BRPI0719111A2 - Agente par inibir a sinalização de citocinina - Google Patents

Agente par inibir a sinalização de citocinina Download PDF

Info

Publication number
BRPI0719111A2
BRPI0719111A2 BRPI0719111-1A BRPI0719111A BRPI0719111A2 BR PI0719111 A2 BRPI0719111 A2 BR PI0719111A2 BR PI0719111 A BRPI0719111 A BR PI0719111A BR PI0719111 A2 BRPI0719111 A2 BR PI0719111A2
Authority
BR
Brazil
Prior art keywords
group
plant
cytokine receptor
amino acid
acid sequence
Prior art date
Application number
BRPI0719111-1A
Other languages
English (en)
Inventor
Asako Nagasawa
Yuto Arata
Hideki Uneme
Original Assignee
Sumitomo Chemical Co
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from JP2007022850A external-priority patent/JP5082474B2/ja
Application filed by Sumitomo Chemical Co filed Critical Sumitomo Chemical Co
Publication of BRPI0719111A2 publication Critical patent/BRPI0719111A2/pt
Publication of BRPI0719111A8 publication Critical patent/BRPI0719111A8/pt

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D405/00—Heterocyclic compounds containing both one or more hetero rings having oxygen atoms as the only ring hetero atoms, and one or more rings having nitrogen as the only ring hetero atom
    • C07D405/02—Heterocyclic compounds containing both one or more hetero rings having oxygen atoms as the only ring hetero atoms, and one or more rings having nitrogen as the only ring hetero atom containing two hetero rings
    • C07D405/12—Heterocyclic compounds containing both one or more hetero rings having oxygen atoms as the only ring hetero atoms, and one or more rings having nitrogen as the only ring hetero atom containing two hetero rings linked by a chain containing hetero atoms as chain links
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01G—HORTICULTURE; CULTIVATION OF VEGETABLES, FLOWERS, RICE, FRUIT, VINES, HOPS OR SEAWEED; FORESTRY; WATERING
    • A01G7/00—Botany in general
    • A01G7/06—Treatment of growing trees or plants, e.g. for preventing decay of wood, for tingeing flowers or wood, for prolonging the life of plants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N43/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing heterocyclic compounds
    • A01N43/48—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing heterocyclic compounds having rings with two nitrogen atoms as the only ring hetero atoms
    • A01N43/54—1,3-Diazines; Hydrogenated 1,3-diazines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N61/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing substances of unknown or undetermined composition, e.g. substances characterised only by the mode of action
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D239/00—Heterocyclic compounds containing 1,3-diazine or hydrogenated 1,3-diazine rings
    • C07D239/70—Heterocyclic compounds containing 1,3-diazine or hydrogenated 1,3-diazine rings condensed with carbocyclic rings or ring systems
    • C07D239/72—Quinazolines; Hydrogenated quinazolines
    • C07D239/78—Quinazolines; Hydrogenated quinazolines with hetero atoms directly attached in position 2
    • C07D239/84—Nitrogen atoms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/502—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics for testing non-proliferative effects
    • G01N33/5041—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics for testing non-proliferative effects involving analysis of members of signalling pathways
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5097—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving plant cells
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/415—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from plants
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2500/00—Screening for compounds of potential therapeutic value
    • G01N2500/04—Screening involving studying the effect of compounds C directly on molecule A (e.g. C are potential ligands for a receptor A, or potential substrates for an enzyme A)

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Pest Control & Pesticides (AREA)
  • Agronomy & Crop Science (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Dentistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Biodiversity & Conservation Biology (AREA)
  • Ecology (AREA)
  • Forests & Forestry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)
  • Cultivation Of Plants (AREA)

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "AGENTE PARA INIBIR A SINALIZAÇÃO DE CITOCININA".
Campo técnico
A presente invenção refere-se a um agente que tem uma ativi- dade de inibir a sinalização intracelular de um receptor de citocinina derivado da planta e controlar o crescimento ou diferenciação de uma planta, e simila- res.
Antecedente da Técnica
Citocinina é um hormônio da planta envolvido na divisão celular e diferenciação da plantas mais altas, e é uma substância biologicamente ativa importante que é conhecida para exercer ações tais como indução de divisão celular da planta mais altas, diferenciação de calo ou medula à fo- lhagem, prevenção de etiolação de folhas, folhas caídas e fruta caída, e anu- lação da dominância apical (Cytokinins: Chemistry, Activity, and Function, CRC Press (1994)). Como um método de controlar fenômenos fisiológicos causados por citocinina, um método compreendendo produzir citocinina do exterior, um método compreendendo controlar biogênese de citocinina em um corpo da planta, um método compreendendo controlar metabolismo de citocinina em um corpo da planta e similares foi proposto.
Uma substância química que serve como o ingrediente ativo de um regulador de crescimento da planta foi convencionalmente encontrada por avaliação randomizada em que uma substância química de teste é dire- tamente contatada com uma planta e em seguida uma atividade biológica da planta é testada. Neste caso, depois que uma substância química tendo uma atividade biológica útil é determinada, é necessário intensivamente estudar que tipo de mecanismo de ação há para a substância química mostrar seu efeito e o que é alvejado pela substância química no nível molecular, para prognosticar a segurança e carga no ambiente da substância química. Descrição de Invenção
Um objetivo da presente invenção é fornecer um agente capaz de controlar o crescimento ou diferenciação de uma planta, e um método para procurar uma substância química tendo uma atividade biológica útil cujo alvo tornou-se claro, isto é, um método para avaliar uma substância química utilizando uma atividade em um alvo específico como um indicador para quimicamente controlar um sítio alvo. Especificamente, um objetivo da pre- sente invenção é fornecer um agente que tem uma atividade de inibir a sina- lização intracelular a partir de um receptor de citocinina derivado da planta e controlar o crescimento ou diferenciação de uma planta, e um método para procurar uma substância química que sirva como um ingrediente ativo do agente.
Desse modo, a presente invenção fornece;
(1) agente capaz de controlar o crescimento ou diferenciação de uma planta que tem uma atividade de inibir a sinalização intracelular de um receptor de citocinina derivado da planta de uma célula;
(2) o agente de acordo com o anterior (1), em que o agente capaz de contro- lar o crescimento ou diferenciação de uma planta é um regulador de cresci- mento da planta;
(3) o agente de acordo com o anterior (1), em que o agente capaz de contro- lar o crescimento ou diferenciação de uma planta é um agente capaz de con- trolar o crescimento de um corpo da planta;
(4) o agente de acordo com o anterior (1), em que o agente capaz de contro- lar o crescimento ou diferenciação de uma planta é um agente capaz de con- trolar a diferenciação de uma célula da planta;
(5) o agente de acordo com o anterior (3), em que o agente capaz de contro- lar o crescimento de uma planta é um agente capaz de controlar o cresci- mento de um broto de uma planta;
(6) o agente de acordo com o anterior (5), em que controla do crescimento de um broto de uma planta é inibição do crescimento de um broto axilar;
(7) o agente de acordo com o anterior (5), em que controle do crescimento de um broto de uma planta é inibição do crescimento de um broto de flor;
(8) o agente de acordo com o anterior (3), em que o agente capaz de contro- lar o crescimento de um corpo da planta é um agente capaz de promover o estabelecimento de resistência de uma planta;
(9) o agente de acordo com o anterior (3), em que o agente capaz de contro- Iar o crescimento de um corpo da planta é um agente capaz de promover o cultivo de uma planta;
(10) o agente de acordo com o anterior (3), em que o agente capaz de con- trolar o crescimento de um corpo da planta é um agente capaz de promover o crescimento de uma raiz de uma planta;
(11)o agente de acordo com qualquer um dos anterior (1) a (10), em que o receptor de citocinina derivado da planta de uma célula é um receptor de citocinina selecionado a partir do seguinte grupo A:
<Grupo A>
(a) uma proteína compreendendo a seqüência de aminoácido SEQ ID NO:1,
(b) uma proteína compreendendo uma seqüência de aminoácido SEQ ID NO:1 em que um ou mais aminoácidos são deletados, adicionados ou subs- tituídos, e tendo uma atividade de funcionar como um receptor de citocinina,
(c) uma proteína compreendendo uma seqüência de aminoácido tendo uma identidade de seqüência de 45% ou mais com a seqüência de aminoácido SEQ ID NO:1, e tendo uma atividade de funcionar como um receptor de cito- cinina
(d) uma proteína compreendendo uma seqüência de aminoácido codificada pela seqüência de nucleotídeo de SEQ ID NO:2
(e) uma proteína compreendendo uma seqüência de aminoácido codificada por um polinucleotídeo que hibridiza sob uma condição estrita com um poli- nucleotídeo complementar a um polinucleotídeo tendo a seqüência de nu- cleotídeo de SEQ ID NO:2, e tendo uma atividade de funcionar como um receptor de citocinina;
(12) o agente de acordo com qualquer um dos anterior (1) a (10), em que a atividade de inibir a sinalização intracelular de um receptor de citocinina de- rivado da planta de uma célula é uma atividade de inibir a sinalização intra- celular de um receptor de citocinina selecionado a partir do seguinte grupo A em um sistema de contato de uma célula tendo o receptor de citocinina com uma substância tendo uma atividade agonística ao receptor de citocinina; <Grupo A>
(a) uma proteína compreendendo a seqüência de aminoácido SEQ ID NO:1, * (b) uma proteína compreendendo uma seqüência de aminoácido SEQ ID NO:1 em que um ou mais aminoácidos são deletados, adicionados ou subs- tituídos, e tendo uma atividade de funcionar como um receptor de citocinina,
(c) uma proteína compreendendo uma seqüência de aminoácido tendo uma identidade de seqüência de 45% ou mais com a seqüência de aminoácido
SEQ ID NO:1, e tendo uma atividade de funcionar como um receptor de cito- cinina
(d) uma proteína compreendendo uma seqüência de aminoácido codificada pela seqüência de nucleotídeo de SEQ ID NO:2
(e) uma proteína compreendendo uma seqüência de aminoácido codificada por um polinucleotídeo que hibridiza sob uma condição estrita com um poli- nucleotídeo complementar a um polinucleotídeo tendo a seqüência de nu- cleotídeo de SEQ ID NO:2, e tendo uma atividade de funcionar como um receptor de citocinina; (13) um regulador de crescimento da planta compreendendo uma substância química capaz de inibir a sinalização intracelular de um receptor de citocini- na derivado da planta de uma célula, ou um sal agricolamente aceitável do mesmo, como um ingrediente ativo;
(14) o regulador de crescimento da planta de acordo com o anterior (13), em ι 20 que a substância química tem uma atividade de inibir a sinalização intracelu- lar de um receptor de citocinina selecionado a partir do seguinte grupo A em um sistema de contato compreendendo uma célula tendo o receptor de cito- cinina, uma substância tendo uma atividade agonística ao receptor de citoci- nina, e a substância química; <Grupo A>
(a) uma proteína compreendendo a seqüência de aminoácido SEQ ID NO:1,
(b) uma proteína compreendendo uma seqüência de aminoácido SEQ ID NO:1 em que um ou mais aminoácidos são deletados, adicionados ou subs- tituídos, e tendo uma atividade de funcionar como um receptor de citocinina,
(c) uma proteína compreendendo uma seqüência de aminoácido tendo uma identidade de seqüência de 45% ou mais com a seqüência de aminoácido SEQ ID NO:1, e tendo uma atividade de funcionar como um receptor de cito- cinina (d) uma proteína compreendendo uma seqüência de aminoácido codificada pela seqüência de nucleotídeo de SEQ ID NO:2
(e) uma proteína compreendendo uma seqüência de aminoácido codificada por um polinucleotídeo que hibridiza sob uma condição estrita com um poli- nucleotídeo complementar a um polinucleotídeo tendo a seqüência de nu- cleotídeo de SEQ ID NO:2, e tendo uma atividade de funcionar como um receptor de citocinina;
(15) o regulador de crescimento da planta de acordo com o anterior (14), em que a substância tendo uma atividade agonística ao receptor de citocinina é trans-zeatina;
(16) o regulador de crescimento da planta de acordo com o anterior (13), em que a substância química tem uma atividade de baixar a sinalização intrace- lular de um receptor de citocinina selecionado a partir do seguinte grupo A em um sistema de contato compreendendo uma célula tendo o receptor de citocinina, 0,6 ppm de trans-zeatina e 2 ppm da substância química, quando comparado com o caso onde a substância química não está presente no sistema de contato;
<Grupo A>
(a) uma proteína compreendendo a seqüência de aminoácido SEQ ID NO:1,
(b) uma proteína compreendendo uma seqüência de aminoácido SEQ ID NO:1 em que um ou mais aminoácidos são deletados, adicionados ou subs- tituídos, e tendo uma atividade de funcionar como um receptor de citocinina,
(c) uma proteína compreendendo uma seqüência de aminoácido tendo uma identidade de seqüência de 45% ou mais com a seqüência de aminoácido SEQ ID NO:1, e tendo uma atividade de funcionar como um receptor de cito- cinina
(d) uma proteína compreendendo uma seqüência de aminoácido codificada pela seqüência de nucleotídeo de SEQ ID NO:2
(e) uma proteína compreendendo uma seqüência de aminoácido codificada por um polinucleotídeo que hibridiza sob uma condição estrita com um poli- nucleotídeo complementar a um polinucleotídeo tendo a seqüência de nu- cleotídeo de SEQ ID NO:2, e tendo uma atividade de funcionar como um receptor de citocinina;
(17) o regulador de crescimento da planta de acordo com o anterior (13), em que a substância química tem uma atividade de baixar a sinalização intrace-
Iular de um receptor de citocinina selecionado a partir do seguinte grupo A em 90% ou mais em um sistema de contato compreendendo uma célula tendo o receptor de citocinina, 0,6 ppm de trans-zeatina e 2 ppm da subs- tância química, quando comparado com o caso onde a substância química não está presente no sistema de contato; <GrupoA>
(a) uma proteína compreendendo a seqüência de aminoácido SEQ ID NO:1,
(b) uma proteína compreendendo uma seqüência de aminoácido SEQ ID NO:1 em que um ou mais aminoácidos são deletados, adicionados ou subs- tituídos, e tendo uma atividade de funcionar como um receptor de citocinina,
(c) uma proteína compreendendo uma seqüência de aminoácido tendo uma identidade de seqüência de 45% ou mais com a seqüência de aminoácido SEQ ID NO:1, e tendo uma atividade de funcionar como um receptor de cito- cinina
(d) uma proteína compreendendo uma seqüência de aminoácido codificada k 20 pela seqüência de nucleotídeo de SEQ ID NO:2
(e) uma proteína compreendendo uma seqüência de aminoácido codificada por um polinucleotídeo que hibridiza sob uma condição estrita com um poli- nucleotídeo complementar a um polinucleotídeo tendo a seqüência de nu- cleotídeo de SEQ ID NO:2, e tendo uma atividade de funcionar como um
receptor de citocinina;
(18) um método para procurar uma substância química capaz de promover o crescimento de uma raiz de uma planta, que compreende:
<1> uma primeira etapa de medir a quantidade de sinalização intracelular de um receptor de citocinina selecionado a partir do seguinte grupo A em um sistema de contato compreendendo uma célula tendo o receptor de citocini- na, uma substância tendo uma atividade agonística ao receptor de citocinina e uma substância teste; e <2> uma segunda etapa de selecionar uma substância química capaz de promover o crescimento de uma raiz de uma planta na base de uma diferen- ça obtida comparando-se a quantidade de sinalização intracelular medida na primeira etapa com a quantidade de sinalização intracelular na ausência da substância química; <Grupo A>
(a) uma proteína compreendendo a seqüência de aminoácido SEQ ID NO:1,
(b) uma proteína compreendendo uma seqüência de aminoácido SEQ ID NO:1 em que um ou mais aminoácidos são deletados, adicionados ou subs- tituídos, e tendo uma atividade de funcionar como um receptor de citocinina,
(c) uma proteína compreendendo uma seqüência de aminoácido tendo uma identidade de seqüência de 45% ou mais com a seqüência de aminoácido SEQ ID NO:1, e tendo uma atividade de funcionar como um receptor de cito- cinina
(d) uma proteína compreendendo uma seqüência de aminoácido codificada pela seqüência de nucleotídeo de SEQ ID NO:2
(e) uma proteína compreendendo uma seqüência de aminoácido codificada por um polinucleotídeo que hibridiza sob uma condição estrita com um poli- nucleotídeo complementar a um polinucleotídeo tendo a seqüência de nu- cleotídeo de SEQ ID NO:2, e tendo uma atividade de funcionar como um receptor de citocinina;
(19) o método minucioso de acordo com o anterior (18), em que a célula tendo o receptor de citocinina é uma célula transformada em que um polinu- cleotídeo compreendendo uma seqüência de nucleotídeo codificando a se- qüência de aminoácido SEQ ID NO:1 é introduzido;
(20) o método minucioso de acordo com o anterior (18), em que a célula tendo o receptor de citocinina é uma célula de levedura transformada em que um polinucleotídeo compreendendo uma seqüência de nucleotídeo codi- ficando a seqüência de aminoácido SEQ ID NO:1 é introduzido;
(21) o método minucioso de acordo com o anterior (18), (19) ou (20), em que a substância tendo uma atividade agonística ao receptor de citocinina é trans-zeatina; (22) um regulador de crescimento da planta compreendendo uma substância química selecionada pelo método minucioso de acordo com o anterior (18), (19), (20) ou (21), ou um sal agricolamente aceitável do mesmo, como um ingrediente ativo;
(23) um método de regulamento de crescimento da planta, que compreende aplicar uma quantidade eficaz do regulador de crescimento da planta de a- cordo com o anterior (13), (14), (15), (16), (17) ou (22) a uma planta ou um hábitat da planta;
(24) um método de regulamento de crescimento da planta compreendendo determinar uma substância química capaz de promover o crescimento de uma raiz de uma planta pelo método minucioso de acordo com o anterior (18), (19), (20) ou (21), e trazendo a substância química capaz de promover o crescimento de uma raiz de uma planta desse modo determinada em con- tato com uma planta; (25) um regulador de crescimento da planta compreendendo um composto representado pela fórmula geral (I):
O)
(X)n"'
Ar
em que ReX são os mesmos ou diferentes e representam um grupo hidro- carboneto opcionalmente substituído, um grupo representado por NR1R2, um grupo representado por OR3, um grupo representado por S(O)mR4, um grupo nitro ou um átomo de halogênio, em que R1 representa um átomo de hidro- gênio ou um grupo hidrocarboneto opcionalmente substituído, R2 representa um átomo de hidrogênio, um grupo hidrocarboneto opcional- mente substituído, um grupo representado por NR5R6 (em que R5 e R6 são os mesmos ou diferentes e representam um átomo de hidrogênio ou um grupo C1-C6 alquila opcionalmente substituído) ou um grupo representado por OR7 (em que R7 representa um átomo de hidrogênio ou um grupo CrC6 alquila opcionalmente substituído), ou R1 e R2 são empregados juntamente com o átomo de nitrogênio ao qual eles são ligados para formar um grupo amino cíclico opcionalmente substituído, R3 e R4 cada qual representa um grupo hidrocarboneto opcionalmente subs- tituído,
I representa um número inteiro de 0 a 1, m representa um número inteiro de 0 a 2, η representa um número inteiro de 0 a 4,
quando η for 2 ou mais, cada X é o mesmo ou diferente um do outro, e Ar representa um grupo arila opcionalmente substituído ou um grupo hetero- arila opcionalmente substituído; ou um sal agricolamente aceitável do mes- mo, como um ingrediente ativo; (26) o regulador de crescimento da planta de acordo com o anterior (25), em que I é 1 e R é um grupo hidrocarboneto opcionalmente substituído; (27) o regulador de crescimento da planta de acordo com o anterior (25), em que I é 1 e R é um grupo C1-3 alquila que é opcionalmente substituído com (a) átomo(s) de halogênio ou (um) grupo(s) oxo; (28) o regulador de crescimento da planta de acordo com o anterior (26), em que o grupo hidrocarboneto opcionalmente substituído é um grupo C1-3 al- quila que é opcionalmente substituído com (a) átomo(s) de halogênio ou (um) grupo(s) oxo;
(29) o regulador de crescimento da planta de acordo com o anterior (25), em que I é 1 e R é um grupo representado por NR1R2;
(30) o regulador de crescimento da planta de acordo com o anterior (29), em que R1 representa um átomo de hidrogênio ou um grupo C1-3 alquila, R2 representa um átomo de hidrogênio, um grupo amino, um grupo C1-3 alqui- lamino, um grupo di C1-3 alquilamino, um grupo amidino, um grupo Ci-3
alcóxi, um grupo fenila, um grupo C1-3 acila, um grupo C1-6 alquila, um gru- po C3-6 alquenila ou um grupo C3-6 alquinila em que o grupo fenila é opcio- nalmente substituído com 1 a 3 os mesmos ou diferentes grupos C1-3 alqui- la, o grupo fenila, o grupo acila, o grupo alquila, o grupo alquenila e o grupo alquinila são opcionalmente substituídos com 1 a 3 os mesmos ou diferentes substituintes selecionados a partir de um átomo de halogênio, um grupo hi- droxila, um grupo C1-3 alcóxi, um grupo hidróxi C1-3 alcóxi, um grupo car- boxila, um grupo C1-3 alcoxicarbonila, um grupo carbamoila, um grupo ami- no, um grupo C1-3 alquilamino, um grupo di C1-3 alquilamino, um grupo mercapto, um grupo C1-3 aciltio, um grupo ciano, um grupo furila e um grupo tetra-hidrofurila, ou R1 e R2 são empregados juntamente com o átomo de nitrogênio ao qual eles são ligados para formar um grupo pirrolidino, um gru- po piperidino ou um grupo morfolino;
(31) o regulador de crescimento da planta de acordo com o anterior (29), em que R1 representa um átomo de hidrogênio, R2 representa um átomo de hi- drogênio, um grupo formila, um grupo C1-6 alquila, um grupo C3-6 alquenila ou um grupo C3-6 alquinila em que o grupo alquila, o grupo alquenila e o
grupo alquinila são opcionalmente substituídos com (a) substituinte(s) sele- cionado a partir de um grupo hidroxila, um grupo metóxi, um grupo metoxi- carbonila, um grupo etoxicarbonila, um grupo ciano e um grupo furila;
(32) o regulador de crescimento da planta de acordo com o anterior (25), em que I é 1 e R é um grupo representado por OR3;
(33) o regulador de crescimento da planta de acordo com o anterior (32), em que R3 é um grupo C1-3 alquila que é opcionalmente substituído com um grupo amino;
(34) o regulador de crescimento da planta de acordo com o anterior (25), em que I é 1 e R é um grupo representado por S(O)mR4; (35) o regulador de crescimento da planta de acordo com o anterior (34), em que R4 é um grupo C1-3 alquila que é opcionalmente substituído com um grupo amino ou um grupo hidroxila, e m é 0;
(36) o regulador de crescimento da planta de acordo com o anterior (25), em que I é 1 e R é um átomo de halogênio; (37) o regulador de crescimento da planta de acordo com o anterior (36), em que o átomo de halogênio é um átomo de cloro;
(38) o regulador de crescimento da planta de acordo com qualquer um do anterior (25) a (37), em que η é de 1 a2eXéum grupo C1-3 alquila, um grupo C1-3 alcóxi, um grupo C1-3 haloalquila, um grupo ciano, um átomo de
halogênio ou um grupo nitro;
(39) o regulador de crescimento da planta de acordo com o anterior (38), em que X é um átomo de cloro, um átomo de bromo ou um grupo nitro, e X está na posição 6 e/ou na posição 8;
(40) o regulador de crescimento da planta de acordo com qualquer um do anterior (25) a (37), em que Ar é um grupo fenila que é opcionalmente subs- tituído com (a) átomo(s) de halogênio ou (a) grupo(s) C1-3 alquila;
(41) um método de regulamento de crescimento da planta compreendendo aplicar uma quantidade eficaz do regulador de crescimento da planta de a- cordo com qualquer um do anterior (25) a (40) a uma planta ou um hábitat da planta;
(42) um composto representado pela fórmula (XI):
em que Ph representa um grupo fenila, R11 representa um átomo de hidro- gênio, um grupo formila, um grupo C1-6 alquila, um grupo C3-6 alquenila ou um grupo C3-6 alquinila em que o grupo alquila, o grupo alquenila e o grupo alquinila são opcionalmente substituídos com pelo menos um substituinte selecionado a partir de um grupo hidroxila, um grupo C1-3 alcóxi, um grupo C1-3 alcoxicarbonila, um grupo ciano, um grupo 2-furila e um grupo 2-tetra- hidrofurila,
m representa um número inteiro de 0 a 3, η representa um número inteiro de 0 a 1, pelo menos um dentre m e η não é 0,
X1 e X2 são os mesmos ou diferentes e representam um átomo de cloro, um átomo de bromo, um grupo trifluorometila, um grupo ciano ou um grupo nitro, quando m for 2 ou mais, cada X1 é o mesmo ou diferente um do outro; con- tanto que
a) quando m for 1, X1 é um átomo de 5-cloro ou um átomo de 7-cloro e R11 representa um grupo metila, η representa um número inteiro de 1, ou
b) quando η for 1 e qualquer uma das condições (1) a (3) está satisfeita, m representa um número inteiro de 1 a 3:
(1) Xz é um átomo de cloro, e R11 é um grupo selecionado a partir de um á- tomo de hidrogênio, um grupo metila, um grupo 2-hidroxietila, um grupo 3-
(Xi )m
Ph hidroxipropila, um grupo 2,2-dimetoxietila e um grupo cianometila,
(2) X2 é um átomo de bromo, e R11 é um grupo selecionado a partir de um grupo 2-hidroxietila, um grupo 3-hidroxipropila e um grupo 2-metoxietila, e
(3) X2 é um grupo nitro, e R11 é um grupo 3-hidroxipropila; ou um sal agrico- lamente aceitável do mesmo;
(43) o composto de acordo com o anterior (42), em que R11 representa um átomo de hidrogênio, um grupo formila, um grupo metila, um grupo etila, um grupo 2-hidroxietila, um grupo 2-metoxietila, um grupo furfurila, um grupo metoxicarbonilmetila ou um grupo etoxicarbonilametila, méO, né1,eX2é
um átomo de cloro ou um grupo nitro, ou um sal agricolamente aceitável do mesmo;
(44) o composto de acordo com o anterior (42), em que R11 representa um átomo de hidrogênio, um grupo formila, um grupo metila, um grupo etila, um grupo 2-hidroxietila, um grupo 3-hidroxipropila, um grupo 2-metoxietila, um
grupo furfurila, um grupo metoxicarbonilmetila ou um grupo etoxicarbonila- metila, mé1,né1,X-|éum átomo de 8-cloro, e X2 representa um átomo de cloro ou um grupo nitro, ou um sal agricolamente aceitável do mesmo;
(45) o composto de acordo com o anterior (42), em que m é um número in- teiro de 1 a 3 e η é 0, ou um sal agricolamente aceitável do mesmo;
(46) o composto de acordo com o anterior (42), em que R11 representa um grupo formila, um grupo C4-6 alquila, um grupo C3-6 alquenila ou um grupo C3-6 alquinila em que o grupo alquila, grupo alquenila e grupo alquinila são opcionalmente substituídos com (a) grupo(s) hidroxila ou (a) grupo(s) C1-3 alcóxi, ou R11 representa um grupo C1-3 alcoxicarbonilmetila, um grupo C1-3 alcóxi C1-3 alquila ou um grupo furfurila, m é 0, η é 1, e
X2 é um átomo de cloro, ou um sal agricolamente aceitável do mesmo;
(47) o composto de acordo com o anterior (42), em que η é 1, ou um sal a- gricolamente aceitável do mesmo;
(48) o composto de acordo com o anterior (42), em que mé1a3ené1,ou um sal agricolamente aceitável do mesmo; (49) o composto de acordo com o anterior (42), (45), (47) ou (48), em que 11
R é que um grupo C1-3 alcoxicarbonilmetila ou um grupo furfurila, ou um sal agricolamente aceitável do mesmo; e
(50) o composto de acordo com o anterior (42), em que η é 1 e X2 é um gru- po trifluorometila ou um grupo ciano; e similares.
Breve Descrição de Desenhos
Figura 1 mostra resultados de um teste de resposta de dose uti- lizando uma substância química capaz de inibir a sinalização intracelular de um receptor de citocinina derivado da planta de uma célula no Exemplo 8. Nas figuras, linhas de dados representam curvas de inibição de crescimento de resposta de dose, em que o eixo X representa a concentração de uma substância química testada e o eixo Y representa uma taxa de crescimento relativa. As figuras esquerdas (três subfiguras de uma fileira vertical esquer- da) mostram resultados em sistemas de teste utilizando a célula transforma- da TM182-CRE1. As figuras direitas (três subfiguras de de uma fileira verti- cal direita) mostram resultados em sistemas de teste utilizando a célula transformada TM182-p415CYC1. As figuras superiores, as figuras medianas, e as figuras inferiores representam resultados em sistemas de teste utilizan- do a substância química Ic7-1, a substância química Ic3-1, e a substância química lc3-3, respectivamente.
Figura 2 mostra resultados de avaliação da atividade de promo- ção de crescimento de raiz de uma substância de inibição de sinalização de citocinina utilizando alface no Exemplo 10. Na figura, uma linha de dados representa uma curva de promoção de crescimento de resposta de dose em que o eixo X representa a concentração de uma substância química testada (substância química Ic3-1) e o eixo Y representa uma taxa de crescimento de raiz (%).
Figura 3 mostra resultados de avaliação da atividade de promo- ção de crescimento de raiz de uma substância de inibição de sinalização de citocinina utilizando alface no Exemplo 10. Na figura, uma linha de dados representa uma curva de promoção de crescimento de resposta de dose em que o eixo X representa a concentração de uma substância química testada (substância química Ic7-1) e o eixo Y representa uma taxa de crescimento de raiz (%).
Figura 4 mostra resultados de avaliação da atividade de promo- ção de crescimento de raiz de uma substância de inibição de sinalização de citocinina utilizando arroz no Exemplo 11. Na figura, uma linha de dados re- presenta uma curva de promoção de crescimento de resposta de dose em que o eixo X representa a concentração de uma substância química testada (substância química Ic3-1) e o eixo Y representa uma taxa de crescimento de raiz (%).
Figura 5 mostrou resultados de avaliação da atividade de pro- moção de crescimento de raiz de uma substância de inibição de sinalização de citocinina utilizando arroz no Exemplo 11. Na figura, uma linha de dados representa uma curva de promoção de crescimento de resposta de dose em que o eixo X representa a concentração de uma substância química testada (substância química Ic7-1) e o eixo Y representa uma taxa de crescimento de raiz (%).
Figura 6 mostra resultados de avaliação da atividade de promo- ção de crescimento de raiz de uma substância de inibição de sinalização de citocinina por tratamento de semente de arroz no Exemplo 12. Na figura, "UTC" representa um resultado de um teste de controle em que apenas ace- tona foi usada no tratamento de semente. "IAA" representa um resultado de um teste em que um composto de auxina IAA foi usado.
Figura 7 mostra resultados de medida da atividade de formação de raiz adventícia de uma substância de inibição de sinalização de citocinina utilizando hipocótilo de A. taliana para avaliar a atividade de promoção de diferenciação da planta no Exemplo 13. Na figura, "seção de controle" mos- tra um resultado em um teste de controle utilizando um meio de ágar como descrito no Exemplo 13.
Figura 8 mostra resultados de medida da atividade de promoção de crescimento de raiz de uma substância de inibição de sinalização de cito- cinina utilizando arroz no Exemplo 14. Na figura, "UTC" mostra um resultado de um teste de controle utilizando apenas acetona em tratamento de solo- encharcado.
Figura 9 mostra resultados de análise da atividade de promoção de crescimento de raiz de uma substância de inibição de sinalização de cito- cinina utilizando arroz utilizando-se um mecanismo de análise de imagem para medir o comprimento da raiz no Exemplo 14. Relativo a linhas de dados na figura, o eixo X representa a concentração de uma substância química testada (substância química lc3-3) e o eixo Y representa a soma total (com- primento da raiz total) dos comprimentos da raiz de cada um dos diâmetros da raiz. Na figura, "UTC" mostra um resultado de um teste de controle utili- zando apenas acetona tratamento de solo-encharcado. O valor de legenda (L) representa um diâmetro da raiz (mm).
Figura 10 mostra resultados de um teste de inibição da ligação de citocinina a um receptor de citocinina por uma substância teste no Exem- plo 19. Na figura, "Apenas DMSO" representa um controle em que uma substância teste não foi adicionada e apenas DMSO, que foi usado como um solvente para uma substância teste, foi adicionado em vez de uma solução de DMSO de uma substância teste, "t-zeatina" representa adição de trans- zeatina como uma substância teste, "lc3-4" representa adição de lc3-4 como uma substância teste, e "ABA" representa adição de ácido abscísico como uma substância teste. A concentração do rótulo radioativo 2IP é 10 nM, e a concentração de cada substância teste é 10 μΜ.
