BRPI0813662B1 - Composição vacinal, processo para a obtenção de uma composição vacinal, e, uso de uma composição vacinal - Google Patents
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Abstract
composição vacinal, processo para a obtenção de uma composição vacinal, e, uso de uma composição vacinal a presente invenção se refere ao ramo da biotecnologia e mais especificamente à saúde humana. particularmente, a presente invenção descreve uma composição vacinal para seu uso terapêutico em pacientes de câncer. a composição vacinal descrita na presente invenção tem como principio ativo um conjugado químico entre o fator de crescimento epidérmico humano recombinante (hregf) e a proteína recombinante p64k. além disso, descrevem-se condições específicas para a realização de uma reação de conjugação que permitem obter de maneira controlada e reproduzível o dito conjugado químico. em outro aspecto, a presente invenção se refere a um processo para a purificação do conjugado químico que não só traz maior pureza à composição vacinal terapêutica, como surpreendentemente aumento à atividade imunológica, provocando aumentos significativos nos títulos de anticorpos anti egf em humanos. adicionalmente a presente invenção proporciona a metodologia para conseguir um preparado vacinal com mais de um tipo de apresentação de dose (miligramas totais de conjugados egf-p64k/vial). esta versatilidade na apresentação do preparado vacinal permite aumentar a dose de imunização por paciente, senão que isto convém a aumentar a frequência de imunização e/ou o número de lugares de imunização. por fim, a presente invenção encerra um processo sanitário para a obtenção do preparado vacinal para a terapia do câncer, administrado por via parenteral.
Description
“COMPOSIÇÃO VACINAL, PROCESSO PARA A OBTENÇÃO DE UMA COMPOSIÇÃO VACINAL, E, USO DE UMA COMPOSIÇÃO VACINAL”
Setor Técnico:
A presente invenção se refere à biotecnologia, e mais especificamente ao campo da saúde humana. Em uma representação, a presente invenção descreve vacinas protetoras e/ou terapêuticas para câncer, e particularmente proporciona composições vacinais que permitem o aumento significativo da resposta imunológica contra o Fator de Crescimento Epidérmico (EGF). Fator de Crescimento cuja relevância oncológica foi amplamente demonstrada para o crescimento de tumores fundamentalmente de origem epitelial.
Técnica Anterior:
O sistema do receptor de EGF (R-EGF) e seus ligantes constitui um complexo molecular cuja interação regula de forma específica o crescimento celular e cujo impacto no crescimento descontrolado de tumores de origem epitelial foi demonstrado.
No processo de tumorigêneses, a desregulação dos processos parácrinos e autócrinos de ativação do (R-EGF), é dada tanto pela sobreprodução dos fatores de crescimento como pela síntese elevada e/ou a mutação de seus receptores.
O EGF é um polipeptídeo de 53 aminoácidos, com um peso molecular aparente de 6045 Da. Este polipeptídeo foi isolado e purificado pela primeira vez por Cohen S., J. Biol. Chem. (1962) 237, 1. 555).
O EGF faz parte da família de ligantes do R-EGF, esta família está constituída por proteínas relacionadas estrutural e funcionalmente. Os outros membros desta família são: TGF, anfiregulina (AR), criptol (CR1), fator de crescimento de ligação de heparina, betacelulina, epiregulina. Por
Petição 870180160535, de 10/12/2018, pág. 9/14 outro lado a família dos poxvírus inclui proteínas relacionadas com o EGF, dentro das quais a mais caracterizada é o fator de crescimento de vaccinia vírus (VGF).
Todas estas moléculas são capazes de se unir e ativar ao (REGF), assim que são conhecidas como ligantes do mesmo e atuam no crescimento de células normais e neoplásicas em menor ou maior grau.
O R-EGF é uma glicoproteina de 170 kDa aproximadamente, cujo gene foi clonado e sequenciado. O domínio intracelular deste receptor está associado com a atividade de proteínas tirosinas quinases que mostram homologia estrutural com o produto do oncogen v-erb-B, o que mostra uma relação com o processo de transformação maligna (Heldin CH. (1984), Cell 37, 9-20.).
Todas as evidências acumuladas nestes anos a respeito da relação entre o sistema EGF-R/ EGF-R ligantes e o câncer, convertem ao mesmo tempo, em um alvo muito atraente para a imunoterapia de câncer.
Resultados prévios demonstraram a possibilidade de realizar uma imunoterapia ativa de câncer com a vacina baseada em EGF. De fato, obtiveram-se evidências tanto pré-clínicas como clínicas a respeito da imunogenicidade e a baixa toxicidade provocada pela vacinação com hrEGF unido a uma proteína transportadora (González y cols. (1996), Vaccine Research 5(4), 233-243.).
EP 0 657 175 descreve uma composição vacinai que contêm EGF autólogo acoplado a uma proteína transportadora e dito complexo inibe o crescimento de tumores dependentes de EGF através de um efeito autoimune.
A composição vacinai descrita em EP 0 657 175 são vacinas conjugadas que contém EGF, acoplado a uma proteína transportadora (a proteína rP64k, a cadeia B da toxina da cólera, a proteína de toxóide tetânico e/ou anticorpos monoclonais) e como conseqüência se obtém uma mistura heterogênea e pouco reproduzível de espécies conjugadas.
O inovador preparado vacinai descrito na presente invenção compreende como princípio ativo o EGF autólogo e está caracterizado por possuir uma composição química homogênea e pureza definida, uma imunogenicidade potenciada, uma atividade clínica substancialmente aumentada e permite diminuir sensivelmente o número de imunizações para sua ação terapêutica.
