BR112020015308A2

BR112020015308A2 - Proteínas f de rsv estabilizadas e usos das mesmas

Info

Publication number: BR112020015308A2
Application number: BR112020015308-7A
Authority: BR
Inventors: Lan Zhang; Arthur Fridman; Eberhard Durr; Andrew Bett
Original assignee: Merck Sharp & Dohme Corp.
Priority date: 2018-01-29
Filing date: 2019-01-24
Publication date: 2020-12-08
Also published as: AU2019212237A1; RU2020128445A3; US11566051B2; RU2020128445A; MX2020007945A; MA51230A; EP3746462A2; BR112020015308A8; US20210300971A1; US20230141153A1; CA3088546A1; WO2019147749A3; CN111655715A; KR20200115567A; WO2019147749A2; EP3746462A4; JP2021511356A

Abstract

a invenção se refere a proteínas f de rsv estáveis e composições imunogênicas contendo as mesmas, bem como a métodos de usar as composições imunogênicas e composições compreendendo as proteínas f de rsv.

Description

PROTEÍNAS F DE RSV ESTABILIZADAS E USOS DAS MESMAS CAMPO DA INVENÇÃO

[001] A presente invenção refere-se a proteínas F de RSV estáveis e composições imunogênicas contendo as mesmas, bem como a métodos de usar as composições imunogênicas e composições compreendendo as proteínas F de RSV.

REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDOS RELACIONADOS

[002] O presente pedido reivindica o benefício do pedido provisório US no. 62/623,184, depositado em 29 de janeiro de 2018, cujo teor é pelo presente incorporado por referência na íntegra.

REFERÊNCIA À LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS SUBMETIDA ELETRONICAMENTE

[003] A listagem de sequências do presente pedido é submetida eletronicamente através de EFS-Web como uma listagem de sequências formatadas por ASCIl com o nome de arquivo “24566WOPCT-SEQLIST- 18JAN2019 TXT”, data de criação de 18 de janeiro de 2019 e tamanho de 167 kb. Essa listagem de sequências submetida através de EFS-Web faz parte do relatório descritivo e é pelo presente incorporada por referência na íntegra.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[004] Vírus Sincicial respiratório (RSV) é um membro da família de pneumovírus. A infecção por RSV é a causa principal de infecção no trato respiratório inferior tanto em crianças pequenas como em adultos mais idosos (>65 anos). Atualmente, não há vacina licenciada disponível e opções terapêuticas são limitadas.

[005] O envoltório de RSV contém três glicoproteínas de superfície: F, Ge SH. As proteínas G e F são antígenos de proteção e alvos de anticorpos de neutralização. A proteína F, entretanto, é mais conservada através de cepas de RSV e tipos (A e B). F de RSV é uma proteína de fusão viral tipo | que rearranja estruturalmente a partir de uma forma pré-fusão metastável em uma forma pós- fusão altamente estável. Embora os alvos para neutralizar anticorpos monoclonais existam na conformação pós-fusão de proteína F, a resposta Ab de neutralização se dirige principalmente à conformação pré-fusão de proteína F em pessoas naturalmente infectadas com RSV (Magro M et al., Proc. Natl Acad Sci U S A; 109(8):3089-94, 2012; Ngwuta JO et al., Sci Transl Med 2015; 7(309):309ra162). Portanto, proteína F de RSV criada estabilizada em sua conformação pré-fusão tem sido uma estratégia atraente para desenvolver antígenos de vacina F de RSV. Por exemplo, um trímero F de RSV recombinante incluindo as substituições “DS-Cavl” (155C, 290C, 190F e 207L) foi anteriormente mostrado como eliciando resposta imune de neutralização em modelos de animais que é maior que a resposta observada para imunógenos RSV baseados em F pós-fusão (McLellan et al., Science, 342: 592-598, 2013). São descritos na presente invenção novos antígenos RSV que são ainda mais estáveis na forma pré-fusão de interesse.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[006] A presente invenção fornece um trímero F de vírus sincicial respiratório (RSV) recombinante, compreendendo: três peptídeos F de RSV recombinantes cada compreendendo uma deleção de aminoácidos F de RSV do tipo selvagem nas posições 98 a 146 e um ligante de oito a quatorze aminoácidos de aminoácido F de RSV do tipo selvagem nas posições 97 e 147, em que os peptídeos F recombinantes compreendem as seguintes modificações para estabilizar o trímero F de RSV recombinante em uma conformação pré-fusão: (i) substituições de aminoácidos 190F e 207L, (ii) substituições de aminoácidos 155C e 290C e uma (ou mais) de (a) substituições de aminoácidos 486C e 490C; (b) substituições de aminoácidos 180C e 186C; (c) substituições de aminoácidos 486C e 490C; (d) substituições de aminoácidos 512C e 513C; (e) uma substituição de aminoácido 505C; e (f) uma deleção de aminoácidos 482 a 513 de F de RSV do tipo selvagem. Em uma modalidade, cada peptídeo F de RSV compreende adicionalmente no C-terminal uma deleção do domínio transmembrana de F de RSV do tipo selvagem e domínio citoplásmico (por exemplo, compreende no C- terminal uma deleção de aminoácidos 525 a 574 de F de RSV do tipo selvagem). Em uma modalidade adicional, cada peptídeo F de RSV compreende uma deleção de aminoácidos 514 a 574 de F de RSV do tipo selvagem.

[007] Em uma modalidade do trímero F de RSV recombinante, cada dos peptídeos R recombinantes compreende adicionalmente uma sequência foldon no C-terminal de cada peptídeo. Em uma modalidade adicional, a sequência do domínio foldon começa no C-terminal do peptídeo e substitui o domínio transmembrana F de RSV do tipo selvagem e domínio citoplásmico (por exemplo, o domínio foldon substitui aminoácidos 525 a 574 de F de RSV do tipo selvagem). Em uma modalidade adicional, a sequência do domínio foldon começa após a posição de aminoácido 513 de F de RSV do tipo selvagem (isto é, a sequência de Ffoldon substitui aminoácidos 514 a 574 do RSV-F do tipo selvagem). Em outra modalidade, quando os peptídeos F de RSV contêm uma deleção adicional de aminoácidos 482 a 513 de F de RSV do tipo selvagem, a sequência do domínio Ffoldon começa após a posições de aminoácido 481 de F de RSV do tipo selvagem (vide, por exemplo, SEQID NO: 44). Em algumas modalidades, a sequência foldon compreende SEQ ID NO: 8.

[008] EM uma modalidade do trímero F de RSV, os peptídeos F recombinantes compreendem, cada, as substituições de aminoácidos 190F e 207L, as substituições de aminoácidos 155C e 290C, as substituições de aminoácidos 486C e 490C, e a deleção de aminoácidos 514 a 574 de F de RSV do tipo selvagem. Em uma modalidade, cada peptídeo F recombinante compreende adicionalmente uma ligação de dissulfeto intra peptídeo não nativa entre cisteínas introduzidas pelas substituições de aminoácidos 155C e 290C. Em outra modalidade, o trímero F de RSV compreende uma ou mais ligação de dissulfeto inter peptídeo não nativa entre cisteínas introduzidas pelas substituições de aminoácidos 486C e 490C. Em uma modalidade adicional, o C-terminal dos peptídeos F de RSV recombinantes compreende, cada, uma sequência de um domínio foldon. Em outra modalidade, a sequência do domínio foldon compreende SEQ ID NO: 8.

[009] EM uma modalidade do trímero F de RSV, os peptídeos F recombinantes compreendem, cada as substituições de aminoácidos 190F e 207L, as substituições de aminoácidos 155C e 290C, as substituições de aminoácidos 180C e 186C e a deleção de aminoácidos 514 a 574 de F de RSV do tipo selvagem. Em uma modalidade, cada peptídeo F de RSV recombinante compreende adicionalmente uma ligação de dissulfeto intra peptídeo não nativa entre cisteínas introduzidas pelas substituições de aminoácidos 155C e 290C e/ou uma ligação de dissulfeto intra peptídeo não nativa entre cisteínas introduzidas pelas substituições de aminoácidos 190C e 186C. Em uma modalidade adicional, o C-terminal dos peptídeos F de RSV recombinantes compreende, cada, uma sequência de um domínio foldon. Em outra modalidade, a sequência do domínio foldon compreende SEQ ID NO: 8.

[0010] Em uma modalidade do trímero F de RSV recombinante, os peptídeos F recombinantes compreendem, cada as substituições de aminoácidos 190F e 207L, as substituições de aminoácidos 155C e 290C, as substituições de aminoácidos 486C e 489C, e a deleção de aminoácidos 514 a 574 de F de RSV do tipo selvagem. Em uma modalidade, cada peptídeo F de RSV recombinante compreende adicionalmente uma ligação de dissulfeto intra peptídeo não nativa entre cisteínas introduzidas pelas substituições de aminoácidos 155C e 290C. Em outra modalidade, o trímero F de RSV compreende uma ligação de dissulfeto inter peptídeo não nativa entre cisteínas introduzidas pelas substituições de aminoácidos 486C e 489C. Em uma modalidade adicional, o C-terminal dos peptídeos RSVF recombinantes compreende, cada, uma sequência de um domínio foldon. Em outra modalidade, a sequência do domínio foldon compreende SEQ ID NO: 8.

[0011] Em uma modalidade do trímero RSV, os peptídeos F recombinantes compreendem cada as substituições de aminoácidos 190F e 207L, as substituições de aminoácidos 155C e 290C, as substituições de aminoácidos 512C e 513C, e a deleção de aminoácidos 514 a 574 de F de RSV do tipo selvagem. Em uma modalidade, cada peptídeo F de RSV recombinante compreende adicionalmente uma ligação de dissulfeto intra peptídeo não nativa entre cisteínas introduzidas pelas substituições de aminoácidos 155C e 290C. Em outra modalidade, o trímero F de RSV compreende uma ligação de dissulfeto inter peptídeo não nativa entre cisteínas introduzidas por substituições de aminoácidos 512C e 513C. Em uma modalidade adicional, o C-terminal dos peptídeos F de RSV recombinantes compreende cada uma sequência de um domínio foldon. Em outra modalidade, a sequência do domínio foldon compreende SEQ ID NO: 8.

[0012] EM uma modalidade do trímero F de RSV recombinante, os peptídeos F recombinantes compreendem, cada substituições de aminoácidos 190F e 207L, as substituições de aminoácidos 155C e 290C, a substituição de aminoácido 505C e a deleção de aminoácidos 514 a 574 de RSV D do tipo selvagem. Em outra modalidade, cada peptídeo de F de RSV recombinante compreende adicionalmente uma ligação de dissulfeto intra peptídeo não nativa entre cisteínas introduzidas pelas substituições de aminoácidos 155C e 290C. Em uma modalidade adicional, o C-terminal dos peptídeos F de RSV recombinantes compreende cada uma sequência de um domínio foldon. Em outra modalidade,

a sequência do domínio foldon compreende SEQ ID NO: 8.

[0013] Em uma modalidade do trímero F de RSV recombinante, os peptídeos F recombinantes compreendem cada as substituições de aminoácidos 190F e 207L, as substituições de aminoácidos 155C e 290C e a deleção de aminoácidos 482 a 513 de F de RSV do tipo selvagem, bem como a deleção de aminoácidos 514 a 574 de F de RSV do tipo selvagem. Em uma modalidade, cada peptídeo F de RSV recombinante compreende adicionalmente uma ligação de dissulfeto intra peptídeo não nativa entre cisteínas introduzidas pelas substituições de aminoácidos 155C e 290C. Em uma modalidade adicional, o C- terminal dos peptídeos F de RSV recombinantes compreende cada uma sequência de um domínio foldon. Em outra modalidade, a sequência do domínio foldon compreende SEQ ID NO: 8.

[0014] Em uma modalidade, o ligante tem oito (8), dez (10), doze (12) ou quatorze (14) aminoácidos de comprimento. Em uma modalidade, o ligante compreende a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 46. Em outra modalidade, o ligante tem a sequência de aminoácidos como estabelecida em qualquer das SEQ ID NOs: 1,2, 3 ou 4.

[0015] Em uma modalidade, os peptídeos F recombinantes do trímero F de RSV, cada, compreendem, consistem essencialmente na, ou consistem na, sequência de aminoácidos madura como estabelecida na SEQID NO: 22. Em uma modalidade, os peptídeos F recombinantes do trímero F de RSV, cada, compreendem, consistem essencialmente na, ou consistem na, sequência de aminoácidos madura como estabelecida na SEQID NO: 24. Em uma modalidade, os peptídeos F recombinantes do trímero F de RSV, cada, compreendem, consistem essencialmente na, ou consistem na, sequência de aminoácidos madura como estabelecida na SEQID NO 26. Em uma modalidade, os peptídeos F recombinantes do trímero F de RSV, cada, compreendem, consistem essencialmente na, ou consistem na, sequência de aminoácidos madura como estabelecida na SEQ ID NO 28. Em uma modalidade, os peptídeos F recombinantes do trímero F de RSV, cada, compreendem, consistem essencialmente na, ou consistem na, sequência de aminoácidos madura como estabelecida na SEQ ID NO: 30. Em uma modalidade, os peptídeos F recombinantes do trímero F de RSV, cada, compreendem, consistem essencialmente na, ou consistem na, sequência de aminoácidos madura como estabelecida na SEQ ID NO: 44.

[0016] A presente invenção também fornece uma composição imunogênica de RSV compreendendo um trímero F de vírus sincicial respiratório (RSV) recombinante, compreendendo: três peptídeos F de RSV recombinantes cada compreendendo uma deleção de aminoácidos de F de RSV do tipo selvagem nas posições 98-146 e um ligante de oito a quatorze aminoácidos de aminoácidos de F de RSV do tipo selvagem nas posições 97 e 147, em que os peptídeos F recombinantes compreendem as seguintes modificações para estabilizar o trímero F de RSV recombinante em uma conformação pré-fusão: (i) substituições de aminoácidos 190F e 207L, (ii) substituições de aminoácidos 155C e 290C, e uma (ou mais) de (a) substituições de aminoácidos 486C e 490C; (b) substituições de aminoácidos 180C e 186C; (c) substituições de aminoácidos 486C e 489C; (d) substituições de aminoácidos 512C e 513C; (e) uma substituição de aminoácido 505C; e (f) uma deleção de aminoácidos 482 a 513 de F de RSV do tipo selvagem. Em uma modalidade, cada peptídeo F de RSV compreende adicionalmente no C-terminal uma deleção do domínio transmembrana F de RSV do tipo selvagem e domínio citoplásmico (por exemplo, (por exemplo, compreende no c-terminal uma deleção de aminoácidos 525 a 574 de F de RSV do tipo selvagem). Em uma modalidade adicional, cada peptídeo F de RSV compreende uma deleção de aminoácidos 514 a 574 de F de RSV do tipo selvagem.

[0017] EM uma modalidade da composição imunogênica, cada dos peptídeos F recombinantes compreende adicionalmente uma sequência foldon no C-terminal de cada peptídeo. Em uma modalidade adicional, a sequência do domínio foldon começa após a posição de aminoácidos 513 de F de RSV do tipo selvagem (isto é a sequência foldon substitui aminoácidos 514 a 574 de RSV-F do tipo selvagem). Em outra modalidade, quando os peptídeos F de RSV contêm uma deleção adicional de aminoácidos 482 a 513 de F de RSV do tipo selvagem, a sequência do domínio foldon começa após a posição de aminoácido 481 de F de RSV do tipo selvagem (vide, por exemplo, SEQ ID NO: 44). Em algumas modalidades, a sequência foldon compreende SEQ ID NO: 8.

[0018] Em uma modalidade da composição imunogênica, o trímero F de RSV é qualquer dos trímeros RSV descritos na presente invenção. Em outra modalidade da composição imunogênica, os peptídeos F recombinantes do trímero F de RSV compreendem, cada, consistem essencialmente na ou consistem na sequência de aminoácidos madura como estabelecida em qualquer das SEQ ID NO: 22, 24, 26, 28, 30 e 44.

[0019] A presente invenção também fornece um peptídeo RSV que compreende uma deleção de aminoácidos F de RSV do tipo selvagem nas posições 98-146 e um ligante de oito a quatorze aminoácidos de F de RSV do tipo selvagem nas posições 97 e 147, e modificações adicionais para estabilizar um trímero F de RSV recombinante contendo três de tais peptídeos RSV recombinantes na conformação pré-fusão. Tais modificações adicionais no peptídeo RSV de cadeia única compreendem: (i) substituições de aminoácidos 190F e 207L, (ii) substituições de aminoácidos 155C e 290C, e uma (ou mais) de (a) substituições de aminoácidos 486C e 490C; (b) substituições de aminoácidos 180C e 186C; (c) substituições de aminoácidos 486C e 489C; (d) substituições de aminoácidos 512C e 513C; (e) uma substituição de aminoácido 505C; e (f) uma deleção de aminoácidos 482 a 513 de F de RSV do tipo selvagem. Em uma modalidade, o peptídeo F de RSV compreende adicionalmente no C-terminal uma deleção do domínio transmembrana F de RSV do tipo selvagem e domínio citoplásmico (por exemplo, compreende no c-terminal uma deleção de aminoácidos 525 a 574 de F de RSV do tipo selvagem). Em uma modalidade adicional, o peptídeo F de RSV compreende uma deleção de aminoácidos 514 a 574 de F de RSV do tipo selvagem.

[0020] EM uma modalidade, o peptídeo F de RSV compreende adicionalmente uma sequência foldon no C-terminal. Em uma modalidade adicional, a sequência do domínio foldon começa após a posição de aminoácido 513 de F de RSV do tipo selvagem (isto é, a sequência foldon substitui aminoácidos 514 a 574 de RSV-F do tipo selvagem). Em outra modalidade, quando o peptídeo F de RSV contém uma deleção adicional de aminoácidos 482 a 513 de F de RSV do tipo selvagem, a sequência do domínio foldon começa após a posição de aminoácido 482 de F de RSV do tipo selvagem (vide, por exemplo, SEQ ID NO: 44). Em algumas modalidades, a sequência foldon compreende SEQ. ID NO:8.

[0021] EM uma modalidade, o peptídeo F de RSV compreende as substituições de aminoácidos 190F e 207L, as substituições de aminoácidos 155C e 290C, as substituições de aminoácidos 486C e 490C, e a deleção de aminoácidos 514 a 574 de F de RSV do tipo selvagem. Em uma modalidade, o peptídeo F de RSV compreende adicionalmente uma ligação de dissulfeto intra peptídeo não nativa entre cisteínas introduzidas pelas substituições de aminoácidos 155C e 290C. Em uma modalidade adicional, o C-terminal do peptídeo F de RSV compreende uma sequência de um domínio foldon. Em outra modalidade, a sequência do domínio foldon compreende SEQ ID NO: 8.

[0022] EM uma modalidade, o peptídeo F de RSV compreende as substituições de aminoácidos 190F e 207L, as substituições de aminoácidos 155C e 290C, as substituições de aminoácidos 180C e 186C, e a deleção de aminoácidos 514 a 574 de F de RSV do tipo selvagem. Em uma modalidade, o peptídeo F de RSV compreende adicionalmente uma ligação de dissulfeto intra peptídeo não nativa entre cisteínas introduzidas pelas substituições de aminoácidos 155C e 290C e/ou uma ligação de dissulfeto intra peptídeo não nativa entre cisteínas introduzidas pelas substituições de aminoácidos 190C e 186C. Em uma modalidade adicional, o C-terminal do peptídeo F de RSV compreende uma sequência de um domínio foldon. Em outra modalidade, a sequência do domínio foldon compreende SEQ ID NO: 8.

[0023] EM uma modalidade, o peptídeo F de RSV compreende as substituições de aminoácidos 190F e 207L, as substituições de aminoácidos 155C e 290C, as substituições de aminoácidos 486C e 489C, e a deleção de aminoácidos 514 a 574 de F de RSV do tipo selvagem. Em uma modalidade, o peptídeo F de RSV compreende adicionalmente uma ligação de dissulfeto intra peptídeo não nativa entre cisteínas introduzidas pelas 155C e 290C substituições de aminoácidos. Em uma modalidade adicional, o C-terminal do peptídeo F de RSV compreende uma sequência de um domínio foldon. Em outra modalidade, a sequência do domínio foldon compreende SEQ ID NO: 8.

[0024] EM uma modalidade, o peptídeo F de RSV compreende as substituições de aminoácidos 190F e 207L, as substituições de aminoácidos 155C e 290C, as substituições de aminoácidos 512C e 513C, e a deleção de aminoácidos 514 a 574 de F de RSV do tipo selvagem. Em uma modalidade, o peptídeo F de RSV compreende adicionalmente uma ligação de dissulfeto intra peptídeo não nativa entre cisteínas introduzidas pelas 155C e 290C substituições de aminoácidos. Em uma modalidade adicional, o C-terminal do peptídeo F de

RSV compreende uma sequência de um domínio foldon. Em outra modalidade, a sequência do domínio foldon compreende SEQ ID NO: 8.

[0025] EM uma modalidade, o peptídeo F de RSV compreende as substituições de aminoácidos 190F e 207L, as substituições de aminoácidos 155C e 290C, a substituição de aminoácido 505C e a deleção de aminoácidos 514 a 574 de F de RSV do tipo selvagem. Em outra modalidade, o peptídeo F de RSV compreende adicionalmente uma ligação de dissulfeto intra peptídeo não nativa entre cisteínas introduzidas pelas 155C e 290C substituições de aminoácidos. Em uma modalidade adicional, o C-terminal do peptídeo F de RSV compreende uma sequência de um domínio foldon. Em outra modalidade, a sequência do domínio Ffoldon compreende SEQ ID NO: 8.

[0026] EM uma modalidade, o peptídeo F de RSV compreende as substituições de aminoácidos 190F e 207L, as substituições de aminoácidos 155C e 290C e a deleção de aminoácidos 482 a 513 de F de RSV do tipo selvagem, bem como a deleção de aminoácidos 514 a 574 de F de RSV do tipo selvagem. Em uma modalidade, o peptídeo F de RSV compreende adicionalmente uma ligação de dissulfeto intra peptídeo não nativa entre cisteínas introduzidas pelas 155C e 290C substituições de aminoácidos. Em uma modalidade adicional, o C-terminal do peptídeo F de RSVs compreende cada uma sequência de um domínio foldon. Em outra modalidade, a sequência do domínio foldon compreende SEQ ID NO:

8.

[0027] Em uma modalidade, o ligante tem oito (8), dez (10), doze (12) ou quatorze (14) aminoácidos de comprimento. Em uma modalidade, o ligante compreende a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 46. Em outra modalidade, o ligante tem a sequência de aminoácidos como estabelecida em qualquer das SEQ ID NOs: 1,2, 3 ou 4.

[0028] Em uma modalidade, o peptídeo F de RSV compreende, consiste essencialmente na, ou consiste na, sequência de aminoácidos madura como estabelecida na SEQ ID NO: 22. Em uma modalidade, o peptídeo F de RSV compreende, consiste essencialmente na, ou consiste na, sequência de aminoácidos madura como estabelecida na SEQID NO: 24. Em uma modalidade, o peptídeo F de RSVs compreende, consiste essencialmente na, ou consiste na, sequência de aminoácidos madura como estabelecida na SEQID NO 26. Em uma modalidade, o peptídeo F de RSV compreende, consiste essencialmente na, ou consiste na, sequência de aminoácidos madura como estabelecida na SEQID NO

28. Em uma modalidade, o peptídeo F de RSV compreende, consiste essencialmente na, ou consiste na, sequência de aminoácidos madura como estabelecida na SEQ ID NO: 30. Em uma modalidade, o peptídeo F de RSV compreende, consiste essencialmente na, ou consiste na, sequência de aminoácidos madura como estabelecida na SEQ ID NO: 44.

[0029] Em uma modalidade, o peptídeo RSV, quando produzido de modo recombinante, forma um trímero F de RSV, como descrito na presente invenção.

[0030] A presente invenção também fornece uma molécula de ácido nucleico isolado codificando um peptídeo RSV de cadeia única como descrito na presente invenção. Em uma modalidade, a molécula de ácido nucleico isolado é uma molécula de DNA. A presente invenção fornece adicionalmente um vetor compreendendo a molécula de ácido nucleico.

[0031] A presente invenção também fornece um método de fazer um trímero F de vírus sincicial respiratório (RSV) como descrito na presente invenção, o método compreendendo (i) expressar a molécula de ácido nucleico ou o vetor, cada descrito acima, e (ii) purificar um trímero F de RSV recombinante produzido a partir do mesmo.

[0032] A presente invenção também fornece moléculas de anticorpo, incluindo anticorpos de comprimento total e derivados de anticorpo,

direcionados contra o trímero F de RSV descrito na presente invenção, ou contra os peptídeos F de RSV descritos na presente invenção.

[0033] Em algumas modalidades, a composição imunogênica é formulada com um adjuvante. Em uma modalidade, o adjuvante é um adjuvante de alumínio. Em algumas modalidades, o adjuvante de alumínio é MAA ou MAPA.

[0034] Em algumas modalidades, o trímero F de RSV recombinante ou peptídeos F de RSV, cada descrito na presente invenção, é formulado com uma nanopartícula de lipídeo (LNP) compreendendo um lipídeo catiônico, um lipídeo modificado por PEG, um esterol e um lipídeo não catiônico.

[0035] Algumas modalidades da presente invenção proveem métodos de uma resposta imune específica para F de RSV em um indivíduo, compreendendo administrar ao indivíduo qualquer das composições imunogênicas descritas na presente invenção ou os trímeros F de RSV recombinantes como descrito na presente invenção, em uma quantidade eficaz para produzir uma resposta imune específica para F de RSV. Em algumas modalidades, a resposta imune específica de antígeno compreende uma resposta de célula T ou uma resposta de célula B.

[0036] Em algumas modalidades, o método compreende administrar a um indivíduo uma dose única (sem dose de reforço) de uma composição imunogênica, ou um trímero F de RSV, como descrito na presente invenção. Em outra modalidade, o método compreende adicionalmente administrar ao indivíduo uma segunda dose (reforço) de uma composição imunogênica, ou um trímero F de RSV, como descrito na presente invenção. Em outra modalidade, o método compreende adicionalmente administrar pelo menos uma dose de reforço do trímero F de RSV ou composição imunogênica de RSV. Doses adicionais podem ser administradas.

[0037] Em algumas modalidades, a composição imunogênica de RSV, ou trímero F de RSV, é administrada a um indivíduo por injeção intradérmica, injeção intramuscular ou por administração intranasal. Em algumas modalidades, uma vacina RSV é administrada a um indivíduo por injeção intramuscular.

[0038] Em algumas modalidades, o trímero F de RSV, ou composição imunogênica, imuniza o indivíduo contra RSV por até 1 ou 2 anos. Em algumas modalidades, o trímero F de RSV, ou composição imunogênica, imuniza o indivíduo contra RSV por mais de 2 anos, mais de 3 anos, mais de 4 anos ou por 5-10 anos. Em uma modalidade, a composição imunogênica é administrada como uma vacina anualmente.

[0039] Em algumas modalidades, o indivíduo tem cerca de 5 anos de idade ou menos. Por exemplo, o indivíduo pode estar entre 1 ano e cerca de 5 anos (por exemplo, cerca de 1, 2, 3, 4 ou 5 anos), ou entre cerca de 6 meses e cerca de 1 ano (por exemplo, cerca de 6, 7, 8, 9, 10, 11 ou 12 meses). Em algumas modalidades, o indivíduo tem cerca de 12 anos ou menos (por exemplo, 12, 11, 10, 9, 8,7, 6, 5, 4, 3, 2 meses ou 1 mês). Em algumas modalidades, o indivíduo tem cerca de 6 meses ou menos.

