CN101790383A - 用于肿瘤治疗的均质疫苗制剂的获得 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物技术领域，更特别地涉及人类健康。具体地，本发明描述了用于在癌症患者中进行治疗使用的疫苗组合物。本发明中所描述的疫苗组合物具有作为活性成分的人重组表皮生长因子(hrEGF)和重组P64K蛋白之间的化学缀合物。此外，还描述了用于实施缀合反应的特定条件，所述缀合反应使得能够以受控的且可重复的方式获得所述化学缀合物。在其他方面，本发明涉及用于纯化所述化学缀合物的方法，所述化学缀合物不仅提供了更高的用于治疗性疫苗组合物的纯度，并且惊人地增加了免疫原性活性，从而引起人体中抗EGF抗体滴度的显著增加。另外，本发明提供了用于获得具有超过一种类型的剂量(EGF-P64K缀合物的总毫克数/瓶)呈递的疫苗制剂的方法。疫苗制剂呈递的多面性允许增加每个患者的免疫接种剂量，而不增加免疫接种的频率和/或免疫接种位点的数目。最后，本发明涉及用于获得通过肠胃外途径施用的用于治疗癌症的疫苗制剂的符合卫生的方法。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术，更特别地涉及人类健康领域。在一个实施例中，本发明描述了保护性和/或治疗性的癌症疫苗，特别是提供了疫苗组合物，其允许针对表皮生长因子(EGF)的免疫应答的显著增强。对于肿瘤(主要是上皮起源的肿瘤)的生长，EGF的肿瘤学相关性已被广泛证实。
背景技术
EGF受体(EGFR)及其配体的系统是这样的分子复合物，其相互作用特异性地调节细胞生长并且显示出其对于上皮起源的肿瘤的不受控制的生长的影响。
在肿瘤发生过程中，关于EGFR的活化的旁分泌和自分泌过程的失调牵涉生长因子的过表达以及其受体的合成增加和/或突变。
EGF为53个氨基酸的多肽，其具有6045Da的表观分子量。该多肽由CohenS.(J.Biol.Chem.20(1962)237，1.555)首次分离和纯化。
EGF是EGFR配体家族的成员；该家族包括在结构和功能上相关的蛋白质。该家族的其他成员为：转化生长因子(TGF)、双调蛋白(amphiregulin)(AR)、criptol(CR1)、肝素结合性生长因子、β细胞素(betacellulin)和表皮调节素(epiregulin)。另一方面，痘病毒家族包括与EGF相关的蛋白质，其中经最多表征的是痘苗病毒生长因子(VGF)。
所有这些分子都能够结合并活化EGFR，因此它们被称为EGFR的配体并且在正常细胞和赘生性细胞的生长中或多或少地起作用。
EGFR是大约170kDa的糖蛋白，其基因已经被克隆和测序。该受体的细胞内结构域与显示出与癌基因v-erb-B的产物的结构同源性的酪氨酸激酶活性相关，所述癌基因v-erb-B的产物牵涉恶性转化过程(Heldin C.H.(1984)，Cell37，9-20)。
近年来所积累的关于EGFR/EGFR配体系统与癌症之间的关系的所有证据使其成为用于癌症的免疫疗法的颇具吸引力的靶标。
先前的结果已证明了用基于EGF的疫苗进行癌症的主动免疫疗法的可能性。事实上，已经获得了关于用与载体蛋白相连接的hrEGF进行疫苗接种而引起的免疫原性和低毒性的临床前和临床证据(González等人，(1996)，VaccineResearch 5(4)，233-243)。
EP 0657175描述了包含与载体蛋白相偶联的自身EGF的疫苗组合物，所述复合物通过自身免疫效应来抑制依赖于EGF的肿瘤的生长。
EP 0657175中所描述的疫苗组合物是缀合疫苗，其包含与载体蛋白(rP64k蛋白，霍乱毒素B链，破伤风类毒素蛋白和/或单克隆抗体)相偶联的EGF，并因此获得缀合物种类的异质的且低重复性的混合物。
本发明所描述的新型疫苗制剂包含作为活性成分的自身EGF，其特征在于具有均一的化学组分、确定的纯度、强有力的免疫原性、大幅提高的临床活性，并且使得能够显著减少为了达到治疗作用所需的免疫接种次数。
在本发明的疫苗制剂中自身抗原含量的降低令人惊讶地没有减少而是引起人体中抗EGF抗体滴度的显著增加。疫苗组合物中EGF及其衍生物的含量的降低是通过开发出通过膜的纯化方法而获得的，这也是本发明的组成部分之一。
