EA021905B1

EA021905B1 - Однородная вакцинная композиция для лечения опухоли и способ её получения

Info

Publication number: EA021905B1
Application number: EA201070080A
Authority: EA
Inventors: Грисселль Мария Родригес Мартинес; Лисель Винья Родригес; Лоани Кальво Гонсалес; Ариадна Куэвас Фиалло; Эрнесто Чико Велис; Таниа Кромбет Рамос; Айрама Албиса Ново; Гисела Мария Гонсалес Маринелло; Агостин Бьенвенидо Лахе Давила
Original assignee: Сентро Де Инмунология Молекулар
Priority date: 2007-06-29
Filing date: 2008-06-26
Publication date: 2015-09-30
Also published as: RS52196B; ES2379130T3; ZA201000609B; PT2184072E; MY149136A; BRPI0813662A2; BRPI0813662B1; US8841251B2; TW200918092A; US20100196412A1; PE20090426A1; CN101790383A; PE20131037A1; KR20100039372A; EP2184072B1; UY31184A1; EP2184072A1; AR067085A1; NZ582829A; JP2010531817A

Abstract

Настоящее изобретение относится к области биотехнологии, в частности к медицине. Раскрыт способ получения конъюгата hrEGF-P64K, включающий ковалентное сопряженное связывание белка hrEGF с белком-носителем P64K и очистку молекулярного комплекса методом ультрафильтрации/диафильтрации с использованием мембраны, имеющей размер пор, пропускающих белки с молекулярной массой от 50 до 100 кДа. Также раскрыта вакцинная композиция, включающая конъюгат hrEGF-P64K, и адъювант, выбранный из группы, включающей гидроксид алюминия или монтанид. Настоящее изобретение позволяет получить вакцинные композиции, увеличивающие иммунные реакции против аутологичного EGF.

Description

Настоящее изобретение относится к биотехнологии, в частности к медицине. В одном варианте осуществления, настоящее изобретение относится к профилактическим и/или лечебным противораковым вакцинам, главным образом, к композициям вакцин, применяемых для обеспечения значительного усиления иммунной реакции против эпидермального фактора роста (ЕОР), связь которого с онкологическими заболеваниями была широкого продемонстрирована, главным образом, в отношении роста опухолей эпителиального происхождения.

Предшествующий уровень техники

Система рецепторов ЕОР (ЕОРК), включая лиганды, представляет собой молекулярный комплекс, который специфически регулирует клеточный рост и его воздействие на неконтролируемый рост эпителиальных опухолей.

В процессе онкогенеза, нарушение регуляции паракринных и аутокринных процессов с активацией ЕОРК участвуют в избыточной экспрессии факторов роста, а также увеличенном синтезе и/или мутации рецепторов.

ЕОР представляет собой полипептид из 53 аминокислот с видимой молекулярной массой 6045 Да. Этот пептид был впервые выделен и очищен СоРеп δ., 1. Βίοί. СРет. 20 (1962) 237, 1555).

ЕОР является членом семейства лигандов ЕОРК; это семейство включает структурно и функционально связанные белки. Другими членами этого семейства являются: трансформирующий фактор роста (ТОР), амфирегулин (АК), криптол (СК1), связывающий герин фактор роста, бетацелулин и эфирегулин. С другой стороны, семейство поксивирусов включает белки, связанные с ЕОР; среди них, наиболее полно охарактеризованным является фактор роста вируса коровьей оспы (УОР).

Все эти молекулы способны связывать ЕОРК с последующей активацией рецепторов. Таким образом, они известны как лиганды ЕОРК и играют роль в росте нормальных и опухолевых клеток.

ЕОРК представляет собой гликопротеин 170 кДа; ген был уже клонирован и секвенирован. Внутриклеточный домен этого рецептора связан с активностью тирозин-киназы молекул, которая проявляет структурную гомологию с теми белками, которые кодируются онкогеном ν-егЬ-В, и они участвуют в процессе злокачественной трансформации (НЕБ-ЭШ С.Н. (1984), СЕРЬ 37, 9-20).

Экспериментальные данные последних лет о связи между ЕОРК и системой их лигандов и раком, делает ее привлекательной мишенью для иммунотерапии рака.

Ранее полученные результаты продемонстрировали эффективность в отношении рака активной иммунотерапии вакцины на основе ЕОР. Действительно, были получены преклинические и клинические данные об иммуногенности и отсутствии токсичности, вызванной вакцинацией РгЕОР, связанным с белком-носителем (Ооп/а1е/ е! а1. (1996) Уассопе КекеагсР 5(4), 233-243).

В документе ЕР 0657175 описана вакцинная композиция, включающая аналогичный ЕОР, соединенный с белком-носителем, которая ингибирует рост зависимых от ЕОР опухолей аутоиммунным эффектом.

Вакцинная композиция, описанная в документе ЕР 0657175, представляет собой сопряженно связанные вакцины, содержащие ЕОР, соединенный с белком-носителем (белок Р64К, цепь холерного токсина В, белок столбнячного анатоксина и/или моноклональные антитела), и, как следствие, получается в неоднородной и мало воспроизводимой смеси сопряженно связанных видов.

Новая вакцинная композиция, описанная в настоящем изобретении, включает аутологичный ЕОР в качестве активного начала, и характеризуется наличием однородной химической композиции с определенной чистотой, вызывающей более высокую иммуногенность, по существу, повышенную клиническую активность и при меньшем количестве иммунизации для получения терапевтического эффекта.