Figura 11 mostra resultados de avaliação da atividade de pro- moção de cultivo de arroz de uma substância de inibição de sinalização de citocinina em um sistema de teste em que sementes tratadas com a subs- tância teste foram cultivadas por semeadura seca direta no Exemplo 21. Na figura, "lc3-3" mostra o número de agricultores por planta no caso de utilizar uma solução de suspensão Absoluta da substância teste lc3-3 para o trata- mento de semente, e "tratamento de suspensão Absoluta" mostra o número de agricultores por planta no caso de utilizar uma solução de suspensão Ab- soluta para o tratamento de semente em vez da solução de lc3-3. Modo para Realizar a Invenção
Na presente invenção, o termo "planta" é usado em um amplo sentido que indica organismos de forma estacionária vivos através de raízes, tal como grama e árvores, e da mesma forma tem um conceito incluindo um corpo da planta, um tecido da planta, uma célula da planta e similares. Es- pecificamente, o termo "planta" significa organismos tal como plantas mais altas em que um órgão referido como uma raiz pode desempenhar papéis importantes tal como fixação de uma planta no solo, e absorção de água e nutrientes do exterior, e exemplos dos mesmos incluem plantas ornamentais tais como plantas de florescimento e plantas de folhagem ornamentais, co- lheitas tais como colheitas de grão, vegetais e árvore frutífera, plantas de fibra, árvores, e gramas. Exemplos específicos dos mesmos incluem cereais tais como arroz e milho; gramas tais como grama de capim-panasco e Zoy- sia matrela; plantas cucurbitáceas tais como tomate, pimentão verde, pimen- ta vermelha e melancia; plantas cucurbitáceas tais como pepino, abóbora, melão e melancia; verdes tais como repolho, brócolos e repolho chinês; ver- des frescos tais como aipo, salsa e alface; vegetais de condimento; Alliums tais como alho-poró, cebola e alho; feijões tais como feijão-soja, feijão roxo, ervilha e feijão azúqui; vegetais de fruta tal como morango; raízes axiais tais como rabanete japonês, nabo japonês, cenoura e bardana; batatas tais co- mo taro, batata, batata-doce e inhame; verdes macios tais como aspargos, espinafre e "honewort"] pétalas tais como Eustoma russellianum, talo, cravo e crisântemo; colheitas de óleo tais como semente de colza e amendoim; colheitas de açúcar tais como cana-de-açúcar e beterraba de açúcar; colhei- tas de fibra tais como algodão e junco; colheitas de alimentos tal como trevo e sorgo; árvores frutíferas decíduas tais como maçã, pêra, uva, pêssego e castanha; árvores cítricas tais como mandarina, limão e toranja; e plantas lenhosas tais como azaleia, rododentro e cedro.
Na presente invenção, o termo "crescimento" de uma planta sig- nifica um processo geral em que já existindo órgãos vegetativos (raízes, cau- les, folhas) são recentemente produzidos e empilhados durante um processo do desenvolvimento precoce de uma planta que começa a germinação de semente ao crescimento e desenvolvimento de raízes, caules e folhas, a formação de flores e em seguida a maturação de sementes. Exemplos do crescimento incluem germinação, crescimento de raízes, extensão de bro- tos, extensão de caules, formação e extensão de brotos terminais e brotos axilares, desenvolvimento de ramificações e folhas, formação de brotos de flor, floração, fixação de semente, e maturação de sementes.
Na presente invenção, o termo "diferenciação" de uma planta significa que um tecido da planta tal como uma raiz, um caule ou uma folha é formada a partir de um calo que é uma população de célula da planta adqui- rindo totipotência (rediferenciação), ou significa que um calo é formado a partir de uma célula de um tecido da planta tal como uma raiz, um caule ou uma folha (dediferenciação).
Na presente invenção, o "controle do crescimento de um broto" significa promoção ou controle do crescimento de um broto terminal ou um broto axilar, e exemplos dos mesmos incluem iniciação do crescimento de broto axilar que é suprimido por domínio apical, supressão do crescimento de broto axilar que é iniciado removendo-se um broto terminal, e supressão de crescimento de broto terminal habitual.
Na presente invenção, o "agente capaz de controlar o cresci- mento ou diferenciação de uma planta" é um agente que pode controlar o crescimento ou diferenciação de uma planta tratando-se a planta com o a- gente por vários métodos. Controle do crescimento ou diferenciação de uma planta é aplicável para controlar do crescimento ou desenvolvimento de uma planta útil tal como uma colheita de fazenda, que torna possível aumentar crescimento precoce, realçar qualidade, aumentar um rendimento, estabilizar um rendimento sob condições desfavoráveis, e exceto trabalho na produção. Desse modo, o "agente capaz de controlar o crescimento ou diferenciação de uma planta" pode ser usado como um "regulador de crescimento da plan- ta".
Na presente invenção, a "raiz" de uma planta inclui uma raiz principal que desenvolve a partir de uma radícula existindo em um embrião de uma semente, e uma raiz lateral que estende a partir de uma raiz princi- pal através de ramificação, no caso de dicotiledôneas e gimnospermas. No caso de monocotiledoneas, a "raiz" inclui uma radícula (raiz seminal) existin- *· do em um embrião de uma semente, uma raiz coroa (denominada raiz fibro- sa) que é formada na porção superior depois da terminação do crescimento de uma raiz seminal, e uma raiz lateral prolongando-se de uma raiz adventí- cia através de ramificação. Da mesma forma, a "raiz" ocasionalmente signifi- ca cabelo de raiz prolongando continuamente para o exterior que é formado de células epidérmicas de uma raiz. A raiz de uma planta é um órgão que desempenha papéis importantes a uma planta, tal como, fixação de uma planta no solo, e absorção de água e nutrientes do exterior. A raiz de uma planta é da mesma forma muito importante como um lugar onde hormônio da planta é produzido. De um ponto de vista agrícola, muitas colheitas pro- pagam através de suas sementes. Portanto, é um elemento muito importante que leva a qualidade alta e rendimento alto em que o estabelecimento de resistência uniforme é atingido em estágio precoce do crescimento de uma planta. Promoção do crescimento de uma raiz de uma planta é esperado ter vários méritos tais como melhoria em uma taxa da raiz retirada no solo, me- lhoria na produtividade ou qualidade para melhoria no estabelecimento de resistência ou similares, controle de erva daninha em um estágio precoce para melhoria no estabelecimento de resistência, e melhoria em eficiência de uma fonte de semente. Promoção de dispersão de raiz é esperado levar a 1 20 um aumento em resistência ao estresse da corrente de ar ou resistência de peste, e uma diminuição na quantidade de fertilizante para melhoria na ca- pacidade de absorção nutriente.
Na presente invenção, o "crescimento de uma raiz" de uma plan- ta significa que o comprimento de uma raiz e o número de raízes aumenta ou que a quantidade, espessura e atividade de uma raiz aumenta, como re- sultado de divisão, crescimento e um aumento no peso de células de raiz.
Na presente invenção, a "promoção do crescimento de uma raiz" de uma planta significa que o crescimento de uma raiz de uma planta é mais ativado do que habitual, e desse modo o comprimento de uma raiz e o nú- mero de raízes aumenta, ou a quantidade, espessura e atividade de uma raiz aumenta quando comparada com o caso de nenhum tratamento.
Na presente invenção, o "agente capaz de promover o cresci- mento de uma raiz de uma planta" é um agente que pode promover o cres- cimento de uma raiz de uma planta tratando-se a planta com a substância por vários métodos. Promoção do crescimento de uma raiz de uma planta é aplicável para controle do crescimento ou desenvolvimento de uma planta útil tal como uma colheita de fazenda, que torna possível realçar crescimento precoce, realçar qualidade, aumentar um rendimento, estabilizar um rendi- mento ainda sob condições desfavoráveis, e exceto trabalho na produção. Desse modo, o "agente capaz de promover o crescimento de uma raiz de uma planta" pode ser usado como um "regulador de crescimento da planta". Quando aqui usado, o termo "estabelecimento de resistência"
significa que uma semente semeada germina e em seguida coleta a raiz no solo em um estado capaz de normalmente crescer como um corpo da plan- ta, ou que uma muda transplantada de uma planta coleta raiz no solo e em seguida normalmente cresce. Promoção de estabelecimento de resistência leva a melhoria no crescimento precoce de uma planta, e desse modo é possível cultivar uma planta saudável. Além disso, como resultado de um aumento no número da plantas cultivadas saudáveis, um aumento no rendi- mento final é esperado. Por exemplo, no caso de semeadura direta de arroz, é geralmente difícil de sempre garantir um determinado número de mudas estabelecidas por causa de germinação instável e estabelecimento de resis- tência. O agente capaz de promover estabelecimento de resistência da pre- sente invenção pode promover estabelecimento de resistência para melhorar eficiência em semeadura direta de arroz. O termo "taxa de estabelecimento de resistência" significa a proporção da plantas estabelecidas no número total de sementes semeadas ou o número total de mudas transplantadas de uma planta. No caso de arroz, quando usado aqui, o "estabelecimento de resistência" pode ser definido pela seguinte equação.
[taxa de estabelecimento de resistência (%)] = [Número de mudas cujo ápice de folha aparece na superfície da água] / [Número de sementes semeadas] χ 100
O termo "cultivo" de uma planta significa a ramificação durante o crescimento da planta, ou ramos que surgem como um resultado da agricul- tura. No caso da plantas gramíneas, por exemplo, o termo "cultivo" significa ramos laterais. Promoção de agricultura inclui agricultura precoce e um au- mento no número de agricultores. Por exemplo, quando o regulador de cres- cimento da planta da presente invenção é usado para uma planta sob condi- ções de estresse tal como baixa temperatura, alta temperatura e corrente de ar para tornar o cultivo da planta precoce e desse modo mudas saudáveis podem ser garantidas precocemente, é possível evitar dano de mudas por estresse. Por exemplo, cultivo precoce resulta em um período de cultivo mais curto de uma planta. Visto que a formação de agricultores de uma plan- ta diretamente influencia o número de espigas, um aumento de rendimento pode ser esperado dependendo das condições de cultivo.
Uma substância ativa de auxina pode exibir propriedades desfa- voráveis tais como epinastia de folhas, torção de caule, rachadura do caule, e indução de nós de raiz, dependendo do tipo de uma planta, da concentra- ção de tratamento de auxina e similares.
Acredita-se que substâncias ativas de citocinina têm ambas as propriedades de suprimir e promover o crescimento de uma raiz de uma planta [por exemplo, PNAS 101 (23): 8821-8826 (2004)]. Entretanto, para utilizar tais propriedades na prática agrícola, muitos resultados devem ser acumulados. Visto que é normalmente difícil ajustar a quantidade de citocini- na em um corpo da planta (particularmente, reduzir a quantidade de citocini- na endógena), não é fácil nem sequer para uma pessoa versada na técnica especificamente investigar papéis de citocinina em uma planta.
Acredita-se que citocinina intrínseca de uma planta pode ser ne- gativamente controlada inibindo-se a transdução de sinalização de citocinina para debilitar a sensibilidade à citocinina. Por exemplo, a transdução de sinal de citocinina pode ser inibida mutando-se um receptor de citocinina propria- mente dito, e mutantes de receptores de citocinina foram isolados [The Plant Cell 16:1365-1377 (2004), PNAS 101 (23):8821-8826 (2004)]. Entretanto, usando os mutantes, é difícil de controlar o grau de inibição por estágios. Um único mutante de um receptor de citocinina exibe o mesmo fenótipo como aquele do tipo selvagem. Por outro lado, um mutante triplo de um receptor de citocinina exibe inibição de alongamento de raiz e defeito de crescimento de um corpo da planta.
O "receptor de citocinina derivado da planta de uma célula" na presente invenção significa um receptor de citocinina existindo em uma plan- ta. O receptor de citocinina é uma proteína que especificamente liga-se a citocinina tal como citocinina de purina tal como cinetina ou zeatina ou cito- cinina de uréia tal como N-fenil-N'-(4-piridil)ureia para controlar a proliferação e diferenciação de células da planta mais altas através do mecanismo de sinalização intracelular denominando um sistema regulador de Dois compo- nentes (ou sistema His to Asp phosphorelay). O receptor de citocinina usado na presente invenção é uma proteína que pertence à família de histidina ci- nase e composto de um domínio extracelular, um domínio de transmembra- na, um domínio de histidina cinase (uma região tendo uma atividade de his- tidina cinase em células e mantendo os resíduos para ser um sítio ativo) e um domínio de receptor (uma região tendo uma parte receptora para transfe- rência de grupo fosfato e mantendo resíduos de Asp para ser um sítio ativo).
O sistema regulador de dois componentes é mecanismo de sina- lização intracelular e receptor de informação que é extensamente usado em eubacteria, bactérias antigas, fungos e plantas. Neste mecanismo, uma his- tidina cinase age como um receptor e a histidina cinase tem uma região de entrada para receber um sinal no lado N-terminal e uma região relativa à transferência de grupo fosfato, que é chamada um domínio de transmissor, no lado C-terminal. Quando a região de entrada percebe um sinal, um resí- duo de His no domínio de transmissor (o domínio de histidina cinase descrito acima de um receptor de citocinina) é autofosforilado. O grupo fosfato trans- fere com fosforilação alternadamente os resíduos de Asp e His específico conservados, e finalmente fosforila um resíduo de Asp em um domínio de receptor de uma proteína chamada de um regulador de resposta. O grupo fosfato pode ser transferido diretamente a partir da histidina cinase ao regu- Iador de resposta ou pode ser transferido ao regulador de resposta através de alguns estágios de transferência de grupo fosfato. Um sistema regulador de Dois-componentes simples como o último principalmente está presente * em procariotas. Por outro lado, uma transferência de fosfato de multietapa é principalmente vista em eucariotas, e um domínio de receptor freqüentemen- te liga-se à histidina cinase de tais eucariotas. Um mediador de transferência de grupo fosfato está da mesma forma envolvido em transferência de grupo fosfato. A fosforilação do regulador de resposta controla a atividade de uma região de saída que liga-se ao regulador de resposta. A região de saída é freqüentemente um regulador transcricional.
No caso de um receptor de citocinina de uma planta, um domínio de receptor está presente na mesma molécula. Em outras palavras, no caso de um receptor de citocinina ligando-se a citocinina, é conhecido que auto- fosforilação de um resíduo de His na molécula é seguido por transferência de grupo fosoilato do resíduo de His a um resíduo de Asp na molécula. Em seguida, é constatado que o grupo fosfato transfere a um resíduo de Asp do regulador de resposta por meio de um resíduo de His do mediador de trans- ferência de fosfato. Por exemplo, no caso de Arabidopsis thaliana, é consta- tado que um grupo fosfato transfere-se do receptor de citocinina CRE1, AHK2 ou AHK3 ao regulador de resposta pelo mediador de grupo fosfato ΑΗΡ.
Exemplos de um gene que codifica um receptor de citocinina ι 20 que foi conhecido antes incluem agora seqüência de nucleotídeo de genes derivados a partir de Arabidopsis thaliana (CRE1: Ns de acesso AB049934, AHK2: Na de acesso AB046869, AHK3: Na de acesso AB046870), Catharan- thus roseus (No. de acesso AY092025), Oryza sativa (N- de acesso AY572461), e Zea mays (ZmHK1: Ne de acesso AB042270, ZmHK2: Na de acesso AB102956, ZmHK3a: Na de acesso AB102957, ZmHK3b: N2 de a- cesso AB121445). Um tal gene cuja seqüência de nucleotídeo é conhecida pode ser ampliado por PCR utilizando o genoma DNA ou cDNA de um orga- nismo tendo o gene desejado como um padrão e iniciadores que são produ- zidos na base de uma seqüência de nucleotídeo que corresponde às imedi- ações do terminal amino de uma proteína codificada pelo gene e um se- qüência de nucleotídeo que corresponde às imediações do terminal carboxi- Ia do mesmo, e em seguida isolados. Um gene codificando uma receptor de citocinina pode da mesma forma se obtido a partir da plantas diferentes das plantas descritas acima. Primeiro, mRNA é preparado a partir da planta de- sejada, e cDNA é sintetizado utilizando-se o mRNA como um modelo e uma transcriptase reversa. O cDNA é incorporado em um vetor de fago tal como ZAPII ou um vetor de plasmídeo tal como pUC para produzir uma biblioteca de cDNA. Em seguida, PCR é realizada utilizando a biblioteca de cDNA co- mo um modelo e iniciadores que são designados e sintetizados na base de seqüências de nucleotídeo bem conservadas entre os genes cujas seqüên- cias de nucleotídeo são conhecidas como descrito acima, e desse modo um fragmento de DNA contendo pelo menos uma parte de um gene que codifica um receptor de citocinina pode ser ampliado. Em seguida, a biblioteca de cDNA é avaliada utilizando o fragmento de DNA como uma sonda para sele- cionar um clone positivo. O DNA do clone selecionado é sequenciado, e po- de ser confirmado que o gene codifica o receptor de citocinina desejado. Todos três tipos de receptores de citocinina (CRE1, AHK2,
AHK3) de Arabidopsis thaliana são histidina cinases para as quais o domínio de receptor liga-se na mesma molécula. Homologia de seqüência de amino- ácido é alta entre estes três receptores de citocinina, e particularmente, há homologia de seqüência de aminoácido alta entre seus domínios extracelula- res que acredita-se ligar a citocinina. Da mesma forma, no caso de levedura recombinante como descrito em seguida, todos os três tipos de receptores de citocinina iniciaram sinalização intracelular com respeito a citocinina, e poderia ser confirmado ter a atividade de um receptor de citocinina. Recepto- res de citocinina das outras plantas são da mesma forma histidina cinases, e suas seqüências de aminoácido têm homologia alta com as seqüências de aminoácido dos receptores de citocinina de Arabidopsis thaliana.
Tabela 1 mostra identidade de seqüência de aminoácido de ou- tros receptores de citocinina com o receptor de citocinina CRE1 de Arabi- dopsis thaliana.
Um exemplo preferível do "receptor de citocinina derivado da
planta de uma célula" inclui uma proteína que consiste em uma seqüência de aminoácido tendo uma identidade de seqüência de 45% ou mais, preferi- velmente 49% ou mais, mais preferivelmente 53% ou mais com a seqüência de aminoácido do receptor de citocinina CRE1 de Arabidopsis thaliana e tem uma atividade de funcionar como um receptor de citocinina. Tabela 1
Identidade de seqüência de aminoácido (%) com CRE1 A. Thaliana AHK2 53% A. Thaliana AHK3 54% Catharanthus roseus 52% Oryza Sativa 49% Zea mays ZmHKI 57% Zea mays ZmHK2 51% Zea mays ZmHK3a 52% Zea mays ZmHK3b 49%
A "sinalização intracelular de um receptor de citocinina derivado
da planta de uma célula" é a transdução de sinal descrita acima que é atin- gida por transferência de grupo fosfato a partir de autofosforilação de um receptor de citocinina ligando-se a citocinina. Em uma célula da planta, um sinal de resposta de citocinina é transmitido por autofosforilação de um re- ceptor de citocinina induzido por ligação de citocinina, transfere a partir de um grupo fosfato do receptor de citocinina autofosforilado a um mediador de transferência de grupo fosfato, e em seguida transferência do grupo fosfato do mediador de transferência de grupo fosfato a um regulador de resposta. Semelhantemente, em uma célula recombinante tendo um receptor de cito- cinina derivado da planta, sinalização intracelular do receptor de citocinina é alcançado por transferência de um grupo fosfato. Entretanto, neste caso, um mediador de transferência de grupo fosfato e um regulador de resposta po- dem ser derivados a partir de uma célula hospedeira. Todos eles podem ser derivados a partir de uma célula hospedeira ou alguns deles podem ser deri- vados a partir de uma célula hospedeira. Além disso, um mediador de trans- ferência de grupo fosfato pode não existir. Por exemplo, em uma levedura de brotamento recombinante tendo um receptor de citocinina derivado da plan- ta, sinalização intracelular do receptor de citocinina é alcançada por transfe- rência de um grupo fosfato do receptor de citocinina autofosforilado por liga- ção de citocinina ao regulador de resposta Sskl, que é um regulador de res- posta derivado da célula de levedura de brotamento hospedeira, pelo medi- ador de transferência de grupo fosfato Ypdl, que é um mediador de transfe- rência de grupo fosfato derivado da célula de levedura de brotamento hos- pedeira. Em uma levedura de divisão recombinante tendo um receptor de citocinina derivado da planta, sinalização intracelular do receptor de citocini- na é alcançada por transferência de um grupo fosfato ao regulador de res- posta Mcs4 derivado da levedura de divisão hospedeira, pelo mediador de transferência de grupo fosfato Spil derivado da levedura de divisão hospe- deira. Em uma Escherichia coli recombinante tendo um receptor de citocini- na derivado da planta, a sinalização intracelular do receptor de citocinina é alcançada por transferência de um grupo fosfato ao regulador de resposta RcsB derivado de Escherichia coli hospedeira pelo mediador de transferên- cia de grupo fosfato YojN derivado de Escherichia coli hospedeira.
Um exemplo de um método para determinar a presença ou au- sência da quantidade de tal sinalização intracelular de um receptor de citoci- nina derivado da planta inclui um método que compreende determinar a pre- sença ou ausência ou da quantidade de expressão de um gene alvo cuja transcrição é controlada por um regulador de resposta localizado a jusante da sinalização intracelular do receptor de citocinina derivado da planta. Este método inclui um método compreendendo diretamente determinar a presen- ça ou ausência ou a quantidade de expressão do gene alvo, bem como um método compreendendo transformar uma célula hospedeira com um plasmí- deo repórter em que um gene repórter tal como um gene de uma proteína fluorescente ou um gene de β-galactosidase é ligado a uma região de pro- motor do gene alvo, e em seguida determinar a presença ou ausência ou a quantidade de expressão do gene repórter utilizando-se fluorescência ou desenvolveu cor como um indicador, e um método compreendendo medir ou observar um aumento ou diminuição do número de células relativo a expres- são do gene alvo, uma mudança nos caráteres da célula, ou similar. Por e- i- xemplo, no caso da levedura de brotamento recombinante descrita acima, o crescimento da levedura de brotamento recombinante dependente de citoci- nina pode ser usado como um indicador para determinar a presença ou au- sência ou a quantidade da sinalização intracelular do receptor de citocinina derivado da planta. No caso da levedura de divisão recombinante, o tama- nho da levedura de divisão recombinante dependente de citocinina pode ser usado como um indicador para determinar a presença ou ausência ou a quantidade de sinalização intracelular do receptor de citocinina derivado da planta. No caso da Escherichia coli recombinante, cor desenvolveu devido a expressão de um gene β-galactosidase que é ligado a uma região de promo- tor do gene alvo cps pode ser usado como um indicador para determinar a presença ou ausência ou a quantidade de sinalização intracelular do recep- tor de citocinina derivado da planta. No caso de Arabidopsis thaliana trans- formada com um plasmídeo repórter em que um gene repórter é ligado a uma região de promotor do regulador de resposta tipo-A ARR5 ou ARR6, fluorescência ou cor desenvolvida dependente de citocinina pode ser usado como um indicador para determinar a presença ou ausência ou a quantidade de sinalização intracelular de um receptor de citocinina. Os métodos descri- tos acima são descritos em, por exemplo, Higuchi e outros, Natureze 409, 1060-1063 (2001); Suzuki e outros, Plant Cell Physiol. 42, 107-113 (2001); Hwang e Sheen, Nature 413, 383-389 (2001), e assim sucessivamente.
Entre vários métodos para determinar sinalização intracelular de um receptor de citocinina derivado da planta de uma célula como descrito acima, um exemplo preferível como um método mecânico, quantitativo e efi- ciente é um método que compreende determinar o crescimento da levedura de brotamento recombinante dependente de citocinina medindo-se turvação de um meio líquido com um espectrofotômetro. Um exemplo específico do mesmo inclui o método descrito em JP-UNS 2003-079393.
A "atividade de inibir a sinalização intracelular de um receptor de citocinina derivado da planta de uma célula" significa a capacidade para re- duzir sinalização intracelular de um receptor de citocinina derivado da planta de uma célula. Em outras palavras, isto significa a capacidade para reduzir a quantidade de transferência de grupo fosfato que é iniciada por autofosfori- lação de um receptor de citocinina e em um grupo fosfato é transferido do receptor de citocinina em um regulador de resposta. Exemplos específicos da atividade de inibir a sinalização intracelular de um receptor de citocinina derivado da planta de uma célula incluem a vapacidade para inibir a ativida- de de histidina cinase de um receptor de citocinina, a capacidade para inibir transferência de grupo fosfato de um receptor de citocinina a um mediador de transferência de grupo fosfato, a capacidade para inibir transferência de grupo fosfato do mediador de transferência de grupo fosfato para um regula- dor de resposta, e a capacidade para inibir controle de transcrição do regu- lador de resposta. Mais especificamente, um exemplo da capacidade para inibir a atividade de histidina cinase de um receptor de citocinina inclui a ca- pacidade para inibir a sinalização intracelular de um receptor de citocinina por mecanismo em que a presença ou ausência de inibição da sinalização intracelular do receptor de citocinina é determinada dependendo da presen- ça ou ausência de inibição de ligação entre uma substância tendo uma ativi- dade agonística de citocinina e o receptor de citocinina, enquanto resultando na inibição da atividade de histidina cinase do receptor de citocinina. Neste caso, como um exemplo de um método para determinar se uma substância teste atualmente inibe a ligação entre uma substância tendo uma atividade agonística de citocinina e um receptor de citocinina inclui um método com- preendendo uso de uma substância radiorrotulada tendo uma atividade ago- nística de citocinina e um receptor de citocinina. Por exemplo, uma substân- cia tendo uma atividade agonística de citocinina que é rotulada com um ra- dioisótopo de hidrogênio, trítio para se tornar altamente radioativo, e uma proteína de receptor de citocinina preparada a partir de uma levedura re- combinante em que um gene de receptor de citocinina é introduzido são permitidos coexistir em um tampão adequado, e em seguida a proteína de receptor de citocinina é coletada em um filtro de vidro para medir a radioati- vidade. Desse modo, a substância tendo uma atividade agonística de citoci- nina que é rotulada com trítio para se tornar altamente radioativo e que está ligando ao receptor de citocina pode ser detectada. Quando uma substância teste é da mesma forma permitida coexistir com a substância radiorrotulada tendo uma atividade agonística de citocinina e a proteína de receptor de ci- tocinina em um tampão, ela pode ser determinada se a substância teste ini- bir a ligação entre a substância tendo uma atividade agonística de citocinina e o receptor de citocinina utilizando-se uma diminuição no valor de medida de radioatividade como um indicador. Em seguida, quando a substância tes- te é adicionada ao sistema de reação descrito acima para determinar a pre- sença ou ausência ou a quantidade de sinalização intracelular de um recep- tor de citocinina derivado da planta, influência da substância teste na sinali- zação intracelular do receptor de citocinina derivado da planta pode ser in- vestigada.
O "agente que tem uma atividade de inibir a sinalização intrace- lular de um receptor de citocinina derivado da planta de uma célula" significa um agente compreendendo, como o ingrediente ativo, uma substância tendo uma atividade de inibir a sinalização intracelular de um receptor de citocinina derivado da planta de uma célula.
Na presente invenção, o "agente capaz de controlar o cresci- mento ou diferenciação de uma planta que tem uma atividade de inibir a si- nalização intracelular de um receptor de citocinina derivado da planta de uma célula" significa um agente cuja capacidade de inibir a sinalização intra- celular de um receptor de citocinina derivado da planta de uma célula é de- terminada pelo método descrito acima e que pode controlar o crescimento ou diferenciação de uma planta. O agente é desejavelmente um agente em que o agente capaz de controlar o crescimento ou diferenciação de uma planta é um regulador de crescimento da planta.
Na presente invenção, o "regulador de crescimento da planta" é um agente capaz de controlar o crescimento ou diferenciação de uma planta.
Um exemplo de um método para determinar a capacidade de controlar o crescimento ou diferenciação de uma planta inclui um método para determinar uma atividade de promoção de crescimento de raiz em uma planta bem como os métodos descritos na presente invenção. Especifica- mente, a capacidade de controlar o crescimento ou diferenciação de uma planta pode ser determinada, por exemplo, de acordo com o seguinte méto- do.
De acordo com composição descrita abaixo, um meio padrão de Enshi é preparado (vide Tabela 2). Uma solução de uma substância química em DMSO é dispensada em cada 4 μΙ para agrupar tubos de forma que a concentração final pode ser 0,001 ppm a 10 ppm. Em seguida, 600 μΙ do meio padrão de Enshi esterilizado é adicionado a cada tubo de grupo, segui- do por mistura. Em cada tubo, 10 a 20 sementes de Arabidopsis thaliana são postas e cultivadas a 22°C durante 10 dias em um lugar luminoso. Em se- guida, o comprimento médio de raízes principais é medido. Uma média de oito repetições é determinada e em seguida uma taxa de crescimento de raiz é determinada pela seguinte equação.
Tabela 2
Composição Concentração (mg/L) Nitrato de cálcio Ca(N03)2-4H20 950 Nitrato de potássio KNO3 810 Sulfato de magnésio MgS04-7H20 500 Fosfato de amônio NI-WH2PO4 155 Ferro quelado Fe-EDTA 22,62 Ácido bórico H3BO3 2,86 Sulfato de manganês MnS04-4H20 1,81 Sulfato de zinco ZnSO4TH2O 0,22 Sulfato de cobre CuSO4SH2O 0,08 Molibdato de sódio Na2Mo04-2H20 0,025 Ajustado em pH 5,8
Taxa de crescimento de raiz (%) = (comprimento de raiz principal médio na seção tratada por substância química) / (comprimento de raiz principal médio na seção de controle) χ 100
Pode ser dito que uma substância teste exibindo uma taxa de crescimento de raiz significativamente alta tem uma atividade de promoção de crescimento de raiz. Mais preferivelmente, uma substância teste tendo < uma taxa de crescimento de raiz de 120% ou mais pode ser julgada ter uma atividade de promoção de crescimento de raiz.
O regulador de crescimento da planta na presente invenção compreende uma substância química capaz de inibir a sinalização intracelu- lar de um receptor de citocinina derivado da planta de uma célula, ou um sal agricolamente aceitável do mesmo como um ingrediente ativo.
Na presente invenção, o "sal agricolamente aceitável" significa um sal na forma que não o torna impossível produzir um regulador de cres- cimento da planta e aplicar o produto, e pode ser um sal em qualquer forma. Exemplos específicos do sal incluem sais de ácido mineral tal como cloridra- to, bromidrato, hidroiodeto, sulfato, nitrato e fosfato; sais de ácido orgânico tal como formato, acetato, propionato, oxalato, malonato, sucinato, fumarato, maleato, lactato, malato, tartarato, citrato, metanossulfonato e etanossulfo- nato; sais de adição de ácido, por exemplo, sais de aminoácido ácido tal como aspartato e glutamato; sais de metal tal como sais de metal de álcali (sal de sódio, sal de potássio, etc.), sais de metal alcalino terroso (sal de magnésio, etc.), e sais de alumínio; sais de adição de bases orgânicas tais como metilamina, etilamina e etanolamina e de aminoácidos básicos tais como Iisina e ornitina; e sais de amônio. O regulador de crescimento da planta é normalmente usado na
forma de uma formulação tal como um concentrado emulsificável, um pó umectável, uma suspensão ou um pó solúvel em água que é obtenível mis- turando-se com um veículo sólido, um veículo líquido ou similar e, se neces- sário, adicionar (a) tensoativo(s) e outros auxiliares de formulação do mes- mo. A formulação normalmente contém 0,5 a 90% em peso, preferivelmente 1 a 80% em peso de uma substância capaz de inibir a sinalização citocani- na.
Exemplos do veículo sólido usados para formulação incluem pós finos e grânulos de argila (caolinita, terra diatomácea, óxido de silício hidroso sintético, argila Fubasami, bentonita, argila de ácido, etc.), talco, outros mi- nerais inorgânicos (sericita, pó de quartzo, pó de enxofre, carbono ativado, carbonato de cálcio, etc.) e fertilizantes químicos (sulfato de amônio, fosfato de amônio, nitrato de amônio, cloreto de amônio, uréia, etc.)· Exemplos do veículo líquido incluem água, álcoois (metanol, etanol, etc.), cetonas (aceto- na, metil etil cetona, ciclohexanona, etc.), hidrocarbonetos aromáticos (tolu- eno, xileno, etilbenzeno, metilnaftaleno, etc.), hidrocarbonetos não aromáti- cos (hexano, cicloexano, querosene, etc.), ésteres (acetato de etila, acetato de butila, etc.), nitrilos (acetonitrilo, isobutironitrilo, etc.), éteres (dioxano, éter di-isopropílico, etc.), amidas de ácido (dimetilformamida, dimetilacetamida, etc.) e hidrocarbonetos halogenados (dicloroetano, tricloroetileno, etc.).
Exemplos do tensoativo incluem sulfatos de alquila, sulfonatos de alquila, sulfonatos de alquil arila, éteres de aquil arila e seus compostos de polioxietileno, éteres de polietileno glicol, ésteres de álcool poli-hídricos, e derivado de álcool do açúcar.
Exemplos de outros auxiliares de formulação incluem agentes de aderência e agentes de dispersão tal como caseína, gelatina, polissacarí- deos (amido, goma Arábica, derivados de celulose, ácido algínico, etc.), de- rivados de lignina, bentonita, polímeros solúveis em água sintéticos (álcool polivinílico, polivinil pirrolidona, ácido poliacrílico, etc.), e agentes de estabili- zação tal como PAP (fosfato de isopropila ácido), BHT (2,6-terc-butil-4- metilfenol), BHA (2-/3-terc-butil-4-metoxifenol), óleos vegetais, óleos mine- rais, ácidos graxos e ésteres de ácido graxo.
