WO2002045747A1 - Combinaciones inmunoterapeuticas para el tratamiento de tumores - Google Patents

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Rolando. Perez Rodriguez
Gisela María GONZALEZ MARINELLO
Tania Crombet Ramos
Irene Beausoleil Delgado
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Definitions

  • the present invention relates to the field of immunology and more specifically to immunotherapy of cancer, particularly with immunotherapeutic combinations and methods of treatment to prevent the growth of tumor cells and / or eliminate said cells.
  • EGF-R EGF receptor system
  • the EGF receptor system (EGF-R) and its ligands constitute a molecular complex whose interaction specifically regulates cell growth and its impact on the uncontrolled growth of tumors of epithelial origin has been demonstrated.
  • the deregulation of the paracrine and autocrine processes of activation of EGF-R is given both by the overproduction of growth factors and by the high synthesis and / or mutation of their receptors.
  • the Epidermal Growth Factor (EGF-R) receptor is a transmembrane glycoprotein of 1186 amino acids and 170 kD molecular weight that is widely expressed in body tissues, and has been implicated in various stages of embryogenic development .
  • EGF or TGF- ⁇ induces receptor dimerization as well as heterodimerization with other members of the ErbB family, including HER-2 (Cohen BD et al. (1996) J Biol Chem 271 : 7620-7629).
  • the binding of ligands to the receptor triggers a cascade of intracellular signals (Ullrich A and Schlessinger J (1990) Cell 61: 203-212) that lead to cell growth and differentiation.
  • EGF Epidermal Growth Factor
  • TGF ⁇ Transforming Growth Factor of type alpha
  • EGF Epidermal Growth Factor
  • AR anfiregulin
  • CR1 cryptol
  • heparin binding growth factor betacellulin
  • epiregulin heparin binding growth factor
  • betacellulin betacellulin
  • epiregulin heparin binding growth factor
  • EGF-R heparin binding growth factor
  • TGF ⁇ is a 50 amino acid polypeptide, capable of competing with EGF for binding to EGF-R.
  • Anti-EGF antibodies are not able to recognize TGF ⁇ (Todaro G J et al. (1976), Nature 264: 26-31), so both growth factors are two immunologically different entities.
  • the system of EGF-R and its ligands has been used as a target for passive immunotherapy (IP), through the use of monoclonal antibodies (AMC) against EGF-R, natively, associated with drugs, toxins, or radioactive isotopes ( Vollmar AM et al. (1987) J Cell Physiol 131: 418-425) in the IP of tumors with high expression of this receptor.
  • AMC monoclonal antibodies
  • These antibodies have been selected for their ability to inhibit the binding of EGF to its receptor (neutralizing antibodies).
  • Passive immunotherapy with the specific IOR-R3 Monoclonal Antibody against EGF-R has shown that specific binding of IOR-R3 to the receptor inhibits EGF binding to it, and inhibits autophosphorylation of the Receiver, dependent on EGF.
  • passive immunotherapy with IOR-R3 inhibited the growth of human tumor cells in nude mice, and has slowed the tumor growth rate of some patients in clinical trials.
  • This system has also been targeted for cancer-specific active immunotherapy.
  • An example of this is the use of a vaccine that contains one of the main ligands of EGF-R, EGF, coupled to a transporter protein (US 5,894,018).
  • This vaccine is capable of inducing a specific antibody response against autologous EGF and inhibiting its binding to its receptor, blocking the proliferation mechanisms triggered by this binding.
  • TAE Ehrlich ascites tumor
  • the present invention proposes the use of combined immunotherapies, directed both against the receptor with kinase activity in tyrosine residues (RTK) and against its ligands, with the aim of enhancing the effect observed by independently applying the different forms of immunotherapy described in the state of the art, directed only against some of the components of the receptor / ligand system.
  • This potentiation is justified by the joint blocking of both ligands and receptor, in a treatment method that includes both active ingredients.
  • the invention relates to an immunotherapeutic combination for the treatment of tumors with an effect on cells whose growth is dependent on the RTK receptor system, which comprises the simultaneous or sequential administration of A + B; or A + C; or A + D; or B + C; or B + D; or C + D, where A, B, C and D are: A. - An antibody against an RTK receptor;
  • O- A vaccine whose active ingredient is an RTK receptor, which induces antibodies against said RTK receptor;
  • D.- A vaccine whose principle is the ligand (s) of an RTK receptor, which induces antibodies against said ligand (s) of the RTK receptor;
  • the monoclonal antibody against the RTK receptor is an antibody against the Epidermal Growth Factor receptor, R-EGF, and more specifically is the humanized antibody against the EGF receptor, hR3, deposited with number Access 951110101 at ECACC, England.
  • the antibody against the selected RTK receptor ligand can be an antibody against EGF or against TGF alpha.
  • the invention also relates to an immunotherapeutic combination where the active principle of the vaccine can be the EGF receptor, the EGF itself or the TGF alpha, or a conjugate of these active ingredients with the p64K protein of Neisseria meningitis.
  • the invention also relates to a method for the control of the growth and / or proliferation of cells whose growth is dependent on the RTK receptor system which comprises the treatment with the therapeutic combinations of the invention, which can be applied simultaneously or sequential, in which case said application of the components of the combination is carried out in any order.
  • the immunotherapeutic combinations of the invention prevent the growth of tumor cells by eliminating said cells, by blocking RTK receptors and their ligands. This blockage can be achieved, among other approaches, with the combination, both simultaneous and sequential of active (therapeutic vaccines) and / or passive immunotherapies (Monoclonal Antibodies) directed to growth factors such as Epidermal Growth Factor, EGF. , and the Transforming Growth Factor of type alpha, TGF ⁇ and its receptors (ieEGF-R).
  • EGF Epidermal Growth Factor
  • ieEGF-R Transforming Growth Factor of type alpha, TGF ⁇ and its receptors
  • Blocking growth factors or their receptors causes an effect of cell proliferation arrest.
  • This invention shows how simultaneous blocking of both ligands and receptors enhances the inhibitory effect on said cell proliferation.
  • This therapeutic concept is of great importance in the treatment of malignant tumors, which have as their fundamental property an increase in the speed of cell proliferation.
  • Immunotherapeutic combinations are described that cause blocking of RTK receptors and / or their ligands, by combining active and / or passive immunotherapy against them.
  • the referred procedures can be applied to patients in different clinical stages of tumors of epithelial origin that overexpress EFG-R.
  • the combination of active and passive immunotherapy can be simultaneous or sequential depending on whether the therapeutic procedure is to be used in patients with advanced disease or as adjuvant therapy.
  • the proposed therapeutic combination is passive immunotherapy with Monoclonal Antibodies (AMC) that recognize the RTK receptor and / or AMC that recognize ligands of said receptor, in combination with the onco-specific therapy of choice, as therapy of attack; followed by active immunotherapy treatment with vaccines aimed at ligands of said receptor and / or the receptor itself, to achieve maintenance responses of the therapeutic effect.
  • AMC Monoclonal Antibodies
  • the proposed therapeutic combinations are either the passive immunotherapy treatment with Monoclonal Antibodies (AMC) that recognize the RTK receptor and / or AMC that recognize ligands of said receptor together with active immunotherapy with vaccines directed at ligands of said receptor and / or the recipient himself, or the combination where the treatment of passive immunotherapy with Monoclonal Antibodies (AMC) that recognize the receptor with kinase activity in tyrosine and / or AMC residues that recognize ligands of said receptor, as attack therapy; It is followed by the simultaneous treatment of active immunotherapy with vaccines directed to the recipients of said receptor and / or to the recipient, to achieve maintenance responses of the therapeutic effect.
  • AMC Monoclonal Antibodies
  • PROCEDURE 1 Immunotherapeutic combination that includes passive immunotherapy with monoclonal antibodies that recognize the receptor with kinase activity in tyrosine residues (ieEGF-R) and / or receptor ligands (ieEGF, TGF ⁇ ), followed by active immunotherapy with vaccines aimed at the recipient and / or receptor ligands, to be applied in patients with advanced epithelial tumors.
