EA015543B1

EA015543B1 - Высокоиммуногенная фармацевтическая композиция, включающая моноклональное антиидиотипическое анти-ca-125 антитело men2234 и соединение алюминия в качестве адъюванта

Info

Publication number: EA015543B1
Application number: EA200900085A
Authority: EA
Inventors: Йенс Флемминг; Карстен Грёгер; Рейнхард Шмитц; Стефано Манцини
Original assignee: Менарини Интернешнл Оперейшнз Люксембург С.А.
Priority date: 2006-06-29
Filing date: 2007-06-28
Publication date: 2011-08-30
Also published as: PT2040749E; AP2009004741A0; UA95806C2; EA200900085A1; MX2008016059A; EP2040749A2; AU2007263690A1; DE602007013402D1; SI2040749T1; CL2007001888A1; US20100040625A1; HK1126417A1; CN101478987A; TNSN08485A1; ES2363616T3; DK2040749T3; PL2040749T3; US20090104184A1; RS51683B; NO20090395L

Abstract

Данное изобретение относится к высокоиммуногенной фармацевтической композиции для парентерального применения, включающей моноклональные антиидиотипические анти-СА-125 антитела и соединение алюминия в качестве адъюванта.

Description

Изобретение относится к области фармацевтических композиций, используемых в качестве вакцин для парентерального применения.

Сведения о предшествующем уровне техники

Как известно, чтобы усилить иммуногенность профилактических или лечебных вакцин, обычно рассматривается применение адъюванта, такого как соединение алюминия (Ие_)ка с1 а1., Кое/. Ращйт. Ζ;·ι1<1. Ηί§. 1993, 73-80), в приготовлении фармацевтических лекарственных форм, таких как растворы или суспензии для парентерального применения. Цель данных формул - индуцировать максимальный и долговременный иммуногенный эффект.

Однако на сегодняшний день в зарегистрированных и выпускаемых на рынок вакцинах применяется ограниченное количество алюминиевых адъювантов и в Европейской фармакопее даже установлен предел 1,25 мг/дозу.

Также администрацией по пищевым продуктам и лекарственным средствам (ΡΌΆ) в 21 СЕК 610.15 установлено количество алюминия в рекомендованной индивидуальной дозе биологического продукта, которое не должно превышать:

(1) 0,85 мг, если определяется количественным анализом; или (2) 1,14 мг, если определяется путем расчета на основании количества добавленного соединения алюминия; или (3) 1,25 мг, определенных с помощью количественного анализа, при условии, что данные демонстрируют, что количество использованного алюминия является безопасным и необходимым для получения предполагаемого эффекта.

Иммуногенность антител, адсорбированных на алюминиевых адъювантах, как кажется, зависит от степени адсорбции (Саре11е е1 а1., Уассше, 2005, 1686-1694), но неясно, какое наилучшее отношение можно использовать для достижения иммуногенного ответа, поддерживая профиль безопасности. Например, Всемирная организация здравоохранения (ВОЗ) рекомендует адсорбцию на алюминиевых адъювантах при уровнях анатоксинов, превышающих 80% для столбнячного и дифтерийного анатоксинов (Сир1а е1 а1., Уаееше, 1995, 1263-1276; \УНО Тес11шса1 Керой 8епек Νο. 5956, 1996, р. 6). Напротив, данные показывают, что адсорбция столбнячных компонентов на гидроксиде алюминия при уровнях, превышающих 80%, не усиливает иммунный ответ у здоровых взрослых (Раоейт е1 а1., 1пГес1. 1ттип. 2001, 6696-6701). Наиболее подходящее содержание соединения алюминия для максимизации иммуногенности (без риска неприемлемого побочного токсического эффекта) в моноклональных антителосодержащих вакцинах все ещё остается открытым техническим вопросом.

Другим техническим вопросом является стабильность вакцин, которая значительно варьирует. Она может отличаться по устойчивости к хранению при повышенных температурах от дифтерийного и столбнячного анатоксинов и вакцины гепатита В, демонстрирующих высокую термостабильность, лиофилизированных вакцин против кори, желтой лихорадки и БЦЖ, занимающих среднее положение, и пероральной полиомиелитной вакцины, являющейся наименее устойчивой (Са1ахка е1 а1., ТкеппойаЬПНу оГ уассшек, \УогШ НеаШз ОгдапйаБоп. 1998). Восстановленные вакцины против кори, желтой лихорадки и туберкулеза (БЦЖ) являются нестабильными вакцинами, их необходимо использовать как можно быстрее после растворения и хранить на ледяной бане во время сеанса иммунизации. Хотя столбнячная и дифтерийная вакцины (например, адсорбированные на солях алюминия) в качестве моновалентных вакцин или компонентов комбинированных вакцин стабильны в течение недель при 35-37°С, каждое воздействие комнатной температуры приводит к некоторой деградации вакцины (Са1ахка е1 а1., см. выше, р. 48). Таким образом, хранение в холодных условиях предписано также для этих стабильных типов вакцин (Ко1е Ь151е, Ебйюп Сап1от Уег1ад, 2005).

Нерешенной технической задачей для данного типа вакцины, содержащей моноклональные антитела, является низкая стабильность при комнатной температуре.

Из-за природы сложного белкового действующего начала эти готовые лекарственные формы нужно хранить в холодных условиях (2-8°С), требующих постоянной холодовой цепи. Это обусловливает более высокую стоимость распространения, подвергает опасности общий профиль безопасности и, что возможно более важно, ограничивает мировое применение высокоцелебных лекарственных средств, таких как противораковая вакцина. Разработка формул вакцин, гарантирующих постоянное качество готовой лекарственной формы даже при комнатной и более высокой температуре (25-37°С) может, таким образом, повысить общую безопасность и профиль эффективности этих лекарственных средств. Это не только очень полезно для пациентов, но также в целом облегчает обращение с данными ценными лекарственными средствами.

С другой стороны, важность иммунотерапии в лечении опухолей у человека, и в частности применения моноклональных и идиотипических антител в качестве лечебных вакцин против опухолей, хорошо известна.

Такая вакцина активирует иммунную систему у хозяина, стимулируя гуморальное и клеточное действие против опухоли.