此外，本发明提供了均质的且可重复的疫苗制剂，其使得能够通过减少免疫接种次数而提高临床效果，这相比于先前所描述的疫苗组合物而言在癌症治疗方面和对于患者来说提供了巨大的好处。本发明的疫苗组合物可以包含合适的佐剂，例如氢氧化铝或Montanide。
在另一方面，本发明涉及用于获得疫苗制剂的符合卫生的方法，所述疫苗制剂适合于通过肠胃外途径施用给患者。所述方法包括用于将hrEGF与载体蛋白rP64k共价缀合的适宜的程序，以及使用50-100kDa的范围内的超滤膜来进行纯化以去除在生物学上无活性(缺乏免疫原性活性)的缀合物种类和其他化学杂质。
发明详述
本发明提高了基于自身EGF的新型疫苗制剂，其特征在于具有均一的化学组分和确定的纯度、强有力的免疫原性、以及大幅提高的临床活性。此外，在本发明中所描述的疫苗呈递提高了当需要提高治疗剂量时显著减少患者所需的施用次数的可能性，这是因为该疫苗组合物是通过使得能够达到缀合物种类hrEGF-rP64k的各种不同浓度/毫升(称为效价)的方法而获得的。
该新型疫苗制剂是由令人惊讶的发现而获得的，即通过新的纯化方法来降低疫苗组合物中自身抗原的含量，并没有减少免疫应答，而是使得能够相比于作为基于EGF的疫苗而使用的异质组合物而言显著增加针对自我EGF的免疫应答。
经由通过超滤膜纯化方法来降低自身抗原含量而获得的疫苗制剂具有均一的组成，其中在免疫学上有活性的种类(缀合物种类hrEGF-rP64k)显示出大于60kDa的分子量。该疫苗制剂显示出其特征如下的分子排阻色谱法分离图谱：该疫苗制剂的具有治疗活性的种类占相应于整个疫苗制剂的色谱图总面积的90％以上，如图4中所显示的。
为了深入研究该疫苗制剂的结构特征而进行的质谱法分析，提供了两个不同批次的疫苗制剂的肽图谱，其中注意到在所出现的肽的位置和比例方面的高度相似性(参见图5)。这一在由两次重复的疫苗制剂而获得的肽图谱之间的相似性是也在本发明中描述的进行化学缀合和纯化程序的条件的控制的指示。该研究使得能够鉴定出构成本发明疫苗制剂的主要肽的序列(参见表3)。
此外，该疫苗制剂的特征还在于，蛋白质hrEGF和rP64k之间的化学缀合比例为1∶2，这意味着2个分子的hrEGF/1个分子的rP64k。
用于获得疫苗制剂的方法
用于降低自身EGF含量的纯化程序
基于证实了疫苗制剂中hrEGF含量的降低增强了其免疫原性作用的实验观察结果，开发出了一种用于降低缀合物的异质混合物中hrEGF含量的方法；使该疫苗制剂富含高分子量的缀合物种类(在免疫学上有活性的种类)并且不含戊二醛。
在本发明中所开发并描述的使用50-100kDa的范围内的超滤膜的纯化程序包括两个步骤：在初始步骤中，连续更换缓冲液(渗滤)以去除戊二醛并清除过量的自身蛋白，所述过量的自身蛋白是游离的或者形成具有不同大小的hrEGF-hrEGF缀合物。在这个步骤期间，进行10至15次缓冲液的更换。第二步骤是浓缩经纯化的化学缀合物，其中其组成的90％以上相应于免疫原性种类hrEGF-rP64k。在所述浓缩步骤期间，化学缀合物的最初体积减小，直至达到在1-12mg/mL的范围内的最终蛋白质浓度(缀合物种类hrEGF-rP64k)。关于所述疫苗制剂在活性成分浓度范围(hrEGF-rP64k缀合物的总毫克数/毫升)方面的这一多面性在癌症治疗方面提供了巨大的好处。这使得能够增加治疗剂量，而对于患者来说并不意味着增加免疫接种的频率和/或增加免疫接种位点的数目。
为了监测化学缀合物纯化的质量，评估了截留物和渗透物的pH和电导率。还使用Lowry D.H.等人，J.Biol Chem 191：495-498，1951中所描述的方法来测定蛋白质浓度，以及通过凝胶过滤色谱法分析(HPLC-FG)来确定均一性百分比。
这种方法的独特性确保了，所获得的疫苗制剂具有均一的组成和确定的纯度，其特征在于主要存在的是在免疫学上有活性的种类：缀合物种类hrEGF-rP64k。
令人惊讶地，游离或聚合的过量的自身蛋白(hrEGF)的去除并没有引起抗EGF抗体浓度的减少，而是使得能够将抗EGF抗体的浓度(1/1000稀释度)显著增加至相对于在用hrEGF的聚合物和用游离的hrEGF免疫小鼠时得到的抗体浓度而言的10倍。疫苗制剂中自身蛋白含量的减少在患者中引起抗EGF抗体的最大滴度增加到至少两倍。相比于接受了4.8mg/剂的在EP 0657175中所描述的疫苗制剂的患者而言，甚至在接受了一半的免疫接种剂量(2.4mg)的患者中也观察到抗体滴度的这种增加。这些结果表明，相比于其他疫苗制剂而言，本发明中所描述的疫苗制剂具有更高的免疫原性活性/毫克在免疫学上有活性的蛋白质。