  • ieEGF-R tyrosine residues
  • ieEGF, TGF ⁇ receptor ligands
  • passive immunotherapy is used with monoclonal antibodies that recognize a receptor with kinase activity in tyrosine residues (ie EGF-R) and have the property of inhibition of said receptor and / or with AMC that recognize ligands of said receptor (ie EGF, TGF ⁇ ), with the aim of carrying out an attack therapy that results in tumor remission.
  • Said passive immunotherapy can be administered in combination with the onco-specific treatment of choice.
  • an active immunotherapy treatment is applied with vaccines that cause a response of receptor blocking antibodies (ie EGF-R) and / or receptor ligands (ieEGF, TGF ⁇ ), with the aim of carrying out a maintenance treatment to achieve greater periods of stabilization of the disease, as well as to avoid the appearance of new metastatic foci.
  • the procedure consists in administering, to patients with tumors of epithelial origin in advanced stages, between 4 and 20 doses in a range between 100 and 400 mg of AMC that recognize EGF-R and that have the property of inhibiting said receptor, and / or of AMC that recognize ligands thereof, with a time between each dose that will range between 6 and 10 days.
  • This treatment can last from 1 to 24 months, in combination with the onco-specific therapy of choice. The treatment will be continued until complete or partial tumor regression or any toxicity reaction that requires its arrest. Between 1 and 4 weeks after the end of AMC treatment, immunization schedules will be initiated with vaccines targeting EFG-R or some EGF-R ligand (ie EGF, TGF ⁇ ), together with a protein that functions as a carrier (ie the P64k recombinant protein from Neisseria Meningitidis) and administered in an adjuvant, which could be alumina (between 1 and 2 mg / dose), Montanide ISA 51 (between 0.6 and 1.2 ml per dose) or other.
  • EGF EGF
  • TGF ⁇ EGF-R ligand
  • a protein that functions as a carrier ie the P64k recombinant protein from Neisseria Meningitidis
  • an adjuvant which could be alumina (between 1 and 2 mg / dose), Montanide ISA
  • Each dose contains between 50 and 800 ug of the active substance (receptor or ligand) bound to the carrier protein, in a final volume of between 0.6 and 5 ml.
  • the scheme to be used is between 5 and 8 initial immunizations for response induction, often that could be from weekly to biweekly. Immunizations may be preceded by cyclophosphamide doses that may be between 100 and 500 mg / m 2 of body mass, given 2 to 4 days before the 1st immunization.
  • Vaccines may be formulated in some other vaccine vehicle (i.e. liposomes, DNA vaccines, viral vectors)
  • Vaccines can be formulated as independent products or within the same vaccine formulation.
  • blood extractions will be performed to measure blood biochemistry parameters and specific antibody titers against the ligand or receptor to which the vaccine is directed. These extractions will be made with a frequency that can be from weekly to monthly.
  • PROCEDURE 2 Immunotherapeutic combination that includes passive immunotherapy with monoclonal antibodies that recognize the receptor with kinase activity in tyrosine residues (ieegf-r) and / or receptor ligands (ieegf, tgf ⁇ ), together with active immunotherapy with vaccines targeting receptor and / or receptor ligands, as adjuvant treatment
  • the patient is administered, immediately after diagnosis and / or surgical treatment, a passive immunotherapy treatment with AMC that recognizes a receptor with kinase activity in tyrosine residues (ie EGF-R) and that it has the property of inhibition of said receptor and / or ligands of said receptor (ieEGF, TGF ⁇ ), together with an active treatment with Vaccines that elicit a response of receptor blocking antibodies (ieEGF-R) and / or
  • the procedure consists in administering, to patients with tumors of epithelial origin in advanced stages, between 4 and 20 doses in a range of 100 and 400 mg of AMC that recognize EGF-R, which has the property of inhibition of said receptor, and / or of AMC that recognize ligands thereof, with a time between doses of between 6 and 10 days.
  • This treatment can last from 1 to 24 months. I know continue treatment until complete or partial tumor regression or any toxicity reaction that requires its arrest.
  • Immunotherapeutic combination includes passive immunotherapy with monoclonal antibodies that recognize the receptor with kinase activity in tyrosine residues (ieegf-r) and / or receptor ligands (ieefg, tgf ⁇ ), followed by active immunotherapy with vaccines directed at the recipient and / or receptor ligands, to be applied in patients as adjuvant therapy.
  • passive immunotherapy is used with monoclonal antibodies that recognize a receptor with kinase activity in tyrosine residues (ieEGF-R) and that have the property of inhibition of said receptor and / or with AMC that recognize ligands of said receptor (ie EGF, TGF ⁇ ), with the aim of carrying out an attack therapy that results in tumor remission.
  • an active immunotherapy treatment is applied with vaccines that cause a response of receptor blocking antibodies (ieEGF-R) and / or receptor ligands (ieEGF, TGF ⁇ ), with the aim of performing a maintenance treatment to achieve higher disease-free intervals, as well as to avoid the appearance of new metastatic foci.
  • the procedure consists in administering, to patients with tumors of epithelial origin in advanced stages, between 4 and 20 doses of between 100 and 400 mg of AMC that recognize EGF-R, which has the property of inhibition of said receptor, and / or of AMC that recognize ligands thereof, with a time between doses of between 6 and 10 days.
  • This treatment can last between 1 and 24 months.
  • the treatment will be continued until complete or partial tumor regression or any toxicity reaction that requires its arrest.
  • immunization schedules with vaccines directed to EFG-R or some EGF-R ligand ie EGF, TGF ⁇
  • Example 1 Immunization scheme with EGF vaccine using alumina as adjuvant in cancer patients.
  • Patient 1.1 was included in the trial with diagnosis of metastatic squamous cell carcinoma of the lung, with disease in progression, being considered ineligible for any other onco-specific treatment. It was immunized with a scheme consisting of the administration of 5 initial doses of the vaccine composition containing 50ug of EGF and 2 mg of alumina, administered on days 1, 7, 14, 21 and 51.
  • Blood extractions were performed for blood biochemical determinations and specific antibody titers against EGF on days 0, 15, 30, 45, 60 and then monthly.
  • Antibody titers were measured by an ELISA assay, evaluating as the result of antibody titre the maximum serum dilution value that gives a positive result in the ELISA assay (OD values above twice the average of the assay targets. ) Upon detecting a drop in antibody titers, a re-immunization was performed with the same dose of vaccine.
  • the patient developed an anti-EGF antibody response with maximum titres of up to 1: 8000, with a kinetics as shown in Figure 1.
  • the patient After the beginning of the Vaccination, the patient showed a clinical and radiological stabilization of the disease until month 15. The patient dies at 23.2 months after the start of vaccination.
  • Antibody titers were measured by an ELISA assay, evaluating as the result of antibody titre the maximum serum dilution value that gives a positive result in the ELISA assay (OD values above twice the average of the assay targets. ) Upon detecting a drop in antibody titers, a re-immunization was performed with the same dose of vaccine.
  • the patient developed an anti-EGF antibody response with maximum titres of up to 1: 32000, with a kinetics as shown in Figure 2. After the start of the Vaccination the patient showed a stabilization of the disease until month 12, in which was diagnosed a tumor regression by both clinical and radiological criteria (Figure 3).
  • Example 3 Immunization scheme with EGF vaccine using alumina as an adjuvant and a treatment prior to vaccination with low dose cyclophosphamide in cancer patients.
  • Patient 3.1 FNR was included in the trial with diagnosis of squamous cell carcinoma of the lung, with disease in progression being considered ineligible for any other onco-specific treatment. It was treated with a dose of 100 mg / m 2 of body surface of Cyclophosphamide, 3 days before being immunized with the EGF Vaccine, with a scheme consisting in the administration of 5 doses of the vaccine composition containing 50 ug of EGF and 2 mg of alumina, administered on days 1, 7, 14, 21 and 51. Blood extractions were performed for blood biochemical determinations and specific antibody titers against EGF on days 0, 15, 30,
  • Antibody titers were measured by an ELISA assay, evaluating as the result of antibody titre the maximum serum dilution value that gives a positive result in the ELISA assay (OD values above twice the average of the assay targets. )
  • the patient developed an anti-EGF antibody response, with maximum titres of up to 1: 8000, as shown in Figure 4.
