WO2009113628A1 - 酵素によるタンパク質の改質方法 - Google Patents

酵素によるタンパク質の改質方法 Download PDF

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WO2009113628A1
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典子 三輪
信久 榛葉
美奈 中村
鈴木　榮一郎
敬一 横山
裕行 中越
文之 廣瀬
佐藤　弘明
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味の素株式会社
天野エンザイム株式会社
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    • G01N2333/9108—Aminoacyltransferases (general) (2.3.2) with definite EC number (2.3.2.-)
    • G01N2333/91085—Transglutaminases; Factor XIIIq (2.3.2.13)

Definitions

  • the present invention is based on the priority claims of Japanese Patent Applications: Japanese Patent Application No. 2008-066765 (filed on March 14, 2008) and Japanese Patent Application No. 2008-294890 (filed on November 18, 2008), The entire contents of this application are incorporated herein by reference.
  • the present invention relates to a method for modifying a protein, wherein two enzyme reactions are carried out by causing both transglutaminase and protein glutaminase, which are enzymes that modify glutamine residues in a protein, to act.
  • the present invention also provides a food containing a protein modified using this method, an enzyme preparation for protein modification containing both protein glutaminase and transglutaminase in a specific ratio, protein glutaminase and transglutaminase.
  • the present invention also relates to a method of finding an appropriate addition amount ratio to a substrate protein.
  • Transglutaminase (hereinafter sometimes abbreviated as TG) is an enzyme that catalyzes an acyl transfer reaction between a ⁇ -carboxyamide group of a glutamine residue and a primary amine in proteins and peptides.
  • TG acts as an acyl acceptor on the ⁇ -amino group of a lysine residue in a protein
  • a cross-linking polymerization reaction of the protein occurs.
  • water functions as an acyl acceptor and catalyzes a deamidation reaction that converts a glutamine residue to a glutamic acid residue.
  • protein cross-linking reactions In food applications, most are due to protein cross-linking reactions.
  • protein gelation is imparted or improved, protein gelation without heating, adhesion, etc.
  • TG preparations for various uses such as ham, sausage, noodles, tofu and bread have been developed.
  • protein glutaminase (hereinafter sometimes abbreviated as PG) is an enzyme having an action of deamidating an amide group of a glutamine residue in a protein.
  • PG acts directly on the amide group in the protein, thereby converting the glutamine residue in the protein to a glutamic acid residue, resulting in a carboxyl group, increasing the negative charge of the protein, electrostatic repulsion Increase, decrease in isoelectric point, increase in hydration power, etc.
  • various functional properties such as increased protein solubility, increased water dispersibility, emulsification power, and improved emulsification stability are brought about, and the use of proteins is expected to be expanded.
  • Patent Document 1 shows an example of using PG as a TG reaction control agent
  • Non-Patent Document 2 describes that when PG ⁇ TG coexists, the crosslinking reaction by TG does not proceed.
  • the knowledge so far regarding the difference in reactivity between TG and PG will be described in more detail.
  • the target in the substrate protein is the same glutamine residue.
  • PG has a wider substrate specificity for individual glutamine residues in the protein than TG.
  • Non-patent Document 2 discloses that casein that has been sufficiently deamidated with PG no longer serves as a substrate for TG, that is, it does not become a crosslinked polymer.
  • Non-patent Document 3 Y.S.Gu et al. Investigated the reactivity of this enzyme to ⁇ -lactalbumin and reported that 4 of 6 glutamine residues were deamidated.
  • actinomycete TG acts only on one of the four, glutamine 54, it is described there that the substrate specificity of PG is broader than that of TG.
  • Patent Document 1 discloses that TG reaction can be stopped at an appropriate time by utilizing the high reactivity of PG to glutamine residues, and PG is not preferred for addition to food. The possibility of replacing commonly known TG inhibitors such as ammonium is mentioned.
  • Patent Document 3 a method using NMR is known (Patent Document 3). That is, by reacting an arbitrary protein with TG in the presence of 15 N-labeled ammonium chloride and observing by NMR the 15 N-labeled carboxyamide nitrogen of the glutamine residue that is the substrate of TG, the reaction of TG is performed. A way to track. When this method is used, reactivity and substrate specificity can be analyzed simultaneously using a protein substrate.
  • Patent Document 3 does not describe that the carboxyamide nitrogen of the glutamine residue with which PG reacts is labeled with 15 N.
  • An object of the present invention is to provide a method for modifying a protein by allowing both protein glutaminase and transglutaminase to act on the protein, to provide a food containing a protein modified by both enzymes, It is to provide an enzyme preparation for protein modification, and to provide a method for easily finding an appropriate addition amount ratio of protein glutaminase and transglutaminase.
  • TG does not act when PG is present, and it is difficult to obtain the combined effect of PG and TG.
  • the inventors have found that under the predetermined conditions, both enzymes act on the substrate protein even when PG and TG coexist, and the combined effect of both enzymes can be obtained.
  • PG like TG, catalyzes the deamidation of glutamine residues in proteins, as well as catalyzing exchange reactions with ammonium salts. That is, the carboxyamide nitrogen of the glutamine residue with which TG or PG reacts is labeled with 15 N.
  • the 15 N labeling rate can be estimated from the NMR signal intensity, and the difference in each reactivity can be known. I found. Furthermore, it has been found that the abundance ratio of TG and PG has a good correlation with the respective NMR signal intensity ratios for various proteins. Furthermore, the PG / TG enzyme weight ratio or activity ratio that gives a ratio of PG to TG signal intensity (hereinafter referred to as PG / TG signal intensity ratio) ranging from 0.2 to 3.0 is such that the TG reaction is stopped by PG.
  • the present inventors have found that the TG reaction and its reforming effect are not impaired even under the condition where PG coexists.
  • TG or PG to act on a substrate in the presence of 15 N-labeled ammonium and comparing the substrate specificities of both using NMR, conditions for obtaining the combined effect of both enzymes can be easily found.
  • the present invention is as follows.
  • the addition time of the protein glutaminase to the protein is substantially the same as the addition time of the transglutaminase, or the transglutaminase is A method for modifying a protein before acting on the protein.
  • An enzyme preparation for protein modification in which the mixing ratio of transglutaminase: protein glutaminase is protein glutaminase: transglutaminase 0.05-3: 1 in the activity ratio.
  • An enzyme preparation for protein modification in which the mixing ratio of transglutaminase: protein glutaminase is protein glutaminase: transglutaminase 0.01 to 0.7: 1 in a weight ratio.
  • transglutaminase protein glutaminase
  • transglutaminase 0.2 to 3.0: 1 in the NMR signal intensity ratio .
  • transglutaminase and protein glutaminase act separately on a protein in the presence of an isotope-labeled ammonium salt, isotopically labeling the functional group of the glutamine residue of the protein, and measuring its NMR signal intensity And a method for finding an appropriate addition ratio of protein glutaminase and transglutaminase in the protein.
  • the protein modification effect different from the case where either TG or PG enzyme is used alone, that is, the combined effect of TG and PG, specifically, the protein contained in the food It is possible to provide a novel protein modification method capable of obtaining the effect that the properties of the food are modified and, as a result, the texture (hardness, smoothness, etc.) of the protein-containing food is improved. . Moreover, the foodstuff containing the protein which has the novel characteristic obtained using such a modification
  • the TG used in the present invention is widely used for the production of foods such as gelatin, cheese, yogurt, tofu, salmon, ham, sausage, noodles, etc. and for improving meat quality (Japanese Patent Laid-Open No. 64-27471 ⁇ reference> Reference 1>).
  • it is an enzyme used for various industrial purposes, such as being used in the production of heat-stable microcapsule materials and immobilized enzyme carriers.
  • TG catalyzes the acyl transfer reaction of the ⁇ -carboxamide group of a glutamine residue in the peptide chain of a protein molecule.
  • TG includes calcium-independent and calcium-dependent types, both of which can be used in the present invention.
  • the former include those derived from microorganisms such as actinomycetes and Bacillus subtilis (for example, see JP-A No. 64-27471 ⁇ Reference Document 2>).
  • the latter include those derived from guinea pig liver (see, for example, Japanese Patent Publication No. 1-50382 ⁇ Reference 3>), human epidermal keratinocytes TG (Phillips, M. A. et al. (1990) Proc. Natl). Acad. Sci. USA 87, 9333 (Reference 4)), human blood coagulation factor XIII (Ichinose, A. et al.
  • microorganisms such as oomycete Derived from animals such as bovine blood and pig blood, derived from fish such as salmon and red sea bream (for example, Nobuo Seki et al., “Journal of Japanese Fisheries Society”, vol. 125, pages 125 to 132, 1990 6>), oyster-derived ones, and the like.
  • those produced by genetic recombination for example, JP-A-1-3000889 ⁇ reference 7>, JP-A-6-225775 ⁇ reference 8>, JP-A-7-23737 ⁇ reference 9 >>). Any material can be used in the present invention, and the present invention is not limited to the origin and the production method.
  • MTG microorganism-derived
  • JP-A No. 64-27471 ⁇ Reference 10> satisfies this condition and can be said to be optimal at the present time.
  • transglutaminase derived from Streptoverticillium mobaraensu may be referred to as MTG.
  • the activity unit of TG used in the present invention is measured and defined as follows. That is, the reaction was carried out using benzyloxycarbonyl-L-glutamylglycine (Z-Gln-Gly) and hydroxylamine as substrates, and the resulting hydroxamic acid was converted to an iron complex in the presence of trichloroacetic acid, followed by absorbance at 525 nm. Measure the amount. Thus, a calibration curve is prepared from the amount of hydroxamic acid, and the amount of enzyme that produces 1 ⁇ mol of hydroxamate per minute is defined as one unit of activity. Details of this measurement method are as already reported (for example, see JP-A No. 64-27471 ⁇ Reference Document 11>). Note that the content described in Reference 11 is incorporated herein by reference.
  • PG used in the present invention directly acts on an amide group of a protein and has a function of deamidation without peptide bond cleavage and protein cross-linking.
  • action the kind is not specifically limited.
