PT2184072E - Produção de uma preparação de vacina homogénea para tratamento do cancro - Google Patents
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Description
ΡΕ2184072 1
DESCRIÇÃO "PRODUÇÃO DE UMA PREPARAÇÃO DE VACINA HOMOGÉNEA PARA TRATAMENTO DO CANCRO"
DOMÍNIO TÉCNICO A presente invenção refere-se à biotecnologia, especialmente à saúde humana. Numa forma de realização, a presente invenção descreve vacinas do cancro protectoras e/ou terapêuticas, principalmente composições de vacina para eliciar um aumento significativo da resposta imune contra o Factor de Crescimento Epidérmico (EGF), cuja relevância oncológica foi amplamente demonstrada, principalmente para o crescimento de tumores de origem epitelial.
ANTECEDENTES DA INVENÇÃO 0 sistema receptor de EGF (EGFR), incluindo os ligandos, é um complexo molecular que regula especifica-mente o crescimento celular e seu efeito sobre o crescimento descontrolado de tumores epiteliais.
No processo tumorigénico, a desregulação dos processos parácrinos e autócrinos para a activação do EGRF envolve a sobre-expressão dos factores de crescimento, bem como a síntese aumentada e/ou mutação dos receptores. 2 ΡΕ2184072 O EGF é um polipéptido de 53 aminoácidos, com um peso molecular aparente de 6045 Da. Este péptido foi isolado e purificado pela primeira vez por Cohen S., J. Biol. Chem. 20 (1962) 237, 1.555). O EGF é um membro da família dos ligandos do EGFR; esta família compreende proteínas estrutural e funcionalmente relacionadas. Outros membros desta família são: factor de transformação do crescimento (TGF), anfirregulina (AR), criptol (CRI), factor de crescimento de ligação da heparina, betacelulina e epirregulina. Por outro lado, a família dos poxvírus inclui proteínas relacionadas com o EGF, entre as quais a mais caracterizada é o factor de crescimento do vírus vaccinia (VGF).
Todas estas moléculas são capazes de se ligar ao EGFR com a consequente activação do receptor, de modo que são conhecidas como ligandos do EGFR e desempenham um papel no crescimento de células normais e tumorais. O EGFR é uma glicoproteina com 170 kDa; o gene já foi clonado e sequenciado. O domínio intracelular deste receptor está associado à actividade de tirosina quinase de moléculas que mostram uma homologia estrutural com as proteínas codificadas pelo oncogene v-erb-B, e estão envolvidas no processo de transformação maligna (Heldin C. H. (1984) , Cell 37, 9-20). 3 ΡΕ2184072
As provas experimentais dos últimos anos sobre a relação entre o EGFR e seu sistema de ligandos com o cancro torna-o um alvo muito atraente para a imunoterapêutica do cancro.
Resultados anteriores demonstraram a eficácia para o cancro da imunoterapêutica activa com a vacina à base de EGF. De facto, foram obtidas provas pré-clinicas e clinicas sobre a imunogenicidade e ausência de toxicidade causada por vacinação com hrEGF ligada a uma proteína transportadora (González et al., (1996), Vaccine Research 5 (4), 233-243). A EP 0657175 descreve uma composição de vacina que compreende EGF autólogo acoplado à proteína transportadora que inibe o crescimento de tumores dependentes de EGF por um efeito auto-imune. A composição de vacina descrita na EP 0657175 são vacinas conjugadas compreendendo o EGF acoplado a uma proteína transportadora (a proteína P64K, a cadeia B da toxina da cólera, a proteína toxóide tetânica e/ou anticorpos monoclonais) e como consequência é obtida uma mistura heterogénea e pouco reprodutível de espécies conjugadas. A nova composição de vacina descrita na presente invenção compreende o EGF autólogo como princípio activo e é caracterizada por ter uma composição química homogénea, com uma pureza definida, eliciando maior imunogenicidade, uma 4 ΡΕ2184072 actividade clínica substancialmente aumentada e com menos imunizações para obter um efeito terapêutico. 0 teor inferior de antigénio autólogo na composição de vacina da presente invenção surpreendentemente não induz os títulos de anticorpos de EGF mais baixos em seres humanos e pelo contrário, em vez disso induz um aumento significativo dos títulos de anticorpos anti-EGF. A menor quantidade de teor de EGF e os seus derivados na composição de vacina foi obtida por desenvolvimento de um método de purificação com base na filtração por membrana, que é também um objecto da presente invenção.
Além disso, a presente invenção proporciona uma composição de vacina homogénea e reprodutível com um maior efeito clinico e menos imunizações, o que significa uma grande vantagem na terapêutica do cancro e para o doente, em comparação com composições de vacina descritas anterior-mente . A composição de vacina da presente invenção poderia também compreender adjuvantes adequados como hidróxido de alumínio ou montanida.