- 1 015543

Разработка и определение такого вида формулы особо важны для ΛΟΑ-125/ΜΕΝ2234 (описанного в ЕР700305), очень многообещающего антиидиотипического моноклонального антитела, предназначенного для применения в качестве лечебной вакцины против карциномы яичников. Для ΜΕΝ2234 присвоено следующее наименование по СА индексу: иммуноглобулин С1 анти(мышиный ОС 125) (мышиный моноклональный АСА-125 клон 3Ό5 д-цепь), дисульфид с мышиным моноклональным АСА-125-клоном 3Ό5 к-цепью, димер. Соответствующий номер в реестре информационной службы Федерального химического журнала СА8 792921-10-9. Предлагаемое международное непатентованное наименование (ΙΝΝ) Абаговомаб.

Аминокислотная последовательность ΜΕΝ2234 показана ниже.

ΜΕΝ2234 является мышиным моноклональным антителом, выработанным против мышиного моноклонального антитела ОС-125, которое распознает ассоциированный с опухолью антиген (ТАА) СА-125. ΜΕΝ2234 эффективно воспроизводит трехмерную структуру СА-125 ТАА и таким образом вызывает у хозяина продукцию антиантиидиотипических антител (АЬ3), направленных на опухолевые клетки, экспрессирующие СА-125 антиген. ΜΕΝ2234 также способен усилить клеточный иммунный ответ хозяина, специфически направленный против СА-125 опухолевых клеток.

Примерно 80% пациенток с раком яичников поздней стадии имеют повышенную экспрессию СА-125. Хотя СА-125 сверхэкспрессируется при раке яичников, человеческий организм сам по себе не способен выработать эффективный иммунный ответ против этих опухолевых клеток. Терапия лечебной вакциной, содержащей ΜΕΝ2234, действительно способна вновь пробудить иммунную систему хозяина к атаке и разрушению диссеминированных клеток рака яичника.

ЕР700305 описывает моноклональные антиидиотипические анти-СА-125-антитела, но не описана специфическая фармацевтическая формула, пригодная для лечения патологий.

В НуЬййоша, 1995, 14(2), 164-174 были охарактеризованы антитела АСА-125, но не была разработана формула.

В Сйшса1 Сапсег Кекеагсй, 2004, 10, 1580-1587 была проведена вакцинация пациенток АСА-125; не было раскрыто указания на концентрацию алюминия в формуле, но специалист в данной области техники, основываясь на предшествующем уровне техники, смог бы легко предположить относительно низкую концентрацию алюминия в качестве адъюванта (ниже чем 1,25 мг на индивидуальную дозу).

В НуЬпйоша, 2005, 133-140 описана система доставки для постоянного эндогенного высвобождения АСА-12511Рс (химерной формы АСА-125) для улучшения иммуногенности в качестве вакцины против рака яичников, но она вырабатывалась как депо ίη νίίτο на основании технологии биоинкапсулирования.

Дальнейшая публикация обобщает результаты доклинических и клинических исследований вакцин против рака яичника, включая ΜΕΝ2234, но конкретные данные о формуле или использованной концентрации адъювантов не упоминаются (например, о соединении алюминия не говорится): Сйшса1 Сапсег Кекеагсй, 2004, 1580-1587; Сйшса1 Сапсег Кекеагсй, 2003, 3234-3240; Сйшса1 Сапсег Кекеагсй, 2001, 11541162; Сйшса1 Сапсег Кекеагсй, 2001, 1112-1115).

Сущность изобретения

Изобретение касается фармацевтической формулы для парентерального применения (предпочтительно подкожного или внутримышечного), содержащей моноклональные антиидиотипические антитела ΜΕΝ2234, адсорбированные на соединении алюминия, выбранном из гидроксида алюминия (квасцов) или фосфата алюминия, и суспендированной в водной буферной системе.

Применение высоких концентраций (выше тех, что обычно рассматриваются и рекомендуются) соединений алюминия в качестве адъюванта обеспечивает вакцину с неожиданными клиническими и фармацевтическими преимуществами, такими как:

Ι) гарантия чрезвычайно высокой специфической иммуногенности в отношении гуморального и клеточного ответа;

ΙΙ) гарантия длительной индукции и поддержания иммунного ответа;

ΙΙΙ) гарантия безопасности применения лекарственного средства;

IV) упрощение процедуры производства и выпуска для конечной готовой лекарственной формы;

V) увеличение согласованности при производстве готовой лекарственной формы;

VI) улучшение стабильности готовой лекарственной формы также в релевантных температурных диапазонах.

Фармацевтические композиции в соответствии с данным изобретением содержат антиидиотипические антитела ΜΕΝ2234 в количестве от 0,1 до 4 мг/мл, предпочтительно от 0,2 до 2,5 мг/мл, даже более предпочтительно в концентрации примерно 2 мг/мл (от 1,9 до 2,1 мг/мл). Антитела ΜΕΝ2234 адсорбируются на соединении алюминия (предпочтительно в концентрации примерно 3,5 мг/мл алюминия) и суспендируются в забуференном и изотоническом солевом растворе. Представленные композиции не требуют какого-либо другого ингредиента в дополнение к антителам, адсорбированным на соединении алюминия и солей буферов, что приводит к очень простому раствору, избегающему любых дополнительных вопросов относительно безопасности, возникающих при использовании других агентов, таких как стабилизаторы, антиоксиданты, другие адъюванты и т.д.

- 2 015543

Предпочтительными буферами являются те, которые получены из фосфатных или нитратных солей. Окончательная композиция содержит предпочтительно 1 мл продукта для парентерального применения, предпочтительно путем подкожного или внутримышечного введения.

Одной из главных характеристик данного изобретения является то, что относительно высокая концентрация соединения алюминия, выбранного из алюминия фосфата и гидроксида алюминия, требуется для обеспечения практически полной адсорбции ΜΕΝ2234 на адсорбенте, причем высоко предпочтительным является гидроксид алюминия (см. табл. 1).

Предпочтительная концентрация А1⁺⁺⁺ в композиции находится в диапазоне 2,4-5,2 мг/мл, наиболее предпочтительно примерно 3,5 мг/мл (в диапазоне 3,1-3,8 мг/мл), что соответствует содержанию гидроксида алюминия в диапазоне 0,7-1,5% мас./мас., предпочтительно 1% мас./мас. (в диапазоне 0,9-1,1%).