[0040] Em algumas modalidades, o indivíduo nasceu a termo (por exemplo, cerca de 37 a 42 semanas). Em algumas modalidades, o indivíduo nasceu prematuro, por exemplo, cerca de 36 meses de gestação ou menos (por exemplo, cerca de 36, 35, 34, 33, 32, 31, 30, 29, 28, 27, 26 ou 25 semanas). Por exemplo, o indivíduo pode ter nascido com cerca de 32 semanas de gestação ou menos. Em algumas modalidades, o indivíduo nasceu prematuramente entre cerca de 32 semanas e cerca de 36 semanas de gestação. Em tais indivíduos, uma vacina pode ser administrada mais tarde em vida, por exemplo, na idade de cerca de 6 meses até cerca de 5 anos ou mais velho.

[0041] Em algumas modalidades, o indivíduo é um adulto jovem entre cerca de 20 anos e cerca de 50 anos (por exemplo, 20, 25, 30, 35, 40, 45 ou 50 anos de idade).

[0042] Em algumas modalidades, o indivíduo é um indivíduo idoso com cerca de 50 a 60 anos de idade, 60 anos de idade, cerca de 70 anos de idade ou mais idoso, 80 anos de idade ou mais velho, 90 anos ou mais velho (por exemplo, cerca de 60, 65, 70, 75, 80, 85 ou 90 anos de idade). Em algumas modalidades, o indivíduo é imunocomprometido (por exemplo, tem um distúrbio imune ou distúrbio autoimune).

[0043] EM algumas modalidades, a mulher está grávida quando administrada a composição imunogênica de RSV. Em algumas modalidades, o indivíduo tem uma doença pulmonar crônica, como doença pulmonar obstrutiva crônica (COPD) ou asma.

[0044] Em algumas modalidades, o indivíduo foi exposto a RSV, está infectado com (tem) RSV, ou está em risco de infecção por RSV.

[0045] Os detalhes das várias modalidades da invenção são estabelecidas na descrição abaixo. Outras características, objetos e vantagens da invenção serão evidentes a partir da descrição e das reivindicações.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[0046] Os objetos, características e vantagens acima e outros serão evidentes a partir da seguinte descrição de modalidades específicas da invenção, como ilustrado nos desenhos em anexo nos quais caracteres de referência similares se referem às mesmas partes do início ao fim das diferentes vistas. Os desenhos não estão necessariamente em escala, ênfase ao invés sendo colocada na ilustração dos princípios de várias modalidades da invenção.

[0047] As figuras 1A e 1B mostram ligação de sobrenadantes de cultura de células pós-transfecção de dia 7 recentemente colhidas (supe) de LZF40 (DS- Cav1 com um ligante 8 a.a.) (figura 1A) ou aqueles armazenados a 4ºC por 8 dias

(figura 1B) a D25 e anticorpos monoclonais Synagisº (palivizumabe).

[0048] As figuras 2A — 2F mostram ligação de sobrenadantes de cultura de células pós-transfecção de dia 3 recentemente colhidas (supe) de LZF55 (F55), LZF 56 (F56) e LZF57 (F57) (DS-Cavl com um ligante 10, 12 ou 14 a.a., respectivamente; figura 2A, 2B e 2C, respectivamente) ou aqueles armazenados a 4ºC por 7 dias (figuras2D, 2E e 2F, respectivamente) a D25 e Synagisº (palivizumabe).

[0049] A figura 3 mostra os resultados de um western blot com soros anti- F de RSV para mutantes RSV de cadeia única LZF55, LZF56 e LZF57 em comparação com DS-Cav1.

[0050] As figuras 4A — 4€ mostram ligação de sobrenadantes de cultura de células recentemente colhidas de DS-Cav1 (figura 44), LXF57 (figura 4B) ou LZF111 (figura 4C) com anticorpos monoclonais D25 e 4D7 como determinado por ELISA. A figura 4D mostra DS-Cav1 purificado, F57 e F111 analisado por SDS- PAGE sob condições de redução (R) ou não redução (NR).

[0051] As figuras 5A e 5B mostram os espectros CD de LZF111 e DS-Cav1, respectivamente.

[0052] A figura 6 mostra análise de estrutura secundária por reconstrução dos espectros CD (185 nm a 260 nm) de DS-Cav1 e LZF111 usando uma rede neural que foi treinada em espectros CD de proteínas com estrutura 3D decomposta.

[0053] A figura 7 mostra estabilidade térmica de LZF11 e DS-Cav1 purificados analisados por Fluorimetria de Varredura diferencial (DSF).

[0054] As figuras 8A-8E mostram a estabilidade de longo prazo de proteína de DS-Cav1 purificada ou LZF111 armazenados congelados ou a 4ºC por 1 (figuras 8A-8C), 2 (figura 8D), ou 3 (figura 8E) meses, como avaliado por ligação com D25, 4D7 e Synagisº (palivizumabe) em um ensaio de ligação ELISA.

[0055] As figuras 9A e 9B mostram títulos ELISA ED10 de soros de camundongos PD2 contra proteína F de pré-fusão (figura 9A) e títulos de neutralização de soro de soros de camundongos PD2 contra cepa Long RSV (figura 9B). Linha tracejada horizontal indica limite de detecção. Os dados mostram que LZF111 induziu níveis similares de anticorpos de neutralização em comparação com DS-Cav1 através de doses diferentes.

[0056] A figura 10 expõe um diagrama esquemático de LZF111 (topo), DS- Cav1 (meio) e LSF57 (inferior).

[0057] A figura 11 expõe títulos de anticorpo de neutralização de soro (NTso Individual e GMT com intervalos de confiança de 95%) a RSV A induzido em ratos de algodão por vacinas de mRNA e Fórmulas de controle.

[0058] A figura 12 expõe títulos ELISA de competição de anticorpo de soro (ITso Individual e GMT com intervalos de confiança de 95%) contra D25 (sítio O), palivizumabe (sítio 11) e 4D7 (sítio |) medido no dia 56 (4 semanas PD2).

[0059] A figura 13 expõe conteúdo de RSV em Pulmão e Nariz após desafio de ratos de algodão com RSV A.

[0060] A figura 14 expõe títulos de anticorpo de neutralização de soro (NTso Individual e GMT com Intervalos de confiança de 95%) a RSV A induzido em Macacos Verdes africanos por vacinas MRNA e formulações de controle.

[0061] A figura 15 expõe títulos ELISA de competição de anticorpo de soro (IT5o Individual e GMT com Intervalos de confiança de 95%) contra D25 (sítio O), palivizumabe (sítio 11) e 4D7 (sítio 1) medido na semana 10 (2 semanas PD3).

[0062] As figuras 16A — 16C expõem conteúdo de RSV em fluido broncoalveolar (BAL) após desafio de AGMs. A figura 16 é imunização de dose alta. A figura 16B é imunização de dose baixa. A figura 16C mostra a área sob a curva.

[0063] As figuras 17A — 17C expõem o conteúdo de RSV em esfregaços de nariz após desafio de AGM;s. A figura 17A é imunização de alta dose. A figura 15B é imunização de dose baixa. A figura 17C mostra a área sob a curva.

[0064] A figura 18 expõe títulos de anticorpo de neutralização de soro (NTso Individual e GMT com Intervalos de confiança de 95%) a Marcados Green africanos experimentados com RSV A por vacinas mMRNA e formulações de controle.

[0065] A figura 19 expõe títulos ELISA de competição de anticorpo de soro (IT5o Individual e GMT com Intervalos de confiança a 95%) contra D25 (sítio O), palivizumabe (sítio 11) e 4D7 (sítio |) medido na semana 10 (2 semanas PD3).

DESCRIÇÃO DETALHADA

[0066] Proteína F de RSV é uma glicoproteína de fusão tipo | que é bem conservada entre isolados clínicos, incluindo entre os subgrupos antigênicos RSV-A e RSV-B. A proteína F faz transição entre estados pré-fusão e pós-fusão mais estável, desse modo facilitando a entrada em células alvo. Glicoproteína F de RSV é inicialmente sintetizada como uma proteína precursora Fo. F de RSVo se dobra em um trímero, que é ativado por clivagem de furina na proteína pré- fusão madura compreendendo subunidades F1 e F2 (Bolt, et al., Virus Res., 68:25, 2000). Proteína F de RSV estabilizada na conformação pré-fusão produz uma maior resposta imune de neutralização em modelos de animais do que aquela observada com proteína F de RSV estabilizada na conformação pós-fusão (McLellan et al., Science, 342: 592-598, 2013). Como tal, proteínas F de RSV pré- fusão estabilizadas são boas candidatas para inclusão em uma vacina de RSV. Ectodomínios de RSV solúveis estabilizados na conformação pré-fusão foram anteriormente gerados, incluindo as substituições “DS-Cav1l”. Vide WO 2014/160463A1 e WO 2017/172890A1, os teores de cada um são pelo presente incorporados por referência.

[0067] Foi anteriormente mostrado que o constructo de F de RSV estabilizado pré-fusão, DS-Cav1, é submetida a alterações de conformação e forma estruturas intermediárias após armazenagem de longa duração a 4ºC (Flynn JA et al., PLoS ONE 2016; 11(10): e0164789). A estabilidade de longa duração a 4ºC ou mais elevada é um atributo desejável para um antígeno de vacina de subunidade de F de RSV. São descritas na presente invenção modificações baseadas em estrutura adicionais para melhorar adicionalmente a estabilidade do trímero de F de RSV na conformação pré-fusão. Tais constructos têm estabilidade aumentada a 4ºC em comparação com DS-Cav1 enquanto retém imunogenicidade.

[0068] “Proteína de fusão RSV” e “proteína F de RSV”, cada como usado na presente invenção se refere a uma glicoproteína de envoltório RSV que facilita a fusão de membranas celulares e virais. Na natureza, a proteína F de RSV é sintetizada em um precursor de polipeptídeo único designado Fo, que inclui um peptídeo sinal que orienta a localização para o retículo endoplásmico, onde o peptídeo sinal é clivado. Os resíduos Fo restantes oligomerizam para formar um trímero e são processados proteoliticamente por uma protease em duas sequências de clivagem de furina conservadas para gerar dois fragmentos ligados por dissulfeto, F1 e F2. Na natureza, três peptídeos F2-F1 oligomerizam em um trímero para formar a proteína F madura, que adota uma conformação pré-fusão que é metastável e pode ser submetida a uma alteração de conformação para uma conformação pós-fusão.

[0069] “Domínio transmembrana F de RSV” corresponde ao domínio transmembrana de F de RSV do tipo selvagem (isto é, aminoácidos 525-550 da SEQ ID NO: 10).

[0070] “Domínio citoplásmico F de RSV” ou “cauda citoplásmica F de RSV” corresponde ao domínio de cauda citoplásmico de F de RSV do tipo selvagem (isto é, aminoácido 551-574 da SEQ ID NO: 10).

[0071] “D25” ou “anticorpo D25" como usado na presente invenção descreve um corpo de neutralização que se liga especificamente a peptídeos F de RSV pré-fusão. Esse anticorpo é descrito na Publicação do Pedido de patente US nº US 2010/0239593, cujo teor integral é pela presente incorporada por referência.

[0072] “Mutantes RSV de cadeia única” se referem a uma proteína F de RSV que foi modificada de modo que não inclua os sítios de clivagem de furina para que quando um mutante RSV de cadeia única é produzido em células, o peptídeo Fo não é clivado em cadeias F1 e F2 separadas. Um exemplo não limitador de um mutante RSV de cadeia única inclui posição 97 do polipeptídeo F> ligado à posição 97 à posição 147 do peptídeo F1 por um ligante flexível para gerar o mutante RSV de cadeia única.

[0073] “DS-Cav1”, “substituições de DS-Cavl”, cada como usados na presente invenção, se referem a modificações genéticas na proteína F de RSV, que contém as substituições “DS” 155C e 290C de modo a introduzir uma ligação de dissulfeto não nativa entre cisteínas introduzida pelas substituições (como substituições S155C e S290C) e as substituições “Cavl”, que incluem substituições de aminoácido de enchimento de cavidade 190F e 207L (como S190F e V207L). DS-Cav1 é descrito em WO 2014/160463, cujo teor na Íntegra é pela presente incorporado por referência.

[0074] “Domínio foldon” ou “foldon”, cada como usado na presente invenção, se refere a um domínio de trimerização de fibritina T4 que compreende uma sequência de aminoácidos que forma naturalmente uma estrutura trimérica. Em alguns exemplos, a sequência da proteína F de RSV é modificada para conter um domínio foldon. Em outros exemplos, os mutantes RSV de cadeia única contêm um domínio foldon. Um exemplo de um domínio de trimerização foldon compreende a sequência de aminoácidos como estabelecida na SEQ ID

NO: 8.

[0075] Como usado na presente invenção, um “peptídeo sinal” ou “sequência sinal” são sequências de aminoácido curtas que orientam proteínas de membrana ou secretórias recentemente sintetizadas para e através das membranas, e desse modo controlam universalmente a entrada da maioria das proteínas tanto em eucariotas como procariotas para a via secretória. O processamento de retículo endoplasmático produz proteínas maduras, em que o peptídeo sinal é clivado a partir das proteínas precursoras. Como mencionado na presente invenção, a “sequência de aminoácidos madura” não contém o peptídeo sinal. A sequência de aminoácido madura dos mutantes RSV de cadeia única não contém um peptídeo único. Além disso, o trímero RSV que compreende três mutantes RSV de cadeia única maduros não contém a sequência de peptídeo sinal.

[0076] Como usado na presente invenção, o termo “substituição”, “substituição de aminoácidos” ou “variante de substituição”, ao se referir a polipeptídeos é aquele que tem pelo menos um resíduo de aminoácido em uma sequência de partida ou nativa removida e um aminoácido diferente inserido em seu lugar na mesma posição. As substituições podem ser únicas, onde somente um aminoácido na molécula foi substituído, ou podem ser múltiplas, onde dois ou mais (por exemplo, 3, 4 ou 5) aminoácidos foram substituídos na mesma molécula. Por exemplo, como usado na presente invenção, referência a uma substituição “155C” em uma proteína F de RSV ou mutante F de RSV de cadeia única se refere à proteína F de RSV de cadeia única tendo um resíduo de cisteína na posição 155, cujo resíduo de cisteína foi substituído pelo resíduo nativo correspondente na posição 155 na proteína F de RSV. Como referência, SEQ ID NO: 10 é uma sequência de referência com relação ao local da substituição. Por exemplo, uma substituição “S155C” é uma substituição do S na posição 155 da

SEQ ID NO: 10 emum CC.

[0077] Polipeptídeos ou polinucleotídeos “isolados” são pelo menos parcialmente livres de outras moléculas biológicas a partir das células ou culturas de células nas quais são produzidos. Tais moléculas biológicas incluem outros ácidos nucleicos, proteínas, lipídeos, carboidratos ou outro material como resíduos celulares e meio de crescimento. Pode ser adicionalmente pelo menos isento de componentes do sistema de expressão como moléculas biológicas a partir de uma célula hospedeira ou do meio de crescimento das mesmas. Em geral, o termo “isolado” não pretende se referir a uma ausência total de tais moléculas biológicas ou a uma ausência de água, tampões ou sais ou a componentes de uma formulação farmacêutica que inclua os polipeptídeos ou polinucleotídeos.

[0078] Uma “variante de polipeptídeo” é uma molécula que difere em sua sequência de aminoácidos em relação a uma sequência nativa ou uma sequência de referência. Variantes de sequência de aminoácidos podem possuir substituições, deleções, inserções ou uma combinação de quaisquer dois ou três dos acima, em certas posições na sequência de aminoácidos, em comparação com uma sequência nativa ou uma sequência de referência. Comumente, variantes possuem pelo menos 50% de identidade para uma sequência nativa ou uma sequência de referência. Em algumas modalidades, variantes partilham pelo menos 80% de identidade ou pelo menos 90% de identidade com uma sequência nativa ou uma sequência de referência.

[0079] “Análogos” pretende incluir variantes de polipeptídeos que diferem em uma ou mais alterações de aminoácidos, por exemplo, substituições, adições ou deleções de resíduos de aminoácidos que mantêm adicionalmente uma ou mais das propriedades do polipeptídeo de origem ou de partida.

[0080] A presente invenção fornece vários tipos de composições que são à base de polinucleotídeo ou polipeptídeo, incluindo variantes e derivados. Esses incluem, por exemplo, variantes e derivados de substituição, de inserção, deleção e covalentes. O termo “derivado” é sinônimo do termo “variante” e se refere em geral a uma molécula que foi modificada e/ou alterada em algum modo em relação a uma molécula de referência ou uma molécula de partida.

[0081] Como tal, polinucleotídeos que codificam peptídeos ou polipeptídeos contendo substituições, inserções e/ou adições, deleções e modificações covalentes com relação a sequências de referência, em particular as sequências de polipeptídeo reveladas na presente invenção, são incluídos no escopo dessa invenção. Por exemplo, marcadores de sequência ou aminoácidos, como uma ou mais lisinas, podem ser adicionados a sequências de peptídeo (por exemplo, na extremidade N-terminal ou C-terminal). Marcadores de sequência podem ser usados para detecção, purificação ou localização de peptídeo. Lisinas podem ser usadas para aumentar solubilidade de peptídeo ou permitir biotinilação. Alternativamente, resíduos de aminoácidos localizados nas regiões de terminal amino e carboxi da sequência de aminoácidos de um peptídeo ou proteína podem ser opcionalmente deletados provendo sequências truncadas. Certos aminoácidos (por exemplo, resíduos de C-terminal ou resíduos de N- terminal) podem ser deletados alternativamente dependendo do uso da sequência, como por exemplo, expressão da sequência como parte de uma sequência maior que é solúvel ou ligada a um suporte sólido.

[0082] Como usado na presente invenção o termo “substituição de aminoácido conservativa” se refere à substituição de um aminoácido que está normalmente presente na sequência com um aminoácido diferente de tamanho, carga ou polaridade similar. Os exemplos de substituições conservativas incluem a substituição de um resíduo não polar (hidrofóbico) como isoleucina, valina e leucina por outro resíduo não polar. De modo semelhante, exemplos de substituições conservativas incluem a substituição de um resíduo polar (hidrofílico) por outro como entre arginina e lisina, entre glutamina e asparagina e entre glicina e serina. Adicionalmente, a substituição de um resíduo básico como lisina, arginina ou histidina por outro, ou a substituição de um resíduo ácido como ácido aspártico ou ácido glutâmico por outro resíduo ácido são exemplos adicionais de substituições conservativas. Os exemplos de substituições não conservativas incluem a substituição de um resíduo de aminoácido não polar (hidrofóbico) como isoleucina, valina, leucina, alanina, metionina por um resíduo polar (hidrofílico) como cisteína, glutamina, ácido glutâmico ou lisina e/ou um resíduo polar por um resíduo não polar.

[0083] Como usado na presente invenção ao se referir a polipeptídeos o termo “domínio” se refere a um motivo de um polipeptídeo tendo uma ou mais características ou propriedades estruturais ou funcionais identificáveis (por exemplo, capacidade de ligação, servindo como um sítio para interações de proteína-proteína).

[0084] Como usado na presente invenção ao se referir a polipeptídeos o termo “sítio” como se refere a modalidades baseadas em aminoácido é usado de modo sinônimo com “resíduo de aminoácido” e “cadeia secundária de aminoácido.” Como usado na presente invenção ao se referir a polinucleotídeos o termo “sítio” como se refere a modalidades baseadas em nucleotídeo é usado de modo sinônimo com “nucleotídeo”. Um sítio representa uma posição em um peptídeo ou polipeptídeo ou polinucleotídeo que pode ser modificado, manipulado, alterado, derivado ou variado nas moléculas baseadas em polipeptídeo ou baseadas em polinucleotídeo.

[0085] Como usado na presente invenção os termos “terminais” ou “terminal” ao se referirem a polipeptídeos ou polinucleotídeos se referem a uma extremidade de um polipeptídeo ou polinucleotídeo respectivamente. Tal extremidade não é limitada somente ao primeiro sítio ou sítio final do polipeptídeo ou polinucleotídeo, porém pode incluir aminoácidos adicionais ou nucleotídeos nas regiões terminais. Moléculas baseadas em polipeptídeo podem ser caracterizadas como tendo tanto um N-terminal (terminado por um aminoácido com um grupo amino livre (NH2)) como um C-terminal (terminado por um aminoácido com um grupo carboxila livre (COOH). Proteínas são em alguns casos compostas de múltiplas cadeias de polipeptídeo unidas por ligações de dissulfeto ou por forças não covalentes (multímeros, oligômeros). Essas proteínas têm múltiplos N- e C-terminais. Alternativamente, os terminais dos polipeptídeos podem ser modificados de modo que começam ou termina, conforme o caso, com uma fração não baseada em polipeptídeo como um conjugado orgânico.

[0086] Como reconhecido por técnicos no assunto, fragmentos de proteína, domínios de proteína funcionais e proteínas homólogas são também considerados como estando compreendidos no escopo de polipeptídeos de interesse. Por exemplo, é fornecido na presente invenção qualquer fragmento de proteína (significando uma sequência de polipeptídeo pelo menos um resíduo de aminoácido mais curta que uma sequência de polipeptídeo de referência, porém de outro modo idêntica) de uma proteína de referência tendo um comprimento de 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100 ou mais longo que 100 aminoácidos. Em outro exemplo, qualquer proteína que inclua um trecho de 20, 30, 40, 50, ou 100 aminoácidos (contíguos) que são 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idênticos a qualquer das sequências descritas na presente invenção pode ser utilizada de acordo com a invenção. Em algumas modalidades, um polipeptídeo inclui 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, ou mais mutações como mostrado em qualquer das sequências provida na presente invenção ou referenciadas na presente invenção. Em outro exemplo, qualquer proteína que inclua um trecho de 20, 30, 40, 50, ou 100 aminoácidos que são mais de 80%, 90%, 95%, ou 100% idênticos a qualquer das sequências descritas na presente invenção, em que a proteína tem um trecho de 5, 10, 15, 20, 25, ou aminoácidos que são menos de 80%, 75%, 70%, 65% a 60% idênticos a quaisquer das sequências descritas na presente invenção pode ser utilizada de acordo com a invenção.

[0087] Moléculas de polipeptídeo ou polinucleotídeo da presente invenção podem compartilhar certo grau de similaridade ou identidade de sequência com as moléculas de referência (por exemplo, polipeptídeos de referência ou polinucleotídeos de referência), por exemplo, com moléculas descritas na técnica (por exemplo, moléculas criadas ou projetadas ou moléculas do tipo selvagem). O termo “identidade”, como sabido na técnica, se refere a uma relação entre as sequências de dois ou mais polipeptídeos ou polinucleotídeos, como determinado por comparar as sequências. Na técnica, identidade também significa o grau de relação de sequência entre duas sequências como determinado pelo número de casamento entre séries de dois ou mais resíduos de aminoácidos ou resíduos de ácido nucleico. Identidade mede a porcentagem de casamentos idênticos entre a menor de duas ou mais sequências com alinhamentos de gap (caso haja) tratados por um programa de computador ou modelo matemático específico (por exemplo, “algoritmos”). Identidade de peptídeos relacionados pode ser prontamente calculada por métodos conhecidos. “% de identidade” como aplicado a sequências de polipeptídeo ou polinucleotídeo é definido como a porcentagem de resíduos (resíduos de aminoácidos ou resíduos de ácido nucleico) na sequência candidata de aminoácido ou ácido nucleico que são idênticos aos resíduos na sequência de aminoácidos ou sequência de ácidos nucleicos de uma segunda sequência após alinhar as sequências e introduzir lacunas, se necessário, para obter porcentagem máxima de identidade. Os métodos e programas de computador para o alinhamento são bem conhecidos na técnica. A identidade depende de um cálculo de porcentagem de identidade, porém pode diferir em valor devido a lacunas e penalidades introduzidas no cálculo. Em geral, variantes de um polinucleotídeo ou polipeptídeo específico têm pelo menos 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% porém menos que 100% de identidade de sequência para aquele polinucleotídeo ou polipeptídeo de referência específico como determinado por programas de alinhamento de sequência e parâmetros descritos na presente invenção e conhecidos por técnicos no assunto. Tais ferramentas para alinhamento incluem aquelas do BLAST suite (Stephen F. Altschul, et al. (1997)." Gapped BLAST e PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs," Nucleic Acids Res. 25:3389-3402). Outra técnica de alinhamento local popular se baseia no algoritmo de Smith-Waterman (Smith, T.F. & Waterman, M.S. (1981) “Identification of common molecular subsequences.” J. Mol. Biol. 147:195-197). Uma técnica de alinhamento global geral baseada em programação dinâmica é o algoritmo de Needleman—Wunsch (Needleman, S.B. & Wunsch, C.D. (1970) “A general method applicable to the search for similarities in the amino acid sequences of two proteins.” J. Mol. Biol. 48:443-453). Mais recentemente, um Fast Optimal Global Sequence Alignment Algorithm (FOGSAA) foi desenvolvido que supostamente produz alinhamento global de sequências de proteína e nucleotídeo mais rápido que outros métodos de alinhamento global ótimos, incluindo o algoritmo de Needleman-Wunsch. Outras ferramentas são descritas na presente invenção, especificamente na definição de “identidade” abaixo.

[0088] Como usado na presente invenção, o termo “homologia” se refere a relação geral entre moléculas poliméricas, por exemplo, entre moléculas de ácido nucleico (por exemplo, moléculas de DNA) e/ou entre moléculas de polipeptídeo. Moléculas poliméricas (por exemplo, moléculas de ácido nucleico (por exemplo, moléculas de DNA) e/ou moléculas de polipeptídeo) que compartilham um nível limiar de similaridade ou identidade determinado por alinhamento de resíduos casados são denominadas homólogas. Homologia é um termo qualitativo que descreve uma relação entre moléculas e pode ser baseada na identidade ou similaridade quantitativa. Similaridade ou identidade é um termo quantitativo que define o grau de casamento de sequência entre duas sequências comparadas. Em algumas modalidades, moléculas poliméricas são consideradas como sendo “homólogas” entre si se suas sequências forem pelo menos 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idênticas ou similares. O termo “homólogo” se refere necessariamente a uma comparação entre pelo menos duas sequências (sequências de polinucleotídeo ou polipeptídeo). Duas sequências de polinucleotídeo são consideradas homólogas se os polipeptídeos que codificam são pelo menos 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, ou mesmo 99% pelo menos para um trecho de pelo menos 20 aminoácidos. Em algumas modalidades, sequências de polinucleotídeo homólogas são caracterizadas pela capacidade de codificar um trecho de pelo menos 4-5 aminoácidos exclusivamente especificados. Para sequências de polinucleotídeo com menos de 60 nucleotídeos de comprimento, homologia é determinada pela capacidade de codificar um trecho de pelo menos 4-5 aminoácidos exclusivamente especificados. Duas sequências de proteína são consideradas homólogas se as proteínas forem pelo menos 50%, 60%, 70%, 80% ou 90% idênticas para pelo menos um trecho de pelo menos 20 aminoácidos.

[0089] Homologia sugere que as sequências comparadas divergiram em evolução a partir de uma origem comum. O termo “homólogo” se refere a uma primeira sequência de aminoácidos ou sequência de ácidos nucleicos (por exemplo, gene (DNA ou RNA) ou sequência de proteína que é relacionada a uma segunda sequência de aminoácidos ou sequência de ácidos nucleicos por descida de uma sequência ancestral comum. O termo “homólogo” pode se aplicar à relação entre genes e/ou proteínas separadas pelo evento de especiação ou à relação entre genes e/ou proteínas separadas pelo evento de duplicação genética. “Ortólogos” são genes (ou proteínas) em espécie diferente que evoluíram a partir de um gene ancestral comum (ou proteína) por especiação. Tipicamente, ortólogos retêm a mesma função no curso de evolução. “Parálogos” são genes (ou proteínas) relacionados por duplicação em um genoma. Ortólogos retêm a mesma função no curso de evolução, ao passo que parálogos desenvolvem novas funções, mesmo se essas forem relacionadas à original.