  • ISA 51 as an adjuvant and a pre-vaccination treatment with low dose cyclophosphamide in cancer patients.
  • EGF using P64 as a carrier protein and alumina as an adjuvant, after a pre-treatment with low dose cyclophosphamide, a clinical trial was conducted in which 10 patients were immunized.
  • Patient 4.1, JPG was included in the trial with a diagnosis of adenocarcinoma of the lung, non-small cells, disease in progression, being considered ineligible for any other onco-specific treatment.
  • Antibody titers were measured by an ELISA assay, evaluating as the result of antibody titre the maximum serum dilution value that gives a positive result in the ELISA assay (OD values above twice the average of the assay targets. )
  • Example 5 Immunogenicity of vaccination with EGF and relationship with disease stabilization in cancer patients.
  • NSCLC non-small cell lung cancer
  • Table 1 Relationship of antibody response and clinical and radiological stabilization of the disease.
  • Example 6 Immunogenicity of vaccination with EGF and relationship with the survival of cancer patients undergoing such treatment.
  • the RML patient diagnosed as a carrier of epidermoid tongue-based carcinoma of the tongue, stage IV was included in the AMC combined clinical trial.
  • IOR-R3 and radiotherapy He received the 200 mg dose of AMC 6 times, weekly. The cumulative dose of AMC was 1200 mg and the radiant dose was 60 Gy.
  • the EPG patient diagnosed as a carrier of squamous cell carcinoma of the tonsil with cervical adenopathies, stage III, was included in the combined treatment trial of the humanized monoclonal antibody hR3 (deposited with access number 951110101 in ECACC, England) and RTP. He received 200 mg of AMC, weekly, for 6 weeks, and a radiant dose of 64 Gy. At the end of the treatment, this patient showed complete remission of the tumor lesion ( Figure 8) and the response was maintained for more than 13 months.
  • Example 9 Therapeutic effect of the combination of Radiotherapy and AMC IOR-R3:
  • the CHA patient diagnosed as a carrier of tonsil tumor, in stage IV, with bilateral cervical adenopathies was included in the trial of combined treatment of hR3 and RTP. He received a dose of 400 mg weekly, for 6 weeks, for a cumulative dose of 2400 mg. Concurrently he received a radiant dose of 64 Gy. At the end of treatment, this patient was in complete remission of the primary tumor and loco-regional metastases (Figure 9). This response is maintained for 12 months.
  • Example 10 Evaluation of combination of passive therapy with anti-EGF-R antibody (IOR-R3) and anti-ligand monoclonal antibody of EGF-R (EGF-1) in athymic mice.
  • Group 1 10 doses of 0.5 mg of AMC EGF-1, intraperitoneally and daily.
  • Group 2 10 doses of 1 mg AMC EGF-1, intraperitoneally and daily.
  • Group 3 10 doses of 0.5 mg of AMC IOR-R3, intraperitoneally and daily.
  • Group 4 10 doses of 1 mg of AMC IOR-R3, intraperitoneally and daily.
  • Group 5 10 doses of PBS, intraperitoneally and daily (negative control).
  • Group 6 10 doses of the combination of 0.5 ⁇ g of EGF-1 and 0.5 mg of IOR-R3, intraperitoneally and daily
  • Group 7 10 doses of the combination of 1 ⁇ g of EGF-1 and 1 mg of IOR-R3, intraperitoneally and daily
  • Example 11 Combined treatment scheme AMC IOR-R3 / EGF vaccine in a patient with advanced stage tumor: The ARP patient, diagnosed as a carrier of epidermoid carcinoma of the head and neck, received a combined sequential treatment of AMC IOR-R3 and Vaccine
  • the MRM patient diagnosed as a carrier of squamous cell carcinoma of the lung, underwent surgery. One month after the surgical procedure, the patient began a combined treatment while combining passive immunotherapy with AMC IOR-R3 and the EGF vaccine. In the
  • Figure 1 Response kinetics of anti-EGF antibodies in MMG patient, immunized as detailed in Example 1. Arrows indicate times when re-immunizations were performed.
  • Figure 2 Antibody response kinetics of the AMC patient, immunized as detailed in Example 2. The arrows indicate times at which immunizations were performed.
  • FIG. 3 Tumor regression observed in the AMC patient. In the image on the left, there is tumor mass at the beginning of the treatment. In the image on the right, it can be seen that 12 months after the start of this treatment, the tumor mass had disappeared.
  • Figure 4 Response kinetics of anti-EGF antibodies in the FNR patient, immunized as detailed in example 3.
  • the arrows indicate times when re-immunizations were performed.
  • Figure 5 Response kinetics of anti-EGF antibodies of the JPG patient, immunized as detailed in example 4.
  • the arrows indicate times at which re-immunizations were performed.
  • Figure 6 The figure shows the Kaplan Meyer curves of the patient groups with high anti-EGF responses (GAR) and with low anti-EGF responses (BAR), as well as that of a historical control group. It can be seen that the GAR show a significant increase in survival compared to both GAR and historical controls.
  • GAR high anti-EGF responses
  • BAR low anti-EGF responses
  • Figure 7 Graphic demonstration of tumor remission in RML patient, treated as detailed in example 7.
  • Figure 8 Graphic demonstration of tumor regression in EPG patient treated as detailed in example 8.
  • Figure 9 Graphic demonstration of the tumor in a CHA patient, treated as detailed in example 9.
  • Figure 10 Groups of mice immunized with ⁇ .5 mg of each of the AMC IOR-
  • Figure 11 Groups of mice immunized with 1mg of each of the AMC IOR-R3, EGF-1, and with the combination of 1 mg of IOR-R3 + 1 mg of EGF1, as detailed in example 10. It is observed a synergistic effect of decreased tumor growth in the group treated with the combination of both AMCs.
  • Figure 12 Combined combined treatment of AMC IOR-R3 and EGF Vaccine:
  • the arrows above the time axis mean the dates of administration of the AMC (days 1, 7,14,21, 28 and 35) and the arrows below the time axis mean the times of immunizations with the EGF Vaccine (days 2,8,15,22, and 52).

Abstract

La presente invención se relaciona con el campo de la Inmunología y más específicamente con la inmunoterapia del cáncer, particularmente con combinaciones inmunoterapéuticas y métodos de tratamiento para impedir el crecimiento de células tumorales y/o eliminar dichas células. Los métodos descritos en la presente invención se basan en el bloqueo de receptores con actividad de proteínas quinasas en residuos de tirosina (RTK) y de ligandos para dichos receptores. Se describen combinaciones inmunoterapéuticas que provocan el bloqueo de receptores RTK y/o sus ligandos, mediante la combinación de inmunoterapia activa y/o pasiva contra los mismos y los procedimientos referidos pueden ser aplicados a pacientes en diferentes estadios clínicos de tumores de origen epitelial que sobre-expresan estos receptores. La combinación de inmunoterapia activa y pasiva puede ser simultánea o secuencial en dependencia de si el procedimiento terapéutico va a ser utilizado en pacientes con enfermedad avanzada o como terapia adyuvante.

Description

COMBINACIONES INMUNOTERAPEUTICAS PARA EL TRATAMIENTO DE
TUMORES Sector Técnico
La presente invención se relaciona con el campo de la inmunología y más específicamente con la inmunoterapia del cáncer, particularmente con combinaciones inmunoterapéuticas y métodos de tratamiento para impedir el crecimiento de células tumorales y/o eliminar dichas células. Técnica Anterior El sistema del receptor de EGF (EGF-R) y sus ligandos constituye un complejo molecular cuya interacción regula de forma específica el crecimiento celular y ha sido demostrado su impacto en el crecimiento descontrolado de tumores de origen epitelial. En el proceso de tumorigénesis, la desregulación de los procesos paracrinos y autocrinos de activación del EGF-R, esta dada tanto por la sobreproducción de los factores de crecimiento como por la síntesis elevada y/o la mutación de sus receptores.