  • examples of such enzymes include those disclosed in Patent Document 1 or Patent Document 2, but are not particularly limited thereto.
  • As the PG one prepared from a culture solution of a microorganism that produces PG can be used.
  • the microorganism used for the preparation of PG is not particularly limited, and examples include microorganisms belonging to the genus Chrysobacterium, Flavobacterium, and Empedobacter.
  • the target enzyme can be obtained by centrifuging the culture solution to remove the cells and then combining salting out, chromatography, and the like.
  • the microbial cells are crushed by pressure treatment, ultrasonic treatment, etc., and then separated and purified in the same manner as described above to obtain the target enzyme.
  • the enzyme may be pulverized by a drying method such as lyophilization or reduced pressure drying, and an appropriate excipient or drying aid may be used at that time.
  • the active unit of PG of the present invention is measured by a method obtained by improving the method described in Patent Document 1, that is, the following method.
  • (1) Add 10 ⁇ l of an aqueous solution containing PG to 100 ⁇ l of 176 mM phosphate buffer (pH 6.5) containing 30 mM Z-Gln-Gly, incubate at 37 ° C. for 10 minutes, and then add 100 ⁇ l of 12% TCA solution to react. Stop. At this time, the enzyme concentration is appropriately diluted with 20 mM phosphate buffer (pH 6.0) so that the enzyme concentration becomes 0.05 mg / ml.
  • NH3 is quantified with F-kit ammonia (Roche) for the supernatant.
  • the method is as follows. (3) Add 10 ⁇ l of supernatant and 190 ⁇ l of 0.1 M triethanolamine buffer (pH 8.0) to 100 ⁇ l of reagent II solution (F-kit accessory), leave it at room temperature for 5 minutes, and then absorb the absorbance at 340 nm using 100 ⁇ l ( E1) is measured.
  • reagent III glutamate dehydrogenase
  • E2 absorbance at 340 nm
  • the ammonia concentration in the reaction solution is obtained from a calibration curve representing the relationship between the ammonia concentration and the amount of change in absorbance (340 nm) prepared using the ammonia standard solution attached to F-kit.
  • the protein concentration is measured using a protein assay CBB (Coomassie Brilliant Blue) solution (Nacalai Tesque) at a detection wavelength of 595 nm.
  • BSA Pierce
  • the activity of PG was determined by the following formula.
  • the time when PG and TG are added to the protein to be modified is substantially the same as the time when PG is added to the protein, or before TG acts on the protein. It is. Therefore, the method of stopping the TG reaction described in Patent Document 1 by addition of PG is not included in the present invention because the addition time of PG to the protein is after TG acts on the protein.
  • the fact that the addition time of PG and TG to the protein is substantially the same means that PG and TG are charged in a series of raw material charging steps. That is, in commercial scale manufacturing, it is common to add a plurality of raw materials in order without mixing them in advance, such as sequentially adding raw material B, raw material C, etc., after introducing raw material A.
  • the temperature at which PG and TG are reacted is generally about 3 ° C. to 60 ° C. If kept at this temperature, both reactions proceed in about 1 minute to about 48 hours. However, it is preferably carried out at about 5 ° C. to 50 ° C. for about 5 minutes to about 24 hours.
  • PG and TG may be added to a raw material containing a protein serving as a substrate, or may be added together with other raw materials.
  • the addition amount of PG and TG can be freely changed according to the type of protein to be modified, the final product, and the desired effect.
  • the addition amount of TG is the standard per gram protein weight in food ingredients. Specifically, it is 0.1 to 100 units.
  • PG may be typically added in an amount of 0.01 to 120 units per gram weight of protein in the food raw material.
  • the above addition amounts of both are only a guide, and are not necessarily limited to these as long as the desired effect of the present invention is exhibited.
  • the ratio of PG and TG to act on the protein is important.
  • the addition time of PG to the protein is substantially the same as the addition time of TG, or before TG acts on the protein
  • the amount of protein glutase and transglutaminase added to the protein is the activity ratio.
  • both PG and TG act on the protein, so that the protein can be modified.
  • the ratio of PG is larger than the above ratio, the action of PG is too effective compared with TG and the effect of the combined use is not exhibited.
  • the ratio is small, the action of PG is too weak and the combined use effect cannot be expected so much. .
  • the NMR spectrum of the obtained protein can be measured and calculated from the NMR signal intensity.
  • the NMR measurement method is not particularly limited. For example, when detecting a 15 N-labeled glutamine residue, a correlation spectrum between 1 H and 15 N, such as an HSQC spectrum, may be measured. When two or more signals are obtained, the sum of the signal intensities is calculated as the signal intensity. That is, the NMR signal intensity ratio is expressed by “the sum of signal intensity when PG is applied” ⁇ “sum of signal intensity when TG is applied”.
  • the labeling compound may be an ammonium salt, and examples thereof include ammonium chloride and ammonium sulfate.
  • an ammonium salt with nitrogen of 15 N may be used
  • an ammonium salt with nitrogen of 14 N may be used.
  • the labeling method is performed in an aqueous solvent in the range of about pH 3.0 to about pH 9.0, preferably in the range of about pH 4.0 to about pH 8.0, at a temperature in the range of about 4 ° C. to about 65 ° C., more preferably What is necessary is just to hold
  • the reaction time is not particularly limited, but may be about 30 seconds to 1 week, more preferably about 1 minute to about 1 day.
  • the concentration of the ammonium salt is preferably about 10 times or more, preferably about 200 times or more with respect to the concentration of the protein to be labeled, and the concentration of the protein to be labeled is in the range of about 1 ⁇ M to about 40 mM. More preferably, the concentration of the ammonium salt ranges from about 10 ⁇ M to about 10M. Since proteins contained in food such as ⁇ -lactoglobulin, casein, soybean globulin, myosin and actomyosin can be isotopically labeled, the NMR signal intensity ratio of the present invention can be measured for all foods containing protein. it can.
  • ⁇ -lactalbumin ⁇ -lactalbumin, hereinafter abbreviated as ⁇ -La
  • a substrate solution 10 mg / ml ⁇ -La, 200 mM 15 NH 4 Cl, 5% D 2 O / 20 mM Tris-HCl (pH 7)) 0.0)
  • TG or PG a substrate-enzyme ratio of 1000: 1, and incubate at 37 ° C. for 26.5 hours.
  • the protein of the present invention is not particularly limited, and examples thereof include milk protein, whey protein, soy protein, wheat gluten, muscle protein, plasma, collagen, and gelatin. A mixture of two or more of these proteins may also be used.
  • any kind of raw material or processed state may be used as long as it includes the above-described protein modified by the combined use of PG and TG. For example, it includes a sterilized state, a degreased state, a diluted state, a concentrated state, a dried state, and other variously processed states.
  • lactose sucrose, maltitol, sorbitol, dextrin, branched dextrin, cyclodextrin, starches, polysaccharides, gums, pectin, which are usually used in this field, in addition to PG and TG
  • animal protein vegetable proteins, such as soybean protein and wheat protein
  • physiologically acceptable inorganic salts such as sodium bicarbonate, sodium citrate, sodium phosphate, sodium chloride and potassium chloride can be added to the enzyme preparation as necessary.
  • seasonings, sugar, spices, colorants, color formers, ascorbic acid, organic salts such as salts thereof, emulsifiers, fats and oils, and the like can be appropriately blended.
  • ⁇ -Lactalbumin ( ⁇ -lactalbumin, hereinafter abbreviated as ⁇ -La) (manufactured by Sigma) was used as a substrate.
  • a substrate solution (10 mg / ml ⁇ -La, 200 mM 15 NH 4 Cl, 5% D 2 O / 20 mM Tris-HCl (pH 7.0)) was prepared, and TG (Ajinomoto Co., Inc.) was prepared so that the substrate-enzyme ratio was 1000: 1.
  • Enzyme-purified product from “Activa” TG) or PG (derived from the genus Chryseobacteria described in Patent Document 1) was added, followed by incubation at 37 ° C. for 26.5 hours.
  • the NMR signal intensity is the sum of the area areas of the elliptical spots in FIG. 1, and the larger the area area, the greater the reaction amount.
  • TG or PG described in Experimental Example 1 was added individually to commercially available milk, 0.2M 15 NH 4 Cl, 5% D 2 O, and the signal intensity at each concentration was calculated.
  • TG was added so that the substrate / enzyme ratio (S / E ratio) was 7400/1 by weight.
  • PG was added in a weight ratio of 0.002 to 5 times that of TG.
  • the specific activity of TG used was 26 units per mg of enzyme protein, and the specific activity of PG was 120 units per mg of enzyme protein.
  • the solution after addition of the enzyme was incubated at 37 ° C. for 3 hours, then transferred to an NMR sample tube, and 1 H- 15 N HSQC measurement was performed using NMR described in Experimental Example 1.
  • the PG addition amount relative to the TG addition amount was expressed as the enzyme weight ratio (PG / TG) and the activity ratio (PG / TG).
  • Table 1 shows the results of determining the PG / TG signal intensity ratio corresponding to each ratio.
  • Yogurt was prepared using commercial milk. 400 g of commercially available milk was heated to 50 ° C., and TG and PG described in Experimental Example 1 were added in the amounts shown in Table 2. The specific activity of TG used was 26 units per mg of enzyme protein, and the specific activity of PG was 120 units. After carrying out the enzyme reaction at 50 ° C. for 90 minutes, the mixture was heated while stirring in a boiling bath. When it reached 90 ° C, it was immediately immersed in ice water and allowed to cool to 45 ° C. 20 g (5% of raw material) of a starter (Meiji Dairy Co., Ltd. Bulgarian yogurt) was added, and after stirring well, 40 g was dispensed into each tasting cup. Covered with aluminum foil and fermented at 38 ° C. for about 3-4 hours until pH dropped to 4.5. It preserve
  • TG and PG described in Experimental Example 1 were added in the amounts shown in Table 2.
  • the breaking stress was measured using a texture analyzer (manufactured by Eihiro Seiki). A 10 mm diameter cylindrical plunger was used, and the breaking speed was 6 cm / min (1 mm / second). The results are shown in Table 3.
