WO2008062907A1 - Substance capable of inhibiting cytokinin signaling - Google Patents

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cytokinin
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Asako Nagasawa
Yuto Arata
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Definitions

  • the present invention relates to a drug having an activity of inhibiting intracellular signal transduction from a plant-derived cytokinin receptor and controlling plant growth or differentiation.
  • Cytokinin is a plant hormone related to cell division and differentiation of higher plants. Induction of higher plant cell division, differentiation from callus medulla to stalks and leaves, prevention of leaf yellowing and fallen leaves and fallen fruit, top bud priority. It is an important physiologically active substance known to exhibit actions such as breaking down (Cytokinins: Chemistry, Activation, and Function, CRC Press (1994)). As methods for controlling physiological phenomena caused by cytokinin, methods of giving cytokinin from the outside, methods of controlling cytokinin biosynthesis in plants, methods of controlling cytokinin metabolism in plants have been considered.
  • a protein comprising an amino acid sequence in which one or more amino acids are deleted, added or substituted in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 and having an activity of functioning as a cytokinin receptor
  • n an integer from 0 to 4,
  • Ar represents an optionally substituted aryl group or an optionally substituted heteroaryl group) or an agriculturally acceptable salt thereof.
  • R 11 represents a formyl group, a C4-6 alkyl group, a C3-6 alkenyl group or a C3-6 alkynyl group, wherein the alkyl group, alkenyl group and alkynyl group are a hydroxyl group or a C1-3 alkoxy group
  • R 11 represents a C1-3 alkoxycarbonylmethyl group, a C1-3 alkoxy C1-3 alkyl group or a furfuryl group,
  • cytokinin receptors In plant cytokinin receptors, a single receiver region is associated with the same molecule. In other words, in the cytokinin receptor bound to cytokinin, it is known that the phosphoryl group transfer from the His residue to the intramolecular Asp residue occurs following the autophosphorylation of the His residue in the molecule. Yes. Furthermore, it has been clarified that this phosphate group is transferred to the Asp residue of the response regulator via the His residue of the phosphate transfer mediator. For example, in Arabidopsis thaliana, it has been clarified that the phosphate group is transferred from the cytokinin receptors CRE1, AHK2, and AHK3 through the phosphate group transfer mediator AHP to the response region.
  • the plant growth regulator is usually mixed with a solid carrier, a liquid carrier, etc., and if necessary, a surfactant, other formulation adjuvants, etc. are added to the emulsion, wettable powder, suspending agent, aqueous solvent. It is used by making it into a formulation.
  • the cytokinin signaling inhibitor is generally contained in an amount of 0.5 to 90% by weight, preferably 1 to 80% by weight.
  • Sequence identity can also be determined using commercially available sequence analysis software. Specifically, an example For example, using GENETYX-WI Ver.5 (Software Development Co., Ltd.) It can be calculated by creating an alignment.
  • the “stringent conditions” described in (e) include: Sambrook J., Frisch EF, Maniatis ⁇ , Molecular Cloning 2nd edition, Cold Spring Harbor Laboratory Issue (Cold In a hybridization performed according to the usual method described in Spring Harbor Laboratory press, etc., for example, a solution containing 6 XSSC (i. 5M NaCK 0.15M trisodium citrate is 10 XSSC.
  • C ⁇ 3 alkyl group (including C ⁇ 3 alkylamino group and C1-3 alkyl group of the group shown as di-C1-3 alkylamino group) includes methyl, ethyl, propyl and isopyl pills. It is done.
  • 1-aziridinyl, pyrrolidino, piperidino, morpholino may be used as the “cyclic amino group” represented by “a cyclic amino group optionally substituted with adjacent nitrogen atoms of R 1 and R 2 ”.
  • Thiomorpholino and the like are used, and as the substituent, for example, one to three of the above-mentioned C1-3 alkyl group, C1-3 alkoxy group, hydroxyl group and the like are used.
  • substituents of these “aryl group” and “heteroaryl group” include, for example, “substitution represented by R, X, R 1 , R 2 , R 3 , R 4 , R 5 , R 6 and R 7.
  • the compound in which 1 is 0 means that the 2-position of the quinazoline skeleton is unsubstituted, that is, the general formula (1-1)
  • X is an optionally substituted hydrocarbon group, a group represented by NR ′ R 2 , a group represented by OR 3 , a group represented by S (0) n R 4 , a nitro group or Represents a halogen atom,-represents a hydrogen atom or an optionally substituted hydrocarbon group,
  • n an integer from 0 to 4,
  • the reaction time is usually 0.2 to 96 hours, preferably 0.5 to 24 hours, more preferably 1 to 3 15 hours.
  • the reaction temperature is usually from 20 to 200, preferably from 50 to 120.
  • Each compound produced by such production method 11 and reference production methods 11, 12, 13 and the like can be obtained by known means such as concentration, concentration under reduced pressure, extraction, phase transfer, crystallization, recrystallization, chromatographic It can be isolated and purified by the first-class method.
  • the plant growth regulation in the present invention is usually carried out by adding an effective amount of a plant growth regulator to the plant or its plant. By applying to the habitat.
  • the reaction solution (251) was prepared by adding 32PdCTP 2.0 MBq to 25 ng of the amplified DNA fragment and adding the reaction composition specified in the kit. The labeling reaction was performed at 37 for 10 minutes.
  • Example 3 (Acquisition of phage cDNA clone carrying CRE1 gene)

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Description

明細書
サイトカイニン信号伝達阻害薬剤 技術分野
本発明は、植物由来のサイトカイニン受容体からの細胞内信号伝達を阻害する活性 を有し、 植物の生長若しくは分化を制御する薬剤等に関する。 背景技術
サイトカイニンは、高等植物の細胞分裂及び分化に関する植物ホルモンであり、高 等植物細胞の分裂の誘起、 カルスゃ髄から茎葉への分化、 葉の黄化や落葉 ·落果等の 防止、頂芽優先の打破等の作用を示すことが知られている重要な生理活性物質である (Cytokinins： Chemi s t ry, Ac t ivi ty, and Func t i on, CRC Press (1994) ) 。 サイト カイニンによって引き起こされる生理現象を制御する方法としては、サイトカイニン を外部から与える方法、植物体内のサイトカイニン生合成を制御する方法、植物体内 のサイトカイニン代謝を制御する方法等が考えられてきた。
植物成長調節剤の有効成分となる化学物質は、従来、供試化学物質を植物に直接作 用させ、その生物学的活性を検定するランダムスクリーニングによって見出されてき た。 この場合、 当該化学物質の安全性や環境への負荷を予測するために、有用な生物 活性を有する化学物質が特定された後に、その化学物質がどのような作用機構で効力 を有するか、その化学物質が作用する標的が何であるかを分子レベルで詳細に研究す る必要があった。 発明の開示
' 本発明は、植物の生長若しくは分化を制御する薬剤、並びに、標的を明確にした有 用な生物活性を有する化学物質の探索手法、即ち、標的部位を化学的に調節するべく 、特定の標的に対する活性を指標として化学物質をスクリーニングする方法等を提供 することを目的とする。より具体的には、植物由来のサイトカイニン受容体からの細 胞内信号伝達を阻害する活性を有し、植物の生長若しくは分化を制御する薬剤、かか る薬剤の有効成分となる化学物質の探索 法等を提供することを目的とする。
即ち、 本発明は、
(1)植物の生長若しくは分化を制御する薬剤であり、細胞が有する植物由来のサイ トカイニン受容体からの細胞内信号伝達を阻害する活性を有することを特徴とする 薬剤；
(2)植物を生長若しくは分化を制御する薬剤が、植物成長調節剤であることを特徴 とする前項 1記載の薬剤；
(3)植物の生長若しくは分化を制御する薬剤が、植物体の生長を制御する薬剤であ ることを特徴とする前項 1記載の薬剤；
(4)植物の生長若しくは分化を制御する薬剤が、植物細胞の分化を制御する薬剤で あることを特徴とする前項 1記載の薬剤； -.
(5)植物体の生長を制御する薬剤が、植物の芽の生長の制御のための薬剤であるこ とを特徴とする前項 3記載の薬剤；
(6)植物の芽の生長の制御が、腋芽抑制等であることを特徴とする前項 5記載の薬 剤；
(7)植物の芽の生長の制御が、花芽抑制等であることを特徴とする前項 5記載の薬 剤； - -
(8)植物体の生長を制御する薬剤が、植物の苗立ちを促進させる薬剤であることを 特徴とする前項 3記載の薬剤；
(9)植物体の生長を制御する薬剤が、植物の分げつを促進させる薬剤であることを 特徴とする請求項 3記載の薬剤；
(10)植物体の生長を制御する薬剤が、植物の根の生長を促進させる薬剤であるこ とを特徴とする前項 3記載の薬剤；
(1 1)細胞が有する植物由来のサイトカイニン受容体が、下記の群 Aから選択され るサイトカイニン受容体であることを特徴とする前項 1〜10いずれか一項記載の 薬剤； '
く群 A>
(a) 配列番号 1で示されるアミノ酸配列からなる蛋白質 ( b )配列番号 1で示されるアミノ酸配列において、 1もしくは複数のアミノ酸が欠 失、付加もしくは置換されたアミノ酸配列からなり、かつサイトカイニン受容体とし て機能する活性を有する蛋白質
( c )配列番号 1で示されるァミノ酸配列と 4 5 %以上の配列同一性を有するァミノ 酸配列からなり、 かつサイトカイニン受容体として機能する活性を有する蛋白質
( d )配列番号 2で示される塩基配列によりコードされるアミノ酸配列からなる蛋白 質
( e )配列番号 2で示される塩基配列を有するポリヌクレオチドに対し相補性を有す るポリヌクレオチドと、ストリンジェントな条件下で八ィブリダイズするポリヌクレ ォチドによりコ ドされるアミノ酸配列からなり、かつサイトカイニン受容体として 機能する活性を有する蛋白質
( 1 2 )細胞が有する植物由来のサイトカイニン受容体からの細胞内信号伝達を阻害 する活性が、下記の群 Aから選択されるサイトカイニン受容体を有する細胞と、前記 サイトカイニン受容体に対してァゴニスト活性を有する物質との接触系において、前 記サイトカイニン受容体からの細胞内信号伝達を阻害する活性であることを特徴と する前項 1〜 1 0いずれか一項記載の薬剤；
く群 A>
( a ) 配列番号 1で示されるアミノ酸配列からなる蛋白質
( b )配列番号 1で示されるアミノ酸配列において、 1もしくは複数のアミノ酸が欠 失、付加もしくは置換されたアミノ酸配列からなり、かつサイトカイニン受容体とし て機能する活性を有する蛋白質
( c )配列番号 1で示されるアミノ酸配列と 4 5 %以上の配列同一性を有するァミノ 酸配列からなり、 かつサイトカイニン受容体として機能する活性を有する蛋白質
( d )配列番号 2で示される塩基配列によりコードされるァミノ酸配列からなる蛋白 質
( e )配列番号 2で示される塩基配列を有するポリヌクレオチドに対し相補性を有す るポリヌクレオチドと、ストリンジェン卜な条件下でハイプリダイズするポリヌクレ ォチドによりコードされるアミノ酸配列からなり、かつサイトカイニン受容体として 機能する活性を有する蛋白質
( 1 3 )有効成分として、細胞が有する植物由来のサイトカイニン受容体からの細胞 内信号伝達を阻害する化学物質又はその農学的に許容される塩を含有することを特 徴とする植物成長調節剤；
( 1 4 )前記化学物質が、下記の群 Aから選択されるサイトカイニン受容体を有する 細胞と、前記サイトカイニン受容体に対してァゴニスト活性を有する物質と、前記化 学物質との接触系内において、前記サイトカイニン受容体からの細胞内信号伝達を阻 害する活性を有する化学物質であることを特徴とする前項 1 3記載の植物成長調節 剤；
く群 A>
( a ) 配列番号 1で示されるアミノ酸配列からなる蛋白質
( b )配列番号 1で示されるアミノ酸配列において、 1もしくは複数のアミノ酸が欠 失、付加もしくは置換されたアミノ酸配列からなり、かつサイトカイニン受容体とし て機能する活性を有する蛋白質
( c )配列^ =号 1で示されるアミノ酸配列と 4 5 %以上の配列同一性を有するァミノ 酸配列からなり、 力、つサイトカイニン受容体として機能する活性を有する蛋白質
( d )配列番号 2で示される塩基配列によりコードされるアミノ酸配列からなる蛋白 質
( e )配列番号 2で示される塩基配列を有するポリヌクレオチドに対し相補性を有す るポリヌクレオチドと、ストリンジェン卜な条件下でハイプリダイズするポリヌクレ ォチドによりコードされるアミノ酸配列からなり、かつサイトカイニン受容体として 機能する活性を有する蛋白質
( 1 5 )サイトカイニン受容体に対してァゴニスト活性を有する物質が、 トランスゼ ァチンであることを特徴とする前項 1 4記載の植物成長調節剤；
( 1 6 )前記化学物質が、下記の群 Aから選択されるサイトカイニン受容体を有する 細胞と、 0 . 6 ppmのトランスゼァチンと、 2 ppmの前記化学物質との接触系内におい て、前記化学物質が存在しない場合よりも前記サイトカイ二ン受容体からの細胞内信 号.伝達を低下させる活性を有する化学物質であることを特徴とする前項 1 3記載の 植物成長調節剤；
く群 A〉
(a) 配列番号 1で示されるアミノ酸配列からなる蛋白質
(b)配列番号 1で示されるアミノ酸配列において、 1もしくは複数のアミノ酸が欠 失、付加もしくは置換されたアミノ酸配列からなり、かつサイトカイニン受容体とし て機能する活性を有する蛋白質
(c)配列番号 1で示されるアミノ酸配列と 45%以上の配列同一性を有するァミノ 酸配列からなり、 かつサイトカイニン受容体として機能する活性を有する蛋白質
(d)配列番号 2で示される塩基配列によりコードされるアミノ酸配列からなる蛋白 質
( e )配列番号 2で示される塩基配列を有するポリヌクレオチドに対し相補性を有す るポリヌクレオチドと、ス卜リンジェントな条件下でハイブリダィズするポリヌクレ ォチドによりコードされるアミノ酸配列からなり、かつサイトカイニン受容体として 機能する活性を有する蛋白質
(17)前記化学物質が、下記の群 Aから選択されるサイトカイニン受容体を有する 細胞と、 0.6ppmのトランスゼァチンと、 2 ppmの前記化学物質との接触系内におい て、前記化学物質が存在しない場合よりも前記サイトカイ二ン受容体からの細胞内信 号伝達を 90 %以上低下させる活性を有する化学物質であることを特徴とする前項 13記載の植物成長調節剤；
く群 A>
( a ) 配列番号 1で示されるァミノ酸配列からなる蛋白質
(b)配列番号 1で示されるアミノ酸配列において、 1もしくは複数のアミノ酸が欠 失、付加もしくは置換されたアミノ酸配列からなり、かつサイトカイニン受容体とし て機能する活性を有する蛋白質
(c)配列番号 1で示されるアミノ酸配列と 45 %以上の配列同一性を有するァミノ 酸配列からなり、 かつサイトカイニン受容体として機能する活性を有する蛋白質 (d)配列番号 2で示される塩基配列によりコードされるアミノ酸配列からなる蛋白 質. ( e )配列番号 2で示される塩基配列を有するポリヌクレオチドに対し相補性を有す るポリヌクレオチドと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレ ォチドによりコードされるアミノ酸配列からなり、かつサイトカイニン受容体として 機能する活性を有する蛋白質
( 1 8 ) 植物の根の生長を促進させる能力を有する化学物質の探索方法であって、 < 1 >下記の群 Aから選択されるサイトカイニン受容体を有する細胞と、前記サイト カイニン受容体に対してァゴニスト活性を有する物質と、被験物質との接触系内にお いて、前記サイ.,トカイニン受容体からの細胞内信号伝達の量を測定する第一工程、及 び
< 2 >第一工程により測定された細胞内信号伝達の量と前記化学物質が存在しない 場合における細胞内信号伝達の量とを比較することにより得られる差異に基づき植 物の根の生長を促進させる能力を有する化学物質を選択する第二工程、
を有することを特徴とする方法； .
く群 A>
( a ) 配列番号 1で示されるアミノ酸配列からなる蛋白質
( b )配列番号 1で示されるアミノ酸配列において、 1もしくは複数のアミノ酸が欠 失、付加もしくは置換されたアミノ酸配列からなり、かつサイトカイニン受容体とし て.機能する活性を有する蛋白質
( c )配列番号 1で示されるアミノ酸配列と 4 5 %以上の配列同一性を有するァミノ 酸配列からなり、 力、つサイトカイニン受容体として機能する活性を有する蛋白質
( d )配列番号 2で示される塩基配列によりコードされるアミノ酸配列からなる蛋白 質
( e )配列番号 2で示される塩基配列を有するポリヌクレオチドに対し相補性を有す るポリヌクレオチドと、ストリンジェン小な条件下でハイプリダイズするポリヌクレ ォチドによりコードされるアミノ酸配列からなり、かつサイトカイニン受容体として 機能する活性を有する蛋白質
( 1 9 )サイトカイニン受容体を有する細胞が、配列番号 1で示されるアミノ酸配列 をコ一ドする塩基配列からなるポリヌクレオチドが導入されてなる形質転換細胞で あることを特徴とする前項 18記載の探索方法；
(20)サイトカイニン受容体を有する細胞が、配列番号 1で示されるアミノ酸配列 をコ一ドする塩基配列からなるポリヌクレオチドが導入されてなる形質転換酵母細 胞であることを特徴とする前項 18記載の探索方法；
(21)サイトカイニン受容体に対してァゴニスト活性を有する物質が、 トランスゼ ァチンであることを特徴とする前項 18、 19又は 20記載の探索方法；
(22)前項 18、 19、 20又は 21記載の探索方法により選抜された化学物質又 はその農学的に許容される塩を有効成分として含有することを特徴とする植物成長 調節剤；
(23) 前項 13、 14、 15、 16、 17又は 22記載の植物成長調節剤の有効量 を、 植物又はその生息場所に施用することを特徴とする植物成長調節方法； (24) 前項 18、 19、 20又は 21記載の探索方法により植物の根の生長を促進 させる能力を有する化学物質を特定し、特定された植物の根の生長を促進させる能力 を有する化学物質と植物とを接触させることを特徴とする植物成長調節方法； (25) 有効成分として、 一般式 （I)
Figure imgf000008_0001
(式中、 R及び Xは同一又は異なって置換されていてもよい炭化水素基、 NR'R2で表さ れる基、 OR3で表される基、 S(0)„R4で表される基、 ニトロ基又はハロゲン原子を示し ここで R1は水素原子又は置換されていてもよい炭化水素基を示し、
R2は水素原子、 置換されていてもよい炭化水素基、 NR5R6で表される基 （ここで R5及 び は同一もしくは異なり水素原子又は置換されていてもよい C1-6アルキル基を示 す） 又は OR7で表される基 （ここで R7は水素原子又は置換されていてもよい C1-6アル キル基を示す） を示し、又は R1及び R2が隣接する窒素原子と一緒になつて置換されて いてもよい環状アミノ基を示し、 '
R3及び R4はそれぞれ置換されていてもよい炭化水素基を示し、
1は 0〜1の整数を示し、 mは 0〜2の整数を示し、
nは 0〜4の整数を示し、
nが 2以上の場合 Xは同一又は異なっていてもよく、
Arは置換されていてもよいァリール基又は置換されていてもよいへテロアリール基 を示す）で表される化合物又はその農学的に許容される塩を含有することを特徴とす る植物成長調節剤；
( 2 6 ) 1が 1であり、 Rが置換されていてもよい炭化水素基である前項 2 5記載の植 物成長調節剤；
( 2 7 ) 1力 1であり、 Rがハロゲン原子又はォキソ基で置換されていてもよい C卜 3 アルキル基である前項 2 5記載の植物成長調節剤；
( 2 8 )置換されていてもよい炭化水素基がハロゲン原子又はォキソ基で置換されて いてもよい C1-3アルキル基である前項 2 6記載の植物成長調節剤；
( 2 9 ) 1が 1であり、 Rが NR' R2で表される基である前項 2 5記載の植物成長調節剤.；
( 3 0 ) R1が水素原子又は C1-3アルキル基を示し、 R2が水素原子、 アミノ基、 C卜 3 アルキルアミノ基、 ジ C1 -3アルキルアミノ基、 アミジノ基、 C1 -3アルコキシ基、 フエ ニル基、 C1-3ァシル基、 C1 -6アルキル基、 C3- 6アルケニル基又は C3- 6アルキニル基を 示し、ここで前記のフエ二ル基は 1〜3個の同じもしくは異なる C1 -3アルキル基で置換 されていてもよく、 前記のフエニル基、 ァシル基、 アルキル基、 アルケニル基及びァ ルキニル基はハロゲン原子、 ヒドロキシル基、 C1-3アルコキシ基、 ヒドロキシ C1-3 アルコキシ基、 カルボキシル基、 C1 -3アルコキシカルポニル基、 力ルバモイル基、 ァ ミノ基、 C卜 3アルキルアミノ基、 ジ Π-3アルキルアミノ基、 メルカプト基、 C卜 3ァシ ルチオ基、 シァノ基、 フリル基及びテトラヒドロフリル基の中から選ばれる 1〜3個の 同じもしくは異なる置換基で置換されていてもよく、又は R1及び R2が隣接する窒素原 子と一緒になつてピロリジノ基、ピペリジノ基又はモルホリノ基を示す前項 2 9記載 の植物成長調節剤；
( 3 1 V R1が水素原子を示し、 R2が水素原子、 ホルミル基、 C1-6アルキル基、 C3-6 アルケニル基又は C3- 6アルキニル基を示し、 ここで前記のアルキル基、 アルケニル基 及 I；アルキニル基はヒドロキシル基、 メトキシ基、 メトキシカルポニル基、 エトキシ カルポニル基、シァノ基及びフリル基の中から選ばれる置換基で置換されていてもよ い前項 2 9記載の植物成長調節剤；
(32) 1が 1であり、 Rが OR3で表される基である前項 2 5記載の植物成長調節剤； (3 3)R3がァミノ基で置換されていてもよい C1-3アルキル基である前項 3 2記載の 植物成長調節剤；
(34) 1が 1であり、 Rが S(0)mR4で表される基である前項 2 5記載の植物成長調節剤
(3 5)R4がァミノ基又はヒドロキシル基で置換されていてもよい C1-3アルキル基で あり、 mが 0である前項 34記載の植物成長調節剤；
(3 6) 1が 1であり、 Rがハロゲン原子である前項 2 5記載の植物成長調節剤； (3 7) ハロゲン原子が塩素原子である前項.3 6記載の植物成長調節剤；
(3 8) nが 1〜2であり、 Xが Π- 3アルキル基、 C1- 3アルコキシ基、 C卜 3ハロアルキル 基、 シァノ基、ハロゲン原子又はニトロ基である前項 2 5〜3 7いずれか一項記載の 植物成長調節剤；
(3 9) Xが塩素原子、 臭素原子又は二ト口基であり、 Xの置換位置が 6位及び/又は 8 位である前項 38記載の植物成長調節剤；