Na presente invenção, o "regulador de crescimento da planta compreendendo uma substância química capaz de inibir a sinalização intra- celular de um receptor de citocinina derivado da planta de uma célula, ou um sal agricolamente aceitável do mesmo, como um ingrediente ativo" é um a- gente que pode controlar o crescimento ou diferenciação de uma planta con- tendo-se, como um ingrediente ativo, uma substância química cuja capaci- dade de inibir a sinalização intracelular de um receptor de citocinina derivado da planta de uma célula é determinada pelo método descrito acima ou um sal agricolamente aceitável da substância química. A substância química é desejavelmente uma substância química tendo a capacidade de inibir a sina- lização intracelular de um receptor de citocinina em um sistema de contato da levedura de brotamento recombinante descrita acima que compreende um receptor de citocinina e uma substância tendo uma atividade agonística para o receptor de citocinina. Mais desejavelmente, um exemplo da substân- cia química inclui uma substância química tendo a capacidade de inibir a atividade de um receptor de citocinina em um sistema de contato da levedu- ra de brotamento recombinante descrita acima compreendendo um receptor de citocinina e uma substância tendo uma atividade agonística ao receptor de citocinina, de forma que a atividade do receptor de citocinina possa ser reduzida na presença de 0,6 ppm de trans-zeatina e 2 ppm ou mais da subs- tância química quando comparado com o caso na ausência da substância química. Ainda mais desejavelmente, um exemplo da substância química inclui uma substância química tendo a capacidade de inibir a atividade de um receptor de citocinina em um sistema de contato da levedura de brota- mento recombinante descrita acima compreendendo um receptor de citocini- na e uma substância tendo uma atividade agonística ao receptor de citocini- na, de forma que a atividade do receptor de citocinina possa ser reduzida por 90% ou mais na presença de 0,6 ppm de trans-zeatina e 2 ppm ou mais da substância química quando comparado com o caso na ausência da subs- tância química.
Na presente invenção, um "método para testar a capacidade de uma substância teste promover o crescimento de uma raiz de uma planta, que compreende:
(1) uma primeira etapa de medir uma atividade de inibir a sinalização intrace- lular de um receptor de citocinina selecionado a partir do seguinte grupo A (ou a presença ou ausência ou a quantidade de sinalização intracelular) em um sistema de contato compreendendo uma célula tendo o receptor de cito- cinina, uma substância tendo uma atividade agonística ao receptor de citoci- nina e a substância teste; e
(2) uma segunda etapa de avaliar a capacidade da substância teste promo- ver o crescimento de uma raiz de uma planta na base de uma diferença ob- tida comparando-se a atividade medida na primeira etapa com a atividade em controle" é um método compreendendo a primeira etapa e a segunda etapa entre vários métodos para testar a capacidade de promover o cresci- mento de uma raiz de uma planta de uma substância teste. O "Grupo A" representa como segue:
(a) uma proteína compreendendo a seqüência de aminoácido SEQ ID NO:1,
(b) uma proteína compreendendo uma seqüência de aminoácido SEQ ID NO:1 em que um ou mais aminoácidos são deletados, adicionados ou subs- tituídos, e tendo uma atividade de funcionar como um receptor de citocinina,
(c) uma proteína compreendendo uma seqüência de aminoácido tendo uma identidade de seqüência de 45% ou mais com a seqüência de aminoácido SEQ ID NO:1, e tendo uma atividade de funcionar como um receptor de cito- cinina
(d) uma proteína compreendendo uma seqüência de aminoácido codificada pela seqüência de nucleotídeo de SEQ ID NO:2
(e) uma proteína compreendendo uma seqüência de aminoácido codificada por um polinucleotídeo que hibridiza sob uma condição estrita com um poli- nucleotídeo complementar a um polinucleotídeo tendo a seqüência de nu- cleotídeo de SEQ ID NO:2, e tendo uma atividade de funcionar como um receptor de citocinina.
A primeira etapa é uma etapa de medir uma atividade de inibir a sinalização intracelular do receptor de citocinina (ou a presença ou ausência ou a quantidade da sinalização intracelular) em um sistema de contato com- preendendo uma célula tendo os vários receptores de citocinina descritos acima, uma substância tendo uma atividade agonística ao receptor de citoci- nina e a substância teste. A segunda etapa é uma etapa de avaliar a capaci- dade da substância teste promover o crescimento de uma raiz de uma planta na base de uma diferença obtida comparando-se a atividade medida na pri- meira etapa com a atividade em controle. Quando aqui usado, por exemplo no caso onde uma solução de uma substância teste em um solvente é adi- cionada a um sistema de reação, o controle significa um teste em que ape- nas o solvente é adicionado.
O receptor de citocinina derivado da planta de uma célula usada no método para testar a capacidade de uma substância teste promover o crescimento de uma raiz de uma planta que compreende a primeira etapa e a segunda etapa é uma proteína mostrada no grupo A descrito acima. Entre as proteínas do grupo A descrito acima, nas seqüências de aminoácido de proteínas mostradas em (b), (c), (d) e (e), diferenças da seqüência de ami- noácido de (a) que podem ser ocasionalmente encontradas são devido a deleção, substituição, adição, e similares de alguns aminoácidos. As diferen- ças incluem deleção causada por processamento que uma proteína tendo a seqüência de aminoácido de (a) sofre em células. Além disso, as diferenças incluem deleção, substituição, adição, e similares de aminoácidos causados por mutação genética de ocorrência natural devido a diferença de espécies, diferença individual ou similar de organismos dos quais a proteína é deriva- da, ou mutação genética artificialmente introduzida por mutagênese sítio di- rigida, mutagênese randomizada, tratamento de mutagênese ou similar.
O número de tal deleção de aminoácido, substituição, adição ou similar pode estar dentro da faixa em que a atividade de histidina cinase de um receptor de citocinina pode ser encontrado. Exemplos da substituição de aminoácido incluem substituições com aminoácidos tendo características análogas tais como hidrofobicidade, carga, pK e estrutura de espaço. Exem- plos específicos de tal substituição incluem substituições dentro dos grupos de (1) glicina, alanina; (2) valina, isoleucina, leucina; (3) ácido aspártico, áci- do glutâmico, asparagina, glutamina; (4) serina, treonina; (5) lisina, arginina; (6) fenilalanina, tirosina; e similares.
Um exemplo de um método para artificialmente realizar tal dele- ção, adição ou substituição de aminoácido (em seguida, ocasionalmente re- ferido como alternação de aminoácido, em geral) inclui um método que com- preende submeter DNA codificando a seqüência de aminoácido de (a) a mu- tagênese sítio-específica e em seguida expressando o DNA por uma técnica convencional. Exemplos do método de mutagênese sítio-específico incluem um método compreendendo uso de mutação ambarina (método dúplex inter- valado, NucIeicAcids Res., 12, 9441-9456 (1984)), e um método compreen- dendo PCR utilizando iniciadores para introduzir mutação. Um exemplo de um método para artificialmente realizar alternação de aminoácido inclui um método que compreende submeter DNA codificando a seqüência de amino- ácido de (a) a mutagênese randomizada e em seguida expressando o DNA por um método convencional. Um exemplo de um método para mutagênese randomizada inclui um método compreendendo PCR utilizando DNA codifi- cando qualquer uma das seqüências de aminoácido descritas acima como um modelo e utilizando um par de iniciador pelo qual o comprimento total de DNA pode ser ampliado, em uma condição de reação que a concentração de adição de cada de d ATP, dTTP, dGTP e dCTP usados como substratos é mudado a partir da condição habitual ou em uma condição de reação que a concentração de Mg2+ para promover a reação de polimerase é aumentada a partir da condição geral. Exemplo de uma tal técnica de PCR inclui um mé- todo descrito em Method in Molecular Biology, (31), 1994, 97-112, bem como um método descrito em W00009682.
Quando aqui usado, a "identidade de seqüência" significa identi- dade entre duas seqüências de nucleotídeo ou duas seqüências de aminoá- cido. A "identidade de seqüência" é determinada comparando-se duas se- qüências otimamente alinhadas em todas as suas regiões. O alinhamento ideal das seqüências de nucleotídeo ou das seqüências de aminoácido pode conter adição ou deleção (por exemplo, abertura). Tal identidade de seqüên- cia pode ser calculada realizando análise de homologia utilizando programas tais como FASTA [Pearson & Lipman, Proc. Natl. Acad. Sei. USA., 4, 2444- 2448 (1988)], BLAST [Altschul e outros Journal of Molecular Biology, 215, 403-410 (1990)], e CLUSTAL W [Thompson, Higgins&Gibson, Nucleic Acid Research, 22, 4673-4680 (1994a)] para construir alinhamentos. Os progra- mas descrito acimas estão geralmente disponíveis na homepage (http://www.ddbi.niq.ac.jp) de DNA Data Bank of Japan [international DNA data bank operated in Center for Information Biology and DNA data bank of Japan; CIB/DDBJ de Bational Institute of Genetics] ou similar. A identidade de seqüência pode da mesma forma ser obtida utilizando-se software de análise de seqüência comercialmente disponível. Especificamente, por e- xemplo, análise de homologia é realizada por método de Lipman-Pearson [Lipman, D. J. e Pearson, W.R., Science, 227, 1435-1441, (1985)] e utilizan- do GENETYX-WIN Ver.5 (fabricado por Software Development Co, Ltd.) pa- ra construir alinhamentos, e desse modo, identidade de seqüência pode ser calculada.
A "condição estrita" descrita em (e) inclui uma tal condição cuja hibridação é realizada a 45°C em uma solução contendo 6 χ SSC (10 χ SSC contém 1,5M de NaCI e 0,15M de citrato trissódico) seguido por lavagem com 2 χ SSC a 50°C (Molecular Biology1 John Wiley & Sons, Ν. Y. (1989), 6.3.1-6.3.6), em hibridação realizada de acordo com um método convencio- nal, por exemplo, como descrito em Molecular Cloning 2a edição escrita por Sambrook J., Frisch E. F., Maniatis T. emitido por Cold Spring Harbor Labo- ratory Press. A concentração de sal na etapa de lavagem pode ser selecio- nada a partir de, por exemplo, a faixa de 2 χ SSC (condição estrita baixa) a 0,2 χ SSC (condição estrita alta). A temperatura na etapa de lavagem pode ser selecionada a partir de, por exemplo, faixa de temperatura ambiente (condição estrita baixa) a 65°C (condição estrita alta). Igualmente a concen- tração de sal e a temperatura podem ser mudadas.
Cada uma destas proteínas é uma proteína tendo uma atividade que funciona como um receptor de citocinina. Desejavelmente, a seguinte proteína é usada: uma proteína compreendendo uma seqüência de aminoá- cido em que resíduos de aminoácido que correspondem às posições (I) 459 e (II) 973 de SEQ ID NO: 1 são respectivamente (I) histidina na posição 459 e (II) ácido aspártico na posição 973, quando a seqüência de aminoácido da proteína está alinhada com a seqüência de aminoácido SEQ ID NO: 1 de forma que a identidade de seqüência máxima possa ser obtida. Quando aqui usado," a seqüência de aminoácido da proteína está alinhado com a se- qüência de aminoácido SEQ ID NO: 1 de forma que a identidade de seqüên- cia máxima possa ser obtida" significa que a análise de identidade de se- qüência de aminoácido plural de interesse incluindo a seqüência de aminoá- cido SEQ ID NO: 1 é realizada utilizando-se o programa descrito acima tal como FASTA, BLAST, ou CLUSTAL W para alinhar as seqüências de ami- noácido. Como resultado do alinhamento de seqüências plurais por um tal método, é possível determinar as posições de resíduos de aminoácido ho- mólogos em cada uma das seqüências de aminoácido apesar da inserção ou deleção que existem nas seqüências de aminoácido. As posições homó- logas acredita-se que sejam as mesmas posições na estrutura tridimensio- nal, e podem ser calculadas para ter efeitos análogos à função específica da proteína de interesse. Por exemplo, no caso de receptores de citocinina co- nhecidos incluindo o receptor de citocinina cuja seqüência é descrita na pre- sente invenção, resíduos de aminoácido correspondentes às posições (I) 459 e (II) 973 de SEQ ID NO: 1 são respectivamente (I) histidina na posição 459 e (II) ácido aspártico na posição 973, quando a seqüência de aminoáci- do do receptor de citocinina está alinhada com a seqüência de aminoácido SEQ ID NO: 1 de forma que a identidade de seqüência máxima possa ser obtida.
O ingrediente ativo do agente capaz de controlar o crescimento ou diferenciação de uma planta pode ser procurado, por exemplo, determi- nando-se a capacidade para promover o crescimento de uma raiz da planta.
O método para testar a capacidade para promover o crescimen- to de uma raiz de uma planta que compreende utilizar um receptor de citoci- nina derivado da planta de uma célula como descrito acima pode da mesma forma ser usado para procurar uma substância tendo a capacidade de con- trolar o crescimento ou diferenciação de uma planta. Especificamente, quan- do a capacidade de uma substância teste para promover o crescimento de uma raiz de uma planta é determinada ser um valor certo ou mais ou um valor certo ou menos utilizando-se o método para testar a capacidade de promover o crescimento de uma raiz de uma planta compreendendo utilizar um receptor de citocinina derivado da planta de uma célula, a substância é selecionada. Desse modo, uma substância tendo a capacidade para promo- ver o crescimento de uma raiz de uma planta pode ser procurada.
Porque uma substância selecionada pelo método minucioso tem a capacidade de controlar o crescimento ou diferenciação de uma planta, uma composição contendo a substância ou um sal agricolamente aceitável do mesmo como um ingrediente ativo pode ser um regulador de crescimento da planta.
Exemplos específicos da substância capaz de inibir a sinalização de citocinina incluem os antagonistas de citocinina, e agonistas de citocinina.
A substância de inibição de sinalização de citocinina selecionada pelo método minucioso descrito acima pode promover o crescimento de uma raiz de uma planta. O crescimento de uma raiz inclui alongamento da raiz principal, alongamento de uma raiz lateral, e alongamento de cabelo da raiz.
A atividade de promoção de crescimento de raiz da substância de inibição de sinalização de citocinina selecionada pelo método minucioso descrito acima pode ser testada utilizando-se, por exemplo, o seguinte mé- todo. Por exemplo, soluções aquosas, meios de cultura hidropônicos ou meios de cultura de tecido contendo a substância de inibição de sinalização de citocinina em concentrações diferentes dentro da faixa de 0,0001 a 100 ppm são preparados dependendo do tipo de uma planta e um método de ensaio. No caso de um teste de placa Petri, um papel filtro disperso em uma placa Petri é impregnado com a solução, e sementes da planta são postas neste. No caso de um teste de bolsa, um papel pesado é impregando com a solução, em que o papel pesado é colocado em uma bolsa que permite a observação do crescimento de raiz tal como uma bolsa para crescimento de semente, e as sementes da planta são semeadas nesta. Um meio sólido é preparado adicionando-se agarose, ágar ou similar à solução em uma placa Petri plástica ou um tubo de centrífuga de plástico, e as sementes da planta são semeadas neste. Depois da incubação durante um certo período a 10 a 30°C na luz, os comprimentos da raiz principal e raízes laterais, o número de raízes laterais, o peso úmido da raiz, o peso seco da raiz, e assim sucessi- vamente são medidos. A substância de inibição de sinalização de citocinina selecionada
pelo método minucioso descrito acima pode ser usada como um regulador de crescimento da planta.
Em grupos representados por R1 X, R1, R21 R3, R41 R51 R6 e R7 no composto representado pela fórmula geral (I) usado na presente invenção (em seguida, às vezes, referido como o composto (I)), exemplos do "grupo hidrocarboneto" incluem um grupo hidrocarboneto alifático, um grupo hidro- carboneto saturado monocíclico e um grupo hidrocarboneto aromático, e um grupo hidrocarboneto tendo 1 a 16 átomos de carbono é preferido. Exemplos específicos do mesmo incluem um grupo alquila, um grupo alquenila, um grupo alquinila, um grupo cicloalquila, um grupo aralquila e um grupo arila.
O "grupo alquila" é preferivelmente, por exemplo, um grupo al- quila inferior. Exemplos específicos do grupo alquila incluem grupos C1-6 alquila tal como metila, etila, propila, isopropila, butila, isobutila, sec-butila e terc-butila, pentila e hexila.
O "grupo alquenila" é preferivelmente, por exemplo, um grupo alquenila inferior. Exemplos específicos do grupo alquenila incluem grupo C2-6 alquenila tal como vinila, 1-propenila, alila, isopropenila, butenila e iso- butenila.
O "grupo alquinila" é preferivelmente, por exemplo um grupo al- quinila inferior. Exemplos específicos do grupo alquinila incluem grupo C2-6 alquinila tal como etinila, propargila e 1-propínila. O "grupo cicloalquila" é preferivelmente, por exemplo um grupo
cicloalquila inferior. Exemplos específicos do grupo cicloalquila incluem gru- po C3-6 cicloalquila tal como ciclopropila, ciclobutila, ciclopentila e ciclo- exila. O "grupo aralquila" é preferivelmente, por exemplo um grupo C7-11 aralquila tal como benzila ou fenetila. Especificamente, por exemplo, um grupo benzila é usado.
O "grupo arila" é preferivelmente um grupo C6-14 arila tal como fenila, 1-naftila, 2-naftila, bifenilila ou 2-antrila. Especificamente, por exem- plo, um grupo fenila é usado.
Exemplos de um substituinte para o "grupo hidrocarboneto" e o "grupo C1-6 alquila" do "grupo hidrocarboneto opcionalmente substituído" e o "grupo C1-6 alquila opcionalmente substituído" incluem um átomo de halo- gênio (por exemplo, flúor, cloro, bromo, iodo, etc.), um grupo nitro, um grupo ciano, um grupo hidroxila, um grupo alquila inferior (por exemplo, um grupo C1-6 alquila tal como metila, etila, propila, isopropila, butila, isobutila, sec- butila, terc-butila, pentila, isopentila, neopentila, ou hexila, etc.), um grupo alcóxi inferior (por exemplo, um grupo C1-6 alcóxi tal como metóxi, etóxi, propóxi, isopropóxi, butóxi, isobutóxi, pentilóxi ou hexilóxi, etc.), um grupo < amino, um grupo alquilamino mono-infeior (por exemplo, um grupo mono- C1-6 alquilamino tal como metilamino ou etilamino, etc.), um grupo alquila- mino di-inferior (por exemplo, um grupo di-C1-6 alquilamino tal como dimeti- Iamino ou dietilamino, etc.), um grupo imino, um grupo carboxila, um grupo alquilcarbonila inferior (por exemplo, um grupo C1-6 alquilcarbonila tal como acetila ou propionila, etc.), um grupo alcoxicarbonila inferior (por exemplo, um grupo C1-6 alcoxicarbonila tal como metoxicarbonila, etoxicarbonila, pro- poxicarbonila ou butoxicarbonila, etc.), um grupo carbamoila, um grupo de tiocarbamoila, um grupo alquilcarbamoila monoinferior (por exemplo, um grupo mono-C1-6 alquilcarbamoila tal como metilcarbamoila ou etilcarbamoi- la, etc.), um grupo alquilcarbamoila di-inferior (por exemplo, um grupo di-C1- 6 alquilcarbamoila tal como dimetilcarbamoila ou dietilcarbamoila, etc.), um grupo arilcarbamoila (por exemplo, um grupo C6-10 arilcarbamoila tal como fenilcarbamoila ou naftilcarbamoila, etc.), um grupo arila (por exemplo, um grupo C6-10 arial tal como fenila ou naftila, etc.), um grupo arilóxi (por e- xemplo, um grupo C6-10 arilóxi tal como fenilóxi ou naftilóxi, etc.), um grupo heterocíclico (por exemplo, 2- ou 3-tienila, 2- ou 3-tetra-hidrotienila, 2- ou 3- furila, 2- ou 3-tetra-hidrofurila, 1-, 2- ou 3-pirrolila, 1-, 2- ou 3-pirrolidinila, 2-, 4- ou 5-oxazolila, 3-, 4- ou 5-isoxazolila, 2-, A- ou 5-tiazolila, 3-, 4- ou 5- ' 20 isotiazolila, 3-, 4- ou 5-pirazolila, 2-, 3- ou 4-pirazolidinila, 2-, 4- ou 5- imidazolila, 4- ou 5-1H-1,2,3-triazolila, 3- ou 5-1,2,4-triazolila, 5-1H- ou 5-2H- tetrazolila, 2-, 3- ou 4-piridila, 2-, 4- ou 5-pirimidinila, 1-, 2- ou 3-tiomorfolinila, 1-, 2- ou 3-morfolinila, 1-, 2-, 3- ou 4-piperidino, 2-, 3- ou 4-piperidila, 2-, 3- ou 4-tiopiranila, 2-, 3- ou 4-4H-1,4-oxadinila, 2-, 3- ou 4-4H-1,4-tiazinila, 1,3- tiazinila, 1- ou 2-piperazinila, 3-, 5- ou 6-1,2,4-triazinila, 2-1,3,5-triazinila, 3- ou 4-piridazinila, 2-pirazinila, etc.), um grupo alquilcarbonilamino inferior (por exemplo, um grupo C1-6 alquilcarbonilamino tal como acetilamino, etc.), um grupo mercapto, um grupo C1-6 alquiltio (por exemplo, um grupo C1-6 alquil- tio tal como metiltio, etc.), um grupo alquilsulfinila (por exemplo, um grupo C1-6 alquilsulfinila tal como metilsulfinila, etc.), um grupo alquilsulfonila (por exemplo, um grupo C1-6 alquilsulfonila tal como metilsulfonila, etc.), um gru- po ariltio (por exemplo, um grupo C6-10 ariltio tal como feniltio, etc.), um grupo de arilsulfinila (por exemplo, um grupo C6-10 arilsulfinila tal como fe- nilsulfinila, etc.), um grupo arilsulfonila (por exemplo, um grupo C6-10 arilsul- fonila tal como fenilsulfonila, etc.), um grupo oxo e um grupo tioxo.
O grupo acila (por exemplo, formila, acetila, propionila, pivaloila, acriloila, benzoila, etc.) é um tipo de um grupo hidrocarboneto substituído com um grupo oxo e é incluído no "grupo hidrocarboneto opcionalmente substituído" e o "grupo C1-6 alquila opcionalmente substituído".
O "grupo hidrocarboneto" e o "grupo C1-6 alquila" do "grupo hi- drocarboneto opcionalmente substituído" e o "grupo C1-6 alquila opcional- mente substituído" pode ter 1 ou mais, preferivelmente 1 a 3 dos substituin- tes descrito acima nas posições substituíveis. Quando o substituinte é um átomo de halogênio, o grupo hidrocarboneto e o grupo C1-6 alquila podem ter o número máximo substituível de substituintes. Quando eles tiverem 2 ou mais substituintes, os substituintes são os mesmos ou diferentes.
Quando o substituinte for um grupo alquila inferior, um grupo alcóxi inferior, um grupo alquilamino monoinferior, um grupo alquilamino di- inferior, um grupo alquilcarbonila inferior, um grupo alcoxicarbonila inferior, um grupo alquilcarbamoila monoinferior, um grupo alquilcarbamoila di- inferior, um grupo arilcarbamoila, um grupo arila, um grupo arilóxi, um grupo heterocíclico, um grupo alquilcarbonilamino inferior, um grupo alquiltio, um grupo alquilsulfinila, um grupo alquilsulfonila, um grupo ariltio, um grupo aril- sulfinila, um grupo arilsulfonila ou similar, o substituinte é opcionalmente substituído com 1 a 3 substituintes selecionados a partir do grupo que con- siste em um átomo de halogênio (por exemplo, flúor, cloro, bromo, iodo, etc.), um grupo nitro, um grupo ciano, um grupo hidroxila, um grupo C1-4 alcóxi (por exemplo, metóxi, etóxi, propóxi, isopropilóxi, butóxi, isobutilóxi), um grupo arila, um grupo oxo e similares. Quando o substituto for um grupo arilcarbamoila, um grupo arila, um grupo arilóxi, um grupo heterocíclico, um grupo C6-10 ariltio, um grupo C6-10 arilsulfinila, um grupo C6-10 arilsulfonila ou similar, o substituinte é opcionalmente substituído com um a três grupos C1-4 alquila (por exemplo, metila, etila, propila, isopropila, butila, isobutila, sec-butila, terc-butila, etc.). Exemplos do "grupo C1-6 alquila" incluem metila, etila, propila, isopropila, butila, isobutila, sec-butila e terc-butila, pentila, e hexila.
Exemplos do "grupo C1-3 alquila" (incluindo o grupo C1-3 alquila contido em um grupo C1-3 alquilamino e um grupo di C1-3 alquilamino) in- cluem metila, etila, propila e isopropila.
Exemplos do "grupo C3-6 alquenila" incluem 1-propenila, alila, isopropenila, butenila e isobutenila.
Exemplos do "grupo C3-6 alquinila" incluem propargila e 1-
propinila.
Exemplos do "grupo C1-3 alcóxi" (incluindo o grupo C1-3 alquila contido em um grupo hidróxi C1-3 alcóxi e um grupo C1-3 alcoxicarbonila) incluem metóxi, etóxi, propóxi e isopropilóxi.
Exemplos do "grupo C1-3 acila" (incluindo o grupo C1-3 acila contido em um grupo C1-3 aciltio) incluem formila, acetila e propionila.
Exemplos do "grupo C1-3 haloalquila" incluem clorometila, triflu- orometila, 2-bromoetila, 2,2,2-trifluoroetila e 2,2,3,3,3-pentafluoropropila.
Exemplos do "grupo amino cíclico" do "R1 e R2 são empregados juntamente com o átomo de nitrogênio ao qual eles são ligados para formar um grupo amino cíclico opcionalmente substituído" incluem 1-aziridinila, pir- rolidino, piperidino, morfolino e tiomorfolino. Exemplos de um substituinte para o "grupo amino cíclico" incluem 1 a 3 de substituintes descritos acima tal como um grupo C1-3 alquila, um grupo C1-3 alcóxi e um grupo hidroxila.
Exemplos do "grupo arila" nos grupos representados por Ar in- cluem grupos arila descritos como exemplos do "grupo hidrocarboneto" re- presentado por R, X, R1, R21 R31 R41 R51 R6 e R7.
Exemplos do "grupo heteroarila" nos grupos representados por Ar incluem 2- ou 3-tienila, 2- ou 3-furila, 1-, 2- ou 3-pirrolila, 2-, 4- ou 5- oxazolila, 3-, 4- ou 5-isoxazolila, 2-, 4- ou 5-tiazolila, 3-, 4- ou 5-isotiazolila, 3- , 4- ou 5-pirazolila, 2-, 4- ou 5-imidazolila, 4- ou 5-1H-1,2,3-triazolila, 3- ou 5- 1,2,4-triazolila, 5-1H- ou 5-2H-tetrazolila, 2-, 3- ou 4-piridila, 2-, 4- ou 5- pirimidinila, 1- ou 2-piperazinila, 3-, 5- ou 6-1,2,4-triazinila, 2-1,3,5-triazinila, 3- ou 4-piridazinila, e 2-pirazinila. Exemplos de um substituinte para o "grupo arila" e o "grupo he- teroarila" incluem grupos descritos como exemplos de um substituinte para o "grupo hidrocarboneto opcionalmente substituído" e o "grupo C1-6 alquila opcionalmente substituído" representado por R1 X, R1, R2, R3, R4, R5, R6 e R7.
O composto da fórmula geral (I) em que I é 0 é o composto em que a posição 2 do esqueleto de quinazolina é não-substituída, isto é, um composto da fórmula geral (1-1):
rrv
LJ^N C-1)
(X)n T
Ar
em que X representa um grupo hidrocarboneto opcionalmente substituído, um grupo representado por NR1R2, um grupo representado por OR3, um grupo representado por S(O)mR4, um grupo nitro ou um átomo de halogênio, em que R1 representa um átomo de hidrogênio ou um grupo hidrocarboneto opcionalmente substituído,
R2 representa um átomo de hidrogênio, um grupo hidrocarboneto opcional- mente substituído, um grupo representado por NR5R6 (em que R5 e R6 são os mesmos ou diferentes e representa um átomo de hidrogênio ou um grupo C1-C6 alquila opcionalmente substituído) ou um grupo representado por OR7 (em que R7 representa um átomo de hidrogênio ou um grupo C1-C6 alquila opcionalmente substituído), ou R1 e R2 são empregados juntamente com o átomo de nitrogênio ao qual eles são ligados para formar um grupo amino cíclico opcionalmente substituído,
R3 e R4 cada qual representa um grupo hidrocarboneto opcionalmente subs- tituído,
m representa um número inteiro de 0 a 2, η representa um número inteiro de 0 a 4,
quando η for 2 ou mais, cada X é o mesmo ou diferente um do outro, e Ar representa um grupo arila opcionalmente substituído ou um grupo hetero- arila opcionalmente substituído.
O composto da fórmula geral (I) em que I é 1 é o composto em que a posição 2 do esqueleto de quinazolina é substituído com R, isto é, um composto da fórmula geral (1-2):
rrv
N (1-2)
(X)n T Ar
em que ReX são os mesmos ou diferentes e representam grupo hidrocar- boneto opcionalmente substituído, um grupo representado por NR1R21 um grupo representado por OR3, um grupo representado por S(O)mR4, um grupo nitro ou um átomo de halogênio,
em que R1 representa um átomo de hidrogênio ou um grupo hidrocarboneto opcionalmente substituído,
R2 representa um átomo de hidrogênio, um grupo hidrocarboneto opcional- mente substituído, um grupo representado por NR5R6 (em que R5 e R6 são os mesmos ou diferentes e representam um átomo de hidrogênio ou um grupo C1-C6 alquila opcionalmente substituído) ou um grupo representado por OR7 (em que R7 representa um átomo de hidrogênio ou um grupo C1-C6 alquila opcionalmente substituído), ou R1 e R2 são empregados juntamente com o átomo de nitrogênio ao qual eles são ligados para formar um grupo amino cíclico opcionalmente substituído,
R3 e R4 cada qual representa um grupo hidrocarboneto opcionalmente subs- tituído,
m representa um número inteiro de 0 a 2, η representa um número inteiro de 0 a 4,
quando η for 2 ou mais, cada X é o mesmo ou diferente um do outro, e Ar representa um grupo arila opcionalmente substituído ou um grupo hetero- arila opcionalmente substituído.
O composto (I) pode estar na forma do "sal agricolamente acei- tável" descrito acima.
Quando o composto (I) tem um ou mais centros assimétricos, o composto inclui dois ou mais estereoisômeros (por exemplo, enantiômero, diastereômero, etc.). O composto da presente invenção inclui todos os este- reoisômeros e uma mistura de dois ou mais estereoisômeros. Quando o composto (I) tem isomerismo geométrico com base em uma ligação dupla e similares, o composto (I) inclui dois ou mais isôme- ros geométricos (por exemplo, E/Z ou trans/cis isômeros, S-trans/S-cis isô- meros, etc.)· O composto (I) inclui todos os isômeros geométricos e uma mistura de dois ou mais isômeros geométricos. Exemplos preferíveis do composto (I) incluem os seguintes com-
postos.
(1) um composto da fórmula geral (I), em que I é 1 e R é um grupo hidrocar- boneto opcionalmente substituído.
(2) um composto da fórmula geral (I), em que I é 1 e R é um grupo C1-3 al- quila que é opcionalmente substituído com (a) átomo(s) de halogênio ou
(um) grupo(s) oxo.
(3) um composto da fórmula geral (I), em que o grupo hidrocarboneto opcio- nalmente substituído é um grupo C1-3 alquila que é opcionalmente substitu- ído com (a) átomo(s) de halogênio ou (um) grupo(s) oxo.
(4) um composto da fórmula geral (I), em que I é 1 e R é um grupo represen- tado por NR1R2.
(5) um composto do anterior (4), em que R1 representa um átomo de hidro- gênio ou um grupo C1-3 alquila, R2 representa um átomo de hidrogênio, um grupo amino, um grupo C1-3 alquilamino, um grupo di C1-3 alquilamino, um grupo amidino, um grupo C1-3 alcóxi, um grupo fenila, um grupo C1-3 acila, um grupo C1-6 alquila, um grupo C3-6 alquenila ou um grupo C3-6 alquinila em que o grupo fenila é opcionalmente substituído com os mesmo ou dife- rentes um a três grupos C1-3 alquila, e o grupo fenila, o grupo acila, o grupo alquila, o grupo alquenila e o grupo alquinila são opcionalmente substituídos com os mesmos ou diferentes 1 a 3 substituintes selecionados a partir do grupo que consiste em um átomo de halogênio, um grupo hidroxila, um gru- po C1-3 alcóxi, um grupo hidróxi C1-3 alcóxi, um grupo carboxila, um grupo C1-3 alcoxicarbonila, um grupo carbamoila, um grupo amino, um grupo C1-3 alquilamino, um grupo di C1-3 alquilamino, um grupo mercapto, um grupo C1-3 aciltio, um grupo ciano, um grupo furila e um grupo tetra-hidrofurila, ou R1 e R2 são empregados juntamente com o átomo de nitrogênio ao qual eles são ligados para formar um grupo pirrolidino, um grupo piperidino ou um grupo morfolino.