A diminuição do conteúdo do antígeno autólogo no preparado vacinai da presente invenção, surpreendentemente não diminui, senão que provoca aumentos significativos nos títulos de anticorpos anti EGF em humanos. A diminuição do conteúdo de EGF e seus derivados na composição vacinai foi obtida através de desenvolvimento de um método de purificação por membrana, que também faz parte desta invenção.
A presente invenção proporciona, além disso, um preparado vacinai homogêneo e reproduzível que permite aumentar o efeito clínico do mesmo diminuindo o numero de imunizações, o que traz uma grande vantagem na terapêutica do câncer e para o paciente, em comparação com composições vacinais previamente descritas. Composição vacinai de acordo com a presente invenção pode ser empregada em conjunção com adjuvantes adequados tais como hidróxido de alumínio ou Montanide.
Em outro aspecto, a presente invenção envolve um procedimento sanitário para a obtenção do preparado vacinai apropriado para a administração em pacientes por via parenteral. O procedimento compreende um método apropriado de conjugação covalente do hrEGF, a proteína transportadora rP64k e a purificação do mesmo empregando membranas de Ultrafiltração em um intervalo de 50-100kDa.
Para remover as espécies conjugadas biologicamente inativas (carente de atividade imunogênica) e outras impurezas químicas.
Descrição Detalhada da Invenção.
A presente invenção proporciona um inovador preparado vacinai baseado no EGF autólogo, caracterizado por possuir uma composição química homogênea e pureza definida, uma imunogenicidade potenciada e uma atividade clínica substancialmente aumentada. Adicionalmente a apresentação vacinai descrita na presente invenção traz a possibilidade de diminuir sensivelmente o número de administrações necessárias ao paciente, quando se requer aumentar a dose terapêutica, pelo fato desta composição vacinai se obtém a partir de uma metodologia que permite atingir diferentes concentrações por mililitros das espécies conjugadas hrEGF-rP64k, conhecido como potência.
Este novo preparado vacinai se obtém a partir do surpreendente resultado de que a diminuição do conteúdo do antígeno autólogo na composição vacinai através um inovador processo de purificação, não diminui, senão permite aumentar significativamente a resposta imune contra o próprio EGF em comparação com composições heterogêneas empregadas como vacinas baseadas no EGF.
O preparado vacinai obtido a partir da diminuição do conteúdo do antígeno autólogo através da metodologia de purificação por membrana de ultrafiltração tem uma composição homogênea onde as espécies imunologicamente ativas (espécies conjugadas hrEGF-rP64k) mostram massas molares superiores a 60kDa.. Este preparado vacinai mostra um perfil de separação cromatográfico por exclusão molecular caracterizado pelo fato de que as espécies que portam atividade terapêutica deste preparado vacinai, representam mais 90% da área total do cromatograma correspondente à preparação vacinai em seu conjunto, como se mostra na figura 4
Estudos de Espectrometria de Massas realizados para aprofundar na caracterização estrutural do preparado vacinai, trazem o mapa de peptídeos para dois lotes diferentes do preparado vacinai, onde se aprecia grande similitude na posição e proporção dos peptídeos que aparecem (ver figura 5). A similitude entre os mapas de peptídeos obtidos a partir de ambas réplicas de preparado vacinais é um indicativo do controle nas condições em que ocorrem os procedimentos de conjugação química e purificação descritas também na presente invenção. Este estudo permitiu identificar a seqüência dos peptídeos majoritários que compõem o presente preparado vacinai, (ver tabela 3).
Este preparado vacinai se caracteriza além disso, por uma relação de conjugação química entre as proteínas hrEGF e rP64k de (1:2), isto significa que existem 2 moléculas de hrEGF conjugada por cada molécula de rP64k.
Metodologia para obtenção do preparado vacinai
Procedimento de purificação para a diminuição do conteúdo de EGF autólogo.
A partir de observações experimentais que evidenciaram que a diminuição do conteúdo de hrEGF no preparado vacinai aumenta ação imunogênica do mesmo, desenvolve-se um método para diminuir o conteúdo de hrEGF na mistura heterogênea de conjugados; enriquecendo o preparado vacinai em espécies conjugadas de alto peso molecular (espécies imunologicamente ativas) e livre de glutaraldeído.
O procedimento de purificação empregando membranas de ultrafiltração em um intervalo entre 50-100kDa desenvolvido e descrito na presente invenção consta de duas etapas: Na etapa inicial se realizam sucessivas mudanças de solução tampão (diafiltração) para remover o glutaraldeído e eliminar o excesso de proteína autóloga, seja livre ou formando conjugados hrEGF-hrEGF de diferentes tamanhos. Durante esta etapa se realizam entre 10 e 15 trocas de solução tampão A segunda etapa é a concentração do conjugado químico purificado, no qual mais de 90% de sua composição corresponde à espécie imunogênica hrEGF-rP64k. Durante a etapa de concentração o volume inicial do conjugado químico se reduz até conseguir uma concentração de proteínas final (espécies conjugadas hrEGFrP64k) em um intervalo entre 1-12 mg/ML. Esta versatilidade no intervalo de concentrações do princípio ativo (miligramas totais de conjugados hrEGFrP64k por mililitros) para dito preparado vacinai traz uma grande vantagem na terapêutica do câncer. Isto permite aumentar a dose de tratamento sem que implique ao paciente um aumento na freqüência de imunização e/ou aumentar o número de lugares de imunização.
Com o propósito de monitorar a qualidade da purificação do conjugado químico se avalia o pH e a condutividade do retido e do permeado. Realiza-se também a determinação da concentração de proteína pelo processo descrito por Lowry D. H. y col. J. Biol Chem 191: 495-498, 1951 e se determina a porcentagem de homogeneidade a partir da análise cromatográfica por filtração em gel (HPLC-FG).