(40)Arがハロゲン原子又は C 1-3アルキル基で置換されていてもよいフエニル基で ある前項 23〜37いずれか一項記載の植物成長調節剤；
(4 1)前項 2 5〜40いずれか一項記載の植物成長調節剤の有効量を、植物又はそ の生息場所に施用することを特徴とする植物成長調節方法；
(42) 式 （XI)
Figure imgf000010_0001
(式中、 Phはフエ二ル基を示し、 R11は水素原子、 ホルミル基、 - 6アルキル基、 C3-6 アルケニル基又は C3-6アルキニル基を示し、 ここで前記のアルキル基、 アルケニル基 及びアルキニル基はヒドロキシル基、 C1-3アルコキシ基、 C1- 3アルコキシカルボニル 基、 シァノ基、 2-フリル基及び 2-テトラヒドロフリル基の中から少なくとも 1つ以上 選ばれる置換基で置換されていてもよく、 mは 0〜3の整数を示し、
nは 0〜1の整数を示し、
m及び nの少なくとも一方は 0ではなく、
X,及び X2はそれぞれ同一又は異なり、 塩素原子、 臭素原子、 トリフルォロメチル基、 シァノ基又はニトロ基を示し、
mが 2以上の場合 X,は同一又は異なる。
ただし、
a) mが 1であり、 が 5-塩素原子又は 7-塩素原子であり、 R11がメチル基を示す場合、 nは 1の整数を示し、 又は
1)) 11カ 1でぁり、下記（1)〜（3)のいずれかの条件を満たす場合、 mは 1〜3の整数を 示す。 -
(1) X2が塩素原子であり、 R11が水素原子、 メチル基、 2-ヒドロキシェチル基、 3-ヒド ロキシプロピル基、 2， 2-ジメトキシェチル基及びシァノメチル基の中から選ばれる基 である。
(2) X2が臭素原子であり、 R11が 2-ヒドロキシェチル基、 3-ヒドロキシプロピル基及び 2-メトキシェチル基の中から選ばれる基である。
(3) X2がニトロ基であり、 R11が 3-ヒドロキシプロピル基である。 ）
で表される化合物又はその農学的に許容される塩（以下、本発明化合物と記すことも ある。 ） ；
( 4 3 ) R11が水素原子、 ホルミル基、 メチル基、 ェチル基、 2-ヒドロキシェチル基 、 2-メトキシェチル基、 フルフリル基、 メトキシカルポニルメチル基又はエトキシカ ルポ二ルメチル基を示し、 mが 0であり、 nが 1であり、 X2が塩素原子又はニトロ基 を示す前項 4 2記載の化合物又はその農学的に許容される塩；
( 4 4 ) R11が水素原子、 ホルミル基、 メチル基、 ェチル基、 2-ヒドロキシェチル基 、 3-ヒドロキシプロピル基、 2-メトキシェチル基、 フルフリル基、 メトキシカルボ二 ルメチル基又はエトキシカルボ二ルメチル基を示し、 mが 1であり、 nが 1であり、 X,が 8-塩素原子であり、 X2が塩素原子又は二ト口基を示す前項 4 2記載の化合物又は その農学的に許容される塩； ( 4 5 ) mが 1〜3の整数であり、 nが 0である請求項 4 2記載の化合物又はその農 学的に許容される塩；
( 4 6 ) R11がホルミル基、 C4- 6アルキル基、 C3 - 6アルケニル基又は C3-6アルキニル 基を示し、 ここで前記のアルキル基、アルケニル基及びアルキニル基はヒドロキシル 基又は C1-3アルコキシ基で置換されていてもよく、 また R11が C1- 3アルコキシカルボ ニルメチル基、 C1-3アルコキシ C1-3アルキル基又はフルフリル基を示し、
mが 0であり、
nが 1であり、，
X2が塩素原子である前項 4 2記載の化合物又はその農学的に許容される塩；
( 4 7 ) nが 1である前項 4 2記載の化合物又はその農学的に許容される塩；
( 4 8 ) mが 1〜3であり、 nが 1である前項 4 2記載の化合物又はその農学的に許 容される塩；
( 4 9 ) R11が C1-3アルコキシカルボニルメチル基又はフルフリル基である前項 4 2 、 4 5、 4 7又は 4 8に記載の化合物又はその農学的に許容される塩；および ( 5 0 ) nが 1であり、 X2がトリフルォロメチル基又はシァノ基である前項 4 2記載の 化合物又はその農学的に許容される塩；
等を提供するものである。 図面の簡単な説明
図 1は、実施例 8において、細胞が有する植物由来のサイトカイニン受容体からの 細胞内信号伝達を阻害する化学物質の濃度応答性を検定した結果を示した図である。 図中のデータラインは、 X軸を供試された化学物質の濃度とし、且つ、 Y軸を相対生育 度とした濃度応答性生育阻害曲線を表している。 尚、 図中の左図（左縦 1列の 3つの サブ図）は形質転換細胞 TM182-CRE1を用いた試験系での結果を示すものであり、右図 (右縦 1列の 3つのサブ図） は形質転換細胞 TM182- P415CYC1.を用いた試験系での結 果を示すものである。また、図中の上段図、中段図及び下段図は、上から化学物質 Ic7-1 、 化学物質 Ic3- 1及び化学物質 IC3-3を用いた試験系での結果を示すものである。 図 2は、実施例 1 0において、 レタスを用いたサイトカイニン情報伝達阻害物質の 根部生長促進活性を評価した結果を示した図である。 図中のデータラインは、 X軸を 供試された化学物質 （化学物質 Ic3- 1) の濃度とし、 且つ、 Y軸を根部生長度 ）とし た濃度応答性生長促進曲線を表している。
図 3は、実施例 1 0において、 レタスを用いたサイトカイニン情報伝達阻害物質の 根部生長促進活性を評価した結果を示した図である。 図中のデータラインは、 X軸を 供試された化学物質 （化学物質 Ic7-1) の濃度とし、 且つ、 Y軸を根部生長度 とし た濃度応答性生長促進曲線を表している。
図 4は、実施例 1 1において、イネを用いたサイトカイニン情報伝達阻害物質の根 部生長促進活性を評価した結果を示した図である。 図中のデータラインは、 X軸を供 試された化学物質 （化学物質 Ic3-1) の濃度とし、 つ、 Y軸を根部生長度 (%)とした 濃度応答性生長促進曲線を表している。 - 図 5は、実施例 1 1において、イネを用いたサイトカイニン情報伝達阻害物質の根 部生長促進活性を評価した結果を示した図である。 図中のデータラインは、 X軸を供 試された化学物質 （化学物質 Ic7-1) の濃度とし、 且つ、 Y軸を根部生長度 (%)とした 濃度応答性生長促進曲線を表している。
図 6は、実施例 1 2において、イネ種子処理によるサイトカイニン情報伝達阻害物 質の根部生長促進活性を評価した結果を示した図である。 図中の 「UTC」 とは、 種子 処理においてアセトンのみを用いた対照区での結果を示すものであり、 また 「IAA」 とはオーキシン化合物 IAAを用いた試験系での結果を示すものである。
図 7は、実施例 1 3において、植物分化促進活性を評価するために、 シロイヌナズ ナの胚軸を用いたサイトカイニン情報伝達阻害物質の不定根形成活性を測定した結 果を示した図である。 図中の 「対照区」 とは、 実施例 1 3に記載された対照区の寒天 培地での結果を示すものである。
図 8は、実施例 1 4において、イネを用いたサイトカイニン情報伝達阻害物質の根 部生長促進活性を測定した結果を示した図である。 図中の 「UTC」 とは、 土壌灌注処 理においてアセトンのみを用いた対照区での結果を示すものである。
図 9は、実施例 1 4において、イネを用いたサイトカイニン情報伝達阻害物質の根 部生長促進活性について根長測定画像解析装置を用いて解析した結果を示した図で ある。 図中のデータラインは、 X軸を供試された化学物質 （化学物質 Ic3- 3) の濃度と し、 且つ、 Y軸は根径毎の根長の累計 （総根長） を表している。 図中の 「UTC」 とは、 土壌灌注処理においてアセトンのみを用いた対照区での結果を示すものである。凡例 の数値 （L) は、 根径 （匪） を示す。
図 1 0は、実施例 1 9において、サイトカイニンがサイトカイニン受容体に結合す ることを被験物質が阻害することを検証した試験結果である。 図中の「DMS0のみ」 と は、 被験物質を入れていない対照区であって、 被験物質の溶媒として使用した DMS0 のみを被験物質の DMS0溶液の替わりに添加したものである。 「t-Zeat in」 とは被験物 質としてトランスゼァチンを添加したもの、 「Ic3-4」 とは被験物質として Ic3-4を添 加したもの、 「ABA」 とは被験物質としてアブシジン酸を添加したものである。 放射 性標識 2IPの濃度は 1 0 nM、 各被験物質の濃度は 10 /zMである。
図 1 1は、実施例 2 1において、乾田直播試験における種子処理したサイトカイ二 ン情報伝達阻害物質のイネ分げつ促進活性の評価結果を示した図である。 図中、 「 Ic3-3j とは種子処理に被験物質 Ic3-3の Bl ank s lurry溶液を用いた場合の、 また 「 Blank s lurry処理」 とは Ic3-3溶液の代わりに種子処理に Bl ank s lurryを用いた場合 の株あたりの分げつ数を示した図である。 発明を実施するための形態 '
本発明において 「植物」 とは、 草や木等、 根が生えて固定的な生活をしているよう な生物を示すような広義な意味で使用されており、植物体、植物組織、植物細胞等を 含むような概念である。詳細には、土壌における植物の固定、外部からの水分及び養 分吸収等の重要な役割を根という器官を介して行うことができる高等植物等の生物 を示し、 花卉 ·観葉植物等の鑑賞用植物、 穀類 ·野菜 ·果樹等の作物、 繊維植物、 樹 木、 芝等の植物があげられる。 具体的には例えば、 イネ、 トウモロコシ等の穀物類、 ベントグラス、 コゥライシバ等の芝類、 トマト、 ピーマン、 トウガラシ、 スイカ等の ゥリ類、 キユウリ、 カポチヤ、 メロン、 スイカ等のゥリ類、 キャベツ、 ブロッコリ一 、 ハクサイ等の菜類、 セロリ、 パセリ、 レタス等の生菜、 香辛菜類、 ネギ、 夕マネギ 、 ニンニク等のネギ類、 ダイズ、 インゲン、 エンドゥ、 ァズキ等の豆類、 イチゴ等の 果菜類、 ダイコン、 カブ、 ニンジン、 ゴボウ等の直根類、 サトイモ、 バレイショ、 サ ツマィモ、 ナガィモ等のィモ類、 アスパラガス、 ホウレンソゥ、 ミツバ等の柔菜類、 トルコギキヨウ、 ストック、 カーネーション、 キク等の花弁類、 ナタネ、 ラッカセィ 等の油料作物類、 サトウキビ、 テンサイ等の糖料作物類、 ヮ夕、 ィグサ等の繊維料作 物類、 クロ一バ一、 ソルガム等の飼料作物類、 リンゴ、 ナシ、 ブドウ、 モモ、 クリ等 の落葉性果樹類、 ミカン、 レモン、 グレープフルーツ等の柑橘類、 サツキ、 ッッジ、 スギ等の木本類等を挙げることができる。
本発明において植物の 「生長」 とは、 種子の発芽に始まる植物の初期発生から、 根 、 茎、 葉の成長と発達、 花の形成から種子の成熟に至るまでの過程において、 すでに ある栄養器官 （根、 茎、 葉） を新たに作っては積み上げていくような一般的な過程を いうが、 例えば、 発芽、 根の伸長、 芽の伸長、 茎の伸長、 頂芽 *腋芽の形成と伸長、 枝 ·葉の展開、 花芽の形成と開花、 結実、 種子の成熟等が挙げられる。
本発明において植物の 「分化」 とは、 分化全能性を獲得した植物細胞集団である力 ルスから、 根、 茎、 葉等の植物組織が形成されること （再分化） 、 又は、 根、 茎、 葉 等の植物組織の細胞からカルスが形成されること （脱分化） をいう。
本発明において植物の 「芽の生長の制御」 とは、 頂芽若しくは腋芽の生長を促進又 は抑制することをいうが、例えば、頂芽優勢により生長が抑制されている腋芽の生長 を開始させたり、頂芽を切除することにより生長を開始する腋芽の生長を抑制させた り、 通常の頂芽の生長を抑制させたりすることが挙げられる。
本発明において 「植物の生長若しくは分化を制御する薬剤」 とは、 植物に種々の方 法により処理することによって植物の生長若しくは分化を制御することができる薬 剤である。植物の生長若しくは分化を制御することにより、農作物等有用植物の成長 や発育をコントロールして、 初期生育を高めたり、 品質を高めたり、 収量を上げたり 、 不良条件でも収量を安定させたり、 生産上の労力を省くことが可能となり、 「植物 の生長若しくは分化を制御する薬剤」 は、 「植物成長調節剤」 として利用することが できる。 本発明において植物の 「根」 とは、 双子葉植物及び裸子植物の場合には、 種子の胚 にある幼根から発達した主根、 主根から枝分かれして伸びる側根等をいう。 また、 単 子葉植物の場合には、 種子の胚にある幼根 (種子根） 、 種子根の成長停止後、 上方部 に生ずる不定根（所謂ひげ根） 、 不定根から枝分かれして伸びる側根等をいう。 また 、 根の表皮細胞が、外側に向かって長く伸びた根毛等をいうこともある。植物の根は 、 土壌における植物の固定、外部からの水分及び養分吸収等、植物にとって重要な役 割を担う器官である。 また、植物の根は、植物ホルモンの生成場所としても非常に重 要である。 農業上においては、 多くの作物は種子によって増殖する。従って、 植物の 生長の初期に均一に苗立ちが得られることは、高品質、高収量につながる非常に重要 な要素である。植物の根の生長を促進させることにより、土壌への活着率の向上、 苗 立ちの改善等による生産性又は品質の向上、苗立ちの向上による早期の雑草防除コン トロール、 種子の供給源の効率化等、 種々の利点が期待される。 また、 根張りが向上 することにより、乾燥ストレス耐性の向上又は病害虫耐性の向上等、 また養分吸収能 力の向上による肥料量の削減等が期待される。 本発明において植物の 「根の生長」 とは、 根の細胞の分裂、 伸長、 重量増加により 、 根の長さ、 根数が増加又は、 根量、 太さ、 活性等が増加すること等をいう。 本発明において植物の「根の生長を促進させる」 とは、植物の根の生長を従来より も活発にし、 無処理の場合と比較して、 根の長さ、 根数が増加又は、 根量、 太さ、 活 性等が増加すること等をいう。 本発明において「植物の根の生長を促進させる薬剤」 とは、植物に種々の方法によ り処理することによって植物の根の生長を促進させることができる薬剤である。植物 の根の生長が促進することにより、農作物等有用植物の成長や発育をコントロールし て、 初期生育を高めたり、 品質を高めたり、 収量を上げたり、 不良条件でも収量を安 定させたり、 生産上の労力を省くことが可能となり、 「植物の根の生長を促進させる 薬剤」 は、 「植物成長調節剤」 として利用することができる。 ここで、 「苗立ち」 とは、播種された種子が出芽した後植物体として正常な生育が 可能な状態で土壌に定着することまたは移植された植物の苗が土壌に定着し正常に 生育することをいう。 苗立ちが促進されることにより、 植物の初期生育が改善され、 健全な植物を育成することができる。また、健全に生育する植物数が増加することに より、 最終的な収量の増加が期待される。 例えば、 イネ直播栽培においては、 出芽 · 苗立ちが不安定で、常に一定の苗立ち数を確保することは一般に困難である。本発明 の苗立ちを促進させる薬剤は、苗立ちを促進しイネ直播栽培の効率を改善することが できる。 「苗立ち率」 とは、播種された種子の総数または移植された植物の苗の総数 に対する苗立ちした植物の割合をいい、例えば、 イネの場合、本願明細書において次 式にて定義されうる。
式； [苗立ち率（％) ] = [葉の先端が水面に出現している苗数] Z [播種数] X 1 0 0 植物の「分げつ」 とは、植物生長にともない枝分かれすることまたはその枝をいい 、例えばイネ科植物の場合側枝をいう。分げつの促進とは、 分げつ時期が早まること および分げつ数が増加することを含む。例えば、 低温 ·高温 ·乾燥などのストレス条 件下で、本発明の植物成長調節剤を用いて分げつ時期を早めて、健全苗を早期に確保 できれば、 ストレスからの苗のダメージを回避することができる。 また、 例えば、 分 げっ時期が早まることにより、植物の栽培期間の短縮につながる。 また、植物の分げ つ形成は、 穂数にも直接影響するため、 栽培条件によっては増収が期待できる。 オーキシン活性物質は、植物の種類 ·オーキシン処理濃度等によっては葉の上偏成 長、茎の捻転や茎割れ、根こぶの誘導等といった好ましくない性質を示すことがある サイトカイニン活性物質は植物の根の生長抑制と生長促進との両面の性質を有す ると考えられている 〔例えば、 PNAS 101 (23) : 8821-8826 (2004) ] が、 このような性 質を農業上実用的に利用するには、未だ多くの知見の蓄積を待たねばならない状況に ある。 しかしながら、 植物におけるサイトカイニンの役割を詳細に検討することは、 植物体内のサイトカイニン量を調節すること（特に、植物の内性のサイトカイニン量 を低減させること） は通常困難であるために、 いくら当該技術分野に精通する研究者 と雖も容易なものではない。
植物の内性のサイトカイニンは、サイトカイニン情報伝達を阻害してサイトカイ二 ンに対する感受性を弱めることにより、 負の制御が可能と考えられる。 例えば、 サイ トカイニン受容体そのものを変異させることによりサイトカイニン情報伝達を阻害 させることができ、サイトカイ二ン受容体の変異体が単離されている〔The P 1 an t Ce 1 1 16 : 1365-1377 (2004) , PNAS 101 (23) : 8821-8826 (2004) ] 。 しかしながら、 これら の変異体では阻害の程度を段階的に制御することは困難であり、サイトカイニン受容 体の 1重変異体は野生型と同様の表現型を示す一方で、 3重変異体は根の伸長阻害と 植物体の生長不良とを示す。 本発明において「細胞が有する植物由来のサイトカイニン受容体」 とは、 植物に存 在するサイトカイニン受容体を示す。 サイトカイニン受容体は、 例えば、 力イネチン 、 ゼァチン等のプリン系サイトカイニン、 N—フエニル— N ' - ( 4—ピリジル） ゥ レア等のウレァ系サイトカイニン等のサイトカイニンに特異的に結合し、
Two-Componen t regu l atory sys t em (又は Hi s to Asp phosphore l ay sys t em)と呼ば れる細胞内信号伝達メカニズムによって高等植物細胞の増殖、分化を制御する機能を 有するタンパク質である。本発明で用いられるサイトカイニン受容体とは、 ヒスチジ ンキナーゼファミリ一に属しており、 細胞外領域、 膜貫通領域、 ヒスチジンキナーゼ 領域 （細胞内でヒスチジンキナーゼ活性を有しかつ活性部位となる Hi s残基を保持す る領域) 及びレシ一バー領域 （リン酸基転移の受容部を有しかつ活性部位となる Asp 残基を保持する領域） から構成されているタンパク質である。
Two-Componen t regu l at ory sys t emは、 真性細菌、 古細菌、 カビ、 植物で広く用い られている情報受容 ·細胞内信号伝達メカニズムである。 このメカニズムにおいて受 容体として働くヒスチジンキナーゼには N-末端側にシグナルを受容するインプット 領域、その C-末端側にリン酸基転移に関わるトランスミッ夕一領域と呼ばれる領域が ある。インプット領域がシグナルを感知するとトランスミッタ一領域（前述のサイト カイニン受容体のヒスチジンキナーゼ領域） の His残基が自己リン酸化される。 この リン酸基は、保存された特定の His残基と Asp残基を交互にリン酸化しながら転移して 、 最終的にはレスポンスレギュレーターと呼ばれるタンパク質のレシ一バー領域の Asp残基をリン酸化する。 リン酸基は、 ヒスチジンキナーゼからレスポンスレギ レ —夕一へ直接受け渡される場合と、何段階かの Uン酸基転移を経てレスポンスレギュ レ一夕一に受け渡される場合がある。前者のような単純な Two-Co即 onent regulatory systemは原核生物に多く存在する。一方、多段階のリン酸基転移は真核生物に多く見 られ、そのような真核生物のヒスチジンキナーゼにはレシ一バー領域が付随している 場合が多い。 また、 リン酸基の転移にはリン酸基転移メデイエ一夕一も関与する。 レ スポンスレギユレ一夕一のリン酸化は、付随するァゥ卜プット領域の活性を制御する 。 アウトプット領域は転写制御因子であることが多い。
植物のサイトカイニン受容体においては、同一分子内にレシーバ一領域が付随して いる。 即ち、 サイトカイニンと結合したサイトカイニン受容体では、 分子内の His残 基の自己リン酸化に続いて、この His残基から分子内 Asp残基へのリン酸基の転移が起 こることが知られている。さらに、このリン酸基はリン酸基転移メデイエ一タ^■の His 残基を経て、 レスポンスレギュレーターの Asp残基へ転移することが明らかになって いる。 例えば、 シロイヌナズナにおいては、 リン酸基はサイトカイニン受容体 CRE1 、 AHK2, AHK3からリン酸基転移メデイエ一ター AHPを経て、 レスポンスレギユレ一夕 一に転移することが明らかになつている。 サイトカイニン受容体をコードする遺伝子としては、 これまでに、 シロイヌナズナ (Arabidopsis thaliana> CRE1： access ion No.AB049934, AHK2: access ion No. AB046869 、 AHK3: access ion No. AB046870)、ッソレニチニチソゥ (Catharanthus roseus、 accession No.AY092025) 、 イネ （Oryza sat iva、 accession o.AY572461) 、 トウモロコシ （Zea mays、 ZmHKl accession No. AB042270, ZmHK2: access ion No. AB102956、
ZmHK3a: access ion No. AB102957、 ZmHK3b:accession No. AB121445) 等由来の遺伝子 の塩基配列が知られている。 このような塩基配列既知の遺伝子は、 目的の遺伝子を持 つ.生物のゲノム DNA又は cDNAを铸型にして、 その遺伝子にコードされるタンパク質の ァミノ末端付近に相当する塩基配列及びカルポキシ末端付近に相当する塩基配列を もとに作製したプライマーを用いて PCRを行うことにより増幅し、 これを単離するこ とができる。 また、 上記以外の植物から、 サイトカイニン受容体をコードする遺伝子 を取得することもできる。 まず、 目的とする植物から mRNAを調製し、 mRNAを鍀型と して逆転写酵素を用いて cDNAを合成し、 これを ΖΑΡΠ等のファージベクタ一又は pUC 等のプラスミドベクタ一に組み込んで cDNAライブラリーを製作する。この cDNAライブ ラリーを铸型にして、上記のような塩基配列既知の遺伝子間で良好に保存された塩基 配列に基づき設計し合成されたプライマーを用いて PCRを行うことによって、 サイト カイニン受容体をコードする遺伝子の少なくとも一部を含む DNA断片を増幅すること ができる。 この DNA断片をプローブにして cDNAライブラリ一をスクリーニングし、 陽 性クローンを選抜する。 選抜したクローンの有する DNAの塩基配列を決定することに よって、目的とするサイトカイニン受容体をコードする遺伝子であることを確認する ことができる。
シロイヌナズナの 3種類のサイトカイニン受容体 （CRE1、 AHK2、 AHK3) はいずれも 同一分子内にレシーバー領域が付随しているヒスチジンキナーゼである。これら 3者 間のアミノ酸配列の相同性は高く、 とりわけ、サイトカイニンと結合すると考えられ る細胞外領域のアミノ酸配列の相同性は高い。後述の組換え酵母においても、 これら 3種類のサイトカイニン受容体はいずれもサイトカイニンに応答した細胞内信号伝 達を起こし、サイトカイニン受容体の活性を確認することができた。他の植物のサイ トカイニン受容体もヒスチジンキナーゼであり、それらのアミノ酸配列はシロイヌナ ズナのサイトカイニン受容体のアミノ酸配列と相同性が高い。
シロイヌナズナのサイトカイ二ン受容体 CRE1のァミノ酸配列に対するその他のサ ィトカイニン受容体のアミノ酸配列との同一性は表 1に示される。
好ましい 「細胞が有する植物由来のサイトカイニン受容体」 として、 例えば、 シロ ィヌナズナのサイトカイニン受容体 CRE1のアミノ酸配列と 4 5 %以上、好ましくは 4 9 %以上、さらに好ましくは 5 3 %以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり 、且つ、サイトカイニン受容体として機能する活性を有する蛋白質を挙げることがで さる。 表 1
Figure imgf000021_0001
「細胞が有する植物由来のサイトカイニン受容体からの細胞内信号伝達」 とは、 前 述のとおり、サイトカイニンが結合したサイトカイニン受容体の自己リン酸化に始ま るリン酸基の転移によって行われる情報伝達である。 即ち、 植物の細胞においては、 サイトカイニンが結合して自己リン酸化されたサイトカイニン受容体からリン酸基 転移メデイエ一夕一に、さらにそこからレスポンスレギユレ一夕一にリン酸基が転移 することでサイトカイニン応答の信号が伝達される。同様に、植物由来のサイトカイ ニン受容体を有する組換え細胞においても、サイトカイニン受容体からの細胞内信号 伝達はリン酸基の転移によつて行われるが、リン酸基転移メデイエ一夕一とレスボン スレギユレ一夕一は宿主細胞由来のものである場合がある。全てが宿主由来のもので ある場合も、 いくつかだけが宿主由来の場合もある。 また、 リン酸基転移メディエー ターは存在しない場合もある。例えば、サイトカイニン受容体を有する組換え出芽酵 母においては、植物由来のサイトカイニン受容体からの細胞内信号伝達は、サイトカ ィニンが結合して自己リン酸化されたサイトカイ二ン受容体から、宿主出芽酵母細胞 由来のリン酸基転移メディエーターである Ypdlを経て、宿主出芽酵母細胞由来のレス ポンスレギュレ一ターである Ssklにリン酸基が転移することによって行われる。また 、サイトカイニン受容体を有する組換え分裂酵母においては、植物由来のサイトカイ ニン受容体からの細胞内信号伝達は、宿主分裂酵母由来のリン酸基転移メデイエ一夕 一 Spylを経て宿主分裂酵母由来のレスポンスレギュレーター Mcs4にリン酸基の転移 によって伝達される。その他、サイトカイニン受容体を有する組換え大腸菌において は、植物由来のサイトカイニン受容体からの細胞内信号伝達は、宿主大腸菌由来のリ ン酸基転移メディエー夕一 YojNを経て宿主大腸菌由来のレスポンスレギュレー夕一 RcsBにリン酸基の転移によって伝達される。
こう.した植物由来のサイトカイニン受容体からの細胞内信号伝達の有無や量を測 定する方法の一つに、植物由来のサイトカイニン受容体からの細胞内信号伝達の下流 に位置するレスポンスレギユレ一夕一によって転写を制御されているターゲット遺 伝子の発現の有無や量を測定する方法がある。 この方法には、 夕一ゲッ卜遺伝子の発 現の有無や量を直接測定する他に、ターゲット遺伝子のプロモーター領域に蛍光夕ン パク質の遺伝子やべ一夕ガラクトシダ一ゼの遺伝子等のレポ一夕一遺伝子を結合し て作製したレポ一夕一プラスミドで宿主細胞の形質転換を行ってレポ一夕一遺伝子 の発現の有無や量を蛍光や発色を指標にして測定する方法や、ターゲット遺伝子の発 現に関連した細胞数の増減や細胞の形質の変化等を測定したり観察したりする方法 がある。例えば、前述の組換え出芽酵母ではサイトカイニン依存的な組換え出芽酵母 の生育を指標に、また組換え分裂酵母ではサイトカイニン依存的な組換え分裂酵母の 大きさを指標に、 さらに組換え大腸菌では夕ーゲット遺伝子 cpsのプロモー夕一領域 に結合したベー夕ガラクトシダ一ゼ遺伝子の発現に起因する発色を指標にして、植物 由来のサイトカイニン受容体からの細胞内信号伝達の有無や量を測定することがで きる。 その他、 タイプ Aのレスポンスレギユレ一ターである ARR5や ARR6のプロモー夕 —領域にレポ一夕一遺伝子を結合したレポ一夕一プラスミドで形質転換したシロイ ヌナズナにおいて、サイトカイニン依存的な蛍光や発色を指標にサイトカイニン受容 体からの細胞内信号伝達の有無や量を測定することもできる。以上のような測定方法 は、 例えば、 Higuchi et al, Nature 409， 1060-1063 (2001)； Suzuki et al , Plant Cel l Phys iol . 2, 107-113 (2001)； Hwang and Sheen, Nature 413, 383-389 (2001) 等に記載されている。 以上のような細胞が有する植物由来のサイトカイニン受容体からの細胞内信号伝 達の様々な測定方法の中で、機械的且つ定量的に効率良く測定する方法としては、組 換え出芽酵母のサイトカイニン依存的な生育を液体培地の濁度を分光光度計で測定 する方法が望ましい。 具体的には、 日本特許公開特許公報 （特開 2 0 0 3— 0 7 9 3 9 3 ) 等に記載されている方法が挙げられる。
「細胞が有する植物由来のサイトカイニン受容体からの細胞内信号伝達を阻害する 活性」 とは、細胞が有する植物由来のサイトカイニン受容体からの細胞内信号伝達を 減少させる能力をいう。即ち、サイトカイニン受容体の自己リン酸化に始まりサイ卜 カイニン受容体からレスポンスレギユレ一夕一へと転移されるリン酸基の量を減少 させる能力を意味する。具体的には、サイトカイニン受容体のヒスチジンキナーゼ活 性を阻害する能力、サイトカイニン受容体からリン酸基転移メデイエ一ターへのリン 酸基転移を阻害する能力、リン酸基転移メデイエ一夕一からレスポンスレギユレ一夕 —へのリン酸基転移を阻害する能力、レスポンスレギユレ一夕一の転写制御を阻害す る能力等が挙げられる。 さらに具体的には、サイトカイニン受容体のヒスチジンキナ ーゼ活性を阻害する能力として、サイトカイニンァゴニスト活性を有する物質とサイ トカイニン受容 との結合の阻害有無に依存して、サイトカイニン受容体からの細胞 内信号伝達の阻害有無が決定されるような機構により、前記サイトカイ二ン受容体か らの細胞内信号伝達を阻害し、その結果、前記サイトカイニン受容体のヒスチジンキ ナ一ゼ活性を阻害する能力が挙げられる。 この場合、実際にサイトカイニンァゴニス ト活性を有する物質とサイトカイニン受容体との結合を被験物質が阻害することを 調べる方法の一つに、放射性標識したサイトカイニンァゴニスト活性を有する物質と サイトカイニン受容体とを用いる方法がある。例えば、水素の放射性同位体であるト リチウムで標識して高い放射活性を持たせたサイトカイニンァゴニスト活性を有す る物質とサイトカイニン受容体の遺伝子を導入した組換え酵母から調製したサイト カイニン受容体タンパク質とを適当な緩衝液中に共存させた後、サイトカイニン受容 体タンパク質をガラスフィルター上に回収して放射能を測定することで、サイトカイ ニン受容体に結合した前記トリチウムで標識して高い放射活性を持たせたサイトカ ィニンァゴニスト活性を有する物質を検出することができ、緩衝液中に被験物質も共 存させた場合に放射能の測定値が減少することを指標にして、サイトカイニンァゴニ ス卜活性を有する物質とサイトカイニン受容体との結合を被験物質が阻害すること を調べることができる。そして、前記の植物由来のサイトカイニン受容体からの細胞 内信号伝達の有無や量を測定する反応系に被験物質を添加して、被験物質が植物由来 のサイ卜カイニン受容体からの細胞内信号伝達に与える影響を調べることができる。