  • the breaking stress of the comparative product T to which only TG was added was significantly increased compared to the control product. This is the effect of TG cross-linking milk proteins.
  • the inventive products 1 to 4 also had a higher breaking stress than the control product, and the effect of increasing the breaking stress due to TG was not impaired.
  • the breaking stress of the comparative product TP was almost the same as that of the comparative product P, it was confirmed that the TG reaction was almost stopped by PG and the effect of TG was hardly exhibited.
  • ⁇ Sensory evaluation evaluated the hardness by 6 panelists. The score was determined so that the harder was +5 points and the softer was -5 points when the control product was 0 points, and the average value was obtained. The results are shown in Table 4. Compared with the control product, the comparative product T to which only TG was added had a marked increase in hardness. In the products 1 to 4 of the present invention, the increase in hardness due to TG was maintained. However, the hardness of the comparative product TP, like the comparative product P, softened the yogurt, which means that the TG reaction was almost stopped by PG, and the effect of TG hardly appeared. This result largely reflects the result of the physical property measurement shown above.
  • the products 1 to 4 of the present invention are preferably evaluated to be smoother than the case where only TG is added while maintaining the effect of improving the hardness of yogurt by TG. Results were obtained. That is, the combined effect of PG and TG was confirmed.
  • skim milk powder low heat type, containing 35% milk protein, manufactured by Yotsuba Dairy 0.85% was added and dissolved while heating at 55 ° C to prepare a raw milk for yogurt.
  • the raw milk was heated in a boiling bath, reached 95 ° C. and held for 2 minutes, and then immediately cooled in an ice bath.
  • 0.006% of lactic acid bacteria starter (Yo-Flex, DVS370YC-370, manufactured by Christian Hansen) was added, and TG and PG were added as shown in Table 5 and stirred well.
  • the surface water separation was observed in many of the control product and the comparative product 2, and a little more in the comparative product 3.
  • comparative product 1 and products 1 and 2 of the present invention surface water separation was not observed, and the surface was glossy.
  • the comparative product 1 was hard and had a brittle agar-like texture, and when it was contained in the mouth, it felt watery.
  • Comparative products 2 and 3 were less hard and more adhesive than the control products. In sensory evaluation, there was a comment that it was smooth but soft and lacked in body feeling.
  • the products 1 and 2 of the present invention were both smooth and creamy yogurt with increased hardness and adhesion and a body feeling.
  • the products 1 and 2 of the present invention are the most preferable yogurts, and the texture improvement of the set type low fat yogurt can be achieved by using TG and PG in an appropriate balance. It was shown to be possible.
  • skim milk powder low heat type, containing 35% milk protein, manufactured by Yotsuba Milk Industry
  • lactic acid bacteria starter Yo-Flex, DVS370YC-370, manufactured by Christian Hansen
  • the surface water separation before turning into a star was confirmed in a large amount in the control product and in a small amount in the comparative product 2, but was hardly seen in the comparative product 1 and the inventive products 1 to 4.
  • the control product was rough and had a watery and soft texture.
  • the comparative product 1 had a rough texture although a body feeling was imparted, whereas the comparative product 2 had a smooth and glossy surface, but a watery and soft texture.
  • All of the products 1 to 4 of the present invention had a gloss on the surface, and were given a smooth feeling as well as a body feeling.
  • the viscosity measurement results are also in good agreement with the sensory evaluation, and the viscosities of the products 1 to 4 of the present invention are clearly higher than those of the control product and the comparative product 2, confirming that the body feeling was imparted. .
  • the comparison product 1 showed lumps and a rough sandy texture, whereas the product 1 of the present invention reduced the tendency.
  • the present invention products 2 to 4 were almost improved.
  • yogurt using only TG has an effect of imparting a body feeling compared to the additive-free product, quality degradation during storage becomes a problem, and yogurt using only PG is also used. Although it is smooth in (Comparative product 2), a watery texture without a body feeling becomes a problem.
  • yogurt (present invention products 1 to 4) used in combination with TG and PG at a certain addition ratio can not only solve these problems, but can also improve the quality by giving the surface gloss and smoothness. Indicated.
  • a tofu containing TG and PG was prepared at the addition ratio shown in Table 10.
  • 10 g (corresponding to 3 g of bittern) of 30% bittern (made by Ako Kasei) solution in a collecting container 1 kg of the above-mentioned commercial soymilk in a stainless mug, and heated to 55 ° C. with a hot water bath.
  • the enzyme solution was added to the soy milk, stirred and mixed, and immediately poured into a gathering container containing bittern, and the stirring plate was moved up and down four times.
  • the lid was capped and transferred to a 55 ° C. incubator and allowed to stand for 50 minutes.
  • the tofu was transferred to a vat filled with water and allowed to stand for 30 minutes to 1 hour, and then the tofu was cut out and transferred to a tofu container, and the content weight was measured.
  • Water was added to the container until it was concealed, and the film was covered and heat-sealed. It was put into a constant temperature water bath at 85 ° C., heated for 45 minutes (secondary heating), then subjected to rough heat with running water, cooled in ice water, and stored refrigerated. The next day, the water in the container was removed and the weight of the solid was measured and subjected to physical properties and sensory evaluation.
  • the physical properties were evaluated by a fracture test using a rheometer (manufactured by Fudo Kogyo Co., Ltd.).
  • the plunger used was a 5 mm diameter disk with a breaking speed of 6 cm / min (1 mm / sec).
  • the sensory evaluation was made by 5 panelists, with no enzyme-added products at 0 points, and the smoothness and hardness were evaluated on a 7-point scale between ⁇ 3 points, and the average value was determined.
  • Table 11 shows the results. Comparative products T1 and T2, to which TG was added, had an increased breaking stress compared to the control product. On the other hand, the comparative products P1 and P2 to which PG was added had a reduced breaking stress compared to the control product.
  • the product 1 of the present invention had almost the same breaking stress as the comparative product T1 to which the same amount of TG was added, and the texture changed more smoothly.
  • the product 2 of the present invention had a slightly lower breaking stress than the comparative product T2 to which the same amount of TG was added, but still had a higher breaking stress and a smoothness compared to the control product.
  • the product 3 of the present invention had a smaller breaking stress than the comparative product T2 to which the same amount of TG was added, but the breaking stress was larger than that of the comparative product P2 to which the same amount of PG was added, confirming the effect of adding TG. did it.
  • the comparative product TP was as soft as the comparative products P1 and P2, and no longer had the effect of imparting hardness due to the TG reaction. This means that the TG reaction was almost stopped by PG.
  • the addition of hardness by TG was maintained, and the texture was improved compared to the addition of TG alone, giving an overall favorable texture. . That is, the combined effect of PG and TG was confirmed.
  • the present invention it is possible to obtain a protein modification effect different from the case of using each of transglutaminase and protein glutaminase alone, and it is possible to produce a protein food having completely novel characteristics. Moreover, it is possible to easily find an appropriate condition in which both TG and PG enzymes act on the substrate. Therefore, the present invention is extremely useful in the food field. It should be noted that the disclosures of the aforementioned patent documents and the like are incorporated herein by reference. Within the scope of the entire disclosure (including claims) of the present invention, the embodiments and examples can be changed and adjusted based on the basic technical concept. Various combinations and selections of various disclosed elements are possible within the scope of the claims of the present invention. That is, the present invention of course includes various variations and modifications that could be made by those skilled in the art according to the entire disclosure including the claims and the technical idea.

