WO2009110624A1

WO2009110624A1 - γ－グルタミルシステイン生産酵母及び酵母エキスの製造法

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Publication number: WO2009110624A1
Application number: PCT/JP2009/054364
Authority: WO
Inventors: 西内博章; 末広真理子
Original assignee: 味の素株式会社
Priority date: 2008-03-04
Filing date: 2009-03-02
Publication date: 2009-09-11
Also published as: EP2251413A1; JPWO2009110624A1; EP2251413A4

Abstract

効率的にγ−グルタミルシステインを生産する酵母、及び、γ−グルタミルシステインを蓄積した酵母の製造方法、並びに同酵母を用いた酵母エキスの製造法を提供する。解決手段は、γ−グルタミルシステイン生産能を有し、かつ、セルレニン耐性を有する酵母を育種し、当該酵母を培地中で培養してγ−グルタミルシステインを酵母中に蓄積させた後、温水で抽出して酵母エキスを製造する。

Description

明細書ァーグルタミルシスティン生産酵母及び酵母エキスの製造法技術分野

本発明は、ァーダル夕ミルシスティンを生産する酵母、ァーグル夕ミルシスティンを蓄積した酵母を用いる酵母エキスの製造法、及び当該酵母エキスを含有する飲食品に関するものである。尚、ァーグル夕ミルシスティンは飲食品、医薬品、化成品、特に調味料分野で有用である。背景技術

現在、含硫化合物は、その高い効能から食品、医薬品、化成品などの幅広い分野で使用されている。例えば、グルタミン酸、システィン、グリシンからなるトリべプチドであるダル夕チオン（GSH) は、医薬品としての薬効を有することが知られている。現在、医薬品としての GSH製剤は、解毒剤及び眼科用剤として位置づけられており、各種の中毒、慢性肝臓疾患、抗癌剤の副作用や放射線療法による障害の防止、皮膚疾患および白内障や角膜損傷の治療に用いられている（非特許文献 1 ) 。また、食品用途として、グル夕チオンは食品にコク味を付与する物質であることが知られており（非特許文献 2 ) 、グル夕チオンを高含有する酵母エキスが調味料用途に用いられている。

一方で、含硫化合物の一つであるシスティンは、食品用途として主に食品の風味改善などを目的に用いられている。例えば、システィン及びその酸化型ジスルフィドであるシスチンを含有する電解液に食品を浸漬し、食品の褐変を抑制する方法が開示されている（特許文献 1 ) 。この発明によると、シスチンが還元極においてシスティンに還元され、このシスティンにより酵素的酸化によるキノン類の精製を経た褐色色素の生成が抑制されていると開示されている。

また、動植物タンパク質に含まれる酸化型システィン残基を還元して得られるシスティン残基をパン生地の改良に用いる技術が開示されている（特許文献 2 ) 。更には、肉風味フレーバーの製造方法を開示した特許文献の実施例 1又は 2では、チキン又はポークとシスティンなどを混合して加熱することにより肉風味が高まったと記載されている（特許文献 3 ) 。

このように調味料分野で有用なシスティンの製造方法としては、蛋白分解法や半合成法などが知られており、これらの方法が現在主に用いられている。しかしながら、消費者の近年の天然志向の高まりから、システィンを食品用途で用いる際にこれを高含有量で含有する食品素材の強い要望があるが、システィンを高含有量で含有する食品素材は従来知られていなかった。

本発明者らは、グルタミン酸とシスティンからなるジペプチドであるァ-グルタミルシスティンを高含有する酵母に着目し、同酵母抽出物を一定の条件下で加熱処理又は酵素処理することによりシスティンを高含有する食品素材が調製できることを報告している（特許文献 4 ) 。 ' その他にも、含硫化合物であるァーグルタミルシスティンに糖類を添加して加熱処理することにより、良好なフレーバー組成物が得られることが報告されている（特許文献 5 ) 。或いは、ダル夕チオン、システィン、ダルタミルシスティン等の含硫化合物を 2〜2 0重量％含有する酵母エキスに糖類を加えて脂肪酸非存在下で加熱処理することによりローストミートフレーバー様の調味料が得られることが報告されている（特許文献 6 ) 。

このような利用方法を持つ 7—グル夕ミルシスティンに関して、これまでにいくつかの検討がなされてきたが以下のような 2つの技術改良が必要であると.考えられている。 .

一つは、酵母菌体中のァーダル夕ミルシスティン含有量を上昇させることにより、力価を高めることである。もう一つは、ァーグル夕ミルシスティンを含有する酵母より調製したシスティン含有素材に関するものである。この調製した素材は、システィンを高含有しており食品の風味改善目的に使用可能であるものの、その調製ェ程の特徴からシスティンの他に酵母特有の呈味、香りも有している。その為、このような素材を食品に大量に加えた場合、システィンの効能の他に酵母風味を食品に付与してしまう為、純品のシスティンを食品に添加する場合に比較して、その添加量が制限されてしまうという改良の余地も残されていた。このような背景の下、より酵母特有の呈味ゃ香りを低減させるという技術改良が望まれていた。しかしながら、ァーグル夕ミルシスティンに関する有用性はダル夕チオンと比較して明らかになり始めたばかりであり、これを効率的に生産する手段はあまり検討されてこなかった。現在までの先行知見等は以下のとおりである。

例えば、本発明者らは、ァーグルタミルシスティンとグリシンを基質としてグル夕チオンを生合成するグル夕チオン合成酵素を破壊又は弱化させることにより、ァ一グル夕ミルシスティンを高含有する酵母を取得したことを報告している（特許文献 3、特許文献 7〜 1 0 ) 。これらの技術では、ァーグル夕ミルシスティンからグル夕チオンへの代謝を抑制し、前駆体としてのァーダル夕ミルシスティンを酵母に高含有させることを目的としている。しかし、ァーグル夕ミルシスティンの含有量は 1〜2重量％であり、更に効率化させる余地がある。

また、本発明者等は、ァ一グル夕ミルシスティン産生能を有しパントテン酸要求性の酵母を、パントテン酸含有培地で培養後、パントテン酸を含まない培地で培養することにより、菌体内のァーグル夕ミルシスティンを上昇させる技術を開示している（特許文献 1 1 ) 。同文献では、ァ—ダル夕ミルシスティンを 4 %弱含有した酵母が示されており、ァ—ダル夕ミルシスティンを効率的に生産する手段と考えられる。しかしながら、同酵母に安定的にァーグル夕ミルシスティンを高含有させるためには培養途中のパントテン酸量を制御する必要がある。

さらに、本発明者らは、遺伝子によってコードされる蛋白質の 569位のセリン残基が他のァミノ酸残基に変異した MET30遺伝子産物を保持させることにより、 T— グル夕ミルシスティンの蓄積量と酵母の生育速度を共に満たすことができることを報告している（特許文献 1 2 ) 。

一方で、酵母のセルレニン耐性に関する研究が行われ、少なくとも YAP 1遺伝子（別名として PDR4遺伝子）（非特許文献 3 ) や FAS2遺伝子（非特許文献 4 ) がセルレニン耐性に関与していると報告されている。 YAP 1遺伝子は、 GSH 1遺伝子 (了 —グル夕ミルシスティン合成酵素遺伝子）や GSH2遺伝子.（ダル夕チオン合成酵素遺伝子）の転写因子であることが報告されているが（非特許文献 5 ) 、 YAP 1遺伝子の改変により酵母菌体内の GSH又は" r—グル夕ミルシスティンの含有量がどのように変化するかは確かめられていない。また、 FAS2遺伝子は、脂肪酸合成のサブユニットをコードしており、 FAS 1遺伝子によってコードされる) 3サブュニッ卜と 6量体を形成している（非特許文献 6)。このような脂肪酸合成酵素遺伝子である FAS2遺伝子遺伝子の変異によっても酵母にセルレニン耐性が付与されることから、必ずしもセルレニン耐性によってァーグル夕ミルシスティン含有量が変化するともいえない。更に、セルレニン耐性酵母を清酒生産に利用しようとの報告（特許文献 13) はあるが、ァーダル夕ミルジスティン生産能がある酵母、特にグル夕チオン合成酵素活性が低下又は消失した酵母にセルレニン耐性を付与したとの報告はない。

また、このようなセルレニン耐性を有する酵母由来の酵母エキスがどのような呈. 味、香りを有するかについても報告はない。

特許文献 1

特開平 1 0-136883号公報

特許文献 2

WO 93/08274

特許文献 3

EP 01 36428

特許文献 4

WO 00/30474

特許文献 5

特許第 283041 5

特許文献 6

特許第 2903659

特許文献 7

WO 0 1/0903 10

特許文献 8

特開 2003— 159048

特許文献 9

特開 2003— 1 59049

特許文献 10

WO 2003/080832

特許文献 1 1 特開 20 04— 2 0 1 67 7

特許文献 1 2

特開 20 04— 1 1 3 1 5 5

特許文献 1 3

特開平 8 - 2 3 9 54

非特許文献 1

蛋白質核酸酵素 1988-7 VOL.33 NO.9 ISSN 003909450臨時増刊「グル夕チオン研究のエポック」 pl626

非特許文献 2

Y. Ueda et al. , Biosci. Biotech. Biochem. , 61, 1977-1980 (1997)

非特許文献 3

Nobusige Nagazawa et al. , Journal of Fermentation and Bioengineering Vol. 76, No 1, 60-63, 1993