El receptor del Factor de Crecimiento Epidérmico (EGF-R, siglas en Inglés) es una glicoproteína transmembrana de 1186 aminoácidos y 170 kD de peso molecular que se encuentra ampliamente expresada en los tejidos del organismo, y ha sido implicada en varias etapas del desarrollo embriogénico. La unión de sus ligandos específicos, EGF o TGF-α, induce la dimerización del receptor así como también la heterodimerización con otros miembros de la familia ErbB, entre ellos el HER-2 (Cohén BD et al. (1996) J Biol Chem 271:7620-7629). La unión de los ligandos al receptor dispara una cascada de señales intracelulares (Ullrich A and Schlessinger J (1990) Cell 61:203-212) que conducen al crecimiento y diferenciación de las células. La sobreexpresión de este receptor en algunos tipos de neoplasias, fundamentalmente de origen epitelial, ha sido blanco de atención en la inmunoterapia del cáncer. Tal es el caso de tumores de mama, vejiga, ovario, vulva, colon, pulmón, cerebro, próstata y tumores de cabeza y cuello. La presencia de EGF-R ha probado ser una indicación de mal pronóstico en cáncer de mama (Pérez R et al. (1984) Breast Cáncer and Treatment 4:189-193). Aún cuando no se conoce todavía el papel que juega el sistema del EGF-R y sus ligandos en la regulación del crecimiento tumoral, se ha sugerido que la expresión del EGF-R en células tumorales proporciona un mecanismo para la estimulación autocrina que conduce a la proliferación descontrolada de dichas células (Schlessinger J et al. (1983) Crit Rev Biochem 14 (2):93-111).
Los principales ligandos de este sistema son el Factor de Crecimiento Epidérmico (EGF) y el Factor de Crecimiento Transformante de tipo alfa (TGFα). Además, existen otros ligandos que pertenecen a la superfamilia del EGF, como son: anfiregulina (AR), criptol (CR1), factor de crecimiento enlazador de heparina, betacelulina, epiregulina, entre otros. El EGF es un polipéptido de 53 aminoácidos con un peso molecular de 6045 Da, el cual resulta mitogénico para células de origen epitelial, ejerciendo su acción fundamentalmente paracrina a partir de su unión al EGF-R. El TGFα es un polipéptido de 50 aminoácidos, capaz de competir con el EGF por la unión al EGF-R. Anticuerpos anti-EGF no son capaces de reconocer al TGFα (Todaro G J et al. (1976), Nature 264:26-31), por lo que ambos factores de crecimiento son dos entidades inmunológicamente diferentes. El sistema del EGF-R y sus ligandos ha sido utilizado como blanco de inmunoterapia pasiva (IP), mediante la utilización de anticuerpos monoclonales (AMC) contra el EGF-R, en forma nativa, asociados a drogas, toxinas, o isótopos radiactivos (Vollmar AM et al. (1987) J Cell Physiol 131:418-425) en la IP de tumores con alta expresión de este receptor. Estos anticuerpos han sido seleccionados por su capacidad de inhibir la unión del EGF a su receptor (anticuerpos neutralizantes). Varios ensayos clínicos con AMC se están llevando a cabo y algunos han mostrado resultados promisorios como es el caso del ensayo clínico con el AMC C225 en cáncer de mama, de células pancreáticas y de células renales en fase II y cabeza-cuello en fase III (Mendelsohn J et al. (1999) American Society of Clinical Oncology Meeting). Otro ensayo clínico de Fase II con buenos resultados es el ensayo efectuado con el AMC IOR-R3 en tumores de pulmón (Crombet T et al. (2000) Cáncer Biotherapy and Biopharmaceutical, manuscrito aceptado).
La inmunoterapia pasiva con el Anticuerpo Monoclonal IOR-R3 específico contra el EGF-R, referido en la patente europea EP 586002B1 , ha demostrado que la unión específica del IOR-R3 al receptor inhibe la unión del EGF al mismo, e inhibe la autofosforilación del Receptor, dependiente de EGF. A su vez, la inmunoterapia pasiva con IOR-R3 inhibió el crecimiento de células tumorales humanas en ratones desnudos, y ha disminuido la velocidad de crecimiento del tumor de algunos pacientes en ensayo clínico. Este sistema también ha sido blanco de inmunoterapia activa específica de cáncer. Un ejemplo de ello lo constituye el uso de una vacuna que contiene uno de los principales ligandos del EGF-R, el EGF, acoplado a una proteína transportadora (US 5,894,018). Esta vacuna es capaz de inducir una respuesta de anticuerpos específica contra el EGF autólogo e inhibir la unión del mismo a su receptor, bloqueando los mecanismos de proliferación desencadenados por esta unión. Estudios preclínicos han mostrado que la inmunización de ratones con EGF autólogo acoplado a una proteína transportadora en adyuvante incrementa la sobrevida de ratones transplantados con el tumor ascítico de Ehrlich (TAE) (González G eí al (1996 )Nacc/t7e Research 5(4):233-243; González G eí al (1997) Vaccine Research 6(2):91-100).
Con una vacuna conteniendo EGF humano recombinante se han reportado los resultados de un ensayo clínico Fase I, que demuestran la inmunogenicicidad y la no-toxicidad provocada por la vacunación. (González G et al (1998), Annals of Oncology 9: 1-5).
Divulgación de la invención.
En la presente invención se propone la utilización de inmunoterapias combinadas, dirigidas tanto contra el receptor con actividad quinasa en residuos de tirosina (RTK) como contra sus ligandos, con el objetivo de potenciar el efecto observado al aplicar de manera independiente las diferentes formas de inmunoterapia descritas en el estado del arte, dirigidas solo contra alguno de los componentes del sistema receptor/ligando. Esta potenciación se justifica por el bloqueo conjunto de ambos, ligandos y receptor, en un método de tratamiento que incluya ambos principios activos. Más particularmente la invención se refiere a una combinación inmunoterapéutica para el tratamiento de tumores con efecto sobre células cuyo crecimiento es dependiente del sistema de receptores RTK, la cual comprende la administración de forma simultánea o secuencial de A + B; ó A + C; ó A + D; ó B + C; ó B + D; ó C + D, donde A, B, C y D son: A.- Un anticuerpo contra un receptor RTK;
B.- Un anticuerpo contra el(los) ligando(s) del receptor RTK;
O- Una vacuna cuyo principio activo es un receptor de RTK, el cual induce anticuerpos contra dicho receptor RTK; D.- Una vacuna cuyo principio es el(los) ligando(s) de un receptor de RTK, el cual induce anticuerpos contra dichos ligando(s) del receptor RTK; En una realización particular de la invención, el anticuerpo monoclonal contra el receptor RTK es un anticuerpo contra el receptor del Factor de Crecimiento Epidérmico, R-EGF, y más específicamente es el anticuerpo humanizado contra el receptor de EGF, el hR3, depositado con número de acceso 951110101 en ECACC, Inglaterra.
En otra materialización de la invención el anticuerpo contra el ligando del receptor RTK seleccionado puede ser un anticuerpo contra el EGF o contra el TGF alfa. Asimismo la invención refiere una combinación inmunoterapéutica donde el principio activo de la vacuna puede ser el receptor del EGF, el propio EGF o el TGF alfa, o un conjugado de estos principios activos con la proteína p64K de Neisseria meningitis. Igualmente la invención se refiere a un método para el control del crecimiento y/o proliferación de células cuyo crecimiento es dependiente del sistema de receptores RTK el cual comprende el tratamiento con las combinaciones terapéuticas de la invención, las cuales pueden ser aplicadas de forma simultánea o secuencial, en cuyo caso dicha aplicación de los componentes de la combinación se realiza en cualquier orden. Las combinaciones inmunoterapéuticas de la invención impiden el crecimiento de células tumorales eliminan dichas células, mediante el bloqueo de receptores RTK y de sus ligandos. Este bloqueo puede lograrse, entre otras aproximaciones, con la combinación, tanto simultánea como secuencial de ¡nmunoterapias activas (vacunas terapéuticas) y/o pasivas (Anticuerpos Monoclonales) dirigidas a factores de crecimiento tales como el Factor de Crecimiento Epidérmico, EGF siglas en Inglés, y el Factor de Crecimiento Transformante de tipo alfa, TGFα y sus receptores (i.e.EGF- R).