A singularidade desta metodologia assegura que o preparado vacinai obtido tenha uma composição homogênea e pureza definida, caracterizada pela presença majoritária das espécies imunologicamente ativas: espécies conjugadas hrEGF-rP64k..
Surpreendentemente, a remoção do excesso de proteína autóloga (hrEGF) livre ou polimérico não provoca a redução, senão que permite aumentar significativamente a concentração de anticorpos anti EGF (a diluição 1/1000), a 10 vezes, mas com relação à concentração de anticorpos atingida ao imunizar ratos com polímeros de hrEGF e com hrEGF livre. A redução do conteúdo de proteína autóloga na preparação vacinai provoca em pacientes aumentos de pelo menos 2 vezes no máximo, título de anticorpos anti EGF. Este aumento do título de anticorpos é observado ainda naqueles pacientes que recebem a metade da dose (2.4 mg) por imunização em comparação com pacientes que recebem (4.8 mg) por dose do preparado vacinai descrito em EP 0657 175. Estes resultados indicam que o preparado vacinai, descrito na presente invenção tem maior atividade imunológica por miligrama de proteína ativamente imunológica, comparado com outros preparados vacinais.
Obtenção do conjugado químico entre a proteína recombinante P64k (rP64k) e o Fator de Crescimento Epidérmico humano recombinante (hrEGF).
A partir da avaliação e otimização das condições para a reação de química conjugação entre as proteínas hrEGF e rP64k se desenvolve um método de conjugação química que requer uma elevada proporção molar da proteína autóloga, 10 moles de hrEGF por cada mol de rP64k para garantir uma elevada eficiência de conjugação entre ambas durante a conjugação. O excesso necessário de proteína autóloga durante a conjugação química, para garantir a eficiência da mesma, se elimina em seguida através do método de purificação por membranas de ultrafiltração descrito anteriormente, o qual permite a obtenção do preparado vacinai com elevada homogeneidade. O procedimento descrito na presente invenção para garantir uma adequada conjugação química entre ambas proteínas consta de um só passo e se inicia misturando a proteína hrEGF concentrada previamente (>6 mg/ML) e a proteína rP64k (> 1 mg/ML) no reator de conjugação. A esta mistura protéica se adiciona posteriormente a solução PBS/MgCh (PH 6.8-7.2) e a solução de conjugação de glutaraldeído 0.5%. Mantém-se a mistura em agitação constante por 2 horas a uma temperatura 22°C± 2°C. A concentração final de proteína na mistura de reação para o hrEGF é 0.82 mg/ML e para a proteína rP64k é 0.89 mg/ML. A concentração de proteínas totais durante a reação de conjugação é de 2 mg/ML e a concentração final do glutaraldeído na mistura de reação é de 0.05%.
A composição vacinai de acordo com a presente invenção pode ser empregada em conjunção com adjuvantes adequados, tais como hidróxido de alumínio ou Montanide.
Em outro aspecto, a presente invenção envolve um procedimento sanitário para a obtenção do preparado vacinal, administrado por via parenteral que minimiza as oportunidades de contaminação microbiana do preparado vacinal durante sua obtenção, permite realizar a metodologia de purificação do conjugado químico em poucas horas e facilita o aumento do volume do preparado vacinal a obter entre outras vantagens.
Os exemplos seguintes são oferecidos para ilustrar mais detalhadamente a presente invenção.
O Exemplo 1 descreve a caracterização molecular do preparado vacinal descrito na presente invenção. A caracterização molecular inclui: a identificação cromatográfica por HPLC-FG das espécies conjugadas formadas durante a reação de conjugação, a determinação da razão de conjugação entre as proteínas hrEGF e rP64k e a definição do mapa de peptídeos que caracteriza este inovador preparado vacinal.
O Exemplo 2 descreve os bioensaios em rato realizados para avaliar a imunogenicidade do inovador preparado vacinal descrito na presente invenção.
O Exemplo 3 descreve a eficácia do uso clínico do presente preparado vacinal no tratamento de tumores de pulmão de origem epitelial.
O Exemplo 4 descreve a obtenção de preparados vacinais ajustados a diferentes potências (miligramas totais de conjugado hrEGFrP64k/vial), empregando a mesma metodologia de conjugação e purificação descrita na presente invenção.
O Exemplo 5 mostra a remoção do glutaraldeído empregado na reação de conjugação, mediante a metodologia de purificação do conjugado químico através de uma membrana de ultrafiltração 5OkDa.
EXEMPLOS:
EXEMPLO 1: Caracterização molecular do preparado vacinal descrito na presente invenção (Preparado Vacinal A).
1.1 Caracterização cromatográfica do preparado vacinal descrito na presente invenção.
Para a caracterização cromatográfica do preparado vacinai purificado por ultrafiltração foram empregaram como indicadores conjugados homoligoméricos hrEGF-hrEGF e rP64k-rP64k. Os perfis cromatográficos mostrados pelos conjugados homoligoméricos (hrEGF-hrEGF e rP64krP64k) foram comparados com o perfil cromatográfico mostrado pelo conjugado químico obtido da reação de conjugação entre as proteínas hrEGF e rP64k sem purificar.
Na figura 1 se mostra o perfil do conjugado homoligomérico rP64k-rP64k e o perfil que se obtém ao realizar a conjugação química entre as proteínas hrEGF e rP64k (conjugado químico sem purificar por ultrafiltração). A zona encerrada no círculo delimita a área onde se encontram as espécies conjugadas hrEGF-rP64k. O perfil do conjugado rP64k-rP64k não mostra total coincidência com o mostrado pelo conjugado químico entre as proteínas hrEGF-rP64k devido ao aporte das moléculas de hrEGF conjugadas com a rP64k.