К удивлению, более низкое содержание аутологичного антигена в вакцинной композиции по настоящему изобретению не вызывает более низкие титры антител против ЕОР у людей; напротив, оно скорее вызывает значительное увеличение титров антител против ЕОР. Более низкое содержание ЕОР и его производных в вакцинной композиции было получено разработкой способа очистки на основе мембранной фильтрации, который также является целью настоящего изобретения.

Кроме того, настоящее изобретение предоставляет однородную и воспроизводимую вакцинную композицию с более длительным клиническим эффектом и требующую меньшее количество иммунизации, что имеет большое преимущество при лечении рака и для пациента, по сравнению с ранее описанными вакцинными композициями.

Вакцинная композиция по настоящему изобретению может также содержать соответствующие адъюванты, такие как гидроксид алюминия или монтанид.

В другом варианте осуществления, настоящее изобретение относится к санитарной процедуре для получения указанной вакцинной композиции, целесообразной для применения у людей парентеральным путем.

Процедура включает подходящий способ ковалентного сопряженного связывания РгЕОР с белкомносителем Р64К, и очистку конъюгатов путем использования ультрафильтрационных мембран в диапазоне от 500 до 100 кДа для удаления биологически неактивных видов, сопряженно связанных (без иммуногенной активности), а также других химических примесей.

- 1 021905

Детальное описание изобретения

Настоящее изобретение раскрывает новую вакцину на основе аутологичного БОР, содержащую указанную вакцинную композицию с однородным химическим составом и определенной чистотой, и которая способна вызывать и потенцировать иммуногенность и существенно увеличить клиническую активность. Кроме того, при использовании вакцинной композиции по настоящему изобретению можно использовать более высокие терапевтические дозы без увеличения числа инъекций при необходимости увеличения терапевтической дозы, потому что с помощью процедуры получения вакцинной композиции по настоящему изобретению можно увеличить концентрацию сопряженно связанных видов ЬгЕОРгР64К, которая известна как активность.

К удивлению, заявители обнаружили, что при уменьшении содержания аутологичного антигена новой процедурой очистки, вакцинная композиция по настоящему изобретению способна вызвать значительное увеличение иммунной реакции против аутологичного ЕОР, по сравнению с ранее описанными вакцинами на основе гетерологичного ЕОР.

Вакцинная композиция, полученная в результате уменьшения содержания аутологичного антигена посредством методологии ультрафильтрации через мембрану, имеет однородную композицию, в которой иммунологически активный вид (сопряженно связанные виды ЬгЕОР-гР64К) проявляет молекулярную массу, превышающую 60 кДа. Эта вакцинная композиция проявляет характерный хроматографический профиль молекулярного исключения, потому что вид, имеющий биологическую активность, представляет более чем 90% общей хроматографической площади, соответствующей всей вакцинной композиции, как показано на фиг. 4. Масс-спектрометрический анализ настоящей вакцинной композиции выявил ее структурные признаки. Пептидные карты двух различных лотов показывают высокую гомологию между лотами в положении к, а также в соотношении (фиг. 5). Эта высокая гомология между лотами подтверждает точность параметров химической сопряженной связи, а также процедур очистки, которые описываются настоящим изобретением. Масс-спектрометрический анализ, кроме того, выявил последовательность основных пептидов, полученных из вакцинной композиции по настоящему изобретению (табл. 3).

В настоящей вакцинной композиции, соотношение сопряженной связи между белками ЕОР и Р64К составляет 1:2, что означает 2 молекулы ЕОР на молекулу Р64К.

Настоящее изобретение также относится к способу получения конъюгата ЬгЕОР-Р64К, включающий ковалентное сопряженное связывание белка ЬгЕОР с белком-носителем Р64К и очистку молекулярного комплекса методом ультрафильтрации/диафильтрации с использованием мембраны, имеющей размер пор, пропускающих белки с молекулярной массой от 50 до 100кДа согласно следующим стадиям:

ί) реакции сопряженного связывания, которая включает смешивание белка ЬгЕОР и белка Р64К в реакторе сопряженного связывания, добавления к полученной смеси раствора РВ§/М§С1₂ с рН 6,8-7,2 и раствора сопряженного связывания 0,5% глутарового альдегида, затем полученную смесь инкубируют при 20-24°С при постоянном перемешивании в течение 2 ч;

ίί) диафильтрации, которая содержит проведение от 10 до 15 замен, раствора, пропитывающего тампон, с получением гомогенной смеси, которая содержит по меньшей мере 90% конъюгированного ЬгЕОР-Р64К, 10% других молекулярных видов, таких как полимеры ЬгЕОР, свободный ЬгЕОР, и не содержит глутарового альдегида, и ίίί) ультрафильтрации, которая заключается в уменьшении начального объема конъюгата ЬгЕОР-Р64К до конечной его концентрации в диапазоне от 1 до 12 мг/мл.

Другим вариантом настоящего изобретения является вакцинная композиция, включающая конъюгат ЬгЕОР-Р64К, вышеупомянутым способом, и адъювант, выбранный из группы, включающей гидроксид алюминия или монтанид.

Вариантом этой вакцинной композиции является композиция, в которой адъювант представляет собой монтанид.

Другим вариантом вакцинной композиции является композиция, в которой адъювант представляет собой гидроксид алюминия.

Методология получения вакцинной композиции Процедура очистки для уменьшения содержания аутологичного ЕСГ

Начиная с экспериментальных наблюдений, которые показали, что уменьшение содержания ЬгЕОР в вакцинной композиции усиливает ее иммунологическое действие, был разработан способ уменьшения содержания ЬгЕОР в гетерогенной смеси конъюгатов; обогащения вакцинной композиции видами конъюгатов с высокой молекулярной массой (иммунологически активных видов), и получения композиции, не содержащей глутаровый альдегид.

