BR112016002174B1 - Composição de vacina - Google Patents

Abstract

COMPOSIÇÃO DE VACINA, E, USO DA MESMA. Uma descrição é dada de composições de vacina que combinam, em proporções iguais, os domínios extrace lulares de receptores do fator de crescimento Her1 e Her2 ou fragmentos dos mesmos e, além disso, proteolipossomas de tamanho muito pequeno derivados de proteínas de membrana externa de Neisseria meningitidis e gangliosídeo GM3 (GM3- VSSP), que são destinados para administração subcutânea. As composições descritas permitem que anticorpos sejam induzidos para o tratamento de tumores malignos e oferecem vantagens devido ao fator de que eles eliminam com sucesso totalmente a massa do tumor e evitam a regressão do tumor a partir do aparecimento de variantes resistentes.

Description

CAMPO TÉCNICO DA INVENÇÃO

[001] A presente invenção refere-se à biotecnologia e imunologia aplicadas à saúde humana. Ela refere-se, particularmente, a uma formulação de vacina para o tratamento de tumores malignos.

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO

[002] Receptores Her1 e Her2 são glicoproteínas transmembranares com atividade de tirosina quinase que pertence a uma família de receptores conhecidos como a família ErbB (Normanno N, et al (2005) Curr Drug Targets 6, (3):243-257). Her1 é sobre-expressado em tumores de pulmão, mama, cabeça e pescoço, colo-retais, pâncreas, bexiga, ovário, glioblastomas (TM Brand, et al, (2011) Cancer Biol Ther 11 (9):777-792); (Zhau HY et al, (1996) Proc Natl Acad Sci EUA 93, (26):15152-15157; Liu XH, et al, (1993) J Clin Endocrinol Metab 77 (6):1472-1478; Neal DE, et al, (1985) Lancet 1 (8425):366-368; Gullick WJ, et al, Cancer Res 46 (1):285-292; Salomon DS, et al, (1995) Crit Rev Oncol Hematol 19 (3):183-232). A superexpressão de Her1 está associada com um pobre prognóstico em tumores de cabeça e pescoço e câncer de pulmão, com um risco elevado de recorrência da doença (Turkeri LN et al, (1998) Urology 51 (4):645-649; Chow NH, et al, (1997) Anticancer Res 17 (2B):1293-1296) e com a sobrevida diminuída de pacientes com câncer de ovário, cólon, bexiga, tireoide e cabeça e pescoço (Grandis et al, (1998) J Cell Biochemr 69 (1):55-62).

[003] Além disso, os níveis de expressão de Her1 correlacionam-se com resistência a terapias convencionais (Holbro T, et al, (2003) Exp Cell Res 284 (1):99-110). Além disso, uma expressão aberrante de receptor Her2, em comparação com a expressão em tecidos normais, foi encontrada em tumores da mama, gástricos, de ovário e próstata (Tai W et al, (2010) J Control Release 146 (3):264-275). Além disso, desregulação deste receptor foi observada na transformação maligna do trato respiratório (Andrade Filho et al., 2010) e é um mecanismo de resistência de tumor às terapias anti-Her1 (Brand et al, (2011) Cancer Biol Ther 11 (9):777-792). A sobre-expressão de Her2 em tumores de mama tem sido correlacionada com menor sobrevida total e a sobrevida livre de recaídas.

[004] Muitos dos tumores acima mencionados coexpressam níveis elevados de Her1 e Her2, e a sobre-expressão de ambos os receptores está associada com a sobrevida diminuída do paciente (Wiseman SM, et al, (2005) Cancer. May 1; 103(9):1770-7). Pacientes com tumores da mama positivos para Her2 têm um risco elevado de mortalidade associado com a doença e, além disso, a coexpressão de Her1 e Her2 nestes tumores aumenta, de modo significativo, este risco, o que indica que a expressão de Her1 nestes carcinomas tem um efeito sinérgico sobre expressão de Her2 (Suo Z et al, (2002) J. Pathol 196 (1):17-25). Foi experimentalmente demonstrado que existe uma interação sinergística entre estes receptores em transformação maligna de células (Kokai Y et al, (1989) Cell 58 (2):287-292). Outros exemplos de tumores, em que a coexpressão de Her1 e Her2 foi encontrada, incluem os cânceres de cérebro, ovários, cabeça e pescoço, pulmão, esófago e cólon (Emanuel SL et al, (2008) Mol Pharmacol 73 (2):338-348 ; Ako E et al, (2007) Oncol Rep 17 (4):887-893; Venkateswarlu S et al, (2002) Oncogene 21 (1):78-86).

[005] Está bem documentado na literatura o papel fisiológico da expressão aberrante e coexpressão de receptores Her1 e Her2 em tumores. Estes receptores, através da formação de dímeros e heterodímeros (Pinkas- Kramarski R et al, (1996) EMBO J 15 (10):2452-2467), regulam processos importantes na biologia de tumor, como a proliferação sustentada, angiogenese, inibição de apoptose, reprogramação metabólica e capacidade invasiva e metastática (Hanahan D et al (2011) Cell 144 (5):646-674).