Na figura 2 são mostram os resultados obtidos depois de realizar uma eletroforese desnaturalizante em condições de redução e Western Blot do preparado vacinai purificado por ultrafiltração. O revelado foi realizado com um anticorpo anti EGF conjugado com fosfatase alcalina. O EGF é uma proteína de peso molecular aparente de 6kDa, portanto deve se localizar na zona inferior do gel. Sua identificação mediante imunodeteção com anticorpos anti-EGF na zona correspondente às proteínas de peso molecular aparente superiores a 6 kDa confirma que existem moléculas de hrEGF unidas à rP64k na zona do gel correspondente às espécies conjugadas hrEGF-rP64k.
Quando se compara o perfil do conjugado químico hrEGFrP64 sem purificar e o perfil obtido para o conjugado homoligomérico hrEGF-hrEGF pode-se apreciar que existe uma correspondência entre ambos perfis. Esta evidência confirma que depois do vale se encontra a zona que corresponde às espécies de hrEGF conjugadas entre si (polímeros de hrEGF) e de moléculas de hrEGF livre (Figura 3).
O perfil cromatográfico por exclusão molecular (ver figura 4) do preparado vacinai objeto da presente invenção mostra que a área correspondente às espécies conjugadas hrEGF-rP64k constituem mais de 90% de área total do cromatograma (zona sombreada) evidenciando a elevada homogeneidade da composição vacinai descrita.
1.2. Determinação da razão de conjugação entre as proteínas hrEGF e rP64k no preparado vacinai descrito na presente invenção.
Com o objetivo de determinar a razão de conjugação em que se encontram o hrEGF e a rP64k no preparado vacinai foram determinaram os moles presentes de cada uma de suas proteínas constituintes. Para isto tomouse um preparado vacinai obtido a partir de um processo de purificação com membrana de ultrafiltração 50 kDa e se coletou a fração cromatográfica correspondente às espécies conjugadas hrEGF-rP64k. Estas frações foram submetidas às análises de aminoácidos.
A determinação da razão de conjugação foi realizada por 2 métodos.
1. Um método se baseou na estimativa da quantidade de Fenilalanina (Phe) e Treonina (Thr) no preparado vacinai (aminoácidos sozinhos presentes na molécula de rP64k). As quantidades destes aminoácidos foram usadas para determinar a quantidade de rP64k. A partir desta última, e levando em conta a quantidade total de aminoácidos da mistura, determinouse a quantidade de EGF.
2. O outro método se baseou na determinação direta das quantidades relativas de cada proteína, utilizando a seqüência de aminoácidos e baseado na quantificação dos aminoácidos Asparagina+Aspártico (Asx), Glutamina + Glutâmico (Glx), Glicina (Gli) e Alanina (Asa) (resíduos altamente estáveis à hidrólise ácida e que comumente são usados na quantificação de proteínas).
Os resultados obtidos por cada método foi mostrado a seguir nas tabelas 1 e 2.
| | Quantidade média de rP64k | Quantidade média de hrEGF | Razão média de conjugação | |
| | 12,07 nmoles | 23,13 nmoles | 1,92 |
Tabela 1: Determinação da razão de conjugação entre as proteínas hrEGF e rP64k realizando a determinação de composição aminoácido do preparado vacinai purificado por ultrafiltração, baseando-se no processo de determinação da quantidade de Fenilalanina (Phe) e Treonina (Thr)
| Proteína | 1 | Quantidade de proteína | | Razão de conjugação |
| rP64K | | | 12,04 nmoles 1 | 2,00 |
| hrEGF | 1 | 24,05 nmoles | |
Tabela 2: Determinação da razão de conjugação entre as proteínas hrEGF e rP64k realizando a determinação de composição aminoácida do preparado vacinai purificado por ultrafiltração, baseando-se no processo de determinação das quantidades relativas dos aminoácidos Asparagina+Aspártico (Asx), Glutamina + Glutâmico (Glx), Glicina (Gli) e Alanina (Asa).
Os resultados obtidos por ambos métodos mostram correspondência na estimação da razão de conjugação entre as proteínas hrEGF :rP64k para o preparado vacinai descrito na presente invenção. A razão de conjugação calculada foi de (1:2), isto significa 2 moléculas de hrEGF por cada molécula de rP64k
1.3. Definição do mapa de peptídeos que caracteriza ao preparado vacinai descrito na presente invenção.
Com o objetivo de caracterizar estruturalmente o preparado vacinai que se apresenta na presente invenção e evidenciar a reprodutibilidade na obtenção do mesmo se desenvolveu e caracterizou o mapa de peptídeos obtido depois da digestão das frações conjugadas hrEGF- rP64k com a endoprotease Glu-C. Cada uma das frações do mapa obtido foi identificada e sequenciada por Espectrometria de Massas.
A figura 5 mostra os mapas de peptídeos obtidos a partir de dois preparados vacinais obtidos independentemente, onde se observa grande similitude nos peptídeos que aparecem e a proporção existente de cada um 5 deles. A reprodutibilidade entre os mapas de peptídeos obtidos a partir de ambos preparados vacinais é um indicativo do controle que existe sobre as condições na qual ocorrem os procedimentos de conjugação química e purificação descritas também na presente invenção.