非特許文献 4

Kazuo Aritomi et al. , Biosci. Biotechnol. Bochem. , 68(1)， 206-214, 2004 非特許文献 5

Sugiyama et al. , Journal of Biological Chemistry (2000), 275 (20), 15535- 15540

非特許文献 6

Schweizer, E. In Ratledge, C. and Wi lkinson, S. G. (eds) , Microbial Lipids. Academic Press, London and New York, Vol.2, p3-50 (1989) 発明の開示

本発明は、効率的にァーグル夕ミルシスティンを生産する酵母を提供すること、ァーグル夕ミルシスティンを蓄積した酵母を用いる酵母エキスの製造法を提供すること、及び当該酵母エキスを含有する風味、呈味良好な飲食品を提供することを課題とする。

本発明者らは鋭意検討を行った結果、ァーダル夕ミルシスティン生産能を有し、かつ、セルレニン耐性を有する酵母が、安定的かつ効率的にァ—ダル夕ミルシステインを生産することができることを見出し、本発明を完成するに至た。

すなわち本発明は以下のとおりである。

(1) ァ—グルタミルシスティン生産能を有し、かつ、セルレニン耐性を有する酵母。

(2) 10 M以上のセルレニンに耐性を有する（1) 記載の酵母。

(3) 変異型 FAS 2遺伝子を有することにより 10； uM以上のセルレニンに耐性となった（2) 記載の酵母

( 4 )変異型 FAS 2遺伝子が配列表の配列番号 5の天然型 FAS 2遺伝子によりコードされるタンパク質の 1475番目のアミノ酸がリジン及び又は 1800番目のァミノ酸がァスパラギンである（3) 記載の酵母

(5) ァーグル夕ミルシスティン生産能が細胞内のグル夕チオン合成酵素活性が低下又は消失するように改変することで得られたものである（1) 〜（4) のいずれか一項に記載の酵母。

(6) 酵母がサッカロマイセス属に属する（1) 〜（5) のいずれか一項に記載の酵母。

(7) 酵母がサッカロマイセス ·セレビシェであることを特徴とする（6) 記載の酵母

(8) (1)〜（7)のいずれか一項に記載の酵母を培地中で培養することにより、ァーグル夕ミルシスティンを酵母中に蓄積させた酵母の製造法。

(9) ( 1) 〜（7)のいずれか一項に記載の酵母を培地中で培養することにより、ァ—グル夕ミルシスティンを酵母中に蓄積させた後、酵母中の内容物を抽出して得られる酵母エキスの製造法。

(10) ァ—グルタミルシスティンを酵母中に蓄積させた後、低温で菌体洗浄を行つた後、酵母中の内容物を抽出して得られる（9) 記載の酵母エキスの製造法。 (1 1) (9) 又は（10) 記載の酵母エキスを更に、加熱又は酵素処理に付すことにより、酵母エキス中のァ—ダル夕ミルシスティンの一部又は全てをシスティンに変換させた酵母エキスの製造法。

(12) 酵母エキス固形分当たりのシスティン含量が 3. 5%以上、塩基性ァミノ酸含量が 1. 0%以下である（1 1) 記載の酵母エキスの製造法。 (1 3) (9) 〜（12) のいずれか一項に記載の酵母エキスを飲食品原料に混合し、次に、加工して得られる飲食品。

(14) ァーグル夕ミルシスティンを酵母中に蓄積させた後、低温で菌体洗浄を行つた後、酵母内容物を抽出して得られる酵母エキスを製造する工程において、 2段階の異なる温度領域で加熱することによりエキス分を抽出する工程を含むことを特徴とする（9) 記載の酵母エキスの製造方法。

( 15) 2段階の異なる温度領域で加熱することによりエキス分を抽出する工程が、 1段階目の抽出温度が 25-6 であり、 2段階目の抽出温度が 65~99でであることを特徴とする（14) 記載の酵母エキスの製造方法。

本発明の酵母は、効率的にァーダル夕ミルシスティンを生産することができる。特に、好適な形態では、高密度で培養した場合、経時的なァーグル夕ミルシスティンの蓄積量の上昇が、セルレニン耐性を有さない酵母に比べて良好である。さらに、本発明の酵母由来の酵母エキスは、酵母特有の呈味ゃ香りが少ない為食品の風味改良素材にも適している。

'

図面の簡単な説明

図 1は、酵母の培養時間とァーダル夕ミルシスティン含有量との関係を示す図である。

図 2は、酵母の培養時間とァーダル夕ミルシスティン含有量との関係を示す図である。 .

図 3は、酵母菌体洗浄中の上清 B r i x変化を示す図である。

図 4は、酵母菌体ブロス中の溶存気体量を測定する実験方法を示す図である。図 5は、 ΑΠ4800株（セルレニン非耐性株）の 2段階抽出によるエキス分抽出率を示す図である。

図 6は、 ΑΠ4892株（セルレニン耐性株）の 2段階抽出によるエキス分抽出率を示す図である。発明を実施するための最良の形態

<1>本発明の酵母本発明の酵母は、ァーグル夕ミルシスティン生産能を有し、かつ、セルレニン耐性を有する酵母である。本発明の酵母は、ァーグル夕ミルシスティン生産能を有する酵母にセルレニン耐性を付与することにより取得することができる。また、本発明の酵母は、セルレニン耐性を有する酵母にァ—グル夕ミルシスティン生産能を付与するか、あるいは、セルレニン耐性を有する酵母の r—グル夕ミルシスティン生産能を高めることによつても取得することができる。また、本発明の酵母は、ァーグル夕ミルシスティン生産能を有する酵母の FAS2遺伝子を変異させることによつても取得することができる。

本発明において、「ァ—グル夕ミルシスティン生産能を有する」とは、ァ—ダル夕ミルシスティンを生産し、菌体内に蓄積する能力を有することをいい、好ましくは、酵母野生株よりも多量のァーグル夕ミルシスティンを菌体内に蓄積することをいう。より好ましくは、本発明の酵母を最小培地で培養したとき、その対数増殖期に、乾燥酵母菌体当たり 1重量％以上、さらに好ましくは 1 . 4重量％以上のァ— グル夕ミルシスティンを蓄積することをいう。また、乾燥酵母菌体当たりのダル夕チオン蓄積量が 0 . 1重量％以下であることが好ましい。

本発明の酵母は、ァ一ダル夕ミルシスティン生産能を有する限り特に制限されなレ。サッカロマイセス .セレピシェ等のサッカロマイセス属、キャンディダ .ュティリス等のキャンディダ属、ピピア ·パストリス等のピピア属、シゾサッカロマイセス ·ボンべ等のシゾサッカロマイセス属等を例示することができる。上記の酵母の中では、ァーグル夕ミルシスティン生産能を向上させる技術、例えばグル夕チォン合成酵素の破壊や弱化の方法が知られており、さらにァ—グル夕ミルシスティン合成酵素遺伝子がクローニングされているものが、本発明の酵母を構築する上で好適である。そのような酵母として、サッカロマイセス ·セレビシェゃキャンディダ •ュティリスが好ましい。

ァーダル夕ミルシスティン生産能を有する酵母としては、例えば、細胞内のグル夕チオン合成酵素活性が低下又は消失した酵母、もしくは、ァーグル夕ミルシステイン合成酵素活性が増強されるように改変された酵母、又は、細胞内のグルタチォン合成酵素活性が低下又は消失し、かつ、ァーグル夕ミルシスティン合成酵素活性が増強されるように改変された酵母が挙げられる。細胞内のグル夕チオン合成酵素活性が低下又は消失した酵母は、例えば、グル夕チオン合成酵素をコードする遺伝子（GSH2) の部分配列を欠失し、正常に機能する酵素を産生しないように改変した遺伝子、又は酵素活性が低下するような変異を有する遺伝子（以下、単に「変異型 GSH2遺伝子」という）を含む D N Aを用いた遺伝子置換により創製することができる。また、細胞内のグル夕チオン合成酵素活性が低下又は消失した酵母は、実施例に記載したのと同様に、野生型酵母を、通常の変異処理、例えば UV照射、あるいは N—メチル—N—ニトロソグァ二ジン（NTG) 、ェチルメタンスルホネート（EMS) 、亜硝酸、ァクリジン等の変異剤による処理によつて、取得することもできる。得られた変異株が目的の変異を有していることは、例えば P C R法等により確認することができる。