[006] Ambos os receptores Her1 e Her2 apresentam uma estrutura similar consistindo de um domínio extracelular (ECD), um domínio transmembranar único e um domínio intracelular com atividade de tirosina quinase. O ECD de Her1 (ECD-Her1) e o ECD de Her2 (ECD-Her2) tem um peso molecular de 105 e 110 kDa, respectivamente, e podem ter uma conformação diferente no espaço da do resto da molécula. Os ECDs compreendem quatro subdomínios denominados I, II, III e IV. Subdomínios I e III são as regiões que formam o sítio de ligação ao ligante e contêm sítios de glicosilação potenciais. Subdomínio II é a região crítica para dimerização entre receptores, sendo chamado de "braço de dimerização" (Garrett TP et al, (2002) Cell 110 (6):763-773; Ferguson KM et al, (2003) Mol Cell 11(2):507- 517).

[007] Sete ligantes para Her1 foram descritos, entre eles os mais relevantes para a formação de tumores são o fator de crescimento epidérmico (EGF), que promove a proliferação de células epidérmicas que expressam o receptor, o fator de crescimento transformante (TGF) e anfirregulina (Normanno et al, (2005) Curr Drug Targets 6 (3):243-257). O ECD-Her1 está em equilíbrio dinâmico e tem conformações múltiplas que incluem conformações "fechadas" e conformações onde subdomínio II está em um estado mais flexível. A ligação do ligante desloca o equilíbrio para "estendido" ou conformação ativa, um estado conformacional que é competente para dimerização (Ferguson KM, (2008) Annu Rev Biophys. 37:353-373).

[008] No entanto, nenhum ligante específico para Her2 foi encontrado. A sinalização através deste receptor não requer fatores de crescimento, uma vez que o receptor tem uma conformação ativa ou "estendida" de forma constitutiva, que expõe seu subdomínio de dimerização (Cho HS et al, (2003) Nature 421 (6924):756-760). Por esta razão, receptor Her2 é o parceiro de dimerização preferido para todos os outros membros da família ErbB, incluindo Her1 (Franklin MC et al, (2004) Cancer Cell 5 (4):317-328). Heterodimerização com Her2 contribui para uma diminuição no grau de endocitose de Her1 e um aumento de reciclo para a membrana dos receptores que formam o heterodímero (Lenferink A E et al, (1998) EMBO J 17 (12):3385-3397).

[009] Como descrito por Baselga J et al, (2009) Nat Rev Cancer 9 (7):463-475), a dimerização induzida por ligante permite a autofosforilação e transfosforilação de resíduos de tirosina na região citoplasmática dos receptores. Os resíduos de fosfotirosina gerados iniciam múltiplas vias de sinalização intracelulares. Uma das vias de sinalização iniciada é a das proteínas quinases ativadas por mitogenes (MAPKs), em cujo cascata de ativação participam as proteínas quinases Erk1 e Erk2 reguladas extra- celulares. Elas induzem a expressão de fatores de transcrição que aumentam a transcrição de genes envolvidos em proliferação celular, como ciclina D1 que promove progressão do ciclo celular para a fase G1/S. As combinações heterodiméricas são os complexos de sinalização mais potentes e tem controle direto do ciclo celular (Pinkas-Kramarski R et al, (1996) EMBO J. 15 (10):2452-2467).

[0010] Estes alvos de tumor foram extensivamente validados em estudos clínicos. O efeito clínico de tratamento com inibidores da tirosina quinase (TKI) destes receptores, como gefitinib e lapatinib, foi avaliado (Ciardiello F et al, (2000) Clin Cancer Res 6 (5):2053-2063; Kondo N et al, (2010) Oncol Rep 23 (4):957-963). Encontram-se também relatórios de testes clínicos que usam anticorpos monoclonais (MAbs) contra os alvos acima mencionados, como cetuximabe (Jean GW et al, (2008) Pharmacotherapy 8(6):742-54) e nimotuzumabe (Ramos TC, et al, (2006) Cancer Biol Ther 5 (4):375-379), que são específicos para o ECD de Her1, e trastuzumabe, que reconhece ECD de Her2 (Clifford A, (2007) N Engl J Med; 357:39-51). Apesar do efeito antitumor potente de algumas destas terapias, como cetuximabe, os mecanismos moleculares de resistência foram descritos, entre os quais os níveis aumentados de expressão de outro receptor da família, por exemplo, Her2 (Brand TM et al, (2011) Cancer Biol Ther 11 (9):777-792). Por outro lado, foi encontrada uma melhor resposta a MAb murino anti-Her1, pertuzumabe, em carcinomas de mama e pulmão expressando heterodímeros de Her2 com outros membros da família ErbB (Agus DB et al, (2005) J Clin Oncol 23 (11):2534-2543). Isso reforça a ideia de que a inibição da heterodimerização constitui uma estratégia atraente para a terapia do câncer.