[0090] O termo “identidade” se refere a relação geral entre moléculas poliméricas, por exemplo, entre moléculas de polinucleotídeo (por exemplo, moléculas de DNA) e/ou entre moléculas de polipeptídeo. O cálculo da porcentagem de identidade de duas sequências de ácido polinucleico, por exemplo, pode ser realizado por alinhar as duas sequências para fins de comparação ótima (por exemplo, lacunas podem ser introduzidas em uma ou ambas de uma primeira e uma segunda sequências de ácido nucleico para alinhamento ótimo e sequências não idênticas podem ser desconsideradas para fins de comparação). Em certas modalidades, o comprimento de uma sequência alinhada para fins de comparação é pelo menos 30%, pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, ou 100% do comprimento da sequência de referência. Os nucleotídeos em posições de nucleotídeo correspondentes são então comparados. Quando uma posição na primeira sequência é ocupada pelo mesmo nucleotídeo que a posição correspondente na segunda sequência, então as moléculas são idênticas naquela posição.

A porcentagem de identidade entre as duas sequências é uma função do número de posições idênticas compartilhadas pelas sequências, levando em conta o número de lacunas e o comprimento de cada lacuna, que necessita ser introduzida para alinhamento ótimo das duas sequências.

A comparação de sequências e determinação de porcentagem de identidade entre duas sequencias pode ser realizada usando um algoritmo matemático.

Por exemplo, a porcentagem de identidade entre duas sequências de ácido nucleico pode ser determinada usando métodos como aqueles descritos em Computational Molecular Biology, Lesk, A.

M., ed., Oxford University Press, New York, 1988; Biocomputing: Informatics e Genome Projects, Smith, D.

W., ed., Academic Press, New York, 1993; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987; Computer Analysis of Sequence Data, Part |, Griffin, A.

M., e Griffin, H.

G., eds., Humana Press, New Jersey, 1994; e Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. e Devereux, J., eds., M Stockton Press, New York, 1991; cada um dos quais é incorporado na presente invenção por referência.

Por exemplo, a porcentagem de identidade entre duas sequências de ácido nucleico pode ser determinada usando o algoritmo de Meyers e Miller (CABIOS, 1989, 4:11-17), que foi incorporado no programa ALIGN (versão 2.0) usando uma tabela de resíduo de peso PAM120, uma penalidade de comprimento de lacuna de 12 e uma penalidade de lacuna de 4. A porcentagem de identidade entre duas sequências de ácido nucleico pode ser, alternativamente, determinada usando o programa GAP no pacote de software GCG usando uma matriz NWSgapdna.CMP.

Os métodos comumente empregados para determinar porcentagem de identidade entre sequências incluem, porém não são limitados àquele revelados em Carillo, H., e Lipman, D., SIAM J Applied Math., 48:1073 (1988); incorporados aqui por referência.

Técnicas para determinar identidade são codificadas em programas de computador publicamente disponíveis. Software de computador exemplificador para determinar homologia entre duas sequências inclui, porém não é limitado a pacote de programa GCG, Devereux, J., et al., Nucleic Acids Research, 12, 387 (1984)), BLASTP, BLASTN, e FASTA Altschul, S. F. et al., J. Molec. Biol., 215, 403 (1990)).

Nanopartículas de lipídeo

[0091] Como usado na presente invenção, “nanopartícula de lipídeo” ou “LNP” se refere a qualquer composição de lipídeo que pode ser usada para fornecer um produto, incluindo, porém não limitado a, lipossomas ou vesículas, em que um volume aquoso é encapsulado por bicamadas de lipídeo anfipático (por exemplo, única; unilamelar ou múltipla; multilamelar) ou, em outras modalidades, em que os lipídeos revestem um interior compreendendo um produto profilático, ou micelas ou agregados de lipídeo, em que o produto terapêutico encapsulado de lipídeo está contido em uma mistura de lipídeo relativamente desordenada. Exceto onde notado, a nanopartícula de lipídeo não necessita ter o polipeptídeo antigênico incorporado na mesma e pode ser usado para fornecer um produto quando na mesma formulação.

[0092] Como usado na presente invenção, “poliamina” significa compostos tendo dois ou mais grupos de amino. Os exemplos incluem putrescina, cadaverina, espermidina e espermina.

[0093] A menos que de outro modo especificado, % de mol se refere a uma porcentagem de mol de total de lipídeos. Em geral, os LNPs das composições da invenção são compostos de um ou mais lipídeos catiônicos (incluindo lipídeos catiônicos ionizáveis) e um ou mais lipídeos poli(etilenoglicol) (PEG-lipídeos). Em certas modalidades, os LNPs compreendem adicionalmente um ou mais lipídeos não catiônicos. O um ou mais lipídeos não catiônicos podem incluir um fosfolipídio, derivado de fosfolipídio, um esterol, um ácido graxo ou uma combinação dos mesmos.

[0094] Lipídeos catiônicos e lipídeos catiônicos ionizáveis adequados para os LNPs são descritos na presente invenção. Lipídeos catiônicos ionizáveis são caracterizados pela basicidade fraca de seus grupos principais de lipídeo, que afeta a carga de superfície do lipídeo em um modo dependente de pH, tornando os mesmos positivamente carregados em pH ácido, porém próximo à carga neutra em pH fisiológico. Lipídeos catiônicos são caracterizados por carga catiônica monovalente ou multivalente em seus grupos principais, o que os torna positivamente carregados em pH neutro. Em certas modalidades, o lipídeo catiônico e ionizável é capaz de complexar com moléculas bioativas hidrofílicas para produzir um complexo hidrofóbico que divide na fase orgânica de um sistema orgânico/aquoso de duas fases. É considerado que lipídeos catiônicos tanto monovalentes como polivalentes podem ser utilizados para formar complexos hidrofóbicos com moléculas bioativas.

[0095] Em algumas modalidades, os lipídeos catiônicos e catiônicos ionizáveis para uso na formação de LNPs incluem, porém não são limitados a, cloreto de N .N-dioleila-N N-dimetilamônio (“DODAC”); cloreto de N- (2,3dioleilóxi)propil)-N,N Ntrimetilamônio (“DOTMA”); brometo de N,NdiestearilN N-dimetilamônio (“DDAB”); cloreto de N-(2,3dioleoilóxi)propil)- N,N, N-trimetilamônio (“DODAP”); 1,2 bis (oleoilóxi)-3-(trimetilamônio) amônio (DOTAP); 3-(N-(N N-dimetilaminoetano)-carbam-oíl)colesterol — (“DC-Chol”); diheptadecilamidoglicilspermidina (“DHGS”) e N-(1,2-dimiristilóxiprop-3-il)-N,N- dimetil-N-hidroxietil amônio brometo (“DMRIE”). Adicionalmente, um número de preparados comerciais de lipídeos catiônicos, bem como outros componentes são disponíveis que podem ser usados na presente invenção. Esses incluem, por exemplo, LIPOFECTINº (nanopartículas de lipídeo catiônico comercialmente disponíveis compreendendo DOTMA e 1,2dioleoíl-sn-3-phosphoetanolamina

(“DOPE”), da GIBCOBRL, Grand Island, N.Y.,, EUA); e LIPOFECTAMINAº (nanopartículas de lipídeo catiônico comercialmente disponíveis compreendendo trifluoroacetato de N-(1-(2,3dioleilóxi)propil)N-(2- (esperminecarboxamido)etil)-N, N-dimetilamônio (“DOSPA') e (“DOPE”), da (GIBCOBRL). Os seguintes lipídeos são catiônicos e têm uma carga positiva em pH abaixo de fisiológico: DODAP, DODMA, DMDMA, 1,2-DiLinoleilóxi-N,N- dimetilaminoamônio — (DLinDMA), — 4-(2,2-diocta-9,12-dienil-[1,3]dioxolan-4- ilmetil)-dimetilamina, DLinKbMA (WO 2009/132131 A1), DLin-K-C2-DMA (WO2010/042877), DLin-M-C3-DMA (WO2010/146740 e/ou WO2010/105209), DLin-MC3-DMA (heptatriaconta-6,9,28,31-tetraen-19-il 4- (dimetilamino)butanoato; Jayaraman et al., 2012, Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 51:8529-8533), — 2-(4-[(3B)-colest-5-en-3-ilóxilbutóxi)-N, N-dimetil-3-[(97,122)- octadeca-9,12-dienlilóxillpropan-1-amina) (CLinDMA), e similares. Outros lipídeos catiônicos adequados para uso na invenção incluem, por exemplo, os lipídeos catiônicos descritos nas Patentes US nos. 5.208.036, 5.264.618,

5.279.833 e 5.283.185, e publicações de pedidos de patente US nos. 2008/0085870 e 2008/0057080. Outros lipídeos catiônicos adequados para uso na invenção incluem, por exemplo, Lipídeos EDOO01-E0118 ou EO119-E0180 como revelado na tabela 6 (páginas 112-139) da Publicação do pedido de patente internacional nº WO2011/076807 (que também revela métodos de fazer e métodos de usar esses lipídeos catiônicos).

[0096] Em algumas modalidades, o lipídeo catiônico compreende qualquer um de DLinDMA; DIinKC2DMA; DLin-MC3-DMA; CLinDMA; S-Octil CLinDMA; (285)-1-(7-[(3 B)-colest-5-en-3-ilóxilheptilóxil-3-[(4 Z )-dec-4-en-1-ilóxi]-N,N- dimetil-propan-2-amina; (2R)-1-(4-[(3B)-colest-5-en-3-ilóxilbutóxil-3-[(472)-dec-4-en-1-ilóxi]l-N,N- dimetil-propan-2-amina;

1-[(2R)-1-(4-[(3B)-colest-5-en-3-ilóxilbutóxil-3-(octilóxi)propan-2- illguanidina;

1-[(2R)-1-(7-[(3B)-colest-5-en-3-ilóxilheptilóxi)-N, N-dimetil-3-[(97,127)- octadeca-9,12-dien-1-ilóxilpropan-2-amina;

1-[(2R)-1-(4-[(3B)-colest-5-en-3-ilóxi]butóxil-N,N-dimetil-3-[(92,122)- octadeca-9,12-dien-1-ilóxilpropan-2-amina;

(28)-1-((6-[(3B))-colest-5-en-3-ilóxilhexiltoxi)-N, N-dimetil-3-[(92)-octadec- 9-en-1-ilóxilpropan-2-amina;

(3B)-3-[6-([(285)-3-[(92)-octadec-9-en-1-ilóxil]-2-(pirrolidin-1- il)propil]Jóxilhexil)óxilcolest-5-eno;

(2R)-1-(4-[(3B)-colest-5-en-3-ilóxilbutóxil-3-(octilóxi)propan-2-amina;

(2R)-1-(18-[(3B)-colest-5-en-3-ilóxi]loctilJóxi)-N,N-dimetil-3- (pentilóxi)propan-2-amina;

(2R)-1-(18-[(3B)-colest-5-en-3-ilóxiloctilJóxi)-3-(heptilóxi)-N,N- dimetilpropan-2-amina;

(2R)-1-((8-[(3B)-colest-5-en-3-ilóxi]Joctilóxi)-N,N-dimetil-3-[(2Z2)-pent-2-en- 1-ilóxilpropan-2-amina;

(285)-1-butóxi-3-((8-[(3B)-colest-5-en-3-ilóxiloctilXóxi)-N N-dimetilpropan-2- amina;

(2S8-1-(18-[(3B)-colest-5-en-3-ilóxiloctil)óxi)-3- [2,2,3,3,4,4,5,5,6,6,7,7,8,8,9,9-hexadecafluorononil)oxi]-N N-dimetilpropan-2- amina;

2-amino-2-([(97,127)-octadeca-9,12-dien-1-ilóxilmetilkamônio-1,3-diol;

2-amino-3-((9-(((3S,10R,13R)-10,13-dimetil-17-(6-metilheptan-2-il)- 2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-tetradeca-hidro-1H- ciclopenta[a]fenantren-3-il)óxi)nonil)óxi)-2-((((927,127Z)-octadeca-9,12-dien-1- il)óxi)Metil)propan-1-ol;

2-amino-3-((6-(((3S,10R,13R)-10,13-dimetil-17-(6-metilheptan-2-il)- 2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-tetradeca-hidro-1H- ciclopenta[alfenantren-3-il)óxi)hexil)óxi)-2-((((Z)-octadec-9-en-1- il)oxi)Metil)propan-1-ol; (207,23Z)-N,N-dimetil-nonacosa-20,23-dien-10-amina; (1772,20Z)-N,N-dimetil-hexacosa-17,20-dien-9-amina; (162,19Z)-N,N-dimetil-pentacosa-16,19-dien-8-amina; (132,16Z)-N,N-dimetil-docosa-13,16-dien-5-amina; (127,15Z)-N,N-dimetil-henicosa-12,15-dien-4-amina; (147,17Z)-N,N-dimetil-tricosa-14,17-dien-6-amina; (157,18Z)-N,N-dimetil-tetracosa-15,18-dien-7-amina; (182,21Z)-N,N-dimetil-heptacosa-18,21-dien-10-amina; (157,18Z)-N,N-dimetil-tetracosa-15,18-dien-5-amina; (147,17Z)-N,N-dimetil-tricosa-14,17-dien-4-amina; (197,22Z)-N,N-dimetiloctacosa-19,22-dien-9-amina; (182,21Z)-N,N-dimetil-heptacosa-18,21-dien-8-amina; (17Z,20Z)-N,N-dimetil-hexacosa-17,20-dien-7-amina; (162,19Z)-N,N-dimetil-pentacosa-16,19-dien-6-amina; (227,25Z)-N,N-dimetil-hentriaconta-22,25-dien-10-amina; (217,24Z)-N N-dimetil-triaconta-21,24-dien-9-amina; (18Z)-N N-dimetil-heptacos-18-en-10-amina; (17Z)-N N-dimetil-hexacos-17-en-9-amina; (197,22Z)-N,N-dimetiloctacosa-19,22-dien-7-amina; N,N-dimetil-heptacosan-10-amina; (207,23Z)-N-etil-N-metil-nonacosa-20,23-dien-10-amina; 1-[(117,147Z)-1-nonilicosa-11,14-dien-1-il]pirrolidina; (20Z)-N N-dimetil-heptacos-20-en-10-amina;

(15Z)-N, N-dimetil-heptacos-15-en-10-amina; (14Z)-N N-dimetil-nonacos-14-en-10-amina; (17Z)-N N-dimetil-nonacos-17-en-10-amina; (247Z)-N N-dimetil-tritriacont-24-en-10-amina; (20Z)-N N-dimetil-nonacos-20-en-10-amina; (22Z)-N N-dimetil-hentriacont-22-en-10-amina; (16Z)-N N-dimetil-pentacos-16-en-8-amina; (1272,15Z)-N,N-dimetil-2-nonil-henicosa-12,15-dien-1-amina; (1372,16Z)-N,N-dimetil-3-nonil-docosa-13,16-dien-1-amina; N,N-dimetil-1-[(1S,2R)-2-octil-ciclopropil]heptadecan-8-amina; 1-[(1S8,2R)-2-hexil-ciclopropil]-N, N-dimetil-nonadecan-10-amina; N,N-dimetil-1-[(1S,2R)-2-octil-ciclopropil]Jnonadecan-10-amina; N,N-dimetil-21-[(1S,2R)-2-octil-ciclopropil]henicosan-10-amina; N,N-dimetil-1-[(1S,25)-2[(1R,2R)-2-pentil- ciclopropil]metilkciclopropil]Jnonadecan-10-amina; N,N-dimetil-1-[(1S,2R)-2-octil-ciclopropil]hexadecan-8-amina; N,N-dimetil-1-[(1R,2S)-2-undecil-ciclopropil]tetradecan-5-amina; N,N-dimetil-3-(7-[(1S8,2R)-2-octil-ciclopropil]heptilklodecan-1-amina; 1-[(1R,2S)-2-heptil-ciclopropil]-N, N-dimetiloctadecan-9-amina; 1-[(1S,2R)-2-decil-ciclopropil]-N N-dimetil-pentadecan-6-amina; N,N-dimetil-1-[(1S,2R)-2-octil-ciclopropil]pentadecan-8-amina; e (11E,207,23Z)-N N-dimetil-nonacosa-11,20,23-trien-10-amina; ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo ou um estereoisômero de qualquer um dos acima.

[0097] Em certos aspectos dessa modalidade da invenção, os LNPs compreendem um ou mais dos seguintes lipídios catiônicos ionizáveis: DLinDMA, DIinKC2DMA DLin-MC3-DMA, CLinDMA, ou S-Octil CLinDMA (Vide a publicação do pedido de patente internacional nº WO2010/021865). Em outros aspectos dessa modalidade da invenção, os LNPs compreendem um ou mais dos seguintes lipídios catiônicos e ionizáveis: (1327,16Z)-N N-dimetil-3-nonil-docosa-13,16- dien-1-amina ou N N-dimetil-1-[(1S,2R)-2-octil-ciclopropil]hexadecan-8-amina, cada um dos quais é descrito no PCT/US2011/0523238, publicado como WO 2012/040184, cujo teor integral é pelo presente incorporado por referência.

[0098] Em certos aspectos dessa modalidade da invenção, o lipídeo ionizável e catiônico pode compreender um lipídeo descrito em WO 2017/049245, cujo teor na íntegra é pelo presente incorporado por referência.

[0099] Em certos aspectos dessa modalidade da invenção, LNPs compreendem um ou mais lipídeos catiônicos ionizáveis descritos na Publicação do pedido de patente internacional nº WO2011/022460 A1, ou qualquer sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, ou um estereoisômero de qualquer dos compostos ou sais no mesmo.

[00100] Quando estruturas da mesma constituição diferem em relação à disposição espacial de certos átomos ou grupos, os mesmos são estereoisômeros, e as considerações que são significativas em analisar suas interrelações são topológicas. Se a relação entre dois estereoisômeros for aquela de um objeto e sua imagem em espelho não sobreposta, as duas estruturas são enantioméricas e se diz que cada estrutura é quiral. Estereoisômeros incluem também diastereômeros, cis-trans isôômeros e isômeros de conformação. Diastereoisômeros podem ser quirais ou aquirais, e não são imagens em espelho um do outro. Cis-trans isômeros diferem somente nas posições de átomos em relação a um plano especificado em casos onde esses átomos são, ou são considerados como se fossem partes de uma estrutura rígida. Isômeros de conformação são isômeros que podem ser interconvertidos por rotações em torno de ligações formalmente únicas. Os exemplos de tais isômeros de conformação incluem conformações de cicloexano com conformadores de barco e cadeira, carboidratos, conformações de alcano linear com conformadores espalhados, em eclipse e gauche etc. Vide J. Org. Chem. 35, 2849 (1970).

[00101] Muitos compostos orgânicos existem em formas oticamente ativas tendo a capacidade de girar o plano de luz polarizada-plana. Ao descrever um composto oticamente ativo, os prefixos D e Lou R e S são usados para indicar a configuração absoluta da molécula em torno de seu(s) centro(s) quiral(is). Os prefixos d e | ou (+) e (-) são empregados para designar o sinal de rotação de luz polarizada-plana pelo composto, com (-) ou significando que o composto é levorotatório. Um composto com prefixo de (+) ou d é dextrorotatório. Para uma dada estrutura química, enantiômeros são idênticos exceto que são imagens em espelho não sobrepostas entre sii Uma mistura de enantiômeros é frequentemente chamada uma mistura enantiomérica. Uma mistura de 50:50 de enantiômeros é mencionada como uma mistura racêmica. Muitos dos lipídeos catiônicos descritos na presente invenção podem ter um ou mais centros quirais e, portanto, podem existir em formas enantioméricas diferentes. Se desejado, um carbono quiral pode ser designado com um asterisco (*). Quando ligações com o carbono quiral são mostradas como linhas retas nas Fórmulas da invenção, é entendido que as configurações tanto de (R) como (S) do carbono quiral, e consequentemente ambos os enantiômeros e misturas dos mesmos são abrangidos na fórmula. Como usado na técnica, quando se deseja especificar a configuração absoluta em torno de um carbono quiral, uma das ligações com o carbono quiral pode ser mostarda como uma cunha (liga com átomos acima do plano) e a outra pode ser mostarda como uma série ou cunha de linhas paralelas curtas (liga com átomos abaixo do plano). O sistema Cahn- Inglod-Prelog pode ser usado para atribuir a configuração (R) ou (S) a um carbono quiral.

[00102] Quando os lipídeos catiônicos da presente invenção contêm um centro quiral, os compostos existem em duas formas enantioméricas e a presente invenção inclui ambos os enantiômeros e misturas de enantiômeros, como a mistura de 50:50 específica mencionada como uma mistura racêmica. Os enantiômeros podem ser decompostos por métodos conhecidos por técnicos no assunto, como formação de sais diastereoisoméricas que podem ser separados, por exemplo, por cristalização (vide, CRC Handbook of Optical Resolutions via Diastereomeric Salt Formation de David Kozma (CRC Press, 2001)); formação de derivados ou complexos diastereoisoméricos que podem ser separados, por exemplo, por cristalização cromatografia líquida ou líquido- gás; reação seletiva de um enantiômero com um reagente específico a enantiômero, por exemplo, esterificação enzimática; ou cromatografia líquida ou líquido-gás em um ambiente quiral, por exemplo, em um suporte quiral, por exemplo, sílica com um ligando quiral ligado ou na presença de um solvente quiral. Será reconhecido que onde o enantiômero desejado é convertido em outra entidade química por um dos procedimentos de separação descritos acima, uma etapa adicional é necessária para liberar a forma enantiomérica desejada. Alternativamente, enantiômeros específicos podem ser sintetizados por síntese assimétrica usando reagentes oticamente ativos, substratos, catalisadores ou solventes, ou por converter um enantiômero no outro por transformação assimétrica.

[00103] A designação de uma configuração absoluta específica em um carbono quiral dos lipídeos catiônicos descritos na presente invenção é entendida como significando que a forma enantiomérica designada dos compostos está em excesso enantiomérico (ee) ou em outras palavras está substancialmente isento do outro enantiômero. Por exemplo, as formas “R” dos compostos são substancialmente livres das formas “S” dos compostos e estão,

desse modo, em excesso enantiomérico das formas “S”. Inversamente, formas “S” dos compostos são substancialmente livres das formas “R” dos compostos estão, desse modo, em excesso enantiomérico das formas “R”. excesso enantiomérico, como usado na presente invenção, é a presença de um enantiômero específico em mais de 50%. Em uma modalidade específica quando uma configuração absoluta específica é designada, o excesso enantiomérico de compostos mostrados é pelo menos cerca de 90%.

[00104] Quando um lipídeo catiônico descrito na presente invenção tem dois ou mais carbonos quirais, pode ter mais de dois isômeros óticos e pode existir em formas diastereoisoméricas. Por exemplo, quando há dois carbonos quirais, o composto pode ter até 4 isômeros óticos e 2 pares de enantiômeros ((S,S)/(R,R) e (R,S)/(S,R)). Os pares de enantiômeros (por exemplo, (S,S)/(R,R) são estereoisômeros de imagem em espelho um do outro. Os estereoisômeros que não são imagens em espelho (por exemplo, (S,S) e (R,S)) são diastereômeros. Os pares diastereoisoméricos podem ser separados por métodos conhecidos por técnicos no assunto, por exemplo, cromatografia ou cristalização e os enantiômeros individuais em cada par podem ser separados como descrito acima. Os LNPs descritos na presente invenção incluem cada diastereoisômero de tais lipídeos catiônicos e misturas dos mesmos.

[00105] Os LNPs podem compreender também qualquer combinação de dois ou mais dos lipídeos catiônicos descritos na presente invenção. Em certos aspectos, o lipídeo catiônico compreende, tipicamente cerca de 0,1 a cerca de 99,9 mol % do total de lipídeos presentes na partícula. Em certos aspectos, o lipídio catiônico pode compreender de cerca de 80 a cerca de 99,9 % mol %. Em outros aspectos, o lipídio catiônico compreende de cerca de 2% a cerca de 70%, de cerca de 5% a cerca de 50%, de cerca de 10% a cerca de 45%, de cerca de 20% a cerca de 99.8%, de cerca de 30% a cerca de 70%, de cerca de 34% a cerca de

59%, de cerca de 20% a cerca de 40%, ou de cerca de 30% a cerca de 40% (mol %) do total de lipídios presentes na partícula.

[00106] Os LNPs descritos na presente invenção podem compreender adicionalmente um lipídio não catiônico, que pode ser qualquer de uma variedade de lipídios aniônicos ou zwiteriônicos não carregados, neutros capazes de produzir um complexo estável. Os mesmos são preferivelmente neutros, embora possam ser negativamente carregados. Os exemplos de lipídios não catiônicos úteis na presente invenção incluem materiais relacionados a fosfolipídio, como fosfolipídios naturais, derivados de fosfolipídio sintético, ácidos graxos, esteróis e combinações dos mesmos. Fosfolipídios naturais incluem fosfatidilcolina (PC), fosfatidiletanolamina (PE), e fosfatidilglicerol (PG), fosfatidilserina (PS), fosfatidilinositol (PI), ácido fosfatidico (fosfatidato) (PA), dipalmitoíilfosfatidilcolina, monoacil-fosfatidilcolina (liso PC), 1-palmito(íl-2- oleoíl-sn-glicero-3-fosfocolina (POPC), N-Acil-PE, fosfoinositides, e fosfosfingolipídios. Derivados de fosfolipídio incluem ácido fosfatídico (DMPA, DPPA, DSPA), fosfatidilcolina (DDPC, DLPC, DMPC, DPPC, DSPC, DOPC, POPC, DEPC), fosfatidilglicerol (DMPG, DPPG, DSPG, POPG), fosfatidiletanolamina (DMPE, DPPE, DSPE DOPE), e fosfatidilserina (DOPS). Ácidos graxos incluem include C14:0, ácido palmítico (C16:0), ácido esteárico (C18:0), ácido oleico (C18:1), ácido linoleico (C18:2), ácido linolênico (C18:3), e ácido araquidônico (C20:4), C20:0, C22:0 e leticina.

[00107] Em certas modalidades do LNP descrito na presente invenção, o lipídio não catiônico é selecionado de lecitina, fosfatidiletanolamina, lisolecitina, lisofosfatidiletanolamina, fosfatidilserina, fosfatidilinositol, esfingomielina, cefalin, —cardiolipinn ácido fosfatídico, cerebrosides, dicetilfosfato, distearoílfosfatidilcolina (DSPC), dioleoilfosfatidilcolina (DOPC), dipalmitoílfosfatidilcolina (DPPC), dioleoíilfosfatidilglicero! (DOPG),

dipalmitoíilfosfatidilglicerol (DPPG), dioleoíil-fosfatidiletanolamina (DOPE), palmitoíiloleoilfosfatidilcolina (POPC) , palmitoíloleoíil-fosfatidiletanolamina (POPE) e dioleoíil-fosfatidiletanolamina 4-(N-maleimidometil)-ciclohexano-1- carboxilato (DOPE-mal). Lipídios não catiônicos também incluem esteróis como colesterol, estigmasterol| ou estigmastanol. Colesterol é conhecido na técnica. Vide as publicações de pedidos de patentes US nº U.S. 2006/0240554 e U.S. 2008/0020058. Em certas modalidades, o LNP compreende uma combinação de um fosfolipídio e um esterol.