获得在重组P64k蛋白(rP64k)和人重组表皮生长因子(hrEGF)之间的化
学缀合物
基于对用于蛋白质hrEGF和rP64k之间的化学缀合反应的条件所进行的评估和优化，开发出了一种化学缀合方法，其要求高摩尔比例的自身蛋白，即10摩尔hrEGF/摩尔rP64k，以在缀合过程中保证两者之间高的缀合效率。在化学缀合过程中为保证缀合效率所必需的过量的自身蛋白随后通过如前文所描述的超滤膜纯化方法而被除去，这使得能够获得具有高均一性的疫苗制剂。本发明中所描述的用于保证这两种蛋白质之间适宜的化学缀合的程序由单一步骤组成，并且开始于在缀合反应器中混合事先经浓缩的hrEGF蛋白(＞6mg/mL)和rP64k蛋白(≥1mg/mL)。然后，向该蛋白质混合物中添加PBS/MgCl2溶液(pH6.8-7.2)和0.5％戊二醛的缀合溶液。该混合物于22℃±2℃的温度下在连续搅拌下维持2小时。反应混合物中最终的蛋白质浓度对于hrEGF来说为0.82mg/mL，和对于rP64k蛋白来说为0.89mg/mL。在缀合反应期间总蛋白质浓度为2mg/mL，和反应混合物中最终的戊二醛浓度为0.05％。
根据本发明的疫苗组合物可以与合适的佐剂例如氢氧化铝或Montanide一同使用。
另一方面，本发明涉及用于获得通过肠胃外途径施用的疫苗制剂的符合卫生的方法，在其他优点中，该方法尤其将在其获得过程中疫苗制剂的微生物污染的机会降到最低，允许在数小时内实施化学缀合物的纯化方法，并且促进待获得的疫苗制剂的体积增加。
提供了下面的实施例以更详细地阐明本发明。
实施例1描述了本发明中所描述的疫苗制剂的分子表征。所述分子表征包括：在缀合反应过程中形成的缀合物种类的通过HPLC-FG的色谱法鉴定，蛋白质hrEGF和rP64k之间的缀合比率的测定，以及对于该新型疫苗制剂来说特征性的肽图谱的解析。
实施例2描述了为了评估本发明中所描述的新型疫苗制剂的免疫原性而实施的在小鼠中的生物测定法。
实施例3描述了在治疗上皮起源的肺肿瘤中本疫苗制剂的临床应用的功效。
实施例4描述了通过使用与本发明中所描述的相同的缀合和纯化方法来获得调整至各种不同效价(hrEGF-rP64k缀合物的总毫克数/瓶)的疫苗制剂。
实施例5显示了借助于通过50kDa的超滤膜来进行的化学缀合物的纯化方法，来去除在缀合反应中所使用的戊二醛。
实施例：
实施例1：本发明中所描述的疫苗制剂(疫苗制剂A)的分子表征
1.1.本发明中所描述的疫苗制剂的色谱法表征
为了对于通过超滤进行纯化的疫苗制剂进行色谱法表征，使用同寡聚缀合物hrEGF-hrEGF和rP64k-rP64k作为指示剂。将由同寡聚缀合物(hrEGF-hrEGF和rP64k-rP64k)所显示的色谱法特性谱与由通过蛋白质hrEGF和rP64k之间的化学缀合反应而获得的未纯化的化学缀合物所显示的色谱法特性谱进行比较。
在图1中显示了同寡聚缀合物rP64k-rP64k的特性谱以及在进行蛋白质hrEGF和rP64k之间的化学缀合时所获得的特性谱(化学缀合物未经超滤纯化)。所圈出的区带构成了其中出现缀合物种类hrEGF-rP64k的区域。rP64k-rP64k缀合物的特性谱没有显示出与hrEGF-rP64k化学缀合物的特性谱完全一致，这是由于与rP64k相缀合的hrEGF分子的贡献。
在图2中显示了在施行经超滤纯化的疫苗制剂的在还原条件下的变性电泳和Western印迹后获得的结果。使用与碱性酸酶相缀合的抗EGF抗体进行揭示。EGF是表观分子量为6kDa的蛋白质，所以位于凝胶的下方区域。在相应于表观分子量大于6kDa的蛋白质的区域处借助于使用抗EGF抗体的免疫检测所作出的鉴定确证了，在相应于缀合物种类hrEGF-rP64k的凝胶区域中存在有与rP64k相结合的hrEGF分子。
当将未纯化的化学缀合物hrEGF-rP64k的特性谱与由同寡聚缀合物hrEGF-hrEGF而获得的特性谱相比较时，可察觉到在这两个特性谱之间存在有对应性。这个证据确证了，在谷部之后，存在有相应于自身之间缀合的hrEGF种类(hrEGF的聚合物)和游离的hrEGF分子的区域(图3)。