Таблица 1 Зависимость адсорбции ΜΕΝ2234 (неадсорбированный белок) от концентрации алюминия (гидроксида алюминия)

Концентрация	Неадсорбированный белок (%)
А!⁴· (мг/мл)	А1(ОН)₃ (%)
0	0	100
0,9	0,25	78
1,2	0,36	59
1,7	0,5	30
2,6	0,75	<1,0
3,5	1,0	<0,1
6,9	2,0	<0,1

Содержание гидроксида алюминия 1% соответствует примерно 3,5 мг алюминия А1⁺⁺⁺ на 1 мл, что значительно выше количества, используемого в настоящее время в зарегистрированных и выпускаемых в продажу вакцинах и обычно рекомендуемого властями.

Представленные формулы могут быть приготовлены в соответствии со стандартными процедурами, хорошо известными в данной области техники. Общая процедура может применяться следующим образом. Производство конечного продукта осуществляют путем смешивания раствора антител и адъюванта (геля соединения алюминия) при заданных условиях. Готовая лекарственная форма удовлетворяет требованиям стерильности в соответствии со справочником Европейской фармакопеи Препараты для парентерального применения. Следовательно, в соответствии с нормативными требованиями производственный процесс проходит строго при асептических условиях. Все используемые ингредиенты являются стерильными или профильтрованными в форме раствора через фильтр с диаметром пор 0,22 мкм в процессе производства.

Формулы в соответствии с данным изобретением демонстрируют последовательную группу преимуществ.

I. Гарантия чрезвычайно высокой специфической иммуногенности в отношении гуморального и клеточного ответа.

Авторы изобретения продемонстрировали, что лечение в течение 1 месяца (подкожное введение в течение 4 недель) материалом композиции данного изобретения способно индуцировать специфический гуморальный ответ (специфические антитела, направленные против ΜΕΝ2234) в количестве, зависящем от концентрации соединения алюминия. Фактически было показано, что уровень гуморального ответа, вызываемого формулой с 1% гидроксидом алюминия (пример 1), значительно выше уровня гуморального ответа, вызванного суспензией, содержащей 0,36% гидроксид алюминия (соответствующий пределу, указанному Европейской фармакопеей и руководствами ΓΌΑ) или ΜΕΝ2234 в буферном солевом растворе.

Таблица 2

Титры антител в плазме против ΜΕΝ2234, измеренные в плазме кролика, после 4 еженедельных подкожных введений

Формула	Титр антител (нг/мл)
Раствор ΜΕΝ2234	907±259
Суспензия ΜΕΝ2234 в А1(ОН)₃ при 0,36%	3658±1473
Суспензия ΜΕΝ2234 в А1(ОН)₃ при 1,0%	15627±5007*

*Р<0,05 по сравнению с двумя другими условиями (критерий множественного сравнения Бонферрони)

В дополнение была проведена гистологическая оценка на месте введения для измерения рекрутинга воспалительных клеток и антигенпрезентирующих клеток, необходимых для установления специфического клеточного иммунного ответа. Также для этого параметра ответ на формулу с 1% гидроксидом алюминия (пример 1) был значительно выше того, что достигался с суспензией при более низком содержании А1(ОН)₃ (0,36%) или раствором ΜΕΝ2234 без А1(ОН)₃.

- 3 015543

Таблица 3

Полуколичественное определение воспалительных клеток в местах введения у кроликов, еженедельно обрабатываемых вакцинами

Формула	Плотность воспалительных клеток
Раствор ΜΕΝ2234	+/-
Суспензия ΜΕΝ2234 в А1(ОН)₃ при 0,36%	++
Суспензия ΜΕΝ2234 в А1(ОН)₃ при 1,0%	+++

II. Гарантия длительной индукции и поддержания иммунного ответа.

Авторы изобретения продемонстрировали на кроликах, что после иммунизации (4 еженедельные инъекции) материалом композиции примера 1 иммунный ответ поддерживается в течение более длительного периода и даже спустя несколько недель специфические антитела определяются в плазме. С другой стороны, когда иммунизацию проводили суспензией ΜΕΝ2234 с более низким количеством А1(ОН)₃ (0,36%) или ΜΕΝ2234 в растворе без адъюванта, присутствие антител выявлялось в течение более короткого периода времени.

III. Гарантия безопасности применения лекарственного средства.

ΜΕΝ2234 суспензию вещества данного изобретения вводили в виде подкожных инъекций в дозе 2 мг/мл в течение 26 недель кроликам. Схема введения: один раз в неделю в течение первого месяца и затем один раз в две недели в течение оставшегося периода. Оценивали местную переносимость и системную безопасность. Даже спустя 15 введений не отмечалось токсических эффектов с точки зрения веса тела, клинических признаков, потребления пищи, гематологии, клинической химии, гистопатологии всех органов. В месте инъекций наблюдался только воспалительный и иммунный ответ как следствие фармакологического действия лекарственного средства.

В дополнение данное изобретение, позволяющее снизить количество мышиных антител, также снижает их адсорбцию и пик в системной циркуляции, таким образом уменьшая риск анафилактической реакции(ий).

IV. Упрощение процедуры производства и выпуска для конечной готовой лекарственной формы.

Приблизительно 1% гидроксид алюминия гарантирует полное связывание ΜΕΝ2234 (<1% неадсорбированных антител). Это обеспечивает очень устойчивую адсорбцию и производственный процесс, не требующий тестов на высвобождение ΐη νίνο (иммуногенного ответа у экспериментальных животных), как обычно требуется для многих алюминийсодержащих вакцин, таких как столбнячная и дифтерийная. Полная адсорбция гарантирует оптимальную презентацию антител (АЪ2) для иммунной системы хозяина.

Подробные исследования механизма адсорбции ΜΕΝ2234 на гидроксиде алюминия установили, что в фосфатном буферном растворе достигается почти идеальное стехиометрическое распределение обоих веществ. Это гарантирует, как упомянуто выше, простой и устойчивый производственный процесс благодаря способности материала изобретения к самосборке. Уже спустя 15 с осторожного смешивания антитела почти полностью адсорбируются на гидроксиде алюминия (табл. 4).

