WO2009003425A1 - Obtención de un preparado vacunal homogéneo para el tratamiento del cáncer - Google Patents
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Classifications
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- A—HUMAN NECESSITIES
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- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
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- A61K2039/6031—Proteins
Definitions
- the present invention relates to biotechnology, and more specifically to the field of human health.
- the present invention describes protective and / or therapeutic vaccines for cancer, and particularly provides vaccine compositions that allow a significant increase in the immune response against Epidermal Growth Factor (EGF).
- EGF Epidermal Growth Factor
- Growth Factor whose oncological relevance has been widely demonstrated for the growth of tumors mainly of epithelial origin.
- R-EGF EGF receptor system
- R-EGF EGF receptor system
- its ligands constitute a molecular complex whose interaction specifically regulates cell growth and its impact on the uncontrolled growth of tumors of epithelial origin has been demonstrated.
- the deregulation of the paracrine and autocrine processes of activation of (R-EGF) is given both by the overproduction of growth factors and by the high synthesis and / or the mutation of its receptors.
- EGF is a 53 amino acid polypeptide, with an apparent molecular weight of 6045 Da. This polypeptide was isolated and purified for the first time by Cohen S., J. Biol. Chem. (1962) 237, 1,555).
- the EGF is part of the R-EGF family of ligands, this family is constituted by structurally and functionally related proteins.
- the other members of this family are: TGF, anfiregulin (AR), cryptol (CR1), heparin-binding growth factor, betacellulin, epiregulin.
- the family of poxviruses includes proteins related to EGF, among them the most characterized is the growth factor of vaccinia virus (VGF).
- R-EGF receptor-binding protein
- R-EGF is a glycoprotein of approximately 170 kDa, whose gene has been cloned and sequenced.
- the intracellular domain of this receptor is associated with the activity of tyrosine kinase proteins that show structural homology with the product of the oncogene v-erb-B, which shows a relationship with the process of malignant transformation (Heldin CH. (1984), CeII 37,
- EP 0 657 175 describes a vaccine composition containing autologous EGF coupled to a transporter protein and said complex inhibits the growth of EGF-dependent tumors through an auto immune effect.
- the vaccine composition described in EP 0 657 175, are conjugate vaccines containing EGF, coupled to a transporter protein (rP64k protein, Cholera toxin B chain, tetanus toxoid protein and / or monoclonal antibodies) and as a consequence a heterogeneous and poorly reproducible mixture of conjugated species is obtained.
- a transporter protein rP64k protein, Cholera toxin B chain, tetanus toxoid protein and / or monoclonal antibodies
- the novel vaccine preparation described in the present invention comprises as an active principle the autologous EGF and is characterized by having a homogeneous chemical composition and defined purity, an enhanced immunogenicity, a substantially increased clinical activity and significantly decreases the number of immunizations for its therapeutic action
- the decrease in the content of the autologous antigen in the vaccine preparation of the present invention surprisingly does not decrease, but causes significant increases in the titers of anti-EGF antibodies in humans.
- the decrease of the content of EGF and its derivatives in the vaccine composition was obtained through the development of a method of membrane purification, which is also part of this invention.
- the present invention also provides a homogeneous and reproducible vaccine preparation that allows to increase the clinical effect thereof by decreasing the number of immunizations, which provides a great advantage in cancer therapy and for the patient, in comparison with previously described vaccine compositions.
- the vaccine composition according to the present invention can be used in conjunction with suitable adjuvants such as aluminum hydroxide or Montanide
- the present invention involves a sanitary procedure for obtaining the appropriate vaccine preparation for administration to patients parenterally.
- the method comprises a suitable method of covalent conjugation of the hrEGF, to the rP64k transporter protein and the purification thereof using Ultrafiltration membranes in a range of 50-10OkDa. to remove biologically inactive conjugate species (lacking immunogenic activity) and other chemical impurities.
- the present invention provides a novel vaccine preparation based on autologous EGF, characterized by having a homogeneous chemical composition and defined purity, enhanced immunogenicity and substantially increased clinical activity. Additionally, the vaccine presentation described in the present invention offers the possibility of significantly decreasing the number of administrations necessary to the patient, when it is required to increase the therapeutic dose, due to the fact that this vaccine composition is obtained from a methodology that allows to achieve different concentrations per milliliter of the hrEGF-rP64k conjugate species, known as potency
- This new vaccine preparation is obtained from the surprising result that the decrease in the content of the autologous antigen in the vaccine composition through a novel purification process, does not decrease, but it allows to significantly increase the immune response against the EGF itself compared to heterogeneous compositions used as vaccines based on the EGF.
- the vaccine preparation obtained from the decrease of the autologous antigen content through the ultrafiltration membrane purification methodology has a homogeneous composition where immunologically active species (hrEGF-rP64k conjugate species) show molar masses greater than 6OkDa .
- This Vaccine preparation shows a chromatographic separation profile by molecular exclusion characterized in that where the species that carry therapeutic activity of this vaccine preparation, represent more than 90% of the total area of the chromatogram corresponding to the vaccine preparation as a whole, as shown in Figure 4
- This vaccine preparation is further characterized by a chemical conjugation relationship between the hrEGF and rP64k proteins of (1: 2), this means that there are 2 conjugated hrEGF molecules for each rP64k molecule Methodology for obtaining the vaccine preparation
- a method is developed to decrease the content of hrEGF in the heterogeneous mixture of conjugates; enriching the vaccine preparation in conjugated species of high molecular weight (immunologically active species) and glutaraldehyde free.
- the purification procedure using ultrafiltration membranes in a range between 50-10OkDa developed and described in the present invention consists of two stages: In the initial stage successive changes of buffer solution (diafiltration) are made to remove the glutaraldehyde and remove the excess of autologous protein, either free or forming hrEGF-hrEGF conjugates of different sizes.
- the second stage is the concentration of the purified chemical conjugate, in which more than 90% of its composition corresponds to the immunogenic species hrEGF-rP64k.
- the concentration stage the initial volume of the chemical conjugate is reduced to a final protein concentration (hrEGF-rP64k conjugate species) in a range between 1-12 mg / mL.
- hrEGF-rP64k conjugate species The uniqueness of this methodology ensures that the vaccine preparation obtained has a homogeneous composition and defined purity, characterized by the majority presence of immunologically active species: hrEGF-rP64k conjugate species.
- hrEGF polymeric autologous protein
- the reduction of the autologous protein content in the vaccine preparation causes in patients increases of at least 2 times the maximum anti-EGF antibody titer.
- the procedure described in the present invention to guarantee an adequate chemical conjugation between both proteins consists of a single step and begins by mixing the previously concentrated hrEGF protein (> 6 mg / mL) and the rP64k protein (> 1 mg / mL) in the conjugation reactor. To this protein mixture is subsequently added the PBS / MgCl 2 solution (pH 6.8-7.2) and the 0.5% glutaraldehyde conjugation solution. The mixture is kept under constant stirring for 2 hours at a temperature 22 ° C ⁇ 2 ° C. The final protein concentration in the reaction mixture for hrEGF is 0.82 mg / mL and for rP64k protein it is 0.89 mg / mL.
- the concentration of total proteins during the conjugation reaction is 2 mg / mL and the final concentration of glutaraldehyde in the reaction mixture is 0.05%.
- the vaccine composition according to the present invention can be used in conjunction with suitable adjuvants, such as aluminum hydroxide or Montanide.
- the present invention involves a sanitary procedure for obtaining the vaccine preparation, administered parenterally that minimizes the opportunities for microbial contamination of the vaccine preparation during its obtaining, allows the chemical conjugate purification methodology to be performed in a few hours and facilitates the increase in the volume of the vaccine preparation to obtain among other advantages.
