈蚣 1 、 冰片 5 、 酸枣仁5。

本发明治疗冠心病的中药组合物制剂的指纹图谱测定方法中，该中药组合物制剂的活性成分可由下列步骤制成：

a 平均粒径小于100 µm的全蝎、水蛭、蜈蚣、土鳖虫、蝉蜕及乳香药粉;

b 冰片药粉;

c 由降香和檀香提取的挥发油;

d 人参用乙醇提取后的醇提液经浓缩后的醇提浸膏;

e 提取成分c后的降香和檀香药渣的水提液、赤芍和酸枣仁加水煎煮后的水提液以及提取成分d后的人参药渣的水提液过滤、混匀后浓缩成的水提浸膏。

本发明治疗冠心病的中药组合物制剂的指纹图谱测定方法中，适用该中药组合物制剂的剂型优选为片剂、胶囊剂、或丸剂。

本发明治疗冠心病的中药组合物制剂的指纹图谱测定方法中，该中药组合物胶囊剂由以下步骤制作成：

a)按照重量份比例称取各原料药；

b)药材粉碎工艺：

将全蝎、水蛭、蜈蚣、土鳖虫和蝉蜕五种虫药经净选、水洗处理后和净选炮制后的制乳香按处方配料，由粉碎机进行粉碎，药粉细度达到80目以上；粗粉后的药粉经各种超微粉碎技术进行超微粉碎，使药粉平均粒径小于100 µm；待粉碎的药材经清洗烘干灭菌后，配料；

c)提取浓缩和干燥工艺：

降香和檀香先加水提取挥发油后再用水提取，赤芍和酸枣仁加水煎煮，水提液过滤后，待浓缩成浸膏；人参用乙醇提取后，再用水提取，醇提液回收乙醇后，浓缩成醇提浸膏，水提液过滤与所有的水提液混匀后浓缩成水提浸膏；

d)制剂工艺：

在沸腾制粒干燥机中加入步骤b)的超微粉碎粉，再将步骤c）所得提取浸膏喷入制粒；将制成的颗粒经整粒，加入冰片细粉，喷入由降香和檀香提取的挥发油，混匀后由胶囊充填机充填，制成胶囊。

本发明治疗冠心病的中药组合物制剂的指纹图谱测定方法中，该中药组合物胶囊剂还可以由以下步骤制作成：

a)按照重量份比例称取各原料药；

b)药材粉碎工艺：

将全蝎、水蛭、蜈蚣、土鳖虫和蝉蜕五种虫药经净选、水洗处理后和净选炮制后的制乳香按处方配料，由粉碎机进行粉碎，药粉细度达到80目以上；粗粉后的药粉经各种超微粉碎技术进行超微粉碎，使药粉平均粒径小于100 µm；待粉碎的药材经清洗烘干灭菌后，配料；

c)提取浓缩和干燥工艺：

降香和檀香先加水提取挥发油后再用水提取，赤芍和酸枣仁加水煎煮，水提液过滤后，待浓缩成浸膏；人参用乙醇提取后，再用水提取，醇提液回收乙醇后，浓缩成醇提浸膏，水提液过滤与所有的水提液混匀后浓缩成水提浸膏，将浸膏直接喷雾干燥成喷雾粉；

d)制剂工艺：

将步骤b)的超微粉碎粉与步骤c)所得喷雾干燥粉一起加到沸腾制粒干燥机中，再喷溶媒制成颗粒；将制成的颗粒经整粒，加入冰片细粉，喷入由降香和檀香提取的挥发油，混匀后由胶囊充填机充填，制成胶囊。

上述中药组合物的其他剂型按比例称取原料药后，采用常规的制备方法制备，例如，范碧亭《中药药剂学》（上海科学出版社1997年12月第1版）记载的制备工艺，制成药剂学可接受的常规剂型。