前記のようなグル夕チオン合成酵素活性が低下するような変異としては、例えば、 370位のアルギニン残基を終止コドンに変更する変異が挙げられる（配列表の配列番号 1及び 2参照）。

また、グル夕チオン合成酵素活性が低下する他の変異としては以下の変異が挙げられる（国際公開 0 3 / 0 4 6 1 5 5号パン.フレット参照）。

( 1 ) 4 7位のスレオニン残基をイソロイシン残基に置換する変異（配列表の配列番号 1及び 2参照）。

( 2 ) 3 8 7位のグリシン残基をァスパラギン酸残基に置換する変異（配列表の配列番号 1及び 2参照）。

( 3 ) 5 4位のプロリン残基がロイシン残基に置換する変異（配列表の配列番号 1 及び 2参照）。 -'

上記変異は、少なくとも（1 ) または（2 ) を含む限り、単独でも、任意の組合せでもよいが、（1 ) と（3 ) の組合せ、及び（2 ) と（3 ) の組合せが好ましい。グル夕チオン合成酵素遺伝子への目的の変異の導入は、合成オリゴヌクレオチドを用いた部位特異的変異法によって行うことができる。

前記遺伝子置換は、以下のようにして行うことができる。変異型 GSH2遺伝子を含む組換え D N Aで酵母を形質転換し、変異型 GSH2遺伝子と染色体上の GSH2遺伝子との間で組換えを起こさせる。その際、組換え D N Aには、宿主の栄養要求性等の形質にしたがって、マーカ一遺伝子を含ませておくと操作がしゃすい。また、前記組換え D N Aは、制限酵素で切断する等により直鎖状にし、さらに、酵母で機能する複製制御領域を除いておくと、染色体に組換え D N Aが組み込まれた株を効率よく取得することができる。

酵母の形質転換は、プロトプラスト法、 K U法、 K U R法、エレクトロボレ一シヨン法等、通常酵母の形質転換に用いられる方法を採用することができる。

上記のようにして染色体に組換え D N Aが組み込まれた株は、変異型 GSH2遺伝子と染色体上にもともと存在する GSH2遺伝子との組換えを起こし、野生型 GSH2遺伝子と変異型 GSH2遺伝子との融合遺伝子 2個が組換え D N Aの他の部分（ベクター部分及びマーカ一遺伝子）を挟んだ状態で染色体に挿入されている。

融合遺伝子 2個のうち、変異型 GSH2遺伝子のみを残すために、 2個の GSH2遺伝子の組換えにより 1コピーの GSH2遺伝子を、ベクタ一部分（マーカー遺伝子を含む）とともに染色体 D N Aから脱落させる。その際、野生型 GSH2遺伝子が染色体 D N A 上に残され、変異型 GSH2遺伝子が切り出される場合と、反対に変異型 GSH2遺伝子が染色体 D N A上に残され、野生型 GSH2遺伝子が切り出される場合がある。いずれの場合もマーカ一遺伝子が脱落するので、 2回目の組換えが生じたことは、マーカ —遺伝子に対応する表現形質によって確認することができる。また、目的とする遺伝子置換株は、 PCRにより GSH2遺伝子を増幅し、その構造を調べることによって、選択することができる。

尚、遺伝子置換に用いる変異型 GSH2遺伝子は、ダル夕チオン合成酵素タンパク質全長をコードするものであってもよいが、欠失部位を含む限り、タンパク質の一部をコードする遺伝子断片であってもよい。

サッカロマイセス ·セレピシェのダル夕チオン合成酵素遺伝子（GSH2) は塩基配列が報告されており（Inoue e t al.， B iochim. B iophys. Ac ta, 1395 (1998) 315- 320、 GenBank access ion Y13804、配列番号 1 ) 、同塩基配列に基づいて作製したォリゴヌクレオチドをプライマーとする PCRにより、サッカロマイセス ·セレピシェ染色体 D N Aから取得することができる。また、導入する遺伝子は、サッカロマイセス属以外の微生物に由来する遺伝子を用いることができる。

本発明に用いる変異型 GSH2遺伝子は、前記 4 7位、 3 8 7位、 5 4位の変異以外に、配列表の配列番号 2に示すアミノ酸配列において、 1又は数箇所の位置における 1又は数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入又は付加を含むアミノ酸配列を有する GSH2産物をコードするものであってもよい。ここで、「数個」とは、アミノ酸残基のタンパク質の立体構造における位置や種類によっても異なるが、具体的には例えば、前記「数個」は、 2〜10個、好ましくは、 2〜6個、より好ましくは 2〜 3 個である。あるいは、変異型 GSH2遺伝子は、 GSH2産物のアミノ酸配列全体に対し、好ましくは 70 %以上、より好ましくは 80 %以上、さらに好ましくは 90 %以上、特に好ましくは 95 %以上の相同性を有するタンパク質をコードする DN Aであつてもよい。

また、上記のような塩基の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位等には、 GSH2遺伝子を保持する微生物の個体差、種ゃ属の違いに基づく場合などの天然に生じる変異 utant又は variant) も含まれる。

尚、 GSH2遺伝子を破壊する場合は、遺伝子置換に用いる変異型 GSH2遺伝子は必ずしも全長を含む必要はなく、遺伝子破壊を起こすのに必要な長さを有していればよい。また、 GSH2遺伝子の取得に用いる微生物は、同遺伝子が、遺伝子破壊株の創製に用いる微生物の相同遺伝子と相同組換えを起こす程度の相同性を有していれば特に制限されない。

前記サッカロマイセス 'セレピシェの GSH2遺伝子と相同組換えを起こし得る DN Aとして具体的には、配列表の配列番号 1に示す塩基配列を有する DN Aと、例えば 70%以上、好ましくは 80%以上、より好ましくは 90 %以上、特に好ましくは 95 %以上の相同性を有する DNAが挙げられる。より具体的には、配列番号 1 に示す塩基配列を有する DN Aと、ス卜リンジェン卜な条件下でハイブリダィズする DNAが挙げられる。ストリンジェン卜な条件としては、 60t:、 1 XS SC, 0. 1 %SDS、好ましくは、 0. 1 XSSC, 0. 1 % S D Sに相当する塩濃度で洗浄が行われる条件が挙げられる。

また、グル夕チオン合成酵素活性が低下又は消失した酵母は、実施例に記載したのと同様に、野生型酵母を、通常の変異処理、例えば UV照射、あるいは N—メチル —N—ニトロソグァ二ジン（NTG) 、ェチルメタンスルホネート（EMS) 、亜硝酸、ァクリジン等の変異剤による処理によって、取得することもできる。

また、酵母細胞内のァ一ダルタミルシスティン合成酵素活性を増強する方法としては、同酵素遺伝子（GSH1) (例えば、 Saccharomyces cerevisiaeのァーグル夕ミルシスティン合成酵素遺伝子： GenBank Accession No. D90220) を挿入したプラスミドで酵母を形質転換し、同遺伝子の細胞内のコピー数を高めるか、染色体：のァ一グル夕ミルシスティン合成酵素遺伝子のプロモーターを強転写プロモーターで置換する方法（大竹康之ら、バイオサイエンスとインダストリ一、第 50巻第 10号、第 989〜994頁、 1992年）が挙げられる。ァーグル夕ミルシスティン合成酵素遺伝子としては、キャンディダ ·ュティリスのグルタチオン合成酵素をコードする遺伝子も知られており（特開 200 5— 0 7 36 38) 、本発明に使用することができる。

細胞内の r一グル夕ミルシスティン合成酵素活性及びグル夕チオン合成酵素性は、それぞれ、 Jacksonの方法 (Jackson, . C. , Biochem. J., Ill, 309 (1969) ) 、及び Gushimaらの方法 (Gushima, T. et al. , J. Ap l. Biochem. , 5, 210 (1983)) によって測定することができる。

また、 MNNG耐性の付与（特開 2 003 - 1 59 048) 、変異型 MET 30 遺伝子を保持させること（特開 20 04 - 1 1 3 1 5 5) 、 MET 2 5遺伝子発現を脱抑制させること（特開 2 0 04— 20 1 67 7) 、パントテン酸要求性を付与すること（特開 2004- 2 0 1 6 7 7) によって、酵母のァーグル夕ミルシスティン生産能を向上させること、あるいは酵母に好ましい性質を付与することができる。

本発明の酵母は、上記のようなァ—グル夕ミルシスティン生産能を有し、かつ、セルレニン耐性を有するように改変された酵母菌株である。本発明において「セルレニン耐性を有する」とは、酵母の非改変株、例えば野生株、又は本発明の酵母の取得に用いる親株が増殖できない濃度のセルレニンを含む培地で増殖できることをいう。具体的には例えば、セルレニンを含む YPDプレート等の寒天培地に酵母懸濁液を広げ、好適な温度、例えば 3 0でで培養したときに、非改変株がコロニーを形成せず、改変株がコロニーを形成すれば、同改変株はセルレニン耐性を有する。ここで、「コロニー」とは、肉眼により確認できるコロニーをいう。