「細胞が有する植物由来のサイトカイニン受容体からの細胞内信号伝達を阻害する 活性を有することを特徴とする薬剤」 とは、細胞が有する植物由来のサイトカイニン 受容体からの細胞内信号伝達を阻害する活性を有する物質を有効成分とする薬剤で ある。 - 本発明において「植物の生長若しくは分化を制御する薬剤であり、細胞が有する植 物由来のサイトカイニン受容体からの細胞内信号伝達を阻害する活性を有すること を特徴とする」 とは、前記の測定方法で細胞が有する植物由来のサイトカイニン受容 体からの細胞内信号伝達を阻害する能力を特定された薬剤であり、植物の生長若しく は分化を制御する-ことができる薬剤を意味する。 当該薬剤として、 望ましくは、 植物 の生長若しくは分化を制御する薬剤が、 植物成長調節剤である薬剤が挙げられる。 本発明において 「植物成長調節剤」 とは、 前記植物の生長若しくは分化を制御する 能力を有する薬剤をいう。
植物の生長若しくは分化を制御する能力を測定する方法の一つとして、本発明で開 示される方法の他に、例えば、前記の植物に対する根部生長促進活性を測定する方法 が挙げられる。 具体的には、 例えば、 以下の方法に従い、 測定することができる。 下記の組成（表 2参照） からなる園試標準培地を調製する。化学物質の DMS0溶液を ずつ、 終濃度 O. OOlppn！〜 lOppmになるようにクラス夕一チューブに分注し、 さら に滅菌した園試標準培地を 600 / 1ずつクラスターチューブに加えて混合する。チュー ブ当り 10〜20粒のシロイヌナズナ種子を播種し、 ΙΤ< 、 明所にて 10日間培養した後、 平均的な主根の長さを測定する。 8反復の平均値を求め、次の式により根部生長率を 求める。 表 2
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根部生長率 （％) = (化学物質処理区の平均主根長） Z (対照区の平均主根長） X 100 有意に高い根部生長率を示す供試薬剤については、根部生長促進活性があると言える 。 また、 より好ましくは、 根部生長率が 120%以上の供試薬剤は根部生長促進活性があ ると判断できる。 本発明における植物成長調節剤は、有効成分として、細胞が有する植物由来のサイ トカイニン受容体からの細胞内信号伝達を阻害す,る化学物質又はその農学的に許容 される塩を含む。
本発明において 「農学的に許容される塩」 とは、 植物成長調節剤としての製造、 及 び当該製造物の施用に関して、その製造及び施用が不可能とならない形態の塩を指し 、 どのような形態の塩でもあってもよい。 かかる塩としては、 具体的には、 塩酸塩、 臭化水素酸塩、 ヨウ化水素酸塩、 硫酸塩、 硝酸塩、 リン酸塩等の鉱酸塩、 ギ酸塩、 酢 酸塩、 プロピオン酸塩、 シユウ酸塩、 マロン酸塩、 コハク酸塩、 フマル酸塩、 マレイ ン酸塩、 乳酸塩、 リンゴ酸塩、 酒石酸塩、 クェン酸塩、 メタンスルホン酸塩、 ェ夕ン スルホン酸塩等の有機酸塩、 ァスパラギン酸塩、 グルタミン酸塩等の酸性アミノ酸塩 などの酸付加塩、 アルカリ金属塩（ナトリウム塩、 カリウム塩など） 及びアルカリ土 類金属塩 （マグネシウム塩など） 、 アルミニウム塩等の金属塩、 並びに、 メチルアミ ン、 ェチルァミン、 エタノールァミン等の有機塩基及びリジン、 オル二チン等の塩基
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性アミノ酸との付加塩やアンモニゥム塩等 5が挙げられる。 当該植物成長調節剤は、 通常、 固体担体、 液体担体等と混合し、 必要により界面活 性剤、 その他の製剤用補助剤等を添加して、 乳剤、 水和剤、 懸濁剤、 水溶剤等に製剤 化して用いられる。 これらの製剤中にサイトカイニン情報伝達阻害物質が一般に 0 . 5〜9 0重量％、 好ましくは 1〜8 0重量％含有される。
製剤化するに際し用いられる固体担体としては、 例えば粘土類（カオリナイト、 珪 藻土、 合成含水酸化珪素、 フバサミクレー、 ベントナイト、 酸性白土等） 、 タルク、 その他の無機鉱物 （セリサイド、 石英粉末、 硫黄粉末、 活性炭、 炭酸カルシヴム等) 、 化学肥料 （硫安、 燐安、 硝安、 塩安、 尿素等） 等の微粉末や粒状物が挙げられ、 液 体担体としては、 例えば水、 アルコール類 （メタノール、 エタノール等） 、 ケトン類 (アセトン、 メチルェチルケトン、 シクロへキサノン等） 、 芳香族炭化水素類 （トル ェン、 キシレン、 ェチルベンゼン、 メチルナフ夕レン等） 、 非芳香族炭化水素類 （へ キサン、 シクロへキサン、 ケロシン等） 、 エステル類 （酢酸ェチル、 酢酸ブチル等） 、 二トリル類 （ァセトニトリル、 イソプチロニトリル等） 、 エーテル類 （ジォキサン 、 ジイソプロピルエーテル等） 、 酸アミド類 （ジメチルホルムアミド、 ジメチルァセ トアミド等） 、 ハロゲン化炭化水素類 （ジクロロェタン、 トリクロロエチレン等） 等 が挙げられる。
界面活性剤としては、 例えばアルキル硫酸エステル類、 アルキルスルホン酸塩、 ァ ルキルァリ一ルスルホン酸塩、アルキルァリールエーテル類及びそのポリォキシェチ レン化物、 ポリエチレングリコールエーテル類、 多価アルコールエステル類、 糖アル コール誘導体等が挙げられる。
その他の製剤用補助剤としては、 例えばカゼイン、 ゼラチン、 多糖類 （澱粉、 ァラ ビアガム、 セルロース誘導体、 アルギン酸等) 、 リグニン誘導体、 ベントナイト、 合 成水溶性高分子（ポリビニルアルコール、 ポリビニルピロリドン、 ポリアクリル酸等 ) 等の固着剤や分散剤、 P A P (酸性リン酸イソプロピル） 、 B H T ( 2， 6— t e r t _ブチル—4—メチルフエノール） 、 B HA ( 2 -/ 3 - t e r t _ブチル— 4 ーメトキシフヱノール） 、 植物油、 鉱物油、 脂肪酸、 脂肪酸エステル等の安定剤が挙 げられる。 本発明において「有効成分として、細胞が有する植物由来のサイトカイニン受容体 からの細胞内信号伝達を阻害する化学物質又はその農学的に許容される塩を含有す ることを特徴とする植物成長調節剤」 とは、前記の測定方法で細胞が有する植物由来 のサイトカイニン受容体からの細胞内信号伝達を阻害する能力を特定された化学物 質又はその農学的に許容される塩を有効成分として含有することにより植物の生長 若しくは分化を制御することができる薬剤をいう。 当該化学物質として、望ましくは 、サイトカイニン受容体と前記サイトカイニン受容体に対してァゴニスト活性を有す る物質との前記組換え出芽酵母接触系において、前記サイトカイニン受容体からの細 胞内信号伝達を阻害する能力を有する化学物質を挙げることができる。 また、 より望 ましくは、サイトカイニン受容体と前記サイトカイニン受容体に対してァゴニスト活 性を有する物質との前記組換え出芽酵母接触系において、 トランスゼァチンの存在濃 度が 0 . 6 p p mで化学物質の存在濃度が 2 p p m以上の場合に、 当該化学物質が存 在しない場合よりもサイトカイニン受容体の活性が低くなるように阻害する能力を 有する化学物質が挙げられる。 またさらに望ましくは、サイトカイニン受容体と前記 サイトカイニン受容体に対してァゴニスト活性を有する物質との前記組換え出芽酵 母接触系において、 トランスゼァチンの存在濃度が 0 . 6 p p mで化学物質の存在濃 度が 2 p p m以上の場合に、当該化学物質が存在しない場合よりもサイトカイニン受 容#：の活性が 9 0 %以上低くなるように阻害する能力を有する化学物質を挙げるこ とができる。 本発明において「被験物質が有する、植物の根の生長を促進させる能力の検定方法 であって、 （1 )下記の群 Aから選択される植物由来のサイトカイニン受容体を有す る細胞と、前記サイトカイニン受容体に対してァゴニスト活性を有する物質と、被験 物質との接触系内において、前記サイトカイニン受容体からの細胞内信号伝達を阻害 する活性 (or細胞内信号伝達の有無若しくはその量）を測定する第一工程、 及び （2 ) 第一工程により：測定された活性と対照における活性とを比較することにより得られ
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る差異に基づき前記物質が有する植物の根 7の生長を促進させる能力を評価する第二 工程、 を有することを特徴とする方法」 とは、 被験物質が有する植物の根の生長を促 進させる能力を検定する様々な方法の中で、前記の第一工程及び第二工程を有するこ とを特徴とする方法をいう。
ここで、 「群 A」 とは、
( a ) 配列番号 1で示されるァミノ酸配列からなる蛋白質
( b )配列番号 1で示されるアミノ酸配列において、 1もしくは複数のアミノ酸が欠 失、付加もしくは置換されたアミノ酸配列からなり、かつサイトカイニン受容体とし て機能する活性を有する蛋白質
( c )配列番号 1で示されるアミノ酸配列と 4 5 %以上の配列同一性を有するァミノ 酸配列からなり、 かつサイトカイニン受容体として機能する活性を有する蛋白質 ( d )配列番号 2で示される塩基配列によりコードされるアミノ酸配列からなる蛋白 質
( e )配列番号 2で示される塩基配列を有するポリヌクレオチドに対し相補性を有す るポリヌクレオチドと、ストリンジェントな条件下でハイブリダィズするポリヌクレ ォチドによりコードされるアミノ酸配列からなり、かつサイトカイニン受容体として 機能する活性を有する蛋白質
を示す。 前記の第一工程は、前記の様々な植物由来のサイトカイニン受容体を有する細胞と 、前記サイトカイニン受容体に対してァゴニスト活性を有する物質と、被験物質との 接触系内において、前記サイトカイニン受容体からの細胞内信号伝達を阻害する活性 (or細胞内信号伝達の有無若しくはその量）を測定する工程である。 また第二工程は、 第一工程により測定された活性と対照における活性とを比較することにより得られ る差異に基づき前記物質が有する植物の根の生長を促進させる能力を評価する工程 である。 ここで対照とは、例えば被験物質を溶媒に溶解した状態で反応系に添加した 場合には、 被験物質を溶解した溶媒のみを添加した試験区を意味する。
当該第一工程及び当該第二工程を有する、被験物質が有する、植物の根の生長を促 進させる能力の検定方法に使用される、細胞が有する植物由来のサイトカイニン受容 体は、 前記群 Aに示す蛋白質である。 上記の群 Aの蛋白質のうち、 （b) 、 （c) 、 （ d) 、 (e) に示される蛋白質のアミノ酸配列において、 （a) に示されるアミノ酸配 列との間に認められることのある相違は、 一部のアミノ酸の欠失、 置換、 付加等であ る。 これらには、 例えば、 上記の (a) で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質が細 胞内で受けるプロセシングによる欠失が含まれる。 また、 当該蛋白質が由来する生物 の種差や個体差等により天然に生じる遺伝子変異や、部位特異的変異導入法、ランダ ム変異導入法、突然変異処理等によって人為的に導入される遺伝子変異等により生じ るアミノ酸の欠失、 置換、 付加等が含まれる。
かかる欠失、 置換、 付加等を受けるアミノ酸の数は、 サイトカイニン受容体のヒス チジンキナーゼ活性を見出すことのできる範囲内の数であれば良い。 また、 アミノ酸 の置換としては、 例えば、 疎水性、 電荷、 p ：、 立体構造上における特徴等の類似し たアミノ酸への置換をあげることができる。 このような置換としては、具体的には例 えば、 （1)グリシン、 ァラニン； （2)バリン、 イソロイシン、 ロイシン； （3)ァスパラ ギン酸、 グルタミン酸、 ァスパラギン、 グルタミン、 （4)セリン、 スレオニン； （5) リジン、 アルギニン； （6)フエ二ルァラニン、 チロシン等のグループ内での置換が挙 げられる。 - かかるアミノ酸の欠失、 付加若しくは置換（以下、 総じてアミノ酸の改変と記すこ ともある。 ） を人為的に行う手法としては、 例えば、 （a) で示されるアミノ酸配列 をコードする DNAに対して部位特異的変異導入を施し、その後この DNAを常法により発 現させる手法が挙げられる。 ここで部位特異的変異導入法としては、 例えば、 アンバ 一変異を利用する方法 （ギャップド ·デュプレックス法、 Nucleic Acids
Res., 12,9441-9456(1984)) 、 変異導入用プライマーを用いた P C Rによる方法等が 挙げられる。 また、 アミノ酸の改変を人為的に行う手法としては、 例えば、 （a) で 示されるアミノ酸配列をコードする DNAに対してランダムに変異導入を施し、 その後 この DNAを常法により発現させる手法も挙げられる。 ここでランダムに変異を導入す る手法としては、 例えば、 上記のアミノ酸配列のいずれかをコードする DNAを铸型と し、それぞれの DNAの全長を増幅できるようなプライマ一対を用レ 、基質に用いる (1ATP 、 dTTP、 dGTP, dCTPの各々の添加濃度を通常とは変化させた反応条件や、 或いはポリ メラ一ゼの反応を促進させる Mg2 +の濃度を通常よりも増加させた反応条件で P C R を行う方法等が挙げられる。 このような PC Rの手法としては、 例えば、 Method in Molecular Biology, (31), 1994, 97-112 に記載される方法があげられる。 また、 W00009682号公報に記載される方法をあげることもできる。 ここで「配列同一性」 とは、 2つの塩基配列又は 2つのアミノ酸配列間の同一性を いう。 前記 「配列同一性」 は、 比較対象の配列の全領域にわたって、 最適な状態にァ ラインメントされた 2つの配列を比較することにより決定される。 ここで、比較対象 の塩基配列又はアミノ酸配列の最適なアラインメントにおいては、付加又は欠失（例 えばギャップ等）を許容してもよい。このような配列同一性は、例えば、 F ASTA [P e a r s on & Li man, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 4, 2444-2448(1988)] 、 BLAST [Altschul ら、 lournal of Molecular Biology, 215, 403-410(1990)] 、 CLUSTAL W [Thompson, Higgins&Gibson, Nucleic Acid Research, 22, 4673-4680 (1994a) ] 等のプログラム を用いて相同性解析を行いアラインメントを作成することによって算出することが できる。 上記のプログラムは、 例えば、 DNA Data Bank of 〗apan [国立遺伝学研究所 生命情報 ' DDB J研究センター （Center for Information Biology and DNA Data Bank of Japan ； CIB/DDBJ)内で運営される国際 DN Aデータバンク] のホームべ一 ジ （http://www.ddbj.nig.ac.jp) 等において、 一般的に利用可能である。 また、 配 列同一性は市販の配列解析ソフトウエアを用いて求めることもできる。具体的には例 えば、 GENETYX-WI Ver.5 (ソフトウェア開発株式会社製） 」 を用い、 Lipman- Pearson 法 [Lipman, D. J. and Pearson, W.R., Science, 227, 1435-1441, (1985)] により 相同性解析を行ってァラインメントを作成することにより算出することができる。 (e)に記載される 「ストリンジェントな条件」 としては、 Sambrook J., Frisch E. F. , Maniatis Τ·著、モレキュラークロ一ニング第 2版（Molecular Cloning 2nd edition ) 、 コールド スプリング ハーバー ラボラトリ一発行 （Cold Spring Harbor Laboratory press)等に記載される通常の方法に準じて行われるハイブリダィゼーシ ヨンにおいて、 例えば、 6 XSSC (i. 5M NaCK 0. 15M クェン酸三ナトリウム を含む溶液を 10 XSSCとする） を含む溶液中で 45 にてハイブリッドを形成させ た後、 2XSSCで 50でにて洗浄するような条件 (Molecular Biology, John Wiley & Sons, N. Y. (1989), 6.3.1-6.3.6) 等を挙げることができる。 洗浄ステップにおけ る塩濃度は、 例えば、 2 XSSC (低ストリンジエンシーな条件） から 0. 2 XSSC (高 ストリンジエンシーな条件） までの条件から選択することができる。洗浄ステップに おける温度は、 例えば、 室温 （低ストリンジエンシーな条 f から 65 : (高ストリ ンジエンシーな条件） までの条件から選択することができる。 また、 塩濃度と温度の 両方を変えるこどもできる。
これらの蛋白質は、勿論サイトカイニン受容体として機能する活性を有する蛋白質 であるが、 より望ましくは、最大の配列同一性が得られるよう配列番号 1で示される アミノ酸配列と整列させた場合に、 配列番号 1で示されるアミノ酸配列の （I) 459 位、 （II) 973位に相当する位置のアミノ酸残基が、 下記アミノ酸残基； （I) 459位 はヒスチジン、 （Π) 973位はァスパラギン酸である蛋白質が用いられる。 ここで、 「最大の配列同一性が得られるように配列番号 1で示されるアミノ酸配列と整列さ せる」 とは、 上記の FASTA、 BLAST, CLUSTAL W等のプログラムを用いて配列番号 1で 示されるアミノ酸配列を含めて対象となる複数のアミノ酸配列の配列同一性解析を 行い整列させることを意味する。このような方法で複数の配列を整列させることによ り、 アミノ酸配列中にある挿入、 欠失にかかわらず、 各アミノ酸配列中における相同 アミノ酸残基の位置を決めることが可能である。相同位置は、三次元構造中で同位置 に存在すると考えられ、対象の蛋白質の特異的機能に関して類似した効果を有するこ とが推定できる。 例えば、 本発明で配列が開示されるサイトカイニン受容体を含め、 既知のサイトカイ二ン受容体は、ァミノ酸配列最大の配列同一性が得られるよう配列 番号 1で示されるアミノ酸配列と整列させた場合に、配列番号 1で示されるアミノ酸 配列の （I) 459位、 （I I) 973位に相当する位置のアミノ酸残基が、 下記アミノ酸残 基； （I) 459位はヒスチジン、 （I I) 973位はァスパラギン酸である。 植物の生長若しくは分化を制御する薬剤の有効成分は、例えば、前記の植物の根に 対する根の生長を促進させる能力を測定することによって探索することができる。 また、前記の細胞が有する植物由来のサイトカイニン受容体を用いた植物の根の生 長を促進させる能力の検定方法によっても植物の生長若しくは分化を制御する能力 を有する物質を探索することが可能である。具体的には、前記のサイトカイニン受容 体を用いた植物の根の生長を促進させる能力の検定方法を用いて、被験物質の植物の 根の生長を促進させる能力がある一定値以上、又は一定値以下であることが特定され た場合、当該物質を選抜することによって植物の根の生長を促進させる能力を有する 物質を探索できる。
また当該探索方法によって選抜された物質は、植物の生長若しくは分化を制御する 能力を有することから、その物質又はその農学的に許容される塩を有効成分として含 有する植物成長調節剤となり得る。 サイトカイニン情報伝達を阻害する物質としては、具体的には例えば、サイトカイ ニンアン夕ゴニス卜、 サイトカイニンァゴニス卜のようなものが挙げられる。
上述の探索方法により選抜されたサイトカイニン情報伝達阻害物質は、 植物の根部 の生長を促進しうる。 根部の生長とは主根の伸長、 側根の伸長、 根毛の伸長等をいう 。
上述の探索方法により選抜されたサイトカイニン情報伝達阻害物質の根部生長促進 活性は、 例えば、 下記の方法を用いて検定することができる。 植物の種類、 アツセィ 方法により変わり得るが、 例えば、 サイトカイニン情報伝達阻害物質を 0 . 0 0 0 1 〜 1 0 O p p mの範囲で種々の濃度に調製した水溶液、水耕栽培用培地、組織培養用 培地を作成する。 シャーレ試験の場合、 シャーレ中に敷いたろ紙に上記溶液を沁み込 ませ、 植物種子を置床する。 小袋試験の場合、 種子成長袋等根の生長の観察のできる 袋中の厚紙に上記溶液を沁みこませ、植物種子を播種する。 また、 上記溶液にァガロ ース、寒天等を添加した固形培地をプラスチックシャーレ又はプラスチック遠沈管に 調製し、植物種子を播種して、 明所にて 1 0〜3 0での温度にて一定期間培養した後 、 主根又は側根の長さ、 側根の数、 根部湿重量、 根部乾重量等を測定する。
上述の探索方法により選抜されたサイトカイニン情報伝達阻害物質は、 植物成長調
3
節剤として利用してもよい。 2
本発明で使用される一般式 （I ) で表される化合物 （以下、 化合物 （ I ) と記すこ ともある。 ） における R、 X、 R R2、 R3、 R4、 R5、 R6及び R7で表される基において、 「炭化水素基」 としては、 例えば、 脂肪族炭化水素基、 単環式飽和炭化水素基及び芳 香族炭化水素基等が挙げられ、 炭素数 1乃至 16個のものが好ましい。 具体的には例え ば、 アルキル基、 アルケニル基、 アルキニル基、 シクロアルキル基、 ァラルキル基、 ァリール基等が用いられる。
「アルキル基」 は、 例えば、 低級アルキル基等が好ましく、 具体的には例えば、 メチ ル、 ェチル、 プロピル、 イソプロピル、 ブチル、 イソブチル、 sec-ブチル及び t er t- プチル、 ペンチル、 へキシル等の C1-6アルキル基等が用いられる。
「アルケニル基」 は、 例えば、 低級アルケニル基等が好ましく、 具体的には例えば、 ビニル、 1—プロべニル、 ァリル、 イソプロぺニル、 ブテニル及びイソブテニル等の C2-6アルケニル基等が用いられる。
「アルキニル基」 は、 例えば、 低級アルキニル基等が好ましく、 具体的には例えば、 ェチニル、 プロパルギル及び 1—プロピニル等の C2- 6アルキニル基等が用いられる。 「シクロアルキル基」 は、 例えば、 低級シクロアルキル基等が好ましく、 具体的には 例えば、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル及びシク口へキシル等の C3-6 シクロアルキル基等が用いられる。 「ァラルキル基」 は、 例えば、 ベンジル、 フエネ チル等の C7-1 1ァラルキル基が好ましく、 具体的には例えば、 ベンジル基が用いられ る。
「ァリール基」 は、 例えば、 フエニル、 1一ナフチル、 2—ナフチル、 ビフエ二リル及 び 2 _アンスリル等の C6-14ァリール基等が好ましく、具体的には例えば、 フエニル基 等が用いられる。
「置換されていてもよい炭化水素基」 及び 「置換されていてもよい C1- 6アルキル基」 の 「炭化水素基」 及び「Cl-6アルキル基」 が有していてもよい置換基としては、 例え ば、 ハロゲン原子 （具体的には例えば、 フッ素、 塩素、 臭素、 ヨウ素等） 、 ニトロ基 、 シァノ基、 ヒドロキシル基、 低級アルキル基 （具体的には例えば、 メチル、 ェチル 、 プロピル、 イソプロピル、 ブチル、 イソブチル、 sec-ブチル、 t er t-ブチル、 ペン チル、 イソペンチル、 ネオペンチル、 へキシル等の C1-6アルキル基等） 、 低級アルコ キシ基 （具体的には例えば、 メトキシ、 エトキシ、 プロボキシ、 イソプロボキシ、 ブ トキシ、 イソブトキシ、 ペンチルォキシ、 へキシルォキシ等の C1- 6アルコキシ基等） 、 アミノ基、 モノー低級アルキルアミノ基 （具体的には例えば、 メチルァミノ、 エヂ ルァミノ等のモノ— C1-6アルキルアミノ基等） 、 ジ—低級アルキルアミノ基 （具体的 には例えば、 ジメチルァミノ、 ジェチルァミノ等のジー C1 - 6アルキルアミノ基等） 、 イミノ基、 力ルポキシル基、 低級アルキルカルボニル基 （具体的には例えば、 ァセチ ル、 プロピオニル等の C1-6アルキル力ルポニル基等） 、 低級アルコキシカルボニル基 (具体的には例えば、 メトキシカルボニル、 エトキシカルボニル、 プロポキシ力ルポ ニル、 ブトキシカルポニル等の C1- 6アルコキシ力ルポニル基等） 、 力ルバモイル基、 チォカルバモイル基、 モノー低級アルキル力ルバモイル基（具体的には例えば、 メチ ルカルバモイル、 ェチルカルバモイル等のモノー C1-6アルキル力ルバモイル基等） 、 ジー低級アルキル力ルバモイル基（具体的には例えば、 ジメチルカルバモイル、 ジェ チルカルバモイル等のジー C1 -6アルキル力ルバモイル基等）、 ァリ一ルカルバモイル 基 （具体的には例えば、 フエ二ルカルバモイル、 ナフチルカルバモイル等の C6-10ァ リール力ルバモイル基等） 、 ァリール基 （具体的には例えば、 フエニル、 ナフチル等 の C6- 10ァリール基等） 、 ァリールォキシ基 （具体的には例えば、 フエニルォキシ、 ナフチルォキシ等の C6- 10ァリールォキシ基等） 、 複素環基 （具体的には例えば、 1 一又は 3—チェニル、 2—又は 3—テトラヒドロチェニル、 2_又は 3_フリル、 2—又は 3—テトラヒドロフリル、 1_、 2_又は 3—ピロリル、 1一、 2—又は 3—ピロリジニル 、 1一、 4—又は 5—ォキサゾリル、 3—、 4_又は 5_イソォキサゾリル、 2—、 4一又は 5—チアゾリル、 3—、 4—又は 5_イソチアゾリル、 3—、 4_又は 5_ピラゾリル、 2 ―、 3—又は 4—ビラゾリジニル、 2—、 4—又は 5—イミダゾリル、 4一又は 5— 1H— 1 , 2, 3—トリァゾリル、 3—又は 5— 1, 2, 4—トリァゾリル、 5— 1H—又は 5— 2H—テ トラゾリル、 2—、 3—又は 4—ピリジル、 2—、 4_又は 5—ピリミジニル、 1一、 2—又 は 3—チオモルホリニル、 1_、 2_又は 3—モルホリニル、 1_、 2_、 3—又は 4—ピぺ リジノ、 2—、 3—又は 4—ピベリジレ、 2—、 3_又は 4—チォビラニル、 1一、 3—又は 4-4H-1, 4—ォキサジニル、 2—、 3—又は 4— 4H— 1， 4—チアジニル、 1， 3—チア ジニル、 1—又は 2 ピペラジニル、 3_、 5—又は 6_1, 2, 4—トリアジニル、 2_1 ， 3, 5—トリアジニル、 3—又は 4一ピリダジニル、 2—ビラジニル等） 、 低級アルキ ルカルポニルァミノ基（具体的には例えば、 ァセチルァミノ等の C1-6アルキルカルボ ニルァミノ基等） 、 メルカプト基、 C1-6アルキルチオ基 （具体的には例えば、 メチル チォ等の C1- 6アルキルチオ基） 、 アルキルスルフィニル基 （具体的には例えば、 メチ ルスルフィニル等の C卜 6アルキルスルフィニル基） 、 アルキルスルホニル基（具体的 には例えば、 メチルスルホニル等の C1-6アルキルスルホニル基） 、 ァリ一ルチオ基 （ 具体的には例えば、 フエ二ルチオ等の C6-10ァリールチオ基） 、 ァリールスルフィ二 ル基 （具体的には例えば、 フエニルスルフィニル等の C6-10ァリ一ルスルフィニル基 ) 、 ァリールスルホニル基 （具体的には例えば、 フエニルスルホニル等の C6- 10ァリ 一ルスルホニル基） 、 ォキソ基、 チォキソ基等が用いられる。
ここでァシル基 （具体的には例えば、 ホルミル、 ァセチル、 プロピオニル、 ピバロ ィル、 ァクリロイル、 ベンゾィル等） はォキソ基で置換された炭化水素基の一種であ り、 前記の 「置換されていてもよい炭化水素基」 及び 「置換されていてもよい C1-6 アルキル基」 に含まれる。
「置換されていてもよい炭化水素基」 及び「置換されていてもよい C1-6アルキル基 」 の 「炭化水素基」 及び 「C1- 6アルキル基」 は、 上記した置換基を置換可能な位置に 1個以上、 好ましくは 1乃至 3個有していてもよく、 置換基がハロゲン原子の場合には 置換可能な最大数まで置換していてもよく、 置換基数が 2個以上の場合には各置換基 は同一又は異なっていてもよい。
上記の置換基が、 低級アルキル基、 低級アルコキシ基、 モノー低級アルキルアミノ 基、 ジー低級アルキルアミノ基、 低級アルキルカルボ二ル基、 低級アルコキシカルボ ニル基、 モノー低級アルキル力ルバモイル基、 ジー低級アルキル力ルバモイル基、 ァ リ一ルカルバモイル基、 ァリール基、 ァリールォキシ基、 複素環基、 低級アルキル力 ルポニルァミノ基、 アルキルチオ基、 アルキルスルフィニル基、 アルキルスルホニル 基、 ァリ一ルチオ基、 ァリ一ルスルフィニル基、 ァリ一ルスルホニル基等の場合には 、 これらの置換基はハロゲン原子 （具体的には例えば、 フッ素、 塩素、 臭素、 ヨウ素 等） 、 ニトロ基、 シァノ基、 ヒドロキシル基、 C1-4アルコキシ基 （具体的には例えば 、 メトキシ、 エトキシ、 プロボキシ、 イソプロピルォキシ、 ブトキシ、 イソブチルォ キシ） 、 ァリール基、 ォキソ基等で 1乃至 3個置換されていてもよく、上記の置換基が 、 ァリール力ルバモイル基、 ァリール基、 ァリールォキシ基、 複素環基、 C6- 10ァリ —ルチオ、 C6-10ァリ一ルスルフィニル、 C6-10ァリールスルホニル等の場合、 これら の置換基は C1-4アルキル基 （具体的には例えば、 メチル、 ェチル、 プロピル、 イソプ 口ピル、 ブチル、 イソブチル、 sec—プチル、 tej t—ブチル等） で 1乃至 3個置換され ていてもよい。
「C卜 6アルキル基」 としては、 例えば、 メチル、 エヂル、 プロピル、 イソプロピル 、 ブチル、 イソブチル、 sec _ブチル及び ter t _ブチル、 ペンチル、 へキシル等が用 いられる。