El bloqueo de los factores de crecimiento o de sus receptores provoca un efecto de detención de la proliferación celular. En esta invención se muestra como el bloqueo simultáneo tanto de ligandos como de receptores potencia el efecto inhibitorio sobre dicha proliferación celular. Este concepto terapéutico es de gran importancia en el tratamiento de tumores malignos, los cuales tienen como propiedad fundamental un incremento en la velocidad de proliferación celular. Se describen combinaciones inmunoterapéuticas que provocan el bloqueo de receptores RTK y/o sus ligandos, mediante la combinación de inmunoterapia activa y/o pasiva contra los mismos.
Los procedimientos referidos pueden ser aplicados a pacientes en diferentes estadios clínicos de tumores de origen epitelial que sobre-expresan el EFG-R.
La combinación de inmunoterapia activa y pasiva puede ser simultánea o secuencial en dependencia de si el procedimiento terapéutico va a ser utilizado en pacientes con enfermedad avanzada o como terapia adyuvante. En casos de enfermedad avanzada la combinación terapéutica propuesta es la inmunoterapia pasiva con Anticuerpos Monoclonales (AMC) que reconozcan al receptor RTK y/o AMC que reconozcan a ligandos de dicho receptor, en combinación con la terapia onco-específica de elección, como terapia de ataque; seguido por tratamiento de inmunoterapia activa con vacunas dirigidas a ligandos de dicho receptor y/o al propio receptor, para lograr respuestas de mantenimiento del efecto terapéutico.
En casos de terapia adyuvante las combinaciones terapéuticas propuestas son o el tratamiento de inmunoterapia pasiva con Anticuerpos Monoclonales (AMC) que reconozcan al receptor RTK y/o AMC que reconozcan a ligandos de dicho receptor conjuntamente con inmunoterapia activa con vacunas dirigidas a ligandos de dicho receptor y/o al propio receptor, o la combinación donde el tratamiento de inmunoterapia pasiva con Anticuerpos Monoclonales (AMC) que reconozcan al receptor con actividad quinasa en residuos de tirosina y/o AMC que reconozcan a ligandos de dicho receptor, como terapia de ataque; es seguido por el tratamiento simultáneo de inmunoterapia activa con vacunas dirigidas a llgandos de dicho receptor y/o al propio receptor, para lograr respuestas de mantenimiento del efecto terapéutico.
La invención se describe más detalladamente a través de los siguientes procedimientos. PROCEDIMIENTO 1: Combinación inmunoterapéutica que incluye inmunoterapia pasiva con anticuerpos monoclonales que reconozcan al receptor con actividad quinasa en residuos de tirosina (i.e.EGF-R) y/o a ligandos del receptor (i.e.EGF, TGFα), seguida por inmunoterapia activa con vacunas dirigidas al receptor y/o ligandos del receptor, a ser aplicadas en pacientes con tumores epiteliales en estadios avanzados.
Se administra a pacientes en estadios avanzados de la enfermedad, en los cuales puede ser aplicable alguna otra forma de terapia onco-específica. Se utiliza primeramente una inmunoterapia pasiva con anticuerpos monoclonales que reconozcan a un receptor con actividad quinasa en residuos de tirosina (i.e. EGF-R) y que presenten la propiedad de inhibición de dicho receptor y/o con AMC que reconozcan ligandos de dicho receptor (i.e.EGF, TGFα) , con el objetivo de efectuar una terapia de ataque que tenga como resultado remisión de tumores. Dicha inmunoterapia pasiva puede administrarse combinada al tratamiento onco- específico de elección.
Posteriormente se aplica un tratamiento de inmunoterapia activa con Vacunas que provoquen una respuesta de anticuerpos bloqueadores del receptor (i.e. EGF-R) y/o de ligandos del receptor (i.e.EGF, TGFα), con el objetivo de efectuar un tratamiento de mantenimiento para lograr mayores períodos de estabilización de la enfermedad, así como para evitar aparición de nuevos focos metastásicos. El procedimiento consiste en administrar, a pacientes con tumores de origen epitelial en estadios avanzados, entre 4 y 20 dosis en un rango entre 100 y 400 mg de AMC que reconozcan al EGF-R y que tengan la propiedad de inhibir dicho receptor, y/o de AMC que reconozcan ligandos del mismo, con un tiempo entre cada dosis que oscilará entre 6 y 10 días. Este tratamiento puede durar de 1 a 24 meses, en combinación con la terapia onco-específica de elección. Se continuará el tratamiento hasta regresión tumoral completa o parcial ó cualquier reacción de toxicidad que requiera la detención del mismo. Entre 1 y 4 semanas después de terminado el tratamiento con AMC se iniciarán esquemas de inmunización con vacunas dirigidas al EFG-R ó a algún ligando del EGF-R (i.e. EGF, TGFα), unido a una proteína que funcione como transportadora (i.e. la proteína recombinante P64k de Neisseria Meningitidis) y administrado en un adyuvante , que pudiera ser alúmina(entre 1 y 2 mg/ dosis), Montanide ISA 51 (entre 0.6 y 1.2 mi por dosis) u otro. Cada dosis contiene entre 50 y 800 ug del principio activo (receptor o ligando) unido a la proteína transportadora, en un volumen final de entre 0.6 y 5 mis. El esquema a utilizar es de entre 5 y 8 inmunizaciones iniciales para inducción de respuesta, con frecuencia que pudiera ser desde semanal hasta quincenal. Las inmunizaciones pueden estar precedidas de dosis de ciclofosfamída que pueden encontrarse entre 100 y 500 mg/m2 de masa corporal, suministrados entre 2 y 4 días antes de la 1ra inmunización.
Las vacunas pueden estar formuladas en algún otro vehículo vacunal (i.e.liposomas, vacunas ADN, vectores virales)
Las vacunas pueden formularse como productos independientes o dentro de una misma formulación vacunal.
En este período se realizarán extracciones de sangre para medición de parámetros de bioquímica sanguínea y títulos de anticuerpos específicos contra el ligando o receptor al que está dirigido la vacuna. Dichas extracciones se realizarán con una frecuencia que puede ser desde semanal a mensual.
Posteriormente, se realizan reinmunizaciones a la caída de los títulos, con frecuencia que pudiera ser desde mensual a trimestral, por un período de entre 1 y 2 años. PROCEDIMIENTO 2: Combinación inmunoterapéutica que incluye inmunoterapia pasiva con anticuerpos monoclonales que reconozcan al receptor con actividad quinasa en residuos de tirosina (i.e.egf-r) y/o a ligandos del receptor (i.e.egf, tgfα), conjuntamente con inmunoterapia activa con vacunas dirigidas al receptor y/o ligandos del receptor, como tratamiento adyuvante Se administra al paciente, inmediatamente después del diagnóstico y/o tratamiento quirúrgico un tratamiento de inmunoterapia pasiva con AMC que reconozcan a un receptor con actividad quinasa en residuos de tirosina (i.e. EGF-R) y que presente la propiedad de inhibición de dicho receptor y/o a ligandos de dicho receptor (i.e.EGF, TGFα), conjuntamente con un tratamiento activo con Vacunas que provoquen una respuesta de anticuerpos bloqueadores del receptor (i.e.EGF-R) y/o de ligandos de dicho receptor (i.e.EGF, TGFα).
Estos tratamientos, administrados de forma conjunta tendrán un efecto sinérgico, logrando mayores % de regresiones y/o estabilizaciones clínicas de la enfermedad. El procedimiento consiste en administrar, a pacientes con tumores de origen epitelial en estadios avanzados, entre 4 y 20 dosis en un rango de 100 y 400 mg de AMC que reconozcan al EGF-R, que presente la propiedad de inhibición de dicho receptor, y/o de AMC que reconozcan ligandos del mismo, con un tiempo entre dosis de entre 6 y 10 días. Este tratamiento puede durar de 1 a 24 meses. Se continúa el tratamiento hasta regresión tumoral completa o parcial ó cualquier reacción de toxicidad que requiera la detención del mismo.