(YPD培地組成) グルコース 2 %

ぺプ卜ン 2 %

酵母エキス 1 %

(pH5. 0)

(寒天培地の場合寒天 2 % ) 酵母がサッカロマイセス ·セレビシェである場合、より具体的には、酵母を YPD 培地に植菌し、生育至適温度、例えば 3 0でで 3日間培養した培養液を、ある濃度のセルレニンを含む YPDプレートに広げ、生育指摘温度で培養したときに、 5日以内にコロニーを形成すれば、前記酵母はその濃度のセルレニンに耐性を有する。セルレニン耐性を付与されるように改変されていないサッカロマイセス 'セレピシェ、例えば実施例に記載の ΑΠ4800株では、少なくとも 7 のセルレニンを含む YPD プレートでは、 3日以内にほとんどコロニーを形成しない。本発明の酵母は、好ましくは 1 0 以上、より好ましくは 1 5 M以上、特に好ましくは 2 0 Λ Μ以上のセルレニンに耐性を有することが好ましい。

セルレニン耐性を有する酵母は、例えば、酵母の野生株又はァーグルタミルシスティン生産能を有する酵母を変異処理し、野生株が生育できない濃度のセルレニンを含む寒天培地に接種し、コロニーを形成する株を選択することによって、取得することができる。また、こうして取得された株の培養液を再度セルレニンを含む寒天培地に広げ、コロニー形成能を有する株を選択する操作を、 2回又はそれ以上繰返してもよい。さらに、取得されたセルレニン耐性を有する酵母を、再度変異処理し、前記選択操作を行ってもよい。変異処理としては、グル夕チオン合成酵奉活性が低下又は消失した酵母について記載したのと同様に、通常の変異処理、例えば UV 照射、あるいは Ν—メチル一Ν—ニトロソグァ二ジン（NTG) 、ェチルメタンスルホネート（EMS) 、亜硝酸、ァクリジン等の変異剤による処理が挙げられる。

また、セルレニン耐性を有する酵母は、変異処理を行わず、野生株から上記と同様にしてセルレニンを含む培地で培養することによつても、自然変異株として取得することができる。

本発明の酵母は、前記セルレニン耐性を有する酵母の中で変異型 FAS2遺伝子を有することによってセルレニ耐性となった酵母を含む。変異型 FAS2遺伝子を有するとは、野生型 FAS2遺伝子によってコードされるタンパク質のアミノ酸配列にセルレニン耐性を与えるような変異が入ることを意味する。一例として、サッカロマイセス ·セレピシェが有する配列表の配列番号 5、 6記載のアミノ酸配列において、 1 300番目のアミノ酸から 1 3 0 5番目のアミノ酸よりなる TPVGACという配列部位にセルレニンが結合し（Hiroshi Funabashi et al, J. Biochem. 105, 751-755 (1 989))、 FAS2遺伝子によってコードされるタンパク質の活性を阻害することが知られている。このアミノ酸配列特に、 1 305番目のシスティン残其にセルレニンが直接結合することから、この部位に変異が入るとセルレニン耐性を与えると考えられている。また、キャンディダ 'アルビカンスが有する FAS2遺伝子によってコードされるタンパク質も同様に TPVGACというアミノ酸配列を有する（Susan B. Southar d et al, Gene, 156 (1995) 133 - 138)ことが知られている。この他にも、配列番号 5 及び 6記載のアミノ酸配列において、 1 250番目のグリシンがセリン、ァラニン、またはシスティンに変化する変異（Kazuo ARITOMI et al， Biosci. Biotechnol. Bi ochem. ， 68 (1), 206-214 (2004) )を例示することができる。更には、 1 47 5番目のグルタミン酸がリジンに変化する変異、 1 800番目のセリンがァスパラギンに変化する変異も例示することができる。

この様に、変異型 FAS2遺伝子は、野生型 FAS2遺伝子によってコードされるタンパク質のアミノ酸配列にセルレニン耐性を付加する変異であれば特に制限されない。特に、配列表の配列番号 5記載のアミノ酸配列において 1 250番目のグリシン、

1305番目のシスティン、 141 7番目のセリン、 1475番目のグルタミン酸、 1800番目のセリンがその他のアミノ酸への変異が好ましい。

例えば、 1 2 50番目のダリシンのセリン、ァラニン、又はシスティンへの変異、

1475番目のグルタミン酸のリジンへの変異、 1800番目のセリンのァスパラギンへの変異が好ましい。 1475番目のグルタミン酸のリジンへの変異、及び又は 1800番目のセリンのァスパラギンへの変異を導入するのがより好ましい。更に、 1475番目のグルタミン酸のリジンへの変異、及び、 1 800番目のセリンのァスパラギンへの変異を両方導入するのが最も好ましい。

なお、本発明の変異型 FAS2遺伝子は、配列番号 5に示すアミノ酸配列において、 1又は数箇所の位置における 1又は数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入又は付加を含むアミノ酸配列を有するものであってもよい。ここで、「数個」とは、アミノ酸残基のタンパク質の立体構造における位置や種類によっても異なるが、具体的には例えば、前記「数個」は、 2〜2 0個、好ましくは、 2〜 1 0個、より好ましくは 2〜 5個である。

また、変異型 FAS遺伝子は、セルレニン耐性に寄与する限り、通常の野生型遺伝子と共存しても構わない。

本発明の酵母は、 1倍体でもよいが、 2倍性またはそれ以上の倍数性を有することが、生育が良好である点で好ましい。 2倍性またはそれ以上の倍数性を有する酵母は、倍数性を有する酵母を変異処理しァーグル夕ミルシスティンを生産する株を選択すること、或いはァ—グル夕ミルシスティン生産株の育種に用いた 1倍体酵母と、野生型酵母の 1倍体を接合させ、得られた 2倍体酵母を胞子形成させ、ァーグル夕ミルシスティンを生産する株を選択し、相異なる接合型を有するァ一ダルタミルシスティン生産 1倍体酵母 2株を接合させることによって、取得することができる。同様にして、 3倍性又はそれ以上の倍数性を有する酵母を取得することができる。

上記のような酵母の育種、改変に関する操作は、「化学と生物実験ライン 31 酵母の実験技術」初版廣川書店；「バイオマニュアルシリーズ 10 酵母による遺伝子実験法」初版、羊土社、「METH0DS in YEAST GENETICS 2000 Ed i t ion] Co l d S pr ing Harbor Labora tory Press等に記載されている。

上記のように、セルレニン耐性を有する酵母は、効率的にァーグル夕ミルシステインを生産する。したがって、セルレニン耐性を指標として、ァ—グル夕ミルシスティンを効率よく産生する菌株をスクリーニング又は育種することができる。

< 2〉本発明の酵母の利用

本発明の酵母を培地で培養することにより、ァーグル夕ミルシスティンを菌体内に蓄積した酵母、及びその培養物、更には酵母エキスを製造することができる。本発明の酵母の培養に用いる培地は、本発明の酵母が良好に生育し、かつ、ァーグル夕ミルシスティンを効率よく産生するものであれば特に制限されず、通常、ェ業的に用いられる培地を用いることができる。尚、必要に応じて、用いる酵母の形質にしたがって必要な栄養素を培地に添加する。

例えば、パン酵母では、対数増殖期又は定常期まで培養した培養液を、 2 %となるように栄養培地に接種し、 2 5 t：〜 3 5でで 8〜2 4時間、振とう培養すれば、対数増殖期の菌体が得られる。

目的とするァ—グル夕ミルシスティン蓄積量に達したら、培養を終了する。通常は、好適な条件下では、培養時間は 10〜30時間、好ましくは 15~27時間である。本発明においては、培養の形態として、高密度培養を採用することができる。本発明において「高密度培養」とは、液体培養における細胞密度が、 1 X 1 0 ⁸個細胞/ m l以上、好ましくは 2 . 5 X 1 0 ⁸個細胞 1以上、より好ましくは 4 X 1 0 ⁸個細胞 Zm 1以上であることをいう。あるいは、液体培養における菌体乾燥重量が、 1 g Z l 0 0 m 1以上、好ましくは 2 . 5 g / 1 0 O m 1以上、より好ましくは 4 g Z l 0 O m 1以上である場合も、高密度培養に含まれる。培養の全期間が高密度培養である必要はなく、少なくとも一部の期間において前記細胞密度に達していればよい。例えば、培養期間の 1 %以上、好ましくは 5 %以上、より好ましくは 1 0 %以上で、前記細胞密度に達していることが好ましい。