Noutra forma de realização, a presente invenção refere-se a um procedimento sanitário para o fabrico da referida composição de vacina, apropriada para a sua utilização em seres humanos por via parentérica. 5 ΡΕ2184072 O procedimento compreende um método adequado para a conjugação covalente do hrEGF ao proteína transportadora P64K, e a purificação deste conjugado utilizando membranas de ultra filtração numa gama de 50-100 kDa, para remover as espécies conjugadas biologicamente inactivas (sem activi-dade imunogénica), bem como outras impurezas químicas. DESCRIÇÃO PORMENORIZADA DA INVENÇÃO. A presente invenção descreve uma nova composição de vacina baseada em EGF autólogo tendo a referida composição de vacina uma composição química homogénea com pureza definida, que é capaz de eliciar imunogenicidade potentado e uma actividade substancialmente aumentada, clínica. Quando a dose terapêutica tem de ser aumentada, com o procedimento para obter a composição de vacina da presente invenção é possível aumentar a concentração da espécie conjugada hEGF-rP64K (conhecida como potência) sem aumentar o número de injecções.
Surpreendentemente, os inventores verificaram que, quando se diminui o teor do antigénio autólogo por um novo processo de purificação, a composição de vacina da presente invenção é capaz de eliciar um aumento significativo da resposta imune contra o EGF autólogo em comparação com vacinas à base de EGF heterogéneas descritas anteriormente. 6 ΡΕ2184072 A composição de vacina obtida a partir da diminuição do teor do antigénio autólogo através da metodologia de purificação de ultrafiltração por membrana tem uma composição homogénea em que as espécies imunologicamente activas (espécies conjugadas hrEGF-rP64K) apresentam peso molecular superior a 60kDa. Esta composição de vacina mostra um perfil cromatográfico de exclusão molecular caracterizado por as espécies que têm a actividade biológica representarem mais de 90% da área total do cromatograma, correspondente à composição de vacina total, como é ilustrado na Figura 4. A análise por espectrometria de massa da presente composição de vacina revelou as suas caracteristicas estruturais. Os mapas peptidicos de dois lotes diferentes mostram uma elevada homologia entre lotes na posição, bem como na proporção (Figura 5). Esta elevada homologia entre os lotes confirma a exactidão dos parâmetros da conjugação química, bem como dos procedimentos de purificação, ambos descritos pela presente invenção. A análise por espectrometria de massa mostrou ainda a sequência dos principais péptidos derivados da composição de vacina da presente invenção (Tabela 3).
Na presente composição de vacina, a proporção de conjugação entre o EGF e proteínas P64K é de 1:2, o que significa 2 moléculas de EGF por molécula de P64K. ΡΕ2184072 7
Metodologia para obtenção da composição de vacina.
Procedimento de purificação para diminuição do teor de EGF autólogo.
Começando a partir de observações experimentais que evidenciaram que uma diminuição do teor de hrEGF na composição de vacina aumenta a sua acção imunológica, é desenvolvido um método para diminuir o teor de hrEGF na mistura heterogénea de conjugados, enriquecendo a composição de vacina em espécies conjugadas de alto peso molecular (espécies imunologicamente activas) e isenta de glutaraldeido. 0 procedimento de purificação utilizando membranas de ultrafiltração numa gama entre 50-100 kDa desenvolvido e descrito na presente invenção, consiste em duas etapas:
Na etapa inicial são efectuadas mudanças sucessivas da solução tampão (diafiltração) para retirar glutaraldeido e eliminar o excesso de proteína autóloga, quer livre quer formando conjugados hEGF-hEGF de diferentes tamanhos. Durante esta etapa, são efectuadas entre 10 e 15 mudanças da solução tampão. A segunda etapa é a concentração do conjugado químico purificado, em que mais de 90% da sua composição ΡΕ2184072 corresponde a espécies imunogénicas hrEGF-rP64K. Durante a etapa de concentração o volume inicial do conjugado químico é reduzido até se atingir uma concentração de proteína final (espécie conjugada hrEGF-rP64K) numa gama entre 1-12 mg/mL. Esta versatilidade na gama de concentrações do princípio activo (miligramas totais de conjugado hrEGF-rP64K por mililitros) para esta composição de vacina é uma grande vantagem para a terapêutica do cancro. Isto permite aumentar a dose de tratamento sem implicar para o doente um incremento da frequência de imunização e/ou um aumento do número de sítios de imunização.
Com a finalidade de monitorizar a qualidade da purificação do conjugado químico foi avaliado o pH e a condutividade do que ficou retido e do permeado. Foi também realizada a determinação da concentração de proteína pelo método descrito por Lowry D. H. et al., J. Biol. Chem. 191: 495-498, 1951 e a percentagem de homogeneidade foi determinada a partir da análise por cromatografia por filtração em gel (HPLC-FG). A singularidade desta metodologia assegura que a composição de vacina obtida tem uma composição homogénea e pureza definida, caracterizada pela presença maioritária das espécies imunologicamente activas: conjugado de hrEGF-rP64K.