[0011] Além disso, terapia ativa com vacina de câncer surgiu como uma nova opção terapêutica, cujo objetivo é ativar a resposta do sistema imune em pacientes com tumores que expressam Her1 e Her2. Este tipo de terapia, no entanto, é desafiador, uma vez que envolve a estimulação do sistema imune deprimido pelo efeito supressor do tumor, o que leva à necessidade de formulações de vacina usarem adjuvantes a fim de ajudar a gerar uma resposta eficaz. Tal é o caso do adjuvante de proteolipossomas de tamanho muito pequeno (VSSP) derivados de proteínas de membrana externa de Neisseria meningitidis, que é capaz de ativar células dendríticas (DC) e polarizar a resposta imune para o padrão de Resposta tipo 1 de auxiliar (Th1), como descrito na patente WO 02/45746, depositada em 6 de dezembro de 2001.

[0012] Receptores Her1 e Her2 têm sido alvos de diferentes candidatos a vacinas avaliados em estudos pré-clínicos e clínicos. No projeto de vacinas com base em Her2, vacinas tipo DCs (Czerniecki BJ et al, (2007) Cancer Res 67 (4):1842-1852), peptídeos Her2 e ECD-Her2 tem sido usados. (Ladjemi MZ et al, (2010) Cancer Immunol Immunother 59 (9):1295-1312). Em estudos clínicos de fase II, com pacientes de câncer da mama, foi avaliada a imunização ativa com peptídeo p369-377 (peptídeo E75) derivado de ECD- Her2 apresentado por MHC-I, usando, como adjuvante, fator estimulador de colônias de granulócitos e macrófagos (GM-CSF). Esta vacina é capaz de gerar linfócitos T citotóxicos específicos (CTL) in vivo contra células sobre- expressando Her2 e está atualmente em estudos clínicos de fase II (Knutson KL et al, (2002) Clin Cancer Res 8 (5):1014-1018; Patil R et al, (2010) J Am Coll Surg 210 (2):140-147). Além disso, uma vacina terapêutica com base em ECD de Her2 e adjuvada com GM-CSF foi projetada, a vacina sendo capaz de retardar o crescimento de carcinomas que expressam Her2 e prolongar a sobrevida dos animais imunizados (Helguera et al, (2006) Vaccine 16; 24(3):304-16).

[0013] Composições de vacina que estimulam ou aumentam a resposta de anticorpos contra gangliosídeos e compreendem um imunogene e um adjuvante imunológico são descritas no pedido de patente EP-A-661061 e patente US-A-6149921. Os imunogenes descritos são VSSP formados pela associação dos gangliosídeos GM3 N-acetilados (N-AcGM3) e N- glicolilGM3 (N-GcGM3), com o complexo de proteína de membrana externa (OMPC) de bactéria Neisseria meningitidis. Imunogenes N-AcGM3/VSSP e N-GcGM3/VSSP são de tamanho muito pequeno, praticamente invisíveis ao microscópio eletrônico, solúveis em água e com alta flutuabilidade.

[0014] Patente WO-A-02145746 descreve composições de vacina que contêm:(a) um ou mais antígenos fracamente imunogênicos; (B) VSSPs com gangliosídeos incorporados, principalmente N-AcGM3/VSSP e N- GcGM3/VSSP; e (C) opcionalmente um ou mais adjuvantes. Particularmente é descrita uma vacina cujo princípio ativo é o ECD-Her1 e que usa VSSP e Montanide ISA51 VG como adjuvantes. Estudos pré-clínicos com esta vacina demonstraram seu efeito antitumor in vitro e in vivo (Ramirez BS, et al, (2006) Int J Cancer 119 (9):2190-2199; Ramirez BS, et al (2008) Vaccine 26(38):4918-4926).

[0015] Embora resultados tenham sido alcançados com terapias monovalentes, eles não foram suficientemente eficazes, porque uma vez que as terapias não podem remover completamente a massa de tumor e mesmo quando o tumor de fato diminui de tamanho, eventualmente ele retorna após a emergência de variantes resistentes. Isto sugere que perturbações específicas não são capazes de anular os sistemas biológicos complexos, como tumores. A explicação para este fato pode ser que as variantes resistentes, geradas por monoterapias alvo-marcando membros da família ErbB, aumentam os níveis de expressão de outros membros da família (Brand TM, et al, (2011) Cancer Biol Ther 11 (9):777-792) permitindo que os tumores escapem do ataque do sistema imune. Devido a isto, uma perturbação múltipla na biologia do tumor através da inativação de mais de um receptor ErbB pode resultar em uma eficácia aumentada.

[0016] O pedido de patente WO-A-02145746 também reivindica uma composição compreendendo receptores de fator de crescimento Her-1, Her-2 e PDGF-R, ou qualquer uma de suas variantes, contendo o domínio extracelular, com ou sem a região transmembranar. No entanto, nem este pedido nem qualquer outro documento da técnica ensina como combinar os dois receptores, particularmente os ECDs de receptores Her1 e Her2 de modo a produzir uma vacina bivalente eficaz na indução da produção de anticorpos no indivíduo vacinado.