Conjuntamente se aplican inmunizaciones con vacunas que reconozcan ligandos y/o receptor, con igual esquema que el descrito en el procedimiento #1. PROCEDIMIENTO 3: Combinación inmunoterapéutica incluye inmunoterapia pasiva con anticuerpos monoclonales que reconozcan al receptor con actividad quinasa en residuos de tirosina (i.e.egf-r) y/o a ligandos del receptor (i.e.efg, tgfα), seguida por inmunoterapia activa con vacunas dirigidas al receptor y/o ligandos del receptor, a ser aplicadas en pacientes como terapia adyuvante.
Se administra al paciente inmediatamente después del diagnóstico y/o tratamiento quirúrgico.
Se utiliza primeramente una inmunoterapia pasiva con anticuerpos monoclonales que reconozcan a un receptor con actividad quinasa en residuos de tirosina (i.e.EGF-R) y que presenten la propiedad de inhibición de dicho receptor y/o con AMC que reconozcan ligandos de dicho receptor (i.e.EGF, TGFα) , con el objetivo de efectuar una terapia de ataque que tenga como resultado remisión de tumores. Posteriormente se aplica un tratamiento de inmunoterapia activa con Vacunas que provoquen una respuesta de anticuerpos bloqueadores del receptor (i.e.EGF-R) y/o de ligandos del receptor (i.e.EGF, TGFα), con el objetivo de efectuar un tratamiento de mantenimiento para lograr mayores intervalos libres de enfermedad, así como para evitar aparición de nuevos focos metastásicos.
El procedimiento consiste en administrar, a pacientes con tumores de origen epitelial en estadios avanzados, entre 4 y 20 dosis de entre 100 y 400 mg de AMC que reconozcan al EGF-R, que presente la propiedad de inhibición de dicho receptor, y/o de AMC que reconozcan ligandos del mismo, con un tiempo entre dosis de entre 6 y 10 días. Este tratamiento puede durar entre 1 y 24 meses. Se continuará el tratamiento hasta regresión tumoral completa o parcial ó cualquier reacción de toxicidad que requiera la detención del mismo. Entre 1 y 4 semanas después de terminado el tratamiento con AMC se iniciarán esquemas de inmunización con vacunas dirigidas al EFG-R ó a algún ligando del EGF-R (i.e. EGF, TGFα), siguiendo igual esquema que el detallado en el procedimiento #1. EJEMPLOS DE REALIZACIÓN:
Ejemplo 1: Esquema de inmunización con Vacuna EGF utilizando alúmina como adyuvante en pacientes con cáncer.
Con el objetivo de demostrar la inmunogenicidad y seguridad de la Vacunación con EGF (US 5,894,018), usando P64 como proteína transportadora y alúmina como adyuvante, se realizó un ensayo clínico en el que se inmunizaron 10 pacientes.
El paciente 1.1 (MMG) fue incluido en el ensayo con diagnóstico de carcinoma epidermoide metastásico de pulmón, con enfermedad en progresión, considerándose no elegible para ningún otro tratamiento onco-específico. Se inmunizó con un esquema consistente en la administración de 5 dosis iniciales de la composición vacunal conteniendo 50ug de EGF y 2 mg de alúmina, administradas en los días 1 , 7, 14, 21 y 51.
Se realizaron extracciones de sangre para determinaciones de bioquímica sanguínea y títulos de anticuerpos específicos contra el EGF en los días 0, 15, 30, 45, 60 y después mensualmente.
Los títulos de anticuerpos se midieron mediante un ensayo ELISA , evaluándose como resultado de título de anticuerpos el valor de máxima dilución de suero que da un resultado positivo en el ensayo ELISA (valores de D.O por encima del doble de la media de los blancos del ensayo ) Al detectarse una caída en los títulos de anticuerpos, se realizó un re-inmunización con igual dosis de vacuna.
El paciente desarrolló una respuesta de anticuerpos anti-EGF con títulos máximos de hasta 1 :8000, con una cinética como se muestra en la Figura 1.
Después del inicio de la Vacunación el paciente mostró una estabilización clínica y radiológica de la enfermedad hasta el mes 15. El paciente fallece a los 23.2 meses después de iniciada la vacunación
Ejemplo 2: Esquema de inmunización con Vacuna EGF utilizando Montanide
ISA51 como adyuvante en pacientes con cáncer.
Con el objetivo de demostrar la inmunogenicidad y seguridad de la Vacunación con EGF, usando P64 como proteína transportadora y Montanide ISA51 como adyuvante, se realizó un ensayo clínico en el que se inmunizaron 10 pacientes. El paciente 2.1 (AMG) fue incluido en el ensayo con diagnóstico de carcinoma epidermoide de pulmón, con enfermedad en progresión, considerándose no elegible para ningún otro tratamiento onco-específico.
Se inmunizó con un esquema consistente en la administración de 5 dosis de la composición vacunal conteniendo 50 ug de EGF, en un volumen total de entre 0.6 mis, mezclado hasta emulsificación con igual volumen de Montanide ISA 51 inmediatamente antes de su administración, en los días 1 , 7, 14, 21 y 51. Se realizaron extracciones de sangre para determinaciones de bioquímica sanguínea y títulos de anticuerpos específicos contra el EGF en los días 0, 15, 30, 45, 60 y después mensualmente.
Los títulos de anticuerpos se midieron mediante un ensayo ELISA , evaluándose como resultado de título de anticuerpos el valor de máxima dilución de suero que da un resultado positivo en el ensayo ELISA (valores de D.O por encima del doble de la media de los blancos del ensayo ) Al detectarse una caída en los títulos de anticuerpos, se realizó un re-inmunización con igual dosis de vacuna.
El paciente desarrolló una respuesta de anticuerpos anti-EGF con títulos máximos de hasta 1 : 32000, con una cinética como se muestra en la Figura 2. Después del inicio de la Vacunación el paciente mostró una estabilización de la enfermedad hasta el mes 12, en el que se diagnosticó una regresión tumoral por criterios tanto clínicos como radiológicos (Figura 3).
En el mes 14 aparece un 2d0 tumor primario. Fallece de una complicación quirúrgica al mes 18 después de incluido en el ensayo. Ejemplo 3: Esquema de inmunización con Vacuna EGF utilizando Alúmina como adyuvante y un tratamiento anterior a la vacunación con baja dosis de ciclofosfamida en pacientes con cáncer.
Con el objetivo de demostrar la inmunogenicidad y seguridad de la Vacunación con EGF, usando P64 como proteína transportadora y Alúmina como adyuvante, después de un pre-tratamiento con ciclofosfamida en baja dosis, se realizó un ensayo clínico en el que se inmunizaron 10 pacientes.
El paciente 3.1 , FNR, fue incluido en el ensayo con diagnóstico de carcinoma epidermoide de pulmón, con enfermedad en progresión considerándose no elegible para ningún otro tratamiento onco-específico. Se trató con una dosis de 100 mg/m2 de superficie corporal de Ciclofosfamida, 3 días antes de ser inmunizado con la Vacuna EGF, con un esquema consistente en la administración de 5 dosis de la composición vacunal conteniendo 50 ug de EGF y 2 mg de alúmina, administradas en los días 1, 7, 14, 21 y 51. Se realizaron extracciones de sangre para determinaciones de bioquímica sanguínea y títulos de anticuerpos específicos contra el EGF en los días 0, 15, 30,
45, 60 y después mensualmente.
Los títulos de anticuerpos se midieron mediante un ensayo ELISA, evaluándose como resultado de título de anticuerpos el valor de máxima dilución de suero que da un resultado positivo en el ensayo ELISA (valores de D.O por encima del doble de la media de los blancos del ensayo)
Al detectarse una caída en los títulos de anticuerpos, se realizó un re-inmunización con igual dosis de vacuna.
El paciente desarrolló una respuesta de anticuerpos anti-EGF, con títulos máximos de hasta 1 :8000, como se muestra en la Figura 4.
Después del inicio de la Vacunación el paciente ha mostrado una estabilización de la enfermedad hasta el mes 19.
Ejemplo 4: Esquema de inmunización con Vacuna EGF utilizando Montanide
ISA 51 como adyuvante y un tratamiento anterior a la vacunación con baja dosis de ciclofosfamida en pacientes con cáncer.