为使上述剂型能够实现，需在制备这些剂型时加入药学可接受的辅料，例如：填充剂、崩解剂、润滑剂、助悬剂、粘合剂、甜味剂、矫味剂、防腐剂、基质等。填充剂包括：淀粉、预胶化淀粉、乳糖、甘露醇、甲壳素、微晶纤维素、蔗糖等；崩解剂包括：淀粉、预胶化淀粉、微晶纤维素、羧甲基淀粉钠、交联聚乙烯吡咯烷酮、低取代羟丙纤维素、交联羧甲基纤维素钠等；润滑剂包括：硬脂酸镁、十二烷基硫酸钠、滑石粉、二氧化硅等；助悬剂包括：聚乙烯吡咯烷酮、微晶纤维素、蔗糖、琼脂、羟丙基甲基纤维素等；粘合剂包括，淀粉浆、聚乙烯吡咯烷酮、羟丙基甲基纤维素等；甜味剂包括：糖精钠、阿斯帕坦、蔗糖、甜蜜素、甘草次酸等；矫味剂包括：甜味剂及各种香精；防腐剂包括：尼泊金类、苯甲酸、苯甲酸钠、山梨酸及其盐类、苯扎溴铵、醋酸氯乙定、桉叶油等；基质包括：PEG6000，PEG4000，虫蜡等。为使上述剂型能够实现中药药剂学，需在制备这些剂型时加入药学可接受的其它辅料（范碧亭《中药药剂学》，上海科学出版社1997年12月第1版中各剂型记载的辅料）。

本发明方法测定该中药组合物制剂的指纹图谱从多个方面评价该方法的可行性，评价方法如下：

1. 1 仪器，试剂及样品

1. 1. 1 仪器 超高效液相色谱仪(UPLC H-Class,PDA Detector，美国Waters公司)；电子天平(AG135， Mettler Toledo)；KQ5200B型超声波清洗器(昆山市超声仪有限公司)；离心机(飞鸽TGL-16C，上海安亭科学仪器厂)；相似度计算软件：中药色谱指纹图谱相似度评价系统A版。

1. 1. 2 试剂 乙腈为高效液相色谱纯（Fisher scientific)，甲醇为高效液相色谱纯（Fisher scientific)，水为屈臣氏蒸馏水(批号：20120319C，广州市屈臣氏食品饮料有限公司)，磷酸为高效液相色谱纯（批号：20120104，天津市科密欧化学试剂有限公司）。

1. 1. 3 样品 10批本发明中药组合物胶囊样品(石家庄以岭药业股份有限公司生产)批号：120229、120231、120233、1200304、1200308、120310、120712、120723、120727、120919；标准品：没食子酸（批号：110831-200302）、苯甲酸（批号：110419-200301）、芍药苷（批号：120524-12）， 对照品均由中国药品生物制品鉴定所提供。

2 方法与结果

2. 1 色谱条件 色谱柱；Waters ACQUIT UPLC BEH C₁₈ ( 100 mm×2.1 mm,1.7 μm )；流速：0.45 ml/min；柱温：30℃；检测波长为 203 nm；进样量：本发明中药组合物胶囊溶液和对照品均进 0.4 μl，流动相B为乙腈，A为0.2%磷酸，梯度洗脱：0～2min，1%B；2～3min，1%～9%B；3～5min，9%～13%B，5～20min，13%～36%B；20～23min，36%～60%B；23～35min，60%～100%B；35～36min， 100%B。

2. 2 供试品溶液的制备 称取本发明中药组合物胶囊药粉 0.15 g 置 10 ml离心管中，加入70%的甲醇 5.0 ml密封超声提取 60 min 后以 4500 r/min 离心 20 min，用0.20 μm 滤膜滤过，即得。

2. 3 对照品溶液的制备 精密称取芍药苷对照品、没食子酸对照品、苯甲酸对照品适量，加70%甲醇制成每 1 ml含芍药苷对照品、没食子酸对照品、苯甲酸对照品分别为0.076 mg、0.840 mg、0.600 mg 的溶液；分别精密吸取上述对照品溶液 1.200ml、0.040ml、0.120 ml、 混匀供标准品对照使用。

2. 4 方法学考察

2. 4. 1 稳定性试验 取同一批号供试品溶液，分别于0、2、4、8、16，24 h 进样，测得各共有峰相对保留时间和峰面积RSD 均小于3% ，表明供试品溶液在24 h 内稳定。

2. 4. 2 精密度试验 取同一批号供试品溶液，连续进样5 次，测得各共有峰相对保留时间和峰面积RSD 均小于3%，表明进样的精密度良好。

2. 4. 3 重复性试验 取同一批号供试品，按2.2项方法，分别制备5份供试品溶液，分别进样，测得各共有峰相对保留时间和峰面积RSD均小于3%，表明方法重复性较好。