(6) um composto do o anterior (4), em que R1 representa um átomo de hi- drogênio, R2 representa um átomo de hidrogênio, um grupo formila, um gru- po C1-6 alquila, um grupo C3-6 alquenila ou um grupo C3-6 alquinila em que
o grupo alquila, o grupo alquenila e o grupo alquinila são opcionalmente substituídos com (a) substituinte(s) selecionado(s) a partir do grupo que con- siste em um grupo hidroxila, um grupo metóxi, um grupo metoxicarbonila, um grupo etoxicarbonila, um grupo ciano e um grupo furila.
(7) um composto da fórmula geral (I), em que I é 1 e R é um grupo represen- tadoporOR3.
(8) um composto do anterior (7), em que R3 é um grupo C1-3 alquila que é opcionalmente substituído com um grupo amino.
(9) um composto da fórmula geral (I), em que I é 1 e R é um grupo represen- tado por S(O)mR4.
(10) um composto do anterior (9), em que R4 é um grupo C1-3 alquila que é opcionalmente substituído com um grupo amino ou um grupo hidroxila, e m é 0.
(11) um composto da fórmula geral (I), em que I é 1 e R é um átomo de ha- logênio.
(12) um composto do anterior (11), em que o átomo de halogênio é um áto- mo de cloro.
(13) um composto da fórmula geral (I), em que nédel a2eXéum grupo C1-3 alquila, um grupo C1-3 alcóxi, um grupo C1-3 haloalquila, um grupo ciano, um átomo de halogênio ou um grupo nitro. (14) um composto do anterior (13), em que X é um átomo de cloro, um áto- mo de bromo ou um grupo nitro, e X é substituído na posição 6 e/ou na posi- ção 8.
(15) um composto da fórmula geral (I), em que Ar é um grupo fenila que é opcionalmente substituído com (a) atomo(s) de halogênio ou (a) grupo(s) C1-3 alquila.
O composto (I) inclui compostos conhecidos e pode ser prepara- do por um método conhecido ou um método análogo a ele. 10
15
20
Por exemplo, um composto (Ia) em que I é 1 e R é um átomo de cloro pode ser preparado aquecendo-se um composto (II) com oxicloreto de fósforo de acordo com o seguinte processo de produção 1. Exemplo de Documento: JP-UNS 62-145073
POCl3
Processo de Produção 1 H
PrV0 ♦
(X)n T
Ar
(II)
em que símbolos são como definidos acima.
A reação pode ser realizada em um solvente que não adversa- mente afeta a reação, e é normalmente realizada na ausência de um solven- te e utilizando uma quantidade em excesso de oxicloreto de fósforo (5 equi- valentes a 30 equivalentes com base no composto (II)). A temperatura de reação é normalmente de 80 a 200°C, preferivelmente de 90°C à temperatu- ra de refluxo (105°C). O tempo de reação é normalmente de 0,1 a 96 horas, preferivelmente de 0,5 a 5 horas, mais preferivelmente 0,5 a 2 horas. Quan- do a reação proceder lentamente ainda sob refluxo, a reação pode da mes- ma forma ser aquecida a cerca de 200°C e pressurizada (por exemplo, a 1,1 a 100 de pressão atmosférica) em um vaso fechado resistente à pressão.
Um composto (Ib) em que I é 1 e R é um grupo Ra que é diferen- te de um átomo de halogênio pode estar preparado, por exemplo, reagindo- se um composto (III) com um composto (IV) de acordo com o seguinte pro- cesso de produção 2.
Exemplo de Documento: Journal of the Chemical Society of Japan, 1973, p1944; JP-UNS 58-88369
Processo de Produção 2
-N^ /Y
Base
rv —π
+Éfd -ym.2
25
(III) (IV) (Ib)
em que Y representa um grupo de saída (por exemplo, um átomo de halo- gênio tal como flúor, cloro, bromo ou iodo; um grupo alcano- ou areno- ι sulfonilóxi tal como um grupo metanossulfonilóxi, um grupo benzenosulfoni- lóxi ou um grupo p-toluenossulfonilóxi; um grupo alcano-, areno- ou arenoal- cano-sulfonila tal como metanossulfonila, benzenossulfonila, ou fenilmeta- nossulfonila, etc.); Ra tem o mesmo significado como aquele de R, contanto que Ra não seja um átomo de halogênio; e outros símbolos são como defini- dos acima.
A reação pode ser realizada com ou sem utilizar um solvente. Exemplos do solvente incluem hidrocarboneto alifático tal como pentano, hexano, heptano, éter de petróleo, ou cicloexano; éster tal como acetato de metila, acetato de etila, formato de etila, ou propionato de etila; cetona tal como acetona, ou metil etil cetona; éter tal como éter dietílico, éter terc-butil metílico, éter di-isopropílico, éter dibutílico, tetra-hidrofurano, ou dioxano; álcool tal como metanol, etanol, ou isopropanol; nitrilo tal como acetonitrilo, ou propionitrilo; amida de ácido tal como dimetilformamida, ou dimetilaceta- mida; amida cíclica tal como 1-metil-2-pirrolidona; amida fosfórica tal como hexametilfosforamida; uréia cíclica tal como 1,3-dimetil-2-imidazolidinona; sulfóxido tal como dimetil sulfóxido; sulfona tal como sulfolano; hidrocarbone- to halogenado tal como diclorometano, clorofórmio, 1,2-dicloroetano, ou te- tracloreto de carbono; amina aromática tal como piridina, picolina, lutidina, ou quinolina; suas misturas, água, e misturas dos solventes e água.
Quando uma mistura do solvente e água é usada e a reação não é um sistema de reação homogêneo, um catalisador de transferência de fa- se (por exemplo, um sal de amônio quaternário tal como cloreto de benzil- trietilamônio, ou brometo de benziltrietilamônio, éter coroa tal como 18- coroa-6, etc.) pode ser usado.
Exemplos da base incluem alcoolato de metal de álcali tal como etilato de sódio, metilato de sódio, ou terc-butóxido de potássio; uma base orgânica tal como piridina, picolina, lutidina, quinolina, trietilamina, di- isopropiletilamina, 4-dimetilaminopiridina, ou Ν,Ν-dimetilanilina; uma base inorgânica tal como carbonato de potássio, carbonato de sódio, hidróxido de sódio, hidróxido de potássio, carbonato de hidrogênio de sódio, ou carbonato de hidrogênio de potássio; hidreto de metal tal como hidreto de lítio, hidreto de sódio, ou hidreto de potássio; e um reagente de lítio orgânico tal como butii lítio, ou di-isopropilamida de lítio.
A quantidade da base a ser usada não está particularmente limi- tada contanto que não adversamente influencie a reação. Uma quantidade em excesso grande da base pode da mesma forma ser usada como um sol- vente.
Quando o composto (IV) for uma amina, uma quantidade em excesso do composto (IV) pode da mesma forma ser usada como igualmen- te uma base e um solvente.
A temperatura de reação é normalmente de -50 a 200°C, preferi- velmente de temperatura ambiente a 150°C. O tempo de reação é normal- mente de 0,1 a 96 horas, preferivelmente de 0,1 a 72 horas, mais preferivel- mente de 0,1 a 24 horas.
Quando o composto (IV) for um composto de ponto de ebulição baixo tal como amônia, metilamina ou etilamina ou quando a reação proce- der lentamente, a reação pode da mesma forma ser aquecida em uma tem- peratura de cerca de 40 a 150°C e pressurizada (por exemplo, em 1,1 a 100 de pressão atmosférica) em um vaso fechado resistente à pressão.
O composto (II) inclui um composto conhecido e pode ser prepa- rado por um método conhecido ou um método análogo a ele.
Por exemplo, o composto (II) pode ser preparado reagindo-se um composto (V) com um composto (VI) e clorocarbonato de metila de acor- do com o seguinte processo de produção de referência 1. Exemplo de Documento: Tetrahedron 42, 3697(1986)
Processo de Produção de Referência 1 NH2
/=( 1) Ar-Mg-Z (VI)
(x /Vcn --
2) ClCO2Me
(X)n
(V) (II)
em que Z representa um átomo de halogênio tal como cloro, bromo ou iodo, e outros símbolos são como definidos acima. * Nesta reação, primeiro, o composto (V) é reagido com o com-
posto (VI). Um solvente é normalmente usado. Exemplos do solvente inclu- em hidrocarboneto alifático tal como pentano, hexano, heptano, ou éter de petróleo; hidrocarboneto aromático tal como benzeno, tolueno, ou xileno;
éter tal como éter dietílico, éter terc-butil metílico, éter di-isopropílico, éter dibutílico, tetra-hidrofurano, ou dioxano, e uma mistura de dois ou mais tipos deles.
O composto (VI) é normalmente usado em uma quantidade de 1 a 5 equivalentes, preferivelmente 2 a 2,5 equivalentes com base no compos- to (V).
Neste estágio, a temperatura de reação é normalmente de 40 a 100°C, preferivelmente de 50 a 70°C.
O tempo de reação é normalmente de 0,2 a 96 horas, preferi- velmente de 0,5 a 24 horas, mais preferivelmente de 1 a 3 horas. Logo, clorocarbonato de metila é adicionado ao sistema de rea-
ção. Clorocarbonato de metila é normalmente usado em uma quantidade de 1 a 5 equivalentes, preferivelmente 1 a 2 equivalentes com base no compos- to (V). Neste estágio, é preferido que clorocarbonato de metila seja adicio- nado depois de resfriar a uma temperatura de 0 a 20°C, seguido por aque- ço cimento. A temperatura de reação sob aquecimento é normalmente de 40 a 200°C, preferivelmente de 50 a 70°C. O tempo de reação total é normalmen- te de 0,2 a 96 horas, preferivelmente de 0,5 a 10 horas, mais preferivelmente de cerca de 1 a 3 horas.
O composto (II) pode da mesma forma ser preparado reagindo- se um composto (VII) com cloreto de tricloroacetila para produzir um com- posto (VIII) e reagindo-se o composto (VIII) com amônia ou um sal de amô- nia com uma substância de ácido fraco de acordo com o seguinte processo de produção de referência 2.
Exemplo de Documento: Chem. Pharm. Bull., 26, 1633 (1978) Processo de Produção de Referência 2 NH2
NHCOCCi3
H
N ^O
COAr
CCi3COCI
COAr
[NH3]
(Χ)η
(VII)
Base
(Χ)η
(VIII)
Ar
em que símbolos são como definidos acima.
Na primeira reação, cloreto de tricloroacetila é reagido com o
composto (VII) na presença de uma base. A reação pode ser realizada na ausência de um solvente, e é normalmente realizada na presença de um 5 solvente. Exemplos do solvente incluem hidrocarboneto alifático, hidrocarbo- neto aromático, éster, cetona, éter, nitrilo, amida de ácido, amida cíclica, a- mida fosfórica, ureia cíclica, sulfóxido, sulfona, hidrocarboneto halogenado descrito no Exemplo de Produção 2, e suas misturas. Exemplos da base in- cluem as bases descritas no Exemplo de Produção 2. Entre estas bases, 10 uma base orgânica ou uma base inorgânica é preferida, e trietilamina é ge- ralmente usada.
velmente O a 20°C. O tempo de reação é normalmente de cerca de 0,1 a 96 horas, preferivelmente de 0,2 a 5 horas, mais preferivelmente de 0,5 a 3 ho-
reação é reagido com amônia ou um composto que gera amônia no sistema. Exemplos do composto incluem sais com substâncias ácidas fracas de amô- nia, tal como carbonato de amônio, formato de amônio, ou acetato de amô- 20 nio. Na reação, o solvente como descrito no Exemplo de Produção 2 é nor- malmente usado. Exemplos preferíveis do solvente incluem amida de ácido, amida cíclica, amida fosfórica, ureia cíclica, sulfóxido, e sulfona.
A temperatura de reação é normalmente de -50 a 100°C, preferi-
ras.
Na segunda reação, o composto (VIII) preparado na primeira
25
A temperatura de reação é normalmente de 20 a 200°C, preferi- velmente de 50 a 120°C.
O tempo de reação é normalmente de 0,2 a 96 horas, preferi- velmente de 0,5 a 10 horas, mais preferivelmente de 1 a 5 horas.
O composto (III) inclui um composto conhecido e pode ser pre- parado por um método conhecido ou um método análogo a ele. < Por exemplo, o composto (III) em que Y é que um átomo de clo-
ro é um composto (Ia) incluído no composto (I) e pode ser preparado pelo método descrito acima.
O composto (IV), o composto (V), o composto (VI) e o composto 5 (VII) são normalmente compostos conhecidos, e estão comercialmente dis- poníveis ou podem ser preparados por um processo de produção conhecido. Particularmente, o composto (VI) é um composto chamado um reagente de Grignard. O composto (VI) pode ser um produto comercialmente disponível, ou pode ser preparado por um processo de produção conhecido e em segui- 10 da usado como está sem isolamento e purificação.
Compostos preparados pelo processo de produção 1, 2 e o pro- cesso de produção de referência 1, 2 descritos acima podem ser isolados e purificados por meios conhecidos, por exemplo, concentração, concentração sob pressão reduzida, extração, dissolução, cristalização, recristalização, ou cromatografia.
Um composto representado pela fórmula geral (XI) (em seguida, às vezes, referido como o composto (XI)) ou um sal agricolamente aceitável do mesmo pode da mesma forma ser usado como o ingrediente ativo de um regulador de crescimento da planta. Um certo composto de quinazolina ten- 20 do um grupo amino substituído na posição 2 é conhecido (folheto de WO 2005/042501).
Exemplos do "grupo C1-6 alquila" representados por R11 em um composto representado pela fórmula geral (XI) da presente invenção (em seguida pode ser referido como um composto (XI)), incluem metila, etila, 25 propila, isopropila, butila, isobutila, sec-butila, terc-butila, pentila, 3- metilbutila, e hexila. Exemplos do "grupo C3-6 alquenila" incluem alila, 2- butenila, 3-butenila, e 3-metil-2-butenila. Exemplos do" grupo C3-6 alquinila" incluem propargila, 2-butinila, e 3-pentinila. Exemplos do "grupo C4-6 alqui- la" incluem butila, isobutila, sec-butila, terc-butila, pentila, 3-metilbutila, e he- 30 xila. Exemplos do "grupo C1-3 alcoxicarbonilmetila" incluem metoxicarbonil- metila, etoxicarbonilmetila, propiloxicarbonilmetila, e isopropiloxicarbonilmeti- la. Exemplos do "grupo C1-3 alcóxiC1-3 alquila" incluem 2-metoxietila, 2- metoxipropila, 3-metoxipropila, 2-etoxietila, e 3-etoxipropila.
O "grupo C1-6 alquila", "grupo C3-6 alquenila", "grupo C3-6 al- quinila" e "grupo C4-6 alquila" descritos acima podem ter um ou mais substi- tuintes, preferivelmente um a três substituintes selecionados a partir de um 5 grupo hidroxila, um grupo C1-3 alcóxi, um grupo C1-3 alcoxicarbonila, um grupo ciano, um grupo 2-furila e um grupo 2-tetra-hidrofurila em posições substituíveis. Quando o número de substituintes for 2 ou mais, os substituin- tes podem ser os mesmos ou diferentes.
Exemplos do "grupo C1-3 alcóxi" descritos como um exemplo do substituinte incluem metóxi, etóxi, propilóxi, e isopropilóxi. Exemplos do "grupo C1-3 alcoxicarbonila" incluem metoxicarbonila, etoxicarbonila, propi- loxicarbonila, e isopropiloxicarbonila.
O composto (XI) pode formar um sal de adição de ácido. Exem- plos do sal de adição de ácido incluem um sal de ácido inorgânico tal como 15 cloridrato, bromidrato, hidroiodeto, fosfato, sulfato, nitrato, ou perclorato; e um sal de ácido orgânico tal como formato, acetato, tartarato, malato, citrato, oxalato, sucinato, benzoato, picrato, metanossulfonato, ou p- toluenossulfonato.
Quando o composto (XI) tem um grupo ácido tal como um grupo 20 carboxila, um grupo hidroxila fenólico ou um grupo metileno ativo, exemplos do sal que pode ser formado incluem sais de metal tal como sais de metal de álcali (sal de lítio, sal de sódio, sal de potássio, etc.) e sais de metal alcalino terroso (sal de magnésio, sal de cálcio, sal de bário, etc.); sal de amônio; e sais de adição salga com bases orgânicas (por exemplo, dimetilamina, trieti- 25 lamina, piperazina, pirrolidina, piperidina, 2-feniletilamina, benzilamina, eta- nolamina, dietanolamina, piridina, colidina, etc.).
Desse modo, o composto (XI) pode estar na forma de um sal agricolamente aceitável como descrito acima.
Quando o composto (XI) tem um ou mais centros assimétricos, o composto inclui dois ou mais estereoisômeros (por exemplo, enantiômero, diastereômero, etc.). O composto da presente invenção inclui todos os este- reoisômeros e uma mistura de dois ou mais estereoisômeros. Quando o composto (XI) tem isomerismo geométrico com base
em uma ligação dupla e similares, o composto inclui dois ou mais isômeros
geométricos (por exemplo, E/Z ou trans/cis isômero, S-trans/S-cis isômero,
etc.). O composto (XI) inclui todos os isômeros geométricos e uma mistura
de dois ou mais isômeros geométricos.
O composto da fórmula geral (XI) em que m é um número inteiro
de1 a3ené0éo composto em que a posição 6 do esqueleto de quinazo-
Iina é não-substituída, isto é, um composto da fórmula geral (XI-1):
(XiW
7\vynhr11
(xi-1)
Ph
em que Ph representa um grupo fenila, R11 representa um átomo de hidro- 10 gênio, um grupo formila, um grupo C1-6 alquila, um grupo C3-6 alquenila ou um grupo C3-6 alquinila, e o grupo alquila, o grupo alquenila e o grupo alqui- nila são opcionalmente substituídos com pelo menos um substituinte sele- cionado a partir de um grupo hidroxila, um grupo C1-3 alcóxi, um grupo C1-3 alcoxicarbonila, um grupo ciano, um grupo 2-furila e um grupo 2-tetra- 15 hidrofurila,
m' representa um número inteiro de 1 a 3,
X-ι representa um átomo de cloro, um átomo de bromo, um grupo trifluoro- metila, um grupo ciano ou um grupo nitro,
quando m' for 2 ou mais, cada Xi é o mesmo ou diferente um do outro,
contanto que quando m' for 1, Xi é um átomo de cloro e R11 representa um grupo metila, Xi é um átomo de 8-cloro.
O composto da fórmula geral (XI) em que n é 1 é o composto em que a posição 6 do esqueleto de quinazolina é substituída com X2, isto é, um
composto da fórmula geral (XI-2):
(Xl)m
NHR11
(ΧΙ-2)
X2"" v v
em que Ph representa um grupo fenila, R" representa um átomo de hidro gênio, um grupo formila, um grupo C1-6 alquila, um grupo C3-6 alquenila ou um grupo C3-6 alquinila, e o grupo alquila, o grupo alquenila e o grupo alqui- nila são opcionalmente substituídos com pelo menos um substituinte sele- cionado a partir de um grupo hidroxila, um grupo C1-3 alcóxi, um grupo C1-3 5 alcoxicarbonila, um grupo ciano, um grupo 2-furila e um grupo 2-tetra- hidrofurila,
m representa um número inteiro de 0 a 3,
Xi e X2 podem ser os mesmos ou diferentes e representam um átomo de cloro, um átomo de bromo, um grupo trifluorometila, um grupo ciano ou um grupo nitro,
quando m for 2 ou mais, cada Xi é o mesmo ou diferente um do outro, contanto que quando qualquer um das seguintes condições (1) a (3) está satisfeita, m representa um número inteiro de 1 a 3:
(1) X2 é um átomo de cloro, e R11 é um grupo selecionado a partir de um á- tomo de hidrogênio, um grupo metila, um grupo 2-hidroxietila, um grupo 3-
hidroxipropila, um grupo 2,2-dimetoxietila e um grupo cianometila,
(2) X2 é um átomo de bromo, e R11 é selecionado a partir de um grupo 2- hidroxietila, um grupo 3-hidroxipropila e um grupo 2-metoxietila, e
(3) X2 é um grupo nitro, e R11 é um grupo 3-hidroxipropila.
Exemplos preferíveis do composto (XI) incluem os seguintes
compostos.
(1) um composto da fórmula geral (XI), em que R11 é um átomo de hidrogê- nio, um grupo formila, um grupo metila, um grupo etila, um grupo 2- hidroxietila, um grupo 3-hidroxipropila, um grupo 2-metoxietila, um grupo fur-
furila, um grupo metoxicarbonilmetila ou um grupo etoxicarbonilametila, m é 0, n é 1, e X2 é um átomo de cloro ou um grupo nitro.
(2) um composto da fórmula geral (XI), em que R11 é um átomo de hidrogê- nio, um grupo formila, um grupo metila, um grupo etila, um grupo 2- hidroxietila, um grupo 2-metoxietila, um grupo furfurila, um grupo metoxicar-
bonilmetila ou um grupo etoxicarbonilametila, mé 1, né 1,Xi éum átomo de 8-cloro, e X2 é um átomo de cloro ou um grupo nitro.
(3) um composto da fórmula geral (XI), em que m é um número inteiro de 1 a 3, e n é 0.
(4) um composto da fórmula geral (XI), em que R11 é um grupo formila, um grupo C4-6 alquila, um grupo C3-6 alquenila ou um grupo C3-6 alquinila em que o grupo alquila, o grupo alquenila e o grupo alquinila são opcionalmente
substituídos com (a) grupo(s) hidroxila ou (a) grupo(s) C1-3 alcóxi, ou R11 é um grupo C1-3 alcoxicarbonilmetila, um grupo C1-3 alcóxi C1-3 alquila ou um grupo furfurila, m é 0, n é 1, e X2 é um átomo de cloro.
(5) um composto da fórmula geral (XI), em que n é 1.
(6) um composto da fórmula geral (XI), em que m é 1 a 3, ené1.
(7) um composto da fórmula geral (XI), em que R11 é um grupo C1-3 alcoxi- carbonilmetila ou um grupo furfurila.
(8) um composto da fórmula geral (XI), em que n é 1, e X2 é um grupo trifluo- rometila ou um grupo ciano.
O composto (XI) é uma nova substância e pode ser preparado reagindo-se um composto (XII) com um composto (XIII) de acordo com o seguinte processo de produção 11.
Processo de Produção 11
(Xl)m
is*
ífCT Ύ + Rh Base -*
(X2)n
Ph
(XIII) (XI)
em que Y representa um grupo de saída (por exemplo, um átomo de halo- gênio tal como flúor, cloro, bromo ou iodo; um grupo alcano- ou areno- 20 sulfonilóxi tal como um grupo metanossulfonilóxi, um grupo benzenossulfoni- lóxi ou um grupo p-toluenossulfonilóxi; ou um grupo alcano-, areno- ou are- noalcano-sulfonila tal como metanossulfonila, benzenossulfonila ou fenilme- tanossulfonila), e outros símbolos são como definidos acima.
A reação pode ser realizada com ou sem utilizar um solvente. Exemplos do solvente incluem hidrocarboneto alifático tal como pentano, hexano, heptano, éter de petróleo, ou cicloexano; éster tal como acetato de metila, acetato de etila, formato de etila, ou propionato de etila; cetona tal como acetona, ou metil etil cetona; éter tal como éter dietílico, éter terc-butil metílico, éter di-isopropílico, éter dibutílico, tetra-hidrofurano, ou dioxano; álcool tal como metanol, etanol, ou isopropanol; nitrilo tal como acetonitrilo, ou propionitrilo; amida de ácido tal como dimetilformamida, ou dimetilaceta- mida; amida cíclica tal como 1-metil-2-pirrolidona; amida fosfórica tal como 5 hexametilfosforamida; ureia cíclica tal como 1,3-dimetil-2-imidazolidinona; sulfóxido tal como dimetil sulfóxido; sulfona tal como sulfolano; hidrocarbone- to halogenado tal como diclorometano, clorofórmio, 1,2-dicloroetano, ou te- tracloreto de carbono; amina aromática tal como piridina, picolina, lutidina, ou quinolina; suas misturas, água, e misturas dos solventes e água.
Quando uma mistura do solvente com água é usada e a reação
não é um sistema homogêneo, um catalisador de transferência de fase (por exemplo, um sal de amônio quaternário tal como cloreto de benziltrietilamô- nio, ou brometo de benziltrietilamônio, éter coroa tal como 18-coroa-6, etc.) pode ser usado.
Exemplos da base incluem alcoolato de metal de álcali tal como
etilato de sódio, metilato de sódio, ou terc-butóxido de potássio; uma base orgânica tal como piridina, picolina, lutidina, quinolina, trietilamina, di- isopropiletilamina, 4-dimetilaminopiridina, ou Ν,Ν-dimetilanilina; uma base inorgânica tal como carbonato de potássio, carbonato de sódio, hidróxido de 20 sódio, hidróxido de potássio, carbonato de hidrogênio de sódio, ou carbonato de hidrogênio de potássio; hidreto de metal tal como hidreto de lítio, hidreto de sódio, ou hidreto de potássio; e um reagente de lítio orgânico tal como butil lítio, ou di-isopropilamida de lítio.
A quantidade da base a ser usada não está particularmente Iimi- tada contanto que não adversamente influencie a reação. Uma quantidade em excesso grande da base pode da mesma forma ser usada como um sol- vente.
Quando o composto (XIII) for uma amina, uma quantidade em excesso do composto (XIII) pode da mesma forma ser usada como uma ba- se e um solvente.
A temperatura de reação é normalmente de -50 a 200°C, preferi- velmente de temperatura ambiente a 150°C. O tempo de reação é normal- mente de 0,1 a 96 horas, preferivelmente de 0,1 a 72 horas, mais preferivel- mente de 0,1 a 24 horas.
Quando o composto (XIII) for um composto de ponto de ebulição baixo tal como amônio, metilamina ou etilamina ou quando a reação proce- 5 der lentamente, a reação pode da mesma forma ser aquecida em uma tem- peratura de cerca de 40 a 150°C e pressurizada (por exemplo, em 1,1 a 100 de pressão atmosférica) em um vaso fechado resistente à pressão.
O composto (XII) inclui um composto conhecido e pode ser pre- parado por um método conhecido ou um método análogo a ele. Por exem- 10 pio, um composto (XIIa) em que Y é um átomo de cloro pode ser preparado reagindo-se um composto (XIV) com oxicloreto de fósforo de acordo com o seguinte processo de produção de referência 11.
Exemplo de Documento: JP-UNS 62-145073
Processo de Produção de Referência 11
(Xl)m H
IkynT0 *
+ POCl3 -^
(X2)n I, (X2)n
em que símbolos são como definidos acima.
A reação anterior pode ser realizada em um solvente que não adversamente afeta a reação, e é normalmente realizada na ausência de um solvente utilizando uma quantidade em excesso de oxicloreto de fósforo (5 equivalentes a 30 equivalentes com base no composto (XIV)).
A temperatura de reação é normalmente de 80 a 200°C, preferi-
velmente de 90°C à temperatura de refluxo (105°C).
O tempo de reação é normalmente de 0,1 a 96 horas, preferi- velmente de 0,5 a 5 horas, mais preferivelmente 0,5 a 2 horas. Quando a reação proceder lentamente ainda sob refluxo, a reação pode da mesma 25 forma ser aquecida em uma temperatura de cerca de 200°C e pode ser pressurizada (por exemplo, em 1,1 a 100 de pressão atmosférica) em um vaso fechado resistente à pressão.
O composto (XIV) inclui um composto conhecido e pode ser pre- parado por um método conhecido ou um método análogo a ele. Por exem- plo, o composto (XIV) pode ser preparado reagindo-se um composto (XV) com um composto (XVI) e clorocarbonato de metila de acordo com o seguin- te processo de produção de referência 12.
Exemplo de Documento: Tetrahedron 42, 3697 (1986)
Processo de Produção de Referência 12 NH2
1) Ph-Mg-Z (XVI)
CN -**
2) CICO2Me
(X2)n
em que Z representa um átomo de halogênio tal como cloro, bromo, ou iodo, e outros símbolos são como definidos acima.
Na reação, primeiro, um composto (XV) é reagido com um com- 10 posto (XVI). Um solvente é normalmente usado, e exemplos do mesmo in- cluem hidrocarboneto alifático tal como pentano, hexano, heptano, ou éter de petróleo; hidrocarboneto aromático tal como benzeno, tolueno, ou xileno; éter tal como éter dietílico, éter terc-butil metílico, éter di-isopropílico, éter dibutílico, tetra-hidrofurano, ou dioxano, e uma mistura de dois ou mais tipos 15 deles.
O composto (XVI) é normalmente usado na quantidade de 1 a 5 equivalentes, preferivelmente 2 a 2,5 equivalentes com base no composto (XV).
A temperatura de reação é normalmente de 40 a 100°C, preferi- velmente de 50 a 70°C.
O tempo de reação é normalmente de 0,2 a 96 horas, preferi- velmente de 0,5 a 24 horas, mais preferivelmente de 1 a 3 horas.
Logo, clorocarbonato de metila é adicionado ao sistema de rea- ção. Clorocarbonato de metila é normalmente usado em uma quantidade de 25 1 a 5 equivalentes, preferivelmente 1 a 2 equivalentes com base no compos- to (XV). Neste estágio, é preferido que clorocarbonato de metila seja adicio- nado depois de resfriar em uma temperatura de 0 a 20°C, seguido por aque- cimento. A temperatura de reação sob aquecimento é normalmente de 40 a 200°C, preferivelmente de 50 a 70°C. O tempo de reação total é normalmen- te de 0,2 a 96 horas, preferivelmente de 0,5 a 10 horas, mais preferivelmente de cerca de 1 a 3 horas.
O composto (XIV) pode da mesma forma ser preparado reagin- do-se um composto (XVII) com cloreto de tricloroacetila para produzir um composto (XVIII) e reagindo-se o composto (XVIII) com amônia ou uma substância ácida fraca de amônia de acordo com o seguinte processo de produção de referência 13.
Exemplo de Documento: Chem. Pharm. Buli, 26, 1633 (1978)
Processo de Produção de Referência 13
(Xl NH2 NHCOCCI3
V=\ CCI3COCi X=K [NH3]
e ' y^~COPh -'
(X2)n Base (X2)n
(XVII) (XVIII)
em que símbolos são como definidos acima.
Na primeira reação, cloreto de tricloroacetila é reagido com o composto (XVII) na presença de uma base. A reação pode ser realizada na ausência de um solvente, e é normalmente realizada na presença de um 15 solvente. Exemplos do solvente incluem hidrocarboneto alifático, hidrocarbo- neto aromático, éster, cetona, éter, nitrilo, amida ácida, amida cíclica, amida fosfórica, ureia cíclica, sulfóxido, sulfona, hidrocarboneto halogenado descri- to no Exemplo de Produção 11, e suas misturas.
Exemplos da base incluem as bases descritas no Exemplo de Produção 11. Entre estas bases, uma base orgânica ou uma base inorgânica é preferida, e trietilamina é geralmente usada.
A temperatura de reação é normalmente de -50 a 100°C, preferi- velmente 0 a 20°C.
O tempo de reação é normalmente de cerca de 0,1 a 96 horas, preferivelmente de 0,2 a 5 horas, mais preferivelmente de 0,5 a 3 horas.
Na segunda reação, o composto (XVIII) preparado na primeira reação é reagido com amônia ou um composto que gera amônia no sistema. Exemplos do composto incluem sais com substâncias ácidas fracas de amô- nia, tal como carbonato de amônio, formato de amônio, ou acetato de amô- nio. Na reação, o solvente como descrito no Exemplo de Produção 11 é normalmente usado. Exemplos preferíveis do solvente incluem amida de ácido, amida cíclica, amida fosfórica, ureia cíclica, sulfóxido, e sulfona.
A temperatura de reação é normalmente de 20 a 200°C, preferi- velmente de 50 a 120°C.
O tempo de reação é normalmente de 0,2 a 96 horas, preferi- velmente de 0,5 a 10 horas, mais preferivelmente de 1 a 5 horas.
O composto (XIII), o composto (XV), o composto (XVI) e o com-
posto (XVII) são compostos normalmente conhecidos, e estão comercial- mente disponíveis ou podem ser preparados por um processo de produção conhecido.
Particularmente, o composto (XVI) é um composto chamado um reagente de Grignard. O composto (XVI) pode ser um produto comercial- mente disponível, ou pode ser preparado por um processo de produção co- nhecido e em seguida usado como está sem isolamento e purificação.
Compostos preparados pelo processo de produção 11 e o pro- cesso de produção de referência 11, 12 e 13 podem ser isolados e purifica- dos por meios conhecidos, por exemplo, concentração, concentração sob pressão reduzida, extração, dissolução, cristalização, recristalização, ou cromatografia.
O crescimento de uma planta na presente invenção é normal- mente regulado aplicando-se uma quantidade eficaz de um regulador de crescimento da planta a uma planta ou hábitat da planta.