Abstract

　タンパク質にプロテイングルタミナーゼ及びトランスグルタミナーゼの両方を作用させてタンパク質を改質する方法を提供し、両酵素により改質されたタンパク質を含有する食品を提供し、両酵素を含有したタンパク質改質用酵素製剤を提供し、プロテイングルタミナーゼとトランスグルタミナーゼのタンパク質への適正添加量比を見出す方法を提供する。プロテイングルタミナーゼのタンパク質への添加時期をトランスグルタミナーゼの添加時期と実質的に同時にする、または、トランスグルタミナーゼがタンパク質に作用する前とする、あるいはタンパク質に作用させるプロテイングルタミナーゼとトランスグルタミナーゼの添加比率を所定の比率にすることにより、タンパク質を改質する。同位体標識アンモニウムで標識したタンパク質のＮＭＲシグナル強度等よりプロテイングルタミナーゼとトランスグルタミナーゼの適正添加量比を見出す。

Description

酵素によるタンパク質の改質方法
［関連出願の記載］
　本発明は、日本国特許出願：特願２００８－０６６７６５号（２００８年　３月１４日出願）及び特願２００８－２９４８９０号（２００８年１１月１８日出願）の優先権主張に基づくものであり、同出願の全記載内容は引用をもって本書に組み込み記載されているものとする。
　本発明は、タンパク質中のグルタミン残基を修飾する酵素であるトランスグルタミナーゼとプロテイングルタミナーゼの両方を作用させて２つの酵素反応を行うことを特徴とするタンパク質の改質方法に関する。また、本発明は、この方法を使用して改質されたタンパク質を含有する食品や、プロテイングルタミナーゼ及びトランスグルタミナーゼの両方を特定の比率で含有したタンパク質改質用酵素製剤、プロテイングルタミナーゼとトランスグルタミナーゼの基質タンパク質への適正添加量比を見出す方法等にも関する。
　トランスグルタミナーゼ（以下、ＴＧと略すことがある）は、タンパク質及びペプチド中のグルタミン残基のγ－カルボキシアミド基と１級アミンとの間のアシル転移反応を触媒する酵素である。ＴＧがアシル受容体としてタンパク質中のリジン残基のε－アミノ基に作用すると、タンパク質の架橋重合反応が起こる。また、１級アミンが存在しない場合には、水がアシル受容体として機能し、グルタミン残基をグルタミン酸残基に変換する脱アミド反応を触媒する。食品への応用の際にはほとんどが、タンパク質の架橋反応によるものであり、現在、タンパク質のゲル形成性付与あるいは向上、未加熱でのタンパク質のゲル化、接着などの性質を利用して、蒲鉾、ハム、ソーセージ、麺類、豆腐、パンなど様々な用途に応じたＴＧ製剤が開発されている。
　一方、プロテイングルタミナーゼ（以下、ＰＧと略すことがある）は、タンパク質中のグルタミン残基のアミド基を脱アミドする作用を有する酵素である。その詳細な記述は、特許文献１、特許文献２、非特許文献１等に開示されている通りである。これらによればＰＧはタンパク質中のアミド基に直接作用し、それによってタンパク質中のグルタミン残基はグルタミン酸残基に変換され、カルボキシル基が生じることから、タンパク質の負電荷の増加、静電反発力の上昇、等電点の低下、水和力の増加等が起こる。その結果、タンパク質の溶解性、水分散性の増加、乳化力、乳化安定性の向上など様々な機能特性の向上をもたらし、タンパク質の用途拡大が期待される。
　このように、ＴＧもＰＧも産業上有用な酵素であることが知られているが、これらの酵素を併用することで新たな付加価値を得るという試みについて、具体的な例はほとんど報告されていない。むしろ、特許文献１にＴＧ反応制御剤としてのＰＧの利用例が示されており、非特許文献２にもＰＧ・ＴＧが共存した場合、ＴＧによる架橋反応は進行しないことが記載されている。さらに、ＴＧとＰＧの反応性の相違に関するこれまでの知見をより詳しく述べる。両酵素とも、その基質タンパク質中のターゲットは同じグルタミン残基である。しかしながら、タンパク質中の個々のグルタミン残基に対する基質特異性はＴＧに比べ、ＰＧの方が広い。これは、ＴＧの場合、グルタミン残基の他にリジン残基のε－アミノ基が必要であるのに対し、ＰＧの場合、グルタミン残基の他には反応環境中豊富に存在する水を必要とするだけであるためと考えられる。例えば、カゼイン中のグルタミン残基に対する反応性は、Ｋｍ値、ｋｃａｔ値からみてもＰＧはＴＧに比べ触媒効率が圧倒的に高く、両者が共存した場合、ＰＧの反応の方が優先して起こり、脱アミド化されたグルタミン残基はもはやＴＧの基質にならず、架橋反応は進行しない。実際に、ＴＧによるカゼインの架橋高分子化反応の途中にＰＧを添加する実験によって、カゼインの高分子化は添加と同時に停止する結果が示されている。さらに、ＰＧにより予め十分脱アミド化を施したカゼインはもはやＴＧの基質にならない、すなわち架橋高分子化されないことも確認されている（非特許文献２）。また、Y.S.Guらは、本酵素のα－ラクトアルブミンに対する反応性について調べ、６つのグルタミン残基のうち４つを脱アミド化すると報告している（非特許文献３）。一方、放線菌ＴＧはその４つのうち一つであるグルタミン５４にしか作用しないことから、ＰＧの基質特異性がＴＧに比べて広いことがそこで述べられている。また、特許文献１には、ＰＧのグルタミン残基に対する高い反応性を利用することで、ＴＧ反応を適当な時点で停止させることでき、ＰＧが、食品への添加には好まれないＥＤＴＡや塩化アンモニウムなど一般に知られるＴＧ阻害剤を代替できる可能性が挙げられている。
　しかしながら、ＰＧによるＴＧ反応の停止以外の観点から両者の併用方法が提案されている例はこれまでに挙げられていない。それだけでなく、ＴＧとＰＧの両方を基質タンパク質に作用させて目的とする効果を得る条件、より詳しくは、ＴＧ反応がＰＧによって停止されることなく、ＰＧが共存する条件下でもＴＧ反応ならびにその改質効果が損なわれることのない条件については、従来の知見だけでは知る由もない。さらに、様々な基質タンパク質に対して、ＴＧとＰＧをどのような割合で作用させた場合に、どのような効果が現れるのかなど、両酵素を効果的に用いるための具体的な方法が示された例はなく、したがって、全く新しい試みと言うべき、ＴＧ、ＰＧにより改質されたタンパク質製品の開発を行うとするならば、各用途別に最適な反応条件を模索するしかないのが現況なのである。
　また、酵素反応は、処理時間、温度、酵素添加量、基質の種類、状態、基質特異性等、様々な因子によってその反応量並びにその効果の程度が異なるため、基質を共通とする２つの酵素を使いこなすことは容易なことでなく、開発者、加工業者が用途ごとに、求める食品の製造条件を決定するためには多大な時間、労力を要する。なぜなら、酵素反応は、処理時間、温度、酵素添加量、基質の種類、状態、基質特異性など様々な因子によってその反応量ならびにその効果の程度が異なる上、２つの酵素を同時に作用させようとすると、ありとあらゆる組み合わせを検討する必要があるからである。したがって基質を共通とする２つの酵素を使いこなす方法の開発が求められる。
　ところで、これまでにＴＧの基質特異性を調べる方法として、ＮＭＲを利用する方法が知られている（特許文献３）。すなわち、１５Ｎ標識塩化アンモニウム存在下において任意のタンパク質をＴＧと作用させ、ＴＧの基質となるグルタミン残基のカルボキシアミド窒素を１５Ｎ標識したものをＮＭＲにて観測することで、ＴＧの反応を追跡する方法である。この方法を用いると、タンパク質基質を用いて反応性と基質特異性を同時に解析することができる。しかしながら、特許文献３には、ＰＧが反応するグルタミン残基のカルボキシアミド窒素が、１５Ｎ標識されることは記載されていない。
特開２０００-５０８８７号公報 特開２００１-２１８５９０号公報 特開２００２-３３２２９５号公報 Yamaguchi ら、Eur.J.Biochem. Vol.268, 2001,1410-1412頁 食品酵素化学の最新技術と応用-フードプロテオミクスへの展望-（シーエムシー出版）、１４６～１５３ページ Y.S.Guら、J. Agric. Food Chem. Vol.49,2001, 5999-6005頁
　以上の特許文献１～３及び非特許文献１～３の全開示内容は、本書に引用をもって繰り込み記載されているものとする。
　以下の分析は、本発明の観点から与えられる。
　本発明の目的は、タンパク質にプロテイングルタミナーゼ及びトランスグルタミナーゼの両方を作用させてタンパク質を改質する方法を提供すること、両酵素により改質されたタンパク質を含有する食品を提供すること、両酵素を含有したタンパク質改質用酵素製剤を提供すること、プロテイングルタミナーゼとトランスグルタミナーゼの適正添加量比を簡便に見出す方法を提供することである。
　本発明者らは、上述したことを鑑みて鋭意研究を重ねた結果、これまで、ＰＧが存在する場合はＴＧは作用せず、ＰＧ，ＴＧの併用効果は得られにくいと考えられていたが、所定条件下では、ＰＧとＴＧが共存した場合においても、基質タンパク質に両酵素が作用し、両酵素の併用効果が得られることを見出した。さらに、ＰＧがＴＧと同様、タンパク質中のグルタミン残基の脱アミド化を触媒するほかに、アンモニウム塩との交換反応も触媒する事実を発見した。すなわち、ＴＧ又はＰＧが反応するグルタミン残基のカルボキシアミド窒素は、１５Ｎ標識される。そこで、１５Ｎ標識されたことを検出する測定法、例えば１Ｈ-１５Ｎ　ＨＳＱＣ測定を実施すると、１５Ｎ標識率がＮＭＲシグナル強度から見積もられ、各々の反応性の相違を知ることができることを見出した。さらに、様々なタンパク質についてＴＧとＰＧの存在比率が、それぞれのＮＭＲシグナル強度比率と良好な相関があることを見出した。さらに、ＴＧに対するＰＧのシグナル強度比率（以下、ＰＧ／ＴＧシグナル強度比と記す）が０．２～３．０の範囲を与えるＰＧ／ＴＧ酵素重量比または活性比が、ＴＧ反応がＰＧによって停止されることなく、ＰＧが共存する条件下でもＴＧ反応ならびにその改質効果が損なわれることのない条件であることを見出した。つまり、１５Ｎ標識アンモニウム存在下でＴＧ又はＰＧをそれぞれ基質に作用させ、ＮＭＲを用いて両者の基質特異性を比較することにより、両酵素の併用効果の得られる条件を簡便に見出すことができることを発見した。我々はＰＧとＴＧを同時に作用させる利点を見出した上に、その条件を現実的に、かつ容易に決定する方法を編み出すことに成功したのである。すなわち、本発明は以下の通りである。