- Example 1 describes the molecular characterization of the vaccine preparation described in the present invention.
- Molecular characterization includes: the HPLC-FG chromatographic identification of the conjugate species formed during the conjugation reaction, the determination of the conjugation ratio between the hrEGF and rP64k proteins and the definition of the peptide map that characterizes this novel vaccine preparation .
- Example 2 describes the mouse bioassays performed to evaluate the immunogenicity of the novel vaccine preparation described in the present invention.
- Example 3 describes the efficacy of the clinical use of the present vaccine preparation in the treatment of lung tumors of epithelial origin.
- Example 4 describes the obtaining of vaccine preparations adjusted to different powers (total milligrams of hrEGF-rP64k / vial conjugate), using the same conjugation and purification methodology described in the present invention.
- Example 5 shows the removal of glutaraldehyde used in the conjugation reaction, by means of the methodology of purification of the chemical conjugate through a 5OkDa ultrafiltration membrane.
- EXAMPLE 1 Molecular characterization of the vaccine preparation described in the present invention (Vaccine Preparation A).
- hrEGF-hrEGF and rP64k-rP64k were used as conjugated homoligomeric indicators.
- the chromatographic profiles shown by the homoligomeric conjugates (hrEGF-hrEGF and rP64k-rP64k) were compared with the chromatographic profile shown by the chemical conjugate obtained from the conjugation reaction between the unpurified hrEGF and rP64k proteins.
- Figure 1 shows the profile of the homoligomeric conjugate rP64k-rP64k and the profile that is obtained when performing the chemical conjugation between the hrEGF and rP64k proteins (chemical conjugate without purification by ultrafiltration).
- FIG. 1 shows the results obtained after performing a denaturing electrophoresis under conditions of reduction and Western Blot of the vaccine preparation purified by ultrafiltration. The development was performed with an anti-EGF antibody conjugated with alkaline phosphatase.
- the EGF is a protein of apparent molecular weight of 6kDa therefore it must be located in the lower area of the gel.
- the moles present in each of its constituent proteins were determined.
- a vaccine preparation obtained from a 50 kDa ultrafiltration membrane purification process was taken and the chromatographic fraction corresponding to the hrEGF-rP64k conjugate species was collected. These fractions were subjected to amino acid analysis.
- the determination of the conjugation ratio was performed by 2 methods. 1. A method was based on the estimation of the amount of Phenylalanine (Phe) and Threonine (Thr) in the vaccine preparation (amino acids only present in the rP64k molecule). The amounts of these amino acids were used to determine the amount of rP64k.
- the amount of EGF was determined. 2.
- the other method was based on the direct determination of the relative amounts of each protein, using the amino acid sequence and based on the quantification of the amino acids Asparagine + Aspartic (Asx), Glutamine + Glutamic (GIx), Glycine (GIy) and Alanine (Ala) (residues highly stable to acid hydrolysis and which are commonly used in protein quantification). The results obtained by each method are shown in Tables 1 and 2 below.
- Table 1 Determination of the ratio of conjugation between the hrEGF and rP64k proteins by performing the determination of amino acid composition of the vaccine preparation purified by ultrafiltration, based on the method of determining the amount of phenylalanine (Phe) and Threonine (Thr)
- Table 2 Determination of the ratio of conjugation between the hrEGF and rP64k proteins by determining the amino acid composition of the vaccine preparation purified by ultrafiltration, based on the method of determining the relative amounts of the amino acids Asparagine + Aspartic (Asx), Glutamine + Glutamic (GIx), Glycine (GIy) and Alanine (Ala)
- Figure 5 shows the maps of peptides obtained from two vaccine preparations obtained independently, where great similarity is observed in the peptides that appear and the existing proportion of each of them.
- the reproducibility between the peptide maps obtained from both vaccine preparations is an indication of the control that exists over the conditions under which the chemical conjugation and purification procedures also described in the present invention occur.
- the inoculation of 10 mice was performed with a single dose of 200 ⁇ L of a water-in-oil emulsion (50/50% v / v) of the immunogens (conventional vaccine preparation obtained by dialysis, vaccine preparation obtained by membrane purification ultrafiltration and the permeate obtained from the UF / DF purification process, where the hrEGF-hrEGF conjugated species are found) with the Montanide ISA 51 adjuvant.
- the protein dose applied for each immunogen is referred to in Table 4.
- the extraction of the serum from the animals and the evaluation of the anti-EGF antibody titer by means of an ELISA was performed.
- the test positivity criterion was that the optical density measured at 405 nm was more than twice the average obtained for the plate blank. Plaque blank is obtained when the blocking buffer is added to the well instead of an anti-EGF serum sample.
- the Mann-Whitney test applied to the analysis of the data was performed using a statistical program.
- Table 4 Immunogens evaluated and the concentration of proteins to be inoculated by animal as appropriate for the biological activity test.
- Figure 6 shows the results of the biological activity test as evidence of the immunogenic activity of each immunogen evaluated.
- the Vaccine Preparation A produces an increase in the concentration of anti EGF antibodies (at 1/1000 dilution) 10 times higher compared to that achieved by immunizing with the conjugate corresponding to the free hrEGF and hrEGF 'polymers.
- the vaccine preparation described in the present invention produced a 2-fold increase in the concentration of anti EGF antibodies
- Point Estimate for ETA1-ETA2 is -0.2590
- EXAMPLE 3 Evaluation of the efficacy of the clinical use of the vaccine preparation described in the present invention in the treatment of lung tumors of epithelial origin.
- the objective of this example is to evaluate in patients the immunogenicity produced by the Vaccine Preparation A in comparison with the immunogenicity achieved by the Vaccine Preparation B obtained by the method of dialysis purification.
- patients carrying non-cell lung tumors were treated. Small in advanced stages.
- Two groups of patients (patients vaccinated with Vaccine Preparation B and patients vaccinated with Vaccine Preparation A, described in the present invention were defined for the study.
- the dose of vaccine preparation applied per patient for each group was the following 'vaccinated patients With Vaccine B Preparation they received 1.2 mg of total protein per immunization site, patients vaccinated with Vaccine A Preparation received 0.6 mg of total protein per immunization site, for both groups the immunization sites were 4. All patients received therapy oncospecific, at least 4 weeks before Start the essay. Immunizations were performed intramuscularly, and they continued to happen once a month.
- the humoral immune response of both groups of patients was evaluated through the obtaining of blood serum.
- the fundamental outcome variable was the specific antibody titer against EGF. This parameter was determined by means of an ELISA system. The positive values were those optical density readings that were 2 times above the value of the negative control. The antibody titer reported means the greatest dilution of positive sera.
- the analysis of the immune response for the members of each group represented in Table 6 showed that the geometric mean of the maximum antibody titer for the group of patients immunized with Vaccine Preparation A corresponds to 1: 56421, while for the group of patients immunized with Vaccine Preparation B the geometric mean of the maximum antibody titer was 1: 23515. This means that the vaccine preparation described in the present invention produced a 2-fold increase in the geometric mean of the maximum anti-EGF antibody titer in relation to that achieved with the vaccine preparation B.
- Vaccine Preparation A causes an increase of at least 100 times the titer of anti-EGF antibodies in immunized subjects
- Test 1 At the conclusion of the diafiltration, the purified chemical conjugate was concentrated to a final protein concentration of 2 mg / mL.
- Test 2 At the conclusion of the diafiltration, the purified chemical conjugate was concentrated to a final protein concentration of 5 mg / mL.