[00108] Onde presente, o lipídio não catiônico compreende tipicamente de cerca de 0,1% a cerca de 65%, cerca de 2% a cerca de 65%, cerca de 10% a cerca de 65%, ou cerca de 25% a cerca de 65% expresso como porcentagem de mol do total de lipídios presentes no LNP. Os LNPs descritos na presente invenção incluem adicionalmente um conjugado de polietilenoglicol (PEG) lipídio (“PEG- lipídio”) que pode auxiliar como um componente de estabilização de bicamadas. O componente de lipídio do PEG lipídio pode ser qualquer lipídio não catiônico descrito acima incluindo fosfolipídios naturais, derivados de fosfolipídio sintético, ácidos graxos, esteróis e combinações dos mesmos. Em certas modalidades dos LNPs descritos na presente invenção, os PEG-lipídios incluem, PEG acoplado a dialquilóxi propilas (PEG-DAA) como descrito, por exemplo, na Publicação do pedido de patente internacional no. WO 05/026372, PEG acoplado a um diacilglicerol (PEG-DAG) como descrito, por exemplo, nas publicações de patentes norte-americanas nº 20030077829 e 2005008689; PEG acoplado a fosfatidiletanolamina (PE) (PEG-PE), ou PEG conjugado com 1,2-Di-O- hexadecil-sn-glicerídeo (PEG-DSG), ou qualquer mistura dos mesmos (vide, por exemplo, a patente US nº 5.885.613).

[00109] Em uma modalidade, o conjugado PEG-DAG é um conjugado de dilaurilglicerol (C 12)-PEG, um conjugado de PEG dimiristilglicerol (C14), um conjugado de PEG-dipalmitoílglicerol (C16)) um conjugado de PEG- dilaurilglicamida (C12), um conjugado de PEG-dimiristilglicamida (C14), um conjugado de PEG-dipalmitoílglicamida (C16), ou um PEG-disterilglicamida (C18). Os técnicos no assunto reconhecerão prontamente que outros diacilglicerois podem ser usados nos conjugados de PEG-DAG.

[00110] Em certas modalidades, lipídios-PEG incluem, porém não são limitados a PEG-dimiristolglicerol (PEG-DMG), PEG-diesteril glicerol (PEG-DSG), PEG-dipalmetoleíla, PEG-dioleila, PEG-diestearila, PEG-diacilglicamida (PEG- DAG), PEG- dipalmitoil fosfatidiletanolamina (PEG-DPPE), e PEG-1,2- dimiristilox|Ipropil-3-amina (PEG-c-DMA).

[00111] Em certas modalidades, o lipídio-PEG é PEG acoplado a dimiristoílglicerol (PEG-DMG), por exemplo, como descrito em Abrams et al., 2010, Molecular Therapy 18(1):171, e publicações dos pedidos de patente U.S. nº US 2006/0240554 e US 2008/0020058, incluindo por exemplo, 2KPEG/PEG200-DMG.

[00112] Em certas modalidades, o lipídio-PEG, como um PEG-DAG, PEG- colesterol, PEG-DMB, compreende um polietilenoglicol tendo um peso molecular médio que varia de cerca de 500 daltons a cerca de 10,000 daltons, de cerca de 750 daltons a cerca de 5,000 daltons, de cerca de 1,000 daltons a cerca de 5,000 daltons, de cerca de 1,500 daltons a cerca de 3,000 daltons ou de cerca de 2,000 daltons. Em certas modalidades, o PEG-lipídio compreende PEGA400, PEG1500, PEG2000 ou PEGS000.

[00113] Os grupos de acila em quaisquer dos lipídios descritos acima são preferivelmente grupos de acila derivados de ácidos graxos tendo cerca de cadeias de carbono C10 a C24. Em uma modalidade, o grupo de acila é lauroíla, miristoíla, palmitoíla, estearoíla ou oleoíla.

[00114] O conjugado de lipídio-PEG compreende tipicamente de cerca de

0,1% a cerca de 15%, de cerca de 0,5% a cerca de 20%, de cerca de 1,5% a cerca de 18%, de cerca de 4% a cerca de 15%, de cerca de 5% a cerca de 12%, de cerca de 1% a cerca de 4%, ou cerca de 2% expresso como um mol % do total de lipídios presentes na partícula.

[00115] Em certas modalidades da invenção, os LNPs compreendem um ou mais lipídios catiônicos, colesterol e 1,2-dimiristoíl-sn-glicerol metoxipolietilenoglicol (PEG-DMG).

[00116] Em certas modalidades da invenção, os LNPS compreendem um ou mais lipídios catiônicos, colesterol, 1,2-Distearoíl-sn-glicero-3-fosfocolina (DSPC) e 1,2-dimiristoíl-sn-glicerol metoxipolietilenoglicol (PEG-DMG).

[00117] Em certas modalidades da invenção, os LNPs compreendem compostos de lipídio montados nas seguintes razões molares: Lipídio catiônico (20-99,8 mol %) Lipídio não catiônico (0,1-65 mol %) e PEG-DMG (0,1-20 mol %).

[00118] Em certas modalidades da invenção, os LNPs compreendem compostos de lipídio montados nas seguintes razões molares: Lipídio catiônico (30-70 mol %) Lipídio não catiônico (20-65 mol %) e PEG-DMG (1-15 mol %).

[00119] Em certos aspectos dessa modalidade, o lipídio não catiônico é colesterol. LNPs exemplificadores podem incluir lipídio catiônico/colesterol/PEG-DMG cerca de nas seguintes razões molares: 58/30/10.

[00120] Em certos aspectos dessa modalidade, o lipídio não catiônico é colesterol e DSPC. LNPs exemplificadores podem incluir lipídio catiônico/colesterol/DSPC/PEG-DMG cerca de nas seguintes razões molares:

59/30/10/1; 58/30/10/2; 43/41/15/1; 42/41/15/2; 40/48/10/2; 39/41/19/1; 38/41/19/2; 34/41/24/1; e 33/41/24/2.

Preparação de LNPs

[00121] LNPs podem ser formados, por exemplo, por um processo de precipitação rápida que abrange micro-mistura dos componentes de lipídio dissolvidos em etanol com uma solução aquosa usando um aparelho de mistura de volume confinado como um misturador-T de volume confinado, um misturador de vórtice de múltiplas entradas (MIVM) ou um dispositivo misturador microfluídico como descrito abaixo. A solução de lipídio contém um ou mais lipídios catiônicos, um ou mais lipídios não catiônicos (por exemplo, DSPC), PEG-DMG e opcionalmente colesterol, em razões molares específicas em etanol. A solução aquosa consiste em uma solução de sal tamponada com acetato de sódio ou citrato de sódio com pH na faixa de 2-6, de preferência 3,5- 5,5. As duas soluções são aquecidas a uma temperatura na faixa de 25ºC— 45ºC, de preferência 30ºC — 40ºC, e então misturadas em um misturador de volume confinado desse modo formando instantaneamente o LNP. Quando um misturador-T de volume confinado é usado, o misturador T tem uma faixa de diâmetro interno (ID) de 0,25 a 1,0 mm. As soluções aquosas e de álcool são fornecidas à entrada do misturador-T usando bombas de seringa programáveis e com uma taxa de fluxo total de 10-600 mL/minuto. As soluções aquosa e de álcool são combinados no misturador de volume confinado com uma razão na faixa de 1:1 a 1:3 vol:vol, porém direcionado a 1:1.1 até 1:2.3. A combinação de fração de volume de etanol, taxas de fluxo de solução de reagente e ID de tubagem de misturador— utilizadas nesse estágio de mistura tem o efeito de controlar o tamanho de partícula dos LNPs entre 30 e 300 nm. A suspensão de LNP resultante é duas vezes diluída em tampões de pH mais alto na faixa de 6-8 em um processo de mistura em linha de múltiplos estágios, sequencial. Para a primeira diluição, a suspensão de LNP é misturada com uma solução tamponada em um pH mais alto (pH 6-7,5) com uma razão de mistura na faixa de 1:1 a 1:3 vol:vol, porém direcionado a 1:2 vol:vol.

Essa solução tamponada está em uma temperatura na faixa de 15-40ºC, direcionada a 30-40ºC.

A suspensão de LNP resultante é adicionalmente misturada com uma solução tamponada em um pH mais lato, por exemplo, 6-8 e com uma razão de mistura na faixa de 1:1 a 1:3 vol:vol, porém direcionado a 1:2 vol:vol.

Essa solução tamponada posterior está em uma temperatura na faixa de 15-40ºC, direcionado a 16-25ºC.

Os LNPs misturados são mantidos de 30 minutos a 2 horas antes de uma etapa de filtração de permuta de ânions.

A temperatura durante o período de incubação está na faixa de 15-40ºC, direcionado a 30-40"ºC.

Após incubação, a suspensão de LNP é filtrada através de um filtro de 0.8 um contendo uma etapa de separação de permuta de ânion.

Esse processo usa IDs de tubagem variando de 1 mm ID a mMMm|ID e uma taxa de fluxo de 10 a 2000 mL/minuto.

Os LNPs são concentrados e diafiltrados através de um processo de ultrafiltração onde o álcool é removido e o tampão é permutado para a solução de tampão final como solução salina tamponada com fosfato ou um sistema de tampão adequado para criopreservação (por exemplo, contendo sacarose, trealose ou combinações dos mesmos). O processo de ultrafiltração usa um formato de filtração de fluxo tangencial (TFF). Esse processo usa uma faixa de corte de peso molecular nominal de membrana de 30-500 KD, direcionado a 100 KD.

O formato de membrana pode ser fibra oca ou cassete de folha plana.

Os processos de TFF com o corte de peso molecular adequado retêm o LNP no concentrado e o filtrado ou permeado contém o álcool e os refugos de tampão finais.

O processo de TFF é um processo de múltiplas etapas com uma concentração inicial em uma concentração de lipídio de 20-30 mg/mL.

Após concentração, a suspensão de LNP é diafiltrada contra o tampão final (por exemplo, solução salina tamponada com fosfato (PBS) com pH 7-8, 10 MM Tris, 140 mM NaCl com pH 7-8, ou 10 MM Tris, 70 MM NaCl, 5% em peso de sacarose, com pH 7-8) por 5-20 volumes para remover o álcool e realizar permuta de tampão. O material é então concentrado 1-3 vezes adicionais através de ultrafiltração. As etapas finais do processo de fabricação de LNP são filtração estéril da solução de LNP concentrada em um recipiente adequado em condições assépticas. A filtração estéril é realizada passando a solução de LNP através de um pré-filtro (Acropak 500 PES 0.45/0.8 um cápsula) e um filtro de redução de biocarga (Acropak 500 PES 0.2/0.8 um cápsula). Após filtração, o produto LNP em frasco é armazenado em condições de armazenagem adequadas (2ºC-8ºC, ou -20ºC se formulação congelada).

[00122] Em algumas modalidades, os LNPs das composições fornecidas na presente invenção têm um diâmetro geométrico médio que é menor que 1000 nm. Em algumas modalidades, os LNPs têm diâmetro geométrico médio que é maior que 50 nm porém menor que 500 nm. Em algumas modalidades, o diâmetro geométrico médio de uma população de LNPs é cerca de 60 nm, 75 nm, 100 nm, 125 nm, 150 nm, 175 nm, 200 nm, 225 nm, 250 nm, 275 nm, 300 nm, 325 nm, 350 nm, 375 nm, 400 nm, 425 nm, 450 nm, ou 475 nm. Em algumas modalidades, o diâmetro geométrico médio está entre 100-400 nm, 100-300 nm, 100-250 nm, ou 100-200 nm. Em algumas modalidades, o diâmetro geométrico médio está entre 60-400 nm, 60-350 nm, 60-300 nm, 60-250 nm, ou 60-200 nm. Em algumas modalidades, o diâmetro geométrico médio está entre 75-250 nm. Em algumas modalidades, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, ou mais dos LNPs de uma população de LNPs têm um diâmetro que é menor que 500 nm. Em algumas modalidades, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, ou mais dos LNPs de uma população de LNPs têm um diâmetro que é maior que 50 nm porém menor que 500 nm. Em algumas modalidades, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, ou mais dos LNPs de uma população de LNPs têm um diâmetro de cerca de 60 nm, 75 nm, 100 nm, 125 nm, 150 nm, 175 nm, 200 nm, 225 nm, 250 nm, 275 nm, 300 nm, 325 nm, 350 nm, 375 nm, 400 nm, 425 nm, 450 nm, ou 475 nm. Em algumas modalidades, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, ou mais dos LNPs de uma população de LNPs tem um diâmetro que está entre 100-400 nm, 100-300 nm, 100-250 nm, ou 100-200 nm. Em algumas modalidades, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, ou mais dos LNPs de uma população de LNPs têm um diâmetro que está entre 60- 400 nm, 60-350 nm, 60-300 nm, 60-250 nm, ou 60-200 nm.

[00123] Em uma modalidade específica, o tamanho dos LNPs varia entre cerca de 1 e 1000 nm, preferivelmente entre cerca de 10 e 500 nm, mais preferivelmente entre cerca de 100 a 300 nm, e preferivelmente 100 nm.

Ácidos nucleicos/Polinucleotídeos

[00124] DNA da presente invenção, em algumas modalidades é otimizado por códon. Métodos de otimização por códon são conhecidos na técnica e podem ser usados como provido na presente invenção. Otimização por códon, em algumas modalidades, pode ser usada para casar frequências de códon em organismos alvo e hospedeiro para assegurar dobramento adequado; tendência do teor de GC de aumentar a estabilidade de mRNA ou reduzir estruturas secundárias; minimizar códons de repetição tandem ou cursos de base que podem prejudicar a expressão ou constructo de gene; customizar regiões de controle de translação e transcrição; inserir ou remover sequências de tráfico de proteína, remover/adicionar sítios de modificação pós-translação em proteína codificada (por exemplo, sítios de glicosilação); adicionar, remover ou embaralhar domínios de proteína; inserir ou deletar sítios de restrição; modificar sítios de ligação de ribossomo e sítios de degradação de mRNA; ajustar taxas de translação para permitir que os vários domínios da proteína dobrem adequadamente; ou reduzir ou eliminar estruturas secundárias problemáticas no polinucleotídeo. Ferramentas de otimização por códon, algoritmos e serviços são conhecidos na técnica — exemplos não limitadores incluem serviços da GeneArt (Life Technologies), DNA2.0 (Menlo Park CA) e/ou métodos de propriedade. Em algumas modalidades, a sequência de quadro de leitura aberto (ORF) é otimizado usando algoritmos de otimização.

[00125] Em algumas modalidades, uma sequência otimizada por códon compartilha menos de 95% de identidade de sequência, menos de 90% de identidade de sequência, menos de 85% de identidade de sequência, menos de 80% de identidade de sequência, ou menos de 75% de identidade de sequência de ocorrência natural ou sequência do tipo selvagem.

[00126] Em algumas modalidades, uma sequência otimizada por códon compartilha entre 65% e 85% (por exemplo, entre cerca de 67% e cerca de 85%, ou entre cerca de 67% e cerca de 80%) de identidade de sequência a uma sequência de ocorrência natural ou uma sequência do tipo selvagem. Em algumas modalidades, uma sequência otimizada por códon compartilha entre 65% e 75%, ou cerca de 80% de identidade de sequência a uma sequência de ocorrência natural ou sequência do tipo selvagem.

Métodos de tratamento

[00127] São fornecidas na presente invenção composições (por exemplo, composições farmacêuticas), métodos, kits e reagentes para prevenção e/ou tratamento de RSV em humanos e em outros mamíferos. Vacinas de vírus RSV podem ser usadas como agentes terapêuticos ou profiláticos. Elas podem ser usadas em medicina para prevenir e/ou tratar doença infecciosa. Em aspectos exemplificadores, as composições imunogênicas de RSV da presente invenção são usadas como vacinas para prover proteção profilática contra vírus RSV. Proteção profilática contra vírus RSV pode ser obtida após administração de uma vacina RSV da presente invenção. Vacinas podem ser administradas uma vez,

duas vezes, três vezes, quatro ou mais vezes. É possível, embora menos desejável, administrar a vacina a um indivíduo infectado para obter uma resposta terapêutica. A dosagem pode necessitar ser ajustada de acordo.

[00128] Em algumas modalidades, as composições imunogênicas de RSV da presente invenção podem ser usadas como um método para prevenir uma infecção de RSV em um indivíduo, o método compreendendo administrar ao indivíduo pelo menos uma composição imunogênica de RSV como provido na presente invenção. Em algumas modalidades, as composições imunogênicas de RSV da presente invenção podem ser usadas como um método para tratar uma infecção de RSV em um indivíduo, o método compreendendo administrar ao indivíduo pelo menos uma composição imunogênica de RSV como provido na presente invenção. Em algumas modalidades, as composições imunogênicas de RSV da presente invenção podem ser usadas como um método de reduzir uma incidência de RSV em um indivíduo, o método compreendendo administrar ao indivíduo pelo menos uma composição imunogênica de RSV como provido na presente invenção. Em algumas modalidades, as composições imunogênicas de RSV da presente invenção podem ser usadas como um método para inibir disseminação de RSV a partir de um primeiro indivíduo infectado com RSV para um segundo indivíduo não infectado com RSV, o método compreendendo administrar a pelo menos um do primeiro indivíduo e do segundo indivíduo pelo menos uma composição imunogênica de RSV como provido na presente invenção.

[00129] Um método de eliciar uma resposta imune em um indivíduo contra RSV é provido em aspectos da invenção. O método envolve administrar ao indivíduo uma composição imunogênica de RSV descrita na presente invenção, induzindo, desse modo no indivíduo uma resposta imune específica para RSV.

[00130] Uma dose profilaticamente eficaz é uma dose terapeuticamente eficaz que previne infecção com o vírus em um nível clinicamente aceitável. em algumas modalidades, a dose terapeuticamente eficaz é uma dose listada em uma inserção de embalagem para a vacina.

Composições terapêuticas e profiláticas

[00131] São fornecidas na presente invenção composições (por exemplo, composições farmacêuticas), métodos, kits e reagentes para prevenção, tratamento ou diagnóstico de RSV em seres humanos e outros mamíferos, por exemplo. As composições imunogênicas de RSV, incluindo vacinas, podem ser usadas como agentes terapêuticos ou profiláticos. Elas podem ser usadas em medicina para prevenir e/ou tratar doença infecciosa. Em algumas modalidades, as composições imunogênicas de RSV de acordo com a presente invenção podem ser usadas para tratamento de RSV.

[00132] Composições imunogênicas de RSV, incluindo vacinas de RSV, podem ser administradas profilática ou terapeuticamente como parte de um esquema de imunização ativa a indivíduos saudáveis ou no início de infecção durante a fase de incubação ou durante infecção ativa após início de sintomas. Em algumas modalidades, a quantidade de vacina da presente relação provida a uma célula, um tecido ou um indivíduo pode ser uma quantidade eficaz para profilaxia imune.

[00133] Composições imunogênicas de RSV, incluindo vacinas de RSV, podem ser administradas com outros compostos profiláticos ou terapêuticos. Como exemplo não limitador, um composto profilático ou terapêutico pode ser um adjuvante ou um reforço. Como usado na presente invenção, ao se referir a uma composição profilática, como uma vacina, o termo “reforço” se refere a uma administração extra da composição profilática (vacina). Um reforço (ou vacina de reforço) pode ser dada após administração inicial da composição profilática. O tempo de administração entre a administração inicial da composição profilática e o reforço pode ser, porém não é limitado a, 1 minuto, 2 minutos, 3 minutos, 4 minutos, 5 minutos, 6 minutos, 7 minutos, 8 minutos, 9 minutos, 10 minutos, 15 minutos, 20 minutos 35 minutos, 40 minutos, 45 minutos, 50 minutos, 55 minutos, 1 hora, 2 horas, 3 horas, 4 horas, 5 horas, 6 horas, 7 horas, 8 horas, 9 horas, 10 horas, 11 horas, 12 horas, 13 horas, 14 horas, horas, 16 horas, 17 horas, 18 horas, 19 horas, 20 horas, 21 horas, 22 horas, 23 horas, 1 dia, 36 horas, 2 dias, 3 dias, 4 dias, 5 dias, 6 dias, 1 semana, 10 dias, 2 semanas, 3 semanas, 1 mês, 2 meses, 3 meses, 4 meses, 5 meses, 6 meses, 7 meses, 8 meses, 9 meses, 10 meses, 11 meses, 1 ano, 18 meses, 2 anos, 3 anos, 4 anos, 5 anos, 6 anos, 7 anos, 8 anos, 9 anos, 10 anos, 11 anos, 12 anos, 13 anos, 14 anos, 15 anos, 16 anos, 17 anos, 18 anos, 19 anos, 20 anos, 25 anos, 30 anos, anos, 40 anos, 45 anos, 50 anos, 55 anos, 60 anos, 65 anos, 70 anos, 75 anos, 80 anos, 85 anos, 90 anos, 95 anos ou mais de 99 anos. Em algumas modalidades, o tempo de administração entre a administração inicial da composição profilática e o reforço pode ser, porém não é limitado a, 1 semana, 2 semanas, 3 semanas, 1 mês, 2 meses, 3 meses, 6 meses ou 1 ano.

[00134] Em algumas modalidades composições imunogênicas de RSV, incluindo vacinas de RSV, podem ser administradas por via intramuscular, intradérmica, ou intranasal, similarmente à administração de vacinas inativadas conhecidas na técnica. Em algumas modalidades, composições imunogênicas de RSV, incluindo vacinas de RSV, são administradas por via intramuscular.

[00135] Composições imunogênicas de RSV, incluindo vacinas de RSV, podem ser utilizadas em vários cenários dependendo da prevalência da infecção ou do grau ou nível de necessidade médica não atendida. Vacinas têm propriedades superiores em que produzem títulos de anticorpo muito maiores e produzem respostas mais cedo do que composições/agentes antivirais comercialmente disponíveis.

[00136] São fornecidas na presente invenção composições farmacêuticas incluindo composições imunogênicas de RSV opcionalmente em combinação com um ou mais excipientes farmaceuticamente aceitáveis.

[00137] Composições imunogênicas de RSV, que incluem vacinas de RSV, podem ser formuladas ou administradas individualmente ou em combinação com um ou mais outros componentes. Por exemplo, tais composições podem compreender outros componentes incluindo, porém não limitados a adjuvantes.

[00138] Em algumas modalidades, as composições imunogênicas de RSV não incluem um adjuvante (elas são isentas de adjuvante).

[00139] Há muito, alumínio é mostrado como estimulando a resposta imune contra antígenos administrados em conjunto principalmente por estimular uma resposta de TH2. Prefere-se que o adjuvante de alumínio das composições fornecidas na presente invenção não tenha a forma de um precipitado de alumínio. Vacinas de alumínio precipitado podem aumentar a resposta imune a um antígeno alvo, porém foram mostradas como sendo preparados altamente heterogêneos e tiveram resultados inconsistentes (vide Lindblad E.B. Immunology and Cell Biology 82: 497-505 (2004)). Vacinas de alumínio adsorvido, em contraste, podem ser formadas previamente em um modo padronizado, que é uma característica essencial de preparados de vacina para administração em seres humanos. Além disso, pensa-se que a adsorção física de um antígeno desejado sobre o adjuvante de alumínio tem um papel importante em função adjuvante, talvez em parte por permitir uma depuração mais lenta do sítio de injeção ou por permitir uma absorção mais eficiente de antígeno por células apresentadoras de antígeno.

[00140] O adjuvante de alumínio da presente invenção pode ter a forma de hidróxido de alumínio (AI(OH)3), fosfato de alumínio (AIPO4), hidroxifosfato de alumínio, sulfato de hidroxifosfato de alumínio amorfo (AAHS) ou o denominado

"alume" (KA1(S04)-12H20) (vide Klein et al Analysis of aluminium hidroxiphosphate vaccine adjuvants by (27)A1 MAS NMR,, J. Pharm. Sci. 89(3): 311-21 (2000)). Em modalidades exemplificadoras da invenção fornecidas aqui, o adjuvante de alumínio é hidroxi fosfato de alumínio ou AAHS. A razão de fosfato para alumínio no adjuvante de alumínio pode variar de O a 1,3. Em modalidades preferidas desse aspecto, a razão de fosfato para alumínio está compreendida na faixa de 0,1 a 0,70. Em modalidades particularmente preferidas, a razão de fosfato para alumínio está compreendida na faixa de 0,2 a 0,50. MAPA é uma suspensão aquosa de hidroxifosfato de alumínio. MAPA é fabricado por misturar cloreto de alumínio e fosfato de sódio em uma razão volumétrica de 1:1 para precipitar hidroxi fosfato de alumínio. Após o processo de mistura, o material é reduzido em tamanho com um misturador de cisalhamento alto para obter um tamanho de partícula agregada alvo na faixa de 2-8 um. O produto é então diafiltrado contra solução salina fisiológica e esterilizado a vapor. Vide, por exemplo, a publicação do pedido de patente internacional nº WO2013/078102.

[00141] Em algumas modalidades da invenção, o adjuvante de alumínio tem a forma de AAHS (mencionado de modo intercambiável aqui como adjuvante de alumínio Merck (MAA)). MAA carrega carga zero em pH neutro, enquanto AIOH carrega uma carga positiva líquida e AIPO; carrega tipicamente uma carga negativa líquida em pH neutro.

[00142] Um técnico no assunto será capaz de determinar uma dosagem ótima de adjuvante de alumínio que é tanto segura como eficaz para aumentar a resposta imune aos polipeptídeos antigênicos alvos. Para uma discussão do perfil de segurança de alumínio, bem como quantidades de alumínio incluídas em vacinas licenciadas por FDA, vide Baylor et al., Vaccine 20: S18-523 (2002). Em geral, uma dose eficaz e segura de adjuvante de alumínio varia de 150 a 600 ug/dose (300 a 1200 ug/mL de concentração). Em modalidades específicas das formulações e composições da presente invenção, há entre 200 e 300 ug de adjuvante de alumínio por dose de vacina. Em modalidades alternativas das formulações e composições da presente invenção, há entre 300 e 500 ug de adjuvante de alumínio por dose de vacina.

[00143] Composições imunogênicas de RSV, incluindo vacinas de RSV, podem ser formuladas ou administradas em combinação com um ou mais excipientes farmaceuticamente aceitáveis. Em algumas modalidades, as composições compreendem pelo menos uma substância ativa adicional, como, por exemplo, uma substância terapeuticamente ativa, uma substância profilaticamente ativa ou uma combinação de ambas. As composições podem ser estéreis, isentas de pirógeno ou tanto estéreis como isentas de pirógeno. Considerações gerais na formulação e/ou fabricação de agentes farmacêuticos, como composições de vacina, podem ser encontradas, por exemplo, em Remington: The Science and Practice of Pharmacy 21º ed., Lippincott Williams & Wilkins, 2005 (incorporado na presente invenção por referência na íntegra). Em algumas modalidades, as composições imunogênicas de RSV, incluindo vacinas de RSV, são administradas a seres humanos, pacientes humanos ou indivíduos.

[00144] Formulações das composições imunogênicas de RSV descritas na presente invenção podem ser preparadas por qualquer método conhecido ou posteriormente desenvolvido na técnica de farmacologia. Em geral, tais métodos preparatórios incluem a etapa de colocar o ingrediente ativo (por exemplo, polipeptídeo ou polinucleotídeo) em associação com um excipiente e/ou um ou mais outros ingredientes acessórios, e então, se necessário e/ou desejável, dividir, moldar e/ou embalar o produto em uma unidade de dose única ou múltiplas doses, desejada.

[00145] Quantidades relativas do ingrediente ativo, o excipiente farmaceuticamente aceitável e/ou quaisquer ingredientes adicionais em uma composição farmacêutica de acordo com a invenção variarão, dependendo da identidade, tamanho e/ou condição do indivíduo tratado e adicionalmente dependendo da via pela qual a composição deve ser administrada. Como exemplo, a composição pode compreender entre 0,1% e 100%, por exemplo., entre 0.5 e 50%, entre 1-30%, entre 5-80%, pelo menos 80% (peso/peso) de ingrediente ativo.