（１）プロテイングルタミナーゼ及びトランスグルタミナーゼをタンパク質に作用させてタンパク質を改質する方法において、プロテイングルタミナーゼのタンパク質への添加時期が、トランスグルタミナーゼの添加時期と実質的に同時である、又はトランスグルタミナーゼが該タンパク質に作用する前であるタンパク質の改質方法。
（２）タンパク質に添加するプロテイングルタミナーゼとトランスグルタミナーゼの添加量が、活性比において、プロテイングルタミナーゼ：トランスグルタミナーゼ＝０．０５～３：１である（１）記載の方法。
（３）タンパク質に添加するプロテイングルタミナーゼとトランスグルタミナーゼの添加量が、重量比において、プロテイングルタミナーゼ：トランスグルタミナーゼ＝０．０１～０．７：１である（１）又は（２）記載の方法。
（４）タンパク質に添加するプロテイングルタミナーゼとトランスグルタミナーゼの添加量が、ＮＭＲシグナル強度比において、プロテイングルタミナーゼ：トランスグルタミナーゼ＝０．２～３．０：１となる条件である（１）乃至（３）の何れか記載の改質方法。
（５）タンパク質が乳タンパク質、乳清タンパク質、大豆タンパク質、小麦グルテン、プラズマ、筋肉タンパク質、コラーゲン及びゼラチンより選ばれる１又は２以上のものである（１）乃至（４）の何れか記載の方法。
（６）（１）乃至（５）の何れか記載の方法にて改質されたタンパク質を含有する食品。
（７）トランスグルタミナーゼ：プロテイングルタミナーゼの配合比率が、活性比において、プロテイングルタミナーゼ：トランスグルタミナーゼ＝０．０５～３：１であるタンパク質改質用酵素製剤。
（８）トランスグルタミナーゼ：プロテイングルタミナーゼの配合比率が、重量比において、プロテイングルタミナーゼ：トランスグルタミナーゼ＝０．０１～０．７：１であるタンパク質改質用酵素製剤。
（９）トランスグルタミナーゼ：プロテイングルタミナーゼの配合比率が、ＮＭＲシグナル強度比において、プロテイングルタミナーゼ：トランスグルタミナーゼ＝０．２～３．０：１となる条件であることを特徴とするタンパク質改質用酵素製剤。
（１０）トランスグルタミナーゼとプロテイングルタミナーゼをそれぞれ別々に同位体標識アンモニウム塩の存在下でタンパク質に作用させ、該タンパク質のグルタミン残基の官能基を同位体標識し、そのＮＭＲシグナル強度を測定することにより、該タンパク質におけるプロテイングルタミナーゼとトランスグルタミナーゼの適正添加量比を見出す方法。
　本発明によれば、ＴＧ又はＰＧの何れかの酵素を単独で使用した場合とは異なるタンパク質の改質効果、すなわちＴＧ及びＰＧの併用効果、具体的には、食品に含有されるタンパク質の、当該食品に及ぼす性質が改質され、その結果タンパク質含有食品の食感（硬さ、なめらかさ等）が改良されるという効果を得ることができる、タンパク質の新規改質方法を提供することができる。また、このような改質方法を用いて得られる新規特徴を有するタンパク質を含有する食品を提供することができる。また、タンパク質においてＴＧ及びＰＧの両方の酵素が共に基質に作用して前記効果が得られるようにするのに適切な条件（添加条件）を簡便に見出す方法を提供することができる。
１５ＮＨ４Ｃｌ存在下におけるα－ＬａｃｔａｌｂｕｍｉｎのＮＭＲにおける１Ｈ－１５Ｎ　ＨＳＱＣスペクトルである。（実験例１）
　本発明に用いるＴＧは、ゼラチン、チーズ、ヨーグルト、豆腐、蒲鉾、ハム、ソーセージ、麺類などの食品の製造や食肉の肉質改善等に広く利用されている（特開昭６４－２７４７１号公報〈参考文献１〉）。また、熱に安定なマイクロカプセルの素材、固定化酵素の担体などの製造に利用されているなど、産業上種々の目的に使用されている酵素である。ＴＧは、タンパク質分子のペプチド鎖内にあるグルタミン残基のγ－カルボキシアミド基のアシル転移反応を触媒する。ＴＧがタンパク質分子中のリジン残基のε－アミノ基がアシル受容体として作用すると蛋白質分子中及び分子間においてε－（γ－グルタミン酸）－リジン結合が形成される。なお、参考文献１の記載内容は、引用をもって本書に組み込まれる。
　ＴＧとしてはカルシウム非依存性のものとカルシウム依存性のものがあり、何れも本発明に使用することができる。前者の例としては、放線菌、枯草菌等の微生物由来のもの（例えば、特開昭６４-２７４７１号公報〈参考文献２〉参照。）を挙げることができる。後者の例としてはモルモット肝臓由来のもの（例えば、特公平１-５０３８２号公報〈参考文献３〉参照。）、ヒト表皮ケラチン細胞ＴＧ（Phillips, M. A. et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 87, 9333.〈参考文献４〉）、ヒト血液凝固因子XIII（Ichinose, A. et al. (1990) Biochemistry 25, 6900.〈参考文献５〉）、卵菌等の微生物由来のもの、牛血液、豚血液等の動物由来のもの、サケ、マダイ等の魚由来のもの（例えば、関信夫等、「日本水産学会誌」５６巻１２５～１３２頁、１９９０年〈参考文献６〉）、カキ由来のもの、等を挙げることができる。この他、遺伝子組み換えにより製造されるもの（例えば、特開平１-３００８８９号公報〈参考文献７〉、特開平６-２２５７７５号公報〈参考文献８〉、特開平７-２３７３７号公報〈参考文献９〉参照。）等、を挙げることができる。本発明には何れのものでも使用することができ、起源及び製法に限定されることはない。尚、同位体標識するタンパク質の性質によってはカルシウムを含む溶媒中での酵素反応が好ましくない場合もあるため、そのようなタンパク質についてはカルシウム非依存性のＴＧを使用することが好ましい。例えば、上記微生物由来の（ＭＴＧ）（例えば、特開昭６４-２７４７１号公報〈参考文献１０〉参照。）等はこの条件をも満足するものであり、現時点では最適と言うことができる。例えば、ストレプトベルチシリウム・グリセオカルネウム（Streptoverticillium griseocarneum ）ＩＦＯ  １２７７６、ストレプトベルチシリウム・シナモネウム（Streptoverticillium cinnamoneum sub sp. cinnamoneum ）ＩＦＯ  １２８５２、ストレプトベルチシリウム・モバラエンス（Streptoverticillium mobaraense）ＩＦＯ  １３８１９等に由来するである。以下、ストレプトベルチシリウム・モバラエンスに由来するトランスグルタミナーゼをＭＴＧと呼ぶ場合がある。なお、上記参考文献２～１０の記載内容は、引用をもって本書に組み込まれる。
　本発明に使用するＴＧの活性単位は、次のようにして測定され、かつ定義される。即ち、ベンジルオキシカルボニル－Ｌ－グルタミルグリシン（Ｚ－Ｇｌｎ－Ｇｌｙ）とヒドロキシルアミンを基質として反応を行い、生成したヒドロキサム酸をトリクロル酢酸存在下で鉄錯体に変換させた後、５２５ｎｍの吸光度で、その量を測定する。このようにしてヒドロキサム酸の量より検量線を作成し、１分間に１μモルのハイドロキサメートを生成させる酵素量を活性単位、１ユニットと定義する。この測定法の詳細は既に報告されている通り（例えば、特開昭６４－２７４７１号公報〈参考文献１１〉等参照。）である。なお、参考文献１１の記載内容は、引用をもって本書に組み込まれる。
　本発明に用いるＰＧは、タンパク質のアミド基に直接作用してペプチド結合の切断及びタンパク質の架橋を伴わず脱アミドする作用を有する。当該作用を有する限りにおいてその種類は特に限定されるものではない。この様な酵素の例として、特許文献１あるいは特許文献２に開示された酵素があるが、これらに特に限定されるものではない。ＰＧは、ＰＧを産生する微生物の培養液より調製したものを用いることができる。ＰＧの調製に用いられる微生物は特に限定されないが、クリセオバクテリウム属、フラボバクテリウム属、エンペドバクター属の微生物が例示される。
　微生物の培養液からのＰＧの調製方法については、公知のタンパク質分離、精製方法（遠心分離、ＵＦ濃縮、塩析、イオン交換樹脂等を用いた各種クロマトグラフィー等）を用いることができる。例えば、培養液を遠心分離して菌体を除去し、その後塩析、クロマトグラフィー等を組み合わせて目的の酵素を得ることができる。菌体内から酵素を回収する場合には、例えば菌体を加圧処理、超音波処理などによって破砕した後、上記と同様に分離、精製を行うことにより目的の酵素を取得することができる。尚、ろ過、遠心処理などによって予め培養液から菌体を回収した後、上記一連の工程（菌体の破砕、分離、精製）を行ってもよい。酵素は凍結乾燥、減圧乾燥等の乾燥法により粉末化してもよいし、その際に適当な賦形剤、乾燥助剤を用いてもよい。
　本発明のＰＧの活性単位は、特許文献１記載の方法を改良した方法、すなわち、下記の方法で測定する。
（１）３０ｍＭ　　Ｚ－Ｇｌｎ－Ｇｌｙを含む１７６ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ６．５）１００μｌにＰＧを含む水溶液１０μｌを添加して、３７℃、１０分間インキュベートした後、１２％ＴＣＡ溶液１００μｌを加えて反応を停止させる。このとき、酵素濃度が０．０５ｍｇ／ｍｌとなるように２０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ６．０）で適宜希釈する。
（２）遠心分離（１２０００ｒｐｍ、４℃、５分間）後、上清についてＦ－ｋｉｔアンモニア（Ｒｏｃｈｅ製）によるＮＨ３の定量を行う。その方法は以下の通りである。