本発明の酵母は、高密度培養において、経時的に菌体当りのァーダル夕ミルシスティン含有量が上昇する。セルレニン耐性を有さない従来のァ—グル夕ミルシスティン酵母も、高密度培養でァーダルタミルシスティン含有量は上昇するものがあるが、培養期間の経過と共にァーグル夕ミルシスティン含有量の上昇が頭打になる傾向がある。それに対して、本発明の酵母は、好的な形態では、従来の酵母に比べてァ—グル夕ミルシスティン含有量の上昇が顕著である。

上記のようにして得られる培養物又はその分画物は、ァーグルタミルシスティンを含有する。培養物は、酵母菌体を含む培養液であってもよいし、それから採取された酵母菌体、菌体破砕物、又は菌体抽出物（酵母エキス）であってもよい。また、菌体破砕物又は酵母エキスから、ァーグル夕ミルシスティンを含む画分を得てもよい。

上記酵母菌体を含む培養液から、酵母菌体を分離 ·洗浄する場合は、低温で行うことが好ましい。低温とは、酵母を培養するときの温度より低い温度を意味する。即ち、培養温度が 30でであれば、 30T:未満を意味する。より好ましくは、 20T:以下、更に好ましくは 16で以下、最も好ましくは 10で以下である。なお、あまりに低い温度帯では培養液が凍結してしまい菌体の分離が進行しない為、培養液が凍結しない温度が下限になることは言うまでもない。菌体洗浄に水を用いる場合は、温度下限は 0でより高い温度に設定する必要がある。

培養液からの酵母菌体の分離は、通常の方法を用いることができる。遠心分離、膜分離、フィル夕一プレス、デカンテ一シヨンなどを例示できるが、操作性の観点から遠心分離が好ましい。

酵母エキス等の調製は、通常の酵母エキスの調製と同様にして行えばよい。即ち、酵母菌体を抽出又は消化してものから得ることができる。抽出する場合は、酵母菌体 (場合により酵母菌体を含む培養液）を熱水抽出する。酵母菌体の熱水抽出の条件は、通常 5 0〜 9 9で、好ましくは 6 0〜 9 5で、より好ましくは 6 5〜9 0でである。

また、上記ァーグル夕ミルシスティンを含む酵母エキスを加熱又は酵素処理に付すことにより、ァーダル夕ミルシスティンの一部又は全てをシスティンに変換させることができる。この場合の加熱条件は特に制限はないが、通常 5 0〜 1 2 0でで 3 ~ 3 0 0分加熱すればよい。また、酵素処理に付す場合は、 7—グル夕ミルぺプチド加水分解酵素で処理すればよい。尚、ァーグル夕ミルペプチド加水分解酵素としては、具体的にグル夕ミナーゼ、ァーダル夕ミルトランスフェラ一ゼ、ァ一グル夕ミルシクロトランスフェラ一ゼ等が使用できる。上記酵素を 1又 2種以上組み合わせて使用すればよい。

また、セルレニン耐性を有する酵母菌体を熱水抽出する際は、 2段階の異なる温度領域で加熱すること、すなわち、低い温度領域で加熱しその後高い温摩領域で加熱することにより、エキス分の抽出率を向上させることができる。低い温度領域と高い温度領域に 5で以上の温度差があればよい。低い温度領域は 2 5〜6 0 °Cであることが好ましく、 2 5〜5 5でであればより好ましく、 3 5〜5 5 °Cであることが更に好ましい。高い温度領域は、 6 5〜9 9 °Cであることが好ましく、 6 5〜9 5 °Cであればより好ましく、 7 0〜9 0でが更に好ましい。低い温度領域では一定時間加熱すればよく、通常 2 0秒以上、好ましくは 2分以上、より好ましくは 2 0 分以上加熱すればよい。加熱時間が長くなるほどより効果が顕著に見られるが、あまりに長時間加熱した場合汚染微生物が増殖する危険性があるため好ましくない。加熱時間はこれらを考慮して設定できるが、一例として加熱時間の上限として 1 5 時間と設定することもできる。高い温度領域でも一定時間加熱すればよく、例えば 3 0秒〜 2 0分、好ましくは 1分〜 2 0分、より好ましくは 1分〜 1 5分、更に好ましくは 2〜 1 0分である。

ァーグル夕ミルシスティンを含む酵母エキスを加熱又は酵素処理して得られる酵母エキスの中でも、特に、酵母由来のエキス固形分当たりのシスティン含量が 3. 5% 以上、塩基性アミノ酸含量が 1. 0%以下のものは酵母特有の呈味、香りが少なく、好ましい。尚、本発明において、塩基性アミノ酸とは、ヒスチジン、アルギニン、リジンを意味する。より好ましくは、酵母由来のエキス固形分あたりのシスティン含量が 3. 5%以上、塩基性アミノ酸含量が 0. 8%以下のものがよく、更に好ましくは酵母由来のエキス固形分あたりのシスティン含量が 3. 5%以上、塩基性アミノ酸含量が 0. 6%以下のものがよい。

上記ァ—グル夕ミルシスティン又はシスティンを含む酵母エキス、本発明の 7— グル夕ミルシスティン高生産能の酵母を培養して得られる培養物及びその分画物は、飲食品の製造に用いることができる。即ち、上記ァ—ダル夕ミルシスティン又はシスティンを含む酵母エキス、本発明のァ—ダル夕ミルシスティン高生産能の酵母を培養して得られる培養物及びその分画物を単独又は組み合わせて飲食品原料に混合し、加熱等の加工処理を行えばよい。飲食品としては、アルコール飲料、パン食品、又は発酵食品調味料等の飲料又は食品が挙げられる。尚、熱処理によるァ一グル夕ミルシスティンからシスティンの生成は、飲食品の製造中、又は製造の後に行われてもよい。

上記飲食品はァ—グル夕ミルシスティン又はシスティンを含む酵母エキス、本発明のアーダル夕ミルシスティン高生産能の酵母を培養して得られる培養物及びその分画物を単独又は組み合わせて食品原料に混合し、飲食品に加工することによって製造される。本発明の飲食品は、前記、酵母エキス、培赛物、分画物を使用すること以外は、通常の飲食品と同様の原料を用い、同様の方法によって製造することができる。，このような原料としては、例えばアルコール飲料では、米、大麦、コーンス夕一チ等、パン食品では小麦粉、砂糖、食塩、バター、発酵用酵母菌等が、発酵食品調味料では大豆、小麦等が挙げられる。

(実施例）

以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明する。なお、本発明は以下実施例になんら限定されるものではない。

(参考例 1 ) YAP1遺伝子高発現による高ァ -GC酵母の分子育種

ァ—ダル夕ミルシスティン産生酵母 ΑΠ4800株から、 YAP1遺伝子が高発現する株を育種した。

ΑΠ4800株は、野生型サッカロマイセス ·セレピシェに由来するグル夕チオン合成酵素活性が弱化した菌株 AJ 14809株と、サッカロマイセス ·セレビシェ野生株 AJ 14810株（MATa) を接合させ、グル夕チオン合成酵素活性が弱化し、ァ—グルタミルシスティンを産生する株を選択することにより取得された 2倍体酵母（gsh2/gsh 2) である（特開 2003- 159048、米国特許公開 2004- 0214308A1) 。

AJ 14809株は、 2001年 10月 1 日に、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（〒305- 5466 日本国茨城県つくば市東 1丁目 1番地 1 中央第 6 )に、 FERM P- 18546の受託番号で寄託され、 2002年 11月 1 日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、受託番号 FERM BP- 8228が付与されている。また、 ΑΠ4810株は、 .2001年 10月 1日に、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センタ ― (〒305-5466 日本国茨城県つくば巿東 1丁目 1番地 1 中央第 6 ) に、 FERM P- 18547の受託番号で寄託され、 2002年 1 1月 1日にブダぺスト条約に基づく国際寄託に移管され、受託番号 FERM BP- 8229が付与されている。

まず、常法に基づき、 YAP1遺伝子を高発現するベクター（YAP l/pAUR123)を、以下のようにして作製した。 AJ 14800株を YPD培地で培養し、その対数増殖期に染色体 D NAを回収した。回収した染色体 DNAを銬型として、 Pyrobes t DNA po lymerase (夕力ラバイオ社）、プライマ一 1 (配列番号 3 ) 及びプライマー 2 (配列番号 4 ) を用いて YAP1遺伝子の 0RF領域を増幅した。プライマ一の末端には Smalサイト又は Xbal サイトが付加されるように設計されているため、 PCR産物の N末端側には Smalサイトが， C末端側には Xba Iサイトが付加される。この PCR産物を精製し、精製産物と、酵母用のタンパク発現型シャトルべクタ一 PAUR123 (夕カラバイオ社）を各々制限酵素 Smal、 Xbalで切断し、 TaKaRa MAライゲ一シヨンキット ver. 2 (夕カラバイオ社）を用いて連結した。連結物でェシエリヒア ·コリ IM109を形質転換して、形質転換体を取得した。目的の発現ベクターを保持する形質転換体を選抜し、得られた株から YAPl/pAUR123ベクタ一を大量調製した。