Modos de administração da vacina

[00146] Composições imunogênicas de RSV, incluindo vacinas de RSV, podem ser administradas por qualquer via que resulte em um resultado terapeuticamente eficaz. Essas incluem, porém não são limitadas à administração intradérmica, intramuscular, intranasal e/ou subcutânea. A presente invenção fornece métodos compreendendo administrar composições a um indivíduo necessitando das mesmas. A quantidade exata necessária variará de indivíduo para indivíduo, dependendo da espécie, idade, e condição geral do indivíduo, gravidade da doença, composição específica, seu modo de administração, seu modo de atividade e similar. Composições imunogênicas de RSV são tipicamente formuladas em forma de unidade de dosagem para facilidade de administração e uniformidade de dosagem. Será entendido, entretanto, que o uso total diário de composições de vacina pode ser decidido pelo médico atendente compreendido no escopo da decisão médica. O nível de dose de imageamento terapeuticamente eficaz, específica, profilaticamente eficaz ou apropriada para qualquer paciente específico dependerá de uma variedade de fatores incluindo o distúrbio sendo tratado e a gravidade do distúrbio; a atividade do composto específico empregado; a composição específica empregada; a idade; peso corpóreo, saúde geral, sexo e dieta do paciente; o tempo de administração, via de administração, e taxa de excreção do composto específico empregado; a duração do tratamento; drogas usadas em combinação ou coincidentes com o composto específico empregado; e fatores similares bem conhecidos na medicina.

[00147] Em algumas modalidades, composições imunogênicas de RSV podem ser administradas em níveis de dosagem suficientes para fornecer 0,0001 mg/kg a 100 mg/kg, 0,001 mg/kg a 0,05 mg/kg, 0,005 mg/kg a 0,05 mg/kg, 0,001 mg/kg a 0,005 mg/kg, 0,05 mg/kg a 0,5 mg/kg, 0,01 mg/kg a 50 mg/kg, 0,1 mg/kg a 40 mg/kg, 0,5 mg/kg a 30 mg/kg, 0,01 mg/kg a 10 mg/kg, 0,1 mg/kg a 10 mg/kg, ou 1 mg/kg a 25 mg/kg, do peso corpóreo do indivíduo por dia, uma ou mais vezes por dia, por semana, por mês, etc., para obter o efeito terapêutico, de diagnóstico, profilátio ou imageamento, desejado. Em modalidades exemplificadoras, composições imunogênicas de RSV, composições de vacinas podem ser administradas em níveis de dosagem suficientes para fornecer 0,0005 mg/kg a 0,01 mg/kg, por exemplo, cerca de 0,0005 mg/kg a cerca de 0,0075 mg/kg, por exemplo, cerca de 0,0005 mg/kg, cerca de 0,001 mg/kg, cerca de 0,002 mg/kg, cerca de 0,003 mg/kg, cerca de 0,004 mg/kg ou cerca de 0,005 mg/kg.

[00148] Em algumas modalidades, as composições imunogênicas de RSV podem ser administradas uma vez ou duas vezes (ou mais) em níveis de dosagem suficientes para fornecer 0,025 mg/kg a 0,50 mg/kg, 0,025 mg/kg a 0,500 mg/kg, 0,025 mg/kg a 0,750 mg/kg, ou 0,025 mg/kg a 1,0 mg/kg.

[00149] Uma composição farmacêutica imunogênica de RSV descrita na presente invenção pode ser formulada em uma forma de dosagem descrita aqui, como intranasal, intratraqueal ou injetável (por exemplo, intravenosa, intraocular, intravítrea, intramuscular, intradérmica, intracardíaca, intraperitoneal, intranasal e subcutânea).

[00150] A presente invenção não é limitada em sua aplicação aos detalhes de constructo e a disposição de componentes estabelecida na descrição que se segue ou ilustrada nos desenhos. A invenção é capaz de outras modalidades e de ser posta em prática ou de ser realizada em vários modos. Também, a fraseologia e terminologia usadas na presente invenção são para fins de descrição e não devem ser consideradas como limitadoras. O uso de “incluindo”, “compreendendo” ou “tendo”, “contendo”, “envolvendo” e variações dos mesmos, pretendem abranger os itens listados posteriormente e equivalentes dos mesmos bem como itens adicionais.

EXEMPLOS Exemplo 1: Geração de mutantes de cadeia única tendo fragmentos F1 e F? unidos por um ligante de peptídeo

[00151] Polipeptídeo F de RSV do tipo selvagem é clivado em fragmentos F1 e Fr por pós translação de protease de furina hospedeira. Para avaliar mutantes de RSV de cadeia única que não são clivados por furina e que permanecem como um polipeptídeo único, aminoácidos 98-146 de RSV WT (cujos aminoácidos incluem os sítios de clivagem de furina, o peptídeo p27 e parte do peptídeo de fusão) foram substituídos com um ligante de aminoácido flexível de vários comprimentos (8-14 a.a.) no segundo plano de pré-fusão estabilizando mutações DS-Cav2 (S155C, V207L e S290C) (McLellan et al. 2013). Nesses mutantes, o domínio de trimerização de fibritina de fago T4 (foldon) foi preso ao C-terminal do ectodomínio F de RSV, seguido por um sítio de clivagem de protease e marcadores de purificação. Sequências F de RSV mutantes foram otimizados por códon para uso de códon de mamífero, clonadas em um vetor de expressão e transfectadas de modo transiente em células de suspensão Expi293 (Life Technologies). Sobrenadantes de cultura de célula foram colhidas nos dias 3 a 7 após transfecção de plasmídeo para avaliar ligação desses mutantes com anticorpos diferentes contra F de RSV. Em resumo, placas revestidas com Ni-NTA de 96 poços (Thermo Scientific) foram revestidas com sobrenadantes de cultura de células por 1 hora em temperatura ambiente. Sítios não ligados foram bloqueados pela adição de alumina de soro bovino a 2% (v/v) (BSA) em PBS e incubação por 1 hora em temperatura ambiente. As placas foram lavadas com PBS contenho 0,05% (v/v) de Tween'" 20 (polisorbato 20) (PBS-T) e incubadas com diluições seriais de anticorpos (D25 ou Synagisº (palivizumabe)) em temperatura ambiente por 1 hora. As placas foram lavadas novamente com PBS- T e incubadas por 1 hora em temperatura ambiente com anticorpo secundário conjugado com HRP IgG anti-humano de cabra (Thermo Fisher) diluído 1:2.000. Após uma lavagem adicional com PBS-T e enxague breve com ddH2O, substrato ELISA Super AquaBlue (eBioscience) foi adicionado e a placa foi imediatamente lida a 405 nm por 5 min. mMOD/min. foi calculado para cada poço.

[00152] As figuras 1A e 18 mostram ligação de sobrenadantes de cultura de célula pós-transfecção dia 7 colhidos recentemente do constructo 40a (DS-Cav1 com um ligante 8 a.a.) (figura 1A) ou aqueles armazenados a 4ºC por 8 dias (figura 1B) a anticorpos monoclonais de D25 e Synagisº (palivizumabe). O mutante LZF-40a apresentou ligação de D25 mAb específica de pré-fusão baixa. A ligação com palivizumabe (que reage tanto com pré-fusão como pós-fusão F) foi alta, sugerindo que o mutante foi bem expresso. As figuras 2A e 2B mostram ligação de sobrenadantes de cultura de célula pós transfecção no dia 3 colhidos recentemente de LZF55a, LZF56a, e LZF57a (DS-Cav1 com ligante de 10, 12 ou 14 aminoácidos, respectivamente; as figuras 2A, 2B, 2C, respectivamente) ou aqueles armazenados a 4ºC por 7 dias (Figuras 2D, 2E, e 2F, respectivamente) a D25 e palivizumabe. Todos os três mutantes expressam bem, com base na reatividade a palivizumabe. Entre esses mutantes, LZF57a (DS-Cav1l com um ligante de aminoácidos) apresentou a ligação de D25 mAb específica à pré-fusão mais alta e reteve ligação de D25 após 7 dias de armazenagem a 4ºC.

[00153] Além de ELISA, sobrenadantes de cultura de células colhidas em pontos de tempo pós-transfecção diferentes foram analisados em um western blot com soros F anti-RSV. Os sobrenadantes foram tratados com tampão de carga de SDS com agente redutor (Life Technologies), aplicado para eletroforese de gel e a seguir eletro-transferido para sobre membranas de nitrocelulose (Life Technologies). As membranas foram bloqueadas durante a noite a 4ºC em bloqueador do tipo blotting (BioRad) feito em 1X TBST (solução salina tamponada Tris + tween). As membranas foram incubadas com soros de porquinho da índia policlonais contra ectodomínio de proteína F de RSV do tipo selvagem (Sino Biological) seguido por um anticorpo secundário de IgG anti- porquinho da índia de cabra conjugado com AP (Santa Cruz Biotechnology). Mutantes RSV de cadeia única LZF55a, LZF56a e LZF57a mostraram níveis de expressão significativamente aperfeiçoados em comparação com o DS-Cav1 original (figura 3). DS-Cav1 apareceu como duas faixas no gel: uma faixa superior representa a proteína F não clivada e uma faixa inferior representa o fragmento F1 clivado com furina. Os mutantes RSV de cadeia única LZF55, LZF56 e LZF57 apareceram como uma faixa predominante única no gel, representando F não clivado.

Exemplo 2: Mutações de estabilização adicionais

[00154] O anticorpo monoclonal, 4D7, que reage com sítio antigênico | na proteína F pós-fusão RSV e pode ser usado para avaliar a estabilidade da estrutura F pré-fusão (Flynn et al. 2016). Sobrenadantes de cultura de célula recentemente colhidas de DS-Cav1 ou constructo LZF57a foram avaliados por ELISA em relação à ligação 4D7 de D25 (figura 4C). Embora o constructo LZF57a retivesse a ligação D25, indicando sua conformação de pré-fusão, pareceu apresentar ligação de 4D7 aumentada em comparação com o constructo DS- Cav1 original, sugerindo que poderia haver alteração de conformação sutil quando o ligante de cadeia única foi introduzido. Para estabilizar adicionalmente o constructo LZF57a de RSV mutante de cadeia única, o design baseado em estrutura foi realizado para gerar variantes com mutações de ligação de dissulfeto; mutações de enchimento de cavidade; e/ou mutações de desestabilização pós-fusão. Especialmente, modelo de um mutante de dissulfeto D486C/D489C com base em estrutura de cristal da proteína F pré-fusão sugeriu que uma ligação de dissulfeto intermolecular em 3.8À poderia ajudar a estabilizar adicionalmente a conformação pré-fusão (dados não mostrados). Mutações selecionadas foram combinadas com as mutações LZF57a, e avaliadas com D25 e 4D7 mAb específico de pré-fusão como descrito acima. Mutante LZF111a (que corresponde a LZF57a com mutação D486C/D489C) apresentou ligação de 4D7 diminuída em comparação com o constructo LZF57a, sugerindo que poderia adotar uma conformação mais semelhante a pré-fusão (figuras 4B, 4C e 4D). A figura 10 expõe o diagrama esquemático dos constructos LZF111 e LZF57.

[00155] Para caracterizar adicionalmente o mutante LZF111, proteínas F de RSV (DS-Cav1 e LZF111a) foram purificadas a partir de sobrenadantes de cultura com um método modificado adotado a partir do anteriormente descrito (McLellan 2013). Em resumo, suas proteínas marcadas foram purificadas usando cromatografia Ni-Sefarose (GE Healthcare). Marcadores foram removidos por digestão durante a noite com trombina. A digestão foi realizada durante diálise para reduzir a concentração de imidazol. Para remover contaminantes de eluição em conjunto e proteína F não clivada, as amostras foram submetidas a uma segunda etapa de cromatografia Ni-Sefarose. Proteínas F foram adicionalmente purificadas por cromatografia de filtração de gel (Superdex 200, GE Healthcare) e foram armazenadas em um tampão de 50 mM HEPES pH 7.5, análise de 300 mM NacCl.SDS-PAGE foi realizada sob condições redutora e não redutora para avaliar as formações de ligação de dissulfeto (figura 4D). Em resumo, amostras de proteína purificadas foram tratadas com tampão de carga SDS com ou sem agente redutor (Life Technologies), aquecidas a 95ºC por 2-3 minutos, e aplicadas a eletroforese de gel NuPAGE (Invitrogen). Géis foram coloridos com solução de coloração de Gel Code Blue (Pierce) e a coloração retirada com água. Em condições de redução, DS-Cavl apareceu como duas faixas no gel, representando os fragmentos F1 e F2 clivados, como esperado. Sob condições de não redução, DS-Cav1 apareceu principalmente como uma faixa perto de 50 kDa, representando um fragmento F1 clivado e um fragmento F2 mantidos juntos por ligações de dissulfeto nativas. Como esperado, mutante RSV de cadeia única LZF57 apareceu principalmente como uma faixa Fo monomérica não clivada no gel, sob qualquer condição. A alteração em mobilidade para LZF57 sob condições de redução e não redução é mais provavelmente causada por perda de compacidade sob condições de redução, levando a um peso molecular aparente aumentado. O mutante RSV de cadeia única LZF111 também apareceu principalmente como uma faixa FO monomérica não clivada no gel, sob condições de redução. Sob condições de não redução, embora haja duas faixas inferiores subdominantes em 50 kDa e 100 kDa consistentes com formas monoméricas e diméricas, a faixa dominante para LZF111 é deslocado para cima perto de 150 kDa, consistente com o peso molecular de um trímero. Como as mutações D486C/D489C foram a única diferença entre os constructos LZF57 e LZF111, esses dados sugerem que a ligação de dissulfeto intermolecular projetada se forma, realmente, na maioria das moléculas LZF111.

Exemplo 3: Estudos de estabilidade de LZF111

[00156] Para analisar as estruturas secundárias de proteínas F de RSV purificadas, espectros de dicroísmo circular (“CD”) foram adquiridos em um espectrômetro Chirascan (Applied Photophysics LtD, UK). As amostras foram analisadas após permuta de tampão em 10 mM Na2HPO, usando colunas de giro Zeba (Pierce) e diluição subsequente de 1:2 em 10 mM de Na2HPO4 fornecendo uma concentração de proteína final de 3.9 uM e 4.4 uM para DsCav-1 e LZF111, respectivamente. Espectros CD foram registradas não diluídos usando uma cuba de quartzo com 0,5 mm de comprimento de percurso. O controle de temperatura foi ajustado em 20ºC. A largura de banda foi ajustada em 1 nm. Pontos de dados entre 185 nm e 260 nm foram adquiridos em intervalos de 1 nm com 5 s de tempo de amostragem por ponto de tempo. Espectros de tampão e amostra foram adquiridos após 10 minutos de equilíbrio de temperatura aplicando três réplicas técnicas, respectivamente. Espectros médios de tampão foram subtraídos dos espectros de amostra. Pontos de dados resultantes foram suavizados com o algoritmo Savitzky-Golay (ordem polinomial 2, dois pontos de dados à esquerda e direita) usando o pacote de software Origin Pro 7.5 SR7 (Origin lab Corporation). Os espectros CD de DS-Cav1 e LZF111 eram quase idênticos (figuras 5A e 5B). Estruturas secundárias foram adicionalmente analisadas por reconstrução dos espectros CD (185 nm a 260 nm) usando uma rede neural que foi treinada em espectros CD de proteínas com estrutura 3D decomposta (software CDNN: Circular Dichroism Neuronal Network (Rede Neuronal de Dicroísmo circular) (figura 6), indicando que as modificações de LZF111 não levaram a alterações significativas em estruturas secundárias da proteína F pré-fusão.

[00157] Análises de fluorimetria de varredura diferencial (DSF) foram realizadas com proteínas DS-Cav1 e LZF111 para avaliar sua estabilidade. As soluções de proteína DS-Cav1 (0.27 — 35 uM) em 50 mM HEPES, 300 mM NaCl a pH 7.5 foram preparadas por diluição serial. O sinal de fluorescência de cada amostra de proteína de 85 ul em uma micro cuba de quartzo com um comprimento de percurso ótico de 3 mm x 3 mm (Thermo Fisher) foi detectada usando um fluorímetro Cary Eclipse equipado com um controlador de temperatura Cary (Agilent Technologies, CA). A fluorescência de proteína intrínseca foi registrada em 330 nm e 350 nm. O comprimento de onda de excitação foi ajustado em 280 nm com uma largura de fenda de 10 nm. A largura de fenda de emissão foi ajustada em 2,5 nm. A tensão de foto multiplicador foi ajustada antes de cada medição em valores entre 500V e 800V para maximizar o sinal de fluorescência. Experimentos de desdobramento térmico foram realizados usando uma rampa de temperatura de 1ºC/min. de 20ºC a 95ºC em incrementos de 0,5ºC. A amostra foi equilibrada na temperatura de partida por 1 min. e sinais de fluorescência foram mediados para cada ponto de dados por 1,5 s. Um suporte de múltiplas células permitiu análise de até 4 amostras simultaneamente. Dados brutos foram exportados para processamento adicional com Origin Proº7.5 SR7 para obter curvas de fusão de intensidade de fluorescência como uma função da temperatura. As curvas de fusão foram suavizadas (ordem polinomial = 1, número de pontos = 12), e centros de pico do primeiro derivado da razão entre 350 nm e 330 nm foram usados como temperaturas de fusão (Tm). Os dados foram normalizados pela intensidade de sinal mais alta para auxiliar a comparação de amostras de proteína ou concentrações de proteínas diferentes. Ds-Cav1 tem dois pontos médios de transição (60,85 + 1,98ºC e 80,7 + 0,93ºC), que foram apresentados como a média obtida de todas as concentrações de proteína analisadas para o mesmo tipo de amostra (Flynn et al. 2016) (figura 7). Para LZF111, a Tm apresentada (*81ºC) foi obtida a partir de uma concentração única de 15 uM (figura 7). À ausência da Tm inferior a “60,85ºC e o pico mais estreito para a Tm mais alta a “81ºC sugeriu que LZF111 tem estabilidade aperfeiçoada em comparação com DS-Cav1.

[00158] Estabilidade de longo prazo a 4ºC ou mais alta é um atributo desejável para um antígeno de vacina de subunidade.

Para avaliar a estabilidade de longo prazo de DS-Cav1l, usamos anteriormente ensaios de ligação de anticorpo com D25 e 4D7, bem como análises biofísicas.

Nossos dados demonstraram que após armazenagem de longo prazo a 4ºC, DS-Cav1 é submetida a uma alteração de conformação, adotando estruturas alternadas que obtêm a capacidade de ligar 4D7 (Flynn et al. 2016). Para avaliar a estabilidade de longo prazo de LZF111, proteína DS-Cav1 purificada ou constructo LZF111 foi armazenado congelado ou a 4ºC por 1, 2 ou 3 meses, e avaliada com D25, 4D7 e palivizumabe em um ensaio de ligação ELISA.

Em resumo, proteínas purificadas foram diluídas a 1 ug/mL com PBS e revestidas em placa ELISA de 96 poços (NUNC) durante a noite a 4ºC.

Sítios não ligados foram bloqueados por adição de albumina de soro bovino (BSA) a 2% (v/v) em PBS e incubação por 1 hora em temperatura ambiente.

As placas foram lavadas com PBS contendo 0,05% (v/v) Tweenº 20 (polisorbato 20) (PBS-T) e incubadas com diluições seriais de anticorpos (D25 ou palivizumabe) em temperatura ambiente por 1 hora.

As placas foram lavadas novamente com PBS-T e incubadas por 1 hora em temperatura ambiente com anticorpo secundário conjugado com HRP IgG anti-ccamundongo (para 4D7) ou anti-humano de cabra (para D25 e palivizumabe) (Thermo Fisher) diluído 1:2.000. Após uma lavagem adicional com PBS-T e enxague breve com ddH7O, substrato ELISA Super AquaBlue (eBioscience) foi adicionado e a placa foi imediatamente lida a 405 nm por 5 min. mOD/min. foi calculado para cada poço.

As figuras 84, 8B e 8€ mostram que após 1 mês de armazenagem a 4ºC, enquanto as relatividades de D25 e palivizumabe foram mantidas para ambos os constructos, um aumento significativo em ligação de 4D7 foi detectado com DS-Cav1, porém não com LZF111 aperfeiçoado.

Além disso, nenhuma ligação de 4D7 aumentada foi observada com LZF111 após 2e 3 meses de armazenagem a 4ºC (figuras 8D e 8E), sugerindo que estabilidade de longo prazo de LZF111 é superior a DS-Cav1.

Exemplo 4: Estudos de imunogenicidade

[00159] Um estudo de imunogenicidade de camundongo foi projetado para comparar a imunogenicidade de vacinas de subunidade LZF111 e DS-Cav1. Animais testados foram camundongos fêmeas BALB/c obtidos de Charles River Laboratories. 10 camundongos por grupo foram imunizados duas vezes com três doses diferentes (2 ug, 0,4 ug e 0,2 ug) de proteínas DS-Cav1 ou LZF111a purificadas com adjuvantes de alumínio nas semanas O e 3. Sangramentos foram coletados 2 semanas após cada imunização e soros foram analisados. Para avaliar os títulos de anticorpo de ligação contra proteína F pré-fusão, placas de microtítulo 12HB immulon (NUNC) foram revestidas com 2 ug/mL de proteína F de RSV recombinante purificada DS-Cav1, e incubadas a 4ºC durante a noite. As placas foram então lavadas e bloqueadas por 1 hora com PBS-T contendo leite desnatado a 3% (tampão de bloqueio) em temperatura ambiente. Amostras de teste foram diluídas em série 4 vezes em tampão de bloqueio (iniciando em diluição de 1:50), transferidas para as placas revestidas com F de RSV, e incubadas por 2 horas em temperatura ambiente. Após três lavagens com PBS- T, anticorpo secundário IgG anti-camundongo conjugado com HRP (Invitrogen) diluído 1:3.000 em tampão de bloqueio foi adicionado às placas e incubado por um período adicional de 1 hora. As placas foram lavadas novamente e reveladas com SuperBlu Turbo TMB (Virolabs) no escuro. A reação foi parada após 5 minutos e absorvência foi lida a 450 nm em uma leitora de microplaca ELISA VersaMax (Molecular Devices). Títulos ELISA ED10, que indicaram a diluição efetiva da amostra de soro que fornece 10% do sinal máximo, foram determinados por ajuste de curva de quatro parâmetros em software GraphPad Prism 7. A figura 9A mostra os títulos ELISA ED10 contra proteína F pré-fusão de 2 soros pós dose. A linha tracejada horizontal inferior indica limite de detecção.

Os dados mostraram que LZF111 induziram níveis de anticorpo F anti-pré-fusão similares em comparação com DS-Cav1 através de doses diferentes.

[00160] O ensaio de neutralização também foi realizado em soros de camundongo que foram tratados a 56ºC por 30 min. para inativar complemento antes do teste. Diluições seriais duas vezes de amostras de soro foram preparadas em EMEM contendo 2% FBS iniciando em diluição de 1:4. Soro diluído foi adicionado em duplicata a placas com 96 poços e misturado com cepa Long RSV (100 pfu/mL) em 100 ul de volume total. A mistura de amostras de soro e vírus foi incubada por 1 hora a 37ºC com 5% CO». Após incubação, células Hep-2 em uma concentração de 1,5 x 10º células por poço foram adicionadas. As placas foram incubadas por 3 dias a 37ºC com 5% CO». As células foram então lavadas e fixadas com acetona a 80% por 15 minutos. Células infectadas com RSV foram então imunocoloridas. Em resumo, anticorpos monoclonais específicos de N e F de RSV foram adicionadas às placas de teste com células fixadas e incubados por 1 hora em temperatura ambiente. Após lavagem, lgG anti- camundongo de cabra biotinilado foi adicionado e incubado por 1 hora. As placas foram lavadas novamente e reveladas por um sistema de detecção quase infravermelho (NID) de canal dual. Corante infravermelho-Estreptavidina para detectar sinal específico de RSV e duas colorações de células para normalização de ensaio foram adicionados às placas de 96 poços e incubadas por 1 hora no escuro. As placas foram lavadas, secas no escuro por 20 minutos e lidas no Sistema de Imageamento Automatizado Licor Aerius1 utilizando um laser de 700 canais para normalização de células e um laser de 800 canais para detecção de sinal específico de RSV. As razões 800/700 foram calculadas e títulos de neutralização de soro (IC50) foram determinadas por ajuste de curva de quatro parâmetros em software GraphPad Prism 7. Títulos de neutralização de soro de soros PD2 contra cepa Long RSV foram mostrados na figura 9B. A linha tracejada horizontal inferior indica limite de detecção. Os dados mostraram que LZF111 induziu níveis similares de anticorpos de neutralização em comparação com DS- Cav1 através de doses diferentes.

Exemplo 5: Estudo de Imunogenicidade de rato de algodão

[00161] Nesse exemplo, ensaios foram realizados para testar a imunogenicidade e eficácia de vacinas MRNA/LNP no modelo de desafio de RSV de rato de algodão. Mais especificamente, ratos de algodão Sigmodon hispidus fêmeas foram usadas e imunizações começaram com 6-7 semanas de idade. As vacinas MRNA usadas foram geradas e formuladas em nanopartículas de lipídio. As vacinas de MRNA avaliadas nesse estudo incluíram: DS-Cav1 ligada por membrana MRK-O4 (proteína F de pré-fusão estabilizada) DS-Cav1 ligada por membrana MRK-04 nopolyA 3mut (proteína F de pré- fusão estabilizada) mMDS-Cav1 sc9 de cadeia única ligada por membrana mVRC-1 (v2), A149C, Y458C (proteína F de pré-fusão estabilizada) mDS-Cav1 de cadeia única ligada por membrana mLZF-111, D486C, D489C (proteína F pré-fusão estabilizada).

[00162] Os grupos de 8 ratos de algodão foram imunizados por via intramuscular com 100 uL de vacina, aplicada com injeções de 50 ul em cada quadríceps. Os grupos foram vacinados com as seguintes vacinas: Cone lug/ml Dose (us) MRK-04, 1.M. MRK-04 nopolyA 3mut, L.M. MRK-04 nopolyA 3mut, L.M. MRK-04 nopolyA 3mut, |.M. |6 | mvRC1(V2)IM. MVRC-1 (2), L.M. [8 ——JmvRC1(V2), IM.

[9 Imeenm Bo Bs

[00163] Os animais foram imunizados no dia O e dia 28 do experimento. No dia 28 e 56, sangue foi retirado de cada animal e usado para ensaios sorológicos. No dia 56, os ratos de algodão foram desafiados por via intranasal com 1x10º* PFU RSV A2. Quatro dias após inoculação, os animais foram sacrificados por inalação de CO, e cornetos nasais e de pulmão (lobos esquerdos) foram removidos e homogeneizados em 10 volumes de Solução de Sal equilibrada Hanks (Lonza) contendo SPG em gelo molhado. As amostras foram clarificadas por centrifugação a 2000 rpm por 10 minutos, formadas em alíquota, congeladas instantaneamente e armazenadas imediatamente congeladas a -70ºC.

Ensaio de neutralização RSV:

[00164] Soros de rato de algodão de cada animal foram avaliados em relação à neutralização de RSV-A (cepa Long) usando os seguintes procedimentos:

[00165] 1. Todas as amostras de soro foram inativadas por calor por colocar em incubador de banho seco ajustado a 56ºC por 30 minutos. As amostras e soros de controle foram então diluídos 1:3 em diluente de vírus (2% FBS em EMEM) e amostras duplicatas foram adicionadas a uma placa de ensaio e diluídas em série.