本发明的目标疫苗制剂的分子排阻色谱法特性谱(参见图4)显示，相应于缀合物种类hrEGF-rP64k的面积占色谱图总面积的90％以上(阴影区域)，这证明了所描述的疫苗组合物的高的均一性。
1.2.在本发明中所描述的疫苗制剂中蛋白质hrEGF和rP64k之间的缀合比率的测定
为了测定疫苗制剂中hrEGF与rP64k的缀合比率，测定了每一种构成性蛋白质的存在的摩尔数。为此，采用由使用50kDa的超滤膜的纯化过程而获得的疫苗制剂并收集相应于缀合物种类hrEGF-rP64k的色谱法级分。对这些级分进行氨基酸分析。
通过两种方法来测定缀合比率。
1.一种方法基于疫苗制剂中苯丙氨酸(Phe)和苏氨酸(Thr)的量的估计(仅存在于rP64k分子中的氨基酸)。使用这些氨基酸的量来确定rP64k的量。基于上一步并考虑混合物的氨基酸的总量，即可确定出EGF的量。
2.另一种方法基于直接测定每种蛋白的相对量，其中使用氨基酸序列并且基于下列氨基酸的定量：天冬酰胺+天冬氨酸(Asx)，谷氨酰胺+谷氨酸(Glx)，甘氨酸(Gly)和丙氨酸(Ala)(对于酸水解高度稳定并且在蛋白质定量中普遍使用的残基)。
下面在表1和表2中显示了通过每种方法而获得的结果。
表1：基于测定苯丙氨酸(Phe)和苏氨酸(Thr)的量的方法，通过实施经超滤纯化的疫苗制剂的氨基酸组成的确定来测定蛋白质hrEGF和rP64k之间的缀合比率
| rP64k的平均量 | hrEGF的平均量 | 缀合的平均比率 |
| 12.07纳摩尔 | 23.13纳摩尔 | 1.92 |
表2：基于测定天冬酰胺+天冬氨酸(Asx)，谷氨酰胺+谷氨酸(Glx)，甘氨酸(Gly)和丙氨酸(Ala)这些氨基酸的相对量的方法，通过实施经超滤纯化的疫苗制剂的氨基酸组成的确定来测定蛋白质hrEGF和rP64k之间的缀合比率
通过这两种方法所获得的结果显示出在估计本发明中所描述的疫苗制剂的蛋白质hrEGF∶rP64k之间的缀合比率方面的对应性。计算出的缀合比率为1∶2，这意味着2个分子的hrEGF/1个分子的rP64k。
1.3.对于本发明中所描述的疫苗制剂来说特征性的肽图谱的解析
为了在结构上表征本发明中所提及的疫苗制剂并证实获得该疫苗制剂的可重复性，形成并表征在用内切蛋白酶Glu-C消化缀合物级分hrEGF-rP64k后获得的肽图谱。通过质谱法来鉴定所获得的图谱中的每一个级分并进行测序。
图5显示了由独立地获得的两种疫苗制剂而获得的肽图谱，其中可以看出在所出现的肽以及相互之间的存在比例方面具有极大的相似性。在由这两种疫苗制剂获得的肽图谱之间的可重复性是对于也在本发明中描述的进行化学缀合和纯化程序的条件所存在的控制的指示。
通过使用MALDI法(基质辅助激光解吸电离(Matrix Assisted LaserDesorption Ionization))和使用ESI-MS法(电喷雾电离质谱法(ElectrosprayIonization-Mass Spectrometry))分析它们中的每一个而获得在图谱的每一级分中所包含的肽的鉴定。在表3中显示了主要肽的序列。
表3：在用内切蛋白酶Glu-C消化EGF-P64k缀合物级分后获得的主要肽的氨基酸组成。通过MALDI和ESI-MS来测定所述氨基酸组成。
| 峰 | 肽 |
| HG05 | LDIDQAAPTGE |
| HG06 | SIGMAAEAEGTAAAPKAE |
| HG08 | AEGTAAAPKAE |
| HG09 | KISESIGMAAE |
| HG11 | AAAAPAQEAPKAAGANAPKEPQRYD |
| HG12 | SIGMAAE |
| HG14 | VKVKVGDKISE |
| HG15 | VAWVGE |
| HG16 | VAWVGETEVSLTAGDAYE |
| HG17 | VCLAIE |
| HG18 | VRHLAANGIKYPEPE |
| HG19 | AAAAPAQEAPKAAAPAPQAAQFGVRHLAANGIKYPEPE |
| HG20 | LKVPDIGGHERVIPGVAYTSPETGRIIGGGIVGPNVRHLAANGIKYPEPE |
| HG21 | KAGVAVTDRGFIELIFDAEGGPGGYSAAFAAADE |