Surpreendentemente, a remoção do excesso de proteína autóloga (hrEGF) livre ou polimérica não causa a re- 9 ΡΕ2184072 dução, mas em vez disso, permite aumentar significativamente a concentração de anticorpos anti-EGF (a 1/1000 de diluição) , para 10 vezes mais do que a obtida quando se imuniza murganhos com polímeros de hrEGF e com hrEGF livre. A redução do teor de proteína autóloga na composição de vacina causa no doente incrementos de pelo menos 2 vezes o título máximo de anticorpos anti-EGF. Este incremento dos títulos de anticorpos é ainda observado nos doentes que recebem metade por imunização (2,4 mg) em comparação com doentes que recebem a dose de 4,8 mg por dose da composição de vacina descrita na EP 0657175. Estes resultados indicam que a composição de vacina descrita na presente invenção tem maior actividade imunológica por miligrama de proteína imunologicamente activa, em comparação com outras composições de vacina.
Obtenção de vim conjugado quimico entre a proteína recombinante P64K (rP64K) e o Factor de Crescimento Epidérmico humano recombinante (hrEGF). A partir da avaliação e optimização das condições para a reacção de conjugação química entre as proteínas hrEGF e rP64K é desenvolvido um método de conjugação que requer uma elevada proporção molar da proteína autóloga, 10 moles de hrEGF para cada mole de rP64K, para garantir alta eficiência da conjugação entre ambas. O excesso necessário de proteína autóloga durante a conjugação química, para garantir a sua eficiência, é eliminado subsequentemente através do método de purificação de ultrafiltração por 10 ΡΕ2184072 membrana, como descrito anteriormente, que permite a obtenção de uma composição de vacina com alta homogeneidade. 0 procedimento descrito na presente invenção para garantir uma conjugação química apropriada entre ambas as proteínas consiste num só passo e começa misturando a proteína hrEGF previamente concentrada (> 6 mg/mL) e a proteína rP64K (> = 1 mg/mL) no reactor de conjugação. A esta mistura de proteínas é adicionada a solução de PBS/MgCl2 (pH 6,8-7,2) e a solução de conjugação de glutaraldeído a 0,5%. A mistura é mantida com agitação constante durante 2 horas à temperatura 22 °C ± 2°C. A concentração final de proteína na mistura reaccional para a proteína hrEGF é de 0,82 mg/mL e para a proteína rP64K é de 0,89 mg/mL. A concentração de proteína total durante a reacção de conjugação é de 2 mg/mL e a concentração final do glutaraldeído na mistura reaccional é de 0,05%. A composição de vacina de acordo com a presente invenção pode ser utilizada em conjunto com adjuvantes apropriados, como hidróxido de alumínio ou Montanida.
Num outro aspecto, a presente invenção envolve um procedimento sanitário para obtenção de uma composição de vacina, a ser administrada por via parentérica, procedimento que minimiza as oportunidades de contaminação microbiana da composição de vacina durante a conjugação permitindo realizar a metodologia de purificação do conjugado químico em poucas horas e facilitando o incremento do volume da composição de vacina a ser obtido, entre outras 11 ΡΕ2184072 vantagens. Os exemplos seguintes ilustram em mais em pormenor a presente invenção. 0 Exemplo 1 descreve a caracterização molecular da composição de vacina descrita na presente invenção. A caracterização molecular inclui: a identificação cromato-gráfica por HPLC-FG das espécies conjugadas formadas durante a reacção de conjugação, a determinação da proporção de conjugação entre as proteínas hrEGF e rP64K e a definição do mapa péptidos que caracteriza esta nova composição de vacina. O Exemplo 2 descreve os bioensaios em murganhos realizados para avaliar a imunogenicidade da nova composição de vacina descrita na presente invenção. O Exemplo 3 descreve a eficácia na utilização clinica da presente composição de vacina no tratamento de tumores do pulmão de origem epitelial. 0 Exemplo 4 descreve a obtenção das composições de vacina ajustadas para uma potência diferente (miligramas totais de conjugado de hrEGF-rP64K/frasco), utilizando a mesma metodologia de conjugação e purificação que as descritas na presente invenção. 0 Exemplo 5 mostra a remoção do glutaraldeido utilizado na reacção de conjugação por meio da metodologia de purificação do conjugado químico através de uma membrana de ultrafiltração de 50 kDa. 12 ΡΕ2184072 EXEMPLOS : EXEMPLO 1: Caracterização molecular da composição de vacina descrita na presente invenção (composição de vacina A). 1.1 Caracterização cromatográfica da composição de vacina descrita na presente invenção.
Para a caracterização cromatográfica da composição de vacina purificada por ultrafiltração, utilizou-se como indicadores os conjugados holigoméricos hrEGF-hrEGF e rP64K-rP64K.