「C卜 3アルキル基」 （C卜 3アルキルアミノ基及びジ C1 - 3アルキルアミノ基として示 される基の C1- 3アルキル基を含む） としては、 メチル、 ェチル、 プロピル及びイソプ 口ピルが用いられる。
「C 3-6アルケニル基」 としては、 例えば、 1—プロべニル、 ァリル、 イソプロぺニル 、 ブテニル及びイソブテニル等が用いられる。
「C 3-6アルキニル基」 としては、 例えば、 プロパルギル及び 1—プロピニル等が用い られる。 「C卜 3アルコキシ基」 （ヒドロキシ C1 -3アルコキシ基及び C 1-3アルコキシカルボ二 ル基として示される基の C1-3アルキル基を含む） としては、 メトキシ、 エトキシ、 プ 口ポキシ及びィソプロピルォキシ等が用いられる。
「C卜 3ァシル基」 （C卜 3ァシルチオ基として示される基の C1-3ァシル基を含む） と しては、 例えば、 ホルミル、 ァセチル、 プロピオニル等が用いられる。
「C卜 3ハロアルキル基」 としては、 例えば、 クロロメチル、 トリフルォロメチル、 2 —ブロモェチル、 1, 2， 2—トリフルォロェチル、 , 2, 3, 3, 3—ペン夕フルォロプ 口ピル等が用いられる。
("R1及び R2が隣接する窒素原子と一緒になつて置換されていてもよい環状アミノ基」 で示される 「環状アミノ基」 としては、 例えば、 1—アジリジニル、 ピロリジノ、 ピ ペリジノ、 モルホリノ、 チオモルホリノ等が用いられ、 その置換基としては、 例えば 、 上記したような C1-3アルキル基、 C1- 3アルコキシ基、 ヒドロキシル基等が 1〜3個用 いられる。
Arで表される基において、
「ァリール基」 としては、 例えば、 上記、 R、 X、 R R2、 R3、 R4、 R5、 Rsおよび R7 で表される基の 「炭化水素基」 の一部として示したァリール基等が用いられ、
「ヘテロァリール基」 としては、 例えば、 2 _または 3 _チェニル、 2 _または 3—フリ ル、 1—、 2—または 3—ピロリル、 2 _、 4 _または 5—ォキサゾリル、 3—、 4—または 5—イソォキサゾリル、 2—、 4一または 5—チアゾリル、 3—、 4 _または 5—イソチア ゾリル、 3 _、 4—または 5 _ピラゾリル、 2—、 4—または 5—イミダゾリル、 4—また は 5— 1H— 1 , 2, 3 _トリァゾリル、 3—または 5— 1， 2, 4 _トリァゾリル、 5— 1H—ま たは 5— 2H—テトラゾリル、 2 _、 3—または 4 _ピリジル、 2 _、 4—または 5 _ピリミ ジニル、 1一または 2—ピペラジニル、 3 _、 5 _または 6—1 , 2, 4 _トリアジニル、 2 —1 , 3, 5 _トリアジニル、 3—または 4—ピリダジニル、 2—ビラジニル等が用いられ る。
これら 「ァリール基」 および「ヘテロァリール基」 の置換基としては、 例えば、 上記 、 R、 X、 R1 , R2、 R3、 R4、 R5、 R6および R7で表される 「置換されていてもよい炭化水 素基」および「置換されていてもよい C1 -6アルキル基」 の置換基として例示した基等 が用いられる。 一般式（I) において、 1が 0である化合物とは、 キナゾリン骨格の 2位が無置換で あるもの、 すなわち一般式 （1-1)
Figure imgf000038_0001
(式中、 Xは置換されていてもよい炭化水素基、 NR' R2で表される基、 OR3で表される 基、 S (0) nR4で表される基、 ニトロ基またはハロゲン原子を示し、 - ここで は水素原子または置換されていてもよい炭化水素基を示し、
R2は水素原子、 置換されていてもよい炭化水素基、 NR5 R6で表される基 （ここで R5お よび R6は同一もしくは異なり水素原子または置換されていてもよい C1-6アルキル基 を示す） または OR7で表される基 （ここで R7は水素原子または置換されていてもよい C1- 6アルキル基を示す） を示し、又は R1および R2が隣接する窒素原子と一緒になつて 置換されていてもよい環状アミノ基を示し、
R3および R4はそれぞれ置換されていてもよい炭化水素基を示し、
mは 0〜2の整数を示し、
nは。〜 4の整数を示し、
nが 2以上の場合 Xは同一または異なっていてもよく、
Arは置換されていてもよいァリール基または置換されていてもよいへテロアり一ル 基を示す） で表される化合物である。 一般式 （I) において、 1が 1である化合物とは、 キナゾリン骨格の 2位が Rで置換 されたもの、 すなわち一般式 （1-2)
Figure imgf000038_0002
(式中、 Rおよび Xは同一または異なって置換され'ていてもよい炭化水素基、 NR' R2で 表される基、 OR3で表される基、 S (0)mR4で表される基、 ニトロ基またはハロゲン原子 を示し、 ここで R1は水素原子または置換されていてもよい炭化水素基を示し、 R2は水素原子、 置換されていてもよい炭化水素基、 NR5 R6で表される基 （ここで R5お よび R6は同一もしくは異なり水素原子または置換されていてもよい C1-6アルキル基 を示す） または OR7で表される基 （ここで R7は水素原子または置換されていてもよい C1-6アルキル基を示す）を示し、又は R1および R2が隣接する窒素原子と一緒になつて 置換されていてもよい環状アミノ基を示し、
R3および R4はそれぞれ置換されていてもよい炭化水素基を示し、
mは 0〜2の整数を示し、
nは 0〜4の整数を示し、
nが 2以上の場合 Xは同一または異なっていてもよく、
Arは置換されていてもよいァリール基または置換されていてもよいへテロアリール 基を示す） で表される化合物である。 化合物 （I ) は、 前記した 「農学的に許容される塩」 の形態であってもよい。 化合物（I )が 1個以上の不斉中心を有する場合には、 当該化合物には 2個以上の立 体異性体 （具体的には例えば、 ェナンチォマー、 ジァステレオマー等） が存在する。 本発明化合物にば、 これらの立体異性体のすべて及びそれらのうちの任意の 2個以上 からなる混合物が包含される。
また化合物（I )が二重結合等に基づく幾何異性を有する場合には、 当該化合物に は 2個以上の幾何異性体 （具体的には例えば、 E/Z又はトランス Zシスの各異性体、 S 一トランス/ S—シスの各異性体等） が存在する。 化合物 （I ) には、 これらの幾何 異性体のすべて及びそれらのうちの任意の 2個以上からなる混合物が包含される。 化合物 （I ) の好ましい態様としては、 例えば、 以下に示される態様が挙げられる 。
一般式 （I ) において、
( 1 ) 1が 1であり、 Rが置換されていてもよい炭化水素基である化合物。
(.2 ) 1が 1であり、 Rがハロゲン原子又はォキソ基で置換されていてもよい C1- 3アル キル基である （1) 記載の化合物。
(3)置換されていてもよい炭化水素基がハロゲン原子又はォキソ基で置換されてい てもよい C1-3アルキル基である （1) 記載の化合物。
(4) 1が 1であり、 Rが N R2で表される基である化合物。
(5) R1が水素原子又は C1-3アルキル基を示し、 R2が水素原子、 アミノ基、 C1-3アル キルアミノ基、 ジ C1- 3アルキルアミノ基、 アミジノ基、 C卜 3アルコキシ基、 フエニル 基、 C1-3ァシル基、 C1-6アルキル基、 C3-6アルケニル基又は C3-6アルキニル基を示し 、ここで前記のフエ二ル基は 1〜3個の同じもしくは異なる C1-3アルキル基で置換され ていてもよく、 前記のフエニル基、 ァシル基、 アルキル基、 アルケニル基及びアルキ 二ル基はハロゲン原子、 ヒドロキシル基、 C1-3アルコキシ基、 ヒドロキシ C卜 3アルコ キシ基、 力ルポキシル基、 C1- 3アルコキシカルポニル基、 力ルバモイル基、 アミノ基 、 C卜 3アルキルアミノ基、 ジ C1-3アルキルアミノ基、 メルカプト基、 C1-3ァシルチオ 基、 シァノ基、 フリル基及びテトラヒドロフリル基の中から選ばれる 1〜3個の同じも しくは異なる置換基で置換されていてもよく、又は R1及び R2が隣接する窒素原子と一 緒になってピロリジノ基、 ピペリジノ基又はモルホリノ基を示す（4)記載の化合物
(6) R1が水素原子を示し、 R2が水素原子、 ホルミル基、 C1 - 6アルキル基、 C3 - 6アル ケニル基又は C3-6アルキニル基を示し、 ここで前記のアルキル基、 アルケニル基及び アルキニル基はヒドロキシル基、 メトキシ基、 メトキシカルボニル基、 エトキシカル ポニル基、 シァノ基及びフリル基の中から選ばれる置換基で置換されていてもよい（ 4) 記載の化合物。
(7) 1が 1であり、 Rが OR3で表される基である化合物。
(8) R3がァミノ基で置換されていてもよい C1- 3アルキル基である （7)記載の化合 物。
(9) 1が 1であり、 Rが S(0)mR4で表される基；である化合物。
( 10) R4がァミノ基又はヒドロキシル基で置換されていてもよい C1-3アルキル基で あり、 mが 0である （9) 記載の化合物。
(1 1) 1が 1であり、 Rがハロゲン原子である化合物。 (12) ハロゲン原子が塩素原子である （1 1) 記載の化合物。
(13) nが 1〜2であり、 Xが C1-3アルキル基、 C1-3アルコキシ基、 C卜 3ハロアルキル 基、 シァノ基、 ハロゲン原子又はニトロ基である化合物。
(14) Xが塩素原子、 臭素原子又はニトロ基であり、 Xの置換位置が 6位及び 又は 8 5 位である （13) 記載の化合物。
(15 )Arがハロゲン原子又は C1-3アルキル基で置換されていてもよいフエニル基で ある化合物。 化合物（I) は、 公知化合物を含み、 公知又はそれに準じる方法で製造することが 10 できる。
例えば、 1が 1であり、 Rが塩素原子である化合物 （la) は、 例えば以下の製造法 1 により、化合物（I I) をォキシ塩化リンと加熱することにより製造することができ る。
文献例：特開昭 62— 145073
15 製造法 1
Figure imgf000041_0001
(式中の記号は前記と同意義を示す。 ） 当該反応は、反応に支障のない溶媒中で行ってもよいが、通常無溶媒で過剰量のォ 20 キシ塩化リン （化合物 （II) に対し 5当量〜 30当量） を使用する。 反応温度は、 通常 80〜200°Cであり、 好ましぐは 9(TC〜還流 （105 ） である。 反応時間は、 通常 0.1〜 96時間、好ましぐは 0.5〜5時間、 より好ましくは 0.5〜2時間である。還流下でも反応 , の進行が遅い場合には、 耐圧密閉容器を使用し、 200 程度まで加熱し、 加圧下 （例 ' えば、 1.1〜100気圧） で反応させることもできる'。
25 また、 1が 1であり、 Rがハロゲン原子以外の基 Raである化合物 （lb) は、 例えば、 以下の製造法 2により、 化合物 （I I I) と化合物 （I V) とを反応させることによ り製造することができる。
文献例： 日本化学会誌 1973、 1944頁；特開昭 58-88369
製造法 2
Figure imgf000042_0001
(式中、 Yは脱離基 （例えば、 フッ素、 塩素、 臭素、 ヨウ素等のハロゲン原子、 例え ば、 メタンスルホニルォキシ基、 ベンゼンスルホニルォキシ基、 P-トルエンスルホニ ルォキシ基等のアルカン又はアレーンスルホニルォキシ基，例えばメタンスルホニル 、 ベンゼンスルホニル、 フエニルメタンメタンスルホニル等のアルカン、 ァレ一ン又 はァレーンアルカンスルホニル基等） を示し、 Raは Rと同意義であるがハロゲン原子 ではなく、 他の記号は前記と同意義を示す。 ） 当該反応は無溶媒で行ってもよく、 溶媒を使用してもよい。 溶媒としては、 例えば 、 ペンタン、 へキサン、 ヘプタン、 石油エーテル、 シクロへキサン等の脂肪族炭化水 素類、 酢酸メチル、 酢酸ェチル、 ギ酸ェチル、 プロピオン酸ェチル等のエステル類、 アセトン、 メチルェチルケトン等のケトン類、 ジェチルエーテル、 メチル ter t-ブチ ルエーテル、 ジイソプロピルエーテル、 ジブチルエーテル、 テトラヒドロフラン、 ジ ォキサン等のエーテル類、 メタノール、 エタノール、 イソプロパノール等のアルコー ル類、 ァセトニトリル、 プロピオ二トリル等の二トリル類、 ジメチルホルムアミド、 ジメチルァセトアミド等の酸アミド類、1—メチル—2—ピロリドン等の環状アミド類 、 へキサメチルホスホルアミド等のリン酸アミド類、 1 , 3—ジメチル— 2 _イミダゾ リジノン等の環状尿素類、 ジメチルスルホキシド等のスルホキシド類、 スルホラン等 のスルホン類、 ジクロロメタン、 クロ口ホルム、 1 , 2—ジクロロェ夕ン、 四塩化炭素 等のハロゲン化炭化水素類、 ピリジン、 ピコリン、 ルチジン、 キノリン等の芳香族ァ ミン類、 及びこれらの混合溶媒、 水、 さらにはこれらと水との混合溶媒等が挙げられ 水との混合溶媒が用いられ、 反応が均一系でない場合には、 相間移動触媒（例えば 、塩化べンジルトリェチルアンモニゥム、臭化テトラプチルアンモニゥム等の四級ァ ンモニゥム塩、 18-クラウン- 6等のクラウンエーテル類等） を使用してもよい。
塩基としては、 例えば、 ナトリウムェチラート、 ナトリウムメチラート、 カリウム ter t-ブトキシド等のアルカリ金属のアルコラ一ト、 例えば、 ピリジン、 ピコリン、 ルチジン、 キノリン、 卜リエチルァミン、 ジイソプロピルェチルァミン、 4—ジメチ ルアミノビリジン、 N， N—ジメチルァニリン等の有機塩基、 例えば、 炭酸カリウム、 炭酸ナトリウム、 水酸化ナトリウム、 水酸化カリウム、 炭酸水素ナトリウム、 炭酸水 素力リゥム等の無機塩基、 例えば、 水素化リチウム、 水素化ナ卜リゥム、 水素化力リ ゥム等の金属水素化物、 例えば、 ブチルリチウム、 リチウムジイソプロピルアミド等 の有機リチウム試薬等が挙げられる。
用いられる塩基の量は反応に悪影響を及ぼさない量であれば特に限定されず、溶媒 を兼ねて大過剰量用いることもできる。 - 化合物 （ I V) がァミン類である場合には、 過剰量の化合物 （ I V) を塩基及び溶 媒を兼ねて使用することもできる。
反応温度は、 通常— 5 0〜2 0 0 であり、 好ましくは室温〜 1 5 である。 反 応時間は一般には 0. 1〜96時間、 好ましくは 0. 1〜72時間、 より好ましくは 0. 1〜24時 間である。
化合物 （I V) がアンモニア、 メチルァミン、 ェチルァミン等の低沸点化合物であ る場合や反応の進行が遅い場合には、 耐圧密閉容器を使用し、 40〜150 程度に加熱 し、 加圧下 （例えば、 1. 1〜100気圧） で反応させることもできる。 化合物 （I I ) は、 公知化合物を含み、 公知又はそれに準じる方法で製造すること ができる。
例えば、 以下の参考製造法 1により、 化合物 （V) を化合物 （V I ) 友びクロ口炭 酸メチルと反応させることにより製造することができる。
文献例： Te t rahedron 42, 3697 (1986)
参考製造法 1
Figure imgf000044_0001
(V) (II)
(式中、 Zは塩素、 臭素、 ヨウ素等のハロゲン原子を示し、 他の記号は前記と同意義 を示す。 ）
5 当該反応では、 まず化合物 （V) と化合物 （V I) とを反応させる。 通常溶媒を使 用し、 例えば、 ペンタン、 へキサン、 ヘプタン、 石油エーテル等の脂肪族炭化水素類 、 ベンゼン、 トルエン、 キシレン等の芳香族炭化水素類、 ジェチルエーテル、 メチル tert -ブチルエーテル、 ジイソプロピルエーテル、 ジブチルェ一テル、 テトラヒドロ フラン、 ジォキサン等のエーテル類又はこれらの 2種以上の混合物が用いられる。 10 化合物 （V) に対し化合物 （V I) は、 通常 1〜5当量、 好ましくは 2〜 2.5当量用 いられる。
この段階での反応温度は、通常 40〜 100でであり、好ましくは 50〜70 であ る。
反応時間は、 通常 0.2〜96時間、 好ましくは 0.5〜24時間、 より好ましくは 1〜3 15 時間である。
次いでクロ口炭酸メチルを反応させる。 化合物 （V) に対しクロ口炭酸メチルは、 通常 1〜5当量、好ましくは 1〜2当量用いられる。 この段階ではまず 0〜2(T に冷却し てクロ口炭酸メチルを添加し、 その後加熱するのが好ましい。 加熱時の反応温度は、 通常 40〜200 であり、好ましくは 50〜 70 である。反応時間は合わせて通 20 常 0.2〜96時間、 好ましくは 0.5〜10時間、 より好ましくは約 1〜3時間である。
また化合物 （I I) は、 以下の参考製造法 2により、 化合物 （V I I) を塩化トリ クロロアセチルと反応させ、 化合物 （V I I I) を製造した後、 化合物 （V I I I) , とアンモニア又はアンモニアの弱酸性物質との塩とを反応させることによつても製 ' 造することができる。 '
25 文献例： Chem. Pharm. Bull., 26, 1633 (1978)
参考製造法 2
Figure imgf000045_0001
(VII) (VIII)
(式中の記号は前記と同意義を示す。 ） 前半の反応では、 化合物（V I I ) に塩基の存在下で塩ィ匕トリクロロアセチルを反 応させる。反応は無溶媒で行ってもよいが通常溶媒の存在下で行われる。 このような 溶媒としては製造例 2で記載した、 脂肪族炭化水素類、 芳香族炭化水素類、 エステル 類、 ケトン類、 エーテル類、 二トリル類、 酸アミド類、 環状アミド類、 リン酸アミド 類、 環状尿素類、 スルホキシド類、 スルホン類、 八ロゲン化炭化水素類等、 又はこれ らの混合物が用いられる。 塩基としては、 製造例 2で記載したような塩基が用いられ 、 特に有機塩基、 無機塩基が好ましく、 中でもトリエチルァミンが汎用される。 反応温度は、 通常— 5 0〜 1 0 0 X：であり、 好ましくは 0〜 2 0 :である。 反応時 間は一般には約 0..1〜9 6時間、 好ましくは 0 . 2〜5時間、 より好ましくは 0 . 5 〜 3時間である。
後半の反応では前半の反応で製造した化合物（V I I I ) にアンモニア又は系中で アンモニアを発生する化合物を反応させる。 このような化合物としては、炭酸アンモ 二ゥム、 ギ酸アンモニゥム、酢酸アンモニゥム等のアンモニアの弱酸性物質との塩が 用いられる。 反応は通常、 製造例 2で記載したような溶媒が用いられる。 好ましい溶 媒は、 酸アミド類、 環状アミド類、 リン酸アミド類、 環状尿素類、 スルホキシド類、 スルホン類等である。
反応温度は、 通常 2 0〜2 0 0 であり、 好ましくは 5 0〜 1 2 0 である。
反応時間は一般には 0 . 2〜9 6時間、 好ましくは 0 . 5〜1 0時間、 より好まし くは 1〜 5時間である。 化合物 （I I I ) は、 公知化合物を含み、 公知又はそれに準じる方法で製造するこ とができる。
例えば、 Yが塩素原子である場合には、 化合物 （I I I ) は、 化合物 （I ) に含まれ る化合物 （la) であり、 上記した方法で製造できる。 化合物 （ I V) 、 化合物 （V) 、 化合物 （V I ) 及び化合物 （V I I ) は、 通常公 知化合物であり、市販されているか公知の方法で製造することができる。特に化合物 (V I ) はグリニャール試薬と称される化合物であり、 市販品を使用してもよいが、 公知の方法で使用前に製造し、 単離 ·精製せずにそのまま用いることもできる。 上記の製造法 1、 2及び参考製造法 1、 2により製造される各化合物は、 公知の手段、 例えば濃縮、 減圧濃縮、 抽出、 転溶、 結晶化、 再結晶化、 クロマトグラフィー等の方 法によって、 単離 ·精製することができる。 一般式 （XI) で表される化合物 （以下、 化合物 （XI) と記すこともある。 ） または その農学的に許容される塩は、植物成長調節剤の有効成分として使用することができ る。 ある種の 2位に置換アミノ基を有するキナゾリン化合物は公知である （国際公開 第 2005/042501号パンフレット） 。
本発明の一般式 (XI) で表される化合物 （以下、 化合物 （XI) と記すこともある。 ) における R'1で表される基において、 「Cl-6アルキル基」 としては、 例えば、 メチ ル、 ェチル、 プロピル、 イソプロピル、 ブチル、 イソブチル、 sec-ブチル、 tert -ブ チル、 ペンチル、 3-メチルプチル、 へキシル等が用いられる。 「C3-6アルケニル基」 としては、 例えば、 ァリル、 2-ブテニル、 3-ブテニル、 3-メチル -2-ブテニル等が用 いられる。 「C3- 6アルキニル基」 としては、 例えば、 プロパルギル、 2 _ブチニル、 3 -ペンチニル等が用いられる。 「C4-6アルキル基」 としては、 例えば、 プチル、 イソ ブチル、 sec-ブチル、 tert -プチル、 ペンチル、 3-メチルブチル、 へキシル等が用い られる。 「Cl-3アルコキシカルポニルメチル基」 としては、 メトキシカルボ二ルメチ ル、 エトキシカルボニルメチル、 プロピルォキシカルボニルメチル、 イソプロピルォ キシカルボニルメチルが用いられる。 「Cl-3アルコキシ C1-3アルキル基」 としては、 例えば、 2-メトキシェチル、 2-メトキシプロピル、 3-メトキシプロピル、 2-エトキシ ェ.チル、 3-エトキシプロピル等が用いられる。 ここで前記の 「Π-6アルキル華」 、 「C3-6アルケニル基」 、 「C3-6アルキニル基」 及び「C4-6アルキル基」 は、 ヒドロキシル基、 C1-3アルコキシ基、 C1- 3アルコキシ力 ルポエル基、 シァノ基、 2 -フリル基及び 2-テトラヒドロフリル基の中から 1つ以上選 ばれる置換基を置換可能な位置に 1つ以上、 好ましくは 1ないし 3つ有していてもよく 、 置換基数が 2つ以上の場合には各置換基は同一又は異なっていてもよい。
これらの置換基として示される 「C1- 3アルコキシ基」 としては、 メトキシ、 ェトキ シ、 プロピルォキシ、 イソプロピルォキシが用いられ、 「Cl-3アルコキシカルポニル 基」 としては、 メトキシカルポニル、 エトキシカルポニル、 プロピルォキシカルボ二 ル、 イソプロピルォキシ力ルポニルが用いられる。 化合物 （XI) は酸付加塩を形成することがあるが、 かかる酸付加塩としては、 例え ば、 塩酸塩、 臭化水素酸塩、 ヨウ化水素酸塩、 リン酸塩、 硫酸塩、 硝酸塩及び過塩素 酸塩等の無機酸塩、 並びに、 ギ酸塩、 酢酸塩、 酒石酸塩、 リンゴ酸塩、 クェン酸塩、 シユウ酸塩、 コハク酸塩、 安息香酸塩、 ピクリン酸塩、 メタンスルホン酸塩及び P- トルエンスルホン酸塩等の有機酸塩が挙げられる。
また化合物 （XI) が力ルポキシル基、 フエノール性ヒドロキシル基、 活性メチレン 基等の酸性基を有する場合に形成しうる塩としては、 例えば、 アルカリ金属塩（リチ ゥム塩、 ナトリウム塩、 カリウム塩等） 及びアルカリ土類金属塩 （マグネシウム塩、 カルシウム塩、 バリウム塩等） 等の金属塩、 アンモニゥム塩、 並びに、 有機塩基 （例 えば、 ジメチルァミン、 トリェチルァミン、 ピぺラジン、 ピロリジン、 ピぺリジン、 2 _フエニルェチルァミン、 ベンジルァミン、 エタノールァミン、 ジエタノールアミ ン、 ピリジン、 コリジン等） との付加塩が挙げられる。
このように、 化合物 （XI) は、 上記のような農学的に許容される塩の形態であって もよい。
化合物（XI) が 1つ以上の不斉中心を有する場合には、 当該化合物には 2つ以上の立 体異性体 （例えば、 ェナンチォマー、 ジァステレオマー等) が存在する。 本発明化合 物には、 これらの立体異性体のすべて及びそれらのうちの任意の 2つ以上からなる混 合物が包含される。 . また化合物 （XI) が二重結合等に基づく幾何異性を有する場合には、 当該化合物に は 2つ以上の幾何異性体 （例えば、 E/Z又はトランス/シスの各異性体、 S—トランス ZS—シスの各異性体等） が存在する。 化合物 （XI) には、 これらの幾何異性体のす ベて及びそれらのうちの任意の 2つ以上からなる混合物が包含される。 一般式 （XI) において mが 1 3の整数であり、 nが 0である化合物とは、 キナゾ リン骨格の 6位が無置換であるもの、 すなわち一般式 （XI- 1)
Figure imgf000048_0001
(式中、 Phはフエ二ル基を示し、 R11は水素原子、 ホルミル基、 C卜 6アルキル基、 C3-6 アルケニル基又は C3-6アルキニル基を示し、 ここで前記のアルキル基、 アルケニル基 及びアルキニル基はヒドロキシル基、 C1- 3アルコキシ基、 C1- 3アルコキシカルポニル 基、 シァノ基、 2-フリル基及び 2-テドラヒドロフリル基の中から少なくとも 1つ以上 選ばれる置換基で置換されていてもよく、
m ' は 1 3の整数を示し、
X,は塩素原子、 臭素原子、 トリフルォロメチル基、 シァノ基又はニトロ基を示し、 m， が 2以上の場合 X,は同一又は異なる。
ただし、 m' が 1であり、 X,が塩素原子であり、 R11がメチル基を示す場合、 X,は 8- 塩素原子である。 )
で示される化合物を表す。 一般式 (XI) において nが 1である化合物とは、 キナゾリン骨格の 6位が X2で置換 されたもの、 すなわち一般式 （XI- 2)
Figure imgf000048_0002
(式中、 Phはフエ二ル基を示し、 R11は水素原子、 ホルミル基、 C1 - 6アルキル基、 C3-6 アルケニル基又は C3-6アルキニル基を示し、 ここで前記のアルキル基、 アルケニル基 及びアルキニル基はヒドロキシル基、 C1- 3アルコキシ基、 C1-3アルコキシカルポニル 基、 シァノ基、 2-フリル基及び 2-テトラヒドロフリル基の中から少なくとも 1つ以上 選ばれる置換基で置換されていてもよく、 ' mは 0〜3の整数を示し、
X,及び X2はそれぞれ同一又は異なり、 塩素原子、 臭素原子、 トリフルォロメチル基、 シァノ基又はニトロ基を示'し、
mが 2以上の場合 X,は同一又は異なる。
ただし、 下記（1)〜（3)のいずれかの条件を満たす場合、 mは 1〜3の整数を示す。
(1) X2が塩素原子であり、 R11が水素原子、 メチル基、 2-ヒドロキシェチル基、 3-ヒド ロキシプロピル基、 2， 2-ジメトキシェチル基及びシァノメチル基の中から選ばれる基 である。
(2) χ2が臭素原子であり、 R11が 2-ヒドロキシェチル基、 3-ヒドロキシプロピル基及び
2-メトキシェチル基の中から選ばれる基である。
(3) Χ2がニトロ基であり、 R11が 3-ヒドロキシプロピル基である。 ）
で示される化合物を表す。 化合物 (XI) の好ましい態様としては、 例えば、 以下に示される態様が挙げられる 一般式 (XI) において、
( 1 ) R11が水素原子、 ホルミル基、 メチル基、 ェチル基、 2-ヒドロキシェチル基、
3 -ヒドロキシプロピル基、 2-メトキシェチル基、 フルフリル基、 メトキシカルボニル メチル基又はエトキシカルポニルメチル基であり、 mが 0であり、 nが 1であり、 が塩素原子又は二ト口基である化合物。
( 2 ) R11が水素原子、 ホルミル基、 メチル基、 ェチル基、 2-ヒ.ドロキシェチル基、 2-メトキシェチル基、 フルフリル基、 メトキシカルボニルメチル基又はエトキシカル ポニルメチル基であり、 mが 1であり、 nが 1であり、 X,が 8-塩素原子であり、 X2 が塩素原子又は二ト口基である化合物。
( 3 ) mが 1〜3の整数であり、 nが 0である化合物。 ( 4 ) R11がホルミル基、 C4-6アルキル基、 C3-6アルケニル基又は C3-6アルキニル基 であり、 ここで前記のアルキル基、 アルケニル基及びアルキニル基はヒドロキシル基 又は C1-3アルコキシ基で置換されていてもよく、 また R11が C1-3アルコキシカルボ二 ルメチル基、 C1- 3アルコキシ C1-3アルキル基又はフルフリル基であり、 mが 0であり 、 nが 1であり、 X2が塩素原子である化合物。
( 5 ) nが 1である化合物。
( 6 ) mが 1〜3であり、 nが 1である化合物。
( 7 ) R11が C1-3アルコキシカルボニルメチル基又はフルフリル基である化合物。
( 8 ) nが 1であり、 X2がトリフルォロメチル基又はシァノ基である化合物。 化合物 （XI) は、 新規物質であり、 例えば、 以下の製造法 11により、 化合物 （XI I ) と化合物 （XI I I) とを反応させることにより製造することができる。
製造法 1 1
Figure imgf000050_0001
(XII) (XIII) (XI)
(式中、 Yは脱離基 （例えば、 フッ素、 塩素、 臭素、 ヨウ素等のハロゲン原子、 例え ば、 メタンスルホニルォキシ基、 ベンゼンスルホニルォキシ基、 P-トルエンスルホニ ルォキシ基等のアルカン若しくはアレーンスルホニルォキシ基、例えば、 メタンスル ホニル、 ベンゼンスルホニル、 フエニルメタンメタンスルホニル等のアルカン、 ァレ ーン若しくはァレーンアルカンスルホニル基等） を示し、他の記号は前記と同意義を 示す。 ）
上記反応は無溶媒で行ってもよく、 溶媒を使用してもよい。 溶媒としては、 例えば 、 ペンタン、 へキサン、 ヘプタン、 石油エーテル、 シクロへキサン等の脂肪族炭化水 素類、 酢酸メチル、 酢酸ェチル、 ギ酸ェチル、 プロピオン酸ェチル等のエステル類、 アセトン、 メチルェチルケトン等のケトン類、 ジェチルエーテル、 メチル ter t -プチ ルエーテル、 ジイソプロピルエーテル、 ジブチルエーテル、 テトラヒドロフラン、 ジ ォキサン等のエーテル類、 メタノール、 エタノール、 イソプロパノール等のアルコー ル類、 ァセトニトリル、 プロピオ二トリル等の二トリル類、 ジメチルホルムアミド、 ジメチルァセトアミド等の酸アミド類、 1—メチル _ 2—ピロリドン等の環状アミド類 、 へキサメチルホスホルアミド等のリン酸アミド類、 1， 3—ジメチルー 2 _イミダゾ リジノン等の環状尿素類、 ジメチルスルホキシド等のスルホキシド類、 スルホラン等 のスルホン類、 ジクロロメタン、 クロ口ホルム、 1， 2—ジクロロェタン、 四塩化炭素 等のハロゲン化炭化水素類、 ピリジン、 ピコリン、 ルチジン、 キノリン等の芳香族ァ ミン類、 及びこれらの混合溶媒、 水、 さらにはこれらと水との混合溶媒等が挙げられ る。