[0017] Os autores da presente invenção descobriram que, quando os ECDs de Her1 e Her2 e VSSP-GM3 são misturados na mesma proporção, uma composição de vacina capaz de induzir a produção de títulos de anticorpos que inibem fosforilação de Her1 e Her2 é obtida e estes anticorpos têm um efeito anti-proliferativo sobre as células de tumor. Os inventores também descobriram que a proporção em que os ECDs de Her1 e Her2 são combinados é crítica para obter a resposta imune desejada, isto é, que não é qualquer combinação dos ECDs de receptores Her1 e Her2 que desencadeia esta resposta imune.

[0018] O objeto da presente invenção são novas composições de vacina com a mesma proporção dos ECDs de receptores Her1 e Her2 e VSSPs-GM3 para administração subcutânea.

[0019] Outro objeto da presente invenção é um método para tratar pacientes sofrendo de uma doença causada por tumores que expressam os receptores de fatores de crescimento Her1 e Her2 compreendendo a administração subcutânea de uma composição de vacina dos ECDs de receptores Her1 e Her2 e VSSPs-GM3, em que os ECDs de receptores Her1 e Her2 são encontrados em proporção igual.

[0020] Outro objeto da presente invenção são as composições de vacina com a mesma proporção dos ECDs de receptores Her1 e Her2 e VSSP- GM3 e um adjuvante adicional que pode ser oleoso ou não oleoso.

[0021] Outro objeto da presente invenção é um método que induz a resposta imune para o tratamento de tumores malignos que expressam receptores Her1 e Her2.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[0022] A presente invenção refere-se a uma composição de vacina compreendendo os ECDs de receptores Her1 e Her2 ou fragmentos dos mesmos usados para induzir uma resposta imune contra tumores malignos que expressam receptores Her1 e Her2. Esta composição de vacina ainda compreende proteolipossomas de tamanho muito pequeno, purificados a partir de proteínas da membrana externa de Neisseria meningitidis e o GM3 (VSSP- GM3). Em uma modalidade particular, a composição da presente invenção ainda compreende um adjuvante farmaceuticamente apropriado. Estes adjuvantes farmaceuticamente apropriados incluem, mas não são limitados a, adjuvantes oleosos, como óleo mineral altamente purificado e um tensoativo e não adjuvantes oleosos, como alumina.

[0023] Surpreendentemente, os inventores da presente invenção verificaram que a proporção em que ECDs dos receptores são combinados é relevante na indução da resposta imune contra tumores malignos que expressam receptores Her1 e Her2. A composição de vacina bivalente aqui descrita compreende os ECDs de receptores Her1 e Her2 na mesma proporção. A mistura de ambas as substâncias ativas, isto é, os ECDs de receptores Her1 e Her2 em outras proporções, não apresenta o efeito desejado sobre o sistema imune. Em uma modalidade, a composição da presente invenção compreende os ECDs de receptores Her1 e Her2 em uma faixa de concentração de aproximadamente 100 a aproximadamente 800 ug/dose. Mais particularmente, a composição da presente invenção compreende 800 ug/dose de cada um dos ECDs de receptores Her1 e Her2 ou fragmentos dos mesmos e, adicionalmente, compreende 1,2 mg/dose de VSSP-GM3, administrados subcutaneamente, em uma solução aquosa.

[0024] Em outra modalidade, a presente invenção compreende estas doses de 800 ug/dose de cada um dos ECDs de receptores Her1 e Her2 ou fragmentos dos mesmos e 1,2 mg/dose de VSSP-GM3 que podem ser misturados com um adjuvante que pode ser Montanide ISA 51 ou Alumina.

[0025] Em outra modalidade, a presente invenção refere-se a uma composição de vacina compreendendo os ECDs de receptores Her1 e Her2 ou fragmentos dos mesmos a ser usada na indução de uma resposta imune como um método para o tratamento de tumores malignos que expressam receptores Her1 e Her2. O método de tratamento da presente invenção compreende a administração subcutânea de, pelo menos, uma dose dos ECDs de receptores Her1 e Her2 ou fragmentos dos mesmos em uma faixa de dose de aproximadamente 100 a aproximadamente 800ug/dose, e, adicionalmente, de 200 ug/dose a aproximadamente 1,2 mg/dose de VSSPs-GM3. A administração pode ser por injeção subcutânea a cada duas semanas para completar um total de 5 doses e, então, uma dose de manutenção será administradas durante 1 ano. Em uma modalidade particular, a presente invenção compreende a composição de vacina com adjuvante Montanide ISA 51 administrado intramuscularmente.

[0026] A presente invenção compreende o uso dos ECDs de receptores Her1 e Her2 ou fragmentos dos mesmos, obtidos por técnicas de síntese de proteínas ou de engenharia genética.