Quando o regulador de crescimento da planta da presente in- venção for usado para agricultura e silvicultura, a quantidade de aplicação é normalmente 0,01 a 1,000 g/1 OOOm2. Quando o regulador de crescimento da planta da presente invenção é a forma de um concentrado emulsificável, um 30 pó umectável, uma formulação fluível, ou uma microcápsula, é normalmente pulverizada depois da diluição com água para ter uma concentração de in- grediente ativo de 0,001 a 10,000 ppm. Quando o regulador de crescimento da planta da presente invenção estiver na forma de um pó ou um grânulo, é normalmente aplicado no estado em que se encontra.
Para o propósito de promover o crescimento de raízes da plan- tas no solo de um campo cultivado, o solo pode ser tratado diretamente com o regulador de crescimento da planta desse modo formulado da presente invenção ou com uma diluição do regulador de crescimento da planta. Além disso, o regulador de crescimento da planta pode ser formulado em uma formulação de resina na forma de uma folha ou filamento. A formulação de resina pode ser aplicada enrolando-se ao redor das plantas, prolongando-se na redondeza da plantas, assentando-se na superfície do solo aos pés da planta, ou similar. O regulador de crescimento da planta da presente inven- ção pode da mesma forma ser usado por tratamento de folhagem ou trata- mento de brotos. Sementeiras antes do plantio ou orifícios para o plantio ou pés da planta no plantio podem ser da mesma forma tratados com o regula- dor de crescimento da planta da presente invenção. Plantas alvo são trata- das com o regulador de crescimento da planta uma vez ou em tempos plu- rais.
Quando o regulador de crescimento da planta da presente in- venção for usado para tratamento de folhagem de um corpo da planta ou 20 tratamento de solo, a quantidade de aplicação pode variar, dependendo do tipo de formulação, da cronometragem, método e lugar de aplicação, e da planta alvo, e é normalmente de 0,1 a 10.000 g por hectare. Quando o regu- lador de crescimento da planta for usado como uma diluição com água, a concentração do regulador de crescimento da planta pode variar, dependen- 25 do do tipo de formulação, da cronometragem, método e lugar de aplicação, e da planta alvo, e é normalmente de 0,001 a 10.000 ppm, preferivelmente de 0,01 a 1.000 ppm.
O regulador de crescimento da planta da presente invenção po- de da mesma forma ser usado para um tratamento de uma planta antes da transplantação. Quando o regulador de crescimento da planta da presente invenção é diretamente absorvido em uma planta antes do transplante, a porção de raiz ou toda a planta pode ser imersa em uma solução ou suspen- são do regulador de crescimento da planta com uma concentração de 0,001 ppm a 10.000 ppm.
Sementes da planta alvo podem ser diretamente tratadas com uma formulação do regulador de crescimento da planta da presente inven- 5 ção. Exemplos de um tal método de tratamento incluem um método que compreende imergir sementes de uma planta no regulador de crescimento da planta da presente invenção preparado de forma que a concentração de um ingrediente ativo possa ser 1 a 10.000 ppm, um método que compreende sementes pulverização ou revestimento de uma planta com o regulador de 10 crescimento da planta da presente invenção preparado de forma que a con- centração de um ingrediente ativo possa ser de 1 a 10.000 ppm, e um méto- do que compreende cobrir as sementes de uma planta com pó do regulador de crescimento da planta da presente invenção.
O regulador de crescimento da planta da presente invenção po- de ser misturado com um meio de cultura de água para cultura de água, ou pode ser usado como um dentre os componentes do meio para cultura de tecido. Quando o regulador de crescimento da planta da presente invenção for usado para cultura de água, o regulador de crescimento da planta pode ser dissolvido ou suspenso em um meio de cultura de água tal como Enshi em uma concentração de 0,001 ppm a 10.000 ppm. Quando o regulador de crescimento da planta da presente invenção for usado para cultura de tecido ou cultura de célula, o regulador de crescimento da planta pode ser dissolvi- do ou suspenso em um meio de cultura de tecido da planta convencional- mente usado, tal como um meio de MS em uma concentração de 0,001 ppm a 10.000 ppm. Neste caso, sacarídeos como uma fonte de carbono e vários hormônios da planta podem convencionalmente ser adicionados ao meio.
O regulador de crescimento da planta da presente invenção po- de da mesma forma ser usado em combinação com um fungicida, um inseti- cida, um acaricida, um nematocida, um herbicida, um regulador de cresci- mento da planta e/ou um fertilizante.
Suas quantidades de aplicação e concentrações de aplicação podem variar, dependendo do tipo de formulação, da cronometragem, lugar e método de aplicação, do tipo de uma planta e efeito a ser esperado, e por- tanto elas podem ser aumentadas ou diminuídas sem limitação às faixas anteriores.
No método de regulamento de crescimento da planta como des- 5 crito acima, o regulador de crescimento da planta pode ser usado.
É da mesma forma possível especificar uma substância tendo a capacidade para promover o crescimento de uma raiz de uma planta avalia- da pelo método para testar a capacidade de uma substância teste promover o crescimento de uma raiz de uma planta que compreende a primeira etapa 10 e a segunda etapa utilizando-se um receptor de citocinina selecionado a par- tir do grupo A, e em seguida trazer a substância especificada tendo a capa- cidade para promover o crescimento de uma raiz de uma planta em contato com uma planta para promover o crescimento de uma raiz da planta. Um método para trazer a substância especificada tendo a capacidade para pro- 15 mover o crescimento de uma raiz de uma planta em contato com uma planta inclui o método de formulação e o método de aplicação como descrito acima.
O regulador de crescimento da planta da presente invenção po- de ser usado para o propósito de melhoria no estabelecimento de muda e melhoria em uma taxa de remover a raiz no solo por promoção do cresci- 20 mento de raízes sob cultivo de semeadura de arroz. O regulador de cresci- mento da planta da presente invenção pode da mesma forma ser usado para o propósito de promoção do crescimento de raízes ao aumento de mudas de arroz em uma caixa de sementeira. O regulador de crescimento da planta da presente invenção pode da mesma forma ser usado para o propósito de me- 25 Ihoria na dilatação de raiz e resistência à seca e calor de verde de um cam- po de golfe. No caso de colheitas tal como feijão de soja, milho e trigo, o re- gulador de crescimento da planta da presente invenção pode ser usado para o propósito de melhoria na dilatação da raiz, produtividade de melhoria por estabelecimento de muda em um estágio precoce ou redução na quantidade 30 de aplicação de herbicidas. No caso de cultura de tomate, papel ou similar, o regulador de crescimento da planta da presente invenção pode ser usado para o propósito de melhoria em uma taxa de remover raiz no solo sob transplantação. No caso de produção de mudas de vegetais, o uso do regu- lador de crescimento da planta da presente invenção pode ser esperado conduzir a estabelecimento de muda uniforme, e em seguida melhoria em eficiência de transplante mecânico.
5 O regulador de crescimento da planta da presente invenção po-
de ser usado para controle de domínio apical de uma planta. Por exemplo, o regulador de crescimento da planta da presente invenção pode ser usado para inibir o crescimento de brotos axilares de tabaco, rosa e similares. O regulador de crescimento da planta da presente invenção pode controlar a 10 formação de brotos de flor de colheitas de fruta, florescendo plantas e simila- res, e portanto pode ser usado como um agente de adelgaçamento de flor. O regulador de crescimento da planta da presente invenção pode da mesma forma aumentar brotos de flor, e desse modo aumento no rendimento de colheitas de fruta ou melhoria na qualidade do florescimento da plantas pode 15 ser alcançada. O regulador de crescimento da planta da presente invenção pode da mesma forma inibir o crescimento de galhos de colheitas de fruta para diminuir o número de galhos ou pode promover o crescimento de ga- lhos de colheitas de fruta para aumentar o número de ramificações, e portan- to pode ser usado para controle do crescimento do tronco de uma árvore.
O regulador de crescimento da planta da presente invenção po-
de ser usado para tecnologias de cultura de tecido tal como dediferenciação ao calo ou rediferenciação do calo. Por exemplo, o regulador de crescimento da planta da presente invenção pode ser usado para promover a formação de calo de tecidos da planta. O regulador de crescimento da planta da pre- 25 sente invenção pode ser da mesma forma usado para melhorar a eficiência de rediferenciação de um embrião adventício de feijão de soja ou similares.
O regulador de crescimento da planta da presente invenção po- de ser usado para controlar o envelhecimento de uma planta. Por exemplo, o regulador de crescimento da planta da presente invenção pode ser usado 30 para inibir o envelhecimento de e melhorar a manutenção de flores cortadas da plantas em florescimento tal como cravo. O regulador de crescimento da planta da presente invenção pode da mesma forma ser usado para inibir a maturação das frutas. O regulador de crescimento da planta da presente invenção pode da mesma forma prevenir o envelhecimento de folhas de mu- das de arroz de alagado, e desse modo mudas boas podem ser cultivadas. Plantas tal como algodão podem ser tratadas com o regulador de crescimen- 5 to da planta da presente invenção antes de colher para promover o envelhe- cimento das folhas.
O receptor de citocinina derivado da planta consistindo em uma seqüência de aminoácido mostrada no grupo anterior B pode ser usado co- mo uma ferramenta de estudo. Por exemplo, pode ser usado como uma fer- 10 ramenta de estudo para realizar estudo tal como o teste para a capacidade de promover o crescimento de uma raiz de uma planta ou a procura para uma substância química tendo a capacidade de controlar o crescimento ou diferenciação de uma planta como descrito acima. O receptor de citocinina pode da mesma forma ser usado como uma ferramenta de estudo em estu- 15 do para analisar um mecanismo de ação de um fármaco que age em um receptor de citocinina.
Um polinucleotídeo codificando uma seqüência de aminoácido mostrada no grupo B e um polinucleotídeo tendo uma seqüência de nucleo- tídeo complementar a isso, uma seqüência de nucleotídeo parcial de um po- linucleotídeo codificando uma seqüência de aminoácido mostrada no grupo B ou um polinucleotídeo tendo um seqüência de nucleotídeo complementar à seqüência de nucleotídeo parcial, e um polipeptídeo compreendendo uma seqüência de nucleotídeo de SEQ ID NO: 3 ou 4 podem da mesma forma ser usados como ferramentas de estudo. Por exemplo, uma porção deles pode funcionar como um polinucleotídeo a ser usado no processo de produ- ção de um receptor de citocinina como descrito acima. Da mesma forma, uma porção deles pode ser usada como uma ferramenta de estudo impor- tante por obter um polinucleotídeo mostrado no grupo polinucleotídeo B utili- zando PCR, ou obtendo um polinucleotídeo mostrado no grupo polinucleotí- deo B utilizando hibridização, como descrito acima.
Quando uma avaliação de um regulador de crescimento da plan- ta é realizada, eles podem ser usados como uma ferramenta de teste em experiências para avaliação. Especificamente, eles podem ser usados como uma ferramenta de teste em experiências para o teste da capacidade para promover o crescimento de uma raiz de uma planta e a avaliação de uma substância química tendo a capacidade de controlar o crescimento ou dife- 5 renciação de uma planta como descrito acima.
A presente invenção também inclui um sistema (em seguida, às vezes, referido como o sistema da presente invenção) que compreende um meio para introduzir, armazenar e manusear a informação de dados sobre uma atividade (ou a presença ou ausência de sinalização intracelular ou a 10 quantidade do mesmo) de uma substância teste para inibir a sinalização in- tracelular de um receptor de citocinina derivado da planta de uma célula (em seguida, às vezes, referido como os meios a), meios para indagar e procurar a informação de dados com base em condições desejadas (em seguida, às vezes, como os meios b), e meios para exibir e emitir os dados indagados e 15 procurados (em seguida, às vezes, chamado meios c).
Primeiro, os meios a são descritos. Como descrito acima, os meios a são meios que introduzem a informação de dados de uma atividade de uma substância teste para inibir a sinalização intracelular de um receptor de citocinina derivado da planta de uma célula, e em seguida armazena e 20 administra a informação de entrada. Tal informação é entrada por uma en- trada significa 1 e é normalmente memorizado em meios de memória 2. Os meios de entrada incluem meios capazez de introduzir a informação, tal co- mo um teclado ou um mouse. Quando a introdução, armazenamento e ad- ministração da informação são concluídos, a informação procede aos meios 25 subsequentes b. No armazenamento e controle da informação, muitos dados podem ser eficazmente armazenados e controlados manuseando-se infor- mação tendo uma estrutura de dados utilizando hardware tal como um com- putador e software tal como OS e banco de dados, e armazenando da infor- mação em um próprio dispositivo de armazenamento, por exemplo, um meio 30 de gravador legível pelo computador tal como um disco flexível, um disco fotomagnético, um CD-ROM, um DVD-ROM, ou um disco rígido.
Os meios b são descritos. Como descrito acima, os meios b são * meios que indagam e procuram a informação de dados armazenados e ma- nuseados pelos meios a com base em condições para obter os resultados desejados. Quando condições para investigação e pesquisa são registradas pelos meios de entrada 1 e informação que corresponde às condições é 5 normalmente selecionada a partir da informação armazenada nos meios de armazenamento 2, a informação procede aos meios subsequentes c. Os resultados selecionados são normalmente armazenados nos meios de ar- mazenamento 2 e pode ser exibido pelos meios de exibição e produção 3.
Os meios c são descritos. Como descrito acima, os meios c são meios que exibem e produz os resultados indagados e procurados. Os mei- os de exibição e produção 3 incluem um display, e uma impressora, e os resultados podem ser exibidos em um dispositivo de exibição de um compu- tador, ou produzidos em um papel por impressão.
Exemplos
Em seguida, a presente invenção será descrita em detalhes por
meio de Exemplos, porém a presente invenção não está limitada a estes.
O composto (I) usado na presente invenção será descrito mais especificamente por meio de Exemplos de Síntese e Exemplos de Síntese de Referência, porém o composto (I) não está limitado a estes exemplos.
Nestes Exemplos de Síntese e Exemplos de Síntese de Refe-
rência, "temperatura ambiente" normalmente significa uma temperatura de 10 a 30°C. "1H RMN" significa um espectro de ressonância magnética de próton. Utilizando tetrametilsilano como um padrão interno, a medida foi rea- lizada com um espectrômetro (400 MHz), Modelo JNM-AL400, fabricado por 25 JEOL Ltd. e trocas químicas (δ) foram expressas como ppm. "Mp" significa um ponto de fusão e foi medido com um medidor de ponto de fusão, Modelo Mettler FP61.
Abreviações usadas nos seguintes Exemplos de Síntese, Exem- plos de Síntese de Referência e Tabelas 3 a 7 têm os seguintes significados. CDCI3: clorofórmio deuterado, DMSO-dô: dimetil sulfóxido deuterado, s: sin- gleto, d: dupleto, t: o tripleto, q: quadrupleto, dd: dupleto duplo, m: multipleto, br: amplo, J: constante de acoplamento, Me: metila, Et: etila, Pr: propila, i-Pr: isopropila, t-Bu: terc butil, Ph: fenila, Ac: acetila, THF: tetra-hidrofurano, DMF: Ν,Ν-dimetilformamida, DMSO: dimetil sulfóxido e MTBE: éter butil me- tílico terciário
Exemplo de Síntese 1 (Preparação de 2,8-dicloro-4-fenilquinazolina (com- posto N0 Ia 1-11))
Em 1,24 g de 8-cloro-4-fenil-2(1H)-quinazolinona (composto N0 11-11) foi adicionado 6,65 g de oxicloreto de fósforo, seguido por agitação a 95°C durante 1 hora. A solução reacional resultante foi vertida em 200 ml de água gelada, e bicarbonato de sódio foi em seguida adicionado, desse modo 10 ajustando o pH em 9. Em seguida, cristais precipitados foram coletados por filtração. O produto coletado foi recristalizado a partir de etanol para obter
1,07 g do composto titulado. Mp.154,4°C. 1H RMN (CDCI3): 7,52-7,65 (4H, m), 7,76-7,80 (2H, m), 8,02-8,08 (2H, m).
Exemplo de Síntese 2 (Preparação de 2-amino-6,8-dicloro-4-fenilquinazolina (composto N0 IC12-4))
Uma mistura de 300 mg de 2,6,8-tricloro-4-fenilquinazolina (composto N0 Ia1-12), 30 g de uma solução de amônia aquosa a 28% e 6 ml de acetonitrilo foi reagido a 105°C durante 1,5 hora em um vaso de reação resistente à pressão. A solução reacional resultante foi resfriada e em segui- 20 da vertida em 100 ml de água. A mistura foi extraída com 60 ml de acetato de etila e o extrato resultante foi concentrado. O resíduo resultante foi purifi- cado por cromatografia de coluna em sílica gel (clorofórmio) para obter 230 mg do composto titulado. Mp.212,7°C. 1H RMN (CDCI3): 5,56 (2H, br. s), 7,54-7,60 (3H, m), 7,63-7,68 (2H, m), 7,74 (1H, d, J = 2,3 Hz), 7,79 (1H, d, J 25 = 2,3 Hz).
Exemplo de Síntese 3 (Preparação de 6-cloro-2-furfurilamino-4- fenilquinazolina (composto N0 Ic3-16))
Uma mistura de 275 mg de 2,6-dicloro-4-fenilquinazolina (com- posto N0 la1-3) e 486 mg de furfurilamina foi agitada a 85°C durante 40 mi- nutos e em seguida vertida em 50 ml de água. A mistura foi extraída com acetato de etila e o extrato resultante foi lavado com água e em seguida concentrado. O resíduo resultante foi recristalizado a partir de etanol para obter 280 mg do composto titulado. Mp. 142,0°C. 1H RMN (CDCI3): 4,77 (2H, d, J = 5,6 Hz), 5,70 (1H, br. t, J = 5,6 Hz), 6,29-6,32 (2H, m), 7,36 (1H, dd, J = 1,8, 0,9 Hz), 7,53-7,70 (7H, m), 7,78 (1H, d, J = 2,2 Hz).
Exemplo de Síntese 4 (Preparação de 6-cloro-2-etoxicarbonilmetilamino-4- 5 fenilquinazolina (composto N0 lc3-33))
Em 550 mg de 2,6-dicloro-4-fenilquinazolina (composto N0 Ia1 -3) e 419 mg de cloridrato de éster etílico de glicina foram adicionados 3 ml de DMF e 607 mg de trietilamina, seguido por agitação a 85°C durante 5,5 ho- ras. A solução reacional resultante foi vertida em 100 ml de água e extraída 10 com acetato de etila. O extrato foi concentrado. O resíduo resultante foi puri- ficado por cromatografia de coluna em sílica gel (hexano: acetato de etila = 6:1 a 3:1 para obter 503 mg do composto titulado. Mp.146,1°C. 1H RMN (CDCI3): 1,30 (3H, t, J = 7,2 Hz), 4,25 (2H, q, J = 7,2 Hz), 4,31 (2H, d, J = 5,2 Hz), 5,97 (1H, br. s), 7,54 - 7,63 (5H, m), 7,67 - 7,70 (2H, m), 7,79 (1H, s).
Exemplo de Síntese 5 (Preparação de 6-cloro-2-metoxiamino-4- fenilquinazolina (composto N0 lc3-32))
Em uma mistura de 275 mg de 2,6-dicloro-4-fenilquinazolina (composto N0 la1-3), 10 ml de acetonitrilo e 334 mg de cloridrato de metoxi- amina foi adicionado gota a gota 506 mg de trietilamina em temperatura am- 20 biente para obter uma mistura. A mistura foi carregada em um vaso de rea- ção resistente à pressão feito de aço inoxidável e a reação foi realizada a 105°C durante 3,5 horas. Depois de resfriar, a solução reacional foi vertida em 100 ml de água. A mistura foi extraída com acetato de etila e o extrato resultante foi lavado com água e em seguida concentrado. O resíduo resul- 25 tante foi purificado por cromatografia de coluna em sílica gel (hexano : aceta- to de etila = 3:1) para obter 156 mg de cristais crus. Os cristais crus foram recristalizados a partir de acetato de etila para obter 55 mg do composto titu- lado. Mp.173,9°C. 1H RMN (CDCI3): 3,98 (3H, s), 7,47-7,72 (6H, m), 7,87 (1H, d, J = 9,0 Hz), 7,89 (1H, d, J = 2,2 Hz), 8,03 (1H, br, s).
Exemplo de Síntese 6 (Preparação de 6-cloro-2-(2-hidroxietiltio)-4- fenilquinazolina (composto N0 Ie3-1))
Em uma solução de 86 mg de 2-mercaptoetanol em DMF (7,5 ml) foi adicionado 44 mg de hidreto de sódio (60%), seguido por agitação em temperatura ambiente durante 30 minutos. À mistura de reação foi adiciona- do 275 mg de 2,6-dicloro-4-fenilquinazolina (composto N0 la1-3), seguido por agitação em temperatura ambiente durante 2 horas. A solução reacional foi 5 vertida em 100 ml de água e extraída com acetato de etila. O extrato resul- tante foi concentrado. O resíduo resultante foi purificado por cromatografia de coluna em sílica gel (acetato de etila : hexano = 1:5) para obter 266 mg do composto titulado. Mp.124,4°C. 1H RMN (CDCI3): 3,50 (2H, t, J = 5,5 Hz), 3,64 (1H, br. t), 4,07 (2H, q-semelhante, J = 5,5 Hz), 7,57-7,61 (3H, m), 7,71- 10 7,74 (2H, m), 7,77 (1H, dd, J = 8,9, 2,3 Hz), 7,85 (1H, d, J = 8,9 Hz), 7,97 (1H, d, J = 2,3 Hz).
Exemplo de Síntese 7 (Preparação de 6-cloro-2-formamido-4- fenilquinazolina (composto N0 lc3-35))
Em uma solução de 54 mg de formamida seca em DMF (5 ml) 15 foi adicionado 48 mg de hidreto de sódio (60%), seguido por agitação em temperatura ambiente durante 30 minutos. À mistura de reação foi adiciona- do 275 mg de 2,6-dicloro-4-fenilquinazolina (composto N0 la1-3), seguido por aquecimento a 85°C e outra agitação durante 3 horas. A solução reacional resultante foi vertida em 100 ml de água e extraída com acetato de etila. O 20 extrato foi concentrado. O resíduo resultante foi purificado por cromatografia de coluna em sílica gel (acetato de etila : hexano = 1:3) para obter 64 mg do composto titulado. Mp. 252,1 °C. 1H RMN: 7,59-7,66 (3H, m), 7,72-7,81 (3H, m), 7,88 (1H, d, J = 8,8 Hz), 8,02 (1H, d, J = 2,0 Hz), 8,37 (1H, br. d, J = 10,4 Hz), 9,71 (1H, d, J = 10,4 Hz).
Exemplo de Síntese 8 (Preparação de 6-cloro-2-(1-metilidrazino)-4- fenilquinazolina (composto N0 lc3-27))
Uma mistura de 275 mg de 2,6-dicloro-4-fenilquinazolina (com- posto N0 la1-3) e 461 mg de monometilidrazina foi agitada a 85°C durante 30 minutos. O produto de reação resultante foi resfriado e 200 ml de água foi 30 adicionado a ele. Cristais precipitados foram coletados por filtração e o pro- duto coletado foi purificado por cromatografia de coluna (acetato de etila) para obter 225 mg do composto titulado. Mp. 155,9°C. 1H RMN (CDCI3): 3,52 (3Η, s), 4,65 (2Η, s), 7,54-7,63 (5Η, m), 7,70-7,74 (2Η, m), 7,80 (1Η, d, J =
2,0 Hz).
Exemplo de Síntese 9 (Preparação de 2-(2-aminoetóxi)-6-cloro-4- fenilquinazolina (composto N0 Id3-1))
5 Da mesma maneira como no Exemplo de Síntese 6, 500 mg de
2,6-dicloro-4-fenilquinazolina (composto N0 la1-3) e 382 mg de N-(2- hidroxietil)ftalimida foram reagidos para obter 380 mg de 6-cloro-4-fenil-2-(2- ftalimidoetóxi)quinazolina. Mp. 154,7°C. 1H RMN (CDCI3): 4,25 (2H, t, J = 5,8 Hz), 4,84 (2H, t, J = 5,8 Hz), 7,53-7,60 (3H, m), 7,67-7,71 (3H, m), 7,72-7,76 (3H, m), 7,78-7,82 (2H, m), 7,97 (1H, d, J = 2,2 Hz).
Uma mistura de 380 mg de 6-cloro-4-fenil-2-(2- ftalimidoetóxi)quinazolina, 70 mg de hidrato de hidrazina e 6 ml de etanol foi aquecida sob refluxo durante 2 horas. À solução reacional resultante foi adi- cionado 1,2 ml de água, e etanol foi em seguida destilado. Ao resíduo resul- 15 tante foi adicionado 1,5 ml de ácido clorídrico concentrado, seguido por a- quecimento sob refluxo durante 1 hora. O produto de reação resultante foi resfriado e vertido em uma solução saturada de bicarbonato de sódio em água e extraído com acetato de etila. O extrato foi concentrado para obter 240 mg do composto titulado. Mp.134,9°C. 1H RMN (CDCI3): 3,59-3,63 (2H, 20 m), 3,84 (2H, t, J = 4,6 Hz), 6,15 (2H, br. s), 7,53-7,59 (5H, m), 7,63-7,67 (2H, m), 7,75 (1H, d, J = 1,2 Hz).
Exemplo de Síntese 10 (Preparação de 2-(2-acetiltioetilamino)-6-cloro-4- fenilquinazolina (composto N0 Ic3-14))
Em uma solução de 292 mg de trifenilfosfina em THF desidrata- 25 do (3 ml) foi adicionado gota a gota 563 mg de uma solução a 40% de di- isopropilcarbodi-imida em tolueno sob resfriamento com gelo, seguido por agitação durante 20 minutos. À suspensão resultante foi adicionada gota a gota uma solução de 167 mg de 6-cloro-2-(2-hidroxietilamino)-4- fenilquinazolina (composto N0 Ic3-1) em THF desidratado (2ml) sob resfria- 30 mento com gelo, e imediatamente 127 mg de ácido tioacético foi adicionado gota a gota. A solução amarelo-claro resultante foi agitada durante 1 hora sob resfriamento com gelo, agitada em temperatura ambiente durante 1 ho- ra, vertida em uma solução saturada de bicarbonato de sódio em água, e em seguida extraída com clorofórmio. O extrato foi concentrado. O resíduo re- sultante foi purificado por cromatografia de coluna em sílica gel (clorofórmio: acetato de etila = 10 : 1) para obter 170 mg do composto titulado. Mp.
128,9°C. 1H RMN (CDCI3): 2,34 (3H, s), 3,22 (2H, t, J = 6,5 Hz), 3,73 (2H, q, J = 6,5 Hz), 5,74 (1H, br. t, J = 6,5 Hz), 7,53-7,62 (5H, m), 7,65-7,70 (2H, m), 7,77(1 H1 s).
Exemplo de Síntese 11 (6-cloro-2-(2-mercaptoetilamino)-4-fenilquinazolina (composto N0 Ic3-13) e dissulfeto de bis[2-(6-cloro-4-fenil-2- quinazolinil)aminoetila] (composto N0 Ic3-15))
Uma mistura de 108 mg de 2-(2-acetiltioetilamino)-6-cloro-4- fenilquinazolina (composto N0 Ic3-14), 2 ml de etanol e 362 mg de uma solu- ção de hidróxido de sódio aquosa a 10% foi agitada em temperatura ambien- te durante 2 horas e agitada sob aquecimento sob refluxo durante 30 minu- tos. Em seguida substâncias insolúveis foram colecionadas por filtração a partir da solução reacional. O produto coletado (sólido) foi purificado por cromatografia de coluna em sílica gel (clorofórmio : acetato de etila = 10:1) para obter 50 mg de 6-cloro-2-(2-mercaptoetilamino)-4-fenilquinazolina, pri- meiro. Mp. 165,9°C. 1H RMN (CDCI3): 1,46 (1H, t, J = 8,5 Hz), 2,84 (2H, q- semelhante, J=7,2 Hz), 3,66 (2H, q-semelhante, J=6,4 Hz), 5,79 (1H, br. t, J = 5,4 Hz), 7,55-7,57 (3H, m), 7,60 (2H, s), 7,66-7,69 (2H, m), 7,77-7,78 (1H, m). Em seguida, 28 mg de dissulfeto de bis[2-(6-cloro-4-fenil-2- quinazolinil)aminoetil] (composto representado pela seguinte fórmula) foi ob- tido.
Ys-S-S^yn
N N
Mp. 159,2°C. 1H RMN (CDCI3): 3,02 (4H, t, J=6,4 Hz), 3,89 (4H, q, J=6,4 Hz), 5,81 (2H, br. t, J=6,4 Hz), 7,51-7,61 (10H, m), 7,63-7,68 (4H, m), 7,75 (2H, d, J = 2,2Hz).
Exemplos de compostos que podem ser preparados da mesma maneira como nos Exemplos de Síntese descritos acima e compostos co- mercialmente disponíveis são mostrados na Tabela 3, Tabela 4, Tabela 5 e Tabela 6 (da mesma forma incluindo os compostos preparados nos Exem- plos de Síntese descritos acima).
Notas "a)", "b)", "c)" e "d)" na Tabela 4 e Tabela 5 são como segue.
Tabela 3
Ar
Composto R Ar (X)n Ponto de fusão (0C) N0 Ia1-1 Cl Ph 5-CI 125,7 Ia 1-2 Cl Ph 6-F 131,9 la1-3 Cl Ph 6-CI 166,2 la1-4 Cl Ph 6-Br 185,1 (decomposição) la1-5 Cl ' Ph 6-Me 137,8 la1-6 Cl Ph 6-CF3 117,5 (decomposição) la1-7 Cl Ph 6-N02 242,5 (decomposição) la1-8 Cl Ph 6-OMe 148,6 la1-9 Cl Ph 6-CN 206,8 (decomposição) Ia1-10 Cl Ph 7-CI 115,4 Ia1-11 Cl Ph 8-CI 154,4 Ia1-12 Cl Ph 6,8-CI2 160,3 Ia1-13 Cl p-CI-Ph 6-CI 205,6 Ia1-14 Cl m-CI-Ph 6-CI 161,3 Ib4-1 CHO o-CI-Ph 6-Br lcO-1 NH(CH2)2OH Ph (n=0) IC1-1 NH(CH2)3OH Ph 5-CI 175,7 Ic2-1 NH(CH2)3OH Ph 6-F 99,3 Ic3-1 NH(CH2)2OH Ph 6-CI 137,9 lc3-2 pirrolidino Ph 6-CI lc3-3 NH(CH2)3OH Ph 6-CI 135,9 lc3-4 NH(CH2)40H Ph 6-CI 115,6 lc3-5 NH(CH2)50H Ph 6-CI 117,2 lc3-6 NMe(CH2)2OH Ph 6-CI 128,5 lc3-7 NH(CH2)2OMe Ph 6-CI 89,7 lc3-8 NHn-Pr Ph 6-CI 158,3 lc3-9 NMe(CH2)2O Ph 6-CI 88,5 Me Tabela 4
Composto R Ar (X)n Ponto de fusão N0 (0C) Ic3-10 NH(CH2)2CHMe2 Ph 6-CI 90,1 Ic3-11 NH(CH2)6OH Ph 6-CI 107,9 Ic3-12 NH(CH2)2CH(Me)CH2OH Ph 6-CI 112,7 Ic3-13 NH(CH2)2SH Ph 6-CI 165,9 Ic3-14 NH(CH2)2SAc Ph 6-CI 128,9 Ic3-15 a) 159,2 Ic3-16 Nhfurfurila Ph 6-CI 142,0 Ic3-17 NHCH2CH=CMe2 Ph 6-CI 95,9 Ic3-18 NHCH2CH=C(Me)CH2OH Ph 6-CI 154,8 Ic3-19 NH2 Ph 6-CI 157,8 lc3-20 NHNH2 Ph 6-CI 175,0 Ic3-21 NH(CH2)2NMe2 Ph 6-CI 102,1 lc3-22 NH(CH2)4NH2 Ph 6-CI 118,0 lc3-23 NHMe Ph 6-CI 186,9 lc3-24 NHEt Ph 6-CI 156,7 lc3-25 NMe2 Ph 6-CI 141,8 lc3-26 NHCH2CN Ph 6-CI 208,6 (decomposição) lc3-27 NMeNH2 Ph 6-CI 155,9 lc3-28 NHi-Pr Ph 6-CI 112,5 lc3-29 NHCH2CH=CH2 Ph 6-CI 147,3 lc3-30 NHCH2C=CH Ph 6-CI 168,4 Ic3-31 NHCH2CONH2 Ph 6-CI 140,3 lc3-32 NHOMe Ph 6-CI 173,9 lc3-33 NHCH2CO2Et Ph 6-CI 146,1 lc3-34 NHCH2CH2CN Ph 6-CI 198,7 lc3-35 NHCHO Ph 6-CI 252,1 lc3-36 guanidina Ph 6-CI 253,4 (decomposição) Tabela 5
R
Ar
Composto R Ar (X)n Ponto de fusão (0C) N0 lc3-37 NHtetra-hidrofurfurila Ph 6-CI xarope, b) lc3-38 NH(CH2)3OMe Ph 6-CI 89,1 lc3-39 NHCH2CH(OH)CH3 Ph 6-CI 154,2 lc3-40 NH(CH2)2O(CH2)2OH Ph 6-CI 117,4 Ic3-41 NHCH2CH(OH)CH2OH Ph 6-CI 147,0 lc3-42 NHCH2CO2Me Ph 6-CI -aI CD Q ífi j I lc3-43 NHCH2CH2CO2Me Ph 6-CI 117,1 lc3-44 NHCH(Me)CH2OH Ph 6-CI 52,8 lc3-45 NHCH2CH2OEt Ph 6-CI xarope, c) lc3-46 NH(CH2)3OEt Ph 6-CI xarope, d) Ic4-1 NH(CH2)2OH Ph 6-Br lc4-2 NH(CH2)3OH Ph 6-Br 140,9 lc4-3 NHCH2CO2Me Ph 6-Br 183,1 (decomposição) Ic5-1 NH-p-CI-Ph Ph 6-Me lc5-2 NHCH2CoNH2 Ph 6-Me lc5-3 NHCH2CO2Et Ph 6-Me lc5-4 NH2 Ph 6-Me 151,8 lc5-5 NH(CH2)3OH Ph 6-Me 121,1 IC6-1 NH2 Ph 6-CF3 160,4 IC6-2 NH(CH2)3OH Ph 6-CF3 135,1 Ic7-1 NH(CH2)3OH Ph 6-N02 177,4 Ic8-1 NH(CH2)3OH Ph 6-OMe 115,9 Ic9-1 NH(CH2)3OH Ph 6-CN 173,3 (decomposição) IC10-1 NH(CH2)3OH Ph 7-CI 129,7 Tabela 6
Ar
Composto R Ar (X)n Ponto de fusão N0 ((C) IC11-1 NH(CH2)3OH Ph 8-CI 115,5 IC12-1 NH(CH2)3OH Ph 6,8-CI2 146,2 IC12-2 NHCH2CH2OH Ph 6,8-CI2 168,8 IC12-3 Nhfurfurila Ph 6,8-CI2 158,6 IC12-4 NH2 Ph 6, S-Cl2 212,7 IC12-5 NHCH2CN Ph 6,8-CI2 204,7 IC12-6 NHCH2CO2Me Ph 6,8-CI2 201,4 Id3-1 O(CH2)2NH2 Ph 6-CI 134,9 Ie3-1 S(CH2)2OH Ph 6-CI 124,4 le3-2 S(CH2)2NH2 Ph 6-CI 88,3 a) A estrutura foi descrita no Exemplo de Síntese 11. * b) 1H RMN (CDCI3): 1,66-1,75 (1H, m), 1,86-2,08 (3Η, m), 3,57-3,64 (1Η, m), 3,75-3,83 (2Η, m), 3,89-3,59 (1 Hi m), 4,13-4,20 (1Η, m), 5,70 (1Η, br. s), 7,52-7,60 (5H, m), 7,64-7,69 (2H, m), 7,75-7,76 (1H, m).
c) 1H RMN (CDCI3): 1,22 (3H, t, J = 7,0 Hz), 3,55 (2H, q, J = 7,0 Hz), 3,68 5 (2H, t, J = 5,2 Hz), 3,78 (2H, q-semelhante, J = 5,2 Hz), 5,75 (1H, br. t), 7,53-
7,60 (5H, m), 7,65-7,69 (2H, m), 7,75-7,77 (1H, m).
d) 1H RMN (CDCI3): 1,22 (3H, t, J = 7,0 Hz), 1,96 (2H, quinteto, J = 6,3 Hz), 3,50 (2H, q, J = 7,0 Hz), 3,58 (2H, t, J = 6,3 Hz), 3,67 (2H, q-semelhante, J = 6,3 Hz), 5,65 (1H, br, t), 7,53-7,60 (5H, m), 7,65-7,69 (2H, m), 7,74-7,76 (1H,
10 m).