Таблица 4

Зависимость адсорбции ΜΕΝ2234 от времени смешивания

Как видно из табл. 1, с концентрацией адъюванта менее 0,75% не достигается полной адсорбции; концентрации выше 1% (например, 2%) не демонстрируют какого-либо улучшения.

Очень быстрая и полная адсорбция ΜΕΝ2234 на соединении алюминия при более высоких, чем рекомендуемые, концентрациях адсорбента позволяет значительно упростить производство композиции в качестве лекарственного средства. За секунды конечную формулу получают простым смешиванием моноклональных антител с адъювантом. Этот этап смешивания можно проводить рутинно путем применения стандартного оборудования для асептической обработки на фармацевтических предприятиях. Самособирающиеся характеристики описанной системы ведут к совершенно новым перспективам производства и стабилизации данной формулы, а также адсорбированных моноклональных антител и вакцин в целом. Полная адсорбция ΜΕΝ2234 на алюминиевом адъюванте за секунды может также позволить получать конечную суспензию непосредственно перед подкожным или внутримышечным введением просто путем смешивания требуемых количеств лекарственной субстанции и алюминиевого адъюванта в месте конечного применения у пациента, например в госпитале.

- 4 015543

Таким образом, конкретный аспект данного изобретения представлен в форме, где активное действующее вещество вакцины (антитела ΜΕΝ2234) и адъювант (соединение алюминия, предпочтительно гидроксид алюминия) хранятся отдельно и готовы к смешиванию непосредственно перед введением пациенту. Предпочтительное время для этого этапа смешивания должно составлять от 10 с и 10 мин перед введением пациенту.

Для этой конкретной формы композиция должна предоставляться с антителами и раствором адъюванта, хранящимися по отдельности, но разлитыми в фармацевтические стандартные контейнеры, такие как флаконы, ампулы, предварительно заполненные шприцы или подходящие двухкамерные системы для смешивания и/или восстановления. Моноклональные антитела могут применяться не только в форме забуференного в конечном итоге раствора, но также, например, в форме порошка. Возможность применения лекарственной субстанции в твердой форме позволяет использовать для него все методики, предназначенные для повышения стабильности моноклональных антител или вакцин (лиофилизацию, высушивание распылением и т.д.). Это представляет значительный прогресс в обработке и усовершенствовании стабильности для всех адсорбированных вакцин в целом и, в частности, для тех, которые содержат моноклональные антитела, такие как ΜΕΝ2234. Главные недостатки адсорбированных вакцин, такие как непрерывная холодовая цепь при транспортировке и хранении, могут быть устранены и срок годности готовой лекарственной формы может быть увеличен.

Как упоминалось, иммуногенная активность ίη νίνο моноклональных антител, содержащих фармацевтические композиции, зависит вариабельным образом от степени адсорбции антител на применяемых адсорбентах (Саре11е е! а1., Уассше, 2005, 1686-1694). Таким образом, современным состоянием данной области техники является определение биологической иммуногенной активности (адсорбированных) вакцин ίη νίνο у животных перед выпуском готовой лекарственной формы. Воспроизводимая адсорбция ΜΕΝ2234 на алюминиевом адъюванте значительно упрощает процедуру выпуска. Благодаря надежности адсорбции тестирование можно проводить только путем анализа ίη νίίτο для определения мощности композиции. Обычная процедура определения также биологической активности ίη νίνο на животных для композиции данного изобретения является излишней.

V. Увеличение согласованности при производстве готовой лекарственной формы.

Воспроизводимость адсорбции ΜΕΝ2234 с применением более высоких, чем рекомендовано, концентраций, например гидроксида алюминия, значительно повышает согласованность при производстве готовой лекарственной формы. Как показано в табл. 5, если концентрация гидроксида алюминия в формулах находится в диапазоне 0,7-2% в/о, адсорбция ΜΕΝ2234 является полной (<1% свободных антител) для всех произведенных серий.

Таблица 5 Вариабельность адсорбции ΜΕΝ2234 (неадсорбированные антитела)

на гид	роксиде алюминия при производстве
Концентрация гидроксида	Неадсорбированные антитела (%)
алюминия (%)	Серия I	Серия II
0	100	100
0,25	78	66
0,36	59	11
0,5	30	6
0,75	<1,0	<1,0
1,0	<0,1	<0,1
2,0	<0,1	<0,1

Полная и воспроизводимая адсорбция предотвращает далее возможные осложнения при обработке, такие как образование агломератов антител. Антитела в растворе подвержены формированию агрегатов. Агрегация антител в растворе может быть вызвана избыточными силами сдвига в жидкой фазе, например, при перемешивании. Эти агрегаты не могут быть повторно растворены и ведут к значительному уменьшению биологической активности вакцины. Однако благодаря процессу полной и быстрой адсорбции, этого явления можно полностью избежать для композиций, являющихся предметом данного изобретения.

VI. Улучшение стабильности готовой лекарственной формы также в релевантных температурных диапазонах.

Неожиданно композиция из примера 1 является гораздо более стабильной (даже при 25 и 37°С) по сравнению с забуференным раствором ΜΕΝ2234. Это простое, но очень эффективное средство (повышение концентрации гидроксида алюминия в 2-3 раза сверх рекомендуемой дозы) гарантирует почти полное связывание, а также соответственно стабильность. В табл. 6 представлены релевантные данные по стабильности для ΜΕΝ2234 в растворе и в формуле по примеру 1.

- 5 015543

Таблица 6

Данные по стабильности для ΜΕΝ2234 в растворе и при адсорбции на гидроксиде алюминия

Анализируемый продукт	Условия хранения (°С)	\| Продукт (%) спустя время хранения \|
	(месяцы)
0	1	2
ΜΕΝ2234 раствор,	25	100,0	90,2	88,6
серия К2СЕ73-Р5	37	100,0	88,9	89,1
ΜΕΝ2234,	25	100,0	102,1	98,7
адсорбированный на 1% гидроксиде алюминия, серия 287-2р43	37	100,0	98,7	100,4

Соответственно, изобретение обеспечивает требуемую стабильность и активность антител при обычной температуре тела (36-37°С) после введения человеку.