水との混合溶媒が用いられ、 反応が均一系でない場合には、 相間移動触媒（例えば 、塩化べンジルトリェチルアンモニゥム、臭化テトラプチルアンモニゥム等の四級ァ ンモニゥム塩、 18-クラウン- 6等のクラウンエーテル類等） を使用してもよい。
塩基としては、 例えば、 ナトリウムェチラート、 ナトリウムメチラ一ト、 カリウム ter t-ブトキシド等のアルカリ金屑のアルコラ一ト、 例えば、 ピリジン、 ピコリン、 ルチジン、 キノリン、 トリェチルァミン、 ジイソプロピルェチルァミン、 4—ジメチ ルアミノビリジン、 N， N—ジメチルァニリン等の有機塩基、 例えば、 炭酸カリウム、 炭酸ナトリゥム、 水酸化ナ卜リゥム、 水酸化力リゥム、 炭酸水素ナ卜リゥム、 炭酸水 素カリウム等の無機塩基、 例えば、 水素化リチウム、 水素化ナトリウム、 水素化カリ ゥム等の金属水素化物、 例えば、 ブチルリチウム、 リチウムジイソプロピルアミド等 の有機リチウム試薬等が挙げられる。
用いられる塩基の量は反応に悪影響を及ぼさない量であれば特に限定されず、溶媒 を兼ねて大過剰量用いることもできる。
化合物 （XI I I) がァミン類である場合には、 過剰量の化合物 （XI I I) を塩基及び溶 媒を兼ねて使用することもできる。
反応温度は、 通常一 5 0〜2 0 0でであり、 好ましくは室温〜 1 5 である。 反応時間は、 通常 0. 1〜96時間、 好ましくは 0. 1〜72時間、 より ましくは 0. 1〜24 時間である。
化合物 （XI I I) がアンモニア、 メチルァミン、 ェチルァミン等の低沸点化合物であ る場合や反応の進行が遅い場合には、 耐圧密閉容器を使用し、 40〜150 程度に加熱 し、 加圧下 （例えば、 1. 1気圧〜 100気圧） で反応させることもできる。 化合物 （XI I) は、 公知化合物を含み、 公知又はそれに準じる方法で製造すること ができる。 例えば、 Yが塩素原子である化合物 （Xl la) は、 例えば、 以下の参考製造 法 11により、 化合物 （XIV) をォキシ塩化リンと加熱することにより製造することが できる。 〗
文献例：特開昭 62— 145073
参考製造法 11
Figure imgf000052_0001
(式中の記号は前記と同意義を示す。 ）
上記反応は、反応に支障のない溶媒中で行ってもよいが、通常無溶媒で過剰暈のォ キシ塩化リン （化合物 （XIV) に対し 5当量〜 30当量） を使用する。
反応温度は、 通常 80〜20(TCであり、 好ましくは 90 〜還流 （105 ） である。 反応時間は、 通常 0. 1〜96時間、 好ましくは 0. 5〜5時間、 より好ましくは 0. 5〜2時 間である。 還流下でも反応の進行が遅い場合には、 耐圧密閉容器を使用し、 200 程 度まで加熱し、 加圧下 （例えば 1. 1気圧〜 100気圧） で反応させることもできる。 化合物 （XIV) は、 公知化合物を含み、 公知又はそれに準じる方法で製造すること ができる。 例えば、 以下の参考製造法 12により、 化合物 （XV) を化合物 （XVI) 及び クロ口炭酸メチルと反応させることにより製造することができる。
文献例： Tetrahedron 42, 3697 (1986)
参考製造法 12
Figure imgf000052_0002
(XV) (XIV)
(式中、 Zは塩素、 臭素、 ヨウ素等のハロゲン原子を示し、 他の記号は前記と同意義 を示す。 ） 上記反応では、 まず化合物 （XV) と化合物 （XVI) とを反応させる。 通常溶媒を使 用し、 例えば、 ペンタン、 へキサン、 ヘプタン、 石油エーテル等の脂肪族炭化水素類 、 ベンゼン、 トルエン、 キシレン等の芳香族炭化水素類、 ジェチルェ一テル、 メチル tert -ブチルエーテル、 ジイソプロピルエーテル、 ジブチルエーテル、 テ卜ラヒドロ フラン、 ジォキサン等のエーテル類又はこれらの 2種以上の混合物が用いられる。 化合物 （XV) に対し化合物 （XVI) は通常 1〜5当量、 好ましくは 2〜 2 . 5当量用い られる。
反応温度は、 通常 4 0〜1 0 0 であり、 好ましくは 5 0〜7 0でである。
反応時間は、 通常 0. 2〜9 6時間、 好ましくは 0. 5〜2 4時間、 より好ましくは 1〜3 時間である。
次いでクロ口炭酸メチルを反応させる。 化合物 （XV) に対しクロ口炭酸メチルは、 通常 1〜5当量、好ましくは 1〜2当量用いられる。 この段階ではまず 0〜20 に冷却し てクロ口炭酸メチルを添加し、 その後加熱するのが好ましい。 加熱時の反応温度は、 通常 4 0〜2 0 であり、好ましくは 5 0〜 7 O t:である。反応時間は合わせて通 常 0. 2〜9 6時間、 好ましくは 0. 5〜10時間、 より好ましくは約 1〜3時間である。 また化合物 （XIV) は、 以下の参考製造法 13により、 化合物 （XVI I) を塩化トリク 口ロアセチルと反応させ、 化合物 （XVI I I) を製造した後、 化合物 （XVI I I) とアンモ ニァ又はアンモニアの弱酸性物質との塩とを反応させることによつても製造するこ とができる。
文献例： Chem. Pharm. Bul l . , 26, 1633 (1978)
参考製造法 13
Figure imgf000053_0001
(式中の記号は前記と同意義を示す。 ）
前半の反応では、 化合物（XVI I) に塩基の存在下で塩化トリクロロアセチルを反応 ざせる。上記反応は無溶媒で行ってもよいが通常溶媒の存在下で行われる。 このよう な溶媒としては前記製造法 11で記載された、 脂肪族炭化水素類、 芳香族炭化水素類、 エステル類、 ケトン類、 エーテル類、 二トリル類、 酸アミド類、 環状アミド類、 リン 酸アミド類、 環状尿素類、 スルホキシド類、 スルホン類、 ハロゲン化炭化水素類等、 又はこれらの混合物が用いられる。
塩基としては、 前記製造法 11で記載されたような塩基が用いられ、 特に有機塩基、 無機塩基が好ましく、 中でもトリエチルァミンが汎用される。
反応温度は、 通常— 5 0〜 1 0 0 であり、 好ましくは 0〜2 0 である。
反応時間は、 通常約 0. 1〜 9 6時間、 好ましくは 0 . 2〜 5時間、 より好ましくは 0 . 5〜 3時間である。
後半の反応では、 前半の反応で製造された化合物 （XVI I I) にアンモニア若しくは 系中でアンモニアを発生する化合物を反応さ-せる。 このような化合物としては、炭酸 アンモニゥム、ギ酸アンモニゥム、酢酸アンモニゥム等のアンモニアの弱酸性物質と の塩等が挙げられる。 上記反応は、 通常、 前記製造法 11で記載されたような溶媒が用 レ られる。 好ましい溶媒は、 酸アミド類、 環状アミド類、 リン酸アミド類、 環状尿素 類、 スルホキシド類、 スルホン類等である。
反応温度は、 通常 2 0〜2 0 0 であり、 好ましくは 5 0〜1 2 0 である。 反応時間は、 通常 0 . 2〜9— 6時間、 好ましくは 0 . 5〜 1 0時間、 より好ましく は 1〜5時間である。
化合物 （XI I I) 、 化合物 （XV) 、 化合物 （XVI) 及び化合物 （XVI I) は、 通常、 公 知化合物であり、 市販されているか公知の方法で製造することができる。
特に化合物 （XVI) はグリニャール試薬と称される化合物であり、 市販品を使用し てもよいが、 公知の方法で使用前に製造し、 単離 ·精製せずにそのまま用いることも できる。
このような製造法 11及び参考製造法 11、 12、 13等により製造される各化合物は、 公 知の手段、 例えば、 濃縮、 減圧濃縮、 抽出、 転溶、 結晶化、 再結晶化、 クロマトダラ フィ一等の方法によつて単離 ·精製することができる。 本発明における植物の成長調節は、通常、植物成長調節剤の有効量を植物又はその 生息場所に施用することにより.行われる。
本発明の植物成長調節剤を農林用として用いる場合には、その施用量は通常 1 0 0 01112の量で0 . 0 1〜1 0 0 0 gである。 植物成長調節剤が乳剤、 水和剤、 フロア ブル剤、マイクロカプセル剤等に製剤化されたものである場合には、通常有効成分濃 度が 0 . 0 0 1〜 1 0 0 0 0 p p mとなるように水で希釈して散布することにより施 用し、植物成長調節剤が粒剤、粉剤等に製剤化されたものである場合には、通常その まま施用する。
このようにして製剤化された本発明の植物成長調節剤は、例えば、 そのままで、 又 は、水等で希釈して、耕作地の土壌の植物の根の生長を促進させる目的で当該土壌に 処理することにより使用してもよい。また、 シート状やひも状等に加工した樹脂製剤 を作物に巻き付ける、作物の近傍に張り渡す及び Z又は株元の土壌表面に敷く等の方 法で使用することもできる。また、本発明の植物成長調節剤は植物に対して茎寒処理 又は芽に処理することにより使用することができ、作物の苗を植え付ける前の苗床や 植付けの時に植穴ゃ株元に処理することにより使用することもできる。当該植物成長 調節剤は、 対象植物に対して、 1回もしくは複数回処理する。
本発明の植物成長調節剤を植物体に茎葉処理することにより用いる場合又は土壌 に処理することにより用いる場合、 その処理量は製剤形態、 施用時期、 施用方法、 施 用場所、 対象植物により変わり得るが、 1ヘクタール当り通常 0 . l〜1 0 0 0 0 g である。 また、 当該植物成長調節剤を水に希釈して用いる場合の使用濃度としては、 製剤形態、 施用時期、 施用方法、 施用場所、 対象植物により変わり得るが、 一般には 0 . 0 0 1〜1 0 0 0 0 p p mで、 望ましくは 0 . 0 1〜： 1 0 0 0 p p mである。 また、 本発明の植物成長調節剤は移植前の植物に処理して使用することができる。 移植前の植物に直接吸収させる場合は、使用濃度として、 0 . 0 0 1 p p m〜l 0 0 O O p p mに希釈又は懸濁した液に、植物の根部又は全体を浸漬して使用することが できる。
また、製剤化された本発明の植物成長調節剤は対象植物の種子に直接処理して使用 することができる。例えば植物の種子を本発明の植物成長調節剤における有効成分の 濃度が 1〜1 0 0 0 0 p p mに調製した本発明の植物成長調節剤に種子を浸漬する 方法、植物の種子に本発明の植物成長調節剤における有効成分の濃度が 1〜1 0 0 0 0 p p mの本発明の植物成長調節剤を噴霧もしくは塗沫する方法及び植物の種子に 本発明の植物成長調節剤を粉衣する方法が挙げられる。
また、本発明の植物成長調節剤は水耕栽培における水耕液に混合して用いてもよく 、 また組織培養における培地成分の 1つとして用いてもよい。水耕栽培に使用する場 合は、通常用いられる園試等の水耕栽培用の培地に培地中濃度として 0 . 0 0 1 p p m〜l 0 0 0 0 p p mの範囲で溶解又は懸濁して用いることができる。また組織培養 や細胞培養時に使用する場合は、通常用いられる M S培地等の植物組織培養用の培地 に、培地中濃度として 0 . 0 0 1 p p m〜1 0 0 0 0 p p mの範囲で溶解又は懸濁し て用いることができる。 この場合、 定法に従い、 炭素源としての糖類、 各種植物ホル モン等を適宜加えることができる。 本発明の植物成長調節剤は他の殺菌剤、 殺虫剤、 殺ダニ剤、 殺線虫剤、 除草剤、 植 物生長調節剤及び Z又は肥料と共に用いることもできる。
これらの施用量、 施用濃度は、 いずれも製剤の種類、 施用時期、 施用場所、 施用方 法、植物の種類、期待する効果程度の等の状況によって異なり、 上記の範囲にかかわ ることなく増減させることができ、 適宜選択することができる。
以上に示した植物成長調節方法に、 前記の植物成長調節剤を用いることができる。 また一方、 前記の、 群 Aから選択されるサイトカイニン受容体を用いた第一工程、 第二工程を有する、 被験物質が有する植物の根の生長を促進させる能力の検定方法、 によって評価された植物の根の生長を促進させる能力を有する物質を特定し、特定さ れた植物の根の生長を促進させる能力を有する物質と植物とを接触させることによ つて植物の根の生長を促進させることも可能である。ここで特定された植物の根の生 長を促進させる能力を有する物質と植物とを接触させる方法としては、前記の製剤方 法、 施用方法等を用いることが出来る。 本発明の植物成長調節剤はイネの直播栽培時の根部生育促進による苗立ちの向上、 活着率の向上を目的として使用できる。また本発明の植物成長調節剤はイネ育苗箱栽 培時の根部生育促進を目的としても利用できる。また本発明の植物成長調節剤はゴル フ場のグリーンの根張り改善と耐暑 *耐乾燥性の向上を目的として使用できる。ダイ ズ、 トウモロコシ、 コムギ等の作物では、 根張り向上、 早期の苗立ちの確立による生 産性の向上又は除草剤の削減を目的として使用できる。 トマト、ペッパー等の栽培で は移植時の活着率の向上を目的として使用できる。野菜等の苗生産においては、本発 明の植物成長調節剤の使用により均一な苗立ちの確立による機械移植の効率化が期 待できる。
本発明の植物成長調節剤を用いて、植物の頂芽優勢を制御することができる。例え ば、本発明の植物成長調節剤を用いてタバコ、バラ等の腋芽抑制に利用することがで きる。 また、 果樹作物、 花卉植物等の花芽形成を制御することにより、 摘花剤として 利用することができる。また花芽を増やすことにより果樹作物の増収又は花卉植物の 品質を向上させることができる。また、果樹作物等の枝の生長を抑制することにより 枝数を減らし、又は促進することにより枝数を増やし、樹体生長の制御に利用するこ ともできる。
本発明の植物成長調節剤を用いて、カルスへの脱分化若しくはカルスからの再分化 等の組織培養技術に利用することができる。例えば、本発明の植物成長調節剤を用い て植物組織からのカルス化を促進することができる。またダイズ等の不定胚からの再 分化効率を向上させることができる。
本発明の植物成長調節剤を用いて植物の老化を制御するができる。例えば、本発明 の植物成長調節剤を用いて力一ネーション等花卉植物の切花の老化抑制、花持ち改良 に利用することができる。 また、 野菜、 果物等の成熟抑制に利用することもできる。 また水稲の苗等における葉の老化を防止し、健苗育成することができる。 また、 ヮタ 等の植物の収穫前に処理することにより、 葉の老化を促進させることができる。 前記の群 Bに示されるアミノ酸配列からなる植物由来のサイトカイニン受容体は、 研究ツールとして使用することができる。例えば、前記の植物の根の生長を促進させ る能力の検定や、 植物の生長若しくは分化を制御する能力を有する化学物質の探索、 等の研究を実施するための研究ツールとして使用することができる。 また、 例えば、 サイトカイニン受容体に作用する薬剤の作用機構を解析する研究においても、サイ卜 カイニン受容体は研究ツールとして利用可能である。 .
また、前記の群 Bに示されるアミノ酸配列をコ一ドするポリヌクレオチドゃそれら に対して相補性を有する塩基配列を有するポリヌクレオチド、また前記の群 Bに示さ れるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドの部分塩基配列又はその部分塩基 配列に対して相補性を有する塩基配列を有するポリヌクレオチド、配列番号 3又は 4 で示される塩基配列からなるポリペプチドは、研究ツールとして使用することができ る。例えば、 これらの一部は、 前記のようにサイトカイニン受容体の製造法に用いら るポリヌクレオチドとして機能する。 また一部は、 前記のようにして、 P C Rを用 いるポリヌクレオチド群 Bに示されるポリヌクレオチドの取得、或いは、ハイブリダ ィゼーシヨンを用いるポリヌクレオチド群 B.に示されるポリヌクレオチドの取得、等 を実施するための重要な研究ツールとして使用できる。
特に、植物成長調節剤のスクリーニングを実施するにあたっては、スクリーニング のために実施する実験の実験ツールとして使用できる。具体的には、前記の植物の根 の生長を促進させる能力の検定や、植物の生長若しくは分化を制御する能力を有する 化学物質の探索、等を実施するにあたって行う実験のための実験ツールとして使用す ることができる。 さらに本発明は、被験物質について、 当該被験物質が有する、 細胞が有する植物由 来のサイトカイニン受容体からの細胞内信号伝達を阻害する活性 (or細胞内信号伝達 の有無若しくはその量）に係るデータ情報を入力 ·蓄積 ·管理する手段 （以下、 手段 aと記すこともある。 ） 、 前記データ情報を所望の条件に基づき照会，検索する手段 (以下、 手段 bと記すこともある。 ） 、 及び、 照会 ·検索された結果を表示 ·出力す る手段 （以下、 手段 cと記すこともある。 ） を具備することを特徴とするシステム （ 以下、 本発明システムと記すこともある。 ） をも含むものである。 まず、 手段 aについて説明する。 手段 aは、 前記のとおり、 前記被験物質が有する 、細胞が有する植物由来のサイトカイニン受容体からの細胞内信号伝達を阻害する活 性に係るデータ情報を入力した後、入力された当該情報を蓄積 ·管理する手段である 。 かかる情報は、 入力手段 1により入力され、 通常記憶手段 2に記憶される。 入力手 段としては、例えばキーボード、マウス等の当該情報の入力可能なものが挙げられる 。 当該情報の入力及び蓄積 '管理が完了すれば、 次の手段 bに進む。 尚、 当該情報の 蓄積'管理 は、 コンピュータ等のハードウェアと O S及びデータベース管理等のソ フ卜ウェアとを用いて、 デ一夕構造を有する情報を入力し、適当な記憶装置、 例えば 、 フレキシブルディスク、 光磁気ディスク、 C D— R〇M、 D V D - R OM, ハード ディスク等のコンピュータ読取可能な記録媒体に蓄積することにより、大量のデータ
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を効率良く蓄積し管理すればよい。 8
手段 bについて説明する。 手段 bは、 前記のとおり、 手段 aにより蓄積，管理され た前記データ情報を所望の結果を得るための条件に基づき照会 ·検索する手段である 。 かかる情報は、 入力手段 1により照会 ·検索のための条件が入力され、 通常記憶手 段 2に記憶された上記情報の中で当該条件に合致したものを選択すれば、次の手段 c に進む。 選択された結果は、 通常、 記憶手段 2に記憶され、 さらに表示 ·出力手段 3 により表示可能となっている。 手段 cについて説明する。 手段 cは、 前記のとおり、 照会 ·検索された結果を表示 •出力する手段である。 表示 ·出力手段 3としては、 例えばディスプレイ、 プリンタ 等が挙げられ、 当該結果をコンピュータのディスプレイ装置に表示するか、印刷等に より紙上に出力するか等すればよい。 実施例
以下、実施例を挙げてさらに詳細に本発明を説明するが、本発明はこれらに限定さ れるものではない。 以下に合成例及び参考合成例を示し、本発明で用いられる化合物（I ) をより具体 的に説明するが、 化合物 （I ) はこれらの例に限定されない。 合成例及び参考合成例において、 「室 ί¾」 とは、 通常 10- 30 を示す。 ΠΗ NMRJ とは、 プロトン核磁気共鳴スペクトルを示し、 内部標準としてテトラメチルシランを 用いて日本電子 JNM-AL400型スぺクトロメータ一 （400MHz) で測定し、 ケミカルシフ ト （δ) を ppmで表記した。 「Mp」 とは、 融点を示し、 メトラー （Mettler) FP61型融 点測定装置で測定した。
下記合成例、参考合成例及び表 3〜表 7中で用いられている記号は以下の意味を有 する。 「CDC13」 ：重クロ口ホルム、 「DMS0-d6」 ：重ジメチルスルホキシド、 「s」 ： シングレット、 「d」 ：ダブレット、 「t」 ： トリプレット、 「q」 ：カルテット、 「dd」 ：ダブルダブレット、 「m」 ：マルチプレット、 「br」 ：ブロード （幅広い） 、 「J」 ：カップリング定数、 「Me」 ：メチル、 「Et」 ：ェチル、 「Pr」 ：プロピル 、 「i- Pr」 ：イソプロピル、 「t- Bu」 ：タ一シャリーブチル、 「Ph」 ：フエニル、 「 Ac J ：ァセチル、 「THF」 ：テトラヒドロフラン、 「DMF」 ： N， N-ジメチルホルムアミ ド、 「DMS0」 ：ジメチルスルホキシド、 「MTBE」 ：メチル夕一シャリーブチルエーテ ル 合成例 1 (2， 8—ジクロ口— 4—フエニルキナゾリン （化合物 No. Ial-11) の製 造）
8—クロ口— 4—フエニル— 2 (1H) —キナゾリノン （化合物 No. 11-11) 1. 2 4 gにォキシ塩化リン 6. 65 gを加え、 これを 95でで 1時間攪拌した。 得られた 反応液を氷水 200mlに注ぎ加えた後、 これに重曹を加えて pH.9にした。 次いで、 析出 した結晶をろ取した。回収物をエタノールで再結晶することにより標記化合物 1. 0 7 gを得た。 Mp.l54.4.t：。 'Η MR (CDC13)： 7.52-7.65 (4H, m), 7.76-7.80 (2H, m), 8.02-8.08 (2H, m). 合成例 2 (2—アミノー 6, 8—ジクロ口— 4—フエニルキナゾリン （化合物 No. IC12-4) の製造）
2， 6， 8—トリクロ口— 4_フエニルキナゾリン （化合物 No. Ia卜 12) 300m g.、 28%アンモニア水溶液 30 g及びァセトニトリル 6mlの混合物を耐圧反応容 6.0 器中、 1 0 5 で1. 5時間反応させた。 得られた反応液を冷却した後、 これを水 1 00m lに注ぎ加えた。 当該混合物に酢酸ェチル 60m lを加え抽出し、得られた抽 出物を濃縮した。 得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー (クロ口ホル ム）で精製することにより標記化合物 2 3 Omgを得た。 Mp.212.7 。 'H NMR (CDC13)： 5.56 (2H, br. s), 7.54-7.60 (3H, m), 7.63-7.68 (2H, m), 7.74 (1H, d, J = 2.3 Hz), 7.79 (1H, d, J = 2.3 Hz). 合成例 3 ( 6 クロ口 2 フルフリルァミノ 4 フエ二ルキナゾリン（化合物 No. Ic3-16) の製造）
2, 6—ジクロロー 4 フエニルキナゾリン （化合物 No. Ia卜 3) 2 7 5mg及びフル フリルァミン 486mgの混合物を 8 5 で 40分間攪拌した後、これを水 5 0mlに注 ぎ加えた。 当該混合物を酢酸ェチルで抽出し、 得られた抽出物を水洗後濃縮した。 得 られた残渣をエタノール再結晶することにより標記化合物 2 8 Omgを得た。
Mp.142. Ot:. Ή NMR (CDC13)： 4.77 (2H, d, J = 5.6 Hz), 5.70 (1H, br. t， J 5.6 Hz), 6.29-6.32 (2H, m), 7.36 (1H， dd， J = 1.8， 0.9 Hz), 7.53-7.70 (7H, m), 7.78 (1H, d, J = 2.2 Hz). 合成例 4 (6 _クロ口— 2 エトキシカルポニルメチルァミノ _4_フエ二ルキナ ゾリン （化合物 No. Ic3-33) の製造）
2, 6—ジクロ口— 4 フエニルキナゾリン （化合物 No. Ial-3) 5 5 Omg及びグ リシンェチルエステル塩酸塩 4 1 9mgに DMF 3m l及びトリェチルァミン 6 0 7mgを加え、 これを 8 5でで 5. 5時間攪拌した。 得られた反応液を水 1 00 m 1に注ぎ加えた後、 酢酸ェチルで抽出し、 抽出物を濃縮した。 得られた残渣をシリカ ゲルカラムクロマトグラフィー（へキサン： 酢酸ェチル =6 ： 1〜3 ： 1)で精製す ることにより標記化合物 503mgを得た。 Mp.146. l ：。 1 H NMR (CDC13)： 1.30 (3H, t, J = 7.2 Hz), 4.25 (2H, q, J = 7.2 Hz), 4.31 (2H, d， J - 5.2 Hz), 5.97 (1H， br. s), 7.54-7.63 (5H, m), 7.67-7.70 (2H, m), 7.79 (1H, s). 合成例 5 (6—クロロー 2—メトキシアミノー 4一フエニルキナゾリン（化合物 No. Ic3-32) の製造）
2, 6—ジクロ口— 4一フエニルキナゾリン （化合物 No. Ial-3) 275mg、 ァセ トニトリル 10m 1及びメトキシァミン塩酸塩 334mgの混合物にトリェチルァ ミン 506mgを滴室温下で滴下して得られた混合物をステンレス製耐圧反応容器 に仕込み、 これを 105でで 3. 5時間反応した。 冷却後、 反応液を水 100m 1に 注ぎ加えた。 当該混合物を酢酸ェチルで抽出し、 得られた抽出物を水洗後、 濃縮した 。 得られた残渣.をシリカゲルカラムクロマトグラフィー （へキサン：酢酸ェチル = 3
6
： 1) で精製することにより粗結晶 1 56mgを得た。 さらに、 これを酢酸ェチル再 結晶することにより標記化合物 55mgを得た。 Mp.173.9 。 "HNMR (CDC13)： 3.98 (3H， s)， 7.47-7.72 (6H， m), 7.87 (1H， d，— J = 9.0 Hz), 7.89 (1H, d， J = 2.2 Hz), 8.03 (1H, br. s). 合^ ¾例 6 (6_クロロー 2— （2—ヒドロキシェチルチオ） —4—フエニルキナゾ リン （化合物 No. Ie3-1) の製造）
2—メルカプトエタノール 86mgの DMF 7. 5 m 1溶液に水素化ナトリウム（ 60%) 44mgを加え、 これを室温で 30分撹拌した。 反応混合物に 2, 6—ジク ロロ _4_フエニルキナゾリン （化合物 No. Ial-3) 275mgを加え、 これを室 温でさらに 2時間撹拌した。反応液を水 100mlに注ぎ加え、酢酸ェチルで抽出し 、得られた抽出物を濃縮した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー (酢酸ェチル：へキサン = 1 ： 5) で精製することにより標記化合物 266mgを得 た。 Mp.124.4：。 'Η NMR (CDC13): 3.50 (2H, t, J = 5.5 Hz), 3.64 (1H, br. t), 4.07 (2H, q-like, J = 5.5 Hz), 7.57-7.61 (3H, m), 7.71-7.74 (2H, m), 7.77 (1H, dd, J = 8.9, 2.3 Hz), 7.85 (1H, d, J = 8.9 Hz), 7.97 (1H, d, J = 2.3 Hz). 合成例 7 (6—クロ口— 2—ホルムアミドー 4—フエニルキナゾリン （化合物 No. Ic3-35) の製造）
乾燥ホルムアミド 54mgの DMF 5 m 1溶液に水素化ナトリウム（60%) 48 mgを加え、 これを室温で 30分撹拌した。 反応混合物に 2, 6—ジクロロー 4ーフ ェニルキナゾリン （化合物 No. Ial-3) 275mgを加えた後、 85 X：に加温し、 3時間撹拌した。 得られた反応液を水 100m 1に注ぎ加え、 酢酸ェチルで抽出し、 抽出物を濃縮した。得られた残渣をシリ力ゲル力ラムクロマトグラフィー（酢酸ェチ ル：へキサン = 1 ： 3) で精製することにより標記化合物 64mgを得た。 Mp.252.1 „ Ή NMR: 7.59-7.66 (3H, m)， 7.72-7.81 (3H， m), 7.88 (1H, d, J = 8.8 Hz), 8.02 (1H, d， J = 2.0 Hz), 8.37 (1H， br. d， J = 10.4 Hz), 9.71 (1H， d， J = 10.4 Hz). 合成例 8 (6—クロ口— 2— (1—メチルヒドラジノ） —4—フエニルキナゾリン (化合物 No. Ic3-27) の製造） - 2, 6—ジクロ口— 4—フエニルキナゾリン （化合物 No. Ial-3) 275mg及び モノメチルヒドラジン 46 lmgの混合物を 85 で 30分間攪拌した。得られた反 応物を冷却した後、 これに水 20 Om lを加えた。析出した結晶をろ取し、 回収物を カラムクロマトグラフィー（酢酸ェチル）で精製することにより標記化合物 225m gを得た。 Mp. 155.9t：。 'H NMR (CDC13)： 3.52 (3H, s)， 4.65 (2H, s), 7.54-7.63 (5H, m), 7.70-7.74 (2H, m), 7.80 (1H, d, J = 2.0 Hz). 合成例 9 (2 - (2—アミノエトキシ） —6—クロロー 4一フエニルキナゾリン （ 化合物 No. Id3-1) の製造）
2, 6—ジクロロ— 4—フエニルキナゾリン （化合物 No. Ial-3) 500mgと N - (2—ヒドロキシェチル） フタルイミド 382 mgとを合成例 6に準じて反応させ 、 6 _クロ口— 4 _フエニル一 2— (2—フタルイミドエトキシ） キナゾリン 380 mgを得た。 Mp. 154.7 ：。 NMR (CDC13)： 4.25 (2H, t, J = 5.8 Hz), 4.84 (2H, t， J = 5.8 Hz)， 7.53-7.60 (3H, m) , 7.67-7.71 (3H， m)， 7.72-7.76 (3H, m)， 7.78-7.82 (2H, m), 7.97 (1H, d， J = 2.2 Hz).
6—クロ口— 4—フエニル一 2— (2—フタルイミドエトキシ）キナゾリン 380 mg、 抱水ヒドラジン 7 Omg及びエタノール 6m 1の混合物を 2時間加熱還流した 。 得られた反応液に水 1. 2mlを加えた後、 エタノールを留去した。 得られた残留 物に濃塩酸 1. 5m lを加えた後、 これを 1時間加熱還流した。 得られた反応物を冷 下時飽和重曹水に注ぎ加え、酢酸ェチルで抽出し、抽出物を濃縮することにより標記 化合物 240mgを得た。 Mp.134.9 。 Ή NMR (CDC13)： 3.59-3.63 (2H, m), 3.84 (2H, t， J - 4.6 Hz), 6.15 (2H, br. s), 7.53-7.59 (5H, m), 7.63-7.67 (2H, m), 7.75 (1H, d， J = 1.2 Hz). 合成例 10 (2 _ (2 _ァセチルチオェチルァミノ） — 6—クロ口— 4—フエニル キナゾリン （化合物 No. Ic3-14) の製造).