Exemplo de Síntese de Referência 1 (Preparação de 8-cloro-4-fenil-2(1H)- quinazolinona (composto N011-11))
Em 7,10 g de brometo de fenilmagnésio (solução de THF a 32%) foi adicionada gota a gota uma solução de 953 mg de 2-amino-3- 15 clorobenzonitrilo em THF (7 ml) em temperatura ambiente, seguido por a- quecimento sob refluxo durante 30 minutos. Ao produto de reação resultante foi adicionado gota a gota 885 mg de clorocarbonato de metila sob resfria- mento com gelo, seguido por aquecimento sob refluxo durante 40 minutos. A solução reacional resultante foi resfriada e vertida em 40 ml de ácido 2N- k 20 clorídrico, e 8 g de bicarbonato de sódio e 20 ml de MTBE foram adicionados a ela, seguido por agitação. Cristais precipitados foram coletados por filtra- ção para obter 1,30 g do composto titulado. 1H RMN (DMSOd6): 7,24(1 H, t, J = 8,0 Hz), 7,57-7,70 (6H, m), 7,90-7,93 (1H, m), 11,45 (br. s).
Exemplo de Síntese de Referência 2 (4-fenil-6-trifluorometil-2(1H)- 25 quinazolinona (composto N0II-6))
Em uma solução de 762 mg de 2-amino-5-trifluorometilbenzo- fenona em 10 ml de clorofórmio foi adicionado gota a gota 349 mg de trieti- lamina, e em seguida 627 mg de cloreto de tricloroacetila foram adicionados gota a gota sob resfriamento com gelo. Depois de agitar na mesma tempera- 30 tura durante 30 minutos, 50 ml de água foi adicionado, desse modo sepa- rando a solução. A camada orgânica foi coletada e em seguida concentrada. O resíduo resultante foi purificado por cromatografia de coluna em sílica gel (hexano : acetato de etila = 5:1) para obter 1,08 g de 2'-benzoil-2,2,2- tricloro-^-trifluorometilacetanilida. 1H RMN (CDCI3): 7,53-7,58 (2H, m), 7,66- 7,75 (3H, m), 7,90-7,95 (2H, m), 8,81 (1H, d, J = 8,6 Hz), 12,38 (1H, br. s).
Uma mistura de 1,08 g de 2'-benzoil-2,2,2-tricloro-4'- 5 trifluorometilacetanilida, 10 ml de DMSO e 1,18 g de acetato de amônio foi agitado a 75°C durante 1 hora. Depois de resfriar, 100 ml de água foi adicio- nado e cristais precipitados foram coletados por filtração. A substância cole- tada resultante foi dissolvida em uma mistura de hexano: acetato de etila = 1:1, desidratado utilizando sulfato de magnésio anidroso e em seguida con- 10 centrado para obter 765 mg do composto titulado. 1H RMN (CDCI3): 7,58- 7,68 (3H, m), 7,75 (1H, d, J = 8,8 Hz), 7,79-7,83 (2H, m), 7,93 (1H, dd, J = 8,8, 1,7 Hz), 8,17 (1H, br. s), 13,37 (1H, br. s).
Exemplos de compostos que podem ser preparados da mesma maneira como nos Exemplos de Síntese de Referência descritos acima na Tabela 7 (da mesma forma incluindo os compostos preparados nos Exem- plos de Síntese de Referência descritos acima).
Notas "a)" a " i)" na Tabela 7 são como segue.
Tabela 7
H
Ar
Composto Ar (X)n Ponto de fusão (0C) N0 11-1 Ph 5-CI a) II-2 Ph 6-F b) II-3 Ph 6-CI >300 II-4 Ph 6-Br c) II-5 Ph 6-Me 291,9 II-6 Ph 6-CF3 d) II-7 Ph 6-N02 280(decomposição) II-8 Ph 6-OMe e) II-9 Ph 6-CN f) 11-10 Ph 7-CI g) 11-11 Ph 8-CI h) 11-12 Ph 6,8-CI2 i) 11-13 p-CI-Ph 6-CI 269,6(decomposição) 11-14 m-CI-Ph 6-CI 295(decomposição) a) 1H RMN (DMSOd6): 7,27 (1H, dd, J = 7,7, 1,0 Hz), 7,38 (1H, dd, J = 8,3,
1,1 Hz), 7,43-7,55 (5H, m), 7,69 (1H, t, J = 8,1 Hz), 12,18 (1H, br. s).
b) 1H RMN (DMSOd6): 7,35 (1H, dd, J = 9,2, 2,7 Hz), 7,43 (1H, dd, J = 9,2,
4,8 Hz), 7,58-7,74 (6H, m), 12,05 (1H, br. s).
c) 1H RMN (DMSOd6): 7,35 (1H, d, J = 9,2 Hz), 7,59-7,71 (6H, m), 7,91 (1H, dd, J = 9,2, 2,2 Hz), 12,08 (1H, br. s).
d) 1H RMN descrito no Exemplo de Síntese de Referência 2
e) 1H RMN (CDCI3): 3,78 (3H, s), 7,25-7,27 (1H, m), 7,36-7,40 (1H, m), 7,54- 7,62 (4H, m), 7,81 -7,85 (2H, m), 13,37 (1H, br. s).
f) 1H RMN (DMSO-d6): 7,48 (1H, d, J = 8,4 Hz), 7,60-7,68 (3H, m), 7,71-7,74 (2H, m), 8,05 (1H, s), 8,08-8,12 (1H, m), 12,36 (1H, br. s).
g) (não isolado e purificado)
h) 1H RMN descrito no Exemplo de Síntese de Referência 1
i) 1H RMN (DMSO-d6): 7,52-7,72 (6H, m), 8,10-8,12 (1H, m), 11,69 (1H, br. s).
Exemplo 1 (Construção de biblioteca de fago de cDNA de Arabidopsis thali- ana para clonar CER1)
Sementes de Arabidopsis thaiiana, linhagem de Wassilewskija foram esterilizadas com álcool etílico a 70% durante um minuto e em segui- 20 da com 1,5% de hipoclorito de sódio durante 10 minutos. As sementes foram bem lavadas com água estéril e em seguida cultivadas em um meio de GM (4,3 mistura salgada basal de Murashige e Skoog’s, 1% de sacarose, 10 ml de 5% de MES-KOH (pH 5,7), 0,3% de Phitagel® (SIGMA)) durante 2 sema- nas para obter 5 g de uma planta. A planta foi congelada em nitrogênio líqui- 25 do e em seguida fisicamente moída com um alfamotriz. Ao produto moído obtido foi adicionado uma mistura de 10 mg de tampão de extração (200mM de Tris-HCI (pH 8,5), IOOmM de NaCI, 10mM de EDTA, 0,5% de SDS, 14mM de β-mercaptoetanol) e 10 g de fenol. A mistura foi agitada por um misturador de Voltex. Em seguida, 10 ml de clorofórmio foi adicionado à mis- tura, seguido por agitação completa. Logo, a mistura obtida foi centrifugada
5 em 10.000 rpm durante 20 minutos, e uma camada aquosa foi coletada. À camada aquosa coletada foi adicionado LiCI em uma concentração final de 2M, seguida por repouso a -80°C durante 3 horas. O produto congelado ob- tido foi descongelado e em seguida centrifugado a 10.000 rpm durante 20 minutos. Um precipitado foi coletado. O precipitado coletado foi dissolvido 10 em 2 ml de TE (10mM de Tris-HCI (pH 8,0), 1mM de EDTA). Depois que 0,2 ml de 3M de acetato de sódio (pH 5,2) e 5 ml de etanol foram adicionados à solução, a mistura foi centrifugada para coletar um precipitado de RNA. Lo- go, RNA contendo poliA foi extraído a partir do precipitado coletado (RNA) com Oligotex® dT30super (fabricado por Roche Japan Co., Ltd.).
Uma biblioteca de cDNA de fase foi construída a partir do RNA
extraído contendo poliA utilizando-se Kit de ZAP-cDNASynthesis (fabricado por Stratagene Co., Ltd.) de acordo com a instrução do kit. O título da biblio- teca de cDNA de fago construída foi 500.000 PFU.
Exemplo 2 (Preparação de sonda de DNA para CRE1)
Reação de PCR foi realizada utilizando-se um líquido de fago
(cerca de 1.000.000 PFU) da biblioteca de cDNA de fago preparada no E- xemplo 1 como um modelo e um DNA de SEQ ID NO:3 e um DNA de SEQ ID NO:4 como iniciadores, utilizando kit TAKARA LA Taq® (fabricado por Takara Shuzo Co., Ltd.) para ampliar um DNA. Detalhes são descritos abai- xo.
Um líquido de reação de PCR foi preparado adicionando-se composições de reação tal como dNTP a 1.000.000 de PFU da fase e cada 0,2μΜ de DNAs de iniciador de acordo com a instrução do kit. PCR foi reali- zada sob as condição que depois de manter quente a 94°C durante 2 minu- 30 tos, 40 ciclos de 94°C durante 30 segundos, a 55°C durante 30 segundos e a 68°C durante 5 minutos foram conduzidos, para ampliar o fragmento de DNA desejado. Logo, uma sonda rotulada com 32P foi preparada utilizando- se o fragmento de DNA ampliado como um modelo e utilizando-se o kit de sistema de rotulagem de DNA Megaprime (fabricado por Amersham Phar- macia). Aqui, um líquido de reação (25 μΙ) foi preparado adicionando-se 32PdCTP 2,0 MBq a 25 ng do fragmento de DNA ampliado e em seguida 5 adicionando composições de reação especificadas pelo equipamento a este. Reação de rotulagem foi realizada a 37°C durante 10 minutos.
Exemplo 3 (Obtenção de Clone de cDNA de Fago transportando Gene de CRE1)
O gene de DRE1 desejado foi clonado por hibridização de placa utilizando a sonda de DNA preparada no Exemplo 2. Detalhes são descritos abaixo.
Placas foram formadas utilizando-se a biblioteca de fago de cD- NA preparada no Exemplo 1 de acordo com as instruções de kit ZAP- cDNARSynthesis. DNAs foram absorvidos em um filtro de nitrocelulose das placas formadas, e em seguida fixados sobre o filtro por um tratamento ul- travioleta. O filtro desse modo preparado foi mantido a 65°C na presença de
6 x SSC (0,9M de NaCI, 0,09M de citrato de sódio), 5 x solução de Denhart (0,1% (p/v) de Ficol 400, 0,1% (p/v) de polivinil pirrolidona, 0,1% de BSA), 0,5% (p/v) de SDS, e 100 pg/ml de DNA de esperma de salmão desnaturado 20 ou em uma solução de DIG EASY Hyb (Boehringer Mannheim Co., Ltd.) con- tendo 100 pg/ml de DNA de esperma de salmão desnaturado, mantido duas vezes em temperatura ambiente durante 15 minutos na presença de 1 x SSC (0,15M de NaCI, 0,015M de citrato de sódio) e 0,5% de SDS, e em se- guida mantido a 68°C durante 30 minutos na presença de 0,1 x SSC 25 (0,015M de NaCI, 0,0015M de citrato de sódio) e 0,5% de SDS para obter um clone de cDNA de fago cruzado.
Exemplo 4 (Clone de cDNA de CRE1)
Reação de PCR foi realizada utilizando-se cDNA do clone de cDNA de fago obtido no Exemplo 3 como um modelo e utilizando-se um DNA de SEQ ID NO:5 e um DNA de SEQ ID NO:6 como iniciadores para ampliar um DNA tendo a seqüência de nucleotídeo de SEQ ID NO:5. Deta- lhes são descritos abaixo. A reação de PCR foi realizada utilizando-se DNA Polimerase Realçado por Herculase (fabricado por TOYOBO Co., Ltd.) sob a condição de amplificação que depois de manter quente a 94°C durante 1 minuto, 25 ciclos de 94°C durante 30 segundos, a 55°C durante 30 segundos e a 72°C 5 durante 4 minutos foram conduzidos. Aqui, um líquido de reação de PCR (50 μΙ) foi preparado adicionando-se composições de reação tal como dNTP a 500 ng de cDNA do clone de cDNA de fago e cada 100 ng de DNAs de inici- ador de acordo com a instrução do kit.
Como descrito acima, o fragmento de DNA desejado foi amplia- do.
Exemplo 5 (Construção de plasmídeo de expressão de CRE1)
Um vetor de expressão de levedura, p415CYC (Munberg e ou- tros. Gene: 156 119-122 (1995), disponível a partir de biblioteca de ATCC (No. 87382)) foi digerido com a enzima de restrição Sma I. Em seguida, o 15 fragmento de DNA obtido no Exemplo 4 (um DNA tendo a seqüência de nu- cleotídeo SEQ ID NO:2) foi conectado a uma seqüência de promotor CYC1 do vetor de expressão p415CYC1 utilizando-se T4 DNA Ligase, e desse modo incorporado de forma que a proteína desejada poderia ser expressada em levedura. Foi confirmado que a seqüência de nucleotídeo do fragmento 20 de DNA foi inserido na direção correta e foi uma seqüência de nucleotídeo de SEQ ID NO: 2 utilizando-se um sequenciador. Desse modo, o plasmídeo de expressão p415CYC-CRE1 foi obtido.
Exemplo 6 (Produção de célula transformada TM182-CRE1 e célula trans- formada TM182-p415CYC1)
Cada um dos plasmídeos de expressão p451CYC-CRE1 obtidos
no Exemplo 5 e o vetor de expressão de levedura p415CYC foi usado para transformar uma cepa deficiente de gene Sln1, TM182 (sln1A) (Maeda T e outros. Nature: 369 242-245 (1994)). A transformação foi realizada utilizan- do-se um método de transformação mediado por acetato de Polietileno glicol 30 / lítio (PEG/LiAc) de acordo com VII. Transformation & Screening Protocols described in CLONTECH Co., Ltd.: MATCHMAKER Two-Hybrid System 3 User Manual, page 22. Visto que uma exigência nutricional de Ieucina desa- parece na célula transformada obtida, leveduras transformadas capazes de crescer em um meio de DOLU + Gal foram selecionadas para obter a célula transformada TM182-CRE1 e a célula transformada TM182-p415CYC1. Exemplo 7 (Método para avaliar substância química capaz de inibir a sinali- 5 zação intracelular de receptor de citocinina derivado da planta de célula)
A célula transformada TM182-CRE1 e a célula transformada TM182-p415CYC1 obtida no Exemplo 6 foram cada qual inoculadas em 10 ml de um meio DOLU + Gal, e pré-incubadas a 30°C durante 18 horas para obter uma pré-incubação líquida para cada uma das células transformadas. 10 O líquido de pré-incubação foi diluído com um meio de DOLU + Glu para a célula transformada TM182-CRE1 ou com um meio de DOLU + Gal para a célula transformada TM182-p415CYC1 até OD6OO = 0,1 foi alcançado, para obter uma diluição de pré-incubação por cada uma das células transforma- das.
A cada cavidade de uma placa de 96 cavidades foi adicionado 1
μΙ de uma solução de 200 ppm de uma substância teste em dimetil sulfóxido (DMSO) para preparar uma placa de Ensaio. Ao mesmo tempo, como con- troles, apenas 1 μΙ de DMSO foi adicionado a uma parte das cavidades. Uma placa de ensaio para a célula transformada TM182-CRE1 e uma placa de ensaio para a célula transformada TM182-p415CYC1 foram preparadas.
Uma solução de 10.000 ppm de trans-zeatina (citocinina) em DMSO foi diluída 50 vezes com um meio de DOLU + Gul em 200 ppm. A solução de trans-zeatina de 200 ppm foi adicionada em uma quantidade de 3/1.000 de volume a cada uma da diluição de pré-incubação descrita acima 25 para preparar cada diluição de pré-incubação contendo trans-zeatina a 0,6 ppm. A diluição de pré-incubação de 0,6 ppm foi adicionada em uma quanti- dade de 100 μΙ a cada uma das cavidades da placa de ensaio para cada cé- lula transformada. As placas foram incubadas a 30°C durante 24 horas. Em seguida, a turvação (OD 600) de cada cavidade foi medida utilizando-se uma 30 leitora de placa. A atividade da substância teste para inibir a sinalização in- tracelular de um receptor de citocinina derivado da planta de uma célula foi testada comparando-se a turvação medida com a turvação da cavidade de controle. Resultados são mostrados nas Tabelas 8 e 9.
Para a célula transformada TM182-CRE1, uma substância teste que teve uma turvação mais baixa do que a turvação da cavidade de contro- le foi selecionada como uma substância química capaz de inibir a sinaliza- 5 ção intracelular de um receptor de citocinina derivado da planta de uma célu- la. Para a célula transformada TM182-p415CYC1, entretanto, uma substân- cia teste que teve uma turvação mais baixa do que a turvação da cavidade de controle em que o grau de redução é equivalente a ou maior do que no caso da célula transformada TM182-CRE1 fosse tóxica a levedura, e portan- 10 to não foi selecionada como uma substância química capaz de inibir a sinali- zação intracelular de um receptor de citocinina derivado da planta de uma célula.
(Taxa de crescimento relativa na seção teste para seção de controle)
[%] = [(Turvação na seção de teste) - (Turvação em absoluto)] / [(Turvação na seção de controle) - (Turvação em absoluto)] * 100
(Atividade de inibir a sinalização intracelular de receptor de citocinina deriva- do da planta de célula) [%] = 100 - (Taxa de crescimento relativa na seção teste para seção de controle)
Tabela 8
Substância Taxa de crescimento relativa (%) (%) de Atividade de subs¬ química na seção teste de substância teste tância teste para inibir a (composto N0) para seção de controle sinalização intracelular de Célula transfor¬ Célula transfor¬ mada TM 182- mada TM182- CRE1 p415CYC1 la1-3 5,5 113,9 94,5 la1-7 1,2 78,8 98,8 Ib4-1 8,7 110,9 91,3 IC11-1 2,2 114,5 97,8 IC12-1 2,8 106,3 97,2 Ic2-1 2,8 124,6 97,2 IC3-1 5,4 114,1 94,6 lc3-3 1,4 108,6 98,6 lc3-4 1,4 106,4 98,6 lc3-5 3,5 115,4 96,5 lc3-6 2,8 114,6 97,2 lc3-7 2,8 104,1 97,2 lc3-9 1,5 122,0 98,5 Ic3-11 3,9 84,6 96,1 Ic3-12 5,6 90,9 94,4 Ic3-16 3,2 97,0 96,8 Ic3-18 4,0 105,3 96,0 Ic3-19 2,4 102,7 97,6 lc3-20 5,0 86,5 95,0 Ic3-21 5,0 121,6 95,0 lc3-22 4,9 110,6 95,1 IC3-23 4,1 108,1 95,9 lc3-24 2,1 112,5 97,9 lc3-25 6,0 122,0 94,0 IC3-26 5,3 110,7 94,7 lc3-27 2,3 107,4 97,7 lc3-29 1,6 92,7 98,4 Em todos os casos, a concentração existente de trans-zeatina foi ajustada em 0,6 ppm e a concentração existente de uma substância química foi ajustada em 2 ppm.
Tabela 9
Substância Taxa de crescimento relativa (%) (%) de Atividade de subs¬ química (com¬ na seção teste de substância teste tância teste por inibir a posto N0) para seção de controle sinalização intracelular de Célula trans¬ Célula transfor¬ formada mada TM182- TM182-CRE1 p415CYC1 lc3-30 2,2 108,9 97,8 lc3-32 4,5 89,2 95,5 lc3-33 1,0 114,6 99,0 lc3-34 0,2 118,5 99,8 lc3-37 3,5 114,2 96,5 lc3-38 1,2 99,4 98,8 lc3-39 -1,3 108,1 101,3 lc3-40 0,7 123,4 99,3 Ic3-41 8,8 123,3 91,2 lc3-42 -0,7 111,5 100,7 lc3-43 0,8 122,0 99,2 lc3-44 7,0 101,4 93,0 lc3-45 0,8 98,7 99,2 lc3-46 1,3 92,2 98,7 Ic4-1 4,6 95,0 95,4 lc4-2 0,9 109,3 99,1 lc5-4 8,9 116,8 91,1 lc5-5 7,2 126,3 92,8 Ic7-1 6,7 115,8 93,3 Id3-1 2,1 112,5 97,9 Ie3-1 2,3 110,7 97,7 Em todos os casos, a concentração existente de trans-zeatina foi ajustada em 0,6 ppm e a concentração existente de uma substância química foi ajustada em 2 ppm.
Exemplo 8 (Método para testar resposta à dose da substância química ca- 5 paz de inibir a sinalização intracelular de receptor de citocinina derivado da planta de célula)
As substâncias químicas (que inibem sinalização intracelular de um receptor de citocinina derivado da planta de uma célula) selecionadas no Exemplo 7 foram testadas em concentrações de teste variadas da mesma 10 maneira como no Exemplo 7. A célula transformada TM182-CRE1 e a célula transformada TM182-p415CYC1 obtidas no Exemplo 6 foram incubadas sob as mesmas condições como no Exemplo 7 a não ser que as concentrações de teste das substâncias químicas (que inibem sinalização intracelular de um receptor de citocinina derivado da planta de uma célula) selecionadas no 15 Exemplo 7 foram variadas dentro da faixa de 0,06 ppm a 6 ppm. A concen- tração da substância química testada foi ajustada com DMSO. Depois da *· conclusão de incubação, resposta à dose para atividade de inibir a sinaliza- ção intracelular de um receptor de citocinina derivado da planta de uma célu- la foi examinada a partir da concentração de teste mínima em que um esta- do proliferativo da célula transformada TM182-CRE1 não foi observado, ou 5 de uma curva de inibição de crescimento de resposta à dose obtida por um método como descrito abaixo.
Para preparar uma curva de inibição de crescimento de resposta à dose, primeiro, uma taxa de crescimento relativa foi calculada como segue. (Taxa de crescimento relativa) [%] = (B)/(A) χ 100 10 (A) = [(Turvação em 0,06 ppm de seção de teste) - (Turvação em absoluto)] / [(Turvação na seção de controle) - (Turvação em absoluto)]
(B) = [(Turvação em cada seção de teste) - (Turvação em absoluto)] / [(Tur- vação na seção de controle) - (Turvação em absoluto)]
Em seguida, um gráfico em que o eixo X mostrou a concentra- 15 ção de uma substância química de teste e o eixo de Y mostrou uma taxa de crescimento relativa (vide Figura 1, figuras da esquerda: célula transformada TM182-CRE1, figuras da direita: célula transformada TM182-p415CYC1) foi feita para obter uma curva de inibição de crescimento de resposta à dose. Exemplo 9 (Teste de Atividade de Promoção de Crescimento de Raiz)
^ 20 Meio padrão de Enshi tendo a seguinte composição (vide Tabela
10) foi preparado. Aos tubos em grupo foi distribuído a cada, 4 μΙ de uma solução de uma substância química em DMSO em uma concentração final 0,001 ppm a 10 ppm, e em seguida, foi distribuído a cada 600 μΙ do meio padrão de Enshi esterilizado. Em seguida a solução resultante foi bem mistu- 25 rada. Em cada um dos tubos em grupo, 10-20 sementes de Arabidopsis tha- Iiana foram semeadas, e cultivadas a 22°C durante 10 dias na luz. Em se- guida, o comprimento de raízes principais (raízes principais médias) geradas a partir das sementes de Arabidopsis thaliana foi medido. Uma média de oito repetições foi determinada, e uma taxa de crescimento de raiz foi determina- 30 da de acordo com a seguinte equação. Como um resultado, uma substância química que exibiu uma taxa de crescimento de raiz significante (por exem- plo, uma taxa de crescimento de raiz de 120% ou mais) poderia ser julgada ter uma atividade de promoção de crescimento de raiz.
Como resultados detalhados, concentrações finais que exibiram as taxas de crescimento de raiz mais altas foram mostradas na Tabela 11 e Tabela 12.
Taxa de crescimento de raiz (%) = (comprimento de raiz principal
média na seção tratada por substância química) / (comprimento de raiz prin- cipal média na seção de controle) * 100
Tabela 10
Composição Concentração (mq/L) Nitrato de cálcio Ca(NO3)2^H2O 950 Nitrato de potássio KNO3 810 Sulfato de magnésio MgS04-7H20 500 Fosfato de amônio NH4H2P04 155 Ferro quelado Fe-EDTA 22,62 Ácido bórico H3BO3 2,86 Sulfato de manganês MnS04-4H20 1,81 Sulfato de zinco ZnS04-7H20 0,22 Sulfato de cobre CuS04-5H20 0,08 Molibdato de sódio Na2Mo04-2H20 0,025 Ajustado em pH 5,8 Tabela 11
Composto N0 Concentração final de teste Atividade de promoção (ppm) de crescimento de raiz lc3-3 5 163,4 lc3-4 0,625 129,5 lc3-5 0,625 134,0 lc3-6 0,625 122,4 lc3-7 1,25 142,5 lc3-8 1,25 136,4 Ia 1-3 5 137,5 4
Ie3-1 5 120,9 le3-2 10 147,6 Ic3-10 10 120,6 Ic3-11 1,25 128,2 Ic3-12 1,25 128,9 Ic3-13 10 140,5 Ic3-14 2,5 126,2 Ic3-15 5 131,0 Ic3-16 5 155,3 Ic3-17 10 121,3 Ic3-18 2,5 139,5 Ic3-19 1,25 155,6 lc3-20 10 137,8 Ic3-21 2,5 131,7 lc3-22 0,156 129,3 lc3-23 10 150,0 lc3-24 1,25 122,8 lc3-25 10 140,0 lc3-26 5 136,4 lc3-27 2,5 127,8 lc5-4 2,5 136,6 lc5-5 2,5 157,8 lc3-28 10 120,4 lc3-29 10 122,4 Ic3-31 10 142,2 lc3-32 5 123,4 lc3-33 5 123,9 Tabela 12
Composto Concentração final de Atividade de promoção de cresci¬ N0 teste (ppm) mento de raiz lc3-35 10 144,4 lc3-36 2,5 123,1 Ia1-1 5 133,3 la1-2 10 139,7 Ic2-1 2,5 127,4 Ic9-1 10 141,5 IC1-1 2,5 150,9 IC10-1 10 163,6 IC11-1 5 143,9 IC12-1 2,5 184,6 IC6-2 2,5 155,9 la1-6 0,625 126,9 Ic8-1 10 162,1 lc3-37 5 138,5 lc3-38 5 141,9 lc3-39 10 169,0 lc3-40 0,625 125,8 Ic3-41 5 134,5 lc3-42 0,625 128,6 lc3-43 2,5 137,9 lc3-44 1,25 126,5 lc3-46 2,5 121,6 IC12-3 2,5 138,8 Ia1 -14 0,156 129,3 II-5 10 124,4 II-7 5 124,4 11-14 2,5 126,1 Exemplo 10 (Avaliação utilizando alface de atividade de promoção de cres- cimento de raiz de substância capaz de inibir a sinalização de citocinina)
Com respeito â substância química Ic3-1 e a substância química Ic7-1 (que inibem sinalização intracelular de um receptor de citocinina deri- vado da planta de uma célula) selecionada no Exemplo 7, uma atividade de promoção de crescimento de raiz principal foi avaliada utilizando alface (Lac- tuca sativa Red wave). Soluções aquosas da substância química tendo con- centrações diferentes (0,6 ppm, 1,2 ppm, 2,5 ppm, 5 ppm, 10 ppm, 20 ppm, cada contendo 0,1% de DMSO) foram preparadas, e adicionadas em uma quantidade de 1 ml sobre um papel filtro tendo um diâmetro de 50 mm em uma placa de Petri plástica de 60 φ. Em seguida, 30 sementes de alface fo- ram semeadas na placa de Petri plástica. Depois da cultura na Iuz a 22°C durante 4 dias, o comprimento de uma raiz principal foi medido. Uma média de 3 repetições foi determinada em uma taxa de crescimento de raiz foi de- terminada pela seguinte equação.
Taxa de crescimento de raiz (%) = (comprimento de raiz principal médio na seção tratada por substância química) / (comprimento de raiz prin- cipal médio na seção de controle) χ 100 -100
Resultados são mostrados na Figura 2 e Figura 3. No caso da substância química Ic3-1, o crescimento de raiz principal a 0,6 ppm para 2,5 ppm foi aumentado por 15 a 17% relativo a seção de controle (vide Figura
2). No caso da substância química Ic7-1, a extensão de raiz principal em 10 ppm a 20 ppm foi aumentada por 10 a 17% relativo a seção de controle (vide Figura 3). Resultados do teste de Dunnett mostraram que houve diferença 25 significante em um nível significante de 5% em todas as seções de tratamen- to, e portanto, houve efeito de promoção de crescimento de raiz notável. Exemplo 11 (Avaliação utilizando arroz de atividade de promoção de cresci- mento de raiz de substância capaz de inibir a sinalização de citocinina)
Com respeito à substância química Ic3-1 e a substância química Ic7-1 (que inibem sinalização intracelular de um receptor de citocinina deri- vado da planta de uma célula) selecionada no Exemplo 7, uma atividade de promoção de crescimento de raiz foi avaliada utilizando arroz (Oriza sativa L japonica.). Soluções aquosas da substância química tendo concentrações diferentes (10 ppm, 25 ppm, cada qual contendo 0,1% de DMSO) foram pre- paradas. Uma toalha de papel foi impregnada com 17 ml da solução quími- ca, em que o papel pesado foi colocado em uma bolsa de crescimento de 5 semente para observação de crescimento de raiz (177 mm x 163 mm, fabri- cado por Daiki Rika Kogyo Co., Ltd.), e 3 sementes de arroz foram semea- das na toalha de papel. A bolsa foi posta em um recipiente plástico, e em seguida selada. Depois da cultura na Iuz a 25°C durante 7 dias, o compri- mento de uma raiz principal foi medido. Uma média de 3 repetições foi de- 10 terminada e uma taxa de crescimento de raiz foi determinada pela seguinte equação.