[00166] 2. Vírus de material RSV-Long foi removido do congelador e rapidamente descongelado em banho de água a 37ºC. Os vírus foram diluídos em 2000 pfu/mL em diluente de vírus.

[00167] 3. 50 ul de vírus diluído foi adicionado a cada poço da placa de 96 poços, com a exceção de uma coluna de células, que foi usada como um controle “sem vírus”.

[00168] 4. Células HEp-2 foram tripsinizadas, lavadas, suspensas novamente em 1,5 x 10º células/ml em diluente de vírus, e 100 mL das células suspensas foram adicionadas a cada poço da placa de 96 poços. As placas foram então incubadas por 72 horas a 37ºC, 5% CO».

[00169] 5. Após a incubação de 72 horas, as células foram lavadas com PBS e fixadas usando acetona a 80% dissolvida em PBS por 10-20 minutos a 16-24ºC. O fixativo foi removido e as placas foram deixadas secar em ar.

[00170] 6. As placas foram então lavadas totalmente com PBS + 0,05% Tween. Os anticorpos monoclonais de detecção, 143-F3-1N8 e 34C9 foram diluídos a 2,5 ug/mL em diluente de ensaio (1% BSA-PBS-0,1% Tween) e 50 ul dos anticorpos diluídos foram adicionados a cada poço da placa de 96 poços. As placas foram então incubadas em uma câmara úmida a 16-24ºC por 6-75 minutos em oscilador.

[00171] 7. Após a incubação, as placas foram totalmente lavadas.

[00172] 8. IgG anti-ccamundongo de cavalo biotinilado foi diluído 1:200 em diluente de ensaio e adicionado a cada poço da placa de 96 poços. As placas foram incubadas como acima e lavadas.

[00173] 9. Um coquetel de solução de IRDye 800CW Estreptavidina (diluição final 1:1000), Sapphire 700 (diluição 1:1000) e SMM DRAQS (diluição 1:10.000) foi preparado em diluente de ensaio e 50 mL do coquetel foi adicionado a cada poço da placa de 96 poços. As placas foram incubadas como acima no escuro, lavadas e deixadas secar em ar.

[00174] 10. As placas foram então lidas usando um Imageador Aerius. Títulos de neutralização de soro foram então calculados usando um ajuste de curva de 4 parâmetros em Graphpad Prism.

[00175] Os títulos determinados pós dose 1 (dia 28) e pós dose 2 (dia 56) são mostrados na figura 11. Verificou-se que os títulos de neutralização foram eliciados em um modo dependente de dose para todas as vacinas de mRNA.

Todas as vacinas de mMRNA resultaram em títulos aumentados após uma segunda dose independente da dose avaliada. Tanto mVRC-1 (v2) como mLZF111 induziram títulos mais altos do que MRK-O04 e MRK-O4 nopolyA 3mut demonstrando títulos de neutralização de soro superiores ou similares em uma dose 5 vezes mais baixa.

AlphaLISA de competição

[00176] A resposta imune a epítopos específicos em proteína F de RSV para anticorpos de neutralização foi caracterizada. O sítio antigênico Il é o sítio de ligação para palivizumabe, um anticorpo monoclonal desenvolvido para a prevenção de infecção respiratória inferior com RSV em crianças em bebês em risco. O sítio antigênico O é um sítio de ligação para anticorpos de neutralização mais potentes que são eliciados por infecção natural com RSV. Adicionalmente, geramos um anticorpo (4D7) que é direcionado ao sítio |, um epítopo não apresentado na conformação pré-fusão. Portanto, em contraste com D25, extração de anticorpos de competição de 4D7 sugeriria a geração in vivo de proteínas semelhantes a F posteriores. Um alphaLISA de competição foi desenvolvido para caracterizar a resposta do sítio antigênico O, sítio antigênico | e sítio antigênico Il às várias vacinas baseadas em mRNA.

[00177] Para medir títulos de anticorpo concorrentes, 10 ul de amostras diluídas em série em tampão HiBlock (PerkinElmer) são colocadas em uma placa alphaLISA de 384 poços. Amostras diluídas são misturadas com 5 ul de glóbulos aceptores AlphaLISA (100 ug/ml) que foram anteriormente conjugadas com uma proteína F de RSV estabilizada pré-fusão (DS-Cav1) ou uma proteína F de RSV pós-fusão (wt F de RSV). Após 30 min. de incubação em temperatura ambiente, ul de D25 biotinilado, palivizumabe ou anticorpo 4D7 diluído em tampão Hiblock são adicionados a cada poço. Após um período adicional de 30 minutos de incubação, 25 ul de glóbulos doadores de estreptavidina (20 ug/ml) em tampão HiBlock são adicionados a cada poço e incubados por 30 min. no escuro. A placa é então lida em uma Leitora EnVision Alpha (615 nm de detecção).

[00178] Os títulos de anticorpo concorrentes palivizumabe, D25 e 4D7 medidos no dia 56 (4 semanas PD2) são apresentados na figura 12. Os dados de competição revelaram que mVRC-1 (v2) induziu níveis inferiores de anticorpos concorrentes F pós-fusão 4D7, enquanto os títulos pré-fusão D25 e títulos de palivizumabe não são afetados. Esse perfil de competição diferente correlaciona com mRNA mVRC-1 (v2) expressando uma proteína mais estabilizada em pré- fusão do que MRK-04 nopolyA 3mut e mLZF-111.

C. Resultados de desafio de rato de algodão

[00179] Os procedimentos para medir títulos RSV nos homogeneizados de nariz e pulmão de ratos de algodão são descritos abaixo. Os homogeneizados de nariz e pulmão foram clarificados por centrifugação e diluídos 1:10 e 1:100 em EMEM. Monocamadas HEp-2 confluentes foram infectadas em duplicatas com 50 ul por poço começando com amostras não diluídas (puras) seguido por homogeneizados diluídos em placas de 24 poços. Após uma hora de incubação a 37ºC em um incubador de CO? a 5%, os poços foram cobertos com meio de metil celulose a 0,75% e as placas recuperadas para o incubador a 37ºC. Após 4 dias de incubação a cobertura foi removida e as células foram fixadas com 0,1% de coloração de violeta cristal por uma hora, a seguir enxaguadas e secas a ar. As placas foram contadas e títulos de vírus foram expressos como unidades de formação de placa por grama de tecido.

[00180] Para avaliar a proteção mediada por vacina, títulos virais foram medidos em pulmão e nariz 5 dias após o desafio. Todas as vacinas de MRNA obtiveram proteção total no pulmão, porém mVRC-1 (v2) e mMLZF111 mostraram proteção aperfeiçoada no nariz, demonstrando eficácia superior ou similar a MRK-04 e MRK-04 nopolyA 3mut, em uma dose 5 vezes mais baixa (figura 13).

Exemplo 6: Imunogenicidade e eficácia em Macaco Verde africano

[00181] Nesse exemplo, ensaios foram realizados para testar a imunogenicidade e eficácia de vacinas de MRNA/LNP no modelo de desafio RSV de Macaco Verde africano.

[00182] Mais especificamente, Macacos Verdes africanos adultos machos e fêmeas com pesos corpóreos variando de 1,6 a 2,65 kg, que foram confirmados como sendo negativos para RSV por título de anticorpo de neutralização, foram usados. As vacinas MRNA usadas foram geradas e formuladas em nanopartículas de lipídio. As vacinas MRNA avaliadas nesse estudo incluíram: DS-Cav1 ligada por membrana MRK-04 nopolyA 3mut (proteína F pré- fusão estabilizada) mDS-Cav1 sc9 de cadeia única ligada por membrana mVRC-1 (v2), A149C, Y458C (proteína F pré-fusão estabilizada) mMDS-Cav1 de cadeia única ligada por membrana mLZF-111, D486C, D489C (proteína F pré-fusão estabilizada).

[00183] Os grupos de 4 Macacos Verdes africanos foram imunizados por via intramuscular com 500 ul de vacina em um deltoide. Os grupos foram vacinados com as seguintes vacinas como na Tabela 1.

Tabela 1. Formulações de vacinas testadas em relação à Imunogenicidade em Macacos Verdes Africanos Conc. (ug/ml) — | Dose (ug) MRK-04 nopolyA 3mut, L.M. MRK-04 nopolyA 3mut, L.M. MVRC-1 (v2) MVRC-1 (v2) mLZF-111 6 me RSV A2 5.5/0g10pfu, |.N. [8 Nenhuma UN NA

[00184] Os animais foram imunizados no dia O, dia 28 e dia 56 do experimento. Nos dias O, 14, 28, 42, 56 e 70, sangue foi retirado de cada animal e usado para ensaios sorológicos. No dia 70, os Macacos Verdes africanos foram desafiados por via intranasal com 1x10”*” PFU RSV A2. Esfregaços nasofaríngeos foram coletados nos dias 1-14 após desafio e amostras de lavagem de pulmão foram coletadas nos dias 3, 5, 7, 9, 12 e 14 após desafio para testar em relação à replicação viral.

A. Ensaio de neutralização de RSV:

[00185] Soros de macacos de cada animal foram avaliados em relação à neutralização de RSV-A (cepa Long) como descrito acima. Os títulos NTsodeterminados após dose 1 e após dose 2 são mostrados na figura 14. Os títulos foram vistos como aumentando após cada dose de todos os grupos que receberam vacinas de MRNA. Os GMTs obtidos com vacinas MRNA na semana (2 semanas após a dose 3) foram 1 a 2 ordens de magnitude mais altos do que nos animais que receberam RSV A2 dependendo da dose e mRNA em teste. Amostras de soro a partir de animais imunizados com mVRC-1 (v2) apresentaram os títulos de neutralização mais altos, demonstrando uma potência cinco vezes mais alta em relação a MRK-04 nopolyA 3mut.

B. ELISA de competição

[00186] Títulos de ELISA de competição foram determinados para palivizumabe, D25 e 4D7 para caracterizar a resposta do sítio antigênico O, sítio antigênico | e sítio antigênico |l as várias vacinas baseadas em mRNA como descrito acima.

[00187] Os títulos de anticorpo de competição de palivizumabe, D25 e 4D7 medidos na semana 10 (2 semanas PD3) são apresentados na figura 15. Os dados de competição revelaram que níveis mais baixos induzidos por mMVRC-1 (v2) de anticorpos concorrentes F pós-fusão-4D7, enquanto títulos pré-fusão-D25 e títulos de palivizumabe não são afetados. Esse perfil de competição diferente correlaciona com mMRNA mVRC-1 (v2) expressando uma proteína mais estabilizada em pré-fusão do que MRK-04 nopolyA 3mut e mLZF-111.

C. Resultados de desafio de Macaco Verde africano

[00188] Como mencionado acima, para avaliar a eficácia da vacina os Macacos Verdes africanos foram desafiados por via intranasal com 1x10”* PFU RSV A2 no dia 70 após vacinação e esfregaços nasofaríngeos e amostras de lavagem de pulmão foram coletadas após desafio para testar em relação à presença de vírus.

[00189] Para medir títulos RSV nas amostras de lavagem de pulmão de Macacos Verdes africanos um procedimento de ensaio de placa viral para medir títulos virais foi seguido como delineado abaixo. Em resumo, as amostras foram diluídas e adicionadas e duplicata a placas de 24 poços contendo monocamadas de célula HEp-2 confluentes. As placas foram incubadas a 37ºC por uma hora. Após incubação de uma hora, inóculo de amostra foi aspirado e 1 ml de cobertura contendo 0,75% de metil celulose foi adicionado. As placas foram incubadas a 37ºC por 5 dias. Após a incubação de 5 dias, as células foram fixadas e coloridas com solução de glutaraldeído/violeta cristal. As placas foram contadas e títulos foram expressos como pfu/ml. A análise de teor viral em fluido de lavagem broncoalveolar (BAL) (figuras 16A-16C) revelou que somente mVRC- 1 (v2) (25 uu) conferiu proteção total no pulmão, e proporcionou a melhor proteção em uma dose menor (5 ug).

[00190] Para medir títulos de RSV nos esfregaços nasofaríngeos de Macacos Verdes africanos um ensaio de RT-gPCR RSV para detectar RSV A foi realizado como a seguir: 1) Equipamentos e materiais: A. Equipamentos

1. Sistema PCR em tempo real Stratagne Mx3005P e software MxPro

2. Centrífuga Jouan GR422 ou equivalente

3. Portadores de placa Jouan ou equivalente B. Reagentes

1. Kit de sonda Rt-PCR Quantitectº (1000) catálogo tt 204445

2. Água, Primee 5, isenta de Protease e isenta de DNAse de Tipo de Biologia Molecular, catálogo tt 2900136

3. Tampão TE, 10mM Tris 1mMM EDTA pH 8.0, Fisher Bioreagents, catálogo H BP2473-100 4, Iniciadores virais: Iniciadores avançado e inverso RSV A, customizado por Sigma, purificado por HPLC. Materiais Iniciadores são reconstituídos a 100uUM em água tipo Molecular e armazenados a -20ºC.

5. Sonda rotulada dual RSV, customizada por Sigma, purificada por HPLC. Materiais de sonda são reconstituídos a 100uM em tampão TE e armazenados a -20ºC protegidos da luz.

6. Padrão RSV A foi gerada internamente e armazenado a -20ºC. Padrões para o ensaio foram gerados por projetar pares de Iniciador para o gene N de RSV A. O comprimento do produto para o padrão RSV A é 885 bp. QIAGEN OneStep RT-PCR foi usado para gerar esse padrão.

7. Promega, Kit de Purificação de ácido nucleico total Viral Maxwellº 16 (Produto tt AS1150) C. Suprimentos

1. Tira 8x Stratagne Optical cap, catálogo no. 401425

2. Placas de 96 poços Stratagne Mx3000P, com aba, catálogo no. 401334

3. Pontas de pipeta com filtro ART 2) Reações e montagem de RT-PCR

A. Preparação de Mistura mestre completa

1. Preparar Mistura mestre completa após a montagem abaixo para um volume de reação final de 50 ul. A tabela a seguir é volume por poço. Concentração final de iniciador é 300 nM e concentração final de sonda é 200 nM.

2. Adicionar 45 ul de mistura mestre completa a cada poço. Cobrir a placa com tampa de placa e envolver em folha de alumínio para proteger contra luz.

B. Preparação de curva padrão

1. Remover padrão a partir de -20ºC.

2. Diluir padrões até concentrações finais de 1e6 cópia/5uL a 1cópia/S5uLl usando diluições de 10 vezes C. Preparação de amostra

1. Esfregaço nasofaríngeo e amostras de lavagem de pulmão são preparados para a reação RT-PCR usando o Kit de Purificação de ácido nucleico total viral Maxwellº 16 (Promega, produto tt AS1150).

2. 200 uL de amostra são extraídos após o protocolo de fabricação e eluídos em 50 ul para serem usados em reações PCR.

D. Adições de amostras

1. Adicionar Sul de amostras extraídas a poços apropriados. Após adição de amostras, tampar cuidadosamente os poços de amostra antes de adicionar curvas padrão.

2. Adicionar 5ul de padrão diluído a poços apropriados e tampar.

3. Adicionar 5ul de água tipo molecular a poços Sem Controle de gabarito

(NTC).

4. Envolver as placas em folha de alumínio e transferir as placas para centrífuga.

5. Girar as placas por 2 min. a 100 rpm para puxar para baixo quaisquer amostras ou mistura mestre que possam ficar nos lados do poço.

6. Envolver as placas em folha de alumínio e transferir para instrumento de Stratagne.

E. Termociclador: Stratagne MX 3005P

1. Colocar as placas em Stratagne Mx3005P e ajustar as condições de perfil térmico em: | Cielagem de 2 etapas | LO Desnaturação Rs [Número de cielos aj

2. Analisar os resultados usando o software Stratagne Mx3005p.

[00191] O número de cópia RNA médio detectado nas amostras de nariz é apresentado nas figuras 17A — 17C. O efeito de proteção de todas as vacinas baseadas em mRNA foi menos evidente no nariz, porém novamente mVRC-1 (v2) demonstrou uma eficácia 5 vezes mais alta em relação a MRK- 04 nopolyA 3mut.

Exemplo 6: Imunogenicidade em Macacos Verdes africanos em experiência com RSV

[00192] A imunogenicidade de vacinas MRNA formulada em LNP foi testada em Macacos Verdes africanos em experiencia com RSV.

[00193] Macacos Verdes africanos adultos, saudáveis de qualquer sexo (n=4 ou 5/grupo) com pesos corpóreos variando de 2,85 a 4,65 kg, que foram confirmados ser soropositivos para RSV por ELISA e títulos de anticorpo de neutralização, foram selecionados para o estudo. O grupo de animais selecionados para esse estudo tinha sido experimentalmente infectado com RSV em estudos anteriores e foi distribuído através de grupos de estudos com base em seus títulos de neutralização RSV pré-estudo de modo que todos os grupos teriam GMTs de grupo similar no início do estudo. Animais em experiência com RSV proveem um modelo de resposta de recordação de memória imune à vacinação que pode refletir nas respostas que podem ser previstas em adultos humanos soropositivos, com o aviso de que a resposta de anticorpo em AGMs após exposição a RSV é mais tendenciosa a epítopos de proteína F pós-fusão do que o repertório imune humano.

[00194] Uma dose de vacina única foi administrada em cada animal na semana O por via intramuscular (IM). Um grupo de controle recebendo somente PBS também foi incluído no design de estudo. As vacinas foram administradas como descrito na Tabela 2. Após vacinação, os animais foram observados diariamente em relação a quaisquer alterações no sítio de inoculação ou outras alterações em hábitos de alimentação ou atividade que poderiam indicar uma reação adversa à vacina, porém nenhum foi observado. Amostras de soro foram coletadas para avaliação de títulos de anticorpo de neutralização de RSV, bem como títulos de anticorpo concorrentes de palivizumabe (sítio II), D25 (sítio OD) e D47 (sítio |).

Tabela 2: Formulações de vacina testadas em relação à Imunogenicidade em Macacos Verdes africanos soropositivos a RSV [6 | Nenhuma(PBS) UU NANA

[00195] Títulos NT5so de animais individuais foram medidos em amostras de soro coletadas na linha de base e 2 semanas após vacinação usando métodos descritos acima e os resultados são mostrados na figura 18. Verificou-se que todas as vacinas eram altamente imunogênicas como demonstrado pelo aumento em níveis de anticorpos de soro ligando proteínas F de RSV (F de RSV tanto pré-fusão como pós-fusão, dados não mostrados) e aumenta em níveis de anticorpo de neutralização de soro. MVRC-1 (v2) induziu o reforço mais alto em títulos de neutralização (>100 vezes na dose mais alta), e apresentou potência similar em uma dose 5 vezes mais baixa em relação a MRK-04 nopolyA 3mut. Similarmente, mLZF-111 também demonstrou potência aumentada em relação a MRK-04 nopolyA 3mut. Nenhum aumento em títulos foi observado no grupo de controle de PBS.

[00196] Para avaliar a qualidade das respostas de reforço nos animais vacinados, títulos de anticorpo concorrentes de palivizumabe (sítio 1I), D25 (sítio O) e 4D7 (sítio |) foram determinados em soro coletado 2 semanas após vacinação (figura 19). Como descrito acima, sítio antigênico Il é um epítopo de neutralização encontrado na conformação tanto pré-fusão como pós-fusão da proteína F, sítio O é um epítopo de neutralização específico de pré-fusão e 4D7 é um epítopo específico de pós-fusão. Devido à tendência imune de linha de base à conformação pós-fusão, AGMs em experiência com RSV não têm títulos de anticorpo concorrente D25 detectáveis antes da imunização. Entretanto, todos os três antígenos de mRNA induziram títulos de anticorpos concorrentes D25 altos, demonstrando que AGMs montam uma resposta imune de sítio O antigênico após infecção por RSV que pode ser reforçada por imunização. O reforço em títulos de anticorpo concorrente D25 após imunização de mVRC-1 (v2) foi o mais alto (>450 vezes), e demonstrando novamente potência similar em uma dose 5 vezes mais baixa do que o MRK-04 nopolyA 3mut. Em contraste com animais não estabelecida (ratos de algodão e AGMs) observamos um alto reforço de anticorpos específicos de 4D7/pós-F em AGMs em experiência com RSV no grupo mVRC-1 (v2), demonstrando que o grupo de anticorpo de linha de base pode determinar o resultado do perfil de anticorpo específico de epítopo após imunização. Uma vez que se imagina que o pool de memória de célula B a partir de infecção por RSV natural em seres humanos seja fortemente tendencioso à conformação pré-fusão, especulamos que a imunização mMVRC-1 (v2) em seres humanos reforçará preferencialmente anticorpos contra esses epítopos, sabidos como tendo atividade de neutralização mais potente, levando à eficácia aumentada em relação a MRK-04 nopolyA 3mut. Tabela 3: Sequência de ligantes de aminoácido, sítio de clivagem TEV, sítio de clivagem de Trombina e Marcador Strep SEQID NO: Ligante de 8 aminoácidos GGGSGGGS 1 Ligante de 10 aminoácidos — | GGGSGGGSEG Ligante de 12 aminoácidos GGGSGGGSCGGGS 3 Ligante de 15 aminoácidos — | GGGSGGESCEGSES Ia | GGGS [ ao | Sítio de clivagem TEV ENLYFOS 5 Marcador Strep WSHPQFEK 6 Sítio de clivagem de trombina | LVPRGS | Fodon == | SAIGGYIPEAPRDGOAYVRKDGEWVLLISTEL | —==s8 =| MELLILKANAITTILTAVTFCFASG 1 9 | Tabela 4: Sequências de polipeptídeo antigênico Nome sequênia = === | SEQIDNO:

MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYOSTCSAV SKGYLSALRTGWYTSVITIELSNIKENKCNGTDAKVKLIK QELDKYKNAVTELQLLMOSTPPTNNRARRELPRFMNY TLNNAKKTNVTLSKKRKRRFLGFLLGVGSAIASGVAVSK

VLHLEGEVNKIKSALLSTNKAVVSLSNGVSVLTSKVLDL Sequência de KNYIDKQLLPIVNKQSCSISNIETVIEFQQKNNRLLEITRE referência de proteína FSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDOKKLM 10

F RS SNNVOQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYVVQLPLYGVIDTPC WKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVS FFPOAETCKVOSNRVFCDTMNSLTLPSEINLCNVDIFN PKYDCKIMTSKTDVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNK NRGIIKTFSNGCDYVSNKGMDTVSVGNTLYYVNKQEG KSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQOSLA FIRKSDELLHNVNAGKSTTNIMITTIIVIIVILLSLIAVGLL

| | YekARSTPVTLSKDAQLSGINNIARSN [|

MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYOSTCSAV SKGYLSALRTGWYTSVITIELSNIKENKCNGTDAKVKLIK QELDKYKNAVTELQLLMOSTPATNNRARRELPRFMNY

TLNNAKKTNVTLSKKRKRRFLGFLLGVGSAIASGVAVSK Sequência de VLHLEGEVNKIKSALLSTNKAVVSLSNGVSVLTSKVLDL referência WT FRSV | KNYIDKQLLPIVNKQSCSISNIETVIEFQQKNNRLLEITRE com um domínio FSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDOKKLM Ffoldon (negrito) SNNVOQIVROOSYSIMSIIKEEVLAYVVOQLPLYGVIDTPC 11 substituindo WKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVS aminoácidos 514 a 574 | FEPQAETCKVOSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNVDIFN de RSV F WT PKYDCKIMTSKTDVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNK

NRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQEG KSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQOSLA FIRKSDELLHNVNAGKSTTNIMITTGYIPEAPRDGOQAY VRKDGEWVLLSTFL

MELLILKANAITTILTAVTFCFASGOQNITEEFYOSTCSAV Sequência de SKGYLSALRTGWYTSVITIELSNIKENKCNGTDAKVKLIK ectodomínio RSV F WT QELDKYKNAVTELQLLMOSTPATNNRARRELPRFMNY (A sequência contém TLNNAKKTNVTLSKKRKRRFLGFLLGVGSAIASGVAVSK Idon em negrito VLHLEGEVNKIKSALLSTNKAVVSLSNGVSVLTSKVLDL seguido por um Sto de KNYIDKQLLPIVNKQSCSISNIETVIEFQQKNNRLLEITRE clivagem TEV, um FSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDOKKLM marcador strep, um SNNVQIVRQOSYSIMSIIKEEVLAYVVQLPLYGVIDTPC 12 ligante (sublinhado), WKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVS um marcador strep, FFPOAETCKVOSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNVDIFN outro ligante PKYDCKIMTSKTDVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNK (sublinhado) e um NRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQEG marcador His (em KSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLA itálico) FIRKSDELLHNVNAGKSTTNIMITTGYIPEAPRDGQAY

VRKDGEWVLLSTFLENLYFOSWSHPQFEKGGGSGGG SGGGSWSHPQFEKGSGSGSHHHHHHHH MELLILKANAITTILTAVTFCFASGOQNITEEFYQOSTCSAV SKGYLSALRTGWYTSVITIELSNIKENKCNGTDAKVKLIK QELDKYKNAVTELQLLMOSTPATNNRARRELPRFMNY TLNNAKKTNVTLSKKRKRRFLGFLLGVGSAIASGVAVC

KVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAVVSLSNGVSVLTFKVLD Sequência de peptídeo LKNYIDKQLLPILNKQOSCSISNIETVIEFQQKNNRLLEITR DS-Cav1 (sequência EFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDOQKKL 13 foldon em negrito) MSNNVOQIVRQOSYSIMCIIKEEVLAYVVQLPLYGVIDTP

CWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSV SFFPQAETCKVOSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNVDIF NPKYDCKIMTSKTDVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASN KNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQE GKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSL AFIRKSDELLSAIGGYIPEAPRDGQAYVRKDGEWNVLLS

E] |

MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQOSTCSAV

SKGYLSALRTGWYTSVITIELSNIKENKCNGTDAKVKLIK LF 40: QELDKYKNAVTELQLLMGGGSGGGSAIASGVAVCKVL A sequência contém | HLEGEVNKIKSALLSTNKAVVSLSNGVSVLTFKVLDLKN um ligante de 8 YIDKQLLPILNKQSCSISNIETVIEFQQKNNRLLEITREFS aminoácidos (negrito e | YNASVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDOKKLMS sublinhado), NNVOQIVRQQOSYSIMCIIKEEVLAYVVOQLPLYGVIDTPC 1 substituições DS-Cav1 |) WKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVS (S155C, s290C, s190F e | FFPOAETCKVASNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNVDIFN V2071) e um foldon e. | PRYDEKIMTSKTDVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNK terminal (negrito). — | NRSIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQEG

KSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLA FIRKSDELLSAIGGYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLST

FL LZF 40(a): A sequência contém — | MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAV um ligante de 8 SKGYLSALRTGWYTSVITIELSNIKENKCNGTDAKVKLIK aminoácidos (negrito e | QELDKYKNAVTELQLLMGGGSGGGSAIASGVAVCKVL sublinhado), HLEGEVNKIKSALLSTNKAVVSLSNGVSVLTFKVLDLKN substituições DS-Cav1 | YVIDKQLLPILNKQSCSISNIETVIEFQQKNNRLLEITREFS (S155C, S290C, S190F e | VNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDOKKLMS V207L), um foldon c- | NNVOIVRQQOSYSIMCIIKEEVLAYVVQLPLYGVIDTPC 15 terminal (negrito), um | WKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVS ligante GG FFPQAETCKVOSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNVDIFN (sublinhado), um sítio | PKYDCKIMTSKTDVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNK de clivagem de NRGIIKTESNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQEG trombina, um KSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLA marcador His, um — | FIRKSDELLSAIGGYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLST ligante SA (sublinhado) | FIGGLVPRGSHHHHHHSAWSHPQFEK e um marcador strep.

MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQOSTCSAV LF 55: SKGYLSALRTGWYTSVITIELSNIKENKCNGTDAKVKLIK A sequência contém | | QELDKYKNAVTELQLLMGGGSGGGSGGAIASGVAVC um ligante de 10 KVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAVVSLSNGVSVLTFKVLD aminoácidos (negrito e | IKNVIDKQLLPILNKQOSCSISNIETVIEFQQKNNRLLEITR sublinhado), EFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDOKKL 16 Substituições Ds-Cav1 | MSNNVQIVRQQSYSIMCIIKEEVLAYVVQLPLYGVIDTP (S155C, S290C, s190F e | CWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSV V2071) e um foldon e. | SFFPOAETCKVOSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNVDIF terminal (negrito). — | NPKYDCKIMTSKTDVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASN

KNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQE GKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSL AFIRKSDELLSAIGGYIPEAPRDGOQAYVRKDGEWVLLS

TFL LZF 55a: A sequência contém MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAV um ligante de 10 SKGYLSALRTGWYTSVITIELSNIKENKCNGTDAKVKLIK aminoácidos (negrito e | QELDKYKNAVTELQLLMGGGSGGGSGGAIASGVAVC sublinhado), KVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAVVSLSNGVSVLTFKVLD Substituições DS-Cav1 | LKNYIDKQLLPILNKQSCSISNIETVIEFQQKNNRLLEITR (S155C, S290C, S190F e | EESVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDOQKKL V207L), um foldon c- MSNNVOQIVRQQOSYSIMCIIKEEVLAYVVQLPLYGVIDTP uv terminal (negrito), um | CWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSV ligante GG SFFPOAETCKVOSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNVDIF (sublinhado), um sítio | NPKYDCKIMTSKTDVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASN de clivagem de KNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQE trombina, um GKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSL marcador His, um AFIRKSDELLSAIGGYIPEAPRDGOQAYVRKDGEWVLLS ligante SA (sublinhado) | TFLGGLVPRGSHHHHHHSAWSHPQFEK e um marcador strep.

MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYOSTCSAV

SKGYLSALRTGWYTSVITIELSNIKENKCNGTDAKVKLIK 17F 56: QELDKYKNAVTELQLLMGGGSGGGSGGGSAIASGVA A sequência contém VCKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAVVSLSNGVSVLTFKV um ligante de 12 LDLKNYIDKQLLPILNKQSCSISNIETVIEFQQKNNRLLEI aminoácidos (negrito e TREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDOK sublinhado), KLMSNNVQIVRQQOSYSIMCIIKEEVLAYVVQLPLYGVID 18 Substituições DS-Cav1 TPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWYCDNAG (S155C, S290C, S190F e SVSFFPOAETCKVOSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNV V207L), e um foldon c- DIFNPKYDCKIMTSKTDVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTA terminal (negrito). SNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNK

QEGKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKIN OSLAFIRKSDELLSAIGGYIPEAPRDGOQAYVRKDGEW

VLLSTFL LZF 56a MELLILKANAITTILTAVTFCFASGOQNITEEFYQOSTCSAV A sequência contém SKGYLSALRTGWYTSVITIELSNIKENKCNGTDAKVKLIK um ligante de 12 QELDKYKNAVTELQLLMGGGSGGGSGGGSAIASGVA aminoácidos (negrito e | VCKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAVVSLSNGVSVLTFKV sublinhado), LDLKNYIDKQLLPILNKQSCSISNIETVIEFQQKNNRLLEI Substituições DS-Cav1 | TREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDOK (S155C, S290C, S190F e | KLMSNNVQIVRQQSYSIMCIIKEEVLAYVVQLPLYGVID 19 V207L), um foldon c- | TPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWYCDNAG terminal (negrito), um | SYSFFPOAETCKVOSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNV ligante GG DIFNPKYDCKIMTSKTDVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTA (sublinhado), um sítio | SNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNK de clivagem de QEGKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKIN trombina, um OSLAFIRKSDELLSAIGGYIPEAPRDGOQAYVRKDGEW marcador His, um VLLSTFLGGLVPRGSHHHHHHSAWSHPQFEK ligante SA (sublinhado) e um marcador strep.

MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYOSTCSAV

SKGYLSALRTGWYTSVITIELSNIKENKCNGTDAKVKLIK L7F 57: QELDKYKNAVTELQLLMGGGSGGGSGGGSGSAIASG A sequência contém VAVCKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAVVSLSNGVSVLTF um ligante de 14 KVLDLKNYIDKQLLPILNKQSCSISNIETVIEFQQKNNRL aminoácidos (negrito e LEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITND sublinhado), QKKLMSNNVOQIVRQQOSYSIMCIIKEEVLAYVVQLPLYG 20 Substituições DS-Cav1 VIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWYCDN (S155C, 5290C, S190F e AGSVSFFPOQAETCKVOSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLC V207L), e um foldon c- NVDIFNPKYDCKIMTSKTDVSSSVITSLGAIVSCYGKTKC terminal (negrito). TASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVN

KQEGKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKIN OSLAFIRKSDELLSAIGGYIPEAPRDGOAYVRKDGEW

VLLSTFL LZF 57a: A sequência contém MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAV um ligante de 14 SKGYLSALRTGWYTSVITIELSNIKENKCNGTDAKVKLIK aminoácidos (negrito e | QELDKYKNAVTELQLLMGGGSGGGSGEGESECSAIASG sublinhado), VAVCKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAVVSLSNGVSVLTF Substituições DS-Cav1 | KVLDLKNYIDKQLLPILNKQSCSISNIETVIEFQQKNNRL (S155C, S290C, S190F e | LEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITND V207L), um foldon c- | QKKLMSNNVQIVRQQSYSIMCIIKEEVLAYVVQLPLYG 21 terminal (negrito), um | VIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWYCDN ligante GG AGSVSFFPOAETCKVOSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLC (sublinhado), um sítio | NVDIFNPKYDCKIMTSKTDVSSSVITSLGAIVSCYGKTKC de clivagem de TASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVN trombina, um KQEGKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKIN marcador His, um QOSLAFIRKSDELLSAIGGYIPEAPRDGOQAYVRKDGEW ligante SA (sublinhado) | VLLSTFLGGLVPRGSHHHHHHSAWSHPQFEK e um marcador strep. L7F 109 MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQOSTCSAV A sequência contém SKGYLSALRTGWYTSVITIELSNIKENKCNGTDAKVKLIK um ligante de 14 QELDKYKNAVTELQLLMGGGSGGGSGGGSGSAIASG aminoácidos (negrito e VAVCKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAVVCLSNGVCVLTF sublinhado), KVLDLKNYIDKQLLPILNKQSCSISNIETVIEFQQKNNRL Substituições DS-Cav1 LEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITND (S155C, S290C, S190F e QKKLMSNNVOQIVRQQOSYSIMCIIKEEVLAYVVQLPLYG 22 V207L), mutações VIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWYCDN adicionais S180C e AGSVSFFPOAETCKVOSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLC S186C (negrito, em NVDIFNPKYDCKIMTSKTDVSSSVITSLGAIVSCYGKTKC itálico e sublinhado) e TASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVN ; KQEGKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKIN um foldon c-terminal ; OSLAFIRKSDELLSAIGGYIPEAPRDGOQAYVRKDGEW (negrito) VLLSTFL

LZF 109a A sequência contém amino dedos (neguto é | MELUILKANAITTILTAVTFCFASGONITEEFYQSTCSAV sublinhado), SKGYLSALRTGWYTSVITIELSNIKENKCNGTDAKVKLIK Substituições DS-Cav1 QELDKYKNAVTELQLLMGGGSGGGSGGGSGSAIASG (S155C, S290C, S190F e VAVCKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAVVCLSNGVCVLTF V207L), mutações KVLDLKNYIDKQLLPILNKQSCSISNIETVIEFQQKNNRL adicionais S180C e LEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITND S186C (negrito, em QKKLMSNNVQIVRQQOSYSIMCIIKEEVLAYVVQLPLYG 23 itálico e sublinhado) e VIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWYCDN um foldon c-terminal AGSVSFFPOQAETCKVOSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLC (negrito), um ligante NVDIFNPKYDCKIMTSKTDVSSSVITSLGAIVSCYGKTKC GG (sublinhado), um TASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVN sítio de clivagem de KQEGKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKIN trombina, um QOSLAFIRKSDELLSAIGGYIPEAPRDGOQAYVRKDGEW ” VLLSTFLGGLVPRGSHHHHHHSAWSHPQFEK marcador His, um ligante SA (sublinhado) e um marcador strep. L7F 110 MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYOSTCSAV A sequência contém SKGYLSALRTGWYTSVITIELSNIKENKCNGTDAKVKLIK um ligante de 14 QELDKYKNAVTELQLLMGGGSGGGSGGGSGSAIASG aminoácidos (negrito e VAVCKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAVVSLSNGVSVLTF sublinhado), KVLDLKNYIDKQLLPILNKQSCSISNIETVIEFQQKNNRL Substituições DS-Cav1 LEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITND (S155C, S290C, S190F e QKKLMSNNVQIVRQAQOSYSIMCIIKEEVLAYVVQLPLYG 24 V207L), mutações VIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWYCDN adicionais D486C e AGSVSFFPOAETCKVOSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLC A490C (negrito, em NVDIFNPKYDCKIMTSKTDVSSSVITSLGAIVSCYGKTKC itálico e sublinhado) e TASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVN ; KQEGKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSCEFDCSISQVNEKIN um foldon c-terminal (negrito) QOSLAFIRKSDELLSAIGGYIPEAPRDGOQAYVRKDGEW

VLLSTFL LZF 110a MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAV A sequência contém SKGYLSALRTGWYTSVITIELSNIKENKCNGTDAKVKLIK um ligante de 14 QELDKYKNAVTELQLLMGGGSGGGSGGESECESAIASG aminoácidos (negrito e | VAVCKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAVVSLSNGVSVLTF sublinhado), KVLDLKNYIDKQLLPILNKQSCSISNIETVIEFQQKNNRL Substituições DS-Cav1 | LEITREFSVYNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITND (S155C, S290C, S190F e | QOKKLMSNNVQIVRQQSYSIMCIIKEEVLAYVVOQLPLYG 25 V207L), mutações VIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWYCDN adicionais D486C e AGSVSFFPOAETCKVOSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLC A490C (negrito, em NVDIFNPKYDCKIMTSKTDVSSSVITSLGAIVSCYGKTKC itálico e sublinhado), | TASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVN um foldon c-terminal KQEGKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSCEFDCSISQVNEKIN (negrito), um ligante QSLAFIRKSDELLSAIGGYIPEAPRDGQAYVRKDGEW

GG (sublinhado), um | VLLSTFLGGLVPRGSHHHHHHSAWSHPQFEK sítio de clivagem de trombina, um marcador His, um ligante SA (sublinhado) e um marcador strep. L7F 111 MELLILKANAITTILTAVTFCFASGOQNITEEFYOSTCSAV A sequência contém SKGYLSALRTGWYTSVITIELSNIKENKCNGTDAKVKLIK um ligante de 14 QELDKYKNAVTELQLLMGGGSGGGSGGGSGSAIASG aminoácidos (negrito e VAVCKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAVVSLSNGVSVLTF sublinhado), KVLDLKNYIDKQLLPILNKQSCSISNIETVIEFQQKNNRL Substituições DS-Cav1 LEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITND (S155C, S290C, S190F e QKKLMSNNVQIVRQQOSYSIMCIIKEEVLAYVVQLPLYG 26 V207), mutações VIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWYCDN adicionais D486C e AGSVSFFPOQAETCKVOSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLC D489C (negrito, em NVDIFNPKYDCKIMTSKTDVSSSVITSLGAIVSCYGKTKC itálico e sublinhado) e TASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVN um foldon c-terminal KQEGKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSCEFCASISQVNEKIN (negrito) QOSLAFIRKSDELLSAIGGYIPEAPRDGOQAYVRKDGEW

VLLSTFL LZF 111a A sequência contém amino de dos tnsguto e | MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYOSTCSAV sublinhado), SKGYLSALRTGWYTSVITIELSNIKENKCNGTDAKVKLIK Substituições DS-Cav1 QELDKYKNAVTELQLLMGGGSGGGSCGGESESAIASG (S155C, S290C, S190F e VAVCKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAVVSLSNGVSVLTF V207L), mutações KVLDLKNYIDKQLLPILNKQSCSISNIETVIEFQQKNNRL adicionais D486C e LEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITND D489C (negrito, em QKKLMSNNVQIVRQOQOSYSIMCIIKEEVLAYVVQLPLYG 27 itálico e sublinhado), VIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWYCDN um foldon c-terminal AGSVSFFPOAETCKVOSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLC (negrito), a GG ligante NVDIFNPKYDCKIMTSKTDVSSSVITSLGAIVSCYGKTKC (sublinhado), um sítio TASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVN de clivagem de KQEGKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSCEFCASISQVNEKIN trombina, um QOSLAFIRKSDELLSAIGGYIPEAPRDGOQAYVRKDGEW " VLLSTFLGGLVPRGSHHHHHHSAWSHPQFEK marcador His, um — = ligante SA (sublinhado) e um marcador strep. LZF 112 MELLILKANAITTILTAVTFCFASGOQNITEEFYOSTCSAV A sequência contém SKGYLSALRTGWYTSVITIELSNIKENKCNGTDAKVKLIK um ligante de 14 QELDKYKNAVTELQLLMGGGSGGGSGGGSGSAIASG aminoácidos (negrito e | VAVCKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAVVSLSNGVSVLTF 28 sublinhado), KVLDLKNYIDKQLLPILNKQSCSISNIETVIEFQQKNNRL Substituições DS-Cav1 | LEITREFSVYNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITND (S155C, S290C, S190F e | QKKLMSNNVQIVRQAQSYSIMCIIKEEVLAYVVQLPLYG

V207L), mutações — | VIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWYCDN adicionais L5S12Ce — | AGSVSFFPOAETCKVOSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLC L513C (negrito, em — | NVDIFNPKYDCKIMTSKTDVSSSVITSLGAIVSCYGKTKC itálico e sublinhado) e | TASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVN um foldon c-terminal | KQEGKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKIN (negrito) OSLAFIRKSDECCSAIGGYIPEAPRDGOAYVRKDGEWV

LLSTFL 1ZF 112a A sequência contém amino dedos neguto é | MELUILKANAITTILTAVTFCFASGONITEEFYQSTCSAV sublinhado) SKGYLSALRTGWYTSVITIELSNIKENKCNGTDAKVKLIK Substituições DS Cav1 | QELDKYKNAVTELQLLMGGGSGEGSEGESESAIASG (S155C, S290c, S190F e | VAVCKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAVVSLSNGVSVLTF V2070), mutações — | KVLDLKNYIDKQLLPILNKOSCSISNIETVIEFQQKNNRL adicionar ts12ce — | LEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITND L513C (negrito, em — | QKKLMSNNVQIVRQASYSIMCIIKEEVLAYVVALPLYG 29 itálico e sublinhado), | VIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWYCDN um foldon c-terminal | ASSVSFFPOAETCKVASNRVFCDTMNSLTLPSEVNLC (negrito), um ligante: | NVD!FNPKYDCKIMTSKTDVSSSVITSLGAIVSCYGKTKC GS Gsublinhado), um — TASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYUN sítio de clivagem de — KQEGKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKIN trombina um QSLAFIRKSDECCSAIGGYIPEAPRDGQAYVRKDGEW

VLLSTFLGGLVPRGSHHHHHHSAWSHPQFEK marcador His, um ligante SA (sublinhado) e um marcador strep. UF 113 MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQOSTCSAV A sequência contém | SKSYLSALRTGWYTSVITIELSNIKENKCNGTDAKVKLIK um ligante de 14 | QELOKYKNAVTELQLLMGGGSGGGSGGESESAIASG aminoácidos (negrito e | VAVCKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAVVSLSNGVSVLTF sublinhado) KVLDLKNYIDKQLLPILNKQSCSISNIETVIEFQQKNNRL Substituições DS Cav1 | LEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITND (S155C, S290C, S190F e | QKKLMSNNVQIVRQQOSYSIMCIIKEEVLAYVVAQLPLYG 30 V2070), mutação — | VIDTPOWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWYCDN adicional Fsosc — |) AGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLC - >> NVDIFNPKYDCKIMTSKTDVSSSVITSLGAIVSCYGKTKC (negrito, em itálico e sublinhado) eum — | TASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVN Ffoldon eterminai — | KQEGKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKIN (negrito). QSLACIRKSDELLSAIGGYIPEAPRDGQAYVRKDGEW

VLLSTFL 1ZF 113a MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAV A sequência contém | SKGYLSALRTGWYTSVITIELSNIKENKCNGTDAKVKLIK um ligante de 14 — | QELDKYKNAVTELOLLMGGGSGGGSGGGSESAIASG 31 aminoácidos (negrito e | VAVCKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAVVSLSNGVSVLTF sublinhado), KVLDLKNYIDKQLLPILNKQSCSISNIETVIEFQQKNNRL Substituições DS-Cav1 | LEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITND

(S155C, S290C, S190F e | QOKKLMSNNVQIVRQQSYSIMCIIKEEVLAYVVQLPLYG V207L), mutação VIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWYCDN adicional F5SO5C AGSVSFFPOAETCKVOSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLC (negrito, em itálico e NVDIFNPKYDCKIMTSKTDVSSSVITSLGAIVSCYGKTKC sublinhado), um foldon | TASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVN c-terminal (negrito), KQEGKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKIN um ligante GG QOSLACIRKSDELLSAIGGYIPEAPRDGQAYVRKDGEW (sublinhado), um sítio | VLLSTFLGEGLVPRGSHHHHHHSAWSHPQFEK de clivagem de trombina, um marcador His, um ligante SA (sublinhado) e um marcador strep.

MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYOSTCSAV

SKGYLSALRTGWYTSVITIELSNIKENKCNGTDAKVKLIK 17F 123 QELDKYKNAVTELQLLMOSTPATNNRARRELPRFMNY A sequência contém TLNNAKKTNVTLSKKRKRRFLGFLLGVGSAIASGVAVC Substituições DS-Cav1 KVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAVVCLSNGVCVLTFKVLD (S155C, S290C, S190F e LKNYIDKQLLPILNKQSCSISNIETVIEFQQKNNRLLEITR V2071) e substituições EFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDOKKL adicionais S180C e MSNNVOQIVRQOSYSIMCIIKEEVLAYVVQLPLYGVIDTP 32 S186C (negrito, em CWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSV itálico e sublinhado) e SFFPOAETCKVOSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNVDIF um foldon c-terminal NPKYDCKIMTSKTDVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASN (negrito). KNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQE

GKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQOSL AFIRKSDELLSAIGGYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLS

TFL A seq de ntém MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYOSTCSAV Substituições DS-Cav1 SKGYLSALRTGWYTSVITIELSNIKENKCNGTDAKVKLIK (S155C, S290C, S190F e QELDKYKNAVTELQLLMOSTPATNNRARRELPRFMNY V2071) e substituições TLNNAKKTNVTLSKKRKRRFLGFLLGVGSAIASGVAVC adicionais S180C e KVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAVVCLSNGVCVLTFKVLD S186C (negrito, em LKNYIDKQLLPILNKQSCSISNIETVIEFQQKNNRLLEITR itálico e sublinhado), EFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDOQKKL um foldon c-terminal MSNNVOQIVRQQOSYSIMCIIKEEVLAYVVQLPLYGVIDTP 33 (negrito), um ligante CWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSV GG (sublinhado), um SFFPOAETCKVOSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNVDIF sítio de clivagem de NPKYDCKIMTSKTDVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASN trombina, um KNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQE marcador His, um GKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSL ligante SA (sublinhado) AFIRKSDELLSAIGGYIPEAPRDGOQAYVRKDGEWVLLS

TFLGGLVPRGSHHHHHHSAWSHPQFEK e um marcador strep. A sequência contém SKGYLSALRTGWYTSVITIELSNIKENKCNGTDAKVKLIK

Substituições DS-Cav1 | QELDKYKNAVTELQLLMOSTPATNNRARRELPRFMNY (S155C, S290C, S190F e | TINNAKKTNVTLSKKRKRRFLGFLLGVGSAIASGVAVC V207L) e substituições | KVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAVVSLSNGVSVLTFKVLD adicionais D486C e LKNYIDKQLLPILNKQSCSISNIETVIEFQQKNNRLLEITR A490C (negrito, em EFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDOKKL itálico e sublinhado) e | MSNNVQIVRQQOSYSIMCIIKEEVLAYVVQLPLYGVIDTP um foldon c-terminal | CWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSV (negrito). SFFPOAETCKVOSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNVDIF

NPKYDCKIMTSKTDVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASN KNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQE GKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSCEFDCSISQVNEKINQOSL AFIRKSDELLSAIGGYIPEAPRDGOQAYVRKDGEWVLLS

TFL A seq Rr a ntém MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAV Substituições DS-Cav1 SKGYLSALRTGWYTSVITIELSNIKENKCNGTDAKVKLIK (S155C, S290C, S190F e QELDKYKNAVTELQLLMOSTPATNNRARRELPRFMNY V207L), substituições TLNNAKKTNVTLSKKRKRRFLGFLLGVGSAIASGVAVC adicionais DA86C e KVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAVVSLSNGVSVLTFKVLD A490C (negrito, em LKNYIDKQLLPILNKQSCSISNIETVIEFQQKNNRLLEITR itálico e sublinhado) e EFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDOQKKL um foldon c-terminal MSNNVQIVRQOSYSIMCIIKEEVLAYVVQLPLYGVIDTP 35 (negrito), um ligante CWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSV GG (sublinhado), um SFFPQAETCKVOSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNVDIF ns ; NPKYDCKIMTSKTDVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASN sítio de clivagem de trombina, um KNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQE marcador His um GKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSCEFDCSISQVNEKINQSL ligante SA (sublinhado) AFIRKSDELLSAIGGYIPEAPRDGOQAYVRKDGEWVLLS

TFLGGLVPRGSHHHHHHSAWSHPQFEK e um marcador strep. = =

MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYOSTCSAV

SKGYLSALRTGWYTSVITIELSNIKENKCNGTDAKVKLIK LZF 125 QELDKYKNAVTELQLLMOSTPATNNRARRELPRFMNY A sequência contém TLNNAKKTNVTLSKKRKRRFLGFLLGVGSAIASGVAVC Substituições DS-Cav1 KVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAVVSLSNGVSVLTFKVLD (S155C, S290C, S190F e LKNYIDKQLLPILNKQSCSISNIETVIEFQQKNNRLLEITR V207L) e substituições EFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDOKKL adicionais D486C e MSNNVOQIVRQQOSYSIMCIIKEEVLAYVVOQLPLYGVIDTP 36 DA489C (negrito, em CWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSV itálico e sublinhado) e SFFPOAETCKVOSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNVDIF um foldon c-terminal NPKYDCKIMTSKTDVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASN (negrito). KNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQE

GKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSCEFCASISQVNEKINQOSL AFIRKSDELLSAIGGYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLS

TFL A sequência contém SKGYLSALRTGWYTSVITIELSNIKENKCNGTDAKVKLIK

Substituições DS-Cav1 | QELDKYKNAVTELQLLMOSTPATNNRARRELPRFMNY (S155C, S290C, S190F e | TINNAKKTNVTLSKKRKRRFLGFLLGVGSAIASGVAVC V207L), substituições | KVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAVVSLSNGVSVLTFKVLD adicionais D486C e LKNYIDKQLLPILNKQSCSISNIETVIEFQQKNNRLLEITR D489C (negrito, em EFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDOKKL itálico e sublinhado) e | MSNNVQIVRQQOSYSIMCIIKEEVLAYVVQLPLYGVIDTP um foldon c-terminal | CWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSV (negrito), um ligante | SFEFPQAETCKVOSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNVDIF GG (sublinhado), um NPKYDCKIMTSKTDVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASN sítio de clivagem de KNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQE trombina, u marcador | GKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSCEFCASISQVNEKINQSL His, um ligante SA AFIRKSDELLSAIGGYIPEAPRDGOQAYVRKDGEWVLLS (sublinhado) e um TFLGGLVPRGSHHHHHHSAWSHPQFEK marcador strep.

MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYOSTCSAV

SKGYLSALRTGWYTSVITIELSNIKENKCNGTDAKVKLIK L1ZF 126 QELDKYKNAVTELQLLMOSTPATNNRARRELPRFMNY A sequência contém TLNNAKKTNVTLSKKRKRRFLGFLLGVGSAIASGVAVC Substituições DS-Cav1 KVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAVVSLSNGVSVLTFKVLD (S155C, S290C, S190F e LKNYIDKQLLPILNKQSCSISNIETVIEFQOQKNNRLLEITR V2071) e substituições EFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDOKKL adicionais LS12C e L513 MSNNVOQIVRQQOSYSIMCIIKEEVLAYVVQLPLYGVIDTP 38 (negrito, em itálico e CWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSV sublinhado) e um SFFPQAETCKVOSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNVDIF foldon c-terminal NPKYDCKIMTSKTDVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASN (negrito). KNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQE

GKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSL AFIRKSDECCSAIGGYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLL

STFL A seq aa ntém MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAV Substituições DS-Cav1 SKGYLSALRTGWYTSVITIELSNIKENKCNGTDAKVKLIK (S155C, S290C, S190F e QELDKYKNAVTELQLLMOSTPATNNRARRELPRFMNY V207L), substituições TLNNAKKTNVTLSKKRKRRFLGFLLGVGSAIASGVAVC adicionais L512Ce KVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAVVSLSNGVSVLTFKVLD L513C (negrito, em LKNYIDKQLLPILNKQSCSISNIETVIEFQQKNNRLLEITR itálico e sublinhado), EFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDOKKL um foldon c-terminal MSNNVOQIVRQOSYSIMCIIKEEVLAYVVQLPLYGVIDTP 39 (negrito), um ligante CWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSV GG (sublinhado), um SFFPOAETCKVOSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNVDIF sítio de clivagem de NPKYDCKIMTSKTDVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASN trombina, um KNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQE marcador His, um GKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQOSL ligante SA (sublinhado) AFIRKSDECCSAIGGYIPEAPRDGOQAYVRKDGEWVLL

STFLGGLVPRGSHHHHHHSAWSHPQFEK e um marcador strep. | trpr7 | MELULKANAMTTILTAVTFCFASGONITEEFYOSTCSAv | —ao — |

A sequência contém SKGYLSALRTGWYTSVITIELSNIKENKCNGTDAKVKLIK Substituições DS-Cav1 | QELDKYKNAVTELQLLMOSTPATNNRARRELPRFMNY (S155C, S290C, S190F e | TINNAKKTNVTLSKKRKRRFLGFLLGVGSAIASGVAVC V207L) e substituição | KVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAVVSLSNGVSVLTFKVLD adicional F5SO5C LKNYIDKQLLPILNKQSCSISNIETVIEFQQKNNRLLEITR (negrito, em itálico e EFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDOKKL sublinhado) e um MSNNVOQIVRQOSYSIMCIIKEEVLAYVVQLPLYGVIDTP Ffoldon c-terminal CWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSV (negrito). SFFPOAETCKVOSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNVDIF

NPKYDCKIMTSKTDVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASN KNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQE GKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQOSL ACIRKSDELLSAIGGYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLS

TFL A seq Ao e ntém MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQOSTCSAV Substituições DS-Cav1 SKGYLSALRTGWYTSVITIELSNIKENKCNGTDAKVKLIK (S155C, S290C, S190F e QELDKYKNAVTELQLLMOSTPATNNRARRELPRFMNY V2071), substituição TLNNAKKTNVTLSKKRKRRFLGFLLGVGSAIASGVAVC adicional F5O5C KVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAVVSLSNGVSVLTFKVLD (negrito, em itálico e LKNYIDKQLLPILNKQSCSISNIETVIEFQQKNNRLLEITR sublinhado), um foldon EFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDOKKL c-terminal (negrito), MSNNVOQIVRQQOSYSIMCIIKEEVLAYVVQLPLYGVIDTP 41 um ligante CWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSV (sublinhado), um sítio SFFPOAETCKVOSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNVDIF de clivagem de NPKYDCKIMTSKTDVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASN trombina, um KNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQE marcador His um GKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSL ligante (sublinhado) e ACIRKSDELLSAIGGYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLS

TFLGGLVPRGSHHHHHHSAWSHPQFEK um marcador strep.

MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYOSTCSAV

SKGYLSALRTGWYTSVITIELSNIKENKCNGTDAKVKLIK LZF 128 QELDKYKNAVTELQLLMOSTPATNNRARRELPRFMNY A sequência contém TLNNAKKTNVTLSKKRKRRFLGFLLGVGSAIASGVAVC Substituições DS-Cav1 | KVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAVVSLSNGVSVLTFKVLD (S155C, S290C, S190F e | LANYIDKQLLPILNKQSCSISNIETVIEFQQKNNRLLEITR V207L) e deleção EFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDOKKL 22 adicional de domínio | MSNNVQIVRQQOSYSIMCIIKEEVLAYVVQLPLYGVIDTP HRB correspondendo a | CWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSV aminoácidos 482-513 e | SFFPOAETCKVOSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNVDIF um foldon c-terminal | NPKYDCKIMTSKTDVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASN (negrito). KNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQE

GKSLYVKGEPIINFYDPLSAIGGYIPEAPRDGQAYVRK

DGEWVLLSTFL A sequência contém SKGYLSALRTGWYTSVITIELSNIKENKCNGTDAKVKLIK

Substituições DS-Cav1 | QELDKYKNAVTELQLLMOSTPATNNRARRELPRFMNY (S155C, S290C, S190F e | TINNAKKTNVTLSKKRKRRFLGFLLGVGSAIASGVAVC V207L), deleção KVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAVVSLSNGVSVLTFKVLD adicional de domínio LKNYIDKQLLPILNKQSCSISNIETVIEFQQKNNRLLEITR HRB correspondendo a | EESVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDOKKL aminoácidos 482-513, | MSNNVOIVRQOSYSIMCIIKEEVLAYVVQLPLYGVIDTP um foldon c-terminal | CWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSV (negrito), um ligante | SFFPQAETCKVOSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNVDIF (sublinhado), um sítio | NPKYDCKIMTSKTDVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASN de clivagem de KNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQE trombina, um GKSLYVKGEPIINFYDPLSAIGGYIPEAPRDGQAYVRK marcador His, um DGEWVLLSTFLGGLVPRGSHHHHHHSAWSHPQFEK ligante (sublinhado) e um marcador strep.

MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQOSTCSAV SKGYLSALRTGWYTSVITIELSNIKENKCNGTDAKVKLIK QELDKYKNAVTELQLLMGGGSGGGSGGGSGSAIASG VAVCKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAVVSLSNGVSVLTF KVLDLKNYIDKQLLPILNKQSCSISNIETVIEFQQKNNRL

LEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITND LZF 129 QKKLMSNNVOQIVRQQOSYSIMCIIKEEVLAYVVQLPLYG

VIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWYCDN AGSVSFFPOAETCKVOSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLC NVDIFNPKYDCKIMTSKTDVSSSVITSLGAIVSCYGKTKC TASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVN KQEGKSLYVKGEPIINFYDPLSAIGGYIPEAPRDGOQAYV RKDGEWVLLSTFL MELLILKANAITTILTAVTFCFASGONITEEFYOSTCSAV SKGYLSALRTGWYTSVITIELSNIKENKCNGTDAKVKLIK QELDKYKNAVTELQLLMGGGSGGGSGGGSECGSAIASG VAVCKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAVVSLSNGVSVLTF KVLDLKNYIDKQLLPILNKQSCSISNIETVIEFQQKNNRL

LEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITND LZF 129a QKKLMSNNVQIVRQQOSYSIMCIIKEEVLAYVVQLPLYG 45

VIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWYCDN AGSVSFFPQOAETCKVOSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLC NVDIFNPKYDCKIMTSKTDVSSSVITSLGAIVSCYGKTKC TASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVN KQEGKSLYVKGEPIINFYDPLSAIGGYIPEAPRDGOQAYV RKDGEWVLLSTFLGGLVPRGSHHHHHHSAWSHPQFE K

[00197] Os técnicos no assunto reconhecerão ou serão capazes de determinar não usando mais que experimentação de rotina, muitos equivalentes às modalidades específicas da invenção descrita na presente invenção. Tais equivalentes pretendem ser abrangidos pelas reivindicações a seguir.

[00198] Todas as referências, incluindo documentos de patentes, reveladas na presente invenção são incorporadas por referência na Íntegra.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Trímero de proteína F de vírus sincicial respiratório (RSV) recombinante, caracterizado pelo fato de que compreende: três peptídeos F de RSV recombinantes cada compreendendo uma deleção de aminoácidos nas posições 98 a 146 da proteína F de RSV do tipo selvagem e um ligante de oito a quatorze aminoácidos entre os aminoácidos nas posições 97 e 147 de F de RSV do tipo selvagem, em que os peptídeos F recombinantes compreendem as seguintes modificações para estabilizar o trímero de F de RSV recombinante em uma conformação pré-fusão: (i) substituições de aminoácidos 190F e 207L, (ii) substituições de aminoácidos 155C e 290C, e um ou mais de (a) a (f) abaixo (a) substituições de aminoácidos 486C e 490C; (b) substituições de aminoácidos 180C e 186C; (c) substituições de aminoácidos 486C e 489C; (d) substituições de aminoácidos 512C e 513C; (e) uma substituição de aminoácido 505C; e (f) uma deleção de aminoácidos 482 a 513 de F de RSV do tipo selvagem.

2. Trímero de proteína F de RSV recombinante, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que cada dos peptídeos F de RSV recombinantes compreendem adicionalmente no C-terminal uma deleção dos aminoácidos que correspondem ao domínio transmembrana e domínio citoplásmico da proteína F de RSV do tipo selvagem.

3. Trímero de proteína F de RSV recombinante, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que cada dos peptídeos F de RSV recombinantes compreendem adicionalmente no C-terminal uma deleção de aminoácidos 514 a 574 de F de RSV do tipo selvagem.

4, Trímero de proteína F de RSV recombinante, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que cada dos peptídeos F de RSV recombinantes compreende adicionalmente uma sequência foldon no C-terminal de cada peptídeo.

5. Trímero de proteína F de RSV recombinante, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que a sequência foldon compreende SEQ ID NO: 8.

6. Trímero de proteína F de RSV recombinante, de acordo com qualquer uma das reivindicações 3 a 5, caracterizado pelo fato de que os peptídeos F recombinantes compreendem, cada, as substituições de aminoácidos 190F e 207L, as substituições de aminoácidos 155C e 290C, as substituições de aminoácidos 486C e 490C e a deleção de aminoácidos 514-574 de proteína F de RSV do tipo selvagem.

7. Trímero de proteína F de RSV recombinante, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que cada peptídeo F recombinante compreende adicionalmente uma ligação de dissulfeto intra peptídeo não nativa entre cisteínas introduzidas pelas substituições de aminoácidos 155C e 290C e em que o trímero de proteína F de RSV compreende uma ou mais ligações de dissulfeto inter peptídeo não nativas entre cisteínas introduzidas pelas substituições de aminoácidos 486C e 490C.

8. Trímero de proteína F de RSV recombinante, de acordo com qualquer uma das reivindicações 3 a 5, caracterizado pelo fato de que os peptídeos F recombinantes compreendem, cada, as substituições de aminoácidos 190F e 207L, as substituições de aminoácidos 155C e 290C, as substituições de aminoácidos 180C e 186C e a deleção de aminoácidos 514 a 574 de proteína F de RSV do tipo selvagem.

9. Trímero de proteína F de RSV recombinante, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que cada peptídeo F de RSV recombinante compreende adicionalmente uma ligação de dissulfeto intra peptídeo não nativa entre cisteínas introduzidas pelas substituições de aminoácidos 155C e 290C e uma ligação de dissulfeto intra peptídeo não nativa entre cisteínas introduzidas pelas substituições de aminoácidos 190C e 186C.

10. Trímero de proteína F de RSV recombinante, de acordo com qualquer uma das reivindicações 3 a 5, caracterizado pelo fato de que os peptídeos F recombinantes compreendem, cada, as substituições de aminoácidos 190F e 207L, as substituições de aminoácidos 155C e 290C, as substituições de aminoácidos 486C e 489C e a deleção de aminoácidos 514 a 574 da proteína F de RSV do tipo selvagem.

11. Trímero de proteína F de RSV recombinante, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que cada peptídeo F de RSV recombinante compreende adicionalmente uma ligação de dissulfeto intra peptídeo não nativa entre cisteínas introduzidas pelas substituições de aminoácidos 155C e 290C e em que o trímero de proteína F de RSV compreende uma ligação de dissulfeto inter peptídeo não nativa entre cisteínas introduzidas pelas substituições de aminoácidos 486C e 489C.

12. Trímero de proteína F de RSV recombinante, de acordo com qualquer uma das reivindicações 3 a 5, caracterizado pelo fato de que os peptídeos F recombinantes compreendem, cada, as substituições de aminoácidos 190F e 207L, as substituições de aminoácidos 155C e 290C, as substituições de aminoácidos 512C e 513C e a deleção de aminoácidos 514 a 574 da proteína F de RSV do tipo selvagem.

13. Trímero de proteína F de RSV recombinante, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que cada peptídeo F de RSV recombinante compreende adicionalmente uma ligação de dissulfeto intra peptídeo não nativa entre cisteínas introduzidas pelas substituições de aminoácidos 155C e 290C e em que o trímero de proteína F de RSV compreende uma ligação de dissulfeto inter peptídeo não nativa entre cisteínas introduzidas pelas substituições de aminoácidos 512C e 513C.

14. Trímero de proteína F de RSV recombinante, de acordo com qualquer uma das reivindicações 3 a 5, caracterizado pelo fato de que os peptídeos F recombinantes compreendem, cada, as substituições de aminoácidos 190F e 207L, as substituições de aminoácidos 155C e 290C, a substituição de aminoácido 505C e a deleção de aminoácidos 514 a 574 da proteína F de RSV do tipo selvagem.

15. Trímero de proteína F de RSV recombinante, de acordo com qualquer uma das reivindicações 3 a 5, caracterizado pelo fato de que os peptídeos F recombinantes compreendem, cada, as substituições de aminoácidos 190F e 207L, as substituições de aminoácidos 155C e 290C e a deleção de aminoácidos 482 a 513 e aminoácidos 514 a 574 da proteína F de RSV do tipo selvagem.

16. Trímero de proteína F de RSV recombinante, de acordo com a reivindicação 14 ou 15, caracterizado pelo fato de que cada peptídeo F de RSV recombinante compreende adicionalmente uma ligação de dissulfeto intra peptídeo não nativa entre cisteínas introduzidas pelas substituições de aminoácidos 155C e 290C.

17. Trímero de proteína F de RSV recombinante, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 16, caracterizado pelo fato de que o ligante tem oito a quatorze aminoácidos de comprimento e compreende a sequência estabelecida na SEQ ID NO: 46.

18. Trímero de proteína F de RSV recombinante, de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de que o ligante tem oito aminoácidos de comprimento e tem a sequência estabelecida na SEQ ID NO: 1.

19. Trímero de proteína F de RSV recombinante, de acordo com a reivindicação 17 caracterizado pelo fato de que o ligante tem dez aminoácidos de comprimento e tem a sequência estabelecida na SEQ ID NO: 2.

20. Trímero de proteína F de RSV recombinante, de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de que o ligante tem doze aminoácidos de comprimento e tem a sequência estabelecida na SEQ ID NO: 3.

21. Trímero de proteína F de RSV recombinante, de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de que o ligante tem quatorze aminoácidos de comprimento e tem a sequência estabelecida na SEQID NO: 4.

22. Trímero de proteína F de RSV recombinante, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que os peptídeos F recombinantes, cada, compreendem, consistem essencialmente em ou consistem em uma sequência de aminoácidos madura estabelecida em qualquer uma das SEQ ID NOs: 22, 24, 26, 28, 30 ou 44.

23. Peptídeo F de RSV recombinante, caracterizado pelo fato de que compreende: (i) uma deleção de aminoácidos de F de RSV do tipo selvagem nas posições 98 a 146; (ii) um ligante de oito a quatorze aminoácidos entre aminoácidos da proteína F de RSV do tipo selvagem nas posições 97 a 147; (iii) substituições de aminoácidos 190F e 207L; (iv) substituições de aminoácidos 155C e 290C; e um ou mais de (a) a (f) abaixo: (a) substituições de aminoácidos 486C e 490C; (b) substituições de aminoácidos 180C e 186C; (c) substituições de aminoácidos 486C e 489C; (d) substituições de aminoácidos 512C e 513C;

(e) uma substituição de aminoácido 505C; e (f) uma deleção de aminoácidos 482 a 513 de F de RSV do tipo selvagem.

24. Composição imunogênica de RSV, caracterizada pelo fato de que compreende o trímero de proteína F de RSV recombinante definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 22 ou o peptídeo F de RSV recombinante definido na reivindicação 23.

25. Composição imunogênica, de acordo com a reivindicação 24, caracterizada pelo fato de ser formulada em uma quantidade eficaz para produzir uma resposta imune específica de antígeno direcionada contra o trímero de F de RSV recombinante ou o peptídeo F de RSV recombinante.

26. Composição imunogênica, de acordo com a reivindicação 24 ou 25, caracterizada pelo fato de que ser formulada com um adjuvante.

27. Composição imunogênica, de acordo com a reivindicação 26, caracterizada pelo fato de que o adjuvante é um adjuvante de alumínio.

28. Composição imunogênica, de acordo com a reivindicação 27, caracterizada pelo fato de que o adjuvante de alumínio é MAA ou MAPA.

29. Composição imunogênica, de acordo com a reivindicação 24 ou 25, caracterizada pelo fato de que compreende adicionalmente uma nanopartícula de lipídeo compreendendo um ou mais lipídeos catiônicos e um poli(etilenoglicol)-lipídeo (PEG lipídeo).

30. Composição imunogênica, de acordo com a reivindicação 29, caracterizada pelo fato de que um ou mais lipídeos catiônicos são lipídeos catiônicos ionizáveis.

31. Composição imunogênica, de acordo com a reivindicação 30, caracterizada pelo fato de que os lipídeos catiônicos ionizáveis são selecionados a partir de DLinDMA; DIinKC2DMA; DLin-MC3-DMA; CLinDMA; S-Octil CLinDMA; (285)-1-(7-[(3B)-colest-5-en-3-ilóxilheptilóxi)-3-[(47)-dec-4-en-1-ilóxi]-N,N-

dimetilpropan-2-amina;

(2R)-1-(4-[(3B)-colest-5-en-3-ilóxilbutóxil-3-[(42)-dec-4-en-1-ilóxi]-N,N- dimetilpropan-2-amina;

1-[(2R)-1-(4-[(3B)-colest-5-en-3-ilóxi]butóxi)-3-(octilóxi)propan-2- illguanidina;

1-[(2R)-1-(4-[(3B)-colest-5-en-3-ilóxi]lbutóxi)-N N-dimetil-3-[(97,122)- octadeca-9,12-dien-1-ilóxilpropan-2-amina;

(28)-1-((6-[(3B))-colest-5-en-3-ilóxilhexiltóxi)-N,N-dimetil-3-[(97)-octadec- 9-en-1-ilóxilpropan-2-amina;

(3B)-3-[6-([(285)-3-[(92)-octadec-9-en-1-ilóxil]-2-(pirrolidin-1- il)propilJóxilhexil)óxilcolest-5-eno;

(2R)-1-(4-[(3B)-colest-5-en-3-ilóxi]lbutóxil-3-(octilóxi)propan-2-amina;

(2R)-1-((8-[(3B)-colest-5-en-3-ilóxiloctilóxi)-N,N-dimetil-3- (pentilóxi)propan-2-amina;

(2R)-1-((8-[(3B)-colest-5-en-3-ilóxiloctiljóxi)-3-(heptilóxi)-N,N- dimetilpropan-2-amina;

(2R)-1-(18-[(3B)-colest-5-en-3-ilóxi]loctilJóxi)-N,N-dimetil-3-[(2Z2)-pent-2-en- 1-ilóxilpropan-2-amina;

(2S)-1-butóxi-3-(18-[(3B)-colest-5-en-3-ilóxi]loctil)óxi)-N N-dimetilpropan-2- amina;

(285-1-(18-[(3B)-colest-5-en-3-ilóxiloctil+óxi)-3- [2,2,3,3,4,4,5,5,6,6,7,7,8,8,9,9-hexadecafluorononil)óxi]-N N-dimetilpropan-2- amina;

2-amino-2-([(92,122Z)-octadeca-9,12-dien-1-ilóxilmetilIpropano-1,3-diol;

2-amino-3-((9-(((3S,10R,13R)-10,13-dimetil-17-(6-metilheptan-2-il)-

2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-tetradeca-hidro-1H- ciclopenta[a]fenantren-3-il)óxi)nonil)óxi)-2-((((92,12Z)-octadeca-9,12-dien-1- il)óxi)mMetil)propan-1-ol;

2-amino-3-((6-(((3S,10R,13R)-10,13-dimetil-17-(6-metil-heptan-2-il)- 2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-tetradeca-hidro-1H- ciclopenta[a]fenantren-3-il)óxi)hexil)óxi)-2-((((Z)-octadec-9-en-1- il)óxi)Metil)propan-1-ol; (207,23Z)-N,N-dimetil-nonacosa-20,23-dien-10-amina; (1772,20Z)-N,N-dimetil-hexacosa-17,20-dien-9-amina; (162,19Z)-N,N-dimetil-pentacosa-16,19-dien-8-amina; (132,16Z)-N,N-dimetil-docosa-13,16-dien-5-amina; (1272,15Z)-N,N-dimetil-henicosa-12,15-dien-4-amina; (147,17Z)-N,N-dimetil-tricosa-14,17-dien-6-amina; (152,18Z)-N,N-dimetil-tetracosa-15,18-dien-7-amina; (187,21Z)-N,N-dimetil-heptacosa-18,21-dien-10-amina; (152,18Z)-N, N-dimetil-tetracosa-15,18-dien-5-amina; (147,17Z)-N,N-dimetil-tricosa-14,17-dien-4-amina; (197,22Z)-N,N-dimetiloctacosa-19,22-dien-9-amina; (182,21Z)-N,N-dimetil-heptacosa-18,21-dien-8-amina; (17Z,20Z)-N,N-dimetil-hexacosa-17,20-dien-7-amina; (162,19Z)-N,N-dimetil-pentacosa-16,19-dien-6-amina; (222,25Z)-N,N-dimetil-hentriaconta-22,25-dien-10-amina; (217,24Z)-N, N-dimetil-triaconta-21,24-dien-9-amina; (18Z)-N N-dimetil-heptacos-18-en-10-amina; (17Z)-N, N-dimetil-hexacos-17-en-9-amina; (197,22Z)-N,N-dimetiloctacosa-19,22-dien-7-amina; N,N-dimetil-heptacosan-10-amina;

(207,23Z)-N-etil-N-metil-nonacosa-20,23-dien-10-amina; 1-[(117,147Z)-1-nonilicosa-11,14-dien-1-il]pirrolidina;

(20Z)-N N-dimetil-heptacos-20-en-10-amina;

(15Z)-N N-dimetil-heptacos-15-en-10-amina;

(14Z)-N N-dimetil-nonacos-14-en-10-amina;

(17Z)-N N-dimetil-nonacos-17-en-10-amina;

(24Z)-N N-dimetil-tritriacont-24-en-10-amina;

(20Z)-N N-dimetil-nonacos-20-en-10-amina;

(22Z)-N N-dimetil-hentriacont-22-en-10-amina;

(16Z)-N N-dimetil-pentacos-16-en-8-amina;

(127,15Z)-N,N-dimetil-2-nonil-henicosa-12,15-dien-1-amina;

(132,16Z)-N,N-dimetil-3-nonil-docosa-13,16-dien-1-amina;

N,N-dimetil-1-[(1S,2R)-2-octilciclopropil]heptadecan-8-amina;

1-[(1S,2R)-2-hexilciclopropil]-N, N-dimetil-nonadecan-10-amina;

N,N-dimetil-1-[(1S,2R)-2-octilciclopropil]lnonadecan-10-amina;

N,N-dimetil-21-[(1S,2R)-2-octilciclopropil]henicosan-10-amina;

N,N-dimetil-1-[(15,2S5)-2-([(1R,2R)-2-pentil- ciclopropil]metilkciclopropil]Jnonadecan-10-amina;

N,N-dimetil-1-[(1S,2R)-2-octil-ciclopropil]hexadecan-8-amina;

N,N-dimetil-1-[(1R,2S)-2-undecil-ciclopropil]tetradecan-5-amina;

N,N-dimetil-3-(7-[(1S,2R)-2-octil-ciclopropil]heptil:dodecan-1-amina;

1-[(1R,2S)-2-heptil-ciclopropil]-N, N-dimetiloctadecan-9-amina;

1-[(1S,2R)-2-decil-ciclopropil]-N N-dimetil-pentadecan-6-amina;

N,N-dimetil-1-[(1S,2R)-2-octil-ciclopropil]pentadecan-8-amina; e

(11E,207,23Z)-N N-dimetil-nonacosa-11,20,23-trien-10-amina;

ou um sal farmaceuticamente aceitável dos mesmos, ou um estereoisômero de qualquer dos acima.

32. Composição imunogênica, de acordo com a reivindicação 31, caracterizada pelo fato de que os lipídeos catiônicos ionizáveis são selecionados a partir do grupo que consiste em (2S)-1-((6-[(3B))-colest-5-en-3-ilóxilhexil+óxi)- N,N-dimetil-3-[(92)-octadec-9-en-1-ilóxilpropan-2-amina, (132,16Z)-N,N- dimetil-3-nonil-docosa-13,16-dien-1-amina, e N,N-dimetil-1-[(1S8,2R)-2- octilciclopropil]heptadecan-8-amina, ou um sal farmaceuticamente aceitável dos mesmos ou um estereoisômero de qualquer um dos acima.

33. Composição imunogênica, de acordo com a reivindicação 32, caracterizada pelo fato de que compreende 30 a 75 mol % de lipídeo catiônico ionizável e 0,1 a 20 mol % de PEG-lipídeo.

34. Composição imunogênica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 29 a 33, caracterizada pelo fato de que compreende adicionalmente um ou mais lipídeos não catiônicos selecionados a partir de um fosfolipídio, um derivado de fosfolipídio, um ácido graxo, um esterol ou uma combinação dos mesmos.

35. Composição imunogênica, de acordo com a reivindicação 34, caracterizada pelo fato de que o esterol é colesterol, estigmasterol ou estigmastanol.

36. Composição imunogênica, de acordo com a reivindicação 34, caracterizada pelo fato de que o fosfolipídio é selecionado a partir de fosfatidil serina, 1,2-Distearoíl-sn-glicero-3-fosfocolina (DSPC), 1,2-dipalmitoleoíl-sn- glicero-3-fosfocolina, 1,2-dimiristoíl-sn-glicero-3-fosfocolina (DMPC), dilauroíilfosfatidil colina (DLPC), 1,2-dieicosenoíl-sn-glicero-3-fosfocolina e 1,2- dioleoíl-sn-glicero-3-fosfocolina (DOPC).

37. Composição imunogênica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 29 a 36, caracterizada pelo fato de que o PEG-lipídeo é 1,2- Dimiristoíl-sn-glicerol metoxipolietilenoglicol (PEG-DMG), PEG-disteril glicerol

(PEG-DSG), PEG-dipalmetoleíl, PEG-dioleíl, PEG-diestearila, PEG-diacilglicamida (PEG-DAG), PEG-dipalmitoíl fosfatidiletanolamina (PEG-DPPE) ou PEG-1,2- dimiristilox|-propila-3-amina (PEG-c-DMA).

38. Composição imunogênica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 34 a 37, caracterizada pelo fato de compreende 20 a 99,8 mol % de lipídeos catiônicos ionizáveis, 0,1 a 65 mol % de lipídeos não catiônicos e 0,1 a 20 mol % de PEG-lipídeo.

39. Composição imunogênica, de acordo com a reivindicação 38, caracterizada pelo fato de que os lipídeos não catiônicos compreendem uma mistura de colesterol e DSPC.

40. Composição imunogênica, de acordo com a reivindicação 34, caracterizada pelo fato de que compreende 34 a 59 mol % de lipídeos catiônicos ionizáveis selecionados a partir do grupo que consiste em (2S5)-1-((6-[(38))- colest-5-en-3-ilóxilhexilJóxi)-N,N-dimetil-3-[(92)-octadec-9-en-1-ilóxilpropan-2- amina; (132,16Z)-N N-dimetil-3-nonil-docosa-13,16-dien-1-amina; e NN- dimetil-1-[(1S,2R)-2-octil-ciclopropil]heptadecan-8-amina, 30 a 48 mol % de colesterol, 10 a 24% de DSPC e 1 a 2 mol % de PEG-DMG.

41. Uso do trímero de proteína F de RSV definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 22 ou da composição imunogênica definida em qualquer uma das reivindicações 24 a 40, caracterizado pelo fato de ser para a fabricação de uma vacina para produzir uma resposta imune à proteína F de RSV em um indivíduo.

42. Uso, de acordo com a reivindicação 41, caracterizado pelo fato de que a vacina é formulada para ser usada como uma dose única do trímero de proteína F de RSV ou da composição imunogênica de RSV.

43. Uso, de acordo com a reivindicação 41, caracterizado pelo fato de que a vacina é formulada para ser usada pelo menos como uma dose de reforço do trímero de proteína F de RSV ou da composição imunogênica de RSV.

44. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 41 a 43, caracterizado pelo fato de que a vacina é formulada para fornecer o trímero de proteína F de RSV ou a composição imunogênica de RSV por injeção intradérmica ou injeção intramuscular.

45. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 41 a 44, caracterizado pelo fato de que o indivíduo foi exposto ao vírus, em que o indivíduo está infectado com o vírus ou em que o indivíduo está em risco de infecção pelo vírus.

46. Trímero de proteína F de RSV, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 22 ou a composição imunogênica de RSV de acordo com qualquer uma das reivindicações 24 a 40, caracterizado pelo fato de ser para uso em um método para induzir uma resposta imune à proteína F de RSV em um indivíduo, o método compreendendo administrar ao indivíduo o trímero de proteína F de RSV ou composição imunogênica de RSV em uma quantidade eficaz para produzir uma resposta imune específica do antígeno no indivíduo.

47. Uso do trímero de proteína F de RSV, definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 22 ou a composição imunogênica de RSV, definida em qualquer uma das reivindicações 24 a 40, caracterizado pelo fato de ser para a fabricação de um medicamento para uso em um método para induzir uma resposta imune à proteína F de RSV em um indivíduo, o método compreendendo administrar ao indivíduo o trímero de proteína F de RSV ou composição imunogênica de RSV em uma quantidade eficaz para produzir uma resposta imune específica do antígeno no indivíduo.

48. Invenção de produto, processo, sistema, kit ou uso, caracterizada pelo fato de que compreende um ou mais elementos descritos no presente pedido de patente.