Процедура очистки с использованием ультрафильтрационных мембран в диапазоне от 50 до 100 кДа, разработанная и описанная в настоящем изобретении, состоит их двух стадий. На начальной стадии производятся последовательные замены пропитывающего тампон раствора (диафильтрация) для удаления глутарового альдегида и для устранения избытка аутологичного белка, не содержащего или образующего сопряженно связанные ЬгЕОР-ЬгЕОР различных размеров. В течение этой стадии проводится от 10 до 15 замен пропитывающего тампон раствора.

Вторая стадия представляет собой концентрацию очищенного химического конъюгата, на которой более чем 90% его композиции соответствует иммуногенному виду ЬгЕОР-гР64К. В течение стадии кон- 2 021905 центрации, начальный объем химического конъюгата уменьшается до достижения конечной концентрации белка (конъюгированного вида ЬгЕСР-гР64К) в диапазоне от 1 до 12 мг/мл. Эта многосторонность диапазона концентраций активного начала (общее количество сопряженного связанного ЬгЕСР-гР64К в миллиграммах на миллилитр) для настоящей вакцинной композиции представляет собой большое преимущество для лечения рака. Это обеспечивает возможность увеличения лечебной дозы без необходимости увеличения частоты иммунизации и/или увеличения числа участков иммунизации у пациента.

С целью мониторинга качества очистки химического конъюгата, производилась оценка рН и проводимости задержанного и проникшего через мембрану соединения. Проводилось также определение концентрации белка способом, описанным Ьо\\ту Ό.Η. е! а1. 1. ΒίοΙ СЬет 191: 495-498, 1951, и определяли однородность в процентах по анализу гель-фильтрационной хроматографии (НРЬС-РС).

Уникальность данной методологии гарантирует то, что полученная вакцинная композиция имеет однородный состав и определенную частоту и характеризуется присутствием большого количества иммуногенно активного вида: сопряженно связанного ЬтЕСР-тР64К.

К удивлению, удаление избытка аутологичного белка (ЬтЕСР), не содержащего полимерного соединения, не вызывает снижения, а скорее позволяет значительно увеличить концентрацию антител против ЕСР (при разведении 1/1000), до 10 раз больше концентрации, получаемой при иммунизации мышей полимерами ЬтЕСР и свободным ЬтЕСР. Снижение содержания аутологичного белка в вакцинной композиции вызывает у пациента увеличение, по меньшей мере, вдвое максимального титра антител против ЕСР. Это увеличение титров антител наблюдается даже у тех пациентов, которые получают половину дозы на иммунизацию (2,4 мг), по сравнению с пациентами, которые получают дозу 4,8 мг на дозу вакцинной композиции, описанной в документе ЕР 0657 175. Эти результаты указывают на то, что вакцинная композиция, описанная в настоящем изобретении, имеет более высокую иммунологическую активность на 1 мг иммунологически активного белка, по сравнению с другими вакцинными композициями.

Получение химического конъюгата между рекомбинантным белком Р64К (гР64К) и человеческим рекомбинантным эпидермальным фактором роста (ЬгЕСР)

Начиная с оценки и оптимизации условий химической реакции сопряженного связывания между белками ЬгЕСР и гР64К, разработан способ сопряженного связывания, который требует высокой молярной пропорции аутологичного белка, 10 моль ЬгЕСР на каждый моль гР64К, для гарантированного обеспечения высокой эффективности сопряженного связывания между ними. Необходимый избыток аутологичного белка во время химического сопряженного связывания для гарантированного обеспечения его эффективности, в последующем устраняется посредством способа очистки мембранной ультрафильтрацией, как описано ранее, что обеспечивает возможность получения вакцинной композиции с высокой однородностью. Процедура, описанная в настоящем изобретении, используемая для гарантированного обеспечения соответствующего химического сопряженного связывания обоих белков, состоит из одной стадии и начинается со смешивания ранее концентрированного (>6 мг/мл) белка ЬгЕСР и белка гР64К (>1 мг/мл) в реакторе сопряженного связывания. К этой белковой смеси добавляется раствор РВ§ (солевого раствора с фосфатным буфером)/МдС1₂ (рН 6,8-7,2), и 0,5% конъюгационный раствор глутарового альдегида. Смесь поддерживается при постоянном перемешивании в течение 2 ч при температуре 22°С±2°С. Конечная концентрация белка ЬгЕСР в реакционной смеси составляет 0,82 мг/мл, а белка гР64К составляет 0,89 мг/мл. Общая концентрация белка во время реакции сопряженного связывания составляет 2 мг/мл, а конечная концентрация глутарового альдегида в реакционной смеси составляет 0,05%.

Вакцинная композиция в соответствии с настоящим изобретением может использоваться вместе с соответствующими адъювантами, таким как гидроксид алюминия или монтанид.

В другом аспекте, настоящее изобретение включает гигиеническую процедуру для получения вакцинной композиции, подлежащую введению парентеральным путем, процедуру, которая минимизирует возможности микробного заражения вакцинной композиции во время сопряженного связывания, среди других преимуществ, позволяющую проводить методологию очистки химического сопряженно связанного соединения в течение нескольких часов, и содействующую увеличению получаемого объема вакцинной композиции. Следующие примеры более детально иллюстрируют настоящее изобретение.