Os perfis cromatográficos apresentados pelo conjugado homoligomérico (hrEGF-hrEGF e rP64K-rP64K) foram comparados com o perfil cromatográfico apresentado pelo conjugado sem purificação obtido pela reacção de conjugação química entre as proteínas hrEGF e rP64K. Na Figura 1 são apresentados os perfis dos conjugados homoligoméricos rP64K-rP64K e o perfil obtido quando se efectua a conjugação química entre as proteínas hrEGF e rP64K (conjugado químico sem purificação por ultrafiltração). A área envolvida por um círculo pertence à espécie conjugada hrEGF-rP64K. 0 perfil do conjugado rP64K-rP64K não mostra total coincidência com o do conjugado químico hrEGF-rP64K devido à contribuição das moléculas de hrEGF conjugadas com a rP64K. 13 ΡΕ2184072
Na Figura 2 são mostrados os resultados obtidos após a realização de uma electroforese desnaturalizante em condições de redução e um Western Blot da composição de vacina purificada por ultrafiltração. 0 desenvolvimento foi realizada com um anticorpo anti-EGF conjugado com fosfatase alcalina. 0 EGF é uma proteína de peso molecular aparente de 6 kDa, pelo que deve estar localizado na área inferior do gel. É sua identificação por meio de imunodetecção com anticorpos anti-EGF na área correspondente às proteínas de peso molecular aparentemente superior a 6 kDa confirma que as moléculas de hrEGF existem em conjunto com as de rP64K na área do gel correspondente à espécie conjugada hrEGF-rP64K.
Quando se compara o perfil cromatográfico do conjugado químico hrEGF-rP64 sem purificação com este conjugado homoligomérico hrEGF-hrEGF, pode verificar-se que existe uma correspondência entre os dois perfis. Esta prova confirma que, depois do vale, existe uma zona que corresponde à espécie hrEGF conjugada entre si (polímeros de EGF), bem como hrEGF livre (Figura 3). O perfil de cromatografia por exclusão molecular (Figura 4) da composição de vacina objecto da presente invenção mostra que a área correspondente à espécie conjugada hrEGF-rP64K constituem mais do que 90% da área total do cromatograma (área sombreada) evidenciando a elevada homogeneidade da composição de vacina descrita. 14 ΡΕ2184072 1.2. Proporção de conjugação entre as proteínas hrEGF e rP64K na composição de vacina descrita na presente invenção.
Com o objectivo de determinar a razão de conjugação da hrEGF e da rP64K na composição de vacina, foram determinados as moles de cada uma das proteínas constitutivas. Para isso, foi tomada uma composição de vacina obtida pelo processo de ultraf iltração de 50 kDa, e a fracção cromatográfica correspondente à espécie conjugada rhEGF-rP64K foi recolhida. Estas fracções foram submetidas a análise de aminoácidos. A determinação da razão de conjugação foi realizada por 2 métodos. 1. Um método foi baseado na estimativa da quantidade de fenilalanina (Phe) e treonina (Thr) na composição de vacina (aminoácidos só presentes na molécula rP64K). As quantidades destes aminoácidos foram utilizadas para determinar a quantidade de rP64K. A partir desta última, e tendo em mente a quantidade total de aminoácidos da mistura, determinou-se a quantidade de EGF. 2. 0 outro método baseou-se na determinação directa das quantidades relativas de cada proteína, utilizando a sequência de aminoácidos e com base na quantificação desses aminoácidos Asparagina + Aspártico (Asx), Glutamina + Glutâmico (Glx), Glicina (Gly) e Alanina (Ala) 15 ΡΕ2184072 (resíduos altamente estáveis à hidrólise ácida e vulgarmente utilizados na quantificação de proteínas) .
As Tabelas 1 e 2 mostram os resultados obtidos por cada método.
Tabela 1: Determinação da razão de conjugação entre as proteínas hrEGF e rP64K fazendo a determinação da composição de aminoácidos da composição de vacina purificada por ultrafiltração, com base no método de determinação da quantidade de Fenilalanina (Phe) e Treonina (Thr)
Quantidade média de rP64K Quantidade média de heEGF Razão média de conjugação 12,07 nmoles 23,13 nmoles 1,92
Tabela 2: Determinação da razão de conjugação entre as proteínas hrEGF e rP64K fazendo a determinação da composição de aminoácidos da composição de vacina purificada por ultrafiltração, com base no método de determinação das quantidades relativas dos aminoácidos Asparagina + Aspártico (Asx), Glutamina + Glutâmico (Glx), Glicina (Gly) e Alanina (Ala)
Proteína Quantidade de proteína Razão de conjugação rP64K 12,04 nmoles 2,00 hrRGF 24,05 nmoles
Os resultados obtidos por ambos os métodos mostram correspondência na estimativa da razão de conjugação entre as proteínas hrEGF:rP64K para a composição de vacina descrita na presente invenção. A razão de 16 ΡΕ2184072 conjugação calculada foi de (1:2), o que significa 2 moléculas de hrEGF para cada molécula de rP64K. 1.3. Os mapas de péptidos que caracterizam a composição de vacina descrita na presente invenção.