2. 4. 4 指纹图谱的建立及相似度分析

2..4.4.1指纹图谱建立：按上述方法检测10批样品指纹图谱，同时生成对照峰，标示了指纹图谱中40个共有峰。同时测试对照品溶液，对指纹图谱中的部分共有峰进行了归属，见图2， 5号峰为没食子酸，12号峰为芍药苷，14号峰为苯甲酸。其中1、2、3、4、5、12、13、14、15、22、27、31、32号共13个峰为强吸收峰。

2. 4. 4.2 指纹图谱相似度计算：本发明中药组合物胶囊剂指纹图谱共有模式确立利用中国药典“中药色谱指纹图谱相似度评价系统A 版”，将1～10批次本发明中药组合物胶囊剂图谱数据导入，经数据自动匹配，以平均数法生成对照指纹图谱，相似度见表1，指纹图谱见图1。

表1 10批次本发明中药组合物胶囊剂相似度

相似度计算及分析 按照建立起来的指纹图谱对不同批次的本发明中药组合物胶囊剂进行相似度分析，结果表明其10批样品相似度大于0.96，具有很好的相似性。

2.5其他研究：

2.5.1检测波长的确定：为了在指纹图谱中获得最丰富的本发明中药组合物胶囊化学成分信息，参照文献对本发明中药组合物胶囊指纹图谱的检测波长进行了选择，范围为191～400 nm，对此范围内全部波长进行扫描，结果显示在203 nm 下指纹图谱的色谱峰数目最多，代表的化学成分信息量最大，峰的分离也较好。

2.5.2 样品预处理方法的选择：分别以乙腈、无水甲醇、无水乙醇、氯仿和不同浓度的甲醇超声萃取考察，结果显示，用70%的甲醇提取的样品信息量大，且分离度高。之后又对提取时间15 min，30 min和60 min，90 min 进行考查，结果显示 60 min 已充分提取且效果佳，故本实验采用70%的甲醇超声 60 min 提取。

2.5.3 流动相的选择：分别以乙腈-水、甲醇-水，乙腈-磷酸水和甲醇-磷酸水等体系为流动相进行洗脱色谱分析，结果显示采用乙腈-水分离效果较好；乙腈-磷酸溶液质量分数为0.2 %体系且以0.45 ml/min的流速最好。

本方法具有良好的精密度和稳定性，以及重复性，为提高该中药组合物的质量控制提供一种新方法。

附图说明

图1 10批本发明中药组合物胶囊剂UPLC指纹图谱。

图2 本发明中药组合物胶囊剂指纹图谱(实施例1)。

图3 本发明中药组合物片剂指纹图谱(实施例2)。

图4 本发明中药组合物丸剂指纹图谱(实施例3)。

图5 本发明中药组合物胶囊剂指纹图谱(实施例4)。

具体实施方式

实施例1：

一、制备制剂

a) 原料药配方为：

人参 39.6g 水蛭 72.6g 土鳖虫 46.2g 乳香 13.2g

赤芍 33g 降香 13.2g 檀香 13.2g 全蝎 19.8g

蝉蜕 46.2g 蜈蚣 6.6g 冰片 33g 酸枣仁 33g;

b) 药材粉碎工艺：

将全蝎、水蛭、蜈蚣、土鳖虫和蝉蜕五种虫药经净选、水洗处理后和净选炮制后的制乳香按处方配料，由粉碎机进行粉碎，药粉细度达到80目以上;粗粉后的药粉经各种超微粉碎技术进行超微粉碎，使药粉平均粒径小于30-40 µm;待粉碎的药材经清洗烘干灭菌后，配料;

c) 提取浓缩和干燥工艺：

降香和檀香先加水提取挥发油后再用水提取，赤芍和酸枣仁加适量水煎煮二次，每次3小时，合并水提液，过滤后，待浓缩成浸膏；人参用适量70%的乙醇提取二次，每次3小时，合并提取液，回收乙醇至无醇味，再用水提取，醇提液浓缩成相对密度为0.9～1.1(60℃)醇提浸膏，水提液过滤与上述所有水提液混匀后浓缩至相对密度为0.9～1.1(60℃)的清膏，备用；

d) 制剂工艺：

在沸腾制粒干燥机中加入步骤b）的超微粉碎粉，再将步骤c）所得提取浸膏喷入制粒；将制成的颗粒经整粒，加入冰片细粉，喷入由降香和檀香提取的挥发油，混匀后由胶囊充填机充填，制成1000粒胶囊。