（３）試薬ＩＩ液（Ｆ－ｋｉｔ付属品）１００μｌに上清１０μｌと０．１Ｍトリエタノールアミンバッファー（ｐＨ８．０）１９０μｌを加え、室温で５分間放置後１００μｌを用いての３４０ｎｍの吸光度（Ｅ１）を測定する。残りの２００μｌに、１．０μｌの試薬ＩＩＩ（グルタメートデヒドロゲナーゼ）を加えた後、更に２０分間室温に放置した後に残り２００μｌの３４０ｎｍの吸光度（Ｅ２）を測定する。Ｆ－ｋｉｔに付属のアンモニア標準液を用いて作成したアンモニア濃度と吸光度（３４０ｎｍ）の変化量の関係を表す検量線より、反応液中のアンモニア濃度を求める。
（４）タンパク質濃度の測定は、プロテインアッセイＣＢＢ（クマシーブリリアントブルー）溶液（ナカライテスク）を用い、検出波長５９５ｎｍで測定する。Ｓｔａｎｄａｒｄとして、ＢＳＡ（Ｐｉｅｒｃｅ社製）を用いる。
（５）ＰＧの活性を以下の式により求めた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000001
　本発明において、ＰＧ及びＴＧを改質しようとするタンパク質に添加する時期は、ＰＧのタンパク質への添加時期が、ＴＧの添加時期と実質的に同時である、又はＴＧが該タンパク質に作用する前である。従って、特許文献１に記載されているＴＧ反応をＰＧ添加により停止させる方法は、ＰＧのタンパク質への添加時期がＴＧが該タンパク質に作用する後であるので、本発明には含まれない。尚、ＰＧ及びＴＧのタンパク質への添加時期が実質的に同時であるとは、一連の原料投入工程で、ＰＧとＴＧが投入されることを意味する。すなわち、商業規模の製造においては、原料Ａを投入後、原料Ｂ、原料Ｃ・・・を順に投入するといったように、複数の原料をあらかじめ混合することなく、順番に投入するのが一般的であるが、一連の原料投入工程で、ＰＧとＴＧが投入される限り、本発明の「トランスグルタミナーゼとプロテイングルタミナーゼのタンパク質への添加時期が実質的に同時である」に含まれる。もちろん、ＰＧ、ＴＧを含む複数の原料を予め混合し、添加する場合も、本発明の「実質的同時」に含まれることは言うまでもない。
　ＰＧ，ＴＧを反応させる温度は一般に、３℃～６０℃程度であり、この温度に保持すると約１分～約４８時間程度で両者の反応が進行する。しかし、好ましくは５℃～５０℃程度で約５分～約２４時間程度行うのがよい。食品へのＰＧ、ＴＧの添加方法は、基質となるタンパク質を含む原料にＰＧ、ＴＧのみを添加する、あるいは他の原料とともに添加すればよい。ＰＧとＴＧの添加量は改質するタンパク質の種類、最終製品や目的とする効果に応じて自由に変化させることができるが、例えばＴＧの添加量は、食品原材料中のタンパク質グラム重量当たり、標準的には０．１～１００ユニットである。一方ＰＧは、食品原材料中のタンパク質グラム重量当たり、標準的には０．０１～１２０ユニット添加すればよい。もっとも、両者の上記添加量は目安であり、本発明の所期の効果を奏される限りは必ずしもこれらに限定されるものではない。
　本発明において、タンパク質に作用させるＰＧとＴＧの比率が重要である。ＰＧのタンパク質への添加時期がＴＧの添加時期と実質的に同時である、又はＴＧが該タンパク質に作用する前である場合、タンパク質に添加するプロテイングルターゼとトランスグルタミナーゼの添加量は、活性比においてＰＧ：ＴＧ＝０．０５～３：１、好ましくはＰＧ：ＴＧ＝０．０５～２：１であれば、ＰＧ、ＴＧはともにタンパク質に作用するので、タンパク質を改質することができる。あるいは重量比においてＰＧ：ＴＧ＝０．０１～０．７：１、好ましくはＰＧ：ＴＧ＝０．０１～０．４：１、より好ましくはＰＧ：ＴＧ＝０．０１～０．３：１であれば、ＰＧ、ＴＧはともにタンパク質に作用するので、タンパク質を改質することができる。ＰＧの比率が上記比率よりも大きい場合は、ＰＧの作用がＴＧに比べて効きすぎて併用による効果は発揮されないし、また小さい場合は逆にＰＧの作用が弱すぎて併用効果はあまり期待できない。
　また、タンパク質に添加するプロテイングルタミナーゼとトランスグルタミナーゼの添加量が、ＮＭＲシグナル強度比において、ＰＧ：ＴＧ＝０．２～３．０：１、好ましくは０．２～２．３：１となる条件であれば、ＰＧ，ＴＧの添加時期によらず、ＰＧ、ＴＧはともにタンパク質に作用するので、タンパク質を改質することができる。ＰＧの比率が上記比率よりも大きい場合は、ＰＧの作用がＴＧに比べて効きすぎて併用による効果は発揮されないし、また小さい場合は逆にＰＧの作用が弱すぎて併用効果はあまり期待できない。
　本発明のＮＭＲシグナル強度比は、ＴＧ又はＰＧを同位体標識アンモニウム塩（１５Ｎあるいは１４Ｎ）存在下で、基質タンパク質に作用させ、該タンパク質のグルタミン残基を同位体標識した上で、標識されたタンパク質のＮＭＲスペクトルを測定し、ＮＭＲシグナル強度より算出できる。ＮＭＲの測定法は特に限定されないが、例えば、１５Ｎ標識されたグルタミン残基を検出する場合には、１Ｈと１５Ｎの相関スペクトル、例えばＨＳＱＣスペクトルを測定すれば良い。シグナルが２個以上得られる場合は各シグナル強度の総和をシグナル強度として算出する。すなわち、ＮＭＲシグナル強度比は「ＰＧを作用させた場合のシグナル強度の和」÷「ＴＧを作用させた場合のシグナル強度の和」で表される。標識化合物としてはアンモニウム塩であればよく、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウムなど広く挙げることができる。１５Ｎ標識するのであればアンモニウム塩の窒素が１５Ｎのものを用い、１４Ｎ標識するのであればアンモニウム塩の窒素が１４Ｎのものを用いればよい。標識方法は、水性溶媒中で約ｐＨ３．０～約ｐＨ９．０の範囲、好ましくは約ｐＨ４．０～約ｐＨ８．０の範囲で、温度約４℃～約６５℃の範囲で、更に好ましくは約２５℃～約６０℃の範囲で、標識すべきタンパク質及びアンモニウム塩を保持すればよい。反応時間には特に制限はないが、約３０秒～一週間、より好ましくは約１分～約１日とすればよい。この反応において、標識すべきタンパク質の濃度に対してアンモニウム塩の濃度を約１０倍以上、好ましくは約２００倍以上とすることが好ましく、標識すべきタンパク質の濃度が約１μＭ～約４０ｍＭの範囲で、アンモニウム塩の濃度が約１０μＭ～約１０Ｍの範囲であることがより好ましい。尚、α－ラクトグロブリン、カゼイン、大豆グロブリン、ミオシン、アクトミオシン等食品中に含まれるタンパク質が同位体標識され得るので、本発明のＮＭＲシグナル強度比は、タンパク質を含む食品全般において測定することができる。
　ＴＧ又はＰＧの作用により、タンパク質を同位体標識塩化アンモニウムと反応させた例を示す。α－ラクトアルブミン（α－ｌａｃｔａｌｂｕｍｉｎ，以後α－Ｌａと略す）を基質として用いる場合、基質溶液（１０ｍｇ／ｍｌ　α－Ｌａ、２００ｍＭ　１５ＮＨ４Ｃｌ、５％　Ｄ２Ｏ　／２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．０））を調製し、基質－酵素比が１０００：１となるようＴＧまたはＰＧを添加後、３７℃、２６．５時間インキュベートする。インキュベート後の溶液をＮＭＲサンプル管へ移し、Ｂｒｕｋｅｒ社製Ａｖａｎｃｅ６００等を用いて、１Ｈ－１５Ｎ　ＨＳＱＣ　測定を実施する。カルボキシアミド窒素が１５Ｎ標識されると、１５Ｎに２つの１Ｈが結合しているために、１つの１５Ｎの化学シフトに対して２つのシグナルがペアとして観測される。「ＰＧを作用させた場合のシグナル強度の和」÷「ＴＧを作用させた場合のシグナル強度の和」を算出し、ＮＭＲシグナル強度比とする。
　本発明のタンパク質は、特に制限はされないが、乳タンパク質、乳清タンパク質、大豆タンパク質、小麦グルテン、筋肉タンパク質、プラズマ、コラーゲン、ゼラチンなどが挙げられる。またこれらのタンパク質を２種以上混合したものであってもよい。本発明に該当する食品としては、上記したタンパク質をＰＧ、ＴＧの併用により改質したものを含むものであれば、原料の種類や加工状態は問わない。例えば、殺菌された状態、脱脂した状態、希釈された状態、濃縮された状態、乾燥された状態、その他、様々な加工を施した状態もこれに含まれる。
　次に、本発明の酵素製剤について説明する。本発明のタンパク質改質用酵素製剤は、必須構成成分であるトランスグルタミナーゼ、プロテイングルタミナーゼの配合比率が、活性比においてＰＧ：ＴＧ＝０．０５～３：１、好ましくはＰＧ：ＴＧ＝０．０５～２：１であるものや、重量比においてＰＧ：ＴＧ＝０．０１～０．７：１、好ましくはＰＧ：ＴＧ＝０．０１～０．４：１、より好ましくはＰＧ：ＴＧ＝０．０１～０．３：１であるものや、ＮＭＲシグナル強度比において、ＰＧ：ＴＧ＝０．２～３．０：１、好ましくはＰＧ：ＴＧ＝０．２～２．３：１となる条件であるものであればよく、ＰＧ、ＴＧ以外にこの分野で通常使用されている乳糖、蔗糖、マルチトール、ソルビトール、デキストリン、分岐デキストリン、サイクロデキストリン、澱粉類、多糖類、ガム類、ペクチン等様々の任意成分を配合することもできる。また、動物性タンパク質や、大豆タンパク質、小麦タンパク質などの植物性タンパク質を含有させることもできる。更にまた、重曹、クエン酸ナトリウム、リン酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウムなどの生理学的に許容される無機塩類も必要に応じて本酵素製剤に配合することができる。更にまた、調味料、砂糖、香辛料、着色料、発色剤、アスコルビン酸、その塩類などの有機塩類、乳化剤、油脂なども適宜配合することができる。