Com o objectivo de caracterizar a estrutura da composição de vacina apresentada na presente invenção e para evidenciar a reprodutibilidade do procedimento foi desenvolvido e caracterizado o mapa de péptidos obtido após a digestão das fracções de conjugados hrEGF-rP64K com a endoprotease Glu-C. Cada uma das fracções do mapa obtido foi identificada e sequenciada por espectrometria de massa. A Figura 5 mostra os mapas de péptidos obtidos a partir de duas composições de vacina obtidas de forma independente, em que se observa uma grande semelhança nos péptidos que apareceram e na sua proporção relativa. A reprodutibilidade entre esses mapas de péptidos obtidos a partir de ambas as composições de vacina é uma indicação de que o controlo que existe em relação às condições em que decorrem os procedimentos de conjugação química e purificação (descritos na presente invenção). A identificação dos péptidos contidos em cada fracção do mapa foi obtida por análise de cada uma delas pelo método MALDI (ionização com dessorção de laser assistida pela matriz) e pelo método de ESI-MS (ionização por electropulverização/electronebulização por ionização). Na Tabela 3 apresenta-se a sequência dos principais péptidos. ΡΕ2184072 17
Pico Péptidos ^^·χ·ΐχ.χ..Ν:<.:<.χ»>:'ψ^>:·χ·4'Χ«-> :':·:·:·\χ>>χ·?:«χ<>:·:·χ>χνχ «íw ;· LLsiU Ά· Λ < < < ·. \«5·\*\ \ χ < < <χ < * >ssss 1<. S S / / t f *'·' QAAPTOE HG06 ÉIÉÈIÉ^!»^ SfâMAAÊ :AE0TMAPK^; 4 Π ΛΗ 1ΑΑΑΡ<Λ£ í; ' ;; s& ' ' ».. mm ... >Χ«·ϊ:ΨΧ·ΧΐΜ·¥*>»Ν·«Ψ>!·ί' HQ11
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Tabela 3. Composição dos aminoácidos dos principais péptidos obtidos após a digestão da fracção de conjugado EGF-P64K com a endoprotease Glu-C. A composição de aminoácidos foi determinada por MALDI e ESI-MS. EXEMPLO 2.
Imunogenicidade da composição de vacina descrita na presente invenção.
Neste exemplo é descrito o ensaio de actividade biológica realizado para avaliação da imunogenicidade da composição de vacina descrita previamente (composição de vacina A) em comparação com uma composição de vacina descrita na EP 0657175 (chamada composição de vacina B) .
Para o ensaio foi realizada a inoculação de 10 20 ΡΕ2184072 murganhos com uma única dose de 200 pL de uma emulsão de água em óleo (50/50% v/v) dos imunogénios (composição de vacina convencional obtida por diálise, composição de vacina obtida por purificação com ultrafiltração por membrana e permeado obtido a partir do processo de purificação por UF/DF em que as espécies conjugadas hrEGF-hrEGF estão presentes), com o adjuvante MONTANIDA ISA 51. A dose de proteína aplicada para cada imunogénio está referida na Tabela 4.
Nos 14 dias após a inoculação foi realizada a extracção do soro dos animais e na avaliação dos títulos dos anticorpos anti-EGF por meio de um ELISA. O critério positivo para o ensaio foi que a densidade óptica medida a 405 nm tem ser superior ao dobro do valor médio obtido para o branco. 0 branco é obtido quando se adiciona ao poço tampão de bloqueamento em vez de soro. O teste de Mann-Whitney foi aplicado à análise dos dados, utilizando um programa de estatística.
Tabela 4: Imunogénios avaliados e concentração de proteína a ser inoculada por animal para o correspondente ensaio de actividade biológica
Imunogénios Concentração de proteina (Lowry) Composição de vacina A 1,5 mg/mL Composição de vacina B 1,5 mg/mL Conjugados homopoliméricos de hrEGF e hrEFG livre obtidos a partir da purificação por UF/DF da composição de vacina A 0,6 mg/mL 21 ΡΕ2184072
Na Figura 6, são mostrados os resultados do ensaio de actividade biológica como provas da actividade imunogénica de cada imunogénio avaliado. Os componentes do imunogénio correspondente aos conjugados homopoliméricos hrEGF e hrEGF livre não mostram actividade biológica relevante, porque a sua resposta está ao nivel dos critérios positivos para o ensaio ou inferior. Estes resultados verificam a hipótese de que o EGF por si só não induz uma resposta imunogénica. A análise estatística de todos os resultados quando se aplica o teste de Mann-Whitney (Tabela 5) mostraram diferenças altamente significativas para os títulos de anticorpos anti-hrEGF 1/1000 com p = 0,0004 e para a título de 1/100 com p = 0, 0006 para o grupo de animais inoculados com a composição de vacina A em comparação com os títulos obtidos para o grupo de animais inoculados com a composição de vacina B. Isto indica que a composição de vacina A, purificada por meio de uma membrana de ultrafiltração, tem maior actividade imunogénica por miligrama de proteína que a composição de vacina B, obtida pelo método de purificação com base na membrana de diálise. A composição de vacina A produz um incremento das concentrações de anticorpos anti-EGF (a 1/1000 de diluição) 10 vezes maior quando comparada com a alcançada quando a imunização é feita com os conjugados correspondentes a hrEGF polimérico e hrEGF livre.