| 峰 | 肽 |
| HG22 | ARVIPGVAYTSPEGLKVAIVE |
| HG23 | AAAAPAQEAPKAAAPAPQAAQFGGSADAEYDMGCDAADIGKTIHPHPTLGEPKEPQRYDAVLVAAGR |
| HG24 | NVDIIAVEYDVVVLG |
| HG25 | AVLVAAGRAPNGKLISAEMGCDAADIGKTIHPHPTLGETGRIIGGGIVGPNGGDMIGE |
| HG26 | TGRIIGGGIVGPNGGDMIGEVRHLAANGIKYPEPELD |
| HG27 | TGRIIGGGIVGPNGGDMIGERCQYRDLKWWE |
| HG28 | GGLIVVVE |
| HG29 | GGLIVVVETGRIIGGGIVGPNGGDMIGEYRFDNIMVNTKTVAVEPKED |
| HG30 | AIGDIVGQPMLAHKAVHEAIGDIVGQPMLAHKAVHE |
| HG31 | ALDKYACNCVVGYIGEALDKYACNCVVGYIGE |
| HG32 | ARVIPGVAYTSPELDIDMLRAYMDVPAEVAGVVKE |
| 峰 | 肽 |
| HG33 | TGRIIGGGIVGPNGGDMIGEALDKYACNCVVGyIGEGYCLHDGVCMYIERCQYRDLKWWE |
| HG34 | NCAGHKAYFDARVIPGVAYTSPE |
| HG35 | GANAPKEPQRYDAVLVAAGRAPNGKLISAE |
| HG36 | GANAPKEPQRYDAVLVAAGRAPNGKLISAENCAGHKAYFDARVIPGVAYTSPEVIDEVRHLAANGIKYPE |
| HG37 | MGTVYSTLGSRLDVVB |
| HG38 | IIGGGIIGLEMDVPABVAGVVKEVKNSDSECPLSHDGYCLHDGVCMYIE |
| HG39 | VVVLGGGPGGYSAAFAAADE |
| HG40 | MGTVYSTLGSRLDVVE |
| HG41 | LKVPDIGGHENVDIIAVE |
| HG42 | RCQYRDLKWWEL |
| HG43 | VDKQMRTNVPHIYAIGDIVGQPMLAHKAVHEASGRAIANGCDNGFTKLIFDAE |
| HG44 | VDKQMRTNVPHIYAIGDIVGQPMLAHKAVHE |
| HG47 | YRFDNIMVNTKTVAVEPKEDGVYVTFEAIANGCDNGFTKLIFDAE |
| HG48 | RYKTLGGVCLNVGCIPSKALLHNAAVIDE |
| 峰 | 肽 |
| HG49 | VNVGDTIAVDDTLITLDRYKTLGGVCLNVGCIPSKALLHNAAVIDEYRFDNIMVNTKTVAVEPKEDGVYVTFEIVGQPMLAHKAVHEGHVAAENCAGHKAYFDNGFTKLIFDAETGRIIGGGIVGPNGGDMIGE |
| HG50 | TGRIIGGGIVGPNGGDMIGEVCLAIEMGCD |
| HG51 | RCQYRDLKWWEL |
实施例2：本发明中所描述的疫苗制剂的免疫原性
在本实施例中描述了生物学活性测定法，其是为了相比于EP 0657175中所描述的疫苗制剂(称为疫苗制剂B)而言来评估前面所描述的疫苗制剂(疫苗制剂A)的免疫原性而进行的。
为了所述分析，用单剂量的200μL免疫原(通过透析而获得的常规疫苗制剂，通过用超滤膜进行纯化而获得的疫苗制剂，和由通过UF/DF的纯化过程而获得的渗透物，其中存在有缀合物种类hrEGF-hrEGF)的油包水(50/50％v/v)乳剂(具有佐剂Montanide ISA 51)对10只小鼠进行接种。关于每种免疫原所施加的蛋白质剂量参见表4。
在接种后14天，从动物中抽取血清并借助于ELISA来评估抗EGF抗体的滴度。该测定法的阳性标准为，在405nm处测量的光密度必须为关于平板空白所获得的平均值的两倍以上。所述平板空白是当向孔中添加封闭缓冲液以代替抗EGF血清样品时而获得的。通过使用统计学程序，应用Mann-Whitney检验来进行数据分析。