Примеры

Не ограничивающими примерами изобретения являются следующие.

Пример 1. Суспензия для инъекций.

Ингредиент	мг/мл
ΜΕΝ2234	2,00
А1(ОН)з*	10,00
КС1	0,20
КН₂РО₄	0,20
Ναϋ1	8,00
Ыа₂НРО₄ х 7Н₂О	2,16
Вода для инъекций	до 1,00 мл

* Используют для производства гидроксида алюминия, гидратированного, для адсорбции.

Композицию готовили в соответствии со стандартной процедурой, как описано ранее, простым смешиванием ΜΕΝ2234 с суспензией гидроксида алюминия, гидрата, в растворе, забуференном подходящими солями.

Пример 2. Суспензия для инъекций.

Ингредиент	мг/мл
ΜΕΝ2234	2,00
А1(ОН)з*	7,50
КС1	0,20
КН₂РО₄	0,20
ИаС1	8,00
Иа₂НРО₄ х 7Н₂О	2,16
Вода для инъекций	до 1,00 мл

* Используют для производства гидроксида алюминия, гидратированного, для адсорбции. Готовят, как в примере 1.

Пример 3. Суспензия для инъекций.

Ингредиент	мг/мл
ΜΕΝ2234	2,00
А1РО₄	10,00
КН₂РО₄	0,20
ИаС1	9,00
Ма?НРО₄ х 7Н₂О	1,20
Вода для инъекций	до 1,00 мл

- 6 015543

Пример 4. Определение аминокислотной последовательности ΜΕΝ2234 (абаговомаг).

8ΕρΐϋΝ0:1

Последовательность тяжелой цепи

ΟνΟΧβΟδΘΑΕ ΧΑΚΡΘΑδνΚΧ ЗСКАЗСХТЕТ ΝΥ«ΝνΚζ>Κ РСОбХЕИХСА ΧΥΡΘϋΘΝΤΚΥ 60 ΤβΚΕΚΟΚΑΤΧ ΤΑΒΚ333ΤΑΥ Μ<2Χ5δΧΑ3Εϋ ЗАУУУСАКСЕ бЫУАИЕАУИС ОСТХУТУЗАА 120 КТТРРЗУУРХ ΑΡ65ΑΑ0ΤΝ3 МУТХбСХУКб УЕРЕРУГУТИ ПЗСЗХЗЗСУН ТЕРАУХ08ОХ 180 ΥΤΧδδδντνΡ ззт^рзетут спуанраззт куоккхурец СССКРСХСТУ РЕУЗЗУЕХЕР 240 РКРКПУХТХТ ΧΤΡΚντσννν ОХЗКОПРЕУО ЕЗЖУОЦУЕУ ΗΤΑβΤβΡΚΕΕ ОЕИЗТЕКЗУЗ 300 ЕХРХМНСШХ ЫСКЕЕКСКУИ ЗААЕРАРХЕК ТХЗКТКСКРК АРОУУТХРРР КЕОМАКШСУЗ 360 ХТСМХТОЕЕР ΕΟΧΤνΕΜς^Ν ΟΟΡΑΕΝΥΚΝΤ ςΡΧΜΟΤϋΘ3Υ ЕУУЗКХЫУОК 5ΝΚΕΑ3ΝΤΕΤ 400 СЗУХНЕСХНЫ ННТЕКЗХЗНЗ РОК

8Ер ГО N0:2

Последовательность легкой цепи

ΟΙΩΜΓΏ8ΡΑ3 ЪЗАЗУСЕТУТ ХТСКАЗЕЫХУ 5ΥΧΑΚΗ00Κ0 СКЗРОХХУУЦ АКТХАСОУЗЗ 60 КЕ5СЗС5СТН ЕЗХКХКЗХСР ΕϋΕΟΧΥΥΟζΙΗ НУСХЕРТЕСС СТКХЕХКРАО ААРТУЗХГРР 120 ЗЗЕдХТЗССА δννΟΕΧΝΝΕΥ РКОХПУКИКХ ϋΟ3ΕΚ0№νΧ ПЗИТОдОЗКО 3ΤΥ3Μ33ΤΧΤ 180 ΧΓΚΌΕΥΕΡ.ΗΝ ЗУТСЕАТНКТ ЗТЗРХУКЗЕМ КМЕС

Первую часть определения аминокислотной последовательности абаговомаба проводили с использованием методики автоматического секвенирования в соответствии с процедурой деградации по Эдману, в белковом секвенаторе, где абаговомаб был ковалентно связан с мембраной для секвенирования (первые 15 аминокислот легкой цепи).

Автоматизированное секвенирование по Эдману было не способно предоставить какие-либо данные о последовательности тяжелой цепи, что позволило предложить модификацию Ν-концевой группы тяжелой цепи пироглютаминовой кислотой, для более расширенного секвенирования с хорошо известной методикой секвенирования ЖХ-МС/МС с применением масс-спектрометрии (например, Ргос. \;П1. Леаб. 8с1. ϋ8Ά, 1986 8ер., 83(17), 6233-6237).

Вкратце, различные образцы антител фрагментировали различными протеолитическими ферментами перед ЖХ-МС/МС анализом и получали несколько серий фрагментов с перекрывающейся последовательностью. При нахождении схемы перекрывания этих фрагментов можно определить общую последовательность легкой цепи антитела (полные аминокислотные последовательности тяжелой и легкой цепей показаны на 8Ε6) ГО ΝΟ: 1 и 8ΕΕ) ГО ΝΟ: 2).

В качестве конечной проверки надежности экспериментальных результатов зарегистрированные последовательности также подтверждали с помощью анализа сходства последовательностей при помощи пакета программ ΒΕΛ8Τ против неизбыточной базы данных по структуре белка, оптимизированной для анализа белков (Μ8ΏΒ, загружена в марте 2007 с йр-сайта Европейского института биоинформатики).

Поскольку при масс-спектрометрии невозможно отличить изолейцин от лейцина, в приведенных последовательностях 8ΕΕ) ГО ΝΟ: 1 и 2 эта неопределенность выражена как X.

- 7 015543

Список последовательностей <110> мепагтгп 1птегпа11опа1 0регаТ10П5 ьихетЬоигд 5.А.