В примере 1 описана молекулярная характеристика вакцинной композиции, описанной в настоящем изобретении. Молекулярная характеристика включает хроматографическую идентификацию ИРЬС-РС сопряженно связанного вида, образованного во время реакции сопряженного связывания, определение соотношения сопряженного связывания между белками ЬгЕСР и гР64К и определение пептидной карты, которая характеризует данную новую вакцинную композицию.

В примере 2 описаны биологические анализы у мышей, проводимые для очистки иммуногенности новой вакцинной композиции, описанной в настоящем изобретении.

В примере 3 описана эффективность клинического применения настоящей вакцинной композиции при лечении легочных опухолей эпителиального происхождения.

В примере 4 описано получение вакцинных композиций с подобранной различной активностью (общее количество миллиграмм сопряженно связанных ЬгЕСР-гР64К/флакон) с использованием такой же

- 3 021905 методологии сопряженного связывания и очистки, как описано в настоящем изобретении.

В примере 5 показано удаление глутарового альдегида, используемого при реакции сопряженного связывания посредством методологии очистки химического сопряженно связанного соединения пропусканием через ультрафильтрационную мембрану 50 кДа.

Примеры

Пример 1.

Молекулярная характеристика вакцинной композиции, описанной в настоящем изобретении (вакцинная композиция А)

1.1 Хроматографическая характеристика вакцинной композиции, описанной в настоящем изобретении

Для хроматографической характеристики вакцинной композиции, очищенной ультрафильтрацией, в качестве индикаторов использовали гомолигомерные сопряженно связанные ЬгЕОР-ЬгЕОР и гР64КгР64К.

Хроматографические профили, проявляемые гомолигомерными сопряженно связанными ЬгЕОРйгЕОР и гР64К-гР64К, сравнивали с хроматографическим профилем, проявляемым сопряженно связанными белками без очистки, полученными химической реакцией сопряженного связывания между белками ЬгЕОР и гР64К. На фиг. 1 показаны профили гомолигомерных конъюгатов ЬгЕОР-ЬгЕОР, и профиль, полученный при проведении химического сопряженного связывания между белками ЬгЕОР и гР64К (химически сопряженно связанных без очистки ультрафильтрацией). Площадь, очерченная кругом, относится к сопряженно связанному виду ЬгЕОР-гР64К. Профиль сопряженно связанных ЬгЕОР-гР64К не проявляет полного совпадения с профилем химически сопряженно связанных ЬгЕОР-гР64К ввиду вклада молекул ЬгЕОР, сопряженно связанных с гР64К.

На фиг. 2 показаны результаты, полученные после проведения не натурализованного электрофореза в восстановленных условиях и вестерн-блоттинг вакцинной композиции, очищенной ультрафильтрацией. Разработку проводили с использованием антитела против ЕОР, сопряженно связанного со щелочной фосфатазой. ЕОР представляет собой белок с видимой молекулярной массой 6 кДа и поэтому он должен располагаться в нижней области геля. Его идентификация посредством иммунного выявления антителами против ЕОР в области, соответствующей белкам с молекулярной массой, видимо превышающей 6 кДа, подтверждает, что молекулы ЬгЕОР существуют вместе с гР64К в области геля, соответствующей сопряженно связанному виду ЬгЕОР-гР64К.

При сравнении хроматографического профиля химически сопряженно связанных ЬгЕОР-гР64К без очистки с хроматографическим профилем гомолигомерных сопряженно связанных ЬгЕОР-ЬгЕОР, можно понять, что существует соответствие между обоими профилями. Эти данные подтверждают, что после углубления существует зона, которая соответствует виду ЬгЕОР, с сопряженной связью между ними (полимеры ЕОР), а также свободному ЬгЕОР (фиг. 3).

Хроматографический профиль с исключением молекул по размеру (фиг. 4) вакцинной композиции, являющейся предметом настоящего изобретения, показывает, что область, соответствующая сопряженно связанному виду ЬгЕОР-гР64К, составляет более чем 90% общей площади хроматограммы (заштрихованная область), свидетельствуя о высокой однородности описанной вакцинной композиции.

1.2. Соотношение сопряженного связывания между белками ЬгЕОР и гР64К в вакцинной композиции, описанной в настоящем изобретении

С целью определения соотношения сопряженного связывания ЬгЕОР и гР64К в вакцинной композиции, определяли в молях содержание каждого из составляющих конъюгат белков. Для этого брали вакцинную композицию, полученную в результате процесса ультрафильтрации с ограничением по размеру в 50 кДа, и собирали хроматографическую фракцию, соответствующую сопряженно связанному виду ЬгЕОР-гР64К. Эти фракции подвергали аминокислотному анализу.

Определение соотношения сопряженного связывания проводили двумя способами.

1. Способ был основан на оценке количества фенилаланина (РЬе) и треонина (ТЬг) в вакцинной композиции (аминокислоты, присутствующей только в молекуле гР64К). Количества этих аминокислот использовали для определения количества гР64К. Начиная с последнего и имея ввиду общее количество аминокислот в смеси, определяли количество ЕОР.

2. Другой способ был основан на прямом определении реактивных количеств каждого белка с использованием аминокислотной последовательности и основан на количественном определении аминокислот Аспарагина+Аспарагиновой кислоты (Акх), Глутамина+Глутаминовой кислоты (О1х), Глицина (О1у) и Аланина (А1а) (остатков, высоко устойчивых к кислотному гидролизу и обычно используемых при количественном определении белков).

В табл. 1 и 2 показаны результаты, полученные каждым способом.