上記のようにして作製した YAP1/PAUR123ベクタ一及び pAUR123で各々 AJ 14800株を形質転換した。具体的には次のような操作を行った。 ΑΠ4800株を YPD培地で培養し、その対数増殖期に集菌した。 1Mソルビトール溶液で 2回洗浄した菌体を、以下の組成の溶液に懸濁し、 5でで 1時間放置した。 (組成）

0. 1 M LiC l

10 mM DTT

10 mM Tris-HCl (pH7. 5)

1 mM EDTA その後、 1Mソルビトール溶液で菌体を 2回洗浄した。このようにして調製した菌体に上述のようにして作製した PCR産物を混合し、エレクトロポレーションを行つた（「バイオマニュアルシリーズ 10 酵母による遺伝子実験法」初版、羊土社その後、混合物を YPD培地に接種し、 30 で 16時間振とう培養した。培養物を、 ρΑϋ R123ベクターの選択マーカーであるオーレォバシジン Α (宝酒造 code9000) を 0. 2 g/ml含有する YPD寒天培地にスプレッドし、 3日間 301：で培養した。尚、 AJ 14 800株のォ一レオバシジン Aに対する最小生育阻止濃度は 0. 05 g/mlである。出現したコロニーを 0. 2 g/mlのォ一レオバシジン Aを含有する YPD寒天培地に塗布し、オーレォバシジン Aに対する耐性を有するコロニーを選抜した。それらのコロニーから、目的のベクタ一を保持している形質転換体を選抜し、各々 AJ 14800/YAP1/PAU R123株及び AJ 14800/PAUR123株を取得した。

上記 2株を、各々 0. 2 // g/mlのオーレォバシジン Aを含む YPD培地（4ml、試験管）に植菌し、 30°Cで振とう培養した。その前培養液を各々0. 2 g/mlのオーレォバシジン Aを含む SD培地（50mし坂口フラスコ）に ¾シードし、 30°Cで振とう培養した。対数増殖期（シード後 16時間）に集菌し、乾燥菌体当りの r—ダル夕ミルシスティン含有量を測定したところ、 AJ14800/YAP1/PAUR123株は 1.7重量％、 AJ14800/p AUR123株は 1.4重量！ ¾であった。

以上より、 YAP1遺伝子の発現量を向上させることにより、菌体内のァーグル夕ミルシスティン含有量が上昇することが確認された。

(SD培地組成）

グルコース 2 %

Nitrogen Base 1倍濃度

(10倍濃度 Ni trogen Baseは、 1.7g (D Bacto Yeast Nitrogen Base w/o Amino Acids and Ammonium Sulfate (Difco社）と 5gの硫酸アンモニゥムを混合したものを 100mlの滅菌水に溶解し、 pHを 5.2程度に調整し、フィル夕一濾過滅菌したもの）また、各種濃度のセルレニンを含有する YPD寒天培地を作製し、前述の 2株に対するセルレニンの最小生育阻止濃度を測定した。具体的には、各菌株を YPD液体培地で、 30でで振とう培養し、定常期に達した培養液 3 1をセルレニンを含有する寒天培地にスポットし、 30でで 3日間培養し、コロニー形成の有無により菌体の生育を評価した。その結果、最小生育阻止濃度は、 AJ14800/YAP1/PAUR123株は 9 M、 AJ14800/PAUR123株は 7 Mであった。このことより、 YAP1遺伝子の発現量を向上させることにより、セルレニン耐性が上昇することが確認された。

(実施例 1 )

(セルレニン耐性株の取得）

参考例 1と同様にして AJ14800株のセルレニンに対する最小生育阻止濃度を調べたところ 7^Μであった。

次に、 AJ14800株を YPD培地に植菌し、 30 :で 3日間培養した。その培養物を、 Y PDプレート、セルレニンを 7 含有する YPDプレート、セルレニンを IO M含有する YPDプレートにスプレッドし、セルレニン耐性株を取得した。耐性株の出現率を、 YPDプレート上及びセルレニンを含有する YPDプレートに上に形成されたコロ二一の数を比較することにより評価したところ、 7 のプレートで 100株に 1株、 10 Mのプレートで 2000株に 1株であった。 (実施例 2 ) セルレニン耐性株の分類

実施例 1で取得したセルレニン耐性株について、セルレニン耐性度（生育阻止濃度）を調べたところ、以下のとおりであった。

セルレニン耐性度 7 M以上未満： 420株

セルレニン耐性度 I O M以上： 613株これらの菌株のァーグルタミルシスティン含有量を測定し、親株よりもァ—グル夕ミルシスティン含有量が上昇しかつ生育が良好な菌株'を選抜したところ、各群について、以下のような数の菌株が選抜された。

セルレニン耐性度 7 w M以上 10 // M未満： 8株

セルレニン耐性度 Ι Ο Μ以上： 1 8株各々の群から最優良株として、 7 - 46株（セルレニン耐性度以上 I O M未満の群から選抜）、 10- 29株（セルレニン耐性度以上の群から選抜）を選抜した。これらの菌株を SD培地で培養し、その対数増殖期の τ一ダル夕ミルシスティン含有量を測定したところ、 ΑΠ4800株は 1. 5(½、 7- 46株は 1. 68% (親株比 1. 1倍）、 10-29株は 1. 80% (親株比 1. 2倍）であった。

AJ 14800株と 10- 29株の YAP 1遺伝子の塩基配列を決定したところ、相違点は見出せなかった。このことより、 10- 29株のァ—ダル夕ミルシスティン含有量が上昇した原因は YAP 1遺伝子の変異以外にあると推測された。なお、 10-29株はセルレニン 25 Mのプレート上でも生育可能であった。 .

(実施例 3 ) 高密度培養時のァーグル夕ミルシスティン含有量

ΑΠ4800株、 7-46株、 10- 29株をミニジャーを用いて高密度培養し、ァーダル夕ミ.ルシスティン含有量を測定した。

YPD培地 50ml (500ml容坂ロフラスコ）に各々の菌株を 1エーゼ植菌し、 30で、 1 20rpmで振とう培養することによりプレシード培養を行った。次に、プレシード培養物 5ml を YPD培地 500ml (2Lバッフル付三角フラスコ）に植菌し、 30°C、 120rpm で 48時間振とう培養することによりシード培養を行った。シ一ド培養物 200ml をメイン培地に植菌し、ミニジャー（液量 2 L) を用いて以下の条件で培養を行った。表 1

メイン培地組成

組成最終濃度（g/dl)

グルコース 0.50

A区

KH₂P0₄. 0.30

MgS0₄ 0.17

■ ₄) ₂S0₄ 1.00

B区

Yeast Extract (TN¾) 0.23

消泡剤 * 0.10

C区 CaCl₂ 0.07

*: 三菱化学株式会社製「リヨ一ド一ポリグリエステル 0_50D」

A区、 B区、 C区は各々別々にオートクレープ殺菌（120で20分）後、混合した。また、 Yeast Extractは総窒素量が 0.23g/dlになるように添加した。培養温度は 3 0で、通気量は 1/1VVM、攪拌数は 800rpmで培養を行った。糖フィード液として、 46. 7% (W/V) のグルコース液を用い、培養ブロスの pHが 6.0になったらフィードを開始した。培養途中の pHは、糖フィ一ド開始後、アンモニアガスを用いて pH6.0に制御した。糖フィード後 3時間毎に培養液の吸光度（OD660mn) を測定し、 0. グルコース/乾燥菌体重量（DCW) g/hrとなるようにグルコースを添加した。換算式として DCW=0.22XOD660nmを使用した。

一定時間毎にァーグル夕ミルシスティン含有量を測定した結果を図 1に示す。また、培養 48時間目の乾燥菌体重量（DCW)及び γ一グル夕ミルシスティン含有量（ γ - GC) を測定した結果を以下に示す。

ΑΠ4800株： r-GC 2.10¾ DCW3.65g/dl

7 - 46株： r-GC 2.66¾ DCW3.23g/dl

10- 29株：ァ- GC 3.48¾ DCW3.16g/dl

10-29株は、顕著に経時的にァーグル夕ミルシスティン含有量が上昇した。また、セルレニン耐性度 10/zM以上の群から選抜した別の菌株も、高密度培養下で顕著に経時的にァーダル夕ミルシスティン含有量が上昇した。