<120> РНагтасеиЬ1са1 сотро5111оп5 сопЬатт'пд топос1опа! апгт тсНогурч’с апТ1-СА-125 апГтЬойу апй а1ит1П1ит <130> 7626 ртао <150> ΕΙ2006Α000163 <151> 2006-06-29 <160> 2 <170> Ратептт νθΓ5ΐοη 3.3 <210> 1 <211> 443 <212> РКТ <213> АгГ1б1С1а1 5еяиепсе <220>

<223> МопосТопа! апП'Ьойу <220>

<221> М15С_РЕАТиКЕ <222> (4)..(4) <ζζ3> х 15 ьеи ог 11е <220>

<221> М15С_ЕЕАТиКЕ <222> (11)..(11) <223> X 15 Ьеи ог 11е <220>

<221> М15С_РЕАТ11КЕ <222> (20)..(20) <223> X 15 ьеи ог 11е <220>

<221> М15С_ЕЕАТиКЕ <222> (45)..(45) <223> X 15 Ьеи ог 11е <220>

<221> М15С_ЕЕАТиЯЕ <222> (48)..(48) <223> X 15 ьеи ог 11е <220>

<221> М15С_ЕЕАТиКЕ <222> (51)..(51) <223> X 15 Ьеи ог 11е <220>

<221> М18С_РЕАТиЯЕ <222> (70)..(70) <223> X 15 Ьеи ог 11е <220>

<221> М18С_ЕЕАТиКЕ <222> (83)..(83) <223> X 15 Ьеи ог 11е <220>

<221> М15С_РЕАТиКЕ <222> (86)..(86)