　本発明は、プロテイングルタミナーゼとトランスグルタミナーゼの適正添加量比を簡便に見出す方法も含む。すなわち、上述の通り、ＰＧとＴＧをそれぞれ別に同位体標識アンモニウム塩の存在下でタンパク質に作用させ、該タンパク質のグルタミン残基の官能基を同位体標識し、そのＮＭＲシグナル強度を測定し、ＮＭＲシグナル強度比において、プロテイングルタミナーゼ：トランスグルタミナーゼ＝０．２～３．０：１、好ましくは０．２～２．３：１となる条件を見出すことにより、ＰＧとＴＧの適正添加量比を見出すことができる。ＰＧとＴＧのＮＭＲシグナル強度比の上記適正範囲は、基質タンパク質の種類に因らずプロテイングルタミナーゼ：トランスグルタミナーゼ＝０．２～３．０：１、好ましくは０．２～２．３：１であり、ＮＭＲシグナル強度比と各基質タンパク質におけるＰＧとＴＧの適正添加量比（活性比、重量比）との間には相関があるため、ＰＧとＴＧの適正添加量比（活性比、重量比）を多くの実験により試行錯誤を繰り返すことなく、簡単に見出すことができる。
　以下に実験例、実施例を挙げ、本発明をさらに詳しく説明するが、本発明は、これら実施例により何ら限定されるものではない。
実験例１
　α－ラクトアルブミン（α－ｌａｃｔａｌｂｕｍｉｎ，以後α－Ｌａと略す）（Ｓｉｇｍａ製）を基質として用いた。基質溶液（１０ｍｇ／ｍｌ　α－Ｌａ、２００ｍＭ　１５ＮＨ４Ｃｌ、５％　Ｄ２Ｏ／２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．０））を調製し、基質－酵素比が１０００：１となるようＴＧ（味の素「アクティバ」ＴＧからの酵素精製品）またはＰＧ（特許文献１記載のクリセオバクテリウム（Ｃｈｒｙｓｅｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属由来のもの）を添加後、３７℃、２６．５時間インキュベートした。インキュベート後の溶液をＮＭＲサンプル管へ移し、ＮＭＲ（Ｂｒｕｋｅｒ社製Ａｖａｎｃｅ６００）を用い、１Ｈ－１５Ｎ　ＨＳＱＣ測定を実施した。２６．５時間後の１Ｈ－１５Ｎ　ＨＳＱＣ測定を行った結果を図１に示す。カルボキシアミド窒素が１５Ｎ標識されると、１５Ｎに２つの１Ｈが結合しているために、１つの１５Ｎの化学シフトに対して２つのシグナルがペアとして観測される。図１より、α－Ｌａに存在するグルタミン残基のカルボキシアミド窒素のうち一部が１５Ｎ標識されることが判明し、ＰＧによる１５Ｎ標識を示すことに成功した。このように、本方法によって、ＴＧと同様に、ＰＧも脱アミド反応のみならず塩化アンモニウムをグルタミン残基と反応させることができることが示された。尚、ＮＭＲシグナル強度は図１の楕円状のスポットのエリア面積の総和であり、このエリア面積が大きいほど反応量が多いことを示す。
　市販牛乳、０．２Ｍ　１５ＮＨ４Ｃｌ、５％Ｄ２Ｏに実験例１記載のＴＧ又はＰＧをそれぞれ単独で添加して、各添加濃度におけるシグナル強度を算出した。ＴＧは基質／酵素比（Ｓ／Ｅ比）が重量比７４００／１となるように添加した。一方、ＰＧは、重量比でＴＧの０．００２～５倍添加した。用いたＴＧの比活性は酵素タンパク質１ｍｇあたり２６ユニット、ＰＧの比活性は酵素タンパク質１ｍｇあたり１２０ユニットであった。酵素添加後の溶液を３７℃で３時間インキュベートさせた後、ＮＭＲサンプル管へ移し、実験例１記載のＮＭＲを用い、１Ｈ-１５Ｎ　ＨＳＱＣ測定を実施した。ＴＧ添加量を基準とし、それに対するＰＧ添加量をそれぞれの酵素重量比（ＰＧ／ＴＧ）ならびに活性比（ＰＧ／ＴＧ）で表した。そして、それぞれの比に対応するＰＧ／ＴＧシグナル強度比を求めた結果を表１に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　市販牛乳を用いてヨーグルトを調製した。市販牛乳４００ｇを５０℃に加温し、実験例１記載のＴＧ、ＰＧを表２に記載した量添加した。用いたＴＧの比活性は酵素タンパク質１ｍｇ当たり２６ユニット、ＰＧの比活性は１２０ユニットであった。５０℃、９０分の酵素反応を行った後、沸騰浴中でかき混ぜながら加熱した。９０℃に達したら直ちに氷水につけ、４５℃まで冷却させた。２０ｇ（対原料５％）のスターター（明治乳業（株）ブルガリアヨーグルト）を添加し、よくかき混ぜてから４０ｇずつ試飲カップに分注した。
アルミホイルでふたをし、３８℃でｐＨが４．５に低下するまで約３～４時間発酵させた。低温（４℃）で保存し、翌日、物性評価および官能評価を行った。
　物性は、テクスチャーアナライザー（英弘精機製）を用いて破断応力を測定した。１０ｍｍ径円柱型プランジャーを使用し、破断速度は６ｃｍ／ｍｉｎ（１ｍｍ／秒）とした。
その結果を表３に示す。ＴＧのみ添加した比較品Ｔの破断応力は対照品に比べて顕著に増加した。これは、ＴＧによる乳タンパク質の架橋による効果である。本発明品１～４についても、やはり対照品に比べると破断応力は大きく、ＴＧによる破断応力を増加させる効果は損なわれていなかった。しかしながら、比較品Ｔ-Ｐの破断応力は、比較品Ｐとほとんど変わりがなかったことから、ＴＧ反応がＰＧによってほとんど停止し、ＴＧの効果がほとんど現れなかったことが確認された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　官能評価でかたさを６名のパネラーで評価した。対照品を０点としたとき、かたいほど＋５点、やわらかいほど－５点となるよう採点し、平均値を求めた。その結果を表４に示す。対照品に比べ、ＴＧのみ添加した比較品Ｔは顕著に硬さが増加した。本発明品１～４においても、ＴＧによる硬さの増加は保っていた。しかしながら、比較品Ｔ－Ｐのかたさは、比較品Ｐと同様、ヨーグルトを軟化させ、これはＴＧ反応がＰＧによってほとんど停止し、ＴＧの効果がほとんど現れなかったことを意味するものである。本結果は、上で示した物性測定の結果を概ね反映するものである。総合的な食感の好ましさを評価したところ、本発明品１～４では、ＴＧによるヨーグルトの硬さ向上効果を保持しつつ、滑らかさはＴＧのみ添加した場合よりも向上するという好ましい評価結果が得られた。すなわち、ＰＧ、ＴＧの併用効果が確認された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
　タカナシ低脂肪牛乳（乳蛋白３．３％、乳脂肪１．０％）に乳蛋白を３．６％に調整するため、脱脂粉乳（ローヒートタイプ、乳蛋白３５％含有、よつ葉乳業製）を０．８５％添加して、５５℃で加温しながら溶解し、ヨーグルト用原料乳を調製した。該原料乳を沸騰浴中で加熱し、９５℃達温してから２分保持した後、直ちに氷浴中で冷却した。４７℃になったら、乳酸菌スターター（Yo-Flex，DVS YC-370、クリスチャンハンセン製）を０．００６％添加するとともに、ＴＧ、ＰＧを表５記載の通り、添加してよく攪拌した。プラスチックカップに一定量ずつ分注し、ｐＨが４．５～４．６に達するまで４４℃のインキュベーター内で発酵させた。発酵開始から終了まではおおよそ４～５時間要し、発酵終了後は冷蔵庫（５℃）で保存した。翌日、得られたセットタイプヨーグルトの表面離水を観察した。また、ヨーグルトの物性をテクスチャーアナライザー（装置メーカー：Stable Macro System, LTD）により評価した。官能評価は、５名の訓練されたパネルで実施した。ヨーグルトの物性測定条件は、テスト速度１ｍｍ／ｓ、直径１０ｍｍの平板プランジャー、１０％圧縮時の破断応力と付着面積を評価した。破断応力は、ヨーグルトのかたさ、付着面積は、ヨーグルトのクリーミー感と相関が高いことを本発明者らは既に確認している。評価の結果を表６にまとめた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
　表面離水は、対照品と比較品２が多く、また比較品３ではやや多く観察された。比較品１、本発明品１および２では表面離水は見られず表面に艶が合った。一方、物性測定および官能評価結果によれば、比較品１はかたく、もろい寒天様の食感であり、口内に含むと水っぽい感じであった。比較品２、３は対照品よりもかたさが減少し、付着性が増加した。官能評価では、なめらかであるが、やわらかくボディ感に欠けるといったコメントもあった。一方、本発明品１、２はいずれも、かたさと付着性両方が増加し、ボディ感のある、なめらかでクリーミーなヨーグルトであった。以上、外観、物性・食感から総合的に評価すると、本発明品１、２はもっとも好ましいヨーグルトであり、ＴＧとＰＧを適度なバランスで使用することによりセットタイプ低脂肪ヨーグルトの食感改良が可能であることが示された。
　タカナシ低脂肪牛乳（乳蛋白３．３％、乳脂肪１．０％）に乳蛋白を３．９４％に調整するため、脱脂粉乳（ローヒートタイプ、乳蛋白３５％含有、よつ葉乳業製）を添加して、５５℃で加温しながら溶解し、ヨーグルト用原料乳を調製した。該原料乳を沸騰浴中で加熱し、９５℃達温してから２分保持した後、直ちに氷浴中で冷却した。４７℃になったら、乳酸菌スターター（Yo-Flex，DVS YC-370、クリスチャンハンセン製）を０．００６％添加するとともに、ＴＧ、ＰＧを表７記載の通り、添加してよく攪拌した。ステンレスカップに一定量ずつ分注し、ｐＨが４．５～４．６に達するまで４４℃のインキュベーター内で発酵させた。発酵終了後は冷蔵庫（５℃）で冷却した後、メッシュ（２１６μｍ）の篩で濾し取り、スタード化した。出来上がったスタードヨーグルトは５℃で保存し、保存段階において外観および食感の変化を解析することとした。また、ヨーグルトの物性を動的粘弾性測定装置（ＨＡＡＫＥ、レオストレス　ＲＳ１）により評価した。官能評価は、３名の訓練されたパネルで実施した。ヨーグルトの物性測定条件は、直径６ｃｍのコーンプレートを使用し、せん断速度０→１００〔１／ｓ〕を３００秒で増加させた後、直ちにせん断速度を１００→０〔１／ｓ〕に同じ時間かけて減少させるプログラムを作成した。測定温度は、１０℃とし、せん断速度１００〔１／ｓ〕のときの粘度を記録した。結果を表８にまとめた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000009