[0027] Na presente invenção, os termos formulação de vacina bivalente ou composição de vacina bivalente são usados alternadamente e em todos os casos eles fazem referência à composição de vacina compreendendo os domínios extracelulares (ECDs) dos receptores Her1 e Her2 usados ou fragmentos dos mesmos para criar uma resposta imune contra malignidades que expressam receptores Her1 e Her2, e que podem compreender adicionalmente VSSP-GM3.

[0028] Tumores malignos que podem ser tratados com esta composição de vacina incluem tumores que expressam, pelo menos, um receptor da família Her, particularmente Her1 e/ou Her2. Preferivelmente, tumores expressando ambos os receptores e, mais preferivelmente, os tumores que sobre-expressam ambos os receptores. Em uma modalidade preferida, a presente invenção compreende tumores de origem epidérmica e, mais particularmente, tumores de cabeça e pescoço, mama, pulmão, cólon, pâncreas, próstata, bexiga e ovário e glioma. As abreviaturas MAbs e PAbs fazem referência aos anticorpos monoclonais e policlonais, respectivamente. BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS:

[0029] Figura 1 mostra a cinética de Abs de IgG em camundongos BALB/c (n = 5) imunizados subcutaneamente quatro vezes a cada 14 dias, e 30 dias após a última imunização com 100 μg de ECD-Her1 e 100 μg de ECD-Her2 em 200 μg de VSSPs. Retiradas de amostras de sangue foram realizadas nos dias 7, 21, 35, 56, 87 e 102 para medir títulos de Abs de IgG do soro imune usando o teste ELISA. As cinéticas de IgG de Abs são expressadas como o Logaritmo (1/título meio+1) para cada dia de extração, quando foi revestido com o ECD-Her1 (a) e ECD-Her2 (b). Resposta de Abs de camundongos individuais (n = 5) é mostrado na figura, a resposta é específica para ECD-HER1 (c) e ECD-Her2 (d) e foi medida representando graficamente o logaritmo recíproco do título de Abs mais 1, em dia 87 do protocolo de imunização. Letras diferentes indicam significância estatística, como testado por ANOVA de duas vias (fator de grupo de tratamento), usando a correção de teste de Bonferroni (p <0,05).

[0030] Figura 2 mostra o reconhecimento de linhagens celulares de tumor MDAMB468 e MCF7/HER2 por soros imunes induzido pela vacina bivalente Her1+Her2 e vacinas monovalentes Her1 e Her2, usando citometria de fluxo. As linhagens de células de tumor humano acima mencionadas foram incubadas com o soro imune (n = 5) ou com uma mistura de soros pré-imunes diluídos a 1:200, no dia 35 do protocolo de imunização, bem como os controles da expressão de receptores:MAbs nimotuzumabe e trastuzumabe, a uma concentração de 10 μg/ml. Subsequentemente, as células foram rotuladas com IgG anti-camundongo PAbs de cabra conjugado com isotiocianato de fluoresceína. As células rotuladas foram visualizadas por citometria de fluxo. A porcentagem de células reconhecidas pelos soros e MAbs foi determinada usando o software Flow Jo versão 5.7.2. Letras diferentes indicam significância estatística, como testado por ANOVA de duas vias (fator de grupo de tratamento), usando a correção de teste de Bonferroni (p <0,05).

[0031] Figura 3 mostra o reconhecimento de linhagem celular de tumor H292 por soros imunes induzidos pela vacina bivalente Her1+Her2 e vacinas monovalentes Her1 e Her2, usando citometria de fluxo. Células tumorais humanas foram incubadas no dia 35 do protocolo de imunização com soro imune (n = 5) ou com uma mistura de soros pré-imunes diluídos a 1:300, bem como os controles de expressão dos receptores: MAbs trastuzumabe em nimotuzumabe em concentração de 10 μg/ml. Subsequentemente, as células foram rotuladas com IgG anti-camundongo PAbS de cabra conjugada com isotiocianato de fluoresceína. As células rotuladas foram visualizadas por citometria de fluxo. A porcentagem de células reconhecidas pelos soros e MAbs foi determinada usando o software Flow Jo versão 5.7.2. Letras diferentes indicam significância estatística, como testado por ANOVA de duas vias (fator de grupo de tratamento), usando a correção de teste de Bonferroni (p <0,05).

[0032] Figura 4 mostra a inibição da fosforilação de Her2 e Her1 causada pelos soros imunes induzidos por administração da vacina bivalente Her1+Her2. As células H292 foram incubadas em uma mistura de cinco soros imunes induzidos pela vacina bivalente Her1+Her2 e vacinas monovalentes Her1 e Her2. Os níveis de fosforilação de Her1 e Her2e após a estimulação com EGF e com os diferentes tratamentos foram determinados por Western blot. As células não tratadas foram usadas como controle negativo e o tratamento com uma mistura de soros pré-imunes (PI) como um controle negativo de especificidade. TKI AG1478 foi usado como controle positivo para inibição. As imagens mostram os níveis de P-Her1 (a) e P-Her2 (b), obtidos com diferentes tratamentos. Os gráficos de barras mostram a análise densitométrica das imagens a partir de uma experiência representativa escolhida a partir das duas experiências realizadas.