二、指纹图谱测定：

色谱柱为Waters ACQUIT UPLC BEH C₁₈；规格为 100 mm×2.1 mm,1.7 μm；流速：0.45 ml/min；柱温：30℃；检测波长为 203 nm；

供试品溶液的配制：称取该中药组合物0.15 g 置 10 ml离心管中，加入70%的甲醇 5.0 ml 密封超声提取 60 min 后以 4500 r/min 离心 20 min，用 0.20 μm 滤膜滤过，即得；

测定法：精密吸取供试品溶液0.4μl，注入超高压液相色谱仪，记录色谱图，即得。

评价结果：

	精密度RSD(%)	重复性RSD(%)	溶液稳定性RSD(%)
				结果	1.9	2.3	2.2

结论：指纹图谱见图2，结果令人满意可以用于控制上述胶囊剂的质量。

实施例2

一、制备制剂

a) 原料药配方为：

人参 66g 水蛭 52.8g 土鳖虫 46.2g 乳香 13.2g

赤芍 33g 降香 13.2g 檀香 13.2g 全蝎 59.4g

蝉蜕 46.2g 蜈蚣 6.6g 冰片 33g 酸枣仁 33g

b) 药材粉碎工艺：

将全蝎、水蛭、蜈蚣、土鳖虫和蝉蜕五种虫药经净选、水洗处理后和净选炮制后的制乳香按处方配料，由粉碎机进行粉碎，药粉细度达到80目以上;粗粉后的药粉经各种超微粉碎技术进行超微粉碎，使药粉平均粒径小于70-90 µm;待粉碎的药材经清洗烘干灭菌后，配料;

c) 提取浓缩和干燥工艺：

降香和檀香先加水提取挥发油后再用水提取，赤芍和酸枣仁加适量水煎煮二次，每次3小时，合并水提液，过滤后，待浓缩成浸膏；人参用适量70%的乙醇提取二次，每次3小时，合并提取液，回收乙醇至无醇味，再用水提取，醇提液浓缩成相对密度在60℃测定为1.0～1.05醇提浸膏，水提液过滤与上述所有水提液混匀后浓缩至60℃测定相对密度为1.0～1.1的清膏，备用；

d) 制剂工艺：

在沸腾制粒干燥机中加入超微粉碎粉，再将步骤c)所得提取浸膏喷入制粒；将制成的颗粒经整粒，加入冰片细粉，喷入由降香和檀香提取的挥发油，按常规制剂工艺压制成1000片。

二、指纹图谱测定：

色谱柱为ACQUITY UPLC BEH C₁₈色谱柱，规格为100mm×2.1mm，1.7μm；流速：0.2ml/min；柱温：20℃；检测波长为 205 nm；

供试品溶液的配制：称取该中药组合物0.05 g ，加入80%的甲醇 1.0 ml密封超声提取 30 min，称重，用80%的甲醇补重，摇匀，过滤，用 0.20 μm 滤膜滤过，即得；

测定法：精密吸取供试品溶液0.1μl，注入超高压液相色谱仪，记录色谱图，即得。

评价结果：

	精密度RSD(%)	重复性RSD(%)	溶液稳定性RSD(%)
				结果	2.1	2.0	2.8

结论：指纹图谱见图3，结果令人满意可以用于控制上述片剂的质量。

实施例3：丸剂的制备

一、制备制剂

a) 原料药配方为：

人参 39.6g 水蛭 66g 土鳖虫 46.2g 乳香 13.2g

赤芍 33g 降香 13.2g 檀香 13.2g 全蝎 46.2g

蝉蜕 46.2g 蜈蚣 6.6g 冰片 33g 酸枣仁 33g

b) 药材粉碎工艺：

将全蝎、水蛭、蜈蚣、土鳖虫和蝉蜕五种虫药经净选、水洗处理后和净选炮制后的制乳香按处方配料，由粉碎机进行粉碎，药粉细度达到80目以上;粗粉后的药粉经各种超微粉碎技术进行超微粉碎，使药粉平均粒径10-20 µm;待粉碎的药材经清洗烘干灭菌后，配料;