Quando se compara com a composição de vacina 22 ΡΕ2184072 anteriormente descrita na EP 0657175, a composição de vacina descrita na presente invenção produziu um incremento de duas vezes a concentração de anticorpos anti-rhEGF.
Tabela 5: Análise estatística: o teste de Mann-Whitney utilizado para avaliar a imunogenicidade de ambas as composições de vacina através dos títulos de anticorpos anti-hrEGF em murganhos.
Análise estatística dos títulos de anticorpo anti-EGF em murganhos _(diluição de 1/1000)_
Teste de Mann-Whitney e Cl: G1 1/1000; G3 1/1000 N Mediana Gl (preparação de vacina B) 1/1000 20 0,4300 G3 (preparação de vacina A) 1/1000 20 0,7120
Teste de Mann-Whitney e Cl: Gl 1/100; G3 1/100 N Mediana Gl (preparação de vacina convencional) 1/100 20 1,0785 G3 (preparação de vacina por ultrafiltração) 1/100 20 1,3040 A estimativa pontual para ETA1-ETA2 é -0,3115 Cl de 95, por cento para ETA1-ETA2 é (-0,4500; -0,1790) W = 278,0 Teste de ETA1 = ETA2 vs ETA1 não = ETA2 é significativo a 0,0004 O teste é significativo a 0,0004 (ajustado para empates)_ Análise estatística dos títulos de anticorpo anti-EGF em murganhos _(diluição de 1/100) A estimativa pontual para ETA1-ETA2 é -0,2590 Cl de 95, por cento para ETA1-ETA2 é (-0,4389; -0,1149) W = 282,5 Teste de ETA1 = ETA2 vs ETA1 não = ETA2 é significativo a 0,0006 O teste é significativo a 0,0006 (ajustado para empates) 23 ΡΕ2184072 EXEMPLO 3.
Avaliação da eficácia clinica da composição de vacina descrita pela presente invenção no tratamento de tumores do pulmão de origem epitelial. 0 objectivo deste exemplo é o de avaliar em doentes a imunogenicidade eliciada pela composição de vacina A em comparação com a imunogenicidade induzida pela composição de vacina B obtida pelo método de purificação por diálise.
Neste estudo foram tratados doentes com tumores de cancro do pulmão de células não pequenas (NSCLC) em estádios avançados. Foram definidos dois grupos de doentes (doentes vacinados com a preparação B e doentes vacinados com a preparação A descrita na presente invenção) . A dose de composição de vacina por doente em cada grupo foi como se segue: Os doentes vacinados com a preparação B receberam 1,2 mg de proteína total por sítio de imunização, enquanto que os doentes vacinados com a preparação A receberam 0,6 mg de proteínas totais por sítio de imunização. Para ambos foram 4 os sítios de imunização. Todos os doentes receberam terapêutica onco-específica, pelo menos 4 semanas antes de começar o ensaio. As imunizações foram realizadas por via intramuscular e continuaram a ocorrer mensalmente. 24 ΡΕ2184072 A resposta imune humoral dos dois grupos de doentes foi avaliada através do seu soro. A principal variável para avaliação dos resultados foi o titulo de anticorpos anti-EGF específicos. Este parâmetro foi determinado através de um ELISA. Os valores positivos foram aqueles que deram leituras da densidade óptica 2 vezes maiores do que o controlo negativo. O título de anticorpo descrito é a diluição máxima de soro positivo. A análise da resposta imune para doentes em cada grupo, como apresentado na Tabela 6, mostrou que a média geométrica do título de anticorpo máximo no grupo de doentes tratados com a preparação A corresponde a 1:56421, enquanto que no grupo de doentes imunizados com a preparação B foi de 1:23515. Isto significa que a composição de vacina descrita na presente invenção eliciou um aumento de duas vezes a média geométrica dos títulos de anticorpos máximos em comparação com os títulos alcançados com a preparação B.
Historicamente os doentes não imunizados mostram um título anticorpos anti-EGF autólogo de 1:500. Por conseguinte, a composição de vacina descrita na presente invenção (composição de vacina A) provoca um aumento de pelo menos 100 vezes o título de anticorpos anti-EGF em doentes não imunizados. 25 ΡΕ2184072
Tabela 6. Resultado da análise da média geométrica da imunogenicidade de ambas as composições de vacina através da determinação dos títulos de anticorpos anti-EGF no soro dos doentes.
Total de doentes Média geométrica Composição de vacina A 11 56421 Composição de vacina B 9 23515 É importante sublinhar que o grupo de doentes imunizados com a composição de vacina A, descrita na presente invenção, mostrou uma média geométrica superior dos títulos de anticorpos anti-EGF recebendo metade da quantidade de proteínas totais por imunização (2,4 mg) do que a recebida pelo grupo de doentes imunizados com a composição de vacina B (4,8 mg de proteínas totais), o que constitui um resultado surpreendente. Estes resultados evidenciam que o excesso de proteína autóloga hrEGF, quer na forma de polímeros ou livre, não contribui para mais imunogenicidade da composição de vacina, mas dilui a acção imunológica do conjugado químico hrEGF-rP64K. EXEMPLO 4:
Obtenção da composição de vacina ajustado para potência diferente (concentração de proteínas totais por frasco).