Con el objetivo de demostrar la inmunogenicidad y seguridad de la Vacunación con
EGF, usando P64 como proteína transportadora y Alúmina como adyuvante, después de un pre-tratamiento con ciclofosfamida en baja dosis, se realizó un ensayo clínico en el que se inmunizaron 10 pacientes. El paciente 4.1 , JPG, fue incluido en el ensayo con diagnóstico de adenocarcinoma de pulmón, células no pequeñas, enfermedad en progresión considerándose no elegible para ningún otro tratamiento onco-específico.
Se trató con una dosis de 100 mg/kg peso corporal de Ciclofosfamida, 3 días antes de ser inmunizado con la Vacuna EGF, con un esquema consistente en la administración de 5 dosis de la composición vacunal conteniendo 50 ug de EGF en un volumen total de 0.6 mis, mezclado hasta emulsificación con igual volumen de
Montanide ISA 51 inmediatamente antes de su administración, en los días 1 , 7, 14,
21 y 51. Se realizaron extracciones de sangre para determinaciones de bioquímica sanguínea y títulos de anticuerpos específicos contra el EGF en los días 0, 15, 30,
45, 60 y después mensualmente.
Los títulos de anticuerpos se midieron mediante un ensayo ELISA , evaluándose como resultado de título de anticuerpos el valor de máxima dilución de suero que da un resultado positivo en el ensayo ELISA (valores de D.O por encima del doble de la media de los blancos del ensayo )
Al detectarse una caída en los títulos de anticuerpos, se realizó un re-inmunización con igual dosis de vacuna. El paciente desarrolló una respuesta de anticuerpos anti-EGF con títulos máximos de hasta 1 :400000, como se muestra en la Figura 5.
Después del inicio de la Vacunación el paciente mostró una estabilización de la enfermedad hasta el mes 6
Ejemplo 5: Inmunogenicidad de la vacunación con EGF y relación con estabilización de la enfermedad en pacientes con cáncer.
En un ensayo Clínico Fase I, 10 pacientes de Cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC) en estadios III y IV, fueron tratados con un esquema consistente en la administración de 5 dosis iniciales de la composición vacunal conteniendo
50ug de EGF y 2 mg de alúmina, administradas en los días 1 , 7, 14, 21 y 51. En el mismo ensayo otros 10 pacientes de Cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC) en estadios III y IV, se inmunizaron con un esquema consistente en la administración de 5 dosis de la composición vacunal conteniendo
50 ug de EGF , en un volumen total de entre 0.6 mis, mezclado hasta emulsificación con igual volumen de Montanide Los títulos de anticuerpos se midieron mediante un ensayo ELISA, evaluándose como resultado de título de anticuerpos el valor de máxima dilución de suero que da un resultado positivo en el ensayo ELISA (valores de D.O. por encima del doble de la media de los blancos del ensayo).
En el referido ensayo el 50% de los pacientes desarrollaron una respuesta de anticuerpos con títulos de 1 :4000 o mayores (grupo GAR). En el otro 50% de los pacientes los títulos alcanzados fueron menores de 1 :4000 (grupo BAR).
Del grupo GAR, el 87.5% mostraron una estabilización clínica y radiológica de la enfermedad igual o mayor a 3 meses, después de iniciado el tratamiento. Del grupo BAR solo el 11.1% de los pacientes mostraron una estabilización clínica o y radiológica igual o mayor a 3 meses (Tabla 1 ).
Estos datos demuestran la relación existente entre los niveles de respuesta de anticuerpos anti-EGF y la estabilización tumoral.
Tabla 1 : Relación de respuesta de anticuerpos y estabilización clínica y radiológica de la enfermedad.
Figure imgf000015_0001
Ejemplo 6: Inmunogenicidad de la vacunación con EGF y relación con a sobrevida de pacientes con cáncer sometidos a dicho tratamiento.
Cuarenta pacientes de NSCLC, estadios III y IV, fueron tratados en grupos de 10 con los esquemas detallados en los ejemplos 1 ,2,3 y 4.
Fueron caracterizados como GAR y BAR según los criterios expuestos en el ejemplo
6.
Del total de pacientes tratados en todos los esquemas, el 50% resulta ser GAR y el
50% BAR. Al hacer una comparación de las sobrevidas alcanzadas por los pacientes GAR con las alcanzadas por los pacientes BAR, resultó haber una diferencia estadísticamente significativa, con una mediana de sobrevida (SV) para GAR de 9.1 meses, y una mediana de SV para BAR de 4.5 meses (p<0.02). Este resultado puede observarse en la Figura 6. Ejemplo 7: Efecto terapéutico de la combinación de Radioterapia y del AMC
IOR-R3:
El paciente RML, diagnosticado como portador de carcinoma epidermoide de base de lengua, etapa IV fue incluido en el ensayo clínico de uso combinado del AMC
IOR-R3 y radioterapia (RTP). Recibió 6 veces la dosis de 200 mg del AMC, con frecuencia semanal. La dosis acumulada del AMC fue de 1200 mg y la dosis radiante fue de 60 Gy.
Al terminar la terapia combinada el paciente evidenció remisión completa del tumor primario y sus metástasis (Figura 7). Esta respuesta se mantuvo por más de 13 meses. Ejemplo 8: Efecto terapéutico de la combinación de Radioterapia y del AMC IOR-R3:
El paciente EPG, diagnosticado como portador de carcinoma epidermoide de amígdala con adenopatías cervicales, etapa III, fue incluido en el ensayo de tratamiento combinado del anticuerpo monoclonal humanizado hR3 (depositado con número de acceso 951110101 en ECACC, Inglaterra) y RTP. Recibió 200 mg del AMC , con frecuencia semanal, durante 6 semanas, y una dosis radiante de 64 Gy. Al finalizar el tratamiento, este paciente mostró remisión completa de la lesión tumoral (figura 8) y la respuesta se mantuvo por más de 13 meses. Ejemplo 9: Efecto terapéutico de la combinación de Radioterapia y del AMC IOR-R3:
El paciente CHA, diagnosticado como portador de tumor de amígdala, en etapa IV, con adenopatías cervicales bilaterales fue incluido en el ensayo de tratamiento combinado del hR3 y RTP. Recibió dosis de 400 mg con frecuencia semanal, durante 6 semanas, para una dosis acumulada de 2400 mg. Concurrentemente recibió una dosis radiante de 64 Gy. Al finalizar el tratamiento este paciente se encontraba en remisión completa del tumor primario y las metástasis loco-regionales (Figura 9). Esta respuesta se mantiene por 12 meses. Ejemplo 10: Evaluación de combinación de terapia pasiva con anticuerpo anti- EGF-R (IOR-R3) y anticuerpo monoclonal anti-ligando del EGF-R (EGF-1) en ratones atímicos.
Evaluación de efecto anti-tumoral en relación con las dosis administradas. Este experimento simula además el posible efecto de la administración combinada del AMC anti-EGF-R y la Vacuna EGF, ya que esta última provoca una respuesta de anticuerpos anti-EGF que ejerce el mismo efecto que la administración pasiva de anticuerpos monoclonales con esa especificidad, con la ventaja adicional que la respuesta de anticuerpos lograda por vacunación puede ser mantenida en el tiempo, como se puede observar en los ejemplos 1 , 2 , 3 y 4, en los que se demuestra la cinética de títulos de anticuerpos en pacientes inmunizados con dicha vacuna. Siete diferentes grupos de ratones atímicos de fondo genético NMRI (población abierta), fueron inmunizados con :
Grupo 1 : 10 dosis de 0.5 mg del AMC EGF-1 , por vía intraperitoneal y con frecuencia diaria. Grupo 2: 10 dosis de 1 mg AMC EGF-1 , por vía intraperitoneal y con frecuencia diaria.
Grupo 3: 10 dosis de 0.5 mg del AMC IOR-R3, por vía intraperitoneal y con frecuencia diaria. Grupo 4: 10 dosis de 1 mg del AMC IOR-R3, por vía ¡ntraperitoneal y con frecuencia diaria.
Grupo 5: 10 dosis de PBS, por vía intraperitoneal y con frecuencia diaria (control negativo).