トリフエニルホスフィン 292mgの脱水 THF 3m 1溶液に、氷冷下でジイソプ 口ピルカルポジイミド 40%トルエン溶液 5- 63mgを滴下し、 20分間撹拌した。 得られた懸濁液に氷冷卞 6—クロ口— 2— （2—ヒドロキシェチルァミノ） —4—フ ェニルキナゾリン （化合物 No. Ic3-1) 167mgの脱水 THF 2m 1溶液を滴下し 直にチォ酢酸 127mgを滴下した。得られた黄色透明溶液を氷冷下で 1時間、室温 で 1時間撹拌した後、 これを飽和重曹水に注ぎ加え、 クロ口ホルムで抽出し 抽出物 を濃縮した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー （クロ口ホルム： 酢酸ェチル = 10 : 1)で精製することにより標記化合物 17 Omgを得た。 Mp.128.9 で。 'Η NMR'(CDC13) ： 2.34 (3H, s), 3.22 (2H， t, J = 6.5 Hz), 3.73 (2H, q, J = 6.5 Hz), 5.74 (1H, br. t, J = 6.5 Hz), 7.53-7.62 (5H， m), 7.65-7.70 (2H, m), 7.77 (1H, s；)。 合成例 1 1 (6_クロ口— 2_ (2—メルカプトェチルァミノ） _4一フエニルキ ナゾリン （化合物 No. Ic3-13) 及びビス [2— (6—クロ口 _4_フエニル— 2—キ ナゾリニル） アミノエチル]ジスルフイド （化合物 No. Ic3-15) )
2 - (2 _ァセチルチオェチルァミノ） —6_クロ口— 4—フエニルキナゾリン （ 化合物 No. Ic3-14) 108mg、 エタノール 2m 1及び 10 %水酸化ナトリウム水溶 液 362 mgの混合物を室温で 2時間加熱還流下で 30分間撹拌した後、反応液から 不溶物をろ取した。 回収物 （固体） をシリカゲルカラムクロマトグラフィー （クロ口 ホルム：酢酸ェチル =10 ： 1) で精製することにより、 まず 6_クロ口—2— (2 —メルカプトェチルァミノ） —4一フエニルキナゾリン 5 Omgを得た。 Mp.165.9 ：。 Ή NMR (CDC13)： 1.46 (1H, t, J = 8.5 Hz), 2.84 (2H， q-like, J=7.2 Hz), 3.66 (2H, q-like, J=6.4 Hz), 5.79 (1H， br. t, J = 5.4 Hz), 7.55-7.57 (3H， m), 7.60 (2H， s), 7.66-7.69 (2H, m)， 7.77-7.78 (1H, m)。 次いでビス [2— （6—ク ロロ— 4—フエ二ルー 2—キナゾリニル） アミノエチル]ジスルフイ ド （下式で示さ れる化合物）
Figure imgf000065_0001
28mgを得た。 Mp.159.2 。 'HNMR (CDC13)： 3.02 (4H, t, J-6.4 Hz), 3.89 (4H， q, J=6.4 Hz), 5.81 (2H， br. t, ' J=6.4 Hz), 7.51-7.61 (10H， m), 7.63-7.68 (4H, m), 7.75 (2H， d, J = 2.2Hz)。 上記の合成例と同様にして製造可能な化合物及び市販されていて入手可能な化合 物の例を表 3、 表 4、 表 5及び表 6に記載する （上記合成例で製造した化合物も含む
) o
尚、 表 4及び表 5中にある注釈 「a)」 、 「b)」 、 「c)」 及び 「d)」 は以下の通りで ある。
表 3
Figure imgf000066_0001
化合物 No. R Ar (X)„ 融点 CC)
Ial-1 CI Ph 5-C1 125.7
Ial-2 CI Ph 6-F 131.9
Ial-3 CI Ph 6- CI 166.2
Ial-4 CI Ph 6-Br 185.1 (分解)
Ial-5 CI Ph 6- Me 137.8
Ial-6 CI Ph 6-CF3 117.5 (分解）
Ial-7 CI Ph 6-N02 242, 5 (分解）
Ial-8 CI Ph 6-OMe 148.6
Ial-9 CI Ph 6-CN 206.8 (分解)
Ial-10 CI Ph 7 - CI 115.4
Ial-11 CI . Ph 8- CI 154.4
Ial-12 CI Ph 160.3
Ial-13 CI p-Cl-Ph 6-Cl 205.6 laト 14 CI m-Cl-Ph 6-Cl 161.3
Ib4-1 CHO o-Cl-Ph 6-Br
IcO-1 NH(CH2) 20H Ph (n=0)
Icl-1 NH(CH2) 30H Ph 5-C1 175.7
Ic2-1 NH(CH2) 30H Ph 6-F 99.3
Ic3 - 1 NH(CH2)2OH Ph 6-Cl 137.9
Ic3-2 pyrrol idino Ph 6-Cl
Ic3-3 NH(CH2)30H Ph 6-Cl 135.9
Ic3-4 NH(CH2)40H Ph 6-Cl 115.6
Ic3-5 NH(CH2) 50H Ph 6-Cl 117.2
Ic3 - 6 e (CH2) 20H Ph 6-Cl 128.5
Ic3- 7 NH(CH2)20Me Ph 6-Cl 89.7
Ic3-8 NHn-Pr Ph 6-Cl 158.3
Ic3-9 NMe (CH2) 20Me Ph 6-Cl 88.5 表 4
Figure imgf000067_0001
化合物 No. R Ar (X)„ 融点 (°C)
Ic3-10 NH(CH2) 2CHMe2 Ph 6-C1 90.1
Ic3-ll NH(CH2) 60H Ph 6-C1 107.9
Ic3-12 NH(CH2)2CH(Me) CH20H Ph 6- CI 112.7
Ic3-13 NH(CH2)2SH Ph 6- CI 165,9
Ic3- 14 NH(CH2)2SAc Ph 6- CI 128.9
Ic3-15 a) 159.2
Ic3-16 NHfur furyl Ph 6-C1 142.0
Ic3-17 NHCH2CH=CMe2 Ph - 6- CI 95.9
Ic3- 18 NHCH2CH=C(Me) CH20H Ph 6 - CI 154.8
Ic3 - 19 NH2 Ph 6- CI 157.8
Ic3-20 NHNH2 Ph 6- CI 175.0
Ic3-21 NH(CH2) 2NMe2 Ph 6- CI 102.1
Ic3-22 NH(CH2)4NH2 Ph 6 - CI 118.0
Ic3-23 NHMe Ph 6-C1 186.9
Ic3-24 匿 t Ph 6 - CI 156.7
Ic3-25 NMe2 Ph 6- CI 141.8
Ic3-26 NHCH2CN Ph 6-C1 208.6 (分解）
I c 3-27 NMeNH2 Ph 6 - CI 155.9
Ic3-28 NHi-Pr Ph 6- CI 112.5
Ic3-29 NHCH2CH=CH2 Ph 6- CI 147.3
Ic3-30 NHCH2C≡CH Ph 6-C1 168.4
Ic3-31 NHCH2CONH2 Ph 6 - CI 140.3
Ic3-32 励 Me Ph 6-C1 173.9
Ic3-33 HCH2C02Et Ph 6-C1 146.1
Ic3-34 NHCH2CH2CN Ph 6-C1 198.7
Ic3-35 置 HO Ph 6- CI 252.1
Ic3-36 guanidino Ph 6- CI 253.4 (分解) 表 5
Figure imgf000068_0001
Figure imgf000068_0002
表 6
Figure imgf000069_0001
化合物 No. R Ar (X)n 融点 (°C)
Icll-1 NH(CH2)30H Ph 8- CI 115.5
Icl2-1 NH(CH2)30H Ph 6,8- Cl2 146.2
Icl2-2 NHCH2CH2OH Ph 6,8- Cl2 168.8
Icl2-3 NHfurfuryl Ph 6,8— Cl2 158.6
Icl2-4 NH2 Ph 6,8-Cl2 212.7
Icl2-5 NHCH2CN Ph 204.7
Icl2-6 NHGH2C02 e Ph o o 201.4
Id3-1 0(CH2) 2NH2 Ph 6 - CI 134.9
Ie3-1 S (CH2) 20H Ph 6- CI 124.4
Ie3-2 S (CH2) 2NH2 Ph 6-C1 88.3 a) 合成例 11に構造を記載した。
b) Ή NMR (CDC13)： 1.66-1.75 (1H, m), 1.86-2.08 (3H, m) , 3.57-3.64 (1H, m), 3.75-3.83 (2H, m), 3.89-3.59 (1H, m), 4.13-4.20 (1H, m)， 5.70 (1H, br. s), 7.52-7.60 (5H， m), 7.64-7.69 (2H, m), 7.75-7.76 (1H, m).
c) Ή NMR (CDC13)： 1.22 (3H, t, J = 7.0 Hz), 3.55 (2H, q, J = 7.0 Hz), 3.68 (2H, t， J = 5.2 Hz), 3.78 (2H， q- like, J = 5.2 Hz), 5.75 (1H, br. t), 7.53-7.60 (5H， m), 7.65-7.69 (2H, m), 7.75-7.77 (1H, m).
d) Ή NMR (CDCI3)： 1.22 (3H, t, J = 7.0 Hz), 1.96 (2H, quintet, J = 6.3 Hz), 3.50 (2H， q, J = 7.0 Hz), 3.58 (2H, t, J = 6.3 Hz), 3.67 (2H, q-like, J = 6.3 Hz), 5.65 (1H, br. t)， 7.53-7.60 (5H, m) , 7.65-7.69 (2H, m), 7.74-7.76 (1H, m). ' 参考合成例 1 (8_クロ口— 4—フエ二ルー 2 (1H) —キナゾリノン（化合物 No. II - 11) の製造）
フエニルマグネシウムブロミド （32 %THF溶液） 7. 10 gに 2—ァミノ— 3_ クロ口べンゾニトリル 953mgの THF 7 m 1溶液を室温で滴下し、 30分間加熱 還流した。得られた反応物にクロ口炭酸メチル 885 mgを氷冷下滴下した後、 これを 40分間加熱還流した。得られた反応液を冷下時 2 N—塩酸 40m lに注ぎ加えた後 、 これに重曹 8 g及び MTBE20m lを加え攪拌した。次いで、 析出した結晶をろ 取することにより標記化合物 1. 30gを得た。 ^副 R (DMS0-d6): 7.24(1H, t, J = 8.0 Hz), 7.57-7.70 (6H, m)， 7.90-7.93 (1H, m)， 11.45 (br. s). 参考合成例 2 (4_フエ二ルー 6—トリフルォロメチル _2 (1H) _キナゾリノ ン （化合物 Νο· II- 6) )
2—ァミノ一5—トリフルォロメチルベンゾフエノン 762mgをクロ口ホルム 1 Om lに溶かし、 これにトリェチルァミン 349 mgを滴下した後、氷冷下トリク 口ロアセチルクロリド 627mgを滴下した。 30分間同温で攪拌した後、 これに水 50m lを加え分液した。有機層を回収し、 回収された有機層を濃縮した。得られた 残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー （へキサン：酢酸ェチル =5 ： 1) で精 製することにより、 2， 一ベンゾィルー 2, 2, 2—トリクロ口一 4， 一トリフルォ ロメチルァセトァニリド 1. 08 gを得た。 'H MR (CDC13): 7.53-7.58 (2H, m), 7.66-7.75 (3H, m), 7.90-7.95 (2H, m), 8.81 (1H, d, J = 8.6 Hz), 12.38 (1H, br. s).
2 ' 一ベンゾィル—2， 2, 2—トリクロ口— 4' 一トリフルォロメチルァセトァ ニリド 1. 08 g、 DMSO 10m 1及び酢酸アンモニゥム 1. 18 gの混合物を 7 5 で 1時間攪拌した。冷却後、 これに水 10 Om lを加え、析出した結晶をろ取し た。得られた回収物をへキサン：酢酸ェチル = 1 ： 1の混合液に溶かした後、 これを 無水硫酸マグネシウムを用いて脱水し、濃縮することにより標記化合物 765mgを 得た。 'H NMR (CDCI3)： 7.58-7.68 (3H, m), 7.75 (1H, d, J = 8.8 Hz), 7.79-7.83 (2H, m), 7.93 (1H, dd, J = 8.8, 1.7 Hz), 8.17 (1H， br. s), 13.37 (1H, br. s). 上記の参考合成例と同様にして製造可能な化合物の例を表 7に記載する（上記の参 考合成例で製造した化合物も含む） 。
尚、 表 7中にある注釈 「a)」 乃至 「i)」 は以下の通りである。 表 7
Figure imgf000071_0001
Figure imgf000071_0002
a) Ή NMR (DMSO— d6): 7.27 (1H， dd, J = 7.7, 1.0 Hz), 7.38 (1H， dd, J = 8.3 1.1 Hz), 7.43-7.55 (5H, m), 7.69 (1H， t， J = 8.1 Hz), 12.18 (1H， br. s). b) Ή刚 R (DMSO— d6): 7.35 (1H, dd, J = 9.2， 2.7 Hz), 7.43 (1H, dd, J = 9.2 4.8 Hz), 7.58-7.74 (6H, m), 12.05 (1H, br. s). c) Ή NMR (DMSO - d6): 7.35 (IH, d, J = 9.2 Hz), 7.59-7.71 (6H, m), 7.91 (IH, dd, J = 9.2, 2.2 Hz), 12.08 (IH, br. s).
d) Ή NMR参考合成例 2に記載した。
e) 'HfiMR (CDC13)： 3.78 (3H， s)， 7.25-7.27 (IH, m), 7.36-7.40 (IH, m) , 7.54-7.62 (4H， in), 7.81-7.85 (2H, m), 13.37 (IH, br. s).
f) 'H NMR (DMSO - d6): 7.48 (IH, d, J = 8.4 Hz), 7.60-7.68 (3H, m), 7.71-7.74 (2H, m), 8.05 (1H， s)， 8.08-8.12 (IH, m), 12.36 (IH, br. s).
g) (単離精製せず。 ；）
h) NMR参考合成例 1に記載した。
ΐ) Ή NMR (DMS0-d6)： 7.52-7.72 (6H, m), 8.10-8.12 (1H， m)， 11.69 (IH, br. s). 実施例 1 (CER1クロ一ニング用シロイヌナズナ cDNAファージライブラリ一の作成） シロイヌナズナの Wassilewskija系統の種子を 70%のエチルアルコールで 1分間殺菌 し、 さらに 1.5%の次亜塩素酸ナトリウムで 10分間殺菌した。 これを滅菌水でよく洗つ た後、 GM培地 (4.3g Murashige and Skoog s basal salt mixture, 1¾ sucrose, 10ml of 5¾ MES-K0H (pH5.7), 0.3%Phytagel™ (SIGMA)) で 2週間培養することにより、 5 gの植物を得た。 これを液体窒素中で凍結させた後、 乳鉢により物理的に磨枠した。 得られた磨碎物に 10mlの抽出バッファ一 （200mM Tris-HCl (pH8.5) 、 lOOmM aCl 、 10mMEDTA、 0.5¾ SDS, 14mM j3メルカプトエタノール） と lOgのフエノールの混合 液を加えた。当該混合物を Vol tex ミキサーで攪拌した後、 これに 10mlのクロ口ホル ムを加えて激しく攪拌した。 次いで得られた混合物を 10000回転で 20分間遠心し、 水 層を回収した。 回収された水層に LiClを最終濃度 2Mとなるように加え、 これを- 80 : で 3時間放置した。 得られた凍結物を解凍した後、 これを 10000回転で 20分間遠心し、 沈殿を回収した。 回収された沈殿を 2mrの TE (lOmM Tris-HCl (pH 8.0) ImMEDTA)に溶 かした後、 これに 0.2mlの 3M酢酸ナトリウム（pH5.2)と 5mlのエタノールを加えて遠心 し、 RNAを沈殿として回収した。 次いで回収された沈殿 （RNA) を 01igotexTM dT30super (日本ロッシュ社製）に^することにより当該沈殿中から polyAが結合した RNAを抽出した。 抽出された polyAが結合した RNAからのファ一ジ cDNAライブラリ一は、 ZAP-cDNARSyn thesis Kit (Stratagene社製) を用い、 キット説明書に従って作製され た。 作製されたファージ cDNAライブラリーの力価は 500000PFUであった。 実施例 2 (CRE 1の DNAプローブの作製）
実施例 1で作製されたファ一ジ cDNAライブラリ一のファ一ジ液（約 1000000PFU)を 铸型として、 TAKARALATaqTMキット （宝酒造社製） を用い、 配列番号 3で示された DNA 及び配列番号 4で示された DNAをプライマーとして PCR反応を行い、 DNAを増幅した。詳 細を以下に述べる。
ファージ lOOOOOOpfu、プライマ一 DNA各々 0.2 Mにキッ卜説明書に従って dNTP等の 反応組成物を添加して PCR反応液を調製し、 P.CRの条件として、 94 で 2分間保温し、 94 で 30秒間、 55でで 30秒間、 68 で 5分間のサイクルを 40サイクル繰り返す増幅条 件下で PCRを行うことにより、 目的の DNA断片の増幅を行った。 次に増幅された DNA新 片を铸型にして Megaprime DNA-labelling system キット （アマシャムフアルマシア 社製） を用いて32 Pでラベルしたプローブを調製した。 尚、 反応液 （25 1) は、 増 幅された DNA断片 25ngに 32PdCTP 2.0 MBqを添加し、 キットに指定される反応組成物を 添加することにより調製された。 ラベル化反応は、 37で10分間で行われた。 実施例 3 (CRE1遺伝子を保持するファージ cDNAクローンの取得）
実施例 2で調製された D N Aプローブを用いたプラークハイブリダィゼーシヨン により目的とする CRE1遺伝子をクローニングした。 詳細を以下に述べる。
実施例 1で作製された cDNAファージライブラリーを用いて、 ZAP-cDNARSynthesis Kitの説明書に従い 、 プラークを形成させた。形成されたプラークからニトロセル口 一スフィルター上に DNAを吸着させた後、 紫外線処理をすることにより、 フィルター 上に DNAを固定させた。このようにして調製されたフィルターを用いて、 6XSSC (0.9M NaCU 0.09Mクェン酸ナトリウム） 、 5 Xデンハルト溶液 （0. （w/v) フイコール 400 、 0. l¾(w/v) ポリビニルピロリドン、 0.1¾BSA) 、 0.5¾(w/v) SDS及び lOO g/ml変性 サケ精子 DNA存在下に、 又は 100 g/ml変性サケ精子 DNAを含む DIG EASY Hyb溶液 （ベ 一リンガーマンハイム社） 中に 65T:で保温した後、 1 X SSC (0. 15M NaCK 0. 015Mク ェン酸ナトリウム） 及び 0. 5 SDS存在下に室温で 15分間の保温を 2回行い、 さらに 0. 1 X SSC (0. 015M NaCK 0. 0015Mクェン酸ナトリウム) 及び 0. 5%SDS存在下に、 68 で 30 分間保温するごとによりハイブリダイズするファ一ジ cDNAクローンを得た。 実施例 4 (CRE1 cDNAのクローニング）
実施例 3で得られたファージ cDNAクローンの cDNAを铸型として、 配列番号 5に示さ れる DNA及び配列番号 6に示される DNAをプライマ一として PCR反応を行い、配列番号 5 で示される塩基配列を有する DNAを増幅した。 詳細を以下に述べる。
PCR反応は、 Herculase Enhanced DNA Polymerase (T0Y0B0社製）を用いて、 94 で 1 分間保温し、 94 で 30秒間、 で 30秒間、 .72 で 4分間のサイクルを 25サイクル繰 り返す増幅条件下で行われた。 尚、 PCR反応液（50 1) は、 ファージ cDNAクローンの cDNA500ng、プライマー DNA各々 lOOngにキット説明書に従って d NTP等の反応組成物を 添加することにより調製された。 ， このようにして目的の DNA断片の増幅を行った。 実施例 5 (CREr発現プラスミドの構築）
酵母発現べクタ一である P415CYC 1 (Munberg et al . Gene : 156 119-122 (1995) , ATCC ライブラリ一 （No. 87382)から入手可能） を制限酵素 Sma Iで切断した後、 T4 DNA Ligaseを用いて、実施例 4で得られた D N A断片（配列番号 2で示される塩基配列を 有する DNA) を発現べクタ一 p415CYC1の CYC1プロモーター配列に結合することにより 、 酵母において目的タンパク質が発現されるように組み込んだ。 挿入された DNA断片 の塩基配列が正しい向きであり、当該塩基配列が配列番号 2で示された塩基配列であ ることを自動塩基配列決定装置を用いて確認し、 発現プラスミド P415CYC- CRE 1を得 た。 実施例 6 (形質転換細胞 TM182- CRE1及び形質転換細胞 TM182- p415CYClの作製） 実施例 5で得られた発現プラスミド p415CYC-CRE 1及び酵母発現べク夕一である P415CYC 1をそれぞれ用いて、 Slnl遺伝子欠損株である TM182 (s lnl A ) (Maeda T et al . ature : 369 242-245 (1994) ) を形質転換した。 形質転換は、 Polyethylene glycol/l i thium acetate (PEG/LiAc) -media ted trans format ion法を用い、 CLONTECH ¾：: MATCHMAKER Two-Hybr id Sys tem 3 User Manual 22ページに記載される VI I. Library Trans format ion & Screening Protocolsに従って行った。 得られる形質転換細胞では 、 ロイシンの栄養要求性が消失することを利用し、 DOLU+Gal培地で生育する形質転換 酵母を選択することにより、 形質転換細胞 TM182-CRE1及び形質転換細胞 TM182- P415CYC1を得た。 実施例 7 (細胞が有する植物由来のサイトカイニン受容体からの細胞内信号伝達を 阻害する化学物質の探索方法）
実施例 6で得られた形質転換細胞 TM182-CRE1及び形質転換細胞 TM182- P415CYC1を
DOLIHGal培地 10mlに植菌し、 30 で 18時間前培養を行い、 これを前培養液とした。 こ の前培養液を形質転換細胞 TM182-CRE1については DOLU+Glu培地を用いて、また形質転 換細胞 TM182- P415CYC1については DOLU+Gal培地を用いて、それぞれ OD600=0. 1になる ように希釈したものをそれぞれの希釈前培養液とした。
96穴プレートの各ゥエルにジメチルスルホキシド（DMS0)で 200ppmに調製された被 験物質を 1 1ずつ添加したアツセィプレートを準備した。 このとき、一部のゥエルに は DMS0を 添加しただけの対照区を設定した。 アツセィプレートは形質転換細胞 TM182-CRE1用アツセィプレートと形質転換細胞 TM182- p415CYCl用アツセィプレート とを準備した。
DMS0に lOOOOppmで trans-zeat in (サイトカイニン） を溶解したものを、 DOLU+Gul 培地で 50倍に希釈して 200ppmにした。 この 200ppmの trans-zeat in液を、上記のそれぞ れの希釈前培養液に 1000分の 3容量添加して、最終的に 0. 6ppmの trans-zeat inを含有 するそれぞれの希釈前培養液を調製した。 この 0. 6ppmの trans- zeat in を含有したそ れぞれの希釈前培養液を 100 ^ 1ずつ、それぞれの形質転換細胞用アツセィプレートの 各ゥエルに添加し、 30 で 24時間培養した後、プレートリーダ一を用いて各ゥエルの 濁度 （0D600) を測定した。 当該濁度を対照区における濁度と比較することにより、 被験物質の、細胞が有する植物由来のサイトカイニン受容体からの細胞内信号伝達を 阻害する活性を検定した。 その結果を表 8及び表 9に示す。
形質転換細胞 TM182-CRE 1に関して、試験区における濁度が対照区における濁度に比 ベて低い値を示した被験物質を、細胞が有する植物由来のサイトカイニン受容体から の細胞内信号伝達を阻害する化学物質として選抜した。ただし、形質転換細胞 TM182- P415CYC 1に関して、形質転換細胞 TM182- CRE 1の場合と同等以上に試験区における濁度 が対照区における濁度に比べて低い値を示した被験物質は、酵母への毒性を有する化 合物であるものとして、細胞が有する植物由来のサイトカイニン受容体からの細胞内 信号伝達を阻害する化学物質としては選抜しなかった。
(対照区に対する試験区の相対生育度） [%] = [ (試験区の濁度） 一 （ブランクの濁 度） ] Z[ (対照区の濁虔） _ (ブランクの濁度） ] X 1 0 0
(細胞が有する植物由来のサイトカイニン受容体からの細胞内信号伝達を阻害する 活性） [%] = 1 0 0— （対照区に対する試験区の相対生育度）
表 8
Figure imgf000077_0001
いずれの場合も、 トランスゼァチンの存在濃度は 0. 6ppm、化学物質の存在濃度は 2ppm とした。 表 9
Figure imgf000078_0001
いずれの場合も、 トランスゼァチンの存在濃度は 0. 6ppm、化学物質の存在濃度は 2ppm とした。 実施例 8 (細胞が有する植物由来のサイトカイニン受容体からの細胞内信号伝達を 阻害する化学物質の濃度応答性の検定方法）
実施例 7で選抜された（細胞が有する植物由来のサイトカイニン受容体からの細胞 内信号伝達を阻害する）化学物質に関して、供試濃度を変化させて実施例 7と同様の 試験を行った。実施例 7で選抜された（細胞が有する植物由来のサイトカイニン受容 体からの細胞内信号伝達を阻害する） 化学物質の供試濃度を 0. 06ppmから 6ppmとなる ように種々変化させる他は、実施例 7と同じ条件で、実施例 6で得られた形質転換細 胞 TM182-CRE1及び形質転換細胞 TM182- p415CYClを培養した。 供試された化学物質の 濃度調整には DMS0を用いた。培養終了後、形質転換細胞 TM182- CRE1の増殖状態が観察 されなかった最低供試濃度から、また以下に示す方法で作成した濃度応答性生育阻害 曲線から、細胞が有する植物由来のサイトカイ二ン受容体からの細胞内信号伝達を阻 害する活性の濃度応答性を検定した。
濃度応答性生育阻害曲線を作成するにあたり、まず相対生育度を次のように算定し た。
(相対生育度） [%] = ( B ) Z (A) X 1 0 0
(A) = [ (0. 06ppm試験区の濁度） 一 （ブランクの濁度） ] [ (対照区の濁度） 一 （ ブランクの濁度） ]
( B ) = [ (各試験区の濁度） 一 （ブランクの濁度） ]Z [ (対照区の濁度） 一 （ブラ ンクの濁度） ] そして、 X軸を供試された化学物質の濃度とし、 Y軸を相対生育度としたグラフ （図 1参照、 左図：形質転換細胞 TM182- CRE1、 右図：形質転換細胞 TM182- p415CYCl ) を 作成して、 これを濃度応答性生育阻害曲線とした。 実施例 9 (根部生長促進活性試験） '
下記の組成 （表 1 0参照） からなる園試標準培地を調製した。 クラスターチューブ に化学物質の DMS0溶液を 4 1ずつ、 終濃度 0. 001ppm〜10ppmになるように分注し、 さ らに滅菌した園試標準培地を 600 1ずつ分注した後、得られた溶液を充分に混合した 。クラス夕 ""チューブ当り 10 20粒のシロイヌナズナ種子を前記クラスターチューブ 内に播種し、 、 明所にて 10日間培養した後、 シロイズナズナ種子から生じた主根 (平均的な主根） の長さを測定した。 8反復の平均値を求め、 下記の式により根部生 長率を求めることにより、 有意な根部生長率 （例えば根部生長率が 1 20%以上） を示し たものを根部生長促進活性有りとして判定可能であつた。
また詳細な結果として、前記終濃度において最も高い根部生長率を示した値を表 1 1及び表 1 2に示した。
7
9 根部生長率（％) = (化学物質処理区の平均主根長） / (対照区の平均主根長） X 100 表 1 0
Figure imgf000080_0001
表 1 1
化合物 No. 供試終濃度 (ppm) 根部生長促進活性
Ic3-3 5 163.4
Ic3-4 0.625 129.5
Ic3-5 0.625 134.0
Ic3-6 0.625 122.4
Ic3-7 1.25 142.5
Ic3-8 1.25 136.4
Ial-3 5 137.5
Ie3-1 5 120.9
Ie3-2 10 147.6
Ic3-10 10 120.6
Ic3- 11 1.25 128.2
Ic3-12 1.25 128.9
Ic3 - 13 10 140.5
Ic3- 14 2.5 126.2
Ic3-15 5 131.0
Ic3- 16 5 155.3
Ic3 - 17 10 121.3
Ic3-18 2.5 139.5
Ic3- 19 1.25 155.6
Ic3 - 20 10 137.8
Ic3-21 2.5 131.7
Ic3-22 0.156 129.3
Ic3-23 10 150.0