A identificação dos peptídeos contidos em cada fração do mapa foi obtida por análise de cada uma delas pelo método MALDI (siglas em Inglês de Matrix assisted Laser desorption_ionization/ionização_desorbção de matriz assistida por Laser) e pelo método ESI-MS (siglas em inglês de Electrospray ionization/ Eletronebulização por ionização). Na tabela 3 se mostra a seqüência dos 15 peptídeos majoritários.
| Pico | Peptídeos |
| HG05 | LDID QAAPTGE |
| HG06 | SIGMAAE AEGTAAAPKAE |
| HG08 | AEGTAAAPKAE |
| HG09 | KISE SIGMAAE |
| HG11 | AAAAPAQEAPKAA GANAPKEPQRYD |
| HG12 | SIGMAAE |
| HG14 | VKVKVGDKISE |
| HG15 | VAWVGE |
| HG16 | VAWVGETE VSLTAGDAYE |
| HG17 | VCLAIE |
| HG18 | VRHLAANGIKYPEPE |
| HG19 | AAAAPAQEAPKAAAPAPQAAQFG VRHLAANGIKYPEPE |
| HG20 | LKVPDIGGHE RVIPGVAYTSPE TGRIIGGGIVGPN VRHLAANGIKYPEPE |
| HG21 | KAGVAVTDRGFIE LDFDAE GGPGGYSAAFAAADE |
| Pico | Peptídeos |
| HG22 | ARVIPGVAYTSPE GLKVAIVE |
| HG23 | AAAAPAQEAPKAAAPAPQAAQFGGSADAEYD MGCDAADIGKTIHPHPTLGE PKEPQRYDAVLVAAGR |
| HG24 | NVDIIAVE YDVWLG |
| HG25 | AVLVAAGRAPNGKLISAE MGCDAADIGKTIHPHPTLGE TGRIIGGGIVGPNGGDMIGE |
| HG26 | TGRIIGGGIVGPNGGDMIGE VRHLAANGIKYPEPELD |
| HG27 | TGRIIGGGIVGPNGGDMIGE RCQYRDLKWWE |
| HG28 | GGLIVVVE |
| HG29 | GGLIWVE TGRIIGGGIVGPNGGDMIGE YRFDNIMVNTKTVAVEPKED |
| HG30 | AIGDIVGQPMLAHKAVHE AIGDIVGQPMLAHKAVHE |
| HG31 | ALDKYACNCWGYIGE ALDKYACNCWGYIGE |
| HG32 | ARVIPGVAYTSPE LDIDMLRAY MDVPAEVAGWKE |
| HG33 | TGRIIGGGIVGPNGGDMIGE ALDKYACNCWGYIGE GYCLHDGVCMYIE RCQYRDLKWWE |
| HG34 | NCAGHKAYFDARVIPGVAYTSPE |
| HG35 | GANAPKEPQRYDAVLVAAGRAPNGKLISAE |
| HG36 | GANAPKEPQRYDAVLVAAGRAPNGKLISAE NCAGHKAYFDARVIPGVAYTSPE VIDEVRHLAANGIKYPE |
| HG37 | MGTVYSTLGSRLDWE |
| HG38 | IIGGGIIGLE MDVPAEVAGWKEVK NSDSECPLSHDGYCLHDGVCMYIE |
| HG39 | VWLGGGPGGYSAAFAAADE |
| HG40 | MGTVYSTLGSRLDWE |
| HG41 | LKVPDIGGHENVDIIAVE |
| HG42 | RCQYRDLKWWEL |
| HG43 | VDKQMRTNVPHIYAIGDIVGQPMLAHKAVHE ASGRAIANGCDNGFTKLIFDAE |
| HG44 | VDKQMRTNVPHIYAIGDrVGQPMLAHKAVHE |
| HG47 | YRFDNIMVNTKTVAVEPKEDGVYVTFE AIANGCDNGFTKLIFDAE |
| HG48 | RYKTLGGVCLNVGCIPSKALLHNAAVIDE |
| HG49 | VNVGDTIAVDDTLITLD RYKTLGGVCLNVGCIPSKALLHNAAVIDE YRFDNIMVNTKTVAVEPKEDGVYVTFE IVGQPMLAHKAVHEGHVAAENCAGHKAYFD NGFTKLIFDAETGRIIGGGrVGPNGGDMIGE |
| HG50 | TGRIIGGGrVGPNGGDMIGEVCLAIEMGCD |
| Pico | Peptídeos |
| HG51 | RCQYRDLKWWEL |
Tabela 3. Composição aminoácida dos peptídeos majoritários obtidos depois da digestão das frações conjugadas EGF-P64k com a endoprotease Glu-C. Composição aminoácida foi determinada por MALDI e ESI-MS.
EXEMPLO 2.
Imunogenicidade do preparado vacinai descrito na presente invenção.
Neste exemplo se descreve o ensaio de atividade biológica realizado para avaliar a imunogenicidade do preparado vacinai descrito anteriormente (Preparado Vacinai A) comparativamente com um preparado vacinai descrito em EP 0657 175. Nomeado (Preparado Vacinai B).
Para o ensaio se realizou a inoculação de 10 ratos com uma única dose de 200 pL de uma emulsão água em azeite (50/50% v/v) dos imunógenos (preparado vacinai convencional obtido por diálises, preparado vacinai obtido por purificação com membrana de ultrafiltração e o permeado obtido do processo de purificação por UF/DF, onde se encontram as espécies conjugadas hrEGF-hrEGF) com o adjuvante Montanide ISA 51. A dose de proteína aplicada para cada imunógeno está referida na tabela 4.