[0033] Figura 5 mostra o efeito anti-proliferativo de Abs induzido por vacina bivalente Her1+Her2 em linhagem de tumor H292. Células H292 foram incubadas durante 48 horas em uma mistura de cinco soros imunes, diluídos 1:20, em dia 87 do protocolo de imunização. A mistura de soros PI foi usada como controle negativo no experimento. Viabilidade celular foi determinada pelo método colorimétrico MTT, determinando a diferença de densidade óptica (OD) por subtração de OD a 540 para o valor de OD a 620 nm. A porcentagem máxima de viabilidade foi encontrada quando subtraindo a diferença de absorbância da incubação com soro PI. Barras representam a média de triplicatas de três experiências para cada tratamento. Letras diferentes indicam significância estatística de acordo com o teste de Dunnett T3 para a versus b, p <0,01 para a versus c, P <0,001.

[0034] Figura 6 mostra os títulos de Abs que reconhecem ECD-Her1 e ECD-Her2 induzidos por formulações de vacina bivalente Her1+Her2 que contém quantidades equivalentes ou não equivalentes de cada receptor. Camundongos BALB/c (n=5) foram imunizados subcutaneamente quatro vezes a cada 14 dias com: Grupo 1, 100 μg de ECD- Her1 e 100 μg de ECD- Her2; Grupo 2, 100 μg de ECD- Her1 e 200 μg de ECD- Her2; Grupo 3, 100 μg de ECD- Her1 e 300 μg de ECD- Her2; Grupo 4, 200 μg de ECD-Her1 e 100 μg ECD-Her2; Grupo 5, 300 μg ECD- Her1 e 100 μg ECD- Her2. Todas as formulações continham 200 μg de VSSP. A determinação de títulos de anticorpos específicos de ECD-Her1 e ECD-Her2 foi realizada no soro por meio de um teste ELISA, a partir de uma coleta de sangue tomada no dia 56. Cinética de Abs IgG são expressadas como o meio de logaritmo recíproco mais um para cada dia de extração, quando foi revestido com o ECD-Her1 (a) e ECD-Her2 (b). A resposta de Abs IgG de camundongos individuais (n = 5) foi determinada representando graficamente o inverso dos títulos de anticorpos. Não foram observadas diferenças estatísticas como testadas por ANOVA de duas vias (fator de grupo de tratamento), usando a correção de teste de Bonferroni (p <0,05).

[0035] Os exemplos seguintes são destinados apenas a ilustrar, mas de modo nenhum para limitar a invenção reivindicada.

EXEMPLOS: Exemplo 1: Títulos de anticorpos específicos criados contra ECD-Her1 e ECD-Her2 induzidos por vacina bivalente Her1+Her2

[0036] Camundongos Balb/c foram imunizados subcutaneamente com uma formulação de vacina bivalente contendo 100 μg de ECD-Her1 e 100 μg de ECD-Her2. Um segundo grupo de camundongos foi imunizado com uma formulação de vacina monovalente contendo 100 μg de ECD-Her1, e um terceiro grupo foi imunizado com uma formulação de vacina monovalente contendo 100 μg de ECD-Her2. As três formulações de vacinas mencionadas continham 200 μg de adjuvante VSSP. As imunizações foram realizadas nos dias 0, 14, 28, 42 e 72, e amostra de sangue foi coletada para processamento do soro em dias -2, 21, 56, 87 e 102. Os títulos de anticorpos específicos contra os ECDs de Her1 e Her2 no soro foram determinados usando o método ELISA.

[0037] Os camundongos imunizados com a vacina bivalente Her1+Her2 criaram anticorpos do isotipo IgG específicos contra o ECD-Her1 e o ECD-Her2. Os títulos de anticorpos induzidos contra cada um destes receptores não diferiram dos induzidos pelas respectivas vacinas monovalentes. No caso da resposta de anticorpos contra ECD-Her1, ambos os títulos induzidos por vacina bivalente Her1+Her2 e vacina monovalente alcançaram valores de 1/10.000. A resposta contra ECD-Her2 induzida tanto pela vacina bivalente como pela vacina monovalente alcançou valores de títulos de anticorpo de 1/200.000 (Figura 1).

[0038] Este resultado mostra que a mistura de dois receptores em uma formulação de vacina única não afeta a imunogenicidade de cada uma das mesmas individualmente, o que valida o uso potencial desta formulação de vacina.

Exemplo 2: Reconhecimento de linhagens de tumor Her1+/Her2-, Her1- /Her2+ por soros induzidos por vacina bivalente Her1+Her2

[0039] Os soros de camundongos imunizados com a vacina bivalente Her1+Her2 e vacinas monovalentes Her1 e Her2, com diluição 1/200, foram incubados com 105 células de diferentes linhagens de células de tumor: MDA- MB468 (ATCC, HTB-132), derivadas de adenocarcinoma da mama, e MCF7/Her2, geradas a partir da transfecção de linhagens de células MCF7 (ATCC HTB-22) com Her2 de tamanho completo. Os soros de PI foram usados como controles de especificidade negativos. O Mab nimotuzumabe, que reconhece Her1, e anticorpo monoclonal Herceptin, que reconhece Her2, foram usados como controles positivos.