Grupo 6: 10 dosis de la combinación de 0.5m g de EGF-1 y 0.5 mg de IOR-R3, por vía intraperitoneal y con frecuencia diaria
Grupo 7: 10 dosis de la combinación de 1m g de EGF-1 y 1 mg de IOR-R3, por vía intraperitoneal y con frecuencia diaria
El mismo día del inicio del tratamiento se les trasplanta 1 x 106 células de la línea tumoral humana H125, que sobre-expresa el EGF-R. Las Figuras 10 y 11 muestran los resultados obtenidos. Se produce una potenciación del efecto anti-tumoral al combinar ambos tratamientos, y el mismo se hace mayor al aumentar las dosis aplicadas.
Ejemplo 11 : Esquema de tratamiento combinado AMC IOR-R3/ Vacuna EGF en paciente con tumor en estadio avanzado: El paciente ARP, diagnosticado como portador de carcinoma epidermoide de cabeza y cuello, recibió un tratamiento combinado secuencial de AMC IOR-R3 y Vacuna
EGF.
Recibió 6 dosis de 200 mg del AMC, con frecuencia semanal, durante 6 semanas, conjuntamente con 30 dosis de radioterapia, 5 dosis por semana por 6 semanas, para una dosis radiante acumulada de 60 Gy.
Al finalizar el tratamiento estaba en remisión completa del tumor primario.
Un mes después de finalizado el tratamiento con el AMC, se inició un esquema de inmunización con la Vacuna EGF.
Recibió 5 dosis de 50 ug de EGF conjugado a P64, en un volumen total de 0.6 mis, mezclado hasta emulsificación con 0.6 mi de Montanide ISA 51 en el momento de la inmunización. Las inmunizaciones se realizaron en los días 1,7,14,21 y 51. El paciente se mantiene en seguimiento. Ejemplo 12: Esquema de tratamiento combinado AMC IOR-R3/ Vacuna EGF como terapia adyuvante:
El paciente MRM, diagnosticado como portador de carcinoma epidermoide de pulmón, fue sometido a intervención quirúrgica. Un mes después del acto quirúrgico, el paciente inició un tratamiento combinado simultaneando la inmunoterapia pasiva con el AMC IOR-R3 y la vacuna EGF. En la
(Figura 12) se detalla el esquema de intervalos de dosificación del tratamiento recibido.
El paciente se encuentra en seguimiento. BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS:
Figura 1: Cinética de respuesta de anticuerpos anti-EGF en paciente MMG, inmunizado según se detalla en el ejemplo 1. Las flechas indican tiempos en que se realizaron re-inmunizaciones.
Figura 2: Cinética de respuesta de anticuerpos del paciente AMC, inmunizado según se detalla en el ejemplo 2. Las flechas indican tiempos en que se realizaron reinmunizaciones.
Figura 3: Regresión tumoral observada en el paciente AMC. En la imagen de la izquierda se observa masa tumoral existente al inicio del tratamiento. En la imagen de la derecha se observa que a los 12 meses de iniciado dicho tratamiento la masa tumoral había desaparecido.
Figura 4: Cinética de respuesta de anticuerpos anti-EGF en el paciente FNR, inmunizado según se detalla en el ejemplo 3. Las flechas indican tiempos en que se realizaron re-inmunizaciones.
Figura 5: Cinética de respuesta de anticuerpos anti-EGF del paciente JPG, inmunizado según se detalla en el ejemplo 4. Las flechas indican tiempos en que se realizaron re-inmunizaciones.
Figura 6: La figura muestra las curvas Kaplan Meyer de los grupos de pacientes con altas respuestas anti-EGF (GAR) y con bajas respuestas anti-EGF (BAR), así como la de un grupo control histórico. Puede observarse que los GAR presentan un incremento de sobrevida significativo comparados tanto con GAR como con los controles históricos.
Figura 7: Demostración gráfica de remisión del tumor en paciente RML, tratado como se detalla en ejemplo 7. Figura 8: Demostración gráfica de regresión tumoral en paciente EPG tratado según se detalla en el ejemplo 8.
Figura 9: Demostración gráfica del tumor en paciente CHA, tratado como se detalla en el ejemplo 9. Figura 10: Grupos de ratones inmunizados conθ.5 mg de cada uno de los AMC IOR-
R3 , EGF-1 , y con la combinación de 0.5 mg de IOR-R3 + 0.5 mg de EGF1 , como se detalla en el ejemplo 10. Se observa un efecto sinérgico de disminución del crecimiento tumoral en el grupo tratado con la combinación de ambos AMC.
Figura 11: Grupos de ratones inmunizados con 1mg de cada uno de los AMC IOR- R3 , EGF-1 , y con la combinación de 1 mg de IOR-R3 + 1 mg de EGF1 , como se detalla en el ejemplo 10. Se observa un efecto sinérgico de disminución del crecimiento tumoral en el grupo tratado con la combinación de ambos AMC.
Figura 12: Tratamiento combinado conjunto del AMC IOR-R3 y la Vacuna EGF:
Las flechas por encima del eje de tiempo significan las fechas de administración del AMC (días 1 ,7,14,21 ,28 y 35) y las flechas por debajo del eje de tiempo significan los tiempos de las inmunizaciones con la Vacuna EGF (días 2,8,15,22,y 52).

Claims

REIVINDICACIONES
1. Una combinación inmunoterapéutica para el tratamiento de tumores, la cual tiene efecto sobre células cuyo crecimiento es dependiente del sistema de receptores RTK, caracterizada porque dicha combinación comprende la administración de forma simultánea o secuencial de A + B; ó A + C; ó A + D; ó B + C; ó B + D; ó C + D, donde A, B, C y D son:
A.- Un anticuerpo contra un receptor RTK;
B.- Un anticuerpo contra el(los) ligando(s) del receptor RTK; C- Una vacuna cuyo principio activo es un receptor de RTK, el cual induce anticuerpos contra dicho receptor RTK;
D.- Una vacuna cuyo principio es el(los) ligando(s) de un receptor de RTK, el cual induce anticuerpos contra dichos ligando(s) del receptor RTK;
2. Una combinación según la reivindicación 1 donde el anticuerpo monoclonal contra el receptor RTK es un anticuerpo contra el receptor del Factor de Crecimiento
Epidérmico, R-EGF.
3. Una combinación según la reivindicación 2 donde el anticuerpo contra el receptor del Factor de Crecimiento Epidérmico, R-EGF, es un anticuerpo humanizado.
4. Una combinación según la reivindicación 3 donde el anticuerpo humanizado contra el receptor de EGF es el hR3, depositado con número de acceso
951110101 en ECACC, Inglaterra.
5. Una combinación según la reivindicación 1 donde el anticuerpo contra el ligando del receptor RTK es un anticuerpo contra el EGF.
6. Una combinación según la reivindicación 1 donde el anticuerpo contra el ligando del receptor RTK es un anticuerpo contra el TGF alfa.
7. Una combinación según las reivindicaciones de la 1 a la 6 donde el principio activo de la vacuna es el receptor del EGF.
8. Una combinación según las reivindicaciones de la 1 a la 6 donde el principio activo de la vacuna es el EGF.
9. Una combinación según la reivindicación 8 donde el principio activo de la vacuna comprende un conjugado entre la proteína p64K de Neisseria meningitis y el EGF.
10. Una combinación según las reivindicaciones de la 1 a la 6 donde el principio activo de la vacuna es el TGF alfa.
11. Una combinación según la reivindicación 10 donde la vacuna comprende como principio activo un conjugado entre la proteína p64K de Neisseria meningitis y el TGF alfa.
12. Un método para el control del crecimiento y/o proliferación de células cuyo 5 crecimiento es dependiente del sistema de receptores RTK caracterizado porque comprende el tratamiento con una de las combinaciones terapéuticas definidas en cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 11.
13. Un método según reivindicación 12 caracterizado porque las combinaciones pueden ser aplicadas de forma simultánea o secuencial.
10 14. Un método según reivindicación 13 caracterizado porque cuando se aplican las combinaciones de forma secuencial, la aplicación de los componentes de la combinación se realiza en cualquier orden.
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