Nos 14 dias seguintes à inoculação, realizou-se a extração do soro dos animais e a avaliação do título de anticorpos anti-EGF mediante um ELISA. O critério de positividade de ensaio foi que a densidade óptica medida a 405 nm fora mais de duas vezes a média obtida para o alvo de placa. Obtém-se o alvo de placa quando se adiciona ao poço tampão de bloqueio no lugar de mostra de soro anti-EGF. A prova de Mann-Whitney aplicada à análise dos dados foi realizada utilizando um programa estatístico.
| Imunógenos | Concentração de proteínas (Lowry) |
| Preparado Vacinai A | 1.5 mg/mL |
| Preparado Vacinai B | 1.5 mg/mL |
| Conjugados poliméricos de hrEGF e hrEGF livre) obtido pela | purificação por UF/DF do Preparado Vacinai A | 0.6 mg/mL |
Tabela 4: Imunógenos avaliados e a concentração de proteínas a ser inoculada por animal segundo corresponda ao ensaio de atividade biológica.
Na figura 6, mostram-se os resultados do ensaio de atividade biológica como evidência da atividade imunológica de cada imunógeno avaliado. Os componentes do imunógeno correspondentes aos conjugados poliméricos de hrEGF e hrEGF livre, não mostram atividade biológica relevante, pois sua resposta está no nível do critério de positividade do ensaio ou inferior. Estes resultados verificam a hipótese de que o EGF por si mesmo não induz a resposta imunológica.
A análise estatística de todos os resultados ao aplicar o teste de “Mann-Whitney Teste” (ver tabela 5) mostrou diferenças altamente significativas para os títulos de anticorpo anti EGF 1/1000 com p=0.0004 e para o título 1/100 com p=0.0006 do grupo de animais inoculados com o Preparado Vacinai A em relação aos títulos atingidos para o grupo de animais inoculados com o Preparado Vacinai B. Isto indica que o Preparado Vacinai A purificado mediante membrana de ultrafiltração tem maior atividade imunológica por miligrama de proteína do que o Preparado Vacinai B, obtido pelo processo de purificação baseado em membrana de diálises.
O Preparado Vacinai A produz um aumento da concentração de anticorpos anti EGF (a diluição 1/1000) 10 vezes maior em relação ao atingido ao imunizar com o conjugado correspondente os polímeros de hrEGF e hrEGF livre. Em relação ao preparado vacinai descrito previamente em EP 0657175 o preparado vacinai descrito na presente invenção produziu um aumento 2 vezes maior da concentração de anticorpos anti EGF
Análise estatística de Títulos de anticorpo anti EGF (1/1000) em soro de rato
Mann-Whitney Test and Cl: Gl 1/1000; G3 1/1000
| N | Média | ||
| Gl (Preparado Vacinai B) | 1/1000 | 20 | 0,4300 |
| G3 (Preparado vacinai A) | 1/1000 | 20 | 0,7120 |
Point estimate for ETA1-ETA2 is -0,3115
95,0 Percent Cl for ETA1-ETA2 is (-0,4500; -0,1790)
W = 278,0
Test of ETA1 = ETA2 vs ETA1 not = ETA2 is significant at 0,0004
The test is significant at 0,0004 (adjusted for ties)
Análise estatística de Títulos de anticorpo anti EGF (1/100) em soro de rato Mann-Whitney Teste and Cl: Gl 1/100; G31/100
| N | Média | ||
| Gl (Preparado vacinai convencional) | 1/100 | 20 | 1,0785 |
| G3 (Preparado vacinai por ultrafiltração) | 1/100 | 20 | 1,3040 |
Point estimate for ETA1-ETA2 is -0,2590
95,0 Percent Cl for ETA1-ETA2 is (-0,4389;-0 ,1149)
W = 282,5
Test of ETA1 = ETA2 vs ETA1 not = ETA2 is significant at 0,0006
The test is significant at 0,0006 (adjusted for ties)
Tabela 5: Reporte estatístico de Teste de Mann-Whitney empregado para avaliar a imunogenicidade de ambos preparados vacinais através do título de anticorpo antiEGF no soro de ratos
EXEMPLO 3.
Avaliação da eficácia do uso clínico do preparado vacinai descrito na presente invenção no tratamento de tumores de pulmão de origem epitelial.
O objetivo deste exemplo é avaliar em pacientes a imunogenicidade produzida pelo Preparado Vacinai A em comparação com a imunogenicidade conseguida pelo Preparado Vacinai B obtido pelo processo de purificação por diálises.
Neste estudo, trataram-se pacientes portadores de tumores de pulmão de células não pequenas em estágios avançados. Definiram-se para o estudo 2 grupos de pacientes (pacientes vacinados com o Preparado Vacinai B e pacientes vacinados com o Preparado Vacinai A, descrito na presente invenção. A dose de preparado vacinai aplicada por paciente para cada grupo foi a seguinte: os pacientes vacinados com o Preparado Vacinai B receberam 1.2 mg de proteína total por lugar de imunização, os pacientes vacinados com o Preparado Vacinai A receberam 0.6 mg de proteínas totais por lugar de imunização. Para ambos grupos os lugares de imunização foram 4. Todos os pacientes receberam terapia oncoespecífica, ao menos 4 semanas antes de iniciar o ensaio. As imunizações foram realizadas por via intramuscular, e continuaram acontecendo 1 vez de maneira mensal.
A resposta imune humoral de ambos grupos de pacientes foi avaliada através da obtenção do soro sanguíneo. A variável de valoração fundamental dos resultados foi o título de anticorpo específico contra o EGF. Este parâmetro foi determinado por meio de um sistema ELISA. Os valores positivos foram aquelas leituras de densidade óptica que estiveram 2 vezes acima do valor do controle negativo. O título de anticorpo reportado significa a maior diluição dos soros positivos.
A análise da resposta imune para os pacientes integrantes de cada grupo representado na tabela 6 demonstrou que a média geométrica do titulo de anticorpos máximo para o grupo de paciente imunizados com o Preparado Vacinai A corresponde a 1:56421, enquanto para o grupo de pacientes imunizados com o Preparado Vacinai B a média geométrica do titulo de anticorpo máximo foi de 1:23515. Isto significa que o preparado vacinai descrito na presente invenção produziu um aumento 2 vezes maior da média geométrica do título de anticorpos anti EGF máximo em relação ao atingido com o preparado vacinai B.