Ic3-24 1.25 122.8
Ic3-25 10 1 0.0
Ic3-26 5 136.4
Ic3-27 2.5 127.8
Ic5-4 2.5 136.6
Ic5-5 2.5 157.8
Ic3 - 28 10 120.4
Ic3-29 10 122.4 ,
Ic3-31 10 142.2
Ic3-32 5 123.4
Ic3-33 5 123.9 表 1 2
Figure imgf000082_0001
実施例 1 0 (レタスを用いたサイトカイニン情報伝達阻害物質の根部生長促進活性 評価）
実施例 7で選抜された（細胞が有する植物由来のサイトカイ二ン受容体からの細胞 内信号伝達を阻害する）化学物質 IC3-1及び化学物質 Ic7- 1について、レタス（Lac tuca sat iva Red wave) を用いて主根の伸長促進活性を評価した。 化学物質を種々の濃度 の水溶液に調製し （0. 6ppm、 1. 2ppm, 2. 5ppm、 5ppm、 l Oppm, 20ppm、 それぞれ 0. 1% DMSOを含む） 、 60 φプラスチックシャーレ中の直径 50腿のろ紙に lml添加した後、 当 該プラスチックシャーレ上にレタス種子 30粒を播種した。 22 、 明所にて 4日間培養 した後、主根の.長さを測定した。 3反復の平均値を求め、次の式により根部生長率を 求めた。 根部生長率 (%) =- (化学物質処理区の平均主根長） I (対照区の平均主根長） X 100 - 100 図 2及び図 3に結果を示す。 化学物質 Ic3-1は 0. 6ρρπ！〜 2. 5ppmの濃度で対照区に対 し 15〜17% . (図 2参照） 、 化学物質 Ic7-1は ΙΟρρπ！〜 20ppmの濃度で 10〜17% (図 3参 照） の主根伸長が認められた。 Dunne t tの検定の結果、全ての処理区で危険率 5 %の有 意水準で有意差ありと判定され、 顕著に根部生長促進効果があることが示された。 実施例 1 1 (イネを用いたサイトカイニン情報伝達阻害物質の根部生長促進活性評 価）
実施例 7で選抜された（細胞が有する植物由来のサイトカイ二ン受容体からの細胞 内信号伝達を阻害する） 化学物質 Ic3-1及び化学物質 Ic7-1について、 イネ （Or i za sat iva L. j aponi ca) を用いて主根伸長促進活性を評価した。 化学物質を種々の濃度 (10ppm、 25ppm、 それぞれ 0. DMS0を含む） の水溶液に調製した後、 当該薬液 17ml を根部生長観察用の種子成長袋（177mmX 163mm、大起理化工業製） 中の厚紙にしみこ ませ、 当該厚紙上にイネ種子 3粒を播種した。 子袋をプラスチック容器中に入れて密 閉し、 25t:、 明所にて 7日間培養後、 主根の長さを測定した。 3反復の平均値を求め 、 次の式により根部生長率を求めた。 根部生長率 （％) = (化学物質処理区の平均主根長） / (対照区の平均主根長） X 100 - 100 図 4及び図 5にその結果を示す。化学物質 Ic3-1は l Oppmで対照区に対し 17 %、 25ppm で 20%の主根伸長が認められた （図 4参照） 。 また、 化学物質 I c7-1は lOppmで対照区 に対し 17%、 25ppmで 19 %の主根伸長が認められた （図 5参照） 。 Dunnet tの検定の結 果、 全ての処理区で危険率 5 %の有意水準で有意差ありと判定され、 顕著に根部生長 促進効果があることが示された。 実施例 1 2 (イネ種子処理によるサイトカイニン情報伝達阻害物質の根部生長促進 活性評価）
実施例 7で選抜された（細胞が有する植物由来のサイトカイ二ン受容体からの細胞 内信号伝達を阻害する） 化学物質 I c3-1及び化学物質 Ic7-1について、 イネ （Or i za sal iva L. j aponi ca) を用いて種子処理による主根伸長促進活性を評価した。 化学物 質をアセトンに溶解して 10， OOOppmの溶液を調製した。 調製されたアセトン化学物質 溶液 300 をェヅペンチユーブに入れた後、 15粒の種子を当該エツペンチューブに投 入して、次いで得られた混合物を約 30秒間攪拌混合した。 このようにして薬剤処理さ れた種子をろ紙上に広げて乾燥した。
底に穴の開いたプラスチック容器（直径 120mm、 高さ 97mm) に約 820ml容の培養土を 入れ、 これに上記のようにして薬剤処理された種子を 15粒ずつ播種した。当該種子を 暗所、 30 にて 4日間栽培した後、 温室にて 35日間栽培した。 こうして栽培された植 物の根部を切り取って付着した土を洗い流した後、 これを凍結乾燥した。次いで凍結 乾燥後の根部の重量を測定した。各処理区につき 3反復の試験を実施し、その平均値 を求めた。 結果を図 6に示す。
株当りの根部乾燥重量は、 化合物 Ic3-1の場合には対照区の 1 19%、 化合物 Ic7- 1の 場合には 126%に増加し、 いずれの化合物においても顕著な根部生長促進効果が確認 された。 尚、 オーキシン化合物 IAAの場合には対照区の 87%に根部重量は抑えられ、 根部生長抑制効果が認められた。 実旌例 1 3 (シロイヌナズナの胚軸を用いたサイトカイニン情報伝達阻害物質の植 物分化促進活性評価）
実施例 7で選抜された（細胞が有する植物由来のサイトカイニン受容体からの細胞 内信号伝達を阻害する）化学物質 Ic3-1及び化学物質 Ic7-1について、 シロイヌナズナ (Arabi dops i s thal i ana Columb i a) の胚軸を用いて不定根形成活性を調べることに より、 植物分化促進活性を評価した。
まず、 シロイヌナズナを播種するための寒天培地を作製した。 寒天培地の成分は、 水溶液 1リットル当たりムラシゲ ·スク一グ植物培地用混合塩類 （和光純薬工業） 1 リットル用を 1包、 スクロース 10g、 水酸化カリウムで pH5. 7に調整した 5 %MES ( 2- (N-Morpho 1 i no) e t hanesu 1 f on i c Ac i d) 水溶液 10mし イノシト一リレ 100mg、 ビタミン 類ストック液 （水溶液 1リットル当たりチアミン塩酸塩 10g、 ピリドキシン塩酸塩 lg 、 ニコチン酸 lg) lmK 寒天 8gであった。 次いで、 当該寒天培地を 120 で 20分間ォー トクレーブにかけた後、 円形シャーレに分注して固化させた。
次に、種子容量 25 ^ 1程度のシロイヌナズナの種子を 1. 5mlチューブに入れ、そこに 次亜塩素酸ナトリウム溶液（ナカライテスク）を滅菌蒸留水で 10倍に希釈した液を lml 加えて、 チューブミキサー （T0MY、 MT-360、 MIXING SPEED10) で 1分間程度攪拌しな がら殺菌消毒を行った。卓上小型遠心機で遠心して種子を沈降させた後、前記チュー ブ内から次亜塩素酸ナトリゥム溶液の希釈液を除き、 新たに滅菌蒸留水を lml加えた 後、 前記チューブミキサーで 1分間程度攪拌することにより、 種子を洗浄した。 卓上 小型遠心機で遠心して種子を沈降させた後、前記チューブ内から洗浄後の水を除いた 。 当該洗浄作業を 3回繰り返した。 洗浄を終えた種子を円形シャーレの寒天培地上に 蒔き、 22" の暗所で発芽、 生育させた。
一方、 化学物質を DMS0に溶解して 10, 000ppmの溶液を調製した。 さらに、 DMS0で希 釈して 6000ppm、 2000ppm、 600ppm、 200ppmの溶液を調製した。 そして、 12穴マルチプ レート （住友ベークライト） の各穴に、 1穴につき 1種類 1濃度の調製された化学物質 DMS0溶液を 2 1ずつ分注した。対照区として設定した穴には化学物質 DMS0溶液ではな く DMSOを 2 // I入れた。 次いで、 トランスゼァチンを DMSOに溶解して 10， OOOppmの溶液 を調製した。 これを滅菌蒸留水で希釈して l Oppmの溶液を調製した。 前記組成の寒天 培地を調製し、 ォ一トクレーブ後、 50 程度まで冷ましたところに、 この l Oppmのト ランスゼァチン溶液を最終濃度 0. O l ppmになるように添加して混合した。 このトラン スゼァチン含有寒天培地を、化学物質 DMS0溶液又は DMS0を分注し終えた 12穴マルチプ レートの各穴に 2mlずつ分注して固化させた。
前記の 22 の暗所で発芽'生育させたシロイヌナズナの芽生えを胚軸部分で切断し 、子葉が付いている側の胚軸を以下の不定根形成活性の測定に用いた。 尚、根部が付 いている側の胚軸は廃棄した。具体的には、 12穴マルチプレートの各穴の寒天培地に 、 子葉付き胚軸を切断部分から 5mm程度まで挿し込んだ。 当該マルチプレートを 22 、 16時間明所 （8時間暗所） に静置した結果、 1週間後には化学物質 I c3-1を含有する 寒天培地 （最終濃度 6ppm、 2ppm、 0. 6ppm、 0. 2ppmの全試験区） に挿した胚軸部分及び 化学物質 I c7-1を含有する寒天培地 （最終濃度 6ppm、 2ppmの試験区） に挿した胚軸部 分から不定根の形成が確認された。化学物質 DMS0溶液の代わりに DMS0が添加された対 照区では胚軸部分から不定根の形成は確認できなかった。最終濃度 0. 6ppmの化学物質 I c3-1を含有する寒天培地に挿した胚軸、最終濃度 2ppmの化学物質 I c7-1を含有する寒 天培地に挿した胚軸及び対照区の寒天培地に挿した胚軸の場合における試験結果を 図 7に示す。 実施例 1 4 (イネを用いたサイトカイニン情報伝達阻害物質の根部生長促進活性の 測定）
化学物質 Ic3-3について、 イネ (Or i za sat iva j apon i ca二ツボンバレ) を用いて根 の伸長促進活性を測定した。
まず化学物質を所定濃度含むアセトン薬液を調製し、 次いでこれを蒸留水にて 100 倍に希釈して l Oppmの濃度に調製（1 %アセトンを含む）することにより、化学物質溶 液を得た。 水中に 2日間浸漬して催芽処理された種子を 3粒ずつ 288穴プラグトレーに 播種し、 前記化学物質溶液をゥエル当り 500 // 1ずつ土壌灌注した。覆土後、 プラグト レーをビニール袋に入れ、 これを人工気象室 （30t、 暗所） にて 3日間放置した。 プ ラグトレーからビニール袋を外した後、 常時底面灌水しながら、 明所 暗所 = 16hZ 8hの光条件下で、 さらに 4日間放置した。 このようにしてイネ種子を栽培した後、 生 育したイネを得た。 得られたイネの根を洗浄し、 根長測定画像解析装置
WinRHIZO (Regent Ins truments社製）を用いて総根長を解析した。 化学物質 Ic3-3処理 区では土壌灌注処理においてアセトンのみを用いた対照区 （UTC) と比較して顕著な 根の伸長促進が認められた。写真を図 8に示す。 また、 根長測定画像解析装置による 解析の結果、 化学物質 Ic3-3処理区では総根長の増加が認められた。 結果を図 9に示 す。 実施例 1 5 (CRE1 cDNAのクローニング その 2 )
実施例 5で得られた発現プラスミド P415CYC-CRE 1を铸型として、 配列番号 7に示 される DNA及び配列番号 8に示される DNAをプライマーとして PCR反応を行い、 配列番 号 2で示される塩基配列を有する DNAを増幅した。 詳細を以下に述べる。
PCR反応は、 KOD Plus DNA Polymerase (T0Y0B0社製）を用いて、 94^で 2分間保温し 、 94T:で 15秒間、 58でで 30秒間、 68 で 3分 30秒間のサイクルを 30サイクル繰り返す 増幅条件下で行われた。尚、 PCR反応液（50 1)は、プラスミド p415CYC-CRE 1を 500ng 、 プライマ一 DNA各々 100ngにキッ卜説明書に従って d NTP等の反応組成物を添加する ことにより調製された。
このようにして増幅した目的の DNA断片は pCR- Blunt I I- T0P0ベクタ一（インビトロ ジェン社） にキット添付の説明書に従ってクロ一ニングした。 この際、配列番号 7で 示される塩基配列が Τ7プロモーターに近く、 配列番号 8で示される塩基配列が Sp6プ 口モータ—に近くなる向きで目的の DNA断片を pCR-B lunt I I -T0P0べク夕一に挿入し た。 挿入された DNA断片の塩基配列が正しい向きであり、 当該塩基配列が配列番号 2 で示された塩基配列であることを自動塩基配列決定装置を用いて確認した。 実施例 1 6 (CRE1発現プラスミドの構築）
酵母発現ベクターである P425GPD (Munberg et al . Gene : 156 119—122 (1995)、 ATCC ライブラリ— （No. 87359)から入手可能） を制限酵素 BamHIで切断した後、 T4 DNA Ligaseを用いて、実施例 1 5で得られた DNA断片（配列番号 2で示される塩基配列 を有する DNA) を発現べクタ一 P425GPDの GPDプロモーター配列に結合することにより 、 酵母において目的タンパク質が発現されるように組み込んだ。 挿入された DNA断片 の塩基配列が正しい向きであり、当該塩基配列が配列番号 2で示された塩基配列であ ることを自動塩基配列決定装置を用いて確認し、発現プラスミド P425GPD-CRE1を得た
実施例 1 7 (形質転換細胞 TM182- P425GPD-CRE1の作製）
実施例 1 6で得られた発現プラスミドを用いて、 Slnl遺伝子欠損株である TM182 ( slnlA) (Maeda T et al. ature:369 242-245(1994)) を形質転換した。 形質転換 は、 S. cerevisiae Direct Transformation lit Wako (和光純薬工業社製） を用い、 添付のマニュアルに従って行った。得られる形質転換細胞では、 ロイシンの栄養要求 性が消失することを利用し、 DOLU+Gal培地で生育する形質転換酵母を選択することに より、 形質転換細胞 TM182-P425GPD-CRE1を得た。
また、 酵母発現ベクターである P425GPDを用いて同様の方法で形質転換細胞
TM182- P425GPDを得た。 実施例 1 8 (CRE1を含む膜タンパク質画分の調製）
実施例 1 7で得られた形質転換細胞 TM182-P425GPD- CRE1をガラスビーズで破壊し た後、超遠心機によって CRE1を含む膜タンパク質画分を調製した。詳細を以下に述べ る。
実施例 1 7で得られた形質転換細胞 TM182-P425GPD-CRE1を DOLU+Gat培地 100mlに植 菌し、 30 で 16時間培養を行い、 0D600=1.4程度の培養液を得た。 培養液を 50mlの遠 心管に分注して、 4t、 7，400xgで 5分間遠心して形質転換細胞 TM182-P425GPD- CRE1 の菌体を回収した。 この菌体を、 4 に冷却したリン酸バッファ一 （50mM リン酸二 水素ナトリゥム水溶液と 50πιΜ リン酸水素ニナトリゥム水溶液を 4対 6の割合で混ぜ て PH7.0に調整したもの） に再度懸濁して 2mlチューブに分注して、 4T：、 l,000xgで 5.分間遠心して形質転換細胞 TM182- P425GPD- CRE1の菌体を回収した。 この菌体を、 4 に冷却したリン酸バッファ一に再度懸濁して、 4 、 l , 000xgで 5分間遠心して形 質転換細胞 TM182- P425GPD-CRE1の菌体を回収した。 この菌体を、 DTT (ジチオスレィ トール） と PMSF (フッ化フエ二ルメチルスルホニル） を含む菌体の 3倍量のリン酸バ ッファー （前述のリン酸バッファ一に 5mM DTTと 0. 5mM PMSFを添加したもの） に再度 懸濁して、 あらかじめ 250 1のガラスビーズ （直径 0. 25〜0. 5讓） を入れて に冷 却していた 1. 5mlチューブに 200 j 1ずつ分注した。これらの 1. 5mlチューブをマイク口 チューブミキサー （T0MY社、 MT-360) の最高出力で 30秒間攪拌した後、 1分間氷中で 冷却することを 2回繰り返した。 さらに、 これらの 1. 5mlチューブをマルチビーズシ ョッカー （安井器械社、 MB-200) の出力 （SPEED METER) 2000で 30秒間攪拌した後、 1分間氷中で冷却することを 3回繰り返した。 次に、 これらの 1. 5mlチューブを 4 、 1，500 8で1 0分間遠心して上清を回収した。 この上清を新しい 1. 5mlチューブに移 して 4 ：、 10, OOOxgで 3分間遠心して上清を回収した。超遠心機を用いてこの上清を 4 t、 100, 000 X gで 1時間遠心して沈殿を回収した。 この沈殿を、 スクロースモノ力 プレートを 1 %含むリン酸バッファー（前述のリン酸バッファーに 1 %のスクロース モノ力プレートを添加したもの）に溶解させて形質転換細胞 TM182- P425GPD- CRE1の膜 タンパク質画分とした。
また、 同様の方法で、 形質転換細胞 TM182-P425GPDの膜タンパク質画分を調製した
実施例 1 9 (化学物質がサイトカイニンがサイトカイニン受容体に結合することを 阻害することを調べる方法）
実施例 1 8で得られた形質転換細胞 TM182-P425GPD-CRE1の膜タンパク質画分と水 素の放射性同位体であるトリチウムで標識して高い放射活性を持たせたサイトカイ ニンとを用いて、被験物質がサイトカイニンがサイトカイニン受容体に結合すること を阻害することを検証した。 詳細を以下に述べる。
水素の放射性同位体であるトリチウムで標識して高い放射活性を持たせたサイト カイニンは、 アマシャムバイオサイエンス社製の [3H] N- 6- (isopent-2-enyl) Adenine (以下、 放射性標識 2IPと記す） を用いた。 比放射能は 74. 0GBq/mmolで、 放射能濃度 は 37.0MBq/ml。
はじめに、形質転換細胞 TM182-p415CYClの膜タンパク質画分を 100 gと設定濃度に なるようにリン酸バッファーで希釈した放射性標識 2IPと設定濃度になるように DMS0 で希釈した被験物質 1 lをリン酸バッファ一中で混合して 100 1の反応液を調製し た。 次に、 この反応液を氷中に 1時間静置した後、 ガラスフィルター GF/B (ワットマ ン社製）で濾過して形質転換細胞 TM182- P425GPD- CRE1の膜タンパク質画分を回収した 。 そして、 このガラスフィルターを液体シンチレ一シヨンカクテル Ultima Gold (パ 一キンエルマ一社製） に浸して、液体シンチレーションカウンターで放射能を測定し た。 また、 対照として形質転換細胞 TM182-P425GPDの膜タンパク質画分を用いて同様 の試験を行った。 放射性標識 2IPの非特異的な結合による放射能の影響を排除するた めに、形質転換細胞 TM182-P425GPD-CRE1の膜タンパク質画分を用いた試験で得た放射 能の値から形質転換細胞 TM182-P425GPDの膜タンパク質画分を用いた試験で得た放射 能の値を引いた。 その試験結果を図 1 0に示す。
放射能は、 被験物質無し （被験物質の溶媒に用いた DMS0のみを添加） や被験物質がァ ブシジン酸の場合に比べて、 被験物質がトランスゼァチンや Ic3-4の場合に減少した
実施例 20 (湛水直播試験における種子処理したサイトカイニン情報伝達阻害物質 のイネ苗立ち促進活性の評価）
実施例 7で選抜された（細胞が有する植物由来のサイトカイニン受容体からの細胞内 信号伝達を阻害する） 化学物質 Ic3- 3について、 イネ （Oryza sativa japonica 日本 晴） に種子処理して湛水直播条件下生育させ、 苗立ち率を調べることにより、 化学物 質のイネ苗立ち促進活性を評価した。
まず、 5%(v/v) Color Coat Red (BECKER UNDERWOOD社製） 、 5%(v/v) CF- Clear (BECKER UNDERWOOD社製） 、 0.42%(v/v) Maxim-XL (Syngenta社製） を含む Blank slurry溶液を調製した。 1· 3mlの Blank slurry溶液当り、 それぞれ 6.25mg、 12.5mg、 25mg、 50mgの化学物質 I c3- 3を溶解させ、当該溶液を Hege 11種子処理装置（Hans-U lrich Hege社製） を用いて、 50 g種子当り 1.3mlの化学物質一 slurry溶液の割合で処理した (それぞれ 0.125mg 0.25mg 0.5mg lmg/g種子に相当する） 。
次に、 野外に設置されたコンクリートポット （50cmX50cm) に、 湛水深 5cmに設定 して、 ポット当り 50粒ずつ散播した。播種後 23日目に、 葉の先端が水面に出現してい る苗数を調査した結果、 0.125 lmg/g種子の処理濃度で、 Blank slurry処理区と比 較して、 苗立ち率の増大が認められた。 各処理区 （4反復） の試験結果 （平均値） を 表 13に示す。
[苗立ち率 （％) ]=[葉の先端が水面に出現している苗数]/ [播種数] X 100 表 13
Figure imgf000091_0001
実施例 21 (乾田直播試験における種子処理したサイトカイニン情報伝達阻害物質 のイネ分げつ促進活性評価）
実施例 7で選抜された（細胞が有する植物由来のサイトカイニン受容体からの細胞内 信号伝達を阻害する） 化学物質 Ic3-3について、 イネ （Oryza sativa japonica 日本 晴） に種子処理して乾田直播条件下生育させ、 分げつ数を調べることにより、化学物 質のイネに対する分げつ促進活性を評価した。
まず、 5 (v/v) Color Coat Red (BECKER UNDERWOOD社製） 、 5%(v/v) CF-Clear (BECKER UNDERWOOD社製） 、 0·42%(ν/ν) Maxim-XL (Syngenta社製） を含む Blank slurry溶液を調製した。 1.3mlの Blank slurry溶液当り、 12.5mgの化学物質 Ic3- 3を溶 解させ、 当該溶液を Hegel 1種子処理装置 （Hans-Ulrich Hege社製） を用いて 50g種子 当り 1.3mlのの割合で処理した （0.25mg/g種子に相当する） 。 次に種子処理した種子を 1 5000 aワグネルポットに、 ポット当り 20粒ずつ、 播種深度 lcmに播種し、温室にて栽培した。播種後 10日目に湛水深 5cmに設定して 入水し、 さらに栽培を継続した。 播種後 30日目に、 分げつ数を調査した結果、 Blank slurry処理区と比較して、 株当りの分げつ数の増加が認められた。 各処理区 （3反復 ) の試験結果 （平均値） を図 1 1に示す。 以下に合成例及び参考合成例を示し、 本発明で用いられる化合物（XI) をより具体 的に説明するが、 化合物 （XI) はこれらの例に限定されない。
実施例及び参考例において、 「室温」 とは、 通常 10- 3(T を示す。 nH NMR」 とは 、 プロトン核磁気共鳴スペクトルを示し、 内部標準としてテトラメチルシランを用い て日本電子 JNM-AL400型スペケトロメーター （400MHz) で測定し、 ケミカルシフト （ δ) を ppmで表記した。 「Mp」 とは、 融点を示し、 メトラー （MetUer) FP61型融点測 定装置で測定した。 下記の実施例、 参考例、 表 2、 表 3、 表 4及び表 5の中で用いら れている記号は以下の意味を有する。 「CDC13」 ：重クロ口ホルム、 「DMS0-d6」 ：重 ジメチルスルホキシド、 「s」 ： シングレット、 「d」 ：ダブレット、 「t」 ： トリプ レット、 「qj ：カルテット、 「dd」 ：ダブルダブレツ小、 「m」 ：マルチプレッド、 「br」 ：ブロード （幅広い） 、 「J」 ：カップリング定数、 「Me」 ：メチル、 「Et」 ：ェチル、 「Pr」 ：プロピル、 「i- Pr」 ：イソプロピル、 「t- Bu」 ：タ一シャリーブ チル、 「Ph」 ：フエニル、 . 「Ac」 ：ァセチル、 「THF」 ：テトラヒドロフラン、 「DMF 」 ： Ν,Ν-ジメチルホルムアミド、 「DMS0」 ：ジメチルスルホキシド、 「MTBE」 ：メチ ルターシャリーブチルエーテル。 合成例 12 (2—アミノー 6, 8—ジクロロー 4_フエニルキナゾリン（化合物 No. Ie-4) の製造）
2, 6, 8 _トリクロ口— 4一フエニルキナゾリン （化合物 No. Π- 5) 30 Omg 、 28%アンモニア水溶液 30 g及びァセトニトリル 6m 1の混合物を耐圧反応容器 中、 105" で1. 5時間反応させた。 得られた反応液を冷却した後、 これを水 10 O.m 1に注ぎ加えた。 当該混合物に酢酸ェチル 6 Omlを加え抽出し、得られた抽出 物を濃縮した。得られた残渣をシリカゲル力ラムクロマトグラフィー（クロ口ホルム） で精製することにより、 23 Omgの標記化合物を得た。 Mp. 212.7で。 'H NMR (CDC13)： 5.56 (2H, br. s), 7.54-7.60 (3H, m), 7.63-7.68 (2H, m), 7.74 (1H, d, J = 2.3 Hz), 7.79 (1H， d， J = 2.3 Hz). 合成例 13 (6—クロロー 2—フルフリルアミノー 4一フエニルキナゾリン（化合 物 No. Ib-8) の製造）
2, 6—ジクロ口— 4—フエニルキナゾリン （化合物 No. II- 2) 275mg及びフル フリルァミン 486 mgの混合物を 85t:で 40分間攪拌した後、これを水 50 mlに注 ぎ加えた。 当該混合物に酢酸ェチルを加え抽出し、得られた抽出物を水洗後濃縮した 。 得られた残渣をエタノール再結晶することにより 28 Omgの標記化合物を得た。 Mp.142. O :. Ή NMR (CDC13)： 4.77 (2H, d， J = 5.6 Hz), 5.70 (1H, br. t, J = 5.6 Hz), 6.29-6.32 (2H, m), 7.36 (1H, dd, J = 1.8, 0.9 Hz), 7, 53-7.70 (7H, m), 7.78 (1H, d， J = 2.2 Hz). 合成例 14 ( 6 _クロ口— 2—エトキシカルポニルメチルァミノ— 4—フエニルキ ナゾリン (化合物 No. Ib-15) の製造）
2, 6—ジクロ口— 4一フエニルキナゾリン （化合物 No. II-2) 55 Omg及びグ リシンェチルエステル塩酸塩 419mgに DMF 3 m 1及びトリェチルァミン 6 07mgを加え、 これを 85"Cで 5. 5時間攪拌した。 得られた反応液を水 100 m 1に注ぎ加えた後、 酢酸ェチルで抽出し、 抽出物を濃縮した。 得られた残渣をシリカ ゲルカラムクロマトグラフィー（へキサン： 酢酸ェチル =6 ： 1〜3 ： 1)で精製す ることにより標記化合物 503mgを得た。 Mp.146.l ：。 'H MR (CDC13) : 1.30 (3H, t， J = 7.2 Hz) , 4.25 (2H, q, J = 7.2 Hz) , 4.31 (2H, d, J = 5.2 Hz) , 5.97 (1H， br. s), 7.54-7.63 (5H, m), 7.67-7.70 (2H, m), 7.79 (1H, s). 合成例 15 (6 _クロ口— 2—ホルムアミドー 4—フエニルキナゾリン（化合物 No. Ib-17) の製造） 乾燥ホルムアミド 54mgの DMF 5m l溶液に水素化ナトリウム（6 0 %) 48 mgを加え、 これを室温で 30分撹拌した。 反応混合物に 2, 6—ジクロロー 4ーフ ェニルキナゾリン （化合物 No. II- 2) 2 7 5mgを加えた後、 8 5 に加温し、 3時 間撹拌した。 得られた反応液を水 1 00m lに注ぎ加えた後、 酢酸ェチルで抽出し、 抽出物を濃縮した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（酢酸ェチ ル：へキサン = 1： 3)で精製することにより 64mgの標記化合物を得た。 Mp. 252.1 。 Ή NMR: 7.59-7.66 (3H, m)， 7.72-7.81 (3H, m), 7.88 (1H， d, J = 8.8 Hz), 8.02 (1H, d, J = 2.0 Hz), 8.37 (1H, br. d， J = 10.4 Hz), 9.71 (1H, d, J = 10.4 Hz). 上記の合成例と同様にして製造可能な化合物の例を表 14及び表 1 5に記載する (上記の実施例で製造された化合物も含む） 。 尚、 表 14及び表 1 5中にある注釈 「 a)」 、 「b)」 及び 「c)」 は以下の通りである。
a) Ή NMR (CDC13)： 1.66-1.75 (1H, m), 1.86-2.08 (3H, m), 3.57-3.64 (1H, m)， 3.75-3.83 (2H, m), 3.89-3.59 (1H, m), 4.13-4.20 (1H, m), 5.70 (1H, br. s),
7.52-7.60 (5H， m), 7.64-7.69 (2H, m), 7.75-7.76 (1H, m).
b) Ή NMR (CDCI3)： 1.22 (3H, t, J = 7.0 Hz), 3.55 (2H, q, J = 7.0 Hz), 3.68 (2H, t， J = 5.2 Hz), 3.78 (2H， q- like, J = 5.2 Hz), 5.75 (1H, br. t), 7.53-7.60 (5H, m), 7.65-7.69 (2H, m), 7.75-7.77 (1H， m).
c) Ή NMR (CDCI3)： 1.22 (3H, t， J - 7.0 Hz), 1.96 (2H, quintet, J = 6.3 Hz), 3.50 (2H， q， J = 7.0 Hz), 3.58 (2H, t, J - 6.3 Hz), 3.67 (2H, q-like, J = 6.3 Hz), 5.65 (1H, br. t), 7.53-7.60 (5H， m)， 7.65-7.69 (2H, m), 7.74-7.76 (1H, m).