- Test 3 At the conclusion of the diafiltration, the purified chemical conjugate was concentrated to a final protein concentration of 12 mg / mL.
- Table 7 Values corresponding to the percentage of homogeneity in vaccine preparations adjusted to different final protein concentrations
- the residual glutaraldehyde content in the Vaccine Preparation B and in the Vaccine Preparation A was quantified, by a reverse phase chromatographic separation method (HPLC-RP) using a C-8 column. This method required first, the precipitation of the protein contained in the samples with perchloric acid and then a reaction with phenylhydrazine.
- Figure 7 shows that the residual content of this impurity present in both vaccine preparations was less than 0.2 ug / mL or less than 0.002 ppm, (upper limit concentration established for this impurity) starting from an initial concentration of 530 mg / mL or 530 ppm Although both preparations comply with the specification established for this impurity, Figure 7 illustrates that the vaccine preparation A obtained from applying the method of purification of the chemical conjugate by Ultrafiltration membranes, has a lower content of glutaraldehyde, which provides great safety. for the patient to said vaccine preparation
- Figure 1 The superposition of the chromatogram of a homoligomeric conjugate rP64k-rP64k and the chromatogram of a chemical conjugate EGF-P64k without purification is shown. Encased in the circle shows the coincidence of the profiles between both chromatograms.
- the X axis presents the time at which each component of the sample elutes and the Y axis represents the intensity value at 216 nm of each component of the sample, as an indicator of the protein concentration in the same.
- FIG. 1 Immunodetection with an anti EGF antibody conjugated to alkaline phosphatase after electrophoretic separation in SDS-PAGE for vaccine preparation obtained by ultrafiltration.
- Line 1 Molecular weight marker
- Line 2 Vaccine preparation Figure 3.
- the superposition of the chromatogram corresponding to the hrEGF-hrEGF homoligomeric conjugate and the chromatogram of an unpurified hrEGF-rP64k chemical conjugate is shown. Encased in the circle shows the coincidence of species between both chromatograms. .
- the X axis presents the time at which each component of the sample elutes and the Y axis represents the intensity value at 216 nm of each component in the sample, as an indicator of the protein concentration in the same.
- FIG. 4 Chromatographic profile corresponding to the vaccine preparation described in the present invention.
- the shaded area corresponds to the hrEGF-rP64k conjugate species.
- the X axis presents the time at which each fraction elutes and the Y axis represents the intensity value at 216 nm of each component in the sample, as an indicator of the protein concentration in it.
- FIG. 5 Peptide map of the chromatographic fraction corresponding to the hrEGF-rP64k conjugate. The results obtained for two independently purified vaccine preparations are presented through an ultrafiltration membrane. The axis of the X represents the time and the axis of the Y represents the units of milli intensity.
- Figure 6 Titles of anti EGF antibodies in mice immunized with various immunogens: conventional vaccine preparation, vaccine preparation purified by ultrafiltration and permeate from the ultrafiltration purification method of the vaccine preparation The X axis corresponds to the dilutions made to the serum obtained from each animal and the Y axis represents the 405 nm optical density value of each sample as an indicator of the protein concentration in it.
- FIG. 7 HPLC-RP chromatographic profile obtained during the quantification of the residual glutaraldehyde content for the vaccine preparation obtained from the purification method by using the 5OkDa ultrafiltration membranes (Vaccine Preparation A) and for the vaccine preparation obtained using the method of dialysis membrane purification (Vaccine Prepared B).
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Abstract
La presente invención se relaciona con la rama de la biotecnología y mas específicamente con la salud humana. Particularmente, la presente invención describe una composición vacunal para su uso terapéutico en pacientes de cáncer. La composición vacunal descrita en la presente invención tiene como principio activo un conjugado químico entre el Factor de Crecimiento Epidérmico humano recombinante (hrEGF) y la proteína recombinante P64k. Además, se describen condiciones específicas para la realización de una reacción de conjugación que permiten obtener de manera controlada y reproducible dicho conjugado químico. En otro aspecto la presente invención se relaciona con un procedimiento para la purificación del conjugado químico que no solo le aporto mayor pureza a la composición vacunal terapéutica, sino que sorprendentemente incremento la actividad inmunogénica, provocando incrementos significativos en los títulos de anticuerpos anti EGF en humanos. Adicionalmente la presente invención proporciona la metodología para lograr un preparado vacunal con más de un tipo de presentación de dosis (miligramos totales de conjugados EGF-P64k/vial). Esta versatilidad en la presentación del preparado vacunal permite incrementar la dosis de inmunización por paciente, sin que esto conlleve a aumentar la frecuencia de inmunización y/o el número de sitios de inmunización. Por ultimo, la presente invención involucra un procedimiento sanitario para la obtención del preparado vacunal para la terapia del cáncer, administrado por vía parenteral.
Description
Obtención de un preparado vacunal homogéneo para el tratamiento del cáncer.
Sector Técnico:
La presente invención se relaciona con Ia biotecnología, y más específicamente con el campo de Ia salud humana. En una representación, Ia presente invención describe vacunas protectoras y/o terapéuticas para cáncer, y particularmente proporciona composiciones vacunales que permiten el incremento significativo de Ia respuesta inmunitaria contra el Factor de Crecimiento Epidérmico (EGF). Factor de Crecimiento cuya relevancia oncológica ha sido ampliamente demostrada para el crecimiento de tumores fundamentalmente de origen epitelial.
Técnica Anterior:
El sistema del receptor de EGF (R-EGF) y sus ligandos constituye un complejo molecular cuya interacción regula de forma específica el crecimiento celular y ha sido demostrado su impacto en el crecimiento descontrolado de tumores de origen epitelial. En el proceso de tumorigénesis, Ia desregulación de los procesos paracrinos y autocrinos de activación del (R-EGF), esta dada tanto por Ia sobreproducción de los factores de crecimiento como por Ia síntesis elevada y/o Ia mutación de sus receptores.
El EGF, es un polipéptido de 53 aminoácidos, con un peso molecular aparente de 6045 Da. Este polipéptido fue aislado y purificado por primera vez por Cohén S., J. Biol. Chem. (1962) 237, 1. 555).
El EGF forma parte de Ia familia de ligandos del R-EGF, esta familia está constituida por proteínas relacionadas estructural y funcionalmente. Los otros miembros de esta familia son: TGF, anfiregulina (AR), criptol (CR1 ), factor de crecimiento enlazador de heparina, betacelulina, epiregulina. Por otra parte Ia familia de los poxvirus incluye proteínas relacionadas con el EGF, dentro de ellas Ia más caracterizada es el factor de crecimiento de vaccinia virus (VGF).
Todas estas moléculas son capaces de unirse y activar al (R-EGF), así que son conocidas como ligandos del mismo y juegan un rol en el crecimiento de células normales y neoplásicas en menor o mayor grado.
El R-EGF es una glicoproteína de 170 kDa aproximadamente, cuyo gen ha sido clonado y _ secuenciado. El dominio intracelular de este receptor esta asociado con Ia actividad de proteínas tirosinas quinasas que muestran homología estructural con el producto del oncogen v-erb-B, Io que muestra una relación con el proceso de transformación maligna (Heldin CH. (1984), CeII 37,
9-20.)
Todas las evidencias acumuladas en estos años acerca de Ia relación entre el sistema EGF-R/ EGF-R ligandos y el cáncer, convierten al mismo, en un blanco muy atrayente para Ia inmunoterapia de cáncer.