Historicamente os pacientes não imunizados mostram um título anti-EGF autólogo de 1:500. Por isso o preparado vacinai descrito na presente invenção (Preparado Vacinai A) provoca um aumento de pelo menos 100 vezes o título de anticorpos anti-EGF em sujeitos imunizados.
| | Total de pacientes | Média geométrica | |
| | Preparado Vacinai A | 1 11 | 56421 |
| | Preparado Vacinai B | ! 9 | 23515 |
Tabela 6. Resultado da análise da média geométrica da imunogenicidade de ambos preparados vacinais medida através do título de anticorpos anti-EGF no soro dos pacientes.
E importante destacar que o grupo de pacientes imunizados com o Preparado Vacinai A, descrito na presente invenção, mostraram uma média geométrica superior ao título do anticorpo anti-EGF recebendo a metade da quantidade de proteínas totais por imunização (2.4 mg) que a recebida pelo grupo de pacientes imunizados com o Preparado Vacinai B, que correspondeu à 4,8mg de proteínas totais, o que constitui um resultado surpreendente.
Estes resultados evidenciam que o excesso de proteína autóloga hrEGF, seja em forma de polímeros ou forma livre, não traz mais imunogenicidade ao preparado vacinai, senão que dilui a ação imunológica do conjugado químico hrEGF-rP64k.
EXEMPLO 4:
Obtenção do preparado vacinai descrito na presente invenção ajustado a diferentes potências (concentração de proteínas totais por vial).
Com o propósito de demonstrar a capacidade de obter preparados vacinais com diferentes potências (concentrações de proteínas totais por vial) realizou-se a metodologia de purificação como se descreve a seguir:
Ensaio 1: Ao concluir a diafiltração, concentrou-se o conjugado químico purificado até uma concentração final de proteínas de 2 mg/ML.
Ensaio 2: Ao concluir a diafiltração, concentrou-se o conjugado químico purificado até uma concentração final de proteínas de 5 mg/ML.
Ensaio 3: Ao concluir a diafiltração, concentrou-se o conjugado químico purificado até uma concentração final de proteínas de 12 mg/ML.
Em todos os ensaios o volume total de conjugado químico empregado foi 1500 ML, operou-se a uma pressão transmembrana de 1,5 bar e foram realizadas 7 mudanças de solução tampão durante a diafiltração. Para a realização desta avaliação, estabeleceram-se dois critérios de seleção: O primeiro foi atingir um por cento de homogeneidade do preparado vacinai > 80%. O segundo critério foi a não presença de precipitados de proteínas durante a operação de purificação.
Os resultados apresentados na tabela 7 mostram a obtenção de preparados vacinais ajustados a diferentes concentrações de proteínas por mililitro, garantindo elevados níveis de homogeneidade (90.92%,96.79% e, 95.50% de espécies conjugadas hrEGF- rP64k ) e sem produzir precipitação
| de proteínas nos mesmos. | |
| | Concentração Proteína | Porcentagem de homogeneidade do preparado vacinai | |
| 2 mg/mL | 92 00% |
| | 5 mg/mL | 96,79% | |
mg/mL | 95,50%
Tabela 7: Valores correspondentes à porcentagem de homogeneidade nos preparados vacinais ajustados a diferentes concentrações finais de proteínas.
EXEMPLO 5:
Remoção de glutaraldeído no preparado vacinai descrito na presente invenção.
Para avaliar a remoção do agente conjugante (glutaraldeído) quantificou-se o conteúdo de glutaraldeído residual no Preparado Vacinai B e no Preparado Vacinai A, mediante um método de separação cromatográfica por fase reversa (HPLC-RP) empregando uma coluna C-8. Este método requereu primeiramente, a precipitação da proteína contida nas mostras com ácido perclórico e depois uma reação com fenil-hidrazina.
A figura 7 mostra que o conteúdo residual desta impureza presente em ambos preparados vacinais foi menor, de 0,2 μg/ML ou menos de 0,002 ppm, (concentração limite superior estabelecida para esta impureza) partindo de uma concentração inicial de 530 mg/ML ou 530 ppm. Ainda que ambos preparados cumpram com a especificação estabelecida para esta impureza, a figura 7 ilustra que o preparado vacinai A obtido por aplicação do método de purificação do conjugado químico por membranas de Ultrafiltração, possui um conteúdo inferior de glutaraldeído, o que traz grande segurança para o paciente ao dito preparado vacinai.
Breve Descrição das Figuras.
Figura 1. Mostra-se a superposição do cromatograma de um conjugado homoligomérico rP64k- rP64k e do cromatograma de um conjugado químico EGF-P64k sem purificar. Encerrado no círculo, mostra-se a coincidência dos perfis entre ambos cromatogramas. O eixo X apresenta o tempo ao qual elui cada componente da mostra e o eixo Y representa o valor de intensidade a 216 nm de cada componente da mostra, como indicador da concentração de proteína na mesma.
Figura 2. Imunodetecção com um anticorpo anti EGF conjugado com fosfatase alcalina posterior à separação eletroforética em SDS- PAGE para preparado vacinai obtido por ultrafiltração.
Linha 1: Marcador de peso molecular, Linha 2 Preparado vacinai.