- 8 015543 <223> X 15 ьеи ог 11е <220>

<221> М18С_РЕАТиКЕ <222> (114)..(114) <223> х 15 Ьеи ог 11е <220>

<221> М15С_ЕЕАТ1)ЕЕ <222> (130)..(130) <223> X 15 Ьеи ог 11е <220>

<221> М15С_ЕЕАТиКЕ <222> (144)..(144) <223> X 15 1_еи ог 11 е <220>

<221> М15С_ЕЕАТиНЕ <222> (147)..(147) <223> X 15 Ьеи ог 11е <220>

<221> М18С_ЕЕАТ11ЯЕ <222> (165)..(165) <223> X 15 1_еи ог 11е <220>

<221> М15С_ЕЕАТиКЕ <222> (176)..(176) <223> X 15 ί-еи ог 11е <220>

<221> М15С_ЕЕАТ0КЕ <222> (180)..(180) <223> х 15 1_еи ог 11е <220>

<221> М15С_ЕЕАТиЯЕ <222> (183)..(183) <223> X 15 Ьеи ог 11е <220>

<221> М15С_ЕЕАТиКЕ <222> (216)..(216) <223> X 15 Ьеи ог 11е <220>

<221> М15С_ЕЕАТиЕЕ <222> (227)..(227) <223> X 15 Ьеи ог 11е <220>

<221> М15С_РЕАТ1)КЕ <222> (238)..(238) <223> X 15 1_еи ог 11е <220>

<221> М18С_ЕЕАТиКЕ <222> (247)..(247) <223> X 15 Ьеи ог 11е <220>

<221> М18С_ЕЕАТиКЕ <222> (249)..(249) <223> X 15 Ьеи ог 11е <220>

- 9 015543 <221> М18С_ЕЕАТиКЕ <222> (251)..(251) <223> х 15 Ьеи ог 11е <220>

<221> М15С_ГЕАТиКЕ <222> (262)..(262) <223> X 15 ьеи ог Не <220>

<221> М12С_ЕЕАТиКЕ <222> (302)..(302) <223> X 15 1_еи ог 11е <220>

<221> М15С_ЕЕАТиНЕ <222> (304)..(304) <223> X 15 Ьеи ог 11е <220>

<221> М15С_ЕЕАТиВЕ <222> (310)..(310) <223> X 15 Ьеи ог 11е <220>

<221> М18С_ЕЕАТиКЕ <222> (328)..(328) <223> X 15 Ьеи ог 11е <220>

<221> М15С_ЕЕАТиКЕ <222> (332)..(332) <223> X 15 Ьеи ог 11е <220>

<221> М15С_ЕЕАТЫКЕ <222> (347)..(347) <223> X 15 ьеи ог 11е <220>

<221> М15С_РЕАТиКЕ <222> (361)..(361) <223> X 15 Ьеи ог 11е <220>

<221> М15С_ЕЕАТиКЕ <222> (365)..(365) <223> X 15 ьеи ог 11е <220>

<221> М15С_ЕЕАТиКЕ <222> (373)..(373) <223> X 15 ьеи ог 11е <220>

<221> М15С_ЕЕАТиКЕ <222> (393)..(393) <223> X 15 ьеи ог 11е <220>

<221> М18С_ЕЕАТиКЕ <222> (406)..(406) <223> X 15 Ьеи ог 11е <220>

<221> М15С_ЕЕАТиКЕ <222> (424)..(424) <223> X 15 ьеи ог 11е

- 10 015543 <220>

<221> М15С_ЕЕАТиКЕ <222> (428)..(428) <223> X 15 1_еи ог 11е <220>

<221> М15С_ЕЕАТиКЕ <222> (437)..(437) <223> х 15 1.еи ог 11е <400> 1

61 η Уа1 1

61 η

Хаа 61 η 5

61п Зег

61у А1а б!и 10

хаа

А1а Агд

Рго

61 у 15

А1а

5ег

УаТ

1_У5

Хаа

Зег

Су5

ЬУ5

А1а

Зег

б!у

Туг

ТНг

РНе

тИг

А5П

туг

20

25

30

тгр

Μθΐ

61 п

тгр

Уа1

ЬУ5

61 η

Агд

РГО

61 у

61 η

61у

хаа

А5р

тгр

хаа

35

40

45

61 у

А1а

Хаа

Туг

Рго

61 у

А5Р

б!у

А5П

ТНг

Агд

Туг

ТНг

61 П

ЬУ5

РНе

50

55

60

1_У5

б1у

ЬУ5

А1а

тНг

хаа

ТНг

А1а

А5р

1_у5

Зег

зег

Зег

тНг

А1а

туг

65

70

75

80

Μθΐ

61 η

Хаа

5ег

8ег

Хаа

А1а

5ег

61 и

А5р

5ег

А1а

Уа1

туг

Су5

85

90

95

А1а

Агд

61у

61 и

61у

А5П

Туг

А1а

тгр

РНе

А1а

Туг

Тгр

61 у

61 η

61у

100

105

110

тНг

хаа

Уа1

ТНг

Уа1

Зег

А1а

кУ5

ТНг

Рго

5ег

Уа1

туг

115

120

125

РГО

хаа

А1а

Рго

61 у

Зег

А1а

61 п

ТНг

А5П

зег

мег

Уа1

ТНг

Хаа

130

135

140

61 у

Су5

хаа

Уа1

1_У5

б1у

Туг

РНе

Рго

61 и

РГО

Уа1

ТНг

Уа1

ТНг

тгр

145

150

155

160

А5П

Зег

61у

5ег

Хаа

Зег

61 у

Уа1

Н15

ТНг

РНе

РГО

А1а

Уа1

Хаа

165

170

175

61 п

Зег

А5р

хаа

Туг

тНг

хаа

Зег

Уа1

ТНг

Уа1

РГО

зег

Зег

180

185

190

тНг

тгр

РГО

Зег

61 и

тНг

УаТ

ТНг

Су5

А5П

Уа1

А1а

ΗΊ 5

рго

А1а

Зег

195

200

205

Зег

тНг

1_у5

Уа1

А5р

1_У5

ЬУ5

Хаа

Уа1

Рго

Агд

А5р

СУ5

61 у

Су5

1_у5

210

215

220

- 11 015543

рго суз 225

хаа

Суз

ТЬг Уа! 230

Рго 61 и Уа1

зег

Зег Уа1 235

РЬе

хаа

РЬе

РГО 240

РГО

1_У5

Рго

ьуз

Азр

Уа1

Хаа

ТЬг

хаа

тЬг

хаа

тЬг

Рго

ьуз

Уа!

тЬг

245

250

255

Су5

Уа1

Азр

хаа

Зег

ьуз

Азр

Рго

61 и

Уа1

61 η

РЬе

Зег

260

265

270

тгр

РЬе

Уа1

АЗр

Уа1

61 и

Уа1

Н1 5

тЬг

А1а

61 η

ТЬг

61 η

Рго

Агд

ΖΖ э

ζου

^оэ

61 и

61 η

РЬе

АЗП

Зег

ТЬг

РЬе

Агд

Зег

Уа!

Зег

61 и

хаа

Рго

Хаа

290

295

300

мег

Н1 5

61 η

Азр

Тгр

Хаа

АЗП

61 у

ьуз

61 и

РЬе

ьуз

Суз

Агд

Уа1

АЗП

305

310

315

320

Зег

А1а

РЬе

РГО

А1а

РГО

Хаа

61 и

Ьуз

ТЬг

Хаа

Зег

ьуз

тЬг

Ьуз

325

330

335

С1у

Агд

РГО

ьуз

А1а

Рго

61 п

Уа1

туг

тЬг

хаа

Рго

РГО

Рго

ьуз

61 и

340

345

350

61 η

мет

А1а

ьуз

Азр

ьуз

Уа1

Зег

Хаа

ТЬг

Суз

мет

хаа

ТЬг

Азр

РЬе

355

360

365

РЬе

РГО

61 и

А5р

хаа

тЬг

Уа1

61 и

тгр

61 η

Тгр

Азп

б!у

61 η

Рго

А1а

370

375

380

1 и

АЗП

Тут

ьуз

АЗП

Тл г

и ΐ п

Рго

Хаа

мет

Азр

Тпг

Азр

1 у

Зег

Туг

385

390

395

400

РЬе

Уа1

туг

зег

Ьуз

Хаа

А5П

Уа1

61 η

Ьуз

5ег

АЗП

тгр

б1и

А1а

61 у

405

410

415

АЗП

ТЬг

РЬе

ТЬг

суз

зег

Уа1

хаа

Н1 5

61 и

61у

Хаа

Н1 5

Азп

Н18

ΗΊ 8

420

425

430

ТЬг

61 и

ьуз

Зег

хаа

Зег

Н1 5

зег

Рго

61у

ьуз

435 440

<210>	2
<211>	214
<212>	РКТ
<213>	АгТ1Т1С1’а1	зедиепсе
<220> <223>	мопосТопаТ	апттЬоду
<220>
<221>	М13С_РЕАТиКЕ

- 12 015543

<222> <223>	(21)..(21) х 15 Беи ог 11е
<220> <221> <222> <223>	М15С_РЕАТБ1КЕ (29)..(29) X 15 Беи ог 11е
<220> <221> <222> <223>	М18С_РЕАТиЯЕ (33)..(33) X 15 Беи ог 11е
<220> <221> <222> <223>	М18С_РЕАТБ1КЕ (46)..(47) х 15 Беи ог 11е
<220> <221> <222> <223>	М18С_ЕЕАТиЯЕ (54)..(54) х 15 Беи ог 11е
<220> <221> <222> <223>	М18С_РЕАТиКЕ (73)..(73) х 15 Беи ог 11е
<220> <221> <222> <223>	М15С_РЕАТ11КЕ (75)..(75) х 15 Беи ог 11е
<220> <221> <222> <223>	М18С_РЕАТиКЕ (78).. (78) X 15 Беи ог 11е
к220> <221> <222> <223>	М15С_РЕАТ11ЯЕ (85)..(85) X 15 Беи ог 11е
<220> <221> <222> <223>	М15С_РЕАТиЯЕ (94)..(94) х 15 Беи ог 11е
<220> <221> <222> <223>	М18С_РЕАТиЯЕ (104)..(104) х 15 Беи ог 11е
<220> <221> <222> <223>	М18С_РЕАТиКЕ (106)..(106) х 15 Беи ог 11е
<220> <221> <222> <223>	М18С_РЕАТиКЕ (117)..(117) X 15 Беи ог 11е