- 4 021905

Таблица 1. Определение соотношения сопряженного связывания между белками ЬгЕСР и гР64К с проведением определения аминокислотного состава вакцинной композиции, очищенной ультрафильтрацией, на основе способа определения количества фенилаланина (РНе) и треонина (ТЬг)

Среднее количество гР64К	Среднее количество ЬгЕСР	Среднее соотношение сопряженного связывания
12,07 ммоль	23,13 ммоль	1, 92

Таблица 2. Определение соотношения сопряженного связывания между белками ЬгЕСР и гР64К с проведением определения аминокислотного состава вакцинной композиции, очищенной ультрафильтрацией, на основе способа определения относительных количеств аминокислот Аспарагина+Аспарагиновой кислоты (Άδχ), Глутамина+Глутаминовой кислоты (С1х), Глицина (С1у) и Аланина (А1а)

Белок	Количество белка	Соотношение сопряженного связывания
ГР64К	12,04 ммоль
ЬгЕСР	24,05 ммоль	2, 00

Результаты, полученные обоими способами, показывают соответствие в оценке сопряженного связывания между белками ЬгЕСР:гР64К для вакцинной композиции, описанной в настоящем изобретении. Рассчитанное соотношение сопряженного связывания составляло (1:2), что означает 2 молекулы ЬгЕСР на каждую молекулу гР64К.

1.3 Пептидные карты, характеризующие вакцинную композицию, описанную в настоящем изобретении

С целью характеристики структуры вакцинной композиции, представленной в настоящем изобретении, и для доказательства воспроизводимости процедуры, была разработана и охарактеризована пептидная карта, полученная после переваривания сопряженно связанных фракций ЬгЕСР-гР64К эндопротеазой С1и-С. Каждую из фракций полученной карты идентифицировали и секвенировали массспектрометрией.

На фиг. 5 показаны пептидные карты, полученные, начиная с двух независимо полученных вакцинных композиций, где установлено большое сходство пептидов, представленных в их относительной пропорции. Воспроизводимость этих пептидных карт, полученных, начиная с обеих вакцинных композиций, является показателем контроля, существующего над условиями, в которых происходят процедуры химического сопряженного связывания и очистки (описанных в настоящем изобретении).

Идентификацию пептидов, содержавшихся в каждой фракции карты, осуществляли анализом каждого из них методом ΜΑΡΌΙ (лазерной десорбционной ионизации с матричной подложки) и методом Е81-М8 (электроаэрозольной ионизации/электрораспылением ионизацией). В табл. 3 показана последовательность основных пептидов.

- 5 021905

Таблица 3. Аминокислотный состав основных пептидов, полученных после переваривания сопряженносвязанной фракции ЕОР-гР64К эндопротеазой О1и-С. Аминокислотный состав определяли ΜΑΡΌΙ и ΕδΙ-Μδ

Пик	Пептиды
НС05	ίΌΙΟ ОААРТОЕ
НС06	3ΙΟΜΑΑΕ АЕОТАААРКАЕ
нео8	АЕОТАААРКАЕ
НООЭ	ΚΙ3Ε δΙΟΜΑΑΕ
НС11	ΑΑΑΑΡΑΩΕΑΡΚΑΑ ΟΑΝΑΡΚΕΡΟΚΥΟ
ΗΟ12	δΙΟΜΑΑΕ
НС14	νΚνΚνΟΟΚΙδΕ
НО15	УАУТУеЕ
НО16	νΑνννΘΕΤΕ νδίΤΑΟϋΑΥΕ
НО17	νΟΙ-ΑΙΕ
ΗΟ18	νΚΗΙΑΑΝΟΙΚΥΡΕΡΕ
ΗΟ19	ААААРАОЕАРКАААРАРОААОРС νΚΗίΑΑΝΘΙΚΥΡΕΡΕ
ΗΟ20	ίΚνΡϋΙΘΘΗΕ ΡνίΡΟνΑΥΤδΡΕ ΤΟΡΙΙΟΟΟίνΟΡΝ νΚΗΙ_ΑΑΝΟΙΚΥΡΕΡΕ
Н621	ΚΑΟνΑνΤΟΡΟΡΙΕ ΕΙΡΟΑΕ ΟΟΡΟΟΥδΑΑΡΑΑΑϋΕ
НО22	ΑΡνίΡΟνΑΥΤδΡΕ ΘΙ,ΚνΑίνΕ