Figura 3. Mostra-se a superposição do cromatograma correspondente ao conjugado homoligomérico hrEGF-hrEGF e do cromatograma de um conjugado químico hrEGF-rP64k sem purificar. Dentro do círculo, mostra-se a coincidência de espécies entre ambos cromatogramas. O eixo X apresenta o tempo ao qual elui cada componente da mostra e o eixo Y representa o valor de intensidade a 216 nm de cada componente na mostra, como indicador da concentração de proteína na mesma.
Figura 4. Perfil cromatográfico correspondente ao preparado vacinai descrito na presente invenção. A área sombreada se corresponde com as espécies conjugadas hrEGF-rP64k. O eixo X apresenta o tempo ao qual elui cada fração e o eixo Y representa o valor de intensidade a 216 nm de cada componente na mostra, como indicador da concentração de proteína na mesma.
Figura 5. Mapa peptídico da fração cromatográfica correspondente ao conjugado hrEGF- rP64k. Apresentam-se os resultados obtidos para dois preparados vacinais purificados independentemente através de uma membrana de ultrafiltração. O eixo X representa o tempo e o eixo Y representa as unidades de mili-intensidade.
Figura 6: Títulos de anticorpos anti EGF em ratos imunizados com vários imunógenos: preparado vacinai convencional, preparado vacinai purificado por ultrafiltração e o permeado proveniente do método de purificação por ultrafiltração do preparado vacinai O eixo X corresponde as diluições realizadas ao soro obtido de cada animal e o eixo Y representa o valor de densidade óptica a 405 nm de cada mostra como indicador da concentração de proteína na mesma.
Figura 7: Perfil cromatográfico por HPLC-RP obtido durante a quantificação do conteúdo de glutaraldeído residual para o preparado vacinai obtido a partir do método de purificação empregando as membranas de ultrafiltração 50kDa (Preparado Vacinai A) e para o preparado vacinai obtido empregando o método de purificação por membrana de diálises (Preparado Vacinai B).
Claims (17)
- REIVINDICAÇÕES1. Composição vacinal cujo princípio ativo compreende um conjugado protéico hrEGF-rP64k, caracterizada pelo fato de que cada molécula da proteína rP64K tem ligada duas moléculas de hrEGF, e em que a dita composição vacinal compreende pelo menos 90% do princípio ativo sendo livre de outras espécies moleculares, como polímeros de hrEGF, hrEGF livre ou glutaraldeído.
- 2. Composição vacinal de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a razão do conjugado proteico entre a proteína carreadora rP64K e hrEGFé 12.04:24.05 nmolar.
- 3. Composição vacinal de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de queo conjugado hrEGF-rP64K adicionalmente contém um adjuvante apropriado, selecionado do grupo que compreende hidróxido de alumínio ou Montanide.
- 4. Composição vacinal de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que contém como adjuvante Montanide.
- 5. Composição vacinal de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que contém como adjuvante hidróxido de alumínio.
- 6. Composição vacinal de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o conjugado hrEGF-rP64K é capaz de induzir um aumento de pelo menos 10 vezes o título de anticorpos anti-EGF no soro mamíferos imunizados.
- 7. Composição vacinal de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o conjugado hrEGF-rP64K é capaz de induzir um aumento de pelo menos 10 vezes o título de anticorpos anti-EGF no soro de humanos.
- 8. Composição vacinal de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o conjugado hrEGF-rP64K é capaz de induzir um aumento de pelo menos 100 vezes o título de anticorpos anti-EGF no soroPetição 870190014360, de 12/02/2019, pág. 7/9 de humanos.
- 9. Processo para a obtenção da composição vacinal como definida na reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a dita reação de conjugação consiste de uma etapa única que se inicia misturando a proteína hrEGF concentrada previamente (>6 mg/ML) e a proteína P64k (= 1 mg/ML) no reator de conjugação, e então é adicionada à dita mistura proteica PBS/MgCl2 (pH 6.8-7.2) e a solução de conjugação de glutaraldeído 0,5%, a dita a mistura sendo mantida em agitação constante por 2 horas a 22°C ± 2°C de temperatura.
- 10. Processo para a obtenção da composição vacinal de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que os parâmetros de conjugação entre as proteínas hrEGF e rP64k garantem uma relação de conjugação de duas moléculas de hrEGF por cada molécula de rP64k.
- 11. Processo para a obtenção da composição vacinal de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que a proteína de conjugação é purificada por um processo de ultrafiltração/diafiltração usando uma membrana que pode estar no intervalo entre 50 e 100 kDa.
- 12. Processo para a obtenção da composição vacinal de acordo com a reivindicação 11, caracterizada pelo fato de que a proteína de conjugação é purificada por um processo de ultrafiltração/diafiltração usando uma membrana de 50 kDa.
- 13. Processo para a obtenção da composição vacinal de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que a proteína de conjugação é purificada por um processo de ultrafiltração/diafiltração usando uma membrana de 100 kDa.
- 14. Composição vacinal cujo princípio ativo é um conjugado protéico hrEGF-rP64k, caracterizada pelo fato de que a dita composição vacinal é purificada pelo processo como definido na reivindicação 12.
- 15. Composição vacinal cujo princípio ativo é um conjugadoPetição 870190014360, de 12/02/2019, pág. 8/9 protéico hrEGF-rP64k, caracterizada pelo fato de que a dita composição vacinal é purificada pelo processo como definido na reivindicação 13.
- 16. Composição vacinal cujo princípio ativo é um conjugado protéico hrEGF-rP64k de acordo com a reivindicação 14 ou 15, caracterizada5 pelo fato de que a concentração final de proteína total está em um intervalo entre 1 - 12 mg/mL.
- 17. Uso da composição vacinal como definida na reivindicação 14 ou 15, caracterizado pelo fato de que é para a fabricação de um medicamento para o tratamento de câncer de pulmão de origem epitelial.
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