(実施例 4 ) 10- 29株のグル夕チオン合成酵素活性の更なる低下検討

—次に、 10-29株のダル夕チオン合成酵素遺伝子を破壊することにより、更にダル夕チオン合成酵素活性を低下させた場合の影響を検討した。特開 2 0 0 4— 2 0 1 6 7 7の実施例 3に記載された方法と同様の方法により、 10- 29株のダル夕チオン合成酵素遺伝子の破壊を行った。得られた菌株は、プライベートナンバー AJ 14892 が付与され、 2 0 0 6年 8月 2 5日付けで、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託セン夕一（〒305-5466 日本国茨城県つくば市東 1丁目 1番地 1 中央第 6 ) に、受託番号 F E R M P— 2 1 0 0 7として寄託され、 2 0 0 9年 2月 1 9 日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、受領番号 FERM 8 - 1 1097が付与されている。

上記のようにして取得した AJ 14892株を実施例 3と同様に高密度培養を行った。糖フィード液として 60%グルコース溶液を用い、ブロスの pHが 6. 0になったときに糖フィードを開始した。糖フィード流量は、糖フィード開始 0. 5時間後までは 20 ^ l/min、 5. 9時間後までは 75 l/min、それ以降は 135 z 1/minに設定した。

一定時間毎にァ—ダル夕ミルシスティン含有量を測定した結果を図 2に示す。また、培培養 48時間目の乾燥菌体重量（DCW)及びァーダル夕ミルシスティン（ァ-GC) 含有量は、以下のとおりであった。

r -GC： 4. 12¾

DCW ： 5. 02g/d l

本菌株も 10- 29株と同様に、顕著に高密度培養で経時的にァーグル夕ミルシステイン含有量が上昇した。この結果より、ダル夕チオン合成酵素活性を更に低下させてもァーダル夕ミルシスティン含有量は経時的に上昇することがわかった。

(実施例 5 ) 酵母抽出組成物（酵母エキス）の調製

実施例 3記載の ΑΠ4800株及び実施例 4記載の ΑΠ4892株の培養ブロスより、下記の方法でシスティンを高含有する酵母抽出組成物（酵母エキス）を調製した。培養ブロスを各々遠心分離し、酵母菌体と培地成分を分離した。この遠心分離では、酵母菌体に付着母液として培地成分が含まれている。そこで、付着母液として菌体に付着している培地成分を除去する目的で、洗浄水を酵母菌体に添加し、懸濁した。この懸濁液を更に遠心分離し、培地成分（軽液）と酵母菌体（重液）に分離した。この操作を軽液の Br ixが 0. 6になるまで繰り返した。なお、ラボスケールでは、遠心分離は短時間に終了するが、工業レベルを想定した BP、 CPスケールではこの培地成分の除去に数時間かかることもある。そこで、その BP、 CPスケールでの影響を考慮し、酵母菌体を約 10g-DCW (乾燥酵母菌体重量） /d lの濃度になるように懸濁し、スターラーで攪拌しながら（酵母が沈殿しないレベルの攪拌速度） 16でで 4 時間保持した。その後、遠心分離により酵母菌体を回収した。この酵母菌体を約 12 g-DCW/d lの濃度になるように水に懸濁した。この酵母懸濁液を 70でで 10分間加熱することにより酵母菌体より内容物を抽出した。遠心分離により、酵母菌体残渣と内容物を分離した。このようにして、ァ -GCを含有する内容物を調製した。本内容物を 120mmHgの減圧下で温度を 50でに制御して濃縮、約 10時間後に固形分濃度約 3 (^まで濃縮した。このようにして酵母抽出組成物 A (酵母エキス A) を調製した。更に、酵母抽出組成物 A (酵母エキス A) に塩酸を添加して pHを 4. 5に調製した濃縮液を 90でで約 1時間保持し、システィンを高含有する酵母抽出組成物 B (酵母ェキス B ) を調製した。

(実施例 6 ) 酵母抽出組成物（酵母エキス）の評価

実施例 5で調製した酵母抽出組成物 A及び Bを各々 50での湯で希釈して 1 %溶液としたものについて官能評価を行った。官能評価は、専門のパネラー 10名により、 2点識別法で行った。 .

酵母抽出組成物 Aの官能評価結果

表 3

酵母抽出組成物 Bの官能評価結果

. .その結果、 . AJ 14892株ブロス抽出組成物の方が" r - GC (ァーグル夕ミルシステイン. 略 :やシスティン特有の硫黄臭が高い一方で、課題である酵母ェキス:特有 : YE.；.. 臭 ^: （酵母特有め臭）や YE呈味（酵母特有の味）が少ないことがわかつ卞乙。 ' つて:、 r -GCを含有する酵母にセルレニン耐性を付与したことによって、 r -GC含有量が上昇するだけでなく酵母エキス特有の YE臭や YE呈味が少ない酵母抽出組成物（酵母エキス）が得られることがわかった。

なお、実施例 5で調製した酵母抽出組成物 Bを分析したところ、エキス固形分あたりの各成分含量は以下の通りであった。表 4

AJ 14892株ブロス抽出組成物 Bの成分

表 5

AJ 14800株ブロス抽出組成物 Bの成分

これらの結果からもわかるように、 AJ 14892株ブロス抽出組成物 Bは、 AJ 14800 株ブロス抽出組成物 Bに比べてエキス固形分あたりのシスティン含量が上昇している一方で、エキス固形分あたりの塩基性アミノ酸（アルギニン、リジン、ヒスチジン）含量が減少していた。

これらの傾向は、実施例 2で I O M以上のセルレニンに耐性を有し、ァ -GC含量が上昇した菌株として選抜した酵母の中からランダムに選抜した、 10-9株、 10-29 株、 10- 340株においても同様であった。なおこの時の、システィン含量は各々 3. 90 ¾, 3. 88%、 3. 62%であった。

(実施例 7 ) 酵母菌体洗浄中の成分変化

AJ 14892株ブロスと AJ 14800株ブロスの菌体洗浄中に菌体から内容物が遊離するか否か次のようにして調べた。実施例 1と同様にして、実施例 3記載の AJ 14800株及び実施例 4記載の ΑΠ4892株の培養ブロスを遠心分離及び洗浄することにより、軽液の Br ixが 0. 6で酵母菌体濃度が約 10g- DCW (乾燥酵母菌体重量） /d lの懸濁液 ' . を調製した。この懸濁液をス夕一ラーで攪拌しながら（酵母が沈殿しないレベルの攪拌速度） 16でで保持した。一定時間毎に懸濁液をサンプリングし、遠心分離して上清 Br ixを測定した。 ΑΠ4892株では、 ΑΠ4800株と異なり微小な変化ではあるが、経時的に上清 Br i xの上昇が見られた（図 3 ) 。なお、 ΑΠ4892株で、酵母菌体重量あたりのァ -GC含量の変化はほとんどなかった。この洗浄工程においても、セルレニン耐性株の場合酵母菌体から YE (酵母エキス）特有の成分が除去されると推定される為、さらに YE特有の YE呈味ゃ YE臭が低減した酵母菌体抽出組成物が得られたと推定された。

(参考例 2 ) 酵母菌体ブロス中の溶存気体酵母は通性嫌気性である為、通常通気を行って培養する。その為、培養ブロスには通気された空気と酵母の呼吸によって発生する二酸化炭素などの気体が溶け込んでいる。このような溶存気体が溶け込んだ状態で、 CS機を用いて酵母菌体から内容物を抽出すると、抽出時に溶存気体が気化するために CS機内に気泡が発生する。その結果、 CS機による熱水抽出工程が不安定になる。このような不安定化を避ける為に、通常は酵母の培養温度よりも高い温度で菌体洗浄を行う。その結果、菌体洗浄工程においてブロス中の溶存気体が脱気され、熱水抽出工程が安定化する。

ブロス中に溶け込んでいる溶存気体が、菌体洗浄工程の温度によってどのように変化するかを次のようにして調べた。

実施例 5と同様にして、実施例 3記載の ΑΠ4800株培養ブロスを遠心分離、菌体洗浄することにより、上清 Br i xが 0. 6、酵母菌体濃度が約 10g- DCW/dlである酵母懸濁液を約 200ml調製した。この酵母懸濁液 100mlずつを実施例 1と同様にスターラーで攪拌しながら、 35で又は 16でで 4時間保持した。この懸濁液に含まれている溶存気体を以下のようにして調べた。 100ml容量の三角フラスコに 100ml の懸濁液を入れ、上部を密栓した。このとき三角フラスコには約 50mlの空間が発生する。三角フラスコを 60でのウォー夕一バスに浸漬し、ス夕一ラーで攪拌しながら懸濁液を 20分間ホールドした。この 20分間に発生した溶存気体をメスシリンダ一にて.測定した（図 4 ) 。

その結果、 35°Cで 4時間保持したサンプルには 29mlの溶存気体が含まれており、 16でで 4時間保持したサンプルには 55mlの溶存気体が含まれていた。この結果からも、酵母の培養温度よりも高い温度 35でで菌体洗浄することにより、酵母重液中の溶存気体が脱気されることにより熱水抽出工程で発生する気体量を低減し、熱水抽出工程の安定化につながることがわかった。即ち、通常の 30で以上の温度での菌体洗浄工程では、熱水抽出工程の安定化というメリットが得られている。しかし、本発明では培養温度よりも低温で菌体洗浄するという、定法とは異なる方法を採用することで、臭い、香りとも向上した酵母エキスが得られたのは前述の実施例の通りである。