<220>

<221> М15С_РЕАТиКЕ <222> (125)..(125) <223> х 15 Беи ог 11е

- 13 015543 <220>

<221> М15С_ЕЕАТикЕ <222> (136)..(136) <223> X 15 Ьеи ог 11е <220>

<221> М15С_ЕЕАТиКЕ <222> (144)..(144) <223> X 15 Ьеи ог 11е <22О>

<221> М15С_ЕЕАТиКЕ <222> (150).-(150) <223> X 15 кем ог ±1е <220>

<221> М15С_ЕЕАТиКЕ <222> (160)..(160) <223> X 15 ьеи ог 11е <220>

<221> М15С_ЕЕАТиКЕ <222> (179)..(179) <223> X 15 ьеи ог 11е <220>

<221> М15С_ЕЕАТ11КЕ <222> (181)..(181) <223> X 15 ьеи ог 11е <22О>

<221> М18С_ЕЕАТиЯЕ <222> (205)..(205) <223> X 15 Ьеи ог 11е <400> 2

А5р

Не

61 η

Мек

ТЬг

61 η

Зег

Рго

А1а

Зег

кем

Зег

А1а

5ег

Уа1

61у

1

5

10

15

61 и

ТНг

Уа1

ТНг

Хаа

ТЬг

Су5

Агд

А1а

Зег

61 и

А5П

хаа

Туг

Зег

Туг

20

25

30

хаа

А1а

Тгр

Н1 5

61 η

ЬУ5

61 η

61 у

ЬУ5

зег

Рго

61 η

хаа

Уа!

35

40

45

туг

А5П

А1а

ку5

ТЬг

Хаа

А1а

61 у

Уа!

зег

Зег

Агд

р|те

Зег

61у

50

55

60

зег

б!у

Зег

61 у

ТЬг

Н1 5

рИе

5ег

Хаа

ьуз

хаа

ку5

Зег

хаа

61 η

Рго

65

70

75

80

б1и

А5р

РЬе

61 у

Хаа

туг

Су 5

61 η

ΗΪ 5

НТ 5

туг

61у

хаа

РЬе

Рго

85

90

95

ΤΐΐΓ

рКе

61 у

ТЬг

Ьуз

Хаа

61 и

Хаа

ЬУЗ

Агд

А1а

А!5р

А1а

100

105

110

РГО

ТЬг

Уа1

Зег

Хаа

РИе

РГО

Рго

5ег

61 и

61 η

Хаа

ТЬг

5ег

61у

115

120

125

61

у А1

а Зе

г Уа

1 Уа'

1 Су5 РЬе

: хаа

А5П

РЬе

Туг

РГО

ку5

А5р

Хаа

13

0

135

140

А5

;п Уа

.1 ЬУ

5 Тг

Р ЬУ:

5 Хаа А5р

ΐ б!у

Зег

61и

Агд

61 η

А5П

61 у

Уа1

Хаа

14

5

150

155

160

А5

;п Зе

г тг

р ТЬ

Г А5|

О 61П А5р

ΐ Зег

ку5

А5р

зег

тИг

туг

Зег

Мек

Зег

16!

5

170

175

Зе

г тН

г ха

а тЬ

г ха;

а. тЬг ку5

А5р

61 и

Туг

б1и

Агд

НТ 5

А5П

Зег

туг

18

0

185

190

ть

ΙΓ Су

5 61

и А1

а ТЫ

г Н1 Е

; ку5

тЬ г

зег

ТКг

зег

Рго

хаа

Уа1

ЬУЗ

Зег

19

5

200

205

РЬе А5п Агд Αδη С1и Су5

210

- 14 015543

Claims

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

1. Высокоиммуногенная фармацевтическая композиция для парентерального введения, включаю- щая моноклональное антитело и в качестве адъюванта соединение алюминия с концентрацией от 2,4 до 5,2 мг/мл иона алюминия, в которой указанным моноклональным антителом является моноклональное антиидиотипическое анти-СА-125 антитело ΜΕΝ2234, включающее ЗЕЦ ГО N0: 1 и

ЗЕЦ ГО N0: 2, содержащееся в количестве 0,1-4 мг/мл, а указанное соединение алюминия выбрано из гидроксида алюминия и фосфата алюминия.
2. Фармацевтическая композиция по п.1, в которой соединение алюминия содержится в концентрации, соответствующей 3,1-3,8 мг/мл иона алюминия.
3. Фармацевтическая композиция по п.2, в которой соединение алюминия является гидроксидом алюминия.

композиция композиция по по

п.3,

п.4, которой антитело ΜΕΝ2234 содержится которой антитело ΜΕΝ2234 содержится в количестве в количестве
4. Фармацевтическая

0,2-2,5 мг/мл.
5. Фармацевтическая

1,9-2,1 мг/мл.
6. Фармацевтическая композиция по пп.1-5, в которой антитело ΜΕΝ2234 адсорбировано на соединении алюминия и суспендировано в забуференном и изотоническом физиологическом растворе.
7. Фармацевтическая композиция по пп.1-6 в форме жидкой суспензии.
8. Фармацевтическая композиция по п.7, пригодная для подкожного или внутримышечного введе ния.
9. Фармацевтическая композиция по пп.1-8, имеющая следующий состав:

а) ΜΕΝ2234 А1(0Н)э КС1 КН₂Р0₄ №1С1 №ьНР0₄/7Н₂0 вода для инъекций или 2,00 мг/мл 10,00 мг/мл 0,20 мг/мл 0,20 мг/мл 8,00 мг/мл 2,16 мг/мл до 1,00 мл б) ΜΕΝ2234 А1(0Н)3 КС1 КН₂Р0₄ №1С1 №₂НР0₄/7Н₂0 вода для инъекций или в) ΜΕΝ2234 А1Р0₄ КН₂Р0₄ №1С1 №₂НР0₄/7Н₂0 вода для инъекций 2,00 мг/мл 7,50 мг/мл 0,20 мг/мл 0,20 мг/мл 8,00 мг/мл 2,16 мг/мл до 1,00 мл 2,00 мг/мл 10,00 мг/мл 0,20 мг/мл 9,00 мг/мл 1,20 мг/мл до 1,00 мл
10. Фармацевтическая композиция по пп.1-9 для применения в качестве противоопухолевой вакцины для лечения или профилактики опухолей.
11. Фармацевтическая композиция по п.10 для применения в качестве противоопухолевой вакцины для лечения опухолей яичников.