Taxa de crescimento de raiz (%) = (Comprimento de raiz principal média na seção tratada por substância química) / (Comprimento de raiz principal mé- dia na seção de controle) χ 100 -100 Resultados são mostrados na Figura 4 e Figura 5. No caso da
substância química Ic3-1, o crescimento de raiz principal a 10 ppm foi au- mentado por 17% e o crescimento de raiz principal a 25 ppm foi aumentado por 20%, relativo à seção de controle (vide Figura 4). No caso da substância química Ic7-1, o crescimento de raiz principal a 10 ppm foi aumentado por 20 17% e o crescimento de raiz principal a 25 ppm foi aumentado por 19%, rela- tivo à seção de controle (vide Figura 5). Resultados do teste de Dunnett mostraram que houve diferença significante em um nível significante de 5% em todas as seções de tratamento, e portanto, houve efeito de promoção de crescimento raiz notável.
Exemplo 12 (Avaliação de atividade de promoção de crescimento de raiz de substância capaz de inibir a sinalização de citocinina por tratamento de se- mente de arroz)
Com respeito à substância química Ic3-1 e a substância química Ic7-1 (que inibem sinalização intracelular de um receptor de citocinina deri- vado da planta de uma célula) selecionada no Exemplo 7, uma atividade de promoção de crescimento de raiz principal induzida por tratamento de se- mente foi avaliada utilizando arroz (Oriza sativa L. japonica). A substância química foi dissolvida em acetona para preparar uma solução a 10.000 ppm. A solução da substância química acetona (300 μΙ) desse modo preparada foi posta em um tubo Eppendorf. Em seguida, 15 sementes foram postas no tubo eppendorf. A mistura resultante foi misturada durante cerca de 30 se- 5 gundos. As sementes, desse modo, tratadas por substância química foram dispersas e secadas em um papel filtro.
Cerca de 820 ml de terra de cultura foram colocados em um re- cipiente plástico (120 mm em comprimento, 97 mm em altura) com um orifí- cio na base. As sementes tratadas por química foram semeadas no recipien- 10 te plástico (15 sementes por recipiente plástico). As sementes foram cultiva- das em um lugar escuro a 30°C durante 4 dias e em seguida cultivadas em uma estufa durante 35 dias. Raízes da planta desse modo cultivadas foram removidas e o solo aderido à planta foi lavado, seguido por secagem por congelamento. Em seguida, o peso das raízes depois de secagem por con- 15 gelamento foi medido. Um teste foi repetido 3 vezes para cada seção de tra- tamento, e uma média foi determinada. Resultados são mostrados na Figura 6.
No caso do composto Ic3-1, o peso seco de raízes por planta aumentou para 119% da seção de controle. No caso do composto Ic7-1, o 20 peso seco das raízes por planta aumentou para 126% da seção de controle. Em ambos os casos, efeito de promoção de crescimento de raiz notável foi constatado. No caso de um composto de auxina IAA, o peso de raízes foi suprimido para 87% da seção de controle, e desse modo, o efeito de inibição de crescimento de raiz foi constatado.
Exemplo 13 (Avaliação de atividade de promoção de diferenciação da planta de substância capaz de inibir a sinalização de citocinina, utilizando hipocótilo de Arabidopsis thaliana)
Com respeito à substância química Ic3-1 e à substância química Ic7-1 (que inibem a sinalização intracelular de um receptor de citocinina deri- vado da planta de uma célula) selecionada no Exemplo 7, uma atividade de promoção de diferenciação da planta foi avaliada examinando-se uma ativi- dade de formação de raiz adventícia utilizando um hipocótilo de Arabidopsis thaliana Columbia.
Primeiro, um meio de ágar para semear Arabidopsis thaliana foi preparado. O meio de ágar contém, como componentes por 1 litro de uma solução aquosa, 1 pacote de sais misturados para meio da planta Murashi- 5 ge-Scoog (Wako Pure Chemicals Industries, Ltd.) por 1 litro, 10 g de sacaro- se, 10 ml de um MES aquoso a 5% de solução de (ácido 2-(N- Morfolino)etanossulfônico) ajustada em pH 5,7 com hidróxido de potássio, 100 mg de inositol, 1 ml de solução de matéria-prima de vitaminas (10 g de cloridrato de tiamina, 1 g de cloridrato de piridoxina, e 1 g de ácido nicotínico 10 por 1 litro de uma solução aquosa) e 8 g de ágar. Em seguida, o meio de ágar foi submetido ao autoclave a 120°C durante 20 minutos, distribuído em placas de petri circulares, e em seguida foi solidificado.
Sementes de Arabidopsis thaliana (cerca de 25 μΙ) foram postas em um tubo de 1,5 ml. A isso foi adicionado 1 ml de uma solução diluída 10 vezes de uma solução de hipoclorito de sódio (Nacalai Tesque) com água destilada esterilizada. A semente foi esterilizada enquanto agitando durante cerca de 1 minuto com um misturador de tubo (TOMY, MT-360, MIXING SPEED10). Depois que as sementes foram sedimentadas por uma centrífu- ga de tamanho pequeno portátil, a solução diluída da solução de hipoclorito de sódio foi removida do tubo. Depois que 1 ml de água destilada esteriliza- da foi recentemente adicionada ao tubo, as sementes foram lavadas agitan- do-se com o misturador de tubo durante cerca de 1 minuto. As sementes foram sedimentadas por uma centrífuga de tamanho pequeno portátil, e em seguida a água depois de lavar foi removida do tubo. A operação de Iava- gem foi repetida 3 vezes. Depois da conclusão de lavagem, as sementes foram semeadas no meio de ágar na placa de petri circular, e germinadas e crescidas em um lugar escuro a 22°C.
Separadamente, a substância química foi dissolvida em DMSO para preparar uma solução de 10.000 ppm. Além disso, a solução foi diluída com DMSO para preparar soluções de 6.000 ppm, 2.000 ppm, 600 ppm e 200 ppm. Em cada cavidade de uma multiplaca de 12 cavidades (SUMITO- MO BAKELITE Co., Ltd.), 2 μΙ da solução de DMSO contendo um tipo da < substância química em uma concentração foi distribuída. Em uma cavidade como controle, 2 μΙ de DMSO foi distribuído no lugar da solução de DMSO da substância química. Em seguida, trans-zeatina foi dissolvida em DMSO para preparar uma solução de 10.000 ppm. A solução foi diluída com água 5 destilada esterilizada para preparar uma solução de 10 ppm. Um meio de ágar tendo a composição anterior foi preparado, autoclavado e em seguida resfriado a cerca de 50°C. A este meio de ágar foi adicionado a solução de trans-zeatina de 10 ppm em uma concentração final de 0,01 ppm, seguido por mistura. O meio de ágar contendo trans-zeatina (2 ml cada) foi distribuí- 10 do em cada cavidade da multiplaca de 12 cavidades em que a solução de DMSO da substância química ou DMSO foi distribuída, e em seguida solidifi- cado.
Uma muda de Arabidopsis thaliana depois da germinação e crescimento em um lugar escuro a 22°C foi cortado na porção de hipocotila, e o hipocótilo ao lado com cotilédones foi usado para medida de uma ativi- dade de formação de raiz adventícia como descrito abaixo. A hipocótilo ao lado com raízes foi descartada. Especificamente, o hipocótilo com cotilédo- nes foi inserido no meio de ágar em cada cavidade da multiplaca de 12 cavi- dades até cerca de 5 mm da porção cortada. A multiplaca foi permitida re- pousar na Iuz a 22°C 16 horas (no escuro durante 8 horas). Como resultado, raízes adventícias foram formadas a partir da porção de hipocótilo inserido no meio de ágar contendo a substância química Ic3-1 (em todas as seções de teste cada qual tendo uma concentração final de 6 ppm, 2 ppm, 0,6 ppm ou 0,2 ppm) e a porção de hipocótilo inserida no meio de ágar contendo a substância química Ic7-1 (em seções de teste cada qual tendo uma concen- tração final de 6 ppm ou 2 ppm). Na seção de controle em que DMSO foi adicionado no lugar da solução de DMSO da substância química, formação de raízes adventícias a partir da porção de hipocótilo não pôde ser constata- da. Resultados de teste no caso do eixo embrionário inserido no meio de ágar contendo a substância química Ic3-1 tendo uma concentração final de 0,6 ppm, o hipocótilo inserido no meio de ágar contendo a substância quími- ca Ic7-1 tendo uma concentração final de 2 ppm, e o hipocótilo inserida no meio de ágar da seção de controle é mostrada na Figura 7.
Exemplo 14 (Medida utilizando arroz de atividade de promoção de cresci- mento de raiz de substância capaz de inibir a sinalização de citocinina)
Com respeito à substância química lc3-3, uma atividade de pro- 5 moção de crescimento de raiz foi medida utilizando arroz (Oriza sativa japo- nica Nipponbare).
Primeiro, uma solução de acetona contendo uma concentração predeterminada da substância química foi preparada e em seguida diluída 100 vezes com água destilada a 10 ppm (contendo 1% de acetona) para obter uma solução de substância química. Sementes foram imersas em á- gua durante 2 dias para estimular germinação. As sementes foram semea- das em uma bandeja de tampa de 288 cavidades (3 sementes por cavida- de), e em seguida o solo foi encharcado com a solução de substância quími- ca anterior em uma quantidade de 500 μΙ por cavidade. Depois de revestir com terra, a bandeja de tampa foi posta em uma bolsa plástica e em seguida colocada em um ambiente com ar condicionado (lugar escuro a 30°C duran- te 3 dias. Depois de remover a bolsa plástica da bandeja de tampa, a bande- ja de tampa foi colocada sob de condições de Iuz de claro / escuro = 16 h / 8 h durante 4 dias enquanto a base foi irrigada a toda hora. Desse modo, se- mentes de arroz foram cultivadas para obter arroz crescido. As raízes de arroz resultantes foram lavadas e o comprimento de raiz total foi analisada utilizando um analisador de imagem de medida de comprimento de raiz WinRHIZO (fabricado por Regent Instruments). Na seção tratada por subs- tância química lc3-3, o crescimento da raiz foi notavelmente promovido, quando comparado com a seção de controle (UTC) em que apenas acetona foi usada no tratamento de encharcamento de solo. Uma fotografia é mos- trada na Figura 8. Resultados analíticos obtidos pelo analisador de imagem de medida de comprimento de raiz mostraram um aumento do comprimento de raiz total na seção tratada por substância química lc3-3. Resultados são mostrados na Figura 9.
Exemplo 15 (Clone de CRE1 cDNA, N0 2)
Reação de PCR foi realizada utilizando-se o plasmídeo de ex- pressão p415CYC-CRE1 obtido no Exemplo 5 como um modelo e utilizando- se um DNA de SEQ ID NO: 7 e um DNA de SEQ ID NO: 8 como iniciadores para ampliar um DNA tendo a seqüência de nucleotídeo de SEQ ID NO: 2. Detalhes são descritos abaixo.
5 A reação de PCR foi realizada utilizando-se KOD Plus DNA Po-
Iimerase (fabricado por TOYOBO Co., Ltd.) sob condição de amplificação que depois de manter quente a 94°C durante 1 minuto, 30 ciclos a 94°C du- rante 15 segundos, a 58°C durante 30 segundos e a 68°C durante 3 minutos e 30 segundos foram conduzidos. Aqui, um líquido de reação de PCR (50 μΙ) 10 foi preparado adicionando-se composições de reação tal como dNTP a 500 ng do plasmídeo p415CYC-CRE1 e cada 100 ng de DNAs de iniciador de acordo com a instrução do kit.
O fragmento de DNA desejado desse modo ampliado foi clonado em um vetor pCR-Blunt II-TOPO (Invitrogen Corporation) de acordo com a 15 instrução ligada ao kit. Neste caso, o fragmento de DNA desejado foi inseri- do no vetor pCR-Blunt II-TOPO na direção que permite a seqüência de nu- cleotídeo de SEQ ID NO: 7 estar perto de um promotor de T7 e a seqüência de nucleotídeo de SEQ ID NO: 8 estar perto de um promotor de Sp6. Foi confirmado que a seqüência de nucleotídeo do fragmento de DNA foi inseri- 20 da na direção correta e foi uma seqüência de nucleotídeo de SEQ ID NO: 2 utilizando-se um sequenciador.
Exemplo 16 (Construção de plasmídeo de expressão CRE1)
Um vetor de expressão de levedura, p425GPD (Munberg e ou- tros. Gene: 156 119-122 (1995), disponível a partir de biblioteca de ATCC 25 (No. 87359)) foi digerido com a enzima de restrição BamHI. Em seguida, o fragmento de DNA obtido no Exemplo 15 (um DNA tendo a seqüência de nucleotídeo de SEQ ID NO:2) foi conectado a uma seqüência de promotor de GPD do vetor de expressão p425GPD utilizando-se T4 DNA Ligase, e desse modo incorporado de forma que a proteína desejada poderia ser ex- 30 presso na levedura. Foi confirmado que a seqüência de nucleotídeo do fragmento de DNA foi inserida na direção correta e foi uma seqüência de nucleotídeo de SEQ ID NO: 2 utilizando um sequenciador. Desse modo, o plasmídeo de expressão p425GPD-CRE1 foi obtido.
Exemplo 17 (Produção de célula transformada TM182-p425GPD-CRE1)
O plasmídeo de expressão obtido no Exemplo 16 foi usado para transformar uma cepa deficiente de gene Sln1, TM182 (sln1A) (Maeda T e 5 outros. Nature: 369 242-245 (1994)). A transformação foi realizada utilizan- do-se S. cerevisiae Direct Transformation Kit Wako (fabricado por Wako Pu- re chemicals Industries, Ltd.) de acordo com o manual acompanhante. Visto que uma exigência nutricional de Ieucina desaparece na célula transformada obtida, uma levedura transformada capaz de crescer em um meio de DOLU - 10 Gal foi selecionada para obter a célula transformada TM182-p425GPD- CRE1.
Da mesma maneira, a célula transformada TM182-p425GPD foi obtida utilizando-se o vetor de expressão de levedura p425GPD.
Exemplo 18 (Preparação de fração de proteína de membrana contendo CRE1)
A célula transformada TM182-p425GPD-CRE1 obtida no Exem- plo 17 foi quebrada com contas de vidro e em seguida supercentrifugada para preparar uma fração de proteína de membrana contendo CRE1. Deta- lhes são descritos abaixo.
A célula transformada TM182-p425GPD-CRE1 obtida no Exem-
plo 17 foi semeada em 100 ml de um meio de DOLU + Gal e em seguida incubada a 30°C durante 16 horas para obter um líquido de incubação tendo OD6OO = cerca de 1,4. O líquido de incubação foi distribuído em um tubo de centrífuga de 50 ml e em seguida centrifugado a 4°C e 7.400 xg durante 5 25 minutos para coletar células da célula transformada TM182-p425GPD- CRE1. As células resultantes foram novamente suspensas em um tampão de fosfato (preparado misturando-se uma solução de di-idrogenofosfato de sódio a 50 mM aquosa com uma solução de hidrogenofosfato de dissódio a 50 mM aquosa em uma relação de mistura de 4 : 6 e ajustando em pH 7,0) 30 resfriadas a 4°C, distribuídas em um tubo de 2 ml e em seguida centrifuga- das a 4°C e 1.000 xg durante 5 minutos para coletar células da célula trans- formada TM182-p425GPD-CRE1. As células resultantes foram novamente suspensas no tampão de fosfato resfriado a 4°C e em seguida centrifugadas a 4°C e 1.000 xg durante 5 minutos para coletar células da célula transfor- mada TM182-p425GPD-CRE1. As células resultantes foram novamente suspensas em um tampão de fosfato contendo DTT (ditiotiotreitol) e PMSF 5 (fluoreto de fenilmetilsulfonila) (preparado adicionando-se 5 mM de DTT e 0,5 mM de PMSF ao tampão de fosfato descrito acima) em uma quantidade de 3 vezes (com base em células). Em seguida, 200 μΙ da suspensão foram distribuídos em um tubo de 1,5 ml contendo 250 μΙ de contas de vidro (0,25 a 0,5 mm de diâmetro) previamente resfriado a 4°C. O tubo de 1,5 ml foi agi- 10 tado com um misturador de microtubo (MT-360 fabricado por TOMY) na pro- dução máxima durante 30 segundos e em seguida resfriado em gelo durante
1 minuto, e esta operação foi repetida uma vez mais. Além disso, o tubo de 1,5 ml foi agitado com um agitador de múltiplas contas (MB-200, Yasui Kikai Corporation) em uma produção (SPEED METER) de 2.000 durante 30 se- gundos e em seguida resfriado em gelo durante 1 minuto, e esta operação foi também repetida duas vezes. Em seguida, o tubo de 1,5 ml foi centrifu- gado a 4°C e 1.500 xg durante 10 minutos para coletar um sobrenadante. O sobrenadante foi transferido para um novo tubo de 1,5 ml e centrifugado a 4°C e 10.000 xg durante 3 minutos para coletar um sobrenadante. O sobre- nadante foi centrifugado a 4°C e 100.000 xg durante 1 hora utilizando uma supercentrífuga para coletar um precipitado. O precipitado resultante foi dis- solvido em um tampão de fosfato contendo 1% de monocaprato de sacarose (preparado adicionando-se 1% de monocaprato de sacarose ao tampão de fosfato descrito acima) para obter uma fração de proteína de membrana da célula transformada TM182-p425GPD-CRE1.
Da mesma maneira, uma fração de proteína de membrana da célula transformada TM182-p425GPD foi preparada.
Exemplo 19 (Método para examinar inibição de ligação de citocinina a recep- tor de citocinina por substância química)
A fração de proteína de membrana da célula transformada
TM182-p425GPD-CRE1 obtida no Exemplo 18 e citocinina que foi rotulada com um radioisótopo de hidrogênio, trítio para tornar-se altamente radioativo foram usadas para examinar que uma substância teste inibiu a ligação de th de citocinina a um receptor de citocinina. Detalhes são descritos abaixo.
Como a citocinina rotulada com um radioisótopo de hidrogênio, trítio para tornar-se altamente radioativo, [3H]N-6-(isopent-2-enil)Adenina 5 fabricado por Amersham Biosciences (em seguida, referido como 2IP radior- rotulado) foi usado. Teve uma radioatividade específica de 74,0 GBq/mmol e uma concentração de radioatividade de 37,0 MBq/ml.
Primeiro, 100 μg da fração de proteína de membrana da célula transformada TM182-p415CYC1, uma diluição de 2IP radiorrotulada em uma concentração predeterminada com um tampão de fosfato e 1 μΙ de uma dilu- ição de substância teste em uma concentração predeterminada com DMSO foram misturadas em um tampão de fosfato para preparar 100 μΙ de um lí- quido de reação. Logo, o líquido de reação foi permitido repousar em gelo durante 1 hora e em seguida filtrado com um filtro de vidro GF/B (fabricado por Whatman) para coletar uma fração de proteína de membrana da célula transformada TM182-p425GPD-CRE1. O filtro de vidro foi imerso em um coquetel de cintilação líquido Ultima Gold (fabricado por PerkinEImer Co., Ltd.), e a radioatividade foi medida por uma contadora de cintilação líquida. Para controle, o mesmo teste foi realizado utilizando-se uma fração de prote- ína de membrana da célula transformada TM182-p425GPD. Para eliminar influência de radioatividade devido à ligação não específica do 2IP radiorro- tulado, um valor de radioatividade obtido no teste utilizando a fração de pro- teína de membrana da célula transformada TM182-p425GPD foi subtraído de um valor de radioatividade obtido no teste utilizando a fração de proteína de membrana da célula transformada TM182-p425GPD-CRE1. Resultados de teste são mostrados na Figura 10.
No caso onde a substância teste foi trans-zeatina ou lc3-4, a ra- dioatividade foi diminuída quando comparado com o caso onde a substância teste não foi adicionada (apenas DMSO que foi usado como um solvente de uma substância teste) ou a substância teste foi ácido abscísico.
Exemplo 20 (Avaliação de posto de atividade de promoção de estabeleci- mento de resistência de arroz de substância capaz de inibir a sinalização de < citocinina por tratamento de semente em um teste de semadura direto em campo inundado)
Sementes de arroz (Oryza sativa japonica Nipponbare) foram tratadas com a substância química Ic3-1 (que inibe sinalização intracelular 5 de um receptor de citocinina derivado da planta de uma célula) selecionado no Exemplo 7, e foram crescidas sob condições de semeadura diretas. Em seguida, uma taxa de estabelecimento de resistência foi examinada, e desse modo uma atividade de promoção de estabelecimento de resistência de ar- roz da substância química foi avaliada.
10 Primeiro, uma solução de suspensão absoluta contendo 5% (v/v)
de Color Coat red (fabricada por BECKER UNDERWOOD), 5% (v/v) de CF- clear (fabricado por BECKER UNDERWOOD) e 0,42% (v/v) de Maxim-XL (fabricado por Syngenta) foi preparada. Em 1,3 ml da solução de suspensão absoluta, 6,25 mg, 12,5 mg, 25 mg ou 50 mg da substância química lc3-3 foi 15 dissolvido. Sementes foram tratadas com a solução em uma quantidade de
1,3 ml por 50 g de sementes (cada qual correspondendo a 0,125 mg, 0,25 mg, 0,5 mg e 1 mg/g de semente) utilizando um dispositivo de tratamento de semente Hegel 1 (fabricado por Hans-Ulrich Hege).
Em seguida, um pote de concreto (50 cm χ 50 cm) colocado ao >■ 20 ar livre foi inundado em uma profundidade de inundação de 5 cm, e 50 se- mentes por pote foram semeadas. No dia 23 depois de semear, o número de mudas cujo ápice de folha apareceu na superfície de água foi examinado. Como resultado, uma taxa de estabelecimento de resistência foi aumentada em uma concentração de tratamento de semente de 0,125 a 1 mg / g se- 25 mente, quando comparado com a seção tratada por suspensão Absoluta. Resultados de teste (média) de cada seção de tratamento (quatro repeti- ções) são mostrados na Tabela 13.
[Taxa de estabelecimento de resistência (%)] = [Número de mudas cujo ápi- ce de folha aparece na superfície de água] / [Número de sementes semea- 30 das] x 100 Tabela 13
Substância química Quantidade de substân¬ Taxa de estabelecimen¬ cia to de resistência (%) no (mg/g semente) dia 23 depois de seme¬ ar Suspensão Branca 76,7 lc3-3 0,125 87,3 0,25 82,7 0,5 79,3 1 84,0 Exemplo 21 (Avaliação de promoção de cultivo de arroz de substância capaz de inibir a sinalização de citocinina por tratamento de semente em um teste de semeadura direto em campo seco)
Sementes de arroz (Oryza sativa japonica Nipponbare) foram
tratadas com a substância química Ic3-1 (que inibe sinalização intracelular de um receptor de citocinina derivado da planta de uma célula) selecionadas no Exemplo 7, e foram crescidas sob semeadura direta em condição de campo seco. Em seguida, o número de agricultores foi examinado, e desse 10 modo uma atividade de promoção de cultivo da substância química foi avali- ada.
Primeiro, uma solução de suspensão Absoluta contendo 5%(v/v) de Color Coat Red (fabricado por BECKER UNDERWOOD), 5%(v/v) de CF- Clear (fabricado por BECKER UNDERWOOD) e 0,42%(v/v) de Maxim-XL 15 (fabricado por Singenta) foi preparada. Em 1,3 ml da solução de suspensão Absoluta, 12,5 mg da substância química lc3-3 foram dissolvidos. Sementes foram tratadas com a solução em uma quantidade de 1,3 ml por 50 g de se- mentes (correspondendo a 0,25 mg/g semente) utilizando um dispositivo de tratamento de semente Hegel 1 (fabricado por Hans-Ulrich Hege).
As 20 sementes por pote das sementes tratadas foram semea-
das em um pote de 1/5000a Wagner em uma profundidade de 1 cm e em seguida cultivadas em uma estufa. No 10° dia depois de semear, água foi carregada em uma profundidade de inundação de 5 cm e cultura foi continu- ada. No dia 30 depois de semear, o número de agricultores foi examinado. Como resultado, o número de agricultores por matéria-prima foi aumentado, quando comparado com a seção tratada por suspensão Absoluta. Resulta- 5 dos de teste (média) de cada seção de tratamento (três repetições) são mos- trados na Tabela 11.
Em seguida, o composto (XI) usado na presente invenção será descrito mais especificamente por meio de Exemplos de Síntese e Exemplos de Síntese de Referência, porém o composto (XI) não está limitado a estes exemplos.
Em Exemplos de Síntese e Exemplos de Síntese de Referência, "temperatura ambiente" normalmente significa uma temperatura de 10 a 30°C. "1H RMN" significa um espectro de ressonância magnética de próton. Utilizando tetrametilsilano como um padrão interno, a medida foi realizada 15 com um espectrômetro (400 MHz), Modelo JNM-AL400, fabricado por JEOL Ltd. e trocas químicas (δ) foram expressas como ppm. "Mp" significa um ponto de fusão e foi medido com um metro de ponto de fusão, Modelo Met- tler FP61.
Abreviações usadas nos seguintes Exemplos de Síntese, Exem- 20 pios de Síntese de Referência e Tabelas 2, 3, 4 e 5 têm os seguintes signifi- cados. CDCI3: clorofórmio deuterado, DMSO-d6: dimetil sulfóxido deuterado, s: singleto, d: dupleto, t: tripleto, q: quadrupleto, dd: dupleto duplo, m: multi- pleto, br: amplo, J: constante de acoplamento, Me: metila, Et: etila, Pr: propi- la, i-Pr: isopropila, t-Bu: butila terciária, Ph: fenila, Ac: acetila, THF: tetra- 25 hidrofurano, DMF: Ν,Ν-dimetilformamida, DMSO: dimetil sulfóxido e MTBE: éter butil metílico terciário
Exemplo de Síntese 12 (Preparação de 2-amino-6,8-dicloro-4- fenilquinazolina (composto N0 le-4))
Uma mistura de 300 mg de 2,6,8-tricloro-4-fenilquinazolina (composto N0 II-5), 30 g de uma solução de amônia a 28% aquosa e 6 ml de acetonitrilo foi reagida em um vaso de reação resistente à pressão a 105°C durante 1,5 hora. A solução reacional resultante foi resfriada e em seguida vertida em 100 ml de água. A mistura foi extraída com 60 ml de acetato de etila e o extrato resultante foi concentrado. O resíduo resultante foi purificado por cromatografia de coluna em sílica gel (clorofórmio) para obter 230 mg do composto titulado. Mp. 212,7°C. 1H RMN (CDCI3): 5,56 (2H, br. s), 7,54-7,60 5 (3H, m), 7,63-7,68 (2H, m), 7,74 (1H, d, J = 2,3 Hz), 7,79 (1H, d, J = 2,3 Hz). Exemplo de Síntese 13 (Preparação de 6-cloro-2-furfurilamino-4- fenilquinazolina (composto N0 lb-8))
Uma mistura de 275 mg de 2,6-dicloro-4-fenilquinazolina (com- posto N0 II-2) e 486 mg de furfurilamina foi agitada a 85°C durante 40 minu- 10 tos e em seguida vertida em 50 ml de água. A mistura foi extraída com ace- tato de etila, e o extrato resultante foi lavado com água e em seguida con- centrado. O resíduo resultante foi recristalizado a partir de etanol para obter 280 mg do composto titulado. Mp.142,0°C. 1H RMN (CDCI3): 4,77 (2H, d, J = 5,6 Hz), 5,70 (1H, br. t, J = 5,6 Hz), 6,29-6,32 (2H, m), 7,36 (1H, dd, J = 1,8, 15 0,9 Hz), 7,53-7,70 (7H, m), 7,78 (1H, d, J = 2,2 Hz).
Exemplo de Síntese 14 (Preparação de 6-cloro-2-etoxicarbonilmetilamino-4- fenilquinazolina (composto N0 lb-15))
Em 550 mg de 2,6-dicloro-4-fenilquinazolina (composto N0 II-2) e 419 mg de cloridrato de éster etílico de glicina foram adicionados 3 ml de 20 DMF e 607 mg de trietilamina, seguido por agitação a 85°C durante 5,5 ho- ras. A solução reacional resultante foi vertida em 100 ml de água e extraída com acetato de etila, e em seguida o extrato foi concentrado. O resíduo re- sultante foi purificado por cromatografia de coluna em sílica gel (hexano: a- cetato de etila = 6 : 1 a 3 : 1) para obter 503 mg do composto titulado. 25 Mp.146,1°C. 1H RMN (CDCI3): 1,30 (3H, t, J = 7,2 Hz), 4,25 (2H, q, J = 7,2 Hz), 4,31 (2H, d, J = 5,2 Hz), 5,97 (1H, br. s), 7,54-7,63 (5H, m), 7,67-7,70 (2H, m), 7,79(1 H, s).
Exemplo de Síntese 15 (Preparação de 6-cloro-2-formamido-4- fenilquinazolina (composto N0 lb-17))
Em uma solução de 54 mg de formamida seca em DMF (5 ml)
foi adicionado 48 mg de hidreto de sódio (60%), seguido por agitação em temperatura ambiente durante 30 minutos. À mistura de reação foi adiciona- * do 275 mg de 2,6-dicloro-4-fenilquinazolina (composto N0 II-2), seguido por aquecimento a 85°C e outra agitação durante 3 horas. A solução reacional resultante foi vertida em 100 ml de água e extraída com acetato de etila, e em seguida extrato foi concentrado. O resíduo resultante foi purificado por 5 cromatografia de coluna em sílica gel (acetato de etila: hexano = 1:3) para obter 64 mg do composto titulado. Mp. 252,1 °C. 1H RMN: 7,59-7,66 (3H, m), 7,72-7,81 (3H, m), 7,88 (1H, d, J = 8,8 Hz), 8,02 (1H, d, J = 2,0 Hz), 8,37 (1H, br. d, J = 10,4 Hz), 9,71 (1H, d, J = 10,4 Hz).
Exemplos de compostos que podem ser preparados da mesma maneira como em Exemplos de Síntese descritos acima são mostrados na Tabela 14 e Tabela 15 (da mesma forma incluindo os compostos preparados nos Exemplos de Síntese descritos acima). Notas "a)", "b)" e "c)" na Tabela
14 e Tabela 15 são como segue.
a) 1H RMN (CDCI3): 1,66-1,75 (1H, m), 1,86-2,08 (3H, m), 3,57-3,64 (1H, m), 3,75-3,83 (2H, m), 3,89-3,59 (1H, m), 4,13-4,20 (1H, m), 5,70 (1H, br. s),
7,52-7,60 (5H, m), 7,64-7,69 (2H, m), 7,75-7,76 (1H, m).
b) 1H RMN (CDCI3): 1,22 (3H, t, J = 7,0 Hz), 3,55 (2H, q, J = 7,0 Hz), 3,68 (2H, t, J = 5,2 Hz), 3,78 (2H, q-semelhante, J = 5,2 Hz), 5,75 (1H, br. t), 7,53- 7,60 (5H, m), 7,65-7,69 (2H, m), 7,75-7,77 (1H, m).
-20 c) 1H RMN (CDCI3): 1,22 (3H, t, J = 7,0 Hz), 1,96 (2H, quinteto, J = 6,3 Hz), 3,50 (2H, q, J = 7,0 Hz), 3,58 (2H, t, J = 6,3 Hz), 3,67 (2H, q-semelhante, J =
6,3 Hz), 5,65 (1H, br, t), 7,53-7,60 (5H, m), 7,65-7,69 (2H, m), 7,74-7,76 (1H, m). Tabela 14
Composto R11 m Xi n X2 Ponto de fusão N0 (0C) la-1 (CH2)3OH 1 5-CI O _ 175,7 lb-1 (CH2)4OH O 1 Cl 115,6 lb-2 (CH2)5OH O 1 Cl 117,2 lb-3 (CH2)2OMe O 1 Cl 89,7 lb-4 n-Pr O 1 Cl 158,3 lb-5 (CH2)2CHMe2 O 1 Cl 90,1 lb-6 (CH2)6OH O - 1 Cl 107,9 lb-7 (CH2)2CH(Me)CH O - 1 Cl 112,7 20H lb-8 furfurila O _ 1 Cl 142,0 lb-9 CH2CH=CMe2 O 1 Cl 95,9 lb-10 CH2CH=C(Me)CH O - 1 Cl 154,8 20H lb-11 Et O _ 1 Cl 156,7 lb-12 i-Pr O _ 1 Cl 112,5 lb-13 CH2CH=CH2 O _ 1 Cl 147,3 lb-14 CH2CsCH O _ 1 Cl 168,4 lb-15 CH2CO2Et O _ 1 Cl 146,1 lb-16 CH2CH2CN O _ 1 Cl 198,7 lb-17 CHO O _ 1 Cl 252,1 lb-18 tetra-hidrofurfurila O _ 1 Cl xarope, a) lb-19 (CH2)3OMe O _ 1 Cl 89,1 lb-20 CH2CH(OH)CH3 O _ 1 Cl 154,2 lb-21 (CH2)2O(CH2)2OH O _ 1 Cl 117,4 lb-22 CH2CH(OH)CH2O O - 1 Cl 147,0 .......... H i
lb-23 CH2CO2Me O _ 1 Cl 190,5 lb-24 CH2CH2CO2Me O - 1 Cl 117,1 lb-25 CH(Me)CH2OH O _ 1 Cl 52,8 lb-26 CH2CH2OEt O _ 1 Cl xarope, b) lb-27 (CH2)3OEt O _ 1 Cl xarope, c) Composto R11 m Xi n X2 Ponto de fusão N0 (0C) lc-1 (CH2)3OH 1 7-CI O _ 129,7 ld-1 (CH2)3OH 1 8-CI O _ 115,5 le-1 (CH2)3OH 1 8-CI 1 Cl 146,2 le-2 CH2CH2OH 1 8-CI 1 Cl 168,8 le-3 furfurila 1 8-CI 1 Cl 158,6 le-4 H 1 8-CI 1 Cl 212,7 le-5 CH2CN 1 8-CI 1 Cl 204,7 le-6 CH2CO2Me 1 8-CI 1 Cl 201,4 Se-1 (CH2)3OH O _ 1 Br 140,9 Se-2 CH2CO2Me O - 1 Br 183,1 (decomposição) ig-1 H O _ 1 CF3 160,4 lçj-2 (CH2)3OH O _ 1 CF3 135,1 lh-1 (CH2)3OH O - 1 CN 173,3 (decomposição) Exemplo de Síntese de Referência 3 (Preparação de 2,8-dÍcloro-4- fenilquinazolina (composto N0 II-4))
Em 1.24 g de 8-cloro-4-fenil-2(1H)-quinazolinona (composto N0 IV-4) foi adicionado 6,65 g de oxicloreto de fósforo, seguido por agitação a 95°C durante 1 hora. A solução reacional resultante foi vertida em 200 ml de água gelada e bicarbonato de sódio foi adicionado a isso, desse modo ajus- tando o pH 9. Em seguida, cristais precipitados foram coletados por filtração 5 e recristalizados a partir de etanol para obter 1,07 g do composto titulado. Mp.154,4°C. 1H RMN (CDCI3): 7,52-7,65 (4H, m), 7,76-7,80 (2H, m), 8,02- 8,08 (2H, m).