[0040] Os soros gerados pela vacina bivalente reconheceram a mesma porcentagem de células MDA-MB468 como os soros gerados por vacina monovalente Her1. Além disso, os soros gerados pela vacina bivalente reconheceram a mesma porcentagem de células MCF7/Her2 como o soro gerado pela vacina monovalente Her2, de acordo com o teste T3 de Dunnett (p> 0,05) (Figura 2). A intensidade de reconhecimento destes receptores foi também muito similar (Tabela 1).

[0041] Isto demonstra que os anticorpos que induziram a formulação bivalente contendo os receptores Her1 e Her2 truncados não afetam o reconhecimento dos receptores Her1 e Her2 de tamanho completo na membrana de células tumorais. Isto também mostra que a qualidade deste reconhecimento não é afetada quando os anticorpos contra Her1 e Her2 são gerados a partir de uma formulação com base em ambos os receptores, uma vez que o reconhecimento foi igual ao obtido com os soros a partir das vacinas monovalentes tanto em número de células reconhecidas como na intensidade do reconhecimento. Tabela 1: Média de intensidade de fluorescência média (MFI) de células MDAMB468 e MCF7/Her2 reconhecidas pelos soros imunes gerados pelos tratamentos.

Exemplo 3: Reconhecimento de linhagem de tumor Her1+/Her2+ por soros induzidos por vacina bivalente Her1+Her2

[0042] Os soros de camundongos imunizados com vacina bivalente Her1+Her2 e vacinas monovalentes Her1 e Her2, diluídos 1/300, foram incubados com linhagem celular de tumor H292 (ATCC CRL-1848), derivada de carcinoma de células escamosas do pulmão. Os soros pré-imunes foram usados como controles negativos de especificidade. MAb nimotuzumabe e MAb Herceptin foram usados como controles positivos.

[0043] A porcentagem de células H292 reconhecidas foi estatisticamente maior nos soros gerados pela vacina bivalente, em comparação com o reconhecimento dos soros gerados por vacinas monovalentes Her1 e Her2, de acordo com o teste T3 de Dunnett (p < 0,05) (Figura 3).

[0044] Isto demonstra que os anticorpos policlonais induzidos pela formulação bivalente tem um limite maior de reconhecimento de células de tumor devido à sua capacidade de reconhecer simultaneamente ambos os receptores, Her1 e Her2, sobre a membrana das células. Isto sugere que a vacina bivalente tem um potencial maior com relação às vacinas monovalentes, em termos de efeito biológico sobre as células de tumor H292, determinado pelo número de receptores reconhecidos. Este é o caso da inibição de ativação dos receptores da família Her, que estão envolvidos na proliferação de tumores.

Exemplo 4: Inibição da ativação de receptores Her1 e Her2 por vacina bivalente Her1+Her2

[0045] Os soros de camundongos imunizados com a vacina bivalente Her1+Her2 e vacinas monovalentes Her1 e Her2, diluídos a 1/100, foram incubados com células de linhagem de células de tumor H292. As células foram estimuladas com 100 ng/mL de EGF durante 10 min e, então, lisadas. O efeito do soro imune sobre a inibição da fosforilação de EGFR foi determinado por teste Western blotting, usando anticorpos específicos para a detecção de EGFR fosforilado e EGFR total. Neste teste, inibidor da tirosina quinase AG1478 a 10 μM foi usado como controle positivo da inibição da fosforilação, e soro PI foi usado como controle negativo de especificidade.

[0046] Soros gerados pela vacina bivalente inibiram a ativação de receptores Her1 e Her2, medida em termos de fosforilação, em uma maior extensão do que os soros de vacinas monovalentes Her1 e Her2. Os filmes de western blot foram submetidos à análise densitométrica. Os dados a partir da análise densitométrica concluíram que a diminuição em fosforilação de Her1 causada pelo soro imune induzido pela vacina bivalente Her1+Her2 com relação ao soro de PI foi de 11,2 vezes. Quando a mesma análise foi realizada com os soros induzidos por vacina monovalente Her1, a diminuição da fosforilação de Her1 foi de 1,7 vezes. No caso de soros a partir do grupo de vacina monovalente Her2, a redução foi de 2,2 vezes. No caso de Her2, a diminuição da fosforilação de Her2 induzida por soros de camundongos imunizados com vacina bivalente Her1+Her2 com relação ao soro PI foi de 8,7 vezes. Quando a mesma análise foi realizada com os soros induzidos por vacina monovalente Her1, a diminuição na fosforilação de Her2 foi de 1,7 vezes, e para os soros do grupo Her2 de vacina monovalente a redução foi de 3,5 vezes (Figura 4).