Com o objectivo de demonstrar a capacidade de 26 ΡΕ2184072 obter composições de vacina com potência diferente (concentrações de proteínas totais por frasco), foi realizado o método de purificação tal como está descrito adiante:
Ensaio 1: Quando concluída a diafiltração do conjugado químico purificado foi concentrado até uma concentração final de proteínas de 2 mg/mL.
Ensaio 2: Quando concluída a diafiltração do conjugado químico purificado foi concentrado até uma concentração final de proteínas de 5 mg/mL.
Ensaio 3: Quando concluída a diafiltração do conjugado químico purificado foi concentrado até uma concentração final de proteínas de 12 mg/mL.
Em todos os ensaios o volume total de conjugado químico utilizado foi 1500 mL, operou-se a uma pressão transmembranar de 1,5 bar e foram efectuadas 7 mudanças de solução tampão durante a diafiltração. Para a realização desta avaliação foram estabelecidos dois critérios de selecção: 0 primeiro era chegar a uma homogeneidade percentual da composição de vacina > 80%. O segundo critério era a não presença de proteínas precipitadas durante a operação de purificação. 27 ΡΕ2184072
Os resultados, apresentados na Tabela 7, mostram as composições de vacina ajustadas em diferentes concentrações de proteína por mL, garantindo níveis elevados de homogeneidade (90,92%, 96,79% e 95,50% da espécie conjugado de hrEGF-rP64K) e sem produzir precipitação de proteínas.
Tabela 7: Valores correspondentes à percentagem de homogeneidade nas composições de vacina ajustadas para diferentes concentrações de proteína final
Concentração de proteína Percentagem de homogeneidade da composição de vacina 2 mg/mL 92,00% 5 mg/mL 96,79% 12 mg/mL 95,50% EXEMPLO 5:
Remoção de glutaraldeido da composição de vacina da presente invenção.
Para avaliar a remoção do agente de conjugação (glutaraldeido) foi quantificado o teor de glutaraldeido residual na composição de vacina B e na composição de vacina A, por meio de um método de separação cromatográfica em fase inversa (HPLC-RP), utilizando uma coluna C-8.
Este método requer, em primeiro lugar, a precipitação da proteína contida nas amostras com ácido perclórico e posteriormente uma reacção com fenil hidrazina. 28 ΡΕ2184072 A Figura 7 mostra que o teor residual desta impureza em ambas as composições de vacina era inferior a 0,2 pg/mL ou inferior a 0,002 ppm, (limite de concentração mais elevado estabelecido para esta impureza) a partir de uma concentração inicial de 530 mg/mL ou 530 ppm. Mesmo quando ambas as preparações cumprem a especificação estabelecida para esta impureza, a Figura 7 ilustra que a composição de vacina A (obtida quando se aplica o método de ultrafiltração para a purificação do conjugado químico) tem um teor inferior de glutaraldeído, o que contribui para uma grande segurança para o doente que usa esta composição de vacina. BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS.
Figura 1. Mostra a sobreposição do cromatograma de um conjugado homoligomérico rP64K-rP64K com o cromatograma de um conjugado químico EGF-P64K não purificado. No círculo é mostrado a coincidência de perfis entre ambos os cromatogramas. 0 eixo de X representa o tempo até à eluição para cada componente da amostra e o eixo de Y representa o valor da intensidade a 216 nm para cada componente da amostra, como indicador da concentração de proteína.
Figura 2. Immuno-detecção com um anticorpo antiEGF conjugado com fosfatase alcalina, após separação electroforética por SDS-PAGE para a composição de vacina obtida por ultrafiltração Linha 1: Marcador de peso molecular, Linha 2 composição de vacina. 29 ΡΕ2184072
Figura 3. Mostra a sobreposição dos cromatogramas correspondentes ao conjugado hrEGF-hrEGF homoligomérico e do cromatograma correspondente a um conjugado químico hrEGF-rP64K sem purificar. No círculo é mostrada a coincidência de espécies entre ambos os cromatogramas. O eixo de X representa o tempo para a eluição de cada componente e do eixo de Y representa o valor da intensidade a 216 nm de cada componente da amostra, como indicador da concentração de proteína.
Figura 4. Perfil cromatográfico correspondente à vacina descrita pela presente invenção. A área sombreada corresponde à espécie conjugada hrEGF-rP64K. O eixo de X representa o tempo para a eluição de cada fracção e o eixo de Y representa o valor de intensidade a 216 nm de cada componente na amostra, como indicador da concentração de proteína.
Figura 5. O mapa de péptidos da fracção cromatográfica correspondente ao conjugado hrEGF-rP64K. Estes são os resultados de duas composições de vacina purificadas de forma independente por uma membrana de ultrafiltração. 0 eixo de X representa o tempo e o eixo de Y representa as unidades de mili intensidade.