Resultados previos han demostrado Ia posibilidad de realizar una inmunoterapia activa de cáncer con Ia vacuna basada en EGF. De hecho, se han obtenido evidencias tanto preclínicas como clínicas acerca de Ia inmunogenicidad y Ia baja toxicidad provocada por Ia vacunación con hrEGF unido a una proteína transportadora (González y cois. (1996), Vaccine Research 5(4), 233-243.) EP 0 657 175 describe una composición vacunal que contienen EGF autólogo acoplado a una proteína transportadora y dicho complejo inhibe el crecimiento de tumores dependientes de EGF a través de un efecto auto inmune.
La composición vacunal descrita en EP 0 657 175, son vacunas conjugadas que contiene EGF, acoplado a una proteína transportadora (Ia proteína rP64k, Ia cadena B de Ia toxina de Cholera, Ia proteína de toxoide tetánico y/o anticuerpos monoclonales) y como consecuencia se obtiene una mezcla heterogénea y poco reproducible de especies conjugadas.
El novedoso preparado vacunal descrito en Ia presente invención comprende como principio activo el EGF autólogo y está caracterizado por poseer una composición química homogénea y pureza definida, una inmunogenicidad potenciada, una actividad clínica sustancialmente incrementada y permite disminuir sensiblemente el numero de inmunizaciones para su acción terapéutica
La disminución del contenido del antígeno autólogo en el preparado vacunal de Ia presente invención, sorprendentemente no disminuye, sino que provoca incrementos significativos en los títulos de anticuerpos anti EGF en humanos. La disminución del contenido de EGF y sus derivados en Ia composición vacunal se obtuvo a través de desarrollo de un método de purificación por membrana, el cual también forma parte de esta invención
La presente invención proporciona además un preparado vacunal homogéneo y reproducible que permite incrementar el efecto clínico del mismo disminuyendo el numero de inmunizaciones, Io que brinda una gran ventaja en Ia terapéutica del cáncer y para el paciente, en comparación con composiciones vacunales previamente descritas. La composición vacunal acorde a Ia presente invención puede ser empleada en conjunción con adyuvantes adecuados tales como hidróxido de aluminio o Montanide
En otro aspecto, Ia presente invención involucra un procedimiento sanitario para Ia obtención del preparado vacunal apropiado para Ia administración a pacientes por vía parenteral. El procedimiento comprende un método adecuado de conjugación covalente del hrEGF, a Ia proteína transportadora rP64k y Ia purificación del mismo empleando membranas de Ultrafiltración en un rango de 50-10OkDa. para remover las especies conjugadas biológicamente inactivas (carente de actividad inmunogénica) y otras impurezas químicas.
Descripción Detallada de Ia Invención.
La presente invención proporciona un novedoso preparado vacunal basado en el EGF autólogo, caracterizado por poseer una composición química homogénea y pureza definida, una inmunogenicidad potenciada y una actividad clínica sustancialmente incrementada. Adicionalmente Ia presentación vacunal descrita en Ia presente invención brinda Ia posibilidad de disminuir sensiblemente el número de administraciones necesarias al paciente, cuando se requiera incrementar Ia dosis terapéutica, por el hecho de que esta composición vacunal se obtiene a partir de una metodología que permite alcanzar diferentes concentraciones por mililitros de las especies conjugadas hrEGF-rP64k, conocido como potencia Este nuevo preparado vacunal se obtiene a partir del sorpresivo resultado de que Ia disminución del contenido del antígeno autólogo en Ia composición vacunal a través un novedoso proceso de purificación, no disminuye, sino permite incrementar significativamente Ia respuesta inmune contra el EGF propio en comparación con composiciones heterogéneas empleadas como vacunas basadas en el EGF. El preparado vacunal obtenido a partir de Ia disminución del contenido del antígeno autólogo a través de Ia metodología de purificación por membrana de ultrafiltración tiene una composición homogénea donde las especies inmunológicamente activas (especies conjugadas hrEGF-rP64k) muestran masas molares superiores a 6OkDa.. Este preparado vacunal muestra un perfil de separación cromatográfico por exclusión molecular caracterizado porque donde las especies que portan actividad terapéutica de este preparado vacunal, representan más 90% del área total del cromatograma correspondiente a Ia preparación vacunal en su conjunto, como se muestra en Ia figura 4
Estudios de Espectrometría de Masas realizados para profundizar en Ia caracterización estructural del preparado vacunal, aportan el mapa de péptidos para dos lotes diferentes del preparado vacunal, donde se aprecia gran similitud en Ia posición y proporción de los péptidos que aparecen (ver figura 5). La similitud entre los mapas de péptidos obtenidos a partir de ambas replicas de preparado vacunales es un indicativo del control en las condiciones en que ocurren los procedimientos de conjugación química y purificación descritas también en Ia presente invención. Este estudio permitió identificar Ia secuencia de los péptidos mayoritarios que componen el presente preparado vacunal. (ver tabla 3)
Este preparado vacunal se caracteriza además por una relación de conjugación química entre las proteínas hrEGF y rP64k de (1 :2), esto significa que existen 2 moléculas de hrEGF conjugada por cada molécula de rP64k
Metodología para obtención del preparado vacunal
Procedimiento de purificación para Ia disminución del contenido de EGF autólogo.
A partir de observaciones experimentales que evidenciaron que Ia disminución del contenido de hrEGF en el preparado vacunal aumenta acción ¡nmunogénica del mismo, se desarrolla un método para disminuir el contenido de hrEGF en Ia mezcla heterogénea de conjugados; enriqueciendo el preparado vacunal en especies conjugadas de alto peso molecular (especies inmunológicamente activas) y libre de glutaraldehído. El procedimiento de purificación empleando membranas de ultrafiltración en un rango entre 50- 10OkDa desarrollado y descrito en Ia presente invención consta de dos etapas: En Ia etapa inicial se realizan sucesivos cambios de solución tampón (diafiltración) para remover el glutaraldehído y eliminar el exceso de proteína autóloga, ya sea libre o formando conjugados hrEGF-hrEGF de diferentes tallas. Durante esta etapa se realizan entre 10 y 15 cambios de solución tampón La segunda etapa es Ia concentración del conjugado químico purificado, en el cual mas del 90% de su composición corresponde a Ia especie ¡nmunogénica hrEGF-rP64k. Durante Ia etapa de concentración el volumen inicial del conjugado químico se reduce hasta lograr una concentración de proteínas final (especies conjugadas hrEGF-rP64k) en un rango entre 1- 12 mg/mL. Esta versatilidad en el rango de concentraciones del principio activo (miligramos totales de conjugados hrEGF-rP64k por mililitros) para dicho preparado vacunal brinda una gran ventaja en Ia terapéutica del cáncer. Esto permite incrementar Ia dosis de tratamiento sin que implique para el paciente un incremento en Ia frecuencia de inmunización y/o aumentar el número de sitios de inmunización. Con el propósito de monitorear Ia calidad de Ia purificación del conjugado químico se evalúa el pH y Ia conductividad del retenido y del permeado. Se realiza también Ia determinación de Ia concentración de proteína por el método descrito por Lowry D. H. y col. J. Biol Chem 191 : 495-498, 1951 y se determina el porciento de homogeneidad a partir del análisis cromatográfico por filtración en gel (HPLC-FG) .