[0047] Isto demonstra a superioridade da vacina bivalente com relação às vacinas monovalentes. A vacina bivalente não só poderia ser capaz de inibir diretamente a fosforilação dos receptores Her1 ou Her2, que formam homodímeros (Her1/Her1 e Her2/Her2) através de anticorpos que bloqueiam a ligação do ligante contra o braço de dimerização, mas também poderia ser mais eficiente do que as vacinas monovalentes na redução da ativação dos receptores que fazem parte de um heterodímero Her1/Her2.

Exemplo 5: Efeito anti-proliferativo dos soros induzidos por vacina bivalente Her1+Her2 em linhagem de tumor Her1+/Her2+

[0048] As células H292 foram incubadas durante 48 h com soros de camundongos imunizados com vacina bivalente Her1+Her2 e vacinas monovalentes Her1 e Her2, diluídas 1:20. Após este tempo, o sobrenadante da cultura foi removido e o reagente MTT foi adicionado a uma concentração de 1 mg/mL. Após 4 horas de incubação, o sobrenadante foi removido e 100 μL de sulfóxido de dimetila foram adicionados para dissolver os cristais de formazano; absorbância foi medida determinando a diferença de OD subtraindo OD a 540 para o valor de OD a 620 nm com um leitor de ELISA. Células viáveis foram avaliadas por determinação da diferença na absorbância entre 540 nm e 620 nm. A diferença de absorbância obtida soro PI foi considerada como porcentagem de viabilidade máxima.

[0049] Células de tumor tratadas com o soro induzido por vacina bivalente Her1+Her2 tinham menos viabilidade do que as células de tumor incubadas com o soro induzido pelas vacinas monovalentes, de acordo com o teste estatístico T3 de Dunnett (p < 0,05 (Figura 5). Isto demonstra que a administração de vacina bivalente induziu um efeito anti-tumoral maior em células, em termos de efeitos anti-proliferativos, do que as vacinas monovalentes expressando receptores Her1 e Her2. Isto sugere seu potencial para ser um agente terapêutico eficaz contra tumores epiteliais expressando ambos os receptores.

Exemplo 6: Doses não-equivalentes de ECD-Her1 e ECD-Her2 diminuem a capacidade dos anticorpos gerados de reconhecer H125/Her1+/Her2+

[0050] Camundongos Balb/c foram imunizados subcutaneamente com uma formulação de vacina bivalente contendo combinações não equivalentes dos ECD-Her1 e ECD-Her2. Grupo 1 foi imunizado com 100 μg de ECD- Herl e 100 μg de ECD-Her2; grupo 2 com 100 μg de ECD-Her1 e 200 μg de ECD-Her2; grupo 3 com 100 μg de ECD-Her1 e 300 μg de ECD-Her2; grupo 4 com 200 μg de ECD-Her1 e 100 μg de ECD-Her2; grupo 5 com 300 μg de ECD-Her1 e 100 μg ECD-Her2. Todas as formulações de vacinas de adjuvante mencionadas continham 200 μg de VSSP. As imunizações foram administradas nos dias 0, 14 e 28 via injeções subcutâneas e sangue foi coletado para processar o soro no dia 42. Os títulos de anticorpos específicos contra ECDs de Her1 e Her2 foram determinados usando o método ELISA, e a capacidade dos soros acima mencionados para reconhecer linhagem de células de tumor H125, que expressa Her1 e Her2, foi avaliada por FACS (Figura 6).

[0051] A porcentagem de células de tumor reconhecidas pelos soros imunes foi de 100% para todos os grupos avaliados, o que é explicado pela capacidade de variantes de formulação avaliadas induzir títulos de anticorpos contra Her1 e Her2. No entanto, a qualidade de reconhecimento, medida em termos da intensidade de fluorescência média (MFI) foi maior para grupo 1, em que doses equivalentes de ambos os receptores (Tabela 2) foram combinadas. Tabela 2: Reconhecimento da linhagem de células de tumor H125 pelos soros imunes induzidos por formulações de vacina bivalente Her1+Her2 contendo doses equivalentes e não equivalentes de cada receptor. MFI: intensidade de fluorescência média

Claims (4)

1. Composição de vacina, caracterizada pelo fato de compreender os domínios extracelulares de receptores Her1 e Her2 sem a região transmembrana na mesma proporção e em uma faixa de concentração de 400 a 800 μg/dose e proteolipossomas de tamanho muito pequeno derivados de proteínas da membrana externa de Neisseria meningitidis e GM3 para induzir uma resposta imune contra tumores malignos que expressam receptores Her1 e Her2.

2. Composição de vacina de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a referida composição compreende ainda um adjuvante farmaceuticamente aceitável.

3. Composição de vacina de acordo com a reivindicação 2, caracterizada pelo fato de que o adjuvante farmaceuticamente apropriado é selecionado do grupo de: um adjuvante oleoso ou alumina.

4. Composição de vacina de acordo com a reivindicação 1 a 3, caracterizada pelo fato de ser para uso na indução de uma resposta imune contra tumores malignos que expressam Her1 e Her2.