Figura 6. Títulos de anticorpos anti-hrEGF em murganhos imunizados com diferentes imunogénios: Composição de vacina convencional, composição de vacina purificada por 30 ΡΕ2184072 ultrafiltração e permeado proveniente do método de purificação por ultrasfiltração. O eixo de X corresponde às diluições de soros de cada animal e o eixo de Y representa o valor da densidade óptica a 405 nm de cada amostra, como indicador da concentração de proteína.
Figura 7. Perfil cromatográfico por HPLC-RP obtido durante a quantificação do teor de glutaraldeído residual da composição de vacina obtida pelo método de purificação utilizando membranas de ultrafiltração de 50 kDa (composição de vacina A) e para a composição de vacina utilizando o método de purificação por diálise (composição de vacina B).
Lisboa, 8 de Março de 2012
Claims (16)
- ΡΕ2184072 1 REIVINDICAÇÕES 1. Composição de vacina compreendendo como principio activo o conjugada de proteínas hrEGF-rP64K, em que cada molécula de proteína P64K está ligada a duas moléculas de hrEGF e em que a composição de vacina compreende pelo menos 90% do princípio activo.
- 2. Composição de vacina de acordo com a reivindicação 1, em que a razão de conjugação entre a proteína transportadora rP64K e a hrEGF é 12,04:24,05 nmolar.
- 3. Composição de vacina de acordo com a reivindicação 1, em que a referida composição é uma mistura homogénea do conjugado hrEGF-rP64K que está isenta de outras espécies moleculares como polímeros de hrEGF ou hrEGF livre.
- 4. Composição de vacina de acordo com a reivindicação 1, em que a mistura homogénea do conjugado hrEGF-rP64K está isenta de glutaraldeído.
- 5. Composição de vacina de acordo com a reivindicação 2, em que a mistura homogénea do conjugado hrEGF-rP64K contém adicionalmente um adjuvante apropriado, selec-cionado do grupo que compreende hidróxido de alumínio ou Montanida. 2 ΡΕ2184072
- 6. Composição de vacina de acordo com a reivindicação 1, em que a mistura homogénea do conjugado hrEGF-rP64K é capaz de induzir um aumento de pelo menos 10 vezes nos títulos dos anticorpos anti-EGF no soro de mamíferos imunizados.
- 7. Composição de vacina de acordo com a reivindicação 1, em que a mistura homogénea do conjugado hrEGF-rP64K é capaz de induzir um aumento de pelo menos 10 vezes nos títulos dos anticorpos anti-EGF no soro de seres humanos.
- 8. Composição de vacina de acordo com a reivindicação 1, em que a mistura homogénea do conjugado hrEGF-rP64K é capaz de induzir um aumento de pelo menos 100 vezes nos títulos dos anticorpos anti-EGF no soro de seres humanos.
- 9. Procedimento para a obtenção da composição de vacina de acordo com a reivindicação 1 em conformidade com normas sanitárias em que o referido procedimento compreende condições apropriadas para a conjugação covalente do EGF à proteína transportadora rP64K e purificação do complexo molecular, por utilização de uma membrana de ultrafiltração, para remover espécies conjugadas biologicamente inactivas e outras impurezas químicas.
- 10. Procedimento de acordo com a reivindicação 3 ΡΕ2184072 9, em que a reacção de conjugação consiste num único passo que começa pela mistura da proteína hrEGF previamente concentrada (> 6 mg/mL) e a proteína P64K (> 1 mg/mL) no reactor de conjugação, e depois adição à mistura de solução de PBS/MgCl2 (pH 6,8-7,2) e da solução de conjugação de glutaraldeído a 0,5% e a referida mistura é incubada a 22"C ± 2°C com agitação contínua durante duas horas.
- 11. Procedimento de acordo com a reivindicação 10, em que os parâmetros de conjugação entre as proteínas hrEGF e rP64K fixam a razão de conjugação de duas moléculas de hrEGF para cada molécula de rP64K.
- 12. Procedimento para obtenção da composição de vacina de acordo com a reivindicação 9, em que a proteína conjugada é purificada por um método de ultrafiltração/dia-filtração utilizando uma membrana que tem um tamanho de poro compreendido entre 50 e 100 kDa.
- 13. Procedimento para obtenção da composição de vacina de acordo com a reivindicação 12, em que a proteína conjugada é purificada por um método de ultrafiltração/ diafiltração utilizando uma membrana que tem um tamanho de poro de 50 kDa ou 100 kDa.
- 14. Composição de vacina de acordo com a reivindicação 1 compreendendo como princípio activo o conjugado de proteínas hrEGF-rP64K, em que a referida composição de vacina é purificada pelo processo de acordo com qualquer das reivindicações 9 a 13. 4 ΡΕ2184072
- 15. Composição de vacina de acordo com a reivindicação 1 compreendendo como principio activo o conjugado de proteínas hrEGF-rP64K, em que a concentração final da proteína total está na gama de 1-12 mg/mL.
- 16. Composição de vacina de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 9, 14 ou 15 para utilização no tratamento de tumores epiteliais. Lisboa, 8 de Março de 2012
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