- 6 021905

ΗΘ23	ΑΑΑΑΡΑΟΕΑΡΚΑΑΑΡΑΡΟΑΑΟΡβΟδΑΟΑΕΥ ϋ МССОААОЮКТ1НРНРТЮЕ ΡΚΕΡΟΚΥϋΑνΐ_νΑΑΘΠ
ΗΘ24	Ν\/ΟΙΙΑ\/Ε γονννι,α
НС25	ΑνίνΑΑΟΡΑΡΝΘΚΙΙδΑΕ М6СОААОКЗКТ1НРНРТЦЗЕ ΤΟΡΙΙΘΟΘίνΟΡΝΘΒΟΜΙΟΕ
НС326	ΤΟΚΙΙΟΟΟίνΟΡΝΘΟϋΜΙΟΕ νΡΗΙ_ΑΑΝ(3ΙΚΥΡΕΡΕΙ_Ο
ΗΘ27	ΤΘΡΙΙΘΟΟίνΟΡΝΟΟϋΜΙΘΕ ΡΌΩΥΡϋίκννννΕ
НС328	ΟΘΙ_1\Λ/νΕ
ΗΘ29	οβυνννΕ ΤΟΡΙΙΟΟΘίνΟΡΝΟΟϋΜΙΟΕ ΥΡΡΟΝΙΜνΝΤΚΤνΑνΕΡΚΕϋ
ΗΘ30	ΑΙΟϋίνΘΟΡΜΙ-ΑΗΚΑνΗΕ АКЗО1\/<ЗОРМ1-АНКАУНЕ
Н631	ΑίΟΚΥΑΟΝΟννΟΥΙΟΕ АЮКУАСМС\Л/СУЮЕ
ΗΘ32	ΑΡνίΡΘνΑΥΤδΡΕ 1_ϋΙϋΜΙ_ΡΑΥ ΜϋνΡΑΕνΑΘννΚΕ
незз	ΤΘΡΙΙΟΟΘίνΟΡΝΘΟΟΜΙΟΕ ΑΙΌΚΥΑΟΝΟννΟΥΙΟΕ ΟΥΟΙΗϋΟνΟΜΥΙΕ ΚΟΟΥΚϋΙ-ΚννννΕ
ΗΘ34	ΝΟΑΘΗΚΑΥΡϋΑΡνίΡΘνΑΥΤδΡΕ
незб	θΑΝΑΡΚΕΡΟΚΥΟΑνΐ_νΑΑ<3ΡΑΡΝΟΚυ5ΑΕ
НС36	ΘΑΝΑΡΚΕΡΟΡΥϋΑνίνΑΑΘΚΑΡΝΘΚΙΙδΑΕ ΝΟΑΘΗΚΑΥΡϋΑΡνίΡΟνΑΥΤδΡΕ νΐΟΕνΡΗίΑΑΝΟ,ΚΥΡΕ
ΗΘ37	МОТУУ5Т1_е5КЮ\Л/Е

НС38	неоеисьЕ ΜΟνΡΑΕΥΑΘννΚΕνΚ ΝδΟδΕϋΡίδΗΟΟΥΟίΗϋΟνΟΜΥΙΕ
НС39	νννίΘΟΟΡΘβΥδΑΑΓΑΑΑΟΕ
НС40	ΜθΐνΥδτι_θδΡΐ_οννΕ
НС41	1_ΚνΡϋΙΟ<3ΗΕΝνθΙΙΑνΕ
НС42	ροογροίκνυννΕί
НС43	νϋΚΟΜΡΤΝ\/ΡΗΙΥΑΙΟΟΐνΘΟΡΜΙ_ΑΗΚΑνΗΕ ΑδΟΡΑΙΑΝΟΟϋΝΘΡΤΚυΡΟΑΕ
НС44	νΟΚΟΜΡΤΝνΡΗΙΥΑΙβϋΐνΟΟΡΜίΑΗΚΑνΗΕ
НС47	ΥΡΡΟΝΙΜνΝΤΚΤνΑνΕΡΚΕϋΟνΥνΤΕΕ ΑΙΑΝΟΟΟΝβΡΤΚΙ-ΙΡΟΑΕ
Н648	ΡΥΚΤΕΘΘνΟΕΝνΟΟΙΡδΚΑίΙΗΝΑΑνίΟΕ
НС49	νΝνΟϋΤΙΑνϋΟΤυτυ? ΚΥΚΤίΐ3Θν0Ι-ΝνΘ0ΙΡ3ΚΑΙΙ_ΗΝΑΑνΐ0Ε ΥΡΡϋΝΙΜνΝΤΚΤνΑνΕΡΚΕΟΟνΥνΤΡΕ Ι\/ΟΟΡΜΙ_ΑΗΚΑ\/ΗΕ(5ΗνΑΑΕΝΟΑΘΗΚΑΥΡΟ ΝΘΡΤΚυΡΟΑΕΤΟΡΙΙΘΟΟίνΟΡΝΟΟϋΜΙΘΕ
НС50	ΤβΚΙΙΘΟΟΙ νΘΡΝΟΟΟΜΙΟΕνΟίΑΙΕΜΘΟ Э
ΗΘ51	βΌΟΥΡϋΙΚννννΕΙ-

Пример 2. Иммуногенность вакцинной композиции, описанной в настоящем изобретении

В данном примере описан количественный анализ биологической активности, проведенный для оценки иммуногенности вакцинной композиции, описанной ранее (вакцинной композиции А), по сравнению с вакцинной композицией, описанной в документе ЕР 0657 175 (названной вакцинной композицией В).

Для анализа проводили вакцинацию 10 мышей необычной дозой 200 мкл воды в масляной эмульсии (50/50% об/об) иммуногенов (обычной вакцинной композиции, полученной диализом, вакцинной композиции, полученной очисткой ультрафильтрационной мембраной, и проникшей через мембрану, полученной в результате процесса очистки υΡ/ΌΡ, где присутствуют сопряженно связанные виды ЬтЕСР-тР64К) с адъювантом ΜΟΝΤΑΝΙΌΕ Ι8Α 51. Доза белка, применявшаяся для каждого иммуногена, приведена в табл. 4.

Через 14 дней после вакцинации проводилось взятие сыворотки у животных и оценка титров антител против ЕСР посредством ЕЫ8А (иммуносорбентного анализа). Положительным критерием для анализа было то, что измеренная оптическая плотность при 405 нм должна была быть выше, чем двойная

- 7 021905 средняя величина, полученная для контроля. Контроль получали добавлением в лунку блокирующего буфера вместо сыворотки. Для анализа данных применяли критерий Мапп-Аййиеу с использованием статистической программы.