表4：所评估的免疫原和待根据相应的生物学活性测定法来接种给动物的蛋白质的浓度
| 免疫原 | 蛋白质浓度(Lowry) |
| 疫苗制剂A | 1.5mg/mL |
| 疫苗制剂B | 1.5mg/mL |
| hrEGF的聚合缀合物和游离的hrEGF，由疫苗制剂A的通过UF/DF的纯化而获得 | 0.6mg/mL |
在图6中，显示了生物学活性测定法的结果，其作为每种所评估的免疫原的免疫原性活性的证据。相应于hrEGF的聚合缀合物和游离的hrEGF的免疫原组分没有显示出相关的生物学活性，因为它们的应答处于该测定法的阳性标准的水平上或者低于阳性标准。这些结果验证了EGF本身不诱导免疫原性应答的假说。
在应用Mann-Whitney检验时，所有结果的统计学分析(参见表5)显示了：相对于由接种了疫苗制剂B的动物组所达到的滴度而言，对于接种了疫苗制剂A的动物组的抗EGF抗体的滴度1/1000(p＝0.0004)来说以及对于滴度1/100(p＝0.0006)来说均具有高度显著的不同。这表明，相比于通过基于透析膜的纯化方法而获得的疫苗制剂B而言，借助于超滤膜来纯化的疫苗制剂A具有更高的免疫原性活性/毫克蛋白质。
与使用相应于hrEGF的聚合物的缀合物和游离的hrEGF进行免疫接种所达到的相比，疫苗制剂A导致抗EGF抗体的浓度(在1/1000稀释度处)增加至10倍。与先前在EP 0657175中所描述的疫苗制剂相比，本发明中所描述的疫苗制剂导致抗EGF抗体的浓度增加至两倍。
表5：用于通过小鼠血清中抗EGF抗体滴度来评估所述两种疫苗制剂的免疫原性的Mann-Whitney检验的统计学报告
| 小鼠血清中抗EGF抗体滴度(1/1000)的统计学分析Mann-Whitney检验和CI：G1 1/1000；G3 1/1000N 中值G1(疫苗制剂B) 1/1000 20 0.4300G3(疫苗制剂A) 1/1000 20 0.7120关于ETA1-ETA2的点估计值为-0.3115关于ETA1-ETA2的95.0％CI为(-0.4500；-0.1790)W＝278.0ETA1＝ETA2 vs ETA1≠ETA2的检验在0.0004处是显著的该测试在0.0004处是显著的(关于同数(ties)进行了调整)小鼠血清中抗EGF抗体滴度(1/100)的统计学分析Mann-Whitney检验和CI：G1 1/100；G3 1/100N 中值G1(常规疫苗制剂) 1/100 20 1.0785G3(经超滤的疫苗制剂) 1/100 20 1.3040关于ETA1-ETA2的点估计值为-0.2590关于ETA1-ETA2的95.0％CI为(-0.4389；-0.1149)W＝282.5ETA1＝ETA2 vs ETA1≠ETA2的检验在0.0006处是显著的该测试在0.0006处是显著的(关于同数进行了调整) |
实施例3：评估在治疗上皮起源的肺肿瘤中本发明中所描述的疫苗制剂的临床应用的功效
本实施例的目的在于，在患者中评估相比于由通过透析纯化方法获得的疫苗制剂B所达到的免疫原性而言由疫苗制剂A所产生的免疫原性。
在该研究中，治疗了具有晚期非小细胞肺癌(NSCLC)肿瘤的患者。为了该研究，定义了两个组的患者(用疫苗制剂B进行疫苗接种的患者，和用本发明中描述的疫苗制剂A进行疫苗接种的患者)。对于每个组，每位患者所施加的疫苗制剂的剂量如下：用疫苗制剂B进行疫苗接种的患者接受1.2mg总蛋白质/个免疫接种位点，用疫苗制剂A进行疫苗接种的患者接受0.6mg总蛋白质/个免疫接种位点。对于这两组来说，免疫接种位点都是4个。在开始该试验之前至少4周，所有患者接受癌特异性疗法。通过肌内途径来进行免疫接种，并且以每月1次的方式继续。
通过获得血清来评估这两组患者的体液免疫应答。结果的主要评阶变量是针对EGF的特异性抗体的滴度。该参数借助于EL I SA系统来测定。阳性值是为阴性对照值的两倍的那些光密度读数。所报告的抗体滴度是阳性血清的最大稀释度。
表6中所呈现的对于每组中的患者的免疫应答所进行的分析证明，在用疫苗制剂A进行免疫接种的患者组中最大抗体滴度的几何平均值为1∶56421，而在用疫苗制剂B进行免疫接种的患者组中最大抗体滴度的几何平均值为1∶23515。这意味着，与用疫苗制剂B所达到的滴度相比，本发明中所描述的疫苗制剂导致最大抗EGF抗体滴度的几何平均值增加至两倍。