表 14
Figure imgf000095_0001
化合物 No. R11 m X, n x2 融点 cc)
Ia- ,1 (CH2)3OH 1 5-Cl 0 - 175.7
Ib-1 (CH2)40H 0 - , 1 C1 115.6
Ib-2 (CH2)5OH 0 - 1 C1 117.2 lb - 3 (CH2)2OMe 0 - 1 C1 89.7 lb - 4 n-Pr 0 - 1 C1 158.3
Ib-5 (CH2)2CH e2 0 - 1 C1 90.1 lb- 6 (CH2)60H 0 - 1 C1 107.9 lb- 7 (CH2)2CH(Me) CH20H 0 - 1 C1 112.7 lb- 8 fur furyl 0 - 1 C1 142.0
Ib-9 CH2CH=CMe2 0 - 1 C1 95.9
Ib-10 CH2CH=C(Me) CH20H 0 - 1 C1 154.8 lb- 11 Et 0 - 1 C1 156.7 lb- 12 i-Pr 0 - 1 C1 112.5
Ib-13 CH2CH-CH2 0 - 1 C1 147.3
Ib-14 CH2C≡CH 0 - 1 C1 168.4 lb- 15 CH2C02Et 0 - 1 C1 146.1
Ib-16 CH2CH2CN 0 - 1 C1 198.7 lb - 17 CHO 0 - 1 C1 252.1 lb - 18 tetrahydrofurfuryl 0 - 1 C1 syrup, a)
Ib-19 (CH2)3OMe 0 - 1 C1 89.1 lb- 20 CH2CH(OH) CH3 0 - 1 C1 154.2
Ib-21 (CH2)20(CH2)2OH 0 - 1 C1 117.4 lb- 22 CH2CH(OH) CH2OH 0 - 1 C1 147.0 lb- 23 CH2C02Me 0 - 1 C1 190.5 lb- 24 CH2CH2C02Me 0 - 1 C1 117.1
Ib-25 CH(Me) CH2OH 0 ' - 1 C1 52.8 lb - 26 CH2CH2OEt 0 - 1 C1 syrup, b) lb- 27 (CH2)3OEt 0 - 1 C1 syrup, c) 表 15
Figure imgf000096_0001
Figure imgf000096_0002
参考合成例 3 (2, 8—ジクロロ— 4一フエニルキナゾリン （化合物 No. II- 4) の 製造）
8—クロロー 4—フエニル _2 (1H) —キナゾリノン （化合物 No. IV-4) 1. 2 4gにォキシ塩化リン 6. 65 gを加え、 これを 95 で 1時間攪拌した。得られた 反応液を氷水 20 Omlに注ぎ加えた後、 これに重曹を加えて pH.9にした。次いで析 出した結晶をろ取し、回収物をエタノールで苒結晶することにより標記化合物 1. 0 7 gを得た。 Mp.154.4. :„ Ή NMR (CDC13)： 7.52-7.65 (4H, m)， 7.76-7.80 (2H, m), 8.02-8.08 (2H, m). 上記の参考合成例 3と同様にして製造可能な化合物の例を表 16に記載する（上記 の参考合成例 3で製造された化合物も含む） 。 表 16
Figure imgf000097_0001
Figure imgf000097_0002
参考合成例 4 (8_クロ口— 4一フエ二ルー 2 (1H) —キナゾリノン（化合物 No. IV-4) ) の製造）
フエニルマグネシウムブロミド （32 %THF溶液） 7. 10 gに 2—アミノ— 3— クロ口べンゾニトリル 953mgの THF7m 1溶液を室温で滴下し、 30分間加熱還 流した。得られた反応物にクロ口炭酸メチル 885mgを氷冷下滴下した後、 これを 4 0分間加熱還流した。 得られた反応液を冷下時 2 N—塩酸 40 m lに注ぎ加えた後、 これに重曹 8 g及び MTBE2 Om lを加え攪拌した。次いで析出しだ結晶をろ取するこ とにより標記化合物 1. 30gを得た。 'Η NMR (DMS0- d6): 7.24(1H, t, J = 8.0 Hz), 7.57-7.70 (6H, m), 7.90-7.93 (1H, m)， 11.45 (lH,br. s). 参考合成例 5 (4—フエニル— 6—トリフルォロメチル— 2 (1H) —キナゾリノ ン （化合物 No. IV- 7) ) の製造）
2—アミノー 5—トリフルォロメチルベンゾフエノン 7 62mgをクロ口ホルム 1 0m lに溶かし、 これにトリェチルァミン 349 mgを滴下した後、氷冷下トリク 口ロアセチルクロリド 62 7mgを滴下した。 30分間同温で攪拌した後、 これに水 50m lを加え分液した。有機層を回収し、 回収された有機層を濃縮した。得られた 残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー （へキサン：酢酸ェチル =5： 1) で精 製することにより 2 ' ―ベンゾィル一 2, 2, 2—トリクロ口一 4' —トリフルォロ メチルァセトァニリド 1. 088を得た。 '11 1 (CDC13)： 7.53-7.58 (2H, m), 7.66-7.75 (3H, m), 7.90-7.95 (2H, m)， 8.81 (1H, d, J = 8.6 Hz), 12.38 (1H, br. s).
2， —ベンゾィルー 2, 2， 2 _トリクロ口 _4' —トリフルォロメチルァセトァ ニリド 1. 08 g、 DMS01 0m 1及び酢酸アンモニゥム 1. 1 88の混合物を7 5 で 1時間攪拌した。 冷却後、 これに水 1 00m 1を加え、 析出した結晶をろ取した。 得られた回収物をへキサン：酢酸ェチル = 1 ： 1の混合液に溶かした後、 これを無水 硫酸マグネシウムを用いて脱水し、濃縮することにより標記化合物 7 6 5mgを得た 。 Ή NMR (CDC13)： 7.58-7.68 (3H, m), 7.75 (1H, d, J = 8.8 Hz), 7.79-7.83 (2H， m), 7.93 (1H, dd， J = 8.8, 1.7 Hz), 8.17 (1H， br. s), 13.37 (1H， br. s). 上記の参考合成例 4と同様にして製造可能な化合物の例を表 17に記載する（上記 参考合成例 4で製造した化合物も含む） 。 尚、 表 17中にある注釈 「a)」 乃至 「g) 」 は以下の通りである。
a) Ή NMR (DMS0-d6)： 7.27 (1H， dd, J = 7.7, 1.0 Hz), 7.38 (1H， dd, J = 8.3, 1.1 Hz), 7.43-7.55 (5H， m), 7.69 (1H, t, J = 8.1 Hz), 12.18 (1H， br. s). b) (単離精製せず。 ）
c) 1 H NMR参考合成例 4に記載。
d) Ή NMR (DMS0-d6)： 7.52-7.72 (6H, m), 8.10-8.12 (1H, m), 11.69 (1H， br. s). e) Ή NMR (DMS0-d6)： 7.35 (1H, d, J - 9.2 Hz), 7.59-7.71 (6H, m), 7.91 (1H, dd, J = 9.2, 2.2 Hz), 12.08 (1H, br. s). f) Ή NMR参考合成例 5に記載。
g) Ή NMR (DMSO— d6): 7.48 (1H, d, J = 8.4 Hz), 7,60—7.68 (3H:
(2H, m), 8.05 (1H， s), 8.08-8.12 (1H, m), 12.36 (1H, br. s). 表 17
Figure imgf000099_0001
Figure imgf000099_0002
実施例 22 (根部生長促進活性試験）
下記の組成（表 18)からなる園試標準培地を調製した。 クラスターチューブに化 学物質の DMS0溶液を ずつ、 終濃度 O.OOlppn！〜 lOppmになるように分注し、 さらに 滅菌した園試標準培地を 600 1ずつ分注した後、得られた溶液を充分に混合した。 ク ラスタチューブ当り 10〜20粒のシロイヌナズナ種子を前記クラス夕チューブ内に播 種し、 22 、 明所にて 10日間培養した後、 シロイズナズナ種子から生じた主根 （平均 的な主根） の長さを測定した。 8反復の平均値を求め、 下記の式により根部生長率を 求めることにより、 有意な根部生長率 （例えば根部生長率が 120%以上） を示したもの を根部生長促進活性有りとして判定可能であった。
また詳細な結果として、前記終濃度において最も高い根部生長率を示した値を表 1 9に示した。
Figure imgf000100_0001
表 19
化合物 No. 供試終濃度 (ppm) 根部生長促進活性
Ia- 1 2.5 150.9
lb- 1 0.625 129.5
Ib-2 0.625 134.0
Ib-3 1.25 142.5
Ib-4 1.25 136.4
lb - 5 10 120.6
lb- 6 1.25 128.2
lb- 7 1.25 , 128.9
lb- 8 5 155.3
Ib-9 10 121.3
lb - 10 2.5 139.5
Ib-11 1.25 122.8
lb- 12 10 120.4
lb - 13 10 122.4
lb- 15 10 140.4
I -17 2.5 134.0
lb- 18 5 138.5
Ib-19 5 141.9
Ib-20 10 169.0
lb- 21 0.625 125.8
Ib-22 5 134.5
lb - 23 0.625 128.6
lb- 24 2.5 137.9
lb- 25 1.25 126.5
Ib-27 2.5 121.6
Ic-1 10 163.6
Id-1 5 143.9
Ie-1 2.5 184:6
Ie-3 2.5 138.8
Ig-2 2.5 155.9
IH-1 10 141.5 以下に、 本発明において使用される培地の組成を記す。
(a) DOLU+Glu培地
Bacto-yeast nitrogen base without amino acids 6.7g
Glucose 20g
SC - HIS- LEU-URA— (Q-BIOgene社） 1.66g
Histidine 0.076g
Distilled water 1000ml
(b) DOLU+Gal培地
Bacto-yeast nitrogen base without amino acids 6.7g
Glucose 20g
SC- HIS- LEU- URA (Q- BlOgene社） 1.66g
Histidine 0.076g
Distilled water 1000ml 産業上の利用可能性
本発明により、植物の生長若しくは分化を制御する薬剤、並びに、標的を明確にし た有用な生物活性を有する化学物質の探索手法、即ち、標的部位を化学的に調節する ベぐ特定の標的に対する活性を指標として化学物質をスクリーニングする方法等が 提供可能となる。 配列表フリーテキスト
配列番号 3
PCRのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマ一
配列番号 4
PCRのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号 5
PCRのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号 6 PCRのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマ一 配列番号 7
PCRのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマ一 配列番号 8
PCRのために設計されたォリゴヌクレオチドプライマ一

Claims

請求の範囲
1 .植物の生長若しくは分化を制御する薬剤であり、細胞が有する植物由来のサイト カイニン受容体からの細胞内信号伝達を阻害する活性を有することを特徴とする薬
5 剤。
2 .植物を生長若しくは分化を制御する薬剤が、植物成長調節剤であることを特徴と する請求項 1記載の薬剤。
10 3 .植物の生長若しくは分化を制御する薬剤が、植物体の生長を制御する薬剤である ことを特徴とする請求項 1記載の薬剤。
4 .植物の生長若しくは分化を制御する薬剤が、植物細胞の分化を制御する薬剤であ ることを特徴とする請求項 1記載の薬剤。
15
5 .植物体の生長を制御する薬剤が、植物の芽の生長の制御のための薬剤であること を特徴とする請求項 3記載の薬剤。
6 .植物の芽の生長の制御が、腋芽抑制等であることを特徴とする請求項 5記載の薬 20 剤。
7 .植物の芽の生長の制御が、花芽抑制等であることを特徴とする請求項 5記載の薬 剤。
25 8 .植物体の生長を制御する薬剤が、植物の苗立ちを促進させる薬剤であることを特 • 徵とする請求項 3記載の薬剤。 ' .
9 .植物体の生長を制御する薬剤が、植物の分げつを促進させる薬剤であることを特 徵とする請求項 3記載の薬剤。
1 0 .植物体の生長を制御する薬剤が、植物の根の生長を促進させる薬剤であること を特徴とする請求項 3記載の薬剤。
1 1 . 細胞が有する植物由来のサイ卜カイニン受容体が、下記の群 Aから選択される サイトカイニン受容体であることを特徴とする請求項 1〜1 0いずれか一項記載の 薬剤。
く群 A〉
( a ) 配列番号 1で示されるアミノ酸配列からなる蛋白質
( b )配列番号 1で示されるアミノ酸配列において、 1もしくは複数のアミノ酸が欠 失、付加もしくは置換されたアミノ酸配列からなり、かつサイトカイニン受容体とし て機能する活性を有する蛋白質
( c )配列番号 1で示されるアミノ酸配列と 4 5 %以上の配列同一性を有するァミノ 酸配列からなり、 かつサイトカイニン受容体として機能する活性を有する蛋白質 ( d )配列番号 2で示される塩基配列によりコードされるアミノ酸配列からなる蛋白 質
( e )配列番号 2で示される塩基配列を有するポリヌクレオチドに対し相補性を有す るポリヌクレオチドと、ストリンジェン卜な条件下でハイプリダイズするポリヌクレ ォチドによりコードされるアミノ酸配列からなり、かつサイトカイニン受容体として 機能する活性を有する蛋白質
1 2 .細胞が有する植物由来のサイトカイニン受容体からの細胞内信号伝達を阻害す る活性が、下記の群 Aから選択されるサイトカイニン受容体を有する細胞と、前記サ ィトカイニン受容体に対してァゴニスト活性を有する物質との接触系において、前記 サイトカイニン受容体からの細胞内信号伝達を阻害する活性であることを特徴とす る請求項 1〜 1 0いずれか一項記載の薬剤。
<群 A>
( a ) 配列番号 1で示されるアミノ酸配列からなる蛋白質 ( b )配列番号 1で示されるアミノ酸配列において、 1もしくは複数のアミノ酸が欠 失、付加もしくは置換されたアミノ酸配列からなり、かつサイトカイニン受容体とし て機能する活性を有する蛋白質
( c )配列番号 1で示されるアミノ酸配列と 4 5 %以上の配列同一性を有するァミノ 酸配列からなり、 かつサイトカイニン受容体として機能する活性を有する蛋白質
( d )配列番号 2で示される塩基配列によりコードされるアミノ酸配列からなる蛋白 質
( e )配列番号 2で示される塩基配列を有するポリヌクレオチドに対し相補性を有す るポリヌクレオチドと、ストリンジェン卜な条件下でハイプリダイズするポリヌクレ ォチドによりコードされるアミノ酸配列からなり、かつサイトカイニン受容体として 機能する活性を有する蛋白質 -
1 3 .有効成分として、細胞が有する植物由来のサイトカイニン受容体からの細胞内 信号伝達を阻害する化学物質又はその農学的に許容される塩を含有することを特徴 とする植物成長調節剤。
1 4. 前記化学物質が、下記の群 Aから選択されるサイトカイニン受容体を有する細 胞と、前記サイトカイニン受容体に対してァゴニスト活性を有する物質と、前記化学 物質との接触系内において、前記サイトカイニン受容体からの細胞内信号伝達を阻害 する活性を有する化学物質であることを特徴とする請求項 1 3記載の植物成長調節 剤。
ぐ群 A>
( a ) 配列番号 1で示されるアミソ酸配列からなる蛋白質
( b )配列番号 1で示されるアミノ酸配列において、 1もしくは複数のアミノ酸が欠 失、付加もしくは置換されたアミノ酸配列からなり、かつサイトカイニン受容体とし て機能する活性を有する蛋白質
( c )配列番号 1で示されるアミノ酸配列と 4 5 %以上の配列同一性を有するァミノ 酸配列からなり、 かつサイトカイニン受容体として機能する活性を有する蛋白質 ( d )配列番号 2で示される塩基配列によりコードされるァミノ酸配列からなる蛋白 質
( e )配列番号 2で示される塩基配列を有するポリヌクレオチドに対し相補性を有す るポリヌクレオチドと、ストリンジェントな条件下でハイプリダイズするポリヌクレ ォチドによりコードされるアミノ酸配列からなり、かつサイトカイニン受容体として 機能する活性を有する蛋白質
1 5 .サイトカイニン受容体に対してァゴニスト活性を有する物質が、 トランスゼァ チンであることを特徴とする請求項 1 4記載の植物成長調節剤。
1 6 . 前記化学物質が、下記の群 Aから選択されるサイトカイニン受容体を有する細 胞と、 0 . 6 ppmのトランスゼァチンと、 2 ppmの前記化学物質との接触系内において 、前記化学物質が存在しない場合よりも前記サイトカイニン受容体からの細胞内信号 伝達を阻害する活性を有する化学物質であることを特徴とする請求項 1 3記載の植 物成長調節剤。
く群 A〉
( a ) 配列番号 1で示されるアミノ酸配列からなる蛋白質
( b )配列番号 1で示されるアミノ酸配列において、 1もしくは複数のアミノ酸が欠 失、付加もしくは置換されたアミノ酸配列からなり、かつサイトカイニン受容体とし て機能する活性を有する蛋白質
( c )配列番号 1で示されるアミノ酸配列と 4 5 %以上の配列同一性を有するァミノ 酸配列からなり、 かつサイトカイニン受容体として機能する活性を有する蛋白質
( d )配列番号 2で示される塩基配列によりコードされるアミノ酸配列からなる蛋白 質
( e )配列番号 2で示される塩基配列を有するポリヌクレオチドに対し相補性を有す るポリヌクレオチドと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレ ォチドによりコードされるアミノ酸配列からなり、かつサイトカイニン受容体として 機能する活性を有する蛋白質
1 7 .前記化学物質が、下記の群 Aから選択されるサイトカイニン受容体を有する細 胞と、 0 . 6 ppmのトランスゼァチンと、 2 ppmの前記化学物質との接触系内において 、前記化学物質が存在しない場合よりも前記サイトカイ二ン受容体からの細胞内信号 伝達を 9 0 %以上阻害する活性を有する化学物質であることを特徴とする請求項 1 3記載の植物成長調節剤。
<群 A>
( a ) 配列番号 1で示されるアミノ酸配列からなる蛋白質
( b )配列番号 1で示されるアミノ酸配列において、 1もしくは複数のアミノ酸が欠 失、付加もしくは置換されたアミノ酸配列からなり、かつサイトカイニン受容体とし て機能する活性を有する蛋白質
( c )配列番号 1で示されるアミノ酸配列と 4 5 %以上の配列同一性を有するァミノ 酸配列からなり、 かつサイトカイ:^ン受容体として機能する活性を有する蛋白質
( d )配列番号 2で示される塩基配列によりコードされるァミノ酸配列からなる蛋白 質
( e )配列番号 2で示される塩基配列を有するポリヌケレオチドに対し相補性を有す るポリヌクレオチドと、ストリンジェン卜な条件下でハイプリダイズするポリヌクレ ォチドによりコードされるアミノ酸配列からなり、かつサイトカイニン受容体として 機能する活性を有する蛋白質
1 8 . 植物の根の生長を促進させる能力を有する化学物質の探索方法であって、
( 1 )下記の群 Aから選択されるサイトカイニン受容体を有する細胞と、前記サイト カイニン受容体に対してァゴニスト活性を有する物質と、被験物質との接触系内にお いて、前記サイトカイニン受容体からの細胞内信号伝達の量を測定する第一工程、及 び
( 2 )第一工程により測定された細胞内信号伝達の量と前記化学物質が存在しない場 合における細胞内信号伝達の量とを比較することにより得られる差異に基づき植物 の根の生長を促進させる能力を有する化学物質を選択する第二工程、 を有することを特徴とする方法。
く群 A〉
( a ) 配列番号 1で示されるアミノ酸配列からなる蛋白質
( b )配列番号 1で示されるアミノ酸配列において、 1もしくは複数のアミノ酸が欠 5 失、付加もしくは置換されたアミノ酸配列からなり、かつサイトカイニン受容体とし て機能する活性を有する蛋白質
( c )配列番号 1で示されるアミノ酸配列と 4 5 %以上の配列同一性を有するァミノ 酸配列からなり、 かつサイトカイニン受容体として機能する活性を有する蛋白質
( d )配列番号 2で示される塩基配列によりコードされるアミノ酸配列からなる蛋白0 質
( e )配列番号 2で示される塩基配列を有するポリヌクレオチドに対し相補性を有す るポリヌクレオチドと、ストリンジェン卜な条件下でハイブリダイズするポリヌクレ ォチドによりコードされるアミノ酸配列からなり、かつサイトカイニン受容体として 機能する活性を有する蛋白質
5
1 9 .サイトカイニン受容体を有する細胞が、配列番号 1で示されるアミノ酸配列を コードする塩基配列からなるポリヌクレオチドが導入されてなる形質転換細胞であ ることを特徴とする請求項 1 8記載の探索方法。 0
2 0 .サイトカイニン受容体を有する細胞が、配列番号 1で示されるアミノ酸配列を コードする塩基配列からなるポリヌクレオチドが導入されてなる形質転換酵母細胞 であることを特徴とする請求項 1 8記載の探索方法。
2 1 .サイトカイニン受容体に対してァゴニスト活性を有する物質が、 トランスゼァ '5 チンであることを特徴とする請求項 1 8、 1 9又は 2 0記載の探索方法。
2 2 . 請求項 1 8、 1 9、 2 Q又は 2 1記載の探索方法により選抜された化学物質又 はその農学的に許容される塩を有効成分として含有することを特徴とする植物成長 調節剤。
2 3 . 請求項 1 3、 1 4、 1 5、 1 6、 1 7又は 2 2記載の植物成長調節剤の有効量 を、 植物又はその生息場所に施用することを特徴とする植物成長調節方法。
2 4. 請求項 1 8、 1 9、 2 0又は 2 1記載の探索方法により植物の根の生長を促進 させる能力を有する化学物質を特定し、特定された植物の根の生長を促進させる能力 を有する化学物質と植物とを接触させることを特徴とする植物成長調節方法。 0
2 5 . 有効成分として、 一般式 （I )
Figure imgf000110_0001
(式中、 Rおよび Xは同一または異なって置換されていてもよい炭化水素基、 NR 2で 表される基、 OR3で表される基、 S (0)nR4で表される基、 ニトロ基またはハロゲン原子 を示し、
5 ここで R1は水素原子または置換されていてもよい炭化水素基を示し、
R2は水素原子、 置換されていてもよい炭化水素基、 NR5 R6で表される基 （ここで R5お よび R6は同一もしくは異なり水素原子または置換されていてもよい C1-6アルキル基 を示す） または OR7で表される基 （ここで R7は水素原子または置換されていてもよい C1-6アルキル基を示す） を示し、又は R1および R2が隣接する窒素原子と一緒になつて0 置換されていてもよい環状アミノ基を示し、
R3および R4はそれぞれ置換されていてもよい炭化水素基を示し、
1は。〜 1の整数を示し、
mは 0〜2の整数を示し、
, nは 0〜4の整数を示し、
5 nが 2以上の場合 Xは同一または異なっていてもよく、
Arは置換されていてもよいァリール基または置換されていてもよいへテロアリール 基を示す）で表される化合物又はその農学的に許容される塩を含有することを特徴と する植物成長調節剤。
2 6. 1が 1であり、 Rが置換されていてもよい炭化水素基である請求項 2 5記載の植 物成長調節剤。
2 7. 1力 1であり、 Rがハロゲン原子又はォキソ基で置換されていてもよい C1- 3ァ ルキル基である請求項 2 5記載の植物成長調節剤。
2 8.置換されていてもよい炭化水素基がハロゲン原子またはォキソ基で置換されて いてもよい C1- 3アルキル基である請求項 2 6記載の植物成長調節剤。
29. 1が 1であり、 Rが NR'R2で表される基である請求項 2 5記載の植物成長調節剤。
3 0. R1が水素原子または C1- 3アルキル基を示し、 R2が水素原子、 アミノ基、 C1 - 3 アルキルアミノ基、 ジ C卜 3アルキルアミノ基、 アミジノ基、 C1-3アルコキシ基、 フエ ニル基、 C1- 3ァシル基、 C1-6アルキル基、 C3- 6アルケニル基または C3-6アルキニル基 を示し、ここで前記のフエ二ル基は 1〜3個の同じもしくは異なる C1- 3アルキル基で置 換されていてもよく、 前記のフエニル基、 ァシル基、 アルキル基、 アルケニル基およ びアルキニル基はハロゲン原子、ヒドロキシル基、 C1-3アルコキシ基、ヒドロキシ C1-3 アルコキシ基、 力ルポキシル基、 C1- 3アルコキシカルポニル基、 力ルバモイル基、 ァ ミノ基、 C1- 3アルキルアミノ基、 ジ C卜 3アルキルアミノ基、 メルカプト基、 C1-3ァシ ルチオ基、 シァノ基、 フリル基およびテトラヒドロフリル基の中から選ばれる 1〜3 個の同じもしくは異なる置換基で置換されていてもよく、又は R1および R2が隣接する 窒素原子と一緒になつてピロリジノ基、ピペリジノ基またはモルホリノ基を示す請求 項 2 9記載の植物成長調節剤。
3 1. R1が水素原子を示し、 R2が水素原子、 ホルミル基、 C1-6アルキル基、 C3- 6アル ケニル基または C3- 6アルキニル基を示し、 ここで前記のアルキル基、 アルケニル基お よびアルキニル基はヒドロキシル基、 メトキシ基、 メトキシカルポニル基、 エトキシ カルポニル基、シァノ基およびフリル基の中から選ばれる置換基で置換されていても よい請求項 2 9記載の植物成長調節剤。
3 2 . 1が 1であり、 Rが OR3で表される基である請求項 2 5記載の植物成長調節剤。
3 3 . R3がァミノ基で置換されていてもよい C1 -3アルキル基である請求項 3 2記載の 植物成長調節剤。
3 4 . 1が 1であり、 Rが S (0) ra R4で表される基である請求項 2 5記載の植物成長調節剤
3 5 . R4がァミノ基またはヒドロキシル基で置換されていてもよい C1- 3アルキル基で あり、 mが 0である請求項 3 4記載の植物成長調節剤。
3 6 . 1が 1であり、 Rがハロゲン原子である請求項 2 5記載の植物成長調節剤。
3 7 . 八ロゲン原子が塩素原子である請求項 3 6記載の植物成長調節剤。
3 8 . nが 1〜2であり、 Xが C1- 3アルキル基、 C1 - 3アルコキシ基、 C1-3ハロアルキル基 、 シァノ基、ハロゲン原子または二卜口基である請求項 2 5〜3 7いずれか一項記載 の植物成長調節剤。
3 9 . Xが塩素原子、 臭素原子またはニトロ基であり、 Xの置換位置が 6位および/ま たは 8位である請求項 3 8記載の植物成長調節剤。
4 0 . Arがハロゲン原子または C1- 3アルキル基で置換されていてもよいフエニル基で ある請求項 2 5〜 3 9いずれか一項記載の植物成長調節剤。
4 1 .請求項 2 5〜4 0いずれか一項記載の植物成長調節剤の有効量を、植物又はそ の生息場所に施用することを特徴とする植物成長調節方法。
5 4 2 . 式 （XI)
Figure imgf000113_0001
(式中、 Phはフエ二ル基を示し、 R11は水素原子、 ホルミル基、 C1- 6アルキル基、 C3-
6アルケニル基又は C3-6アルキニル基を示し、 ここで前記のアルキル基、 アルケニル 基及びアルキニル基はヒドロキシル基、 C1- 3アルコキシ基、 C1-3アルコキシカルボ二 10 ル基、 シァノ基、 2-フリル基及び 2-テトラヒドロフリル基の中から少なくとも 1っ以 上選ばれる置換基で置換されていてもよく、
mは。〜 3の整数を示し、
nは 0〜：！の整数を示し、
m及び nの少なくとも一方は 0ではなく、
15 X,及び X2はそれぞれ同一又は異なり、 塩素原子、 臭素原子、 トリフルォロメチル基、 シァノ基又はニトロ基を示し、
mが 2以上の場合 X,は同一又は異なる。
ただし、
a) mが 1であり、 X,が 5-塩素原子又は 7-塩素原子であり、 R11がメチル基を示す場合、 20 nは 1の整数を示し、 又は
b) nが 1であり、下記（1)〜 (3)のいずれかの条件を満たす場合、 mは 1〜3の整数を 示す。
(1) X2が塩素原子であり、 R11が水素原子、 メチル基、 2-ヒドロキシェチル基、 3-ヒド • ロキシプロピル基、 2, 2-ジメトキシェチル基及びシァノメチル基の中から選ばれる基 25 である。
(2) X2が臭素原子であり、 R1'が 2-ヒドロキシェチル基、 3-ヒドロキシプロピル基及び 2 -メトキシェチル基の中から選ばれる基である。 (3) X2がニトロ基であり、 R11が 3-ヒドロキシプロピル基である。 ）
で表される化合物又はその農学的に許容される塩。
4 3 . R11が水素原子、 ホルミル基、 メチル基、 ェチル基、 2-ヒドロキシェチル基、 1 -メ卜キシェチル基、 フルフリル基、 メトキシカルボニルメチル基又はエトキシカル ポニルメチル基を示し、 mが 0であり、 n力 1であり、 X2が塩素原子又はニトロ基を 示す請求項 4 2記載の化合物又はその農学的に許容される塩。
4 4 . R11が水素原子、 ホルミル基、 メチル基、 ェチル基、 2-ヒドロキシェチル基、 3 -ヒドロキシプロピル基、 2-メトキシェチル基、 フルフリル基、 メトキシカルポニル メチル基又はエトキシカルボ二ルメチル基を示し、 mが 1であり、 nが 1であり、 X ,が 8-塩素原子であり、 X2が塩素原子又はニトロ基を示す請求項 4 2記載の化合物又 はその農学的に許容される塩。
4 5 . mが 1〜3の整数であり、 nが 0である請求項 4 2記載の化合物又はその農学 的に許容される塩。
4 6 . R11がホルミル基、 C4-6アルキル基、 C3- 6アルケニル基又は C3-6アルキニル基 を示し、 ここで前記のアルキル基、 アルケニル基及びアルキニル基はヒドロキシル基 又は C1-3アルコキシ基で置換されていてもよく、 また R11が C1-3アルコキシ力ルポ二 ルメチル基、 C1-3アルコキシ C1- 3アルキル基又はフルフリル基を示し、
mが 0であり、
nが 1であり、
X2が塩素原子である請求項 4 2記載の化合物又はその農学的に許容される塩。
4 7 . nが 1である請求項 4 2記載の化合物又はその農学的に許容される塩。
4.8 . mが 1〜3であり、 nが 1である請求項 4 2記載の化合物又はその農学的に許 容される塩。
4 9 . R11が C1- 3アルコキシ力ルポニルメチル基又はフルフリル基である請求項 4 2 、 4 5、 4 7又は 4 8に記載の化合物又はその農学的に許容される塩。
5 0 . nが 1であり、 X2がトリフルォロメチル基又はシァノ基である請求項 4 2記載の 化合物又はその農学的に許容される塩。
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