Таблица 4. Оценка иммуногенов и концентрации белков, подлежащих вакцинации животным в соответствии с данными анализа биологической активности

Иммуногены	Концентрация белка (Ьомгу)
Вакцинная композиция А	1_г5 мг/мл
Вакцинная композиция В	1,5 мг/мл
Гомополимерные конъюгаты ЬгЕСГ и свободный йгЕСР, полученные в результате очистки иГ/ОГ вакциной композиции А	0,6 мг/мл

На фиг. 6 показаны результаты анализа биологической активности как свидетельство иммуногенной активности каждого оцененного иммуногена. Компоненты иммуногена, соответствующие конъюгатам гомополимерного ЬгЕОР, и свободному ЬгЕОР, не проявляют релевантной биологической активности, потому что их реакция находится на уровне положительных критериев для анализа или ниже. Эти результаты верифицируют гипотезу, что сам ЕОР не вызывает иммуногенной реакции.

Статистический анализ всех результатов с использованием критерия Маии-Аййиеу (табл. 5) показал высоко значимые различия титров антител против ЬгЕОР 1/1000, при р=0,0004, а для титра 1/100 при р=0,0006 для группы животных, вакцинированных вакцинной композицией А, по сравнению с титрами, достигнутыми для группы животных, вакцинированных вакцинной композицией В. Это указывает на то, что вакцинная композиция А, очищенная посредством мембраны ультрафильтрации, имеет большую иммуногенную активность на 1 мг, чем вакцинная композиция В, полученная способом очистки, основанным на мембране для диализа.

Вакцинная композиция А вызывает возрастание концентрации антител против ЕОР (при разведении 1/1000) в 10 раз, по сравнению с концентрацией, достигаемой при иммунизации конъюгатами, соответствующими полимерному ЬгЕОР и свободному ЬгЕОР.

При сравнении с вакцинной композицией, ранее описанной в документе ЕР 0657175, вакцинная композиция, описанная в настоящем изобретении, вызывает возрастание концентрации антител против ЕОР вдвое.

Таблица 5. Представление статистических данных: критерий Мапп-АЬЬпеу. используемый для оценки иммуногенности обеих вакцинных композиций посредством титров антител против ЬгЕОР у мышей

95,0% доверительный интервал для ЕТА1-ЕТА2 составляет (-0, 4389,--0, 114 9)

И-282,5

Тест ЕТА1=ЕТА2 в сравнении с ЕТА1 не =ЕТА2 значим при 0,0006

Тест значим при 0,0006 (подогнанный по связям)

Пример 3. Оценка клинической эффективности вакцинной композиции, описанной в настоящем изобретении, при лечении легочных опухолей эпителиального происхождения

Целью этого примера является оценка у пациентов иммуногенности, вызванной вакцинной композицией А, по сравнению с иммуногенностью, вызванной вакцинной композицией В, полученной спосо- 8 021905 бом очистки путем диализа.

В данном исследовании лечили пациентов с запущенными стадиями не мелкоклеточного рака легких (Ы§СЬС). Были выделены 2 группы пациентов (пациенты, вакцинированные препаратом В, и пациенты, вакцинированные препаратом А, описанным в настоящем изобретении). Доза вакцинной композиции на пациента в каждой группе была следующей:

пациенты, вакцинированные препаратом В, получали общую дозу белка 1,2 мг на участок иммунизации, тогда как пациенты, вакцинированные препаратом В, получали общую дозу белка 0,6 мг на участок иммунизации. У обеих групп было 4 участка иммунизации. Все пациенты получали специфическое противораковое лечение, по меньшей мере, за 4 недели до начала испытания. Иммунизации выполняли внутримышечным путем и продолжали введением 1 раз в месяц.

Гуморальную иммунную реакцию обеих групп пациентов оценивали исследованием их сыворотки. Основной переменной величиной для оценки результатов был титр специфического антитела против БОР. Этот параметр определяли посредством ЕЫ§А. Положительными величинами были те, которые давали показатели оптической плотности, в 2 раза превышающие отрицательный контроль. Представленный в результатах титр антител представляет собой максимальное разбавление положительной сыворотки.

Анализ иммунного ответа у пациентов в каждой группе, представленный в табл. 6, показал, что геометрическая средняя максимального титра антител в группе пациентов, получавших лечение препаратом А, соответствует 1:56421, тогда как в группе пациентов, иммунизированных препаратом В, она составила 1:23515. Это означает, что вакцинная композиция, описанная в настоящем изобретении, вызывала увеличение вдвое геометрической средней максимальных титров антител, по сравнению с титрами, достигнутыми при использовании препарата В.

Накопленные данные свидетельствуют о том, что у иммунизированных пациентов титр антител против аутологичного ЕОР составляет 1:500. Поэтому вакцинная композиция, описанная в настоящем изобретении (вакцинная композиция А), вызывает у неиммунизированных пациентов возрастание титра антител против ЕОР по меньшей мере в 100 раз.

Таблица 6. Результат анализа геометрической средней иммуногенности для обеих вакцинных композиций посредством измерения титров антител против ЕОР в сыворотке пациентов

	Общее число пациентов	Геометрическая средняя
Вакцинная композиция А	11	56421
Вакцинная композиция в	9	23515

Важно подчеркнуть, что у группы пациентов, иммунизированных вакцинной композицией А, описанной в настоящем изобретении, проявилась более высокая геометрическая средняя титров антител против ЕОР при введении половины общего количества белков на иммунизацию (2,4 мг), чем у группы пациентов, иммунизированных вакцинной композицией В (4,8 мг общего количества белков), что представляет собой удивительный результат. Эти результаты свидетельствуют о том, что избыток аутологичного белка ЬгЕОР или в форме полимеров, или в свободной форме, не вносит вклад в увеличение иммуногенности вакцинной композиции, но он снижает иммунологическое действие химически сопряженно связанного ЬгЕОР-гР64К.