La singularidad de esta metodología asegura que el preparado vacunal obtenido tenga una composición homogénea y pureza definida, caracterizada por Ia presencia mayoritaria de las especies inmunológicamente activas: especies conjugadas hrEGF-rP64k. Sorprendentemente, Ia remoción del exceso de proteína autóloga (hrEGF) libre o polimérico no provoca Ia reducción, sino que permite incrementar significativamente Ia concentración de anticuerpos anti EGF (a Ia dilución 1/1000), a 10 veces mas con relación a Ia concentración de anticuerpos alcanzada al inmunizar ratones con polímeros de hrEGF y con hrEGF libre. La reducción del contenido de proteína autóloga en Ia preparación vacunal provoca en pacientes incrementos de al menos 2 veces el máximo titulo de anticuerpos anti EGF. Este incremento del titulo de anticuerpos se observa aun en aquellos pacientes que reciben Ia mitad de Ia dosis (2.4 mg) por inmunización en comparación con pacientes que reciben (4.8 mg) por dosis del preparado
vacunal descrito en EP 0657 175. Estos resultados indican que el preparado vacunal, descrito en Ia presente invención tiene mayor actividad inmunogénica por miligramo de proteína activamente inmunogénica, comparado con otros preparados vacunales
Obtención del conjugado químico entre Ia proteína recombinante P64k (rP64k) y el Factor de Crecimiento Epidérmico humano recombinante (hrEGF).
A partir de Ia evaluación y optimización de las condiciones para Ia reacción de química conjugación entre las proteínas hrEGF y rP64k se desarrolla un método de conjugación química que requiere de una elevada proporción molar de Ia proteína autóloga, 10 moles de hrEGF por cada mol de rP64k para garantizar una elevada eficiencia de conjugación entre ambas durante Ia conjugación. El exceso necesario de proteína autóloga durante Ia conjugación química, para garantizar Ia eficiencia de Ia misma, se elimina seguidamente a través del método de purificación por membranas de ultrafiltración descrito anteriormente, el cual permite Ia obtención del preparado vacunal con elevada homogeneidad. El procedimiento descrito en Ia presente invención para garantizar una adecuada conjugación química entre ambas proteínas consta de un solo paso y se inicia mezclando Ia proteína hrEGF concentrada previamente (>6 mg/mL) y Ia proteína rP64k (> 1 mg/mL) en el reactor de conjugación. A esta mezcla proteica se Ie añade posteriormente Ia solución PBS/MgCI2 (pH 6.8-7.2) y Ia solución de conjugación de glutaraldehído 0.5 %. La mezcla se mantiene en agitación constante por 2 horas a una temperatura 22°C± 2°C. La concentración final de proteína en Ia mezcla de reacción para el hrEGF es 0.82 mg/mL y para Ia proteína rP64k es 0.89 mg/mL. La concentración de proteínas totales durante Ia reacción de conjugación es de 2 mg/mL y Ia concentración final del glutaraldehído en Ia mezcla de reacción es de 0.05 %. La composición vacunal acorde a Ia presente invención puede ser empleada en conjunción con adyuvantes adecuados, tales como hidróxido de aluminio o Montanide. En otro aspecto, Ia presente invención involucra un procedimiento sanitario para Ia obtención del preparado vacunal, administrado por vía parenteral que minimiza las oportunidades de contaminación microbiana del preparado vacunal durante su obtención, permite realizar Ia metodología de purificación del conjugado químico en pocas horas y facilita el incremento del volumen del preparado vacunal a obtener entre otras ventajas. Los ejemplos siguientes se ofrecen para ilustrar más detalladamente Ia presente invención. El Ejemplo 1 describe Ia caracterización molecular del preparado vacunal descrito en Ia presente invención. La caracterización molecular incluye: Ia identificación cromatográfica por HPLC-FG de las especies conjugadas formadas durante Ia reacción de conjugación, Ia determinación de Ia razón de conjugación entre las proteínas hrEGF y rP64k y Ia definición del mapa de péptidos que caracteriza a este novedoso preparado vacunal. El Ejemplo 2 describe los bioensayos en ratón realizados para evaluar Ia inmunogenicidad del novedoso preparado vacunal descrito en Ia presente invención.
El Ejemplo 3 describe Ia eficacia del uso clínico del presente preparado vacunal en el tratamiento de tumores de pulmón de origen epitelial.
El Ejemplo 4 describe Ia obtención de preparados vacunales ajustados a diferentes potencias (miligramos totales de conjugado hrEGF-rP64k/vial), empleando Ia misma metodología de conjugación y purificación descrita en Ia presente invención.
El Ejemplo 5 muestra Ia remoción del glutaraldehído empleado en Ia reacción de conjugación, mediante Ia metodología de purificación del conjugado químico a través de una membrana de ultrafiltración 5OkDa.
EJEMPLOS:
EJEMPLO 1 : Caracterización molecular del preparado vacunal descrito en Ia presente invención (Preparado Vacunal A).
1.1 Caracterización cromatográfica del preparado vacunal descrito en Ia presente invención
Para Ia caracterización cromatográfica del preparado vacunal purificado por ultrafiltración se emplearon como indicadores conjugados homoligoméricos hrEGF-hrEGF y rP64k-rP64k. Los perfiles cromatográficos mostrados por los conjugados homoligoméricos (hrEGF-hrEGF y rP64k- rP64k) se compararon con el perfil cromatográfico mostrado por el conjugado químico obtenido de Ia reacción de conjugación entre las proteínas hrEGF y rP64k sin purificar. En Ia figura 1 se muestra el perfil del conjugado homoligomérico rP64k-rP64k y el perfil que se obtiene al realizar Ia conjugación química entre las proteínas hrEGF y rP64k (conjugado químico sin purificar por ultrafiltración). La zona encerrada en el círculo enmarca el área donde se encuentran las especies conjugadas hrEGF-rP64k. El perfil del conjugado rP64k-rP64k no muestra total coincidencia con el mostrado por el del conjugado químico entre las proteínas hrEGF-rP64k debido al aporte de las moléculas de hrEGF conjugadas a Ia rP64k. En Ia figura 2 se muestran los resultados obtenidos después de realizar una electroforesis desnaturalizante en condiciones de reducción y Western Blot del preparado vacunal purificado por ultrafiltración. El revelado se realizó con un anticuerpo anti EGF conjugado con fosfatasa alcalina. El EGF es una proteína de peso molecular aparente de 6kDa por consiguiente debe localizarse en Ia zona inferior del gel. Su identificación mediante inmunodetección con anticuerpos anti-EGF en Ia zona correspondiente a las proteínas de peso molecular aparente superiores a 6 kDa confirma que existen moléculas de hrEGF unidas a Ia rP64k en Ia zona del gel correspondiente a las especies conjugadas hrEGF-rP64k.
Cuando se compara el perfil del conjugado químico hrEGF-rP64 sin purificar y el perfil obtenido para el conjugado homoligomérico hrEGF-hrEGF se puede apreciar que existe una correspondencia entre ambos perfiles. Esta evidencia confirma que después del valle se encuentra Ia zona que corresponde a las especies de hrEGF conjugadas entre si (polímeros de hrEGF) y de moléculas de hrEGF libre (Figura 3).
El perfil cromatográfico por exclusión molecular (ver figura 4) del preparado vacunal objeto de Ia presente invención muestra que el área correspondiente a las especies conjugadas hrEGF-rP64k constituyen mas del 90% de área total del cromatograma (zona sombrada) evidenciando Ia elevada homogeneidad de Ia composición vacunal descrita.
1.2. Determinación de Ia razón de conjugación entre las proteínas hrEGF y rP64k en el preparado vacunal descrito en Ia presente invención.