c) 提取浓缩和干燥工艺：

降香和檀香先加水提取挥发油后再用水提取，赤芍和酸枣仁加适量水煎煮二次，每次3小时，合并水提液，过滤后，待浓缩成浸膏；人参用适量70%的乙醇提取二次，每次3小时，合并提取液，回收乙醇至无醇味，再用水提取，醇提液浓缩成60℃测定相对密度为0.9～1.0醇提浸膏，水提液过滤与上述所有水提液混匀后浓缩至60℃测定相对密度为1.0～1.1的清膏，备用；

d) 制剂工艺：按常规制剂工艺，制成1000粒丸剂。

二、指纹图谱测定：

色谱柱为Waters Acquity UPLC HSS T3 C₁₈，规格为100mm×2.1mm，1.8μm；流速：0.8 ml/min；柱温：50℃；检测波长为 201 nm；

供试品溶液的配制：称取该中药组合物0.5 g ，加入50%的甲醇20.0 ml密封超声提取 120 min，称重，用50%的甲醇补重，摇匀，过滤，用 0.20 μm 滤膜滤过，即得；

测定法：精密吸取供试品溶液1.5μl，注入超高压液相色谱仪，记录色谱图，即得。

评价结果：

	精密度RSD(%)	重复性RSD(%)	溶液稳定性RSD(%)
				结果	2.8	2.3	2.5

结论：指纹图谱见图4，结果令人满意可以用于控制上述片剂的质量。

实施例4：

一、制备制剂

a) 原料药配方为：

人参 39.6g 水蛭 72.6g 土鳖虫 46.2g 乳香 13.2g

赤芍 33g 降香 13.2g 檀香 13.2g 全蝎 19.8g

蝉蜕 46.2g 蜈蚣 6.6g 冰片 33g ；

b) 药材粉碎工艺：

将全蝎、水蛭、蜈蚣、土鳖虫和蝉蜕五种虫药经净选、水洗处理后和净选炮制后的制乳香按处方配料，由粉碎机进行粉碎，药粉细度达到80目以上；粗粉后的药粉经各种超微粉碎技术进行超微粉碎，使药粉平均粒径小于100 µm；待粉碎的药材经清洗烘干灭菌后，配料；

c) 提取浓缩和干燥工艺：降香和檀香先加水提取挥发油后再用水提取，赤芍和酸枣仁加适量水煎煮二次，每次3小时，合并水提液，过滤后，待浓缩成浸膏；人参用适量70%的乙醇提取二次，每次3小时，合并提取液，回收乙醇至无醇味，再用水提取，醇提液浓缩成相对密度为0.9～1.1(60℃)醇提浸膏，将浸膏直接喷雾干燥成喷雾粉；

d) 制剂工艺：

将步骤b)的超微粉碎粉与步骤c)所得喷雾干燥粉一起加到沸腾制粒干燥机中，再喷溶媒制成颗粒；将制成的颗粒经整粒，加入冰片细粉，喷入由降香和檀香提取的挥发油，混匀后由胶囊充填机充填，制成1000粒胶囊。

二、指纹图谱测定：

色谱柱为Waters ACQUIT UPLC BEH C₁₈，规格为 100 mm×2.1 mm,1.7 μm；流速：0.6 ml/min；柱温：40℃；检测波长为 204 nm；

供试品溶液的配制：称取该中药组合物0.3 g ，加入60%的甲醇10.0 ml密封超声提取 90 min称重，用60%的甲醇补重，摇匀，过滤，用 0.20 μm 滤膜滤过，即得；

测定法：精密吸取供试品溶液，注入超高压液相色谱仪，记录色谱图，即得。

评价结果：

	精密度RSD(%)	重复性RSD(%)	溶液稳定性RSD(%)
				结果	2.8	2.4	1.7

结论：指纹图谱见图5，结果令人满意可以用于控制上述胶囊剂的质量。

Claims (6)