在历史上，未经免疫接种的患者显示出1∶500的抗自身EGF抗体的滴度。因此，相比于在未经免疫接种的受试者中的抗EGF抗体滴度而言，本发明中所描述的疫苗制剂(疫苗制剂A)导致抗EGF抗体滴度增加到至少100倍。
表6：通过患者血清中抗EGF抗体滴度来测量的两种疫苗制剂的免疫原性的几何平均值的分析结果
重要的是强调，用本发明中所描述的疫苗制剂A进行免疫接种的患者组显示出更优异的抗EGF抗体滴度的几何平均值，因为其每次免疫接种所接受的总蛋白量为用疫苗制剂B进行免疫接种的患者组所接受的总蛋白量(4.8mg总蛋白质)的一半(2.4mg)，这构成了令人惊讶的结果。
这些结果证明，过量的自身蛋白hrEGF(聚合物的形式或者游离的形式)并没有给疫苗制剂提供更强的免疫原性，而是减弱了化学缀合物hrEGF-rP64k的免疫原性作用。
实施例4：调整至各种不同效价(总蛋白浓度/瓶)的本发明中所描述的疫苗制剂的获得
为了证明获得具有各种不同效价(总蛋白浓度/瓶)的疫苗制剂的能力，施行了如下面所描述的纯化方法：
试验1：在渗滤结束时，浓缩经纯化的化学缀合物，直至2mg/mL的最终蛋白质浓度。
试验2：在渗滤结束时，浓缩经纯化的化学缀合物，直至5mg/mL的最终蛋白质浓度。
试验3：在渗滤结束时，浓缩经纯化的化学缀合物，直至12mg/mL的最终蛋白质浓度。
在所有试验中，所使用的化学缀合物的总体积为1500mL，在渗滤过程中在1.5巴的跨膜压力下进行操作并且更换7次缓冲液。为了实施所述评估，建立了两个选择标准。第一个是达到＞80％的疫苗制剂的均一性百分比。第二个标准是在纯化操作过程中不存在蛋白质沉淀物。
表7中所呈现的结果显示了调整至各种不同的“蛋白浓度/毫升”的疫苗制剂的获得，其中保证了高水平的均一性(90.92％、96.79％和95.50％的缀合物种类hrEGF-rP64k)并且没有在其中产生蛋白质沉淀。
表7：相应于调整至各种不同的最终蛋白质浓度的疫苗制剂的均一性百分比的值
| 蛋白质浓度 | 疫苗制剂的均一性百分比 |
| 2mg/mL | 92.00％ |
| 5mg/mL | 96.79％ |
| 12mg/mL | 95.50％ |
实施例5：在本发明中所描述的疫苗制剂之中的戊二醛的去除
为了评估缀合剂(戊二醛)的去除情况，借助于使用C-8柱的反相色谱分离方法(HPLC-RP)来对疫苗制剂B中和疫苗制剂A中残留的戊二醛的含量进行定量。
该方法首先需要用高氯酸来使样品中所包含的蛋白质沉淀，而后与苯肼反应。
图7显示了，在所述两种疫苗制剂中所存在的这种杂质的残留量小于0.2ug/mL或小于0.002ppm(为这种杂质而设定的上限浓度)，而最初的深度为530mg/mL或530ppm。即使当所述两种制剂都符合为这种杂质而设定的规范时，图7也图解说明了，由应用通过超滤膜来进行的化学缀合物的纯化方法而获得的疫苗制剂A具有较低的戊二醛含量，这为使用所述疫苗制剂的患者提供了极高的安全性。
附图简述
图1：显示了同寡聚缀合物rP64k-rP64k的色谱图与未经纯化的化学缀合物EGF-P64k的色谱图的叠置。圈中所显示的是这两张色谱图之间特性谱的重合部分。X轴表示样品中的每种组分的洗脱时间，和Y轴表示样品中的每种组分在216nm处的强度值，作为样品中蛋白质浓度的指示。
图2：在对通过超滤获得的疫苗制剂进行SDS-PAGE电泳分离之后，用与碱性磷酸酶相缀合的抗EGF抗体进行的免疫检测。泳道1：分子量标准参照物；泳道2：疫苗制剂。
图3：显示了相应于同寡聚缀合物hrEGF-hrEGF的色谱图与未经纯化的化学缀合物hrEGF-rP64k的色谱图的叠置。圈中所显示的是这两张色谱图之间种类的重合部分。X轴表示样品中的每种组分的洗脱时间，和Y轴表示样品中的每种组分在216nm处的强度值，作为样品中蛋白质浓度的指示。
图4：相应于本发明中所描述的疫苗制剂的色谱法特性谱。阴影区域相应于缀合物种类hrEGF-rP64k。X轴表示每种级分的洗脱时间，和Y轴表示样品中的每种组分在216nm处的强度值，作为样品中蛋白质浓度的指示。
图5：相应于hrEGF-rP64k缀合物的色谱法级分的肽图谱。呈现了对于两种独立地通过超滤膜来纯化的疫苗制剂而获得的结果。X轴表示时间，和Y轴表示毫强度单位。