Con el objetivo de determinar Ia razón de conjugación en que se encuentran el hrEGF y Ia rP64k en el preparado vacunal se determinaron los moles presentes de cada una de sus proteínas constituyentes. Para esto se tomó un preparado vacunal obtenido a partir de un proceso de purificación con membrana de ultrafiltración 50 kDa y se colectó Ia fracción cromatográfica correspondiente a las especies conjugadas hrEGF-rP64k. Estas fracciones fueron sometidas a análisis de aminoácidos. La determinación de Ia razón de conjugación se realizó por 2 métodos. 1. Un método se basó en Ia estimación de Ia cantidad de Fenilalanina (Phe) y Treonina (Thr) en el preparado vacunal (aminoácidos solo presentes en Ia molécula de rP64k). Las cantidades de estos aminoácidos se usaron para determinar Ia cantidad de rP64k. A partir de esta última, y teniendo en cuenta Ia cantidad total de aminoácidos de Ia mezcla, se determinó Ia cantidad de EGF. 2. El otro método se basó en Ia determinación directa de las cantidades relativas de cada proteína, utilizando Ia secuencia de aminoácidos y basado en Ia cuantíficación de los aminoácidos Asparagina+Aspártico (Asx), Glutamina + Glutámico (GIx), Glicina (GIy) y Alanina (Ala) (residuos altamente estables a Ia hidrólisis acida y que comúnmente se usan en Ia cuantificación de proteínas). Los resultados obtenidos por cada método se muestran a continuación en las tablas 1 y 2.
Tabla 1 : Determinación de Ia razón de conjugación entre las proteínas hrEGF y rP64k realizando Ia determinación de composición aminoacídica del preparado vacunal purificado por ultrafiltración, basándose en el método de determinación de Ia cantidad de Fenilalanina (Phe) y Treonina (Thr)
Los resultados obtenidos por ambos métodos muestran correspondencia en Ia estimación de Ia razón de conjugación entre las proteínas hrEGF:rP64k para el preparado vacunal descrito en Ia presente invención. La razón de conjugación calculada fue de (1 :2), esto significa 2 moléculas de hrEGF por cada molécula de rP64k 1.3. Definición del mapa de péptidos que caracteriza al preparado vacunal descrito en Ia presente invención.
Con el objetivo de caracterizar estructuralmente el preparado vacunal que se presenta en Ia presente invención y evidenciar Ia reproducíbilidad en Ia obtención del mismo se desarrolló y caracterizó el mapa de péptidos obtenido tras Ia digestión de las fracciones conjugadas hrEGF- rP64k con Ia endoproteasa GIu-C. Cada una de las fracciones del mapa obtenido fue identificada y secuenciada por Espectrometría de Masas
La figura 5 muestra los mapas de péptidos obtenidos a partir de dos preparado vacunales obtenidos independientemente, donde se aprecia gran similitud en los péptidos que aparecen y Ia proporción existente de cada uno de ellos. La reproducibilidad entre los mapas de péptidos obtenidos a partir de ambos preparado vacunales es un indicativo del control que existe sobre las condiciones en Ia que ocurren los procedimientos de conjugación química y purificación descritas también en Ia presente invención.
La identificación de los péptidos contenidos en cada fracción del mapa se obtuvo por análisis de cada una de ellas por el método MALDI (siglas en Ingles de Matrix assisted Láser desorptionjonization/ lonización_desorción de matriz asistida por Láser) y por el método ESI-MS (siglas en ingles de Electrospray lonization/ Electronebulización por ionización). En Ia tabla 3 se muestra Ia secuencia de los péptidos mayoritarios.
Tabla 3. Composición aminoacídica de los péptidos mayoritarios obtenidos tras Ia digestión de las fracciones conjugadas EGF-P64k con Ia endoproteasa GIu-C. La composición aminoacídica se determinó por MALDI y ESI-MS.
EJEMPLO 2.
Inmunogenicidad del preparado vacunal descrito en Ia presente invención.
En este ejemplo se describe el ensayo de actividad biológica realizado para evaluar Ia inmunogenicidad del preparado vacunal descrito anteriormente (Preparado Vacunal A) comparativamente con un preparado vacunal descrito en EP 0657 175. nombrado (Preparado Vacunal B)
Para el ensayo se realizó Ia inoculación de 10 ratones con una única dosis de 200 μL de una emulsión agua en aceite (50/50 % v/v) de los inmunógenos (preparado vacunal convencional obtenido por diálisis, preparado vacunal obtenido por purificación con membrana de ultrafiltración y el permeado obtenido del proceso de purificación por UF/DF, donde se encuentran las especies conjugadas hrEGF-hrEGF) con el adyuvante Montanide ISA 51. La dosis de proteína aplicada para cada inmunógeno se refiere en Ia tabla 4.
A los 14 días siguientes a Ia inoculación se realizó Ia extracción del suero de los animales y Ia evaluación del título de anticuerpos anti-EGF mediante un ELISA. El criterio de positividad de ensayo fue que Ia densidad óptica medida a 405 nm fuera más de dos veces Ia media obtenida para el blanco de placa. El blanco de placa se obtiene cuando se adiciona al pocilio tampón de bloqueo en lugar de muestra de suero anti-EGF. La prueba de Mann-Whitney aplicada al análisis de los datos, se realizó utilizando un programa estadístico.
Tabla 4: Inmunógenos evaluados y Ia concentración de proteínas a ser inoculado por animal según corresponda para el ensayo de actividad biológica.
En Ia figura 6 se muestran los resultados del ensayo de actividad biológica como evidencia de Ia actividad inmunogénica de cada inmunógeno evaluado. Los componentes del inmunógeno correspondientes a los conjugados poliméricos de hrEGF y hrEGF libre), no muestran actividad biológica relevante, pues su respuesta está al nivel del criterio de positividad del ensayo o inferior. Estos resultados verifican Ia hipótesis de que el EGF por si mismo no induce respuesta inmunogénica
El análisis estadístico de todos los resultados al aplicar el test de" Mann-Whitney Test" (ver tabla 5) mostró diferencias altamente significativas para los títulos de anticuerpo anti EGF 1/1000 con p=0.0004 y para el titulo 1/100 con p=0.0006 del grupo de animales inoculados con el Preparado Vacunal A con respecto a los títulos alcanzados para el grupo de animales inoculados con el Preparado Vacunal B. Esto indica que el Preparado Vacunal A, purificado mediante membrana de ultrafiltración tiene mayor actividad inmunogénica por miligramo de proteína que el Preparado Vacunal B, obtenido por el método de purificación basado en membrana de diálisis. El Preparado Vacunal A produce un incremento de Ia concentración de anticuerpos anti EGF (a Ia dilución 1/1000) 10 veces mayor con relación al alcanzado al inmunizar con el conjugado correspondiente a los polímeros de hrEGF y hrEGF' libre. Con relación al preparado vacunal descrito previamente en EP 0657175 el preparado vacunal descrito en Ia presente invención produjo un incremento 2 veces mayor de Ia concentración de anticuerpos anti EGF
Análisis estadístico de Títulos de anticuerpo anti EGF (1/1000) en suero de ratón
Mann-Whitney Test and Cl: G11/1000; G3 1/1000
N Median
Gl (Preparado Vacunal B) 1/1000 20 0,4300
G3 (Preparado vacunal A) 1/1000 20 0,7120
Point estímate for ETA1-ETA2 ís -0,3115
95,0 Percent CI for ETA1-ETA2 ís (-0,4500;-0 ,1790)
W = 278,0
Test of ETAl = ETA2 vs ETAl not = ETA2 ís significant at 0,0004
The test is significant at 0,0004 (adj usted for ties)
Análisis estadístico de Títulos de anticuerpo anti EGF (1/100) en suero de ratón
Mann-Whitney Test and Cl: G11/100; G31/100
N Median
Gl (Preparado vacunal convencional) 1/100 20 1,0785
G3 (Preparado vacunal por ultraf íltración) 1/100 20 1,3040
Point estímate for ETA1-ETA2 is -0,2590
95,0 Percent CI for ETA1-ETA2 is (-0,4389;-0 ,1149)
W = 282,5
Test of ETAl = ETA2 vs ETAl not = ETA2 is significant at 0,0006
The test is significant at 0,0006 (adjusted for ties)
Tabla 5: Reporte estadístico de Test de Mann-Whitney empleado para evaluar Ia inmunogenicidad de ambos preparados vacunales a través del titulo de anticuerpo antiEGF en el suero de ratones
EJEMPLO 3. Evaluación de Ia eficacia del uso clínico del preparado vacunal descrito en Ia presente invención en el tratamiento de tumores de pulmón de origen epitelial.