1.一种治疗冠心病的中药组合物制剂指纹图谱测定方法，该中药组合物制剂是由如下重量份的原料药制成：

人参3-10 水蛭3-11 土鳖虫5-10 乳香1-5 赤芍3-9 降香1-5

檀香1-5 全蝎3-9 蝉蜕3-12 蜈蚣1-3 冰片1-7 酸枣仁 3-10，

该中药组合物胶囊剂由以下步骤制成：

a)按照重量份比例称取各原料药；

b)药材粉碎工艺：将全蝎、水蛭、土鳖虫、蜈蚣和蝉蜕五种虫药经净选、水洗处理后和净选炮制后的制乳香按处方配料，由粉碎机进行粉碎，药粉细度达到80目以上；粗粉后的药粉经各种超微粉碎技术进行超微粉碎，使药粉平均粒径小于100μm；待粉碎的药材经清洗烘干灭菌后，配料；

c)提取浓缩和干燥工艺：降香和檀香先加水提取挥发油后再用水提取，赤芍和酸枣仁加水煎煮，水提液过滤后，待浓缩成浸膏；人参用乙醇提取后，再用水提取，醇提液回收乙醇后，浓缩成醇提浸膏，水提液过滤与所有的水提液混匀后浓缩成水提浸膏；

d)制剂工艺：在沸腾制粒干燥机中加入步骤b）的超微粉碎粉，再将步骤c)所得提取浸膏喷入制粒；将制成的颗粒经整粒，加入冰片细粉，喷入由降香和檀香提取的挥发油，混匀后由胶囊充填机充填，制成胶囊，

其特征在于由上述步骤制成的中药组合物的指纹图谱采用超高压液相色谱法，色谱条件及测定方法如下：

色谱条件：色谱柱为C₁₈柱，柱温20-50℃，流速0.2-0.8 ml/min，检测波长201-205nm，流动相B为乙腈，A为0.2%磷酸；梯度洗脱：0～2min，1%B；2～3min，1%～9%B；3～5min，9%～13%B；5～20min，13%～36%B；20～23min，36%～60%B；23～35min，60%～100%B；35～36min， 100%B；

供试品溶液的配制： 称该中药组合物0.05-0.5 g ，加入50-80%的甲醇 1-20.0 ml超声提取 30-120 min 滤过，即得；

测定法：精密吸取供试品溶液0.1-1.5μl，注入超高压液相色谱仪，记录色谱图，即得。

2.如权利要求1所述的指纹图谱测定方法，其特征在于所述色谱柱为Waters ACQUITUPLCR BEH C₁₈，规格为 100 mm×2.1 mm,1.7 μm；流速：0.45 ml/min；柱温：30℃；检测波长为 203 nm；

供试品溶液的配制：称取该中药组合物0.15 g 置 10 ml离心管中，加入70%的甲醇5.0 ml 密封超声提取 60 min 后以 4500 r/min 离心 20 min，用 0.20 μm 滤膜滤过，即得；

测定法：精密吸取供试品溶液和对照品溶液各0.4μl，注入超高压液相色谱仪，记录色谱图，即得。

3.如权利要求1所述的指纹图谱测定方法，其特征在于所述中药组合物制剂是由如下重量份的原料药制成：

人参 6 水蛭 10 土鳖虫 7 乳香 2 赤芍 5 降香 2

檀香 2 全蝎 7 蝉蜕 7 蜈蚣 1 冰片 5 酸枣仁5。

4.如权利要求1所述的指纹图谱测定方法，其特征在于所述中药组合物制剂由下列重量份的原料药制成：

人参 10 水蛭 8 土鳖虫 7 乳香 2 赤芍 5 降香 2

檀香 2 全蝎 9 蝉蜕 7 蜈蚣 1 冰片 5 酸枣仁5。

5.如权利要求1所述的指纹图谱测定方法，其特征在于所述中药组合物制剂由下列重量的原料药制成：

人参 6 水蛭 11 土鳖虫 7 乳香 2 赤芍 5 降香 2

檀香 2 全蝎 3 蝉蜕 7 蜈蚣 1 冰片 5 酸枣仁5。

6.如权利要求1-5任一所述的指纹图谱测定方法，其特征在于所述中药组合物制剂的活性成分由以下列步骤制成：

a 平均粒径小于100 µm的全蝎、水蛭、蜈蚣、土鳖虫、蝉蜕及乳香药粉;

b 冰片药粉;

c 由降香和檀香提取的挥发油;

d 人参用乙醇提取后的醇提液经浓缩后的醇提浸膏;

e 提取成分c后的降香和檀香药渣的水提液、赤芍和酸枣仁加水煎煮后的水提液以及提取成分d后的人参药渣的水提液过滤、混匀后浓缩成的水提浸膏。