图6：在用不同的免疫原进行免疫接种的小鼠中的抗EGF抗体滴度：常规疫苗制剂、通过超滤进行纯化的疫苗制剂和源自疫苗制剂的超滤纯化方法的渗透物。X轴相应于从每种动物获得的血清的稀释度，和Y轴表示每个样品的在405nm处的光密度值，作为样品中蛋白质浓度的指示。
图7：关于由使用50kDa超滤膜的纯化方法而获得的疫苗制剂(疫苗制剂A)和关于采用通过透析膜的纯化方法而获得的疫苗制剂(疫苗制剂B)，在残留的戊二醛含量的定量过程中获得的HPLC-RP色谱法特性谱。
Claims (23)
1.其活性成分包括hrEGF-rP64k蛋白质缀合物的疫苗组合物，其特征在于，每个rP64K蛋白分子连接至两个hrEGF分子。
2.根据权利要求1的疫苗组合物，其特征在于，所述hrEGF-rP64k蛋白质缀合物以12.04纳摩尔rP64k蛋白/24.05纳摩尔hrEGF的比例。
3.根据权利要求1的疫苗组合物，其特征在于，所述组合物是hrEGF-rP64k的均质混合物，其不含诸如hrEGF聚合物或游离的hrEGF的分子种类。
4.根据权利要求1的疫苗组合物，其特征在于，所述hrEGF-rP64k的均质混合物不含戊二醛。
5.根据权利要求1的疫苗组合物，其特征在于，另外还包含合适的佐剂，所述佐剂选自氢氧化铝或Montanide。
6.根据权利要求5的疫苗组合物，其特征在于，包含Montanide作为佐剂。
7.根据权利要求5的疫苗组合物，其特征在于，包含氢氧化铝作为佐剂。
8.根据权利要求1的疫苗组合物，其特征在于，其引起在经免疫接种的哺乳动物的血清中抗EGF抗体的滴度增加到至少10倍。
9.根据权利要求1的疫苗组合物，其特征在于，其引起在人血清中抗EGF抗体的滴度增加到至少10倍。
10.根据权利要求1的疫苗组合物，其特征在于，其引起在人血清中抗EGF抗体的滴度增加到至少100倍。
11.用于以符合卫生的方式获得权利要求1的疫苗组合物的方法，其特征在于，包括用于将EGF与载体蛋白rP64k共价缀合的适宜的程序，以及使用超滤膜来进行纯化以去除在生物学上无活性的缀合物种类和其他化学杂质。
12.根据权利要求11的用于获得疫苗组合物的方法，其特征在于，所述缀合反应开始于在缀合反应器中混合事先经浓缩的hrEGF蛋白(＞6mg/mL)和rP64k蛋白(≥1mg/mL)，向所述蛋白质混合物中添加PBS/MgCl2溶液(pH 6.8-7.2)和0.5％戊二醛的缀合溶液，最后使所述混合物于22℃±2℃的温度下在连续搅拌下维持2小时。
13.根据权利要求12的用于获得疫苗组合物的方法，其特征在于，蛋白质hrEGF与rP64k之间的缀合条件确保了每rP64k分子与两个hrEGF分子进行缀合反应。
14.根据权利要求11的用于获得疫苗组合物的方法，其特征在于，共价缀合反应产物的纯化步骤通过超滤/渗滤方法来进行，所述超滤/渗滤方法使用处于50至100kDa的范围内的膜。
15.根据权利要求14的用于获得疫苗组合物的方法，其特征在于，化学缀合反应产物的纯化步骤通过超滤/渗滤方法来进行，所述超滤/渗滤方法使用50kDa的膜。
16.根据权利要求14的用于获得疫苗组合物的方法，其特征在于，化学缀合反应产物的纯化步骤通过超滤/渗滤方法来进行，所述超滤/渗滤方法使用100kDa的膜。
17.其活性成分为hrEGF-rP64k蛋白质缀合物的疫苗组合物，其特征在于，通过权利要求15的方法进行纯化。
18.其活性成分为hrEGF-rP64k蛋白质缀合物的疫苗组合物，其特征在于，通过权利要求16的方法进行纯化。
19.活性成分为hrEGF-rP64k蛋白质缀合物的疫苗组合物，其特征在于，将疫苗制剂的最终的总蛋白浓度调整在1-12mg/mL的范围内。
20.权利要求17的疫苗组合物的用途，所述用途为用于制备对于引发针对人EGF的免疫应答来说有用的试剂。
21.权利要求18的疫苗组合物的用途，所述用途为用于制备对于引发针对人EGF的免疫应答来说有用的试剂。
22.权利要求17的疫苗组合物的用途，所述用途为用于制备在治疗上皮起源的肿瘤中有用的试剂。
23.权利要求18的疫苗组合物的用途，所述用途为用于制备在治疗上皮起源的肿瘤中有用的试剂。
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