El objetivo de este ejemplo es evaluar en pacientes Ia inmunogenicidad producida por el Preparado Vacunal A en comparación con Ia inmunogenicidad lograda por el Preparado Vacunal B obtenido por el método de purificación por diálisis En este estudio se trataron pacientes portadores de tumores de pulmón de células no pequeñas en estadios avanzado. Se definieron para el estudio 2 grupos de pacientes (pacientes vacunados con el Preparado Vacunal B y pacientes vacunados con el Preparado Vacunal A, descrito en Ia presente invención. La dosis de preparado vacunal aplicada por paciente para cada grupo fue Ia siguiente' los pacientes vacunados con el Preparado Vacunal B recibieron 1.2 mg de proteína total por sitio de inmunización, los pacientes vacunados con el Preparado Vacunal A recibieron 0.6 mg de proteínas totales por sitio de inmunización. Para ambos grupos los sitios de inmunización fueron 4. Todos los pacientes recibieron terapia oncoespecífica, al menos 4 semanas antes de
iniciar el ensayo. Las inmunizaciones se realizaron por vía intramuscular, y se continuaron sucediendo 1 vez de manera mensual.
La respuesta inmune humoral de ambos grupos de pacientes se evaluó a través de Ia obtención del suero sanguíneo. La variable de valoración fundamental de los resultados fue el titulo de anticuerpo específico contra el EGF. Este parámetro se determinó por medio de un sistema ELISA. Los valores positivos fueron aquellas lecturas de densidad óptica que estuvieron 2 veces por encima del valor del control negativo. El titulo de anticuerpo reportado significa Ia mayor dilución de los sueros positivos. El análisis de Ia respuesta inmune para los pacientes integrantes de cada grupo representado eή Ia tabla 6 demostró que Ia media geométrica del titulo de anticuerpos máximo para el grupo de paciente inmunizados con el Preparado Vacunal A corresponde a 1 :56421 , mientras que para el grupo de pacientes inmunizados con el Preparado Vacunal B Ia media geométrica del titulo de anticuerpo máximo fue de 1 :23515. Esto significa que el preparado vacunal descrito en Ia presente invención produjo un incremento 2 veces mayor de Ia media geométrica del titulo de anticuerpos anti EGF máximo con relación al alcanzado con el preparado vacunal B.
Históricamente los pacientes no inmunizados muestran un título anti-EGF autólogo de 1 :500. Por Io tanto el preparado vacunal descrito en Ia presente invención (Preparado Vacunal A) provoca un incremento de al menos 100 veces el título de anticuerpos anti-EGF en sujetos inmunizados
Tabla 6.
Resultado del
análisis de Ia media geométrica de Ia inmunogenicidad de ambos preparados vacunales medido a través del titulo de anticuerpos anti-EGF en el suero de los pacientes.
Es importante remarcar que el grupo de pacientes inmunizados con el Preparado Vacunal A, descrito en Ia presente invención, mostraron una media geométrica superior del titulo dé anticuerpo anti-EGF recibiendo Ia mitad de Ia cantidad de proteínas totales por inmunización (2.4 mg) que Ia recibida por el grupo de pacientes inmunizados con el Preparado Vacunal B, que correspondió con 4,8mg de proteínas totales, Io que constituye un resultado sorprendente. Estos resultados evidencian que el exceso de proteína autóloga hrEGF, ya sea en forma de polímeros o de forma libre, no aporta más inmunogenicidad al preparado vacunal, sino diluye Ia acción inmunogénica del conjugado químico hrEGF-rP64k.
EJEMPLO 4:
Obtención del preparado vacunal descrito en Ia presente invención ajustado a diferentes potencias (concentración de proteínas totales por vial).
Con el propósito de demostrar Ia capacidad de obtener preparados vacunales con diferentes potencias (concentraciones de proteínas totales por vial) se realizó Ia metodología de purificación como se describe en los a continuación:
Ensayo 1 : Al concluir Ia diafiltración se concentró el conjugado químico purificado hasta una concentración final de proteínas de 2 mg/mL.
Ensayo 2: Al concluir Ia diafiltración se concentró el conjugado químico purificado hasta una concentración final de proteínas de 5 mg/mL.
Ensayo 3: Al concluir Ia diafiltración se concentró el conjugado químico purificado hasta una concentración final de proteínas de 12 mg/mL.
En todos los ensayos el volumen total de conjugado químico empleado fue 1500 mL, se opero a una presión transmembrana de 1 ,5 bar y se realizaron 7 cambios de solución tampón durante Ia diafiltracion. Para Ia realización de esta evaluación se establecieron dos criterios de selección: El primero fue alcanzar un porciento homogeneidad del preparado vacunal > 80%. El segundo criterio fue Ia no presencia de precipitados de proteínas durante Ia operación de purificación.
Los resultados presentados en Ia tabla 7 muestran Ia obtención de preparados vacunales ajustados a diferentes concentraciones de proteínas por mililitro, garantizando elevados niveles de homogeneidad (90.92 %,96.79 % y, 95.50 % de especies conjugadas hrEGF- rP64k ) y sin producir precipitación de proteínas en los mismos.
Tabla 7: Valores correspondientes al porciento de homogeneidad en los preparados vacunales ajustados a diferentes concentraciones finales de proteínas,
EJEMPLO 5:
Remoción de glutaraldehído en el preparado vacunal descrito en Ia presente inversión.
Para evaluar Ia remoción del agente conjugante (glutaraldehído) se cuantificó el contenido de glutaraldehído residual en el Preparado Vacunal B y en el Preparado Vacunal A, mediante un método de separación cromatográfica por fase reversa (HPLC-RP) empleando una columna C-8. Este método requirió primeramente, Ia precipitación de Ia proteína contenida en las muestras con ácido perclórico y después una reacción con fenilhidracina.
La figura 7 muestra que el contenido residual de esta impureza presente en ambos preparados vacunales fue menor, de 0.2 ug/mL o menor de 0.002 ppm, (concentración limite superior establecida para esta impureza) partiendo de una concentración inicial de 530 mg/mL ó 530 ppm. Aun cuando ambos preparados cumplen con Ia especificación establecida para esta impureza, Ia figura 7 ilustra que el preparado vacunal A obtenido de aplicar el método de purificación del conjugado químico por membranas de Ultrafiltración, posee un contenido inferior de glutaraldehído, Io que Ie aporta gran seguridad para el paciente a dicho preparado vacunal
Breve Descripción de las Figuras. Figura 1. Se muestra Ia superposición del cromatograma de un conjugado homoligomérico rP64k- rP64k y del cromatograma de un conjugado químico EGF-P64k sin purificar. Encerrado en el círculo se muestra Ia coincidencia de los perfiles entre ambos cromatogramas. El eje X presenta el tiempo al cual eluye cada componente de Ia muestra y el eje Y representa el valor de intensidad a 216 nm de cada componente de Ia muestra, como indicador de Ia concentración de proteína en Ia misma.