Пример 5. Удаление глутарового альдегида из вакцинной композиции по настоящему изобретению

Для оценки удаления агента сопряженного связывания (глутарового альдегида) была произведена количественная оценка остаточного содержания глутарового альдегида в вакцинной композиции В и в вакцинной композиции А посредством способа хроматографического разделения в обращенной фазе (НРС-РР) с использованием колонки С-8.

Для осуществления способа требуется, во-первых, осаждение белка, содержащегося в образцах, хлорной кислотой, а затем взаимодействие с фенилгидрацином.

На фиг. 7 показано, что остаточное содержание этой примеси в обеих вакцинных композициях составляло менее чем 0,2 мкг/мл или менее чем 0,002 м.д. (самый высокий предел концентрации, установленный для этой примеси) от начальной концентрации 530 мг/мл или 530 м.д. Даже когда оба препарата соответствуют установленной спецификации для этой примеси, фиг. 7 иллюстрирует, что вакцинная композиция А (полученная при применении способа ультрафильтрации для очистки химического сопряженно связанного соединения) имеет меньшее содержание глутарового альдегида, что способствует большей безопасности для пациента, у которого применяется эта вакцинная композиция.

Краткое описание чертежей

На фиг. 1 показано перекрытие хроматограммы гомолигомерного сопряженно связанного гР64КгР64К хроматограммой неочищенного химического сопряженно связанного ЕОР-Р64К. Овалом показано совпадение профилей между обеими хроматограммами. Ось X представляет время до элюирования каждого компонента образца, а ось Υ представляет величину интенсивности при 216 нм для каждого компо- 9 021905 нента образца как показателя концентрации белка.

На фиг. 2 показано иммунное выявление антителом против БОР, сопряженно связанным со щелочной фосфатазой после электрофоретического разделения δΌδ-РЛОЕ (электрофорезом в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия) для вакцинной композиции, полученной ультрафильтрацией (полоса 1: Маркер молекулярной массы), полоса 2 - вакцинная композиция.

На фиг. 3 показано перекрытие хроматограммы, соответствующей гомолигомерному сопряженно связанному ЬгЕОР-ЬгЕОР и хроматограммы, соответствующей химическому сопряженно связанному ЬгЕОР-гР64К без очистки. Овалом показано совпадение видов между обеими хроматограммами. Ось X представляет время элюирования каждого компонента, а ось Υ представляет величину интенсивности при 216 нм каждого компонента образца как показателя концентрации белка.

На фиг. 4 показан хроматографический профиль, соответствующий вакцине, раскрытой настоящим изобретением. Заштрихованная область соответствует сопряженно связанному виду ЬгЕОР-гР64К. Ось X представляет время для элюирования каждой фракции, а ось Υ представляет величину интенсивности при 216 нм каждого компонента в образце как показателя концентрации белка.

На фиг. 5 показана пептидная карта хроматографической фракции, соответствующей сопряженно связанному ЬгЕОР-гР64К. Представлены результаты по двум вакцинным композициям, независимо очищенным мембраной ультрафильтрацией. Ось X представляет время, а ось Υ представляет единицы интенсивности в милях.

На фиг. 6 показаны титры антитела против ЬгЕОР у мышей, иммунизированных различными иммуногенами: обычной вакцинной композицией, вакцинной композицией, очищенной ультрафильтрацией, и композицией, прошедшей через мембрану, при способе очистки ультрафильтрацией. Ось X соответствует разведениям сыворотки от каждого животного, а ось Υ представляет величину оптической плотности при 405 нм каждого образца как показателя концентрации белка.

На фиг. 7 показан хроматографический профиль δΌδ-РЛОЕ, полученный во время количественного определения содержания остаточного глутарового альдегида в вакцинной композиции, полученной способом очистки с использованием ультрафильтрационных мембран 50 кДа (вакцинная композиция А) и для вакцинной композиции с использованием способа очистки диализом (вакцинная композиция В).

Claims

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

1. Способ получения конъюгата ЬгЕОР-Р64К, включающий ковалентное сопряженное связывание белка ЬтЕОР с белком-носителем Р64К и очистку молекулярного комплекса методом ультрафильтрации/диафильтрации с использованием мембраны, имеющей размер пор, пропускающих белки с молекулярной массой от 50 до 100 кДа согласно следующим стадиям:

ί) реакция сопряженного связывания, которая включает смешивание белка ЬгЕОР и белка Р64К в реакторе сопряженного связывания, добавление к полученной смеси раствора РВБ/М§С1₂ с рН 6,8-7,2 и раствора сопряженного связывания 0,5% глутарового альдегида, затем полученную смесь инкубируют при 20-24°С при постоянном перемешивании в течение 2 ч;

ίί) диафильтрация, которая содержит проведение от 10 до 15 замен, раствора, пропитывающего тампон, с получением гомогенной смеси, которая содержит по меньшей мере 90% конъюгированного ЬгЕОР-Р64К, 10% других молекулярных видов, таких как полимеры ЬгЕОР, свободный ЬгЕОР, и не содержит глутарового альдегида; и

ш) ультрафильтрация, которая заключается в уменьшении начального объема конъюгата ЬгЕОРР64К до конечной его концентрации в диапазоне от 1 до 12 мг/мл.
2. Вакцинная композиция, включающая конъюгат ЬгЕОР-Р64К, полученный способом по п.1, и адъювант, выбранный из группы, включающей гидроксид алюминия или монтанид.
3. Вакцинная композиция по п.2, где адъювант представляет собой монтанид.
4. Вакцинная композиция по п.2, где адъювант представляет собой гидроксид алюминия.