(実施例 8 ) セルレニン耐性株 10-9株の変異遺伝子の同定実施例 2で取得した 10- 9株は、親株である AJ14800株の培養中に生じた自然変異株をセルレニン耐性という選択圧を利用して選抜しだ変異株である。そこで、その変異遺伝子を特定する目的で、 10-9株の遺伝子発現 cDNAライブラリーを作成した。 10-9株を IO Mのセルレニンを含む SD培地にて 30°Cで培養した。その対数増殖期に菌体を集菌し、常法に従って Tota卜 RNAを回収した。 'この Tota卜 RNA を利用して、 Gateway技術により full lengthの cDNA発現ライブラリ一を作製した。（本ライブラリ一の作製は、 Gateway技術を保有するインビトロジェン株式会社に依頼して行った。なお、同社より発売されている Uncut, Full-length Unc ut, and Nanoquant i ty Uncut Custom cDNA Libraries (Catalog nos. 11144 - 010、 11144-020、 and 11649- 020)を用いることによつても作製可能である。）この時、発現ライブラリーの destination vectorとして同社製の pYES-DEST52 Gateway V ector (Catalog no. 12286-019) を用いた。このようにして、 GAL1プロモーターに 10-9株の遺伝子を含む cDNAライブラリ一を作製した。

次に、 10- 9株の遺伝子を含む cDNAライブラリーを常法に従い、 S. cerevisiae INVScl株（インビトロジェン株式会社、 ]-卜' C81000) に形質転換した。形質転換は、 S. EasyComp Transformation Kit (インビトロジェン株式会社、コード 45 -0476) を用いて作製した INVScl株のコンビテントセルを用いて、マニュアルに従って行った。同形質転換体をグルコースの代わりに同濃度のガラクトースを用いて作製した SD培地（His、 Leu、 Trpは必要濃度添加）に植菌し、 30T:で 24hr 振とう培養した。培養液を全て、 10 Μのセルレニンを含む SD寒天培地（ダルコースの代わりにガラクトースを使用。 His、 Leu, Trpは必要濃度添加）にスプレツドし、 30でで 7日間静置培養したところ 3個のコロニーが出現した。これら 3株から、各々常法に従い、プラスミドを回収した。 3個のプラスミドには全て 10-9 株の FAS2遺伝子が含まれていた。このようにして、 10-9株にセルレニン耐性を付与し、ァ -GC含有量向上に寄与した遺伝子として FAS2遺伝子を特定した。

(実施例 9) FAS2遺伝子の変異点解析

常法に従い取得したプラスミドに含まれる FAS2遺伝子の塩基配列を決定したところ、 FAS2遺伝子によってコ一ドされるタンパク質の 1475番目のグルタミン酸がリジンに変化しかつ 1800番目のセリンがァスパラギンに変化している（配列表の配列番号 5、 6参照）など、配列表の配列番号 7の野生型のタンパク質とは相違が見られた。そこで、常法にしたがい、 AJ 14800株及び 10-9株より染色体 DNAを回収し、 FAS2遺伝子の増幅及び塩基配列の決定を行った。

その結果、 AJ 14800株（2倍体）の FAS2遺伝子によってコードされるタンパク質は 2つとも 1475番目のアミノ酸がグルタミン酸であり、かつ 1800番目のアミノ酸がセリンであった。一方、 10-9株（2倍体）では FAS2遺伝子によってコードされるタンパク質の 1つは 1475番目のアミノ酸がグルタミン酸であり、かつ 180 0番目のアミノ酸がセリンであった。しかし、もう 1つは 1475番目のアミノ酸がリジンであり、かつ、 1800番目のアミノ酸がァスパラギンであった。

(実施例 1 0 ) 2段階加熱によるエキス抽出率向上

実施例 3記載の ΑΠ4800株及び実施例 4記載の ΑΠ4892株の培養ブロスより、下記の方法でエキス分を 2段階加熱により抽出した。

培養ブロスを各々遠心分離し、酵母菌体と培地成分を分離した。付着母液として菌体に付着している培地成分を除去する目的で、洗浄水を酵母菌体に添加し、懸濁した。この懸濁液を更に遠心分離し、培地成分（軽液）と酵母菌体（重液）に分離した。この操作を軽液の Br ixが 0. 6になるまで繰り返した。その後、酵母菌体を約 10g-DCW (乾燥酵母菌体重量） /dlの濃度になるように懸'濁し、ス夕一ラーで攪拌しながら（酵母が沈殿しないレベルの攪拌速度） 16でで 4時間保持した。その後、遠心分離により酵母菌体を回収した。この酵母菌体を約 12g- DCW/dlの濃度になるように水に懸濁した。この酵母懸濁液を 15〜70 の各温度で 1時間ホールドすることにより 1段階目加熱抽出を行った。次に、加熱温度を 70または 80でに上昇させ、 10 分間加熱抽出を行った。酵母抽出菌体を遠心分離し、上清と抽出菌体残渣を分離した。上清の Br ixを測定し、各種条件での抽出効率を比較した。

図 5及び図 6に示すようにセルレニン耐性を有さない AJ 14800株ではいずれの条件でもエキス分の抽出率はほとんど不変であつたが、セルレニン耐性を有する AJ 14 892株では 1段階目加熱を行うことによりエキス分の抽出率が上昇した。なお、ェキス分の抽出率は 1段階目加熱時間が 1 4時間までは経時的に上昇することを確認した。産業上の利用可能性

本発明の？ "一ダルタミルシスティンが蓄積された酵母、又は当該酵母を用いて得られる酵母エキスはアルコール飲料、パン食品、発酵調味料等の飲食品に広く使用できる。

Claims

請求の範囲

I . ア一ダル夕ミルシスティン生産能を有し、かつ、セルレニン耐性を有する酵母。

2. 1 0 /zM以上のセルレニンに耐性を有する請求項 1記載の酵母。

3. 変異型 FAS2遺伝子を有することにより 1 0 M以上のセルレニンに耐性となつた請求項 2記載の酵母。

4.変異型 FAS 2遺伝子が配列表の配列番号 5の天然型 FAS 2遺伝子によりコードされるタンパク質の 1 4 7 5番目のアミノ酸がリジン及び又は 1 8 0 0番目のアミノ酸がァスパラギンである請求項 3記載の酵母。

5. ₇—グル夕ミルシスティン生産能が細胞内のグル夕チオン合成酵素活性が低下又は消失するように改変することで得られたものである請求項 1 ~4のいずれか一項に記載の酵母。

6.酵母がサッカロマイセス属に属する請求項 1〜 5のいずれか一項に記載の酵母。

7. 酵母がサッカロマイセス ·セレピシェであることを特徴とする請求項 6記載の酵母。

8. 請求項 1〜7のいずれか一項に記載の酵母を培地中で培養することにより、 r 一グル夕ミルシスティンを酵母中に蓄積させた酵母の製造法。 '

9. 請求項 1〜7のいずれか一項に記載の酵母を培地中で培養することにより、了一ダル夕ミルシスティンを酵母中に蓄積させた後、酵母中の内容物を抽出して得られる酵母エキスの製造法。

10. ァ—ダルタミルシスティンを酵母中に蓄積させた後、低温で菌体洗浄を行つた後、酵母中の内容物を抽出して得られる請求項 9記載の酵母エキスの製造法。

I I . 請求項 9又は 1 0記載の酵母エキスを更に、加熱又は酵素処理に付すことにより、酵母エキス中のァーダル夕ミルシスティンの一部又は全てをシスティンに変換させた酵母エキスの製造法。

1 2. 酵母エキス固形分当たりのシスティン含量が 3. 5 %以上、塩基性アミノ酸含量が 1. 0 %以下である請求項 1 1記載の酵母エキスの製造法。

1 3. 請求項 9〜 1 2のいずれか一項に記載の酵母エキスを飲食品原料に混合し、次に、加工して得られる飲食品。

1 4 . ァーグル夕ミルシスティンを酵母中に蓄積させた後、低温で菌体洗浄を行つた後、酵母内容物を抽出して得られる酵母エキスを製造する工程において、 2段階の異なる温度領域で加熱することによりエキス分を抽出する工程を含むことを特徴とする請求項 9記載の酵母ェ午スの製造方法。

1 5 . 2段階の異なる温度領域で加熱することによりエキス分を抽出する工程が、 1段階目の抽出温度が 2 5〜6 0でであり、 2段階目の抽出温度が 6 5〜9 9でであることを特徴とする請求項 1 4記載の酵母エキスの製造方法。