Figura 2. Inmunodetección con un anticuerpo anti EGF conjugado con fosfatasa alcalina posterior a Ia separación electroforética en SDS- PAGE para preparado vacunal obtenido por ultrafiltración. Línea 1 : Marcador de peso molecular, Línea 2 Preparado vacunal Figura 3. Se muestra Ia superposición del cromatograma correspondiente al conjugado homoligomérico hrEGF-hrEGF y del cromatograma de un conjugado químico hrEGF-rP64k sin purificar. Encerrado en el círculo se muestra Ia coincidencia de especies entre ambos cromatogramas. . El eje X presenta el tiempo al cual eluye cada componente de Ia muestra y el eje Y representa el valor de intensidad a 216 nm de cada componente en Ia muestra, como indicador de Ia concentración de proteína en Ia misma.
Figura 4. Perfil cromatográfico correspondiente al preparado vacunal descrito en Ia presente invención. El área sombreada se corresponde con las especies conjugadas hrEGF-rP64k. El eje X presenta el tiempo al cual eluye cada fracción y el eje Y representa el valor de intensidad a 216 nm de cada componente en Ia muestra, como indicador de Ia concentración de proteína en Ia misma.
Figura 5. Mapa peptídico de Ia fracción cromatográfica correspondiente al conjugado hrEGF- rP64k. Se presentan los resultados obtenidos para dos preparado vacunales purificados independientemente a través de una membrana de ultrafiltración. El eje de las X representa el tiempo y el eje de las Y representa las unidades de mili intensidad. Figura 6: Títulos de anticuerpos anti EGF en ratones inmunizados con varios inmunógenos: preparado vacunal convencional, preparado vacunal purificado por ultrafiltración y el permeado procedente del método de purificación por ultrafiltración del preparado vacunal El eje X corresponde a las diluciones realizadas al suero obtenido de cada animal y el eje Y representa el
valor de densidad óptica a 405 nm de cada muestra como indicador de Ia concentración de proteína en Ia misma.
Figura 7: Perfil cromatográfico por HPLC-RP obtenido durante Ia cuantificación del contenido de glutaraldehído residual para el preparado vacunal obtenido a partir del método de purificación por empleando las membranas de ultrafiltración 5OkDa (Preparado Vacunal A) y para el preparado vacunal obtenido empleando el método de purificación por membrana de diálisis (Preparado Vacunal B).
Claims
1. Una composición vacunal cuyo principio activo comprende un conjugado proteico hrEGF- rP64k, caracterizada porque cada molécula de Ia proteína rP64K tiene enlazada dos moléculas de hrEGF
2. Una composición vacunal según reivindicación 1 caracterizada porque el conjugado proteico hrEGF-rP64k está en una proporción de 12.04 nmoles de proteína rP64k por 24.05 nmoles de hrEGF.
3. Una composición vacunal según reivindicación 1 caracterizada porque es una mezcla homogénea de hrEGF-rP64k libre de especies moleculares como polímeros de hrEGF o hrEGF libre.
4. La composición vacunal según reivindicación 1 caracterizada porque Ia mezcla homogénea de hrEGF-rP64k esta libre de glutaraldehído.
5. La composición vacunal según reivindicación 1 , caracterizada porque adicionalmente contiene un adyuvante apropiado, seleccionado del grupo que comprende hidróxido de aluminio o Montanide.
6. La composición vacunal según reivindicación 5, caracterizada porque contiene como adyuvante Montanide.
7. La composición vacunal según reivindicación 5, caracterizada porque contiene como adyuvante hidróxido de aluminio.
8. La composición vacunal según reivindicaciones 1 caracterizada porque induce un incremento de al menos 10 veces el título de anticuerpos anti-EGF en el suero mamíferos inmunizados.
9. La composición vacunal según reivindicaciones 1 caracterizada porque induce un incremento de al menos 10 veces el título de anticuerpos anti-EGF en el suero de humanos.
10. La composición vacunal según reivindicaciones 1 caracterizada porque induce un incremento de al menos 100 veces el título de anticuerpos anti-EGF en el suero de humanos.
11. Un procedimiento para Ia obtención de forma sanitaria de Ia composición vacunal de Ia reivindicación 1 que comprende un procedimiento adecuado de conjugación covalente del EGF, a Ia proteína transportadora rP64k y Ia purificación del mismo, empleando una membrana de Ultrafiltración para remover las especies conjugadas biológicamente inactivas y otras impurezas químicas.
12. Un procedimiento para Ia obtención de Ia composición vacunal según Ia reivindicación 11 , caracterizado porque dicha reacción de conjugación se inicia mezclando Ia proteína hrEGF concentrada previamente (>6 mg/mL) y Ia proteína rP64k (≥ 1 mg/mL) en el reactor de conjugación, a dicha mezcla proteica se Ie añade Ia solución PBS/MgCI2 (pH 6.8-7.2) y Ia solución de conjugación de glutaraldehído 0.5 %, finalmente, Ia mezcla se mantiene en agitación constante por 2 horas a 22°C± 2°C de temperatura.
13. Un procedimiento para Ia obtención de Ia composición vacunal según Ia reivindicación 12, caracterizado porque las condiciones de conjugación de las proteínas hrEGF y rP64k garantizan una relación de conjugación de dos moléculas de hrEGF por cada molécula de rP64k.
14. Un procedimiento para Ia obtención de Ia composición vacunal según Ia reivindicación 11 , caracterizado porque el paso de purificación del producto de Ia reacción de conjugación covalente se realiza por el método de ultrafiltración/diafiltración usando una membrana que puede estar en el rango entre 50 y 100 kDa.
15. Un procedimiento para Ia obtención de Ia composición vacunal según Ia reivindicación 14, caracterizada porque el paso de purificación del producto de Ia reacción de conjugación química se realiza por el método de ultrafiltración/diafiltración usando una membrana de 50 kDa.
16. Un procedimiento para Ia obtención de Ia composición vacunal según Ia reivindicación 14, caracterizado porque el paso de purificación del producto de Ia reacción de conjugación química se realiza por el método de ultrafiltración/diafiltración usando una membrana de 10O kDa.
17. La composición vacunal cuyo principio activo es un conjugado proteico hrEGF-rP64k, caracterizada porque esta purificada por el método de Ia reivindicación 15.
18. La composición vacunal cuyo principio activo es un conjugado proteico hrEGF-rP64k, caracterizada porque esta purificada por el método de Ia reivindicación 16.
19. La composición vacunal cuyo principio activo es un conjugado proteico hrEGF-rP64k, caracterizada porque Ia concentración final de proteína total del preparado vacunal se ajusta en un rango entre 1 - 12 mg/mL.
20. Uso de Ia composición vacunal de Ia reivindicación 17 para Ia fabricación de un reactivo útil para desencadenar una respuesta inmune contra el EGF humano.
21. Uso de Ia composición vacunal de Ia reivindicación 18 para Ia fabricación de un reactivo útil para desencadenar una respuesta inmune contra el EGF humano.
22. Uso de Ia composición vacunal de Ia reivindicación 17 para Ia fabricación de un reactivo útil en el tratamiento de tumores de origen epitelial.
23. Uso de Ia composición vacunal de Ia reivindicación 18 para Ia fabricación de un reactivo útil en el tratamiento de tumores de origen epitelial.
Priority Applications (19)
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