　スタード化する前の表面離水は、対照品で大量に、また比較品２では少しの量、確認されたが、比較品１、本発明品１～４ではほとんど見られなかった。スタード化した直後の官能評価の結果、対照品はざらつきがあり、水っぽくやわらかい食感であった。比較品１は、ボディ感が付与されているものの、ざらつく食感であったのに対し、比較品２では、表面の艶がありなめらかであるが、水っぽくやわらかい食感であった。本発明品１～４はいずれも表面の艶があり、ボディ感とともに、なめらかさも付与されていた。粘度の測定結果も官能評価とよく一致するものであり、本発明品１～４の粘度は対照品や比較品２に比べると明らかに高く、ボディ感が付与されたことを裏付けるものであった。３週間冷蔵保存後の外観および食感の変化を確認したところ、比較品１はダマが見られ、ざらざらとした砂様の食感が著しかったのに対し、本発明品１ではその傾向が低減、本発明品２～４ではほぼ改善されていた。以上の結果を総合的に評価すると、対照品および比較品１、２と比べ、本発明品１～４は明らかに物性、食感（保存中の変化）の点で優れるものであった。
　このように、ＴＧのみ使用したヨーグルト（比較品１）では、無添加品に比べてボディ感を付与する効果はあるものの、保存中の品質劣化が問題となるし、また、ＰＧのみ使用したヨーグルト（比較品２）ではなめらかであるものの、ボディ感のない水っぽい食感が問題となる。しかしながら、ＴＧとＰＧをある添加比率で併用したヨーグルト（本発明品１～４）ではそれらの問題を解決できるだけでなく、表面の艶やなめらかさを付与することで品質向上が可能であることが示された。
　市販豆乳（タイシ無調整；最終蛋白質含量４．８％）、０．２Ｍ　１５ＮＨ４Ｃｌ、５％Ｄ２Ｏ、実験例１記載のＴＧ又はＰＧをそれぞれ単独で添加しよく混合した。ＴＧは基質／酵素比（Ｓ／Ｅ比）が重量比６０００／１となるように添加した。一方、ＰＧは、ＴＧの０．０１～１倍添加した。３７℃で１時間１５分インキュベートさせた後の溶液をＮＭＲサンプル管へ移し、実験例１記載のＮＭＲを用い、１Ｈ-１５Ｎ　ＨＳＱＣ測定を実施した。実施例１と同様に、それぞれの酵素重量比（ＰＧ／ＴＧ）ならびに活性比（ＰＧ／ＴＧ）について、ＰＧ／ＴＧシグナル強度比を算出した結果を表９に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000010
　表１０に記載した添加比にてＴＧとＰＧを併用した豆腐を調製した。寄せ容器に30％ニガリ（赤穂化成製）溶液を１０ｇ（ニガリ３ｇ相当）、ステンレスジョッキに上記市販豆乳を１ｋｇ量りとり、湯煎で５５℃に加温した。豆乳に酵素溶液を添加して撹拌・混合し、すみやかにニガリの入った寄せ容器に勢いよく注ぎこみ、攪拌板を４回上下させた。フタをして、５５℃のインキュベーターに移し、５０分間静置した。水を張ったバットに豆腐を移し、３０分～１時間放置した後、豆腐を切り分け、豆腐容器に移し、内容重量を測定した。容器にひたひたになるまで水を加え、フィルムを被せて加熱シールした。８５℃の恒温水槽に投入し、４５分間加熱し（２次加熱）、その後、流水で荒熱をとり、氷水中で冷やして冷蔵保存した。翌日、容器内の水を除いて固形物の重量を測定し、物性および官能評価に供した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000011
　物性評価は、レオメーター（不動工業社製）による破断試験を行った。用いたプランジャーは５ｍｍ径円盤、破断速度６ｃｍ／分（１ｍｍ／秒）とした。官能評価は５名のパネラーで酵素無添加品を０点とし、なめらかさとかたさについて±３点の間で７段階評価を行い、平均値を求めた。表１１に結果を示す。ＴＧを添加した、比較品Ｔ１およびＴ２は対照品に比べ破断応力が増加した。一方、ＰＧを添加した比較品Ｐ１およびＰ２は対照品に比べ破断応力が減少した。本発明品１は、同量のＴＧを添加した比較品Ｔ１と破断応力はほぼ同等で、かつ舌ざわりがより滑らかに変化した。本発明品２は、同量のＴＧを添加した比較品Ｔ２と比べ破断応力は若干低下したが、対照品に比べると依然破断応力は大きく、かつ滑らかさも付与されていた。本発明品３は、同量のＴＧを添加した比較品Ｔ２と比べると破断応力は減少したが、同量のＰＧを添加した比較品Ｐ２と比べると破断応力は大きく、ＴＧの添加効果が確認できた。比較品Ｔ-Ｐは、比較品Ｐ１、Ｐ２と同程度にやわらかく、もはやＴＧ反応によるがかたさ付与効果が現れなかった。これは、ＴＧ反応がＰＧによってほとんど停止したことを意味するものである。また、官能評価の結果、本発明品１～３いずれにおいても、ＴＧによるかたさ付与が保持され、かつ、ＴＧ単独添加よりも舌ざわりが向上しており、総合的に好ましい食感が付与されていた。すなわち、ＰＧ、ＴＧの併用効果が確認された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000012
　表１２に示した配合および試作工程にてうどん及び中華麺を調製した。トランスグルタミナーセおよびプロテイングルタミナーゼは、加水時に水に溶解させた。うどん及び中華麺における各々の酵素添加量を表１３に示した。うどんは、麺１００ｇに対して１５倍量のお湯にて２０分間茹で、その後の食感を訓練されたパネル（ｎ＝５）で評価した。中華麺は、茹で時間は５分間とした以外はうどんと同様に評価を行った。対照品を基準として、硬さ、粘り、なめらかさの項目について評価した（明らかに弱くなる：××、やや弱くなる：×、同等：△、やや強くなる：○、明らかに強くなる：◎）。うどん、中華麺の評価結果はほとんど同じ傾向であったので表１４にまとめて示した。うどん、中華麺いずれにおいてもＰＧ／ＴＧ比が重量比において、０．０１、０．０５、０．２（それぞれ本発明品１、２、３）のときに麺の硬さ、粘り、なめらかさがバランスよく付与された食感となった。すなわち、トランスグルタミナーゼとプロテイングルタミナーゼの両方を作用させて両方の好ましい効果を得る適切な比率であることが麺類の例でも示された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000013
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000014
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000015
　本発明によれば、トランスグルタミナーゼ，プロテイングルタミナーゼ各酵素を単独で使用した場合とは異なるタンパク質改質効果を得ることができ、全く新規な特徴を持ったタンパク質食品を製造することができる。また、ＴＧ，ＰＧ両酵素が共に基質に作用する適切な条件を簡便に見出すことができる。従って、本発明は食品分野において極めて有用である。
　なお、前述の特許文献等の各開示を、本書に引用をもって繰り込むものとする。本発明の全開示（請求の範囲を含む）の枠内において、さらにその基本的技術思想に基づいて、実施形態ないし実施例の変更・調整が可能である。また、本発明の請求の範囲の枠内において種々の開示要素の多様な組み合わせないし選択が可能である。すなわち、本発明は、請求の範囲を含む全開示、技術的思想にしたがって当業者であればなし得るであろう各種変形、修正を含むことは勿論である。

Claims (10)

  1. 　プロテイングルタミナーゼ及びトランスグルタミナーゼをタンパク質に作用させてタンパク質を改質する方法において、プロテイングルタミナーゼのタンパク質への添加時期が、トランスグルタミナーゼの添加時期と実質的に同時である、又はトランスグルタミナーゼが該タンパク質に作用する前であるタンパク質の改質方法。
  2. 　タンパク質に添加するプロテイングルタミナーゼとトランスグルタミナーゼの添加量が、活性比において、プロテイングルタミナーゼ：トランスグルタミナーゼ＝０．０５～３：１である請求項１記載の方法。
  3. 　タンパク質に添加するプロテイングルタミナーゼとトランスグルタミナーゼの添加量が、重量比において、プロテイングルタミナーゼ：トランスグルタミナーゼ＝０．０１～０．７：１である請求項１又は２記載の方法。
  4. 　タンパク質に添加するプロテイングルタミナーゼとトランスグルタミナーゼの添加量が、ＮＭＲシグナル強度比において、プロテイングルタミナーゼ：トランスグルタミナーゼ＝０．２～３．０：１となる条件である請求項１乃至３の何れか記載の改質方法。
  5. 　タンパク質が乳タンパク質、乳清タンパク質、大豆タンパク質、小麦グルテン、プラズマ、筋肉タンパク質、コラーゲン及びゼラチンより選ばれる１又は２以上のものである請求項１乃至４の何れか記載の方法。
  6. 　請求項１乃至５の何れか記載の方法にて改質されたタンパク質を含有する食品。
  7. 　トランスグルタミナーゼ：プロテイングルタミナーゼの配合比率が、活性比において、プロテイングルタミナーゼ：トランスグルタミナーゼ＝０．０５～３：１であるタンパク質改質用酵素製剤。
  8. 　トランスグルタミナーゼ：プロテイングルタミナーゼの配合比率が、重量比において、プロテイングルタミナーゼ：トランスグルタミナーゼ＝０．０１～０．７：１であるタンパク質改質用酵素製剤。
  9. 　トランスグルタミナーゼ：プロテイングルタミナーゼの配合比率が、ＮＭＲシグナル強度比において、プロテイングルタミナーゼ：トランスグルタミナーゼ＝０．２～３．０：１となる条件であることを特徴とするタンパク質改質用酵素製剤。
  10. 　トランスグルタミナーゼとプロテイングルタミナーゼをそれぞれ別々に同位体標識アンモニウム塩の存在下でタンパク質に作用させ、該タンパク質のグルタミン残基の官能基を同位体標識し、そのＮＭＲシグナル強度を測定することにより、該タンパク質におけるプロテイングルタミナーゼとトランスグルタミナーゼの適正添加量比を見出す方法。
PCT/JP2009/054792 2008-03-14 2009-03-12 酵素によるタンパク質の改質方法 WO2009113628A1 (ja)

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