Exemplos de compostos que podem ser preparados da mesma maneira como em Exemplo Síntese de Referência 3 descrito acima são mostrados na Tabela 16 (da mesma forma incluindo os compostos prepara- dos em Exemplo de Síntese de Referência 3).
Tabela 16
Composto N0 m Xi n X2 Ponto de fusão (0C) 11-1 1 5-CI 0 _ 125,7 II-2 0 _ 1 Cl 166,2 II-3 1 7-CI 0 115,4 II-4 1 8-CI 0 _ 154,4 II-5 1 8-CI 1 Cl 160,3 II-6 0 - 1 Br 185,1 (decomposição) II-7 0 - 1 CF3 117,5 (decomposição) II-8 0 - 1 CN 206,8 (decomposição) *■ Exemplo de Síntese de Referência 4 (Preparação de 8-cloro-4-fenil-2(1H)- quinazolinona (composto N0 IV-4)))
Em 7,10 g de brometo de fenilmagnésio (32% de solução de THF) foi adicionado gota a gota uma solução de 953 mg de 2-amino-3- 5 clorobenzonitrilo em THF (7 ml) em temperatura ambiente, seguido por a- quecimento sob refluxo durante 30 minutos. Ao produto de reação resultante foi adicionado gota a gota 885 mg de clorocarbonato de metila sob resfria- mento com gelo, seguido por aquecimento sob refluxo durante 40 minutos. A solução reacional resultante foi resfriada e vertida em 40 ml de ácido 2N- 10 clorídrico, e 8 g de bicarbonato de sódio e 20 ml de MTBE foram adicionados a isso, seguido por agitação. Em seguida, cristais precipitados foram coleta- dos porfiltração para obter 1,30 g do composto titulado. 1H RMN (DMSO-de): 7,24(1 H, t, J = 8,0 Hz), 7,57-7,70 (6H, m), 7,90-7,93 (1H, m), 11,45 (1H, br. s).
15 Exemplo de Síntese de Referência 5 (Preparação de 4-fenil-6-trifluorometil- 2(1 H)-quinazolinona (composto N0 IV-7)))
Em uma solução de 762 mg de 2-amino-5- trifluorometilbenzofenona em 10 ml de clorofórmio foi adicionado gota a gota 349 mg de trietilamina, e em seguida 627 mg de cloreto de tricloroacetila foi - 20 adicionado gota a gota sob resfriamento com gelo. Depois de agitar na mesma temperatura durante 30 atas, 50 ml de água foi adicionado, desse modo separando camadas. A camada orgânica foi coletada e concentrada.
O resíduo resultante foi purificado por cromatografia de coluna em sílica gel (hexano : acetato de etila = 5:1) para obter 1,08 g de 2'-benzoil-2,2,2- 25 tricloro^-trifluorometilacetanilida. 1H RMN (CDCI3): 7,53-7,58 (2H, m), 7,66- 7,75 (3H, m), 7,90-7,95 (2H, m), 8,81 (1H, d, J = 8,6 Hz), 12,38 (1H, br. s).
Uma mistura de 1,08 g de 2'-benzoil-2,2,2-tricloro-4'- trifluorometilacetanilida, 10 ml de DMSO e 1,18 g de acetato de amônio foi agitado a 75°C durante 1 hora. Depois de resfriar, 100 ml de água foi adicio- 30 nado à mistura. Cristais precipitados foram coletados por filtração. A subs- tância coletada foi dissolvida em uma mistura de hexano : acetato de etila = 1:1, desidratada utilizando sulfato de magnésio anidroso, e em seguida concentrada para obter 765 mg do composto titulado. 1H RMN (CDCI3): 7,58- 7,68 (3H, m), 7,75 (1H, d, J = 8,8 Hz), 7,79-7,83 (2H, m), 7,93 (1H, dd, J = 8,8, 1,7 Hz), 8,17 (1H, br. s), 13,37(1H, br. s).
Exemplos de compostos que podem ser preparados da mesma maneira como no Exemplo de Síntese de Referência 4 descritos acima são mostrados na Tabela 17 (da mesma forma incluindo os compostos prepara- dos no Exemplo de Síntese de Referência 4 descrito acima). Notas "a)" a "g)" na Tabela 17 são como segue.
a) 1H RMN (DMSOd6): 7,27 (1H, dd, J = 7,7, 1,0 Hz), 7,38 (1H, dd, J = 8,3, 1,1 Hz), 7,43-7,55 (5H, m), 7,69 (1H, t, J = 8,1 Hz), 12,18 (1H, br. s).
b) (não isolado e purificado)
c) 1H RMN descrito no Exemplo de Síntese de Referência 4
d) 1H RMN (DMSO-d6): 7,52-7,72 (6H, m), 8,10-8,12 (1H, m), 11,69 (1H, br. s).
e) 1H RMN (DMSOd6): 7,35 (1H, d, J = 9,2 Hz), 7,59-7,71 (6H, m), 7,91 (1H, dd, J = 9,2, 2,2 Hz), 12,08 (1H, br. s).
f) 1H RMN descrito no Exemplo de Síntese de Referência 5
g) 1H RMN (DMSO-de): 7,48 (1H, d, J = 8,4 Hz), 7,60-7,68 (3H, m), 7,71-7,74 (2H, m), 8,05 (1H, s), 8,08-8,12 (1H, m), 12,36 (1H, br. s).
Tabela 17
Ph
Composto N0 m Xi n X2 Ponto de fusão (0C) IV-1 1 5-CI O _ a) IV-2 O _ 1 Cl >300 IV-3 1 7-CI O _ b) IV-4 1 8-CI O - c) IV-5 1 8-CI L1 Cl d) IV-6 O _ 1 Br e) IV-7 O _ 1 CF3 f) IV-8 O - 1 CN g) Exemplo 22 (Teste de Atividade de Promoção de Crescimento de Raiz)
Meio padrão de Enshi tendo a seguinte composição (vide Tabela 18) foi preparado. Aos tubos em grupo foi distribuído a cada, 4 μΙ de uma solução de uma substância química em DMSO em uma concentração de final 0,001 ppm a 10 ppm, e em seguida, foi distribuído a cada, 600 μΙ do meio padrão de Enshi esterilizado. Em seguida, a solução resultante foi bem misturada. Em cada um dos tubos em grupo, 10-20 sementes de Arabidop- sis thaliana foram semeadas, e cultivadas a 22°C durante 10 dias na luz. Em seguida, o comprimento de raízes principais (raízes principais média) gerado a partir das sementes de Arabidopsis thaliana foi medido. Uma média de oito repetições foi determinada, e uma taxa de crescimento de raiz foi determina- da de acordo com a seguinte equação. Como um resultado, uma substância química que exibiu uma taxa de crescimento de raiz significante (por exem- plo, uma taxa de crescimento de raiz de 120% ou mais) poderia ser julgada ter uma atividade de promoção de crescimento de raiz.
Como resultados detalhados, concentrações finais que exibiram as taxas de crescimento de raiz mais altas foram mostradas na Tabela 19.
Taxa de crescimento de raiz (%) = (Comprimento de raiz princi- pal média na seção tratada por substância química) / (Comprimento de raiz principal média na seção de controle) χ 100
Meio padrão de Enshi determinado tendo a seguinte composição (Tabela 18) foi preparado. Uma solução de DMSO de uma substância quími- ca foi distribuída por 4 μ I aos tubos em grupo em uma concentração final de
0,001 ppm a 10 ppm e o meio padrão de Enshi esterilizado foi distribuído por 25 600 μΙ e em seguida a solução resultante foi bem misturada. 10-20 sementes de A. taliana por tubos em grupo foram semeadas nos tubos em grupo. De- pois da cultura a 22°C durante 10 dias em Iuz luminosa, o comprimento de raízes principais (raízes principais média) tirado de sementes de A. taliana foi medido. Uma média de oito repetições foi determinada e a taxa de cres- 30 cimento de raiz foi determinada. Como um resultado, uma substância quími- ca que exibiu taxa de crescimento de raiz significante (por exemplo, a taxa de crescimento de raiz é 120% ou mais) pode ser considerada uma substân- cia química com atividade de promoção de crescimento de raiz.
Como resultados detalhados, um valor que exibiu a taxa de crescimento de raiz mais alta na concentração final anterior foi mostrado na Tabela 19.
Taxa de crescimento de raiz (%) = (Comprimento de raiz princi-
pal média de seção tratada por substância química) / (Comprimento de raiz principal médio de seção de controle) * 100
Tabela 18
Composição Concentração (mg/L) Nitrato de cálcio Ca(NO3)2,4H20 950 Nitrato de potássio KNO3 810 Sulfato de magnésio MgSO4JH2O 500 Fosfato de amônio NH4H2P04 155 Ferro quelado Fe-EDTA 22,62 Ácido bórico H3BO3 2,86 Sulfato de manganês MnSO4,4H20 1,81 Sulfato de zinco ZnSO4JH2O 0,22 Sulfato de cobre CuSO4,5H20 0,08 Molibdato de sódio Na2Mo04,2H20 0,025 Ajustado em pH 5,8 Tabela 19
Composto N0 Concentração final de Atividade de promoção de teste (ppm) crescimento de raiz la-1 2,5 150,9 lb-1 0,625 129,5 lb-2 0,625 134,0 lb-3 1,25 142,5 lb-4 1,25 136,4 lb-5 10 120,6 lb-6 1,25 128,2 lb-7 1,25 128,9 lb-8 5 155,3 lb-9 10 121,3 lb-10 2,5 139,5 lb-11 1,25 122,8 lb-12 10 120,4 lb-13 10 122,4 lb-15 10 140,4 lb-17 2,5 134,0 lb-18 5 138,5 lb-19 5 141,9 lb-20 10 169,0 lb-21 0,625 125,8 lb-22 5 134,5 lb-23 0,625 128,6 lb-24 2,5 137,9 lb-25 1,25 126,5 lb-27 2,5 121,6 lc-1 10 163,6 ld-1 5 143,9 le-1 2,5 184,6 le-3 2,5 138,8 lfl-2 2,5 155,9 lh-1 10 141,5 Formulações de meios usados na presente invenção são descri-
tas abaixo.
(a) DOLU + Glu médio
Base de nitrogênio de Bacto-Ievedura sem aminoácidos 6,7g Glicose, 20 g
SC-HIS-LEU-URA (Q-BIOgene) 1,66 g Histidina 0,076g Água destilada 1000 ml
(b) DOLU + Gal médio Base de nitrogênio de Bacto-Ievedura sem aminoácidos 6,7g Glicose 20 g
SC-HIS-LEU-URA (Q-BIOgene) 1,66 g Histidina 0,076g Água destilada 1000 ml Aplicabilidade industrial
De acordo com a presente invenção, é possível fornecer um a- gente capaz de controlar o crescimento ou diferenciação de uma planta, e um método para avaliar uma substância química tendo uma atividade bioló- 10 gica útil cujo alvo tornou-se claro, isto é, um método para avaliar uma subs- tância química utilizando uma atividade em um alvo específico como um in- dicador para quimicamente controlar um sítio alvo.
Texto Livre de Listagem de Seqüência SEQ ID NO: 3 Iniciador de oligonucleotídeo alvo para PCR SEQ ID NO: 4
Iniciadorde oligonucleotídeo alvo para PCR SEQ ID NO: 5
Iniciador de oligonucleotídeo alvo para PCR SEQ ID NO: 6
Iniciador de oligonucleotídeo alvo para PCR SEQ ID NO: 7
Iniciador de oligonucleotídeo alvo para PCR SEQ ID NO: 8 Iniciadorde oligonucleotídeo alvo para PCR LISTAGEM DE SEQÜÊNCIA <110> SUMITOMO CHEMICAL COMPANY, LIMITED
<120> Agente para inibir a sinalização de citotocina
<130> S17000W001
<150> JP2006-315308 <151> 2006-11-22
<150> JP2006-315309 <151> 2006-11-22
<150> JP2007-022849 <151> 2007-02-01
<150> JP2007-022850 <151> 2007-02-01
<160> 8
<210> 1 <211> 1057 <212> PRT
<213> Arabidopsis thali <4 00> 1
Met Asn Trp Ala Leu Asn 1 5
Arg He Glu He Ser Asp 20
Asp Phe Tyr Gln Leu Gly 35
Pro Arg Lys He Asp Phe 50
Met Gln Gln Gln Gln Gln 65 70
Asn Asn Asn Asn Asn Asp 85
He Gln Glu His Arg Ala 100
He He Val Gly Phe Ile 115
Asn His Gln Glu Glu Glu Glu Glu Pro Arg 10 15
Ser Glu Ser Leu Glu Asn Leu Lys Ser Ser 25 30
Gly Gly Gly Ala Leu Asn Ser Ser Glu Lys 40 45
Trp Arg Ser Gly Leu Met Gly Phe Ala Lys 55 60
Leu Gln His Ser Val Ala Val Lys Met Asn 75 80
Leu Met Gly Asn Lys Lys Gly Ser Thr Phe 90 95
Leu Leu Pro Lys Ala Leu He Leu Trp Ile 105 110
Ser Ser Gly He Tyr Gln Trp Met Asp Asp 120 125 Ala
Arg
145
His
Ser
Phe
Asn
Thr
225
Val
Met
Gly
Leu
Asn
305
Gly
Ala
Ser
Ser
His
385
Val
Tyr
Phe
Ala
Met
465
Ser
Asn Lys Ile Arg Arg Glu Glu Val Leu Val Ser Met Cys Asp Gln 130 135 140
Ala Arg Met Leu Gln Asp Gln Phe Ser Val Ser Val Asn His Val 150 155 160
Ala Leu Ala Ile Leu Val Ser Thr Phe His Tyr His Lys Asn Pro 165 170 175
Ala Ile Asp Gln Glu Thr Phe Ala Glu Tyr Thr Ala Arg Thr Ala 180 185 190
Glu Arg Pro Leu Leu Ser Gly Val Ala Tyr Ala Glu Lys Val Val 195 200 205
Phe Glu Arg Glu Met Phe Glu Arg Gln His Asn Trp Val Ile Lys 210 215 220
Met Asp Arg Gly Glu Pro Ser Pro Val Arg Asp Glu Tyr Ala Pro 230 235 240
Ile Phe Ser Gln Asp Ser Val Ser Tyr Leu Glu Ser Leu Asp Met 245 250 255
Ser Gly Glu Glu Asp Arg Glu Asn Ile Leu Arg Ala Arg Glu Thr 260 265 270
Lys Ala Val Leu Thr Ser Pro Phe Arg Leu Leu Glu Thr His His 275 280 285
Gly Val Val Leu Thr Phe Pro Val Tyr Lys Ser Ser Leu Pro Glu 290 295 300
Pro Thr Val Glu Glu Arg Ile Ala Ala Thr Ala Gly Tyr Leu Gly 310 315 320
Ala Phe Asp Val Glu Ser Leu Val Glu Asn Leu Leu Gly Gln Leu 325 330 335
Gly Asn Gln Ala Ile Val Val His Val Tyr Asp Ile Thr Asn Ala 340 345 350
Asp Pro Leu Val Met Tyr Gly Asn Gln Asp Glu Glu Ala Asp Arg 355 360 365
Leu Ser His Glu Ser Lys Leu Asp Phe Gly Asp Pro Phe Arg Lys 370 375 380
Lys Met Ile Cys Arg Tyr His Gln Lys Ala Pro Ile Pro Leu Asn 390 395 400
Leu Thr Thr Val Pro Leu Phe Phe Ala Ile Gly Phe Leu Val Gly 405 410 415
Ile Leu Tyr Gly Ala Ala Met His Ile Val Lys Val Glu Asp Asp 420 425 430
His Glu Met Gln Glu Leu Lys Val Arg Ala Glu Ala Ala Asp Val 435 440 445
Lys Ser Gln Phe Leu Ala Thr Val Ser His Glu Ile Arg Thr Pro 450 455 460
Asn Gly Ile Leu Gly Met Leu Ala Met Leu Leu Asp Thr Glu Leu 470 475 480
Ser Thr Gln Arg Asp Tyr Ala Gln Thr Ala Gln Val Cys Gly Lys 485 490 495
Ala Leu Ile Ala Leu Ile Asn Glu Val Leu Asp Arg Ala Lys Ile 500 505 510
Ala Gly Lys Leu Glu Leu Glu Ser Val Pro Phe Asp Ile Arg Ser 515 520 525
Leu Asp Asp Val Leu Ser Leu Phe Ser Glu Glu Ser Arg Asn Lys 530 535 540
Ile Glu Leu Ala Val Phe Val Ser Asp Lys Val Pro Glu Ile Val 545 550 555
Gly Asp Ser Gly Arg Phe Arg Gln Ile Ile Ile Asn Leu Val Gly 565 570 575
Ser Val Lys Phe Thr Glu Lys Gly His Ile Phe Val Lys Val His 580 · 585 590
Ala Glu Gln Ser Lys Asp Glu Ser Glu Pro Lys Asn Ala Leu Asn 595 600 605
Gly Val Ser Glu Glu Met Ile Val Val Ser Lys Gln Ser Ser Tyr 610 615 620
Thr Leu Ser Gly Tyr Glu Ala Ala Asp Gly Arg Asn Ser Trp Asp 625 630 635
Phe Lys His Leu Val Ser Glu Glu Gln Ser Leu Ser Glu Phe Asp 645 650 655
Ser Ser Asn Val Arg Leu Met Val Ser Ile Glu Asp Thr Gly Ile 660 665 670
Ile Pro Leu Val Ala Gln Gly Arg Val Phe Met Pro Phe Met Gln 675 680 685
Asp Ser Ser Thr Ser Arg Asn Tyr Gly Gly Thr Gly Ile Gly Leu 690 695 700
Ile Ser Lys Cys Leu Val Glu Leu Met Arg Gly Gln Ile Asn Phe 705 710 715
Ser Arg Pro His Ile Gly Ser Thr Phe Trp Phe Thr Ala Val Leu 725 730 735
Lys Cys Asp Lys Cys Ser Ala Ile Asn His Met Lys Lys Pro Asn 740 745 750
Glu His Leu Pro Ser Thr Phe Lys Gly Met Lys Ala Ile Val Val 755 760 765
Ala Lys Pro Val Arg Ala Ala Val Thr Arg Tyr His Met Lys Arg 770 775 780
Gly Ile Asn Val Asp Val Val Thr Ser Leu Lys Thr Ala Val Val 785 790 795
Ala Ala Ala Phe Glu Arg Asn Gly Ser Pro Leu Pro Thr Lys Pro 805 810 815
Leu Asp Met Ile Leu Val Glu Lys Asp Ser Trp Ile Ser Thr Glu 820 825 830
Asn Asp Ser Glu Ile Arg Leu Leu Asn Ser Arg Thr Asn Gly Asn 835 840 845
Glu
Ile
Gly
Lys
560
Asn
Leu
Gly
Asn
Ser
640
Ile
Gly
Ala
Ser
Ile
720
Glu
Val
Asp
Leu
Ala
800
Gln
Asp
Val His His Lys Ser Pro Lys Leu Ala Leu Phe Ala Thr Asn Ile Thr Asn 850 855 860
Ser Glu Phe Asp Arg Ala Lys Ser Ala Gly Phe Ala Asp Thr Val Ile 865 870 875 880
Met Lys Pro Leu Arg Ala Ser Met Ile Gly Ala Cys Leu Gln Gln Val 885 890 895
Leu Glu Leu Arg Lys Thr Arg Gln Gln His Pro Glu Gly Ser Ser Pro 900 905 910
Ala Thr Leu Lys Ser Leu Leu Thr Gly Lys Lys Ile Leu Val Val Asp 915 920 925
Asp Asn Ile Val Asn Arg Arg Val Ala Ala Gly Ala Leu Lys Lys Phe 930 935 940
Gly Ala Glu Val Val Cys Ala Glu Ser Gly Gln Val Ala Leu Gly Leu 945 950 955 960
Leu Gln Ile Pro His Thr Phe Asp Ala Cys Phe Met Asp Ile Gln Met 965 970 975
Pro Gln Met Asp Gly Phe Glu Ala Thr Arg Gln Ile Arg Met Met Glu 980 985 990
Lys Glu Ala Lys Glu Lys Thr Asn Leu Glu Trp His Leu Pro Ile Leu 995 1000 1005
Ala Met Thr Ala Asp Val Ile His Ala Thr Tyr Glu Glu Cys Leu Lys 1010 1015 1020
Ser Gly Met Asp Gly Tyr Val Ser Lys Pro Phe Glu Glu Glu Asn Leu 1025 1030 1035 1040
Tyr Lys Ser Val Ala Lys Ser Phe Lys Pro Asn Pro Ile Ser Pro Ser 1045 1050 1055
Ser
<210> 2 <211> 3174 <212> DNA
<213> Arabidopsis thaliana
<220>
<221> CDS <222> (1) .. (3174)
<400> 2
atg aac tgg gca ctc aac aat cat caa gaa gaa gaa gaa gag cca cga
Met Asn Trp Ala Leu Asn Asn His Gln Glu Glu Glu Glu Glu Pro Arg
10 15
aga att gaa att tct gat tcc gag tca cta gaa aac ttg aaa age age 96 Arg Ile Glu Ile Ser Asp Ser Glu Ser Leu Glu Asn Leu Lys Ser Ser 25 30 gat ttt tat caa ctg ggt ggt ggt ggt gct ctg aat tcg tca gaa aag Asp Phe Tyr Gln Leu Gly Gly Gly Gly Ala Leu Asn Ser Ser Glu Lys 40 45
ccg aga aag atc gat ttt tgg cgt tcg ggg ttg atg ggt ttt gcg aag Pro Arg Lys Ile Asp Phe Trp Arg Ser Gly Leu Met Gly Phe Ala Lys 50 55 60
atg cag cag cag caa cag ctt cag cat tca gtg gcg gtg aag atg aac Met Gln Gln Gln Gln Gln Leu Gln His Ser Val Ala Val Lys Met Asn 65 70 75 80
aat aat aat aat aac gat cta atg ggt aat aaa aaa ggg tca act ttc Asn Asn Asn Asn Asn Asp Leu Met Gly Asn Lys Lys Gly Ser Thr Phe 85 90 95
ata caa gaa cat cga gca ttg tta cca aaa gct ttg att ctg tgg atc Ile Gln Glu His Arg Ala Leu Leu Pro Lys Ala Leu Ile Leu Trp Ile 100 105 110
atc att gtt ggg ttt ata age agt ggg att tat cag tgg atg gat gat Ile Ile Val Gly Phe Ile Ser Ser Gly Ile Tyr Gln Trp Met Asp Asp 115 120 125
gct aat aag att aga agg gaa gag gtt ttg gtc age atg tgt gat caa Ala Asn Lys Ile Arg Arg Glu Glu Val Leu Val Ser Met Cys Asp Gln 130 135 140
aga gct aga atg ttg cag gat caa ttt agt gtt agt gtt aat cat gtt Arg Ala Arg Met Leu Gln Asp Gln Phe Ser Val Ser Val Asn His Val 145 150 155 160
cat gct ttg gct att etc gtc tcc act ttt cat tac cac aag aac cct His Ala Leu Ala Ile Leu Val Ser Thr Phe His Tyr His Lys Asn Pro 165 170 175
tet gca att gat cag gag aca ttt gcg gag tac acg gca aga aca gca Ser Ala Ile Asp Gln Glu Thr Phe Ala Glu Tyr Thr Ala Arg Thr Ala 180 185 190
144
192
240
288
336
384
432
480
528
576
ttt gag aga ccg ttg cta agt gga gtg gct tat gct gaa aaa gtt gtg 624 Phe Glu Arg Pro Leu Leu Ser Gly Val Ala Tyr Ala Glu Lys Val Val 195 200 205 aat ttt Asn Phe 210
aca atg Thr Met 225
gtt ata Val Ile
atg tca Met Ser
gga aaa Gly Lys
ctc gga Leu Gly 290
aat ccg Asn Pro 305
ggt gcg Gly Ala
gct ggt Ala Gly
tca gat Ser Asp
tct ctc Ser Leu 370
gag agg Glu Arg
gat aga Asp Arg
ttc tct Phe Ser
ggc gag Gly Glu 260
gct gtc Ala Val 275
gtt gtg Val Val
act gtc Thr Val
ttt gat Phe Asp
aac caa Asn Gln 340
cca ctt Pro Leu 355
tct cat Ser His
gag atg Glu Met
gga gag Gly Glu 230
caa gat Gln Asp 245
gag gat Glu Asp
ttg act Leu Thr
ttg aca Leu Thr
gaa gag Glu Glu 310
gtg gag Val Glu 325
gca ata Ala Ile
gtc atg Val Met
gag age Glu Ser
ttt gag Phe Glu 215
cct tca Pro Ser
agt gtc Ser Val
cgt gag Arg Glu
age cct Ser Pro 280
ttc cct Phe Pro 295
cgt att Arg Ile
tct cta Ser Leu
gtt gtg Val Val
tat ggt Tyr Gly 360
aag ctc Lys Leu 375
cgg cag Arg Gln
ccg gtt Pro Val
tct tac Ser Tyr 250
aat att Asn Ile 265
ttt agg Phe Arg
gtc tac Val Tyr
gca gcc Ala Ala
gtc gag Val Glu 330
cat gtg His Val 345
aat caa Asn Gln
gat ttt Asp Phe
cac aat His Asn 220
agg gat Arg Asp 235
ctt gag Leu Glu
ttg cga Leu Arg
ttg ttg Leu Leu
aag tct Lys Ser 300
act gca Thr Ala 315
aat tta Asn Leu
tat gat Tyr Asp
gat gaa Asp Glu
gga gac Gly Asp 380
tgg gtt Trp Val
gag tat Glu Tyr
tca ctc Ser Leu
gct aga Ala Arg 270
gaa act Glu Thr 285
tct ctt Ser Leu
ggg tac Gly Tyr
ctt ggt Leu Gly
atc acc Ile Thr 350
gaa gcc Glu Ala 365
CCC ttc Pro Phe
ata aag Ile Lys
gct cct Ala Pro 240
gat atg Asp Met 255
gaa acc Glu Thr
cac cat His His
cct gaa Pro Glu
ctt ggt Leu Gly 320
cag ctt Gln Leu 335
aat gca Asn Ala
gac aga Asp Arg
agg aaa Arg Lys
672
720
768
816
864
912
960
1008
1056
1104
1152
cat aag atg ata tgc agg tac cac caa aag gca cca ata cca ttg aat 1200 His Lys Met Ile Cys Arg Tyr His Gln Lys Ala Pro Ile Pro Leu Asn 385 390 395 400
gtg ctc aca act gtg cca ttg ttc ttt gcg att ggt ttc ttg gtg ggt Val Leu Thr Thr Val Pro Leu Phe Phe Ala Ile Gly Phe Leu Val Gly 405 410 415
tat ata ctg tat ggt gca gct atg cac ata gta aaa gtc gaa gat gat Tyr Ile Leu Tyr Gly Ala Ala Met His Ile Val Lys Val Glu Asp Asp 420 425 430
ttc cat gaa atg caa gag ctt aaa gtg cga gca gaa gct gct gat gtc Phe His Glu Met Gln Glu Leu Lys Val Arg Ala Glu Ala Ala Asp Val 435 440 445
gct aaa tcg cag ttt ctt gct acc gtg tct cac gag atc agg aca cca Ala Lys Ser Gln Phe Leu Ala Thr Val Ser His Glu Ile Arg Thr Pro 450 455 460
atg aat ggc att ctc gga atg ctt gct atg ctc cta gat aca gaa cta Met Asn Gly Ile Leu Gly Met Leu Ala Met Leu Leu Asp Thr Glu Leu 465 470 475 480
age tcg aca cag aga gat tac gct caa acc gct caa gta tgt ggt aaa Ser Ser Thr Gln Arg Asp Tyr Ala Gln Thr Ala Gln Val Cys Gly Lys 485 490 495
gct ttg att gca ttg ata aat gag gtt ctt gat cgc gcc aag att gaa Ala Leu Ile Ala Leu Ile Asn Glu Val Leu Asp Arg Ala Lys Ile Glu 500 505 510
gct gga aag ctg gag ttg gaa tca gta cca ttt gat atc cgt tca ata Ala Gly Lys Leu Glu Leu Glu Ser Val Pro Phe Asp Ile Arg Ser Ile 515 520 525
ttg gat gat gtc ctt tct cta ttc tct gag gag tca agg aac aaa ggc Leu Asp Asp Val Leu Ser Leu Phe Ser Glu Glu Ser Arg Asn Lys Gly
530 535 540
att gag ctc gcg gtt ttc gtt tca gac aaa gta cca gag ata gtc aaa
Ile Glu Leu Ala Val Phe Val Ser Asp Lys Val Pro Glu Ile Val Lys
545 550 555 560
1248
1296
1344
1392
1440
1488
1536
1584
1632
1680
gga gat tca ggg aga ttt aga cag ata atc ata aac ctt gtt gga aat 1728 Gly Asp Ser Gly Arg Phe Arg Gln Ile Ile Ile Asn Leu Val Gly Asn 565 570 575
tcg gtt aaa ttc aca gag aaa gga cat atc ttt gtt aaa gtc cat ctt
Ser Val Lys Phe Thr Glu Lys Gly His Ile Phe Val Lys Val His Leu
580 585 590
gcg gaa caa tca aaa gat gaa tct gaa ccg aaa aat gca ttg aat ggt
Ala Glu Gln Ser Lys Asp Glu Ser Glu Pro Lys Asn Ala Leu Asn Gly
595 600 605
gga gtg tct gaa gaa atg atc gtt gtt tcc aaa cag tca agt tac aac
Gly Val Ser Glu Glu Met Ile Val Val Ser Lys Gln Ser Ser Tyr Asn
610 615 620
aca ttg age ggt tac gaa gct gct gat ggt cgg aat age tgg gat tca
Thr Leu Ser Gly Tyr Glu Ala Ala Asp Gly Arg Asn Ser Trp Asp Ser
625 630 635 640
ttc aag cat ttg gtc tct gag gag cag tca tta tcg gag ttt gat att
Phe Lys His Leu Val Ser Glu Glu Gln Ser Leu Ser Glu Phe Asp Ile
645 650 655
tct age aat gtt agg ctt atg gtt tca atc gaa gac acg ggt att gga
Ser Ser Asn Val Arg Leu Met Val Ser Ile Glu Asp Thr Gly He Gly
660 665 670
atc cct tta gtt gca caa ggc cgt gtg ttt atg ccg ttt atg caa gca
Ile Pro Leu Val Ala Gln Gly Arg Val Phe Met Pro Phe Met Gln Ala
675 680 685
gat age tcg act tca aga aac tat gga ggt act ggt att ggt ttg agt
Asp Ser Ser Thr Ser Arg Asn Tyr Gly Gly Thr Gly Ile Gly Leu Ser
690 695 700
ata age aag tgt ctt gtt gaa ctt atg cgt ggt cag ata aat ttc ata
Ile Ser Lys Cys Leu Val Glu Leu Met Arg Gly Gln Ile Asn Phe Ile
705 710 715 720
age cgg cct cat att gga age acg ttc tgg ttc acg gct gtt tta gag
Ser Arg Pro His Ile Gly Ser Thr Phe Trp Phe Thr Ala Val Leu Glu
725 730 735
1776
1824
1872
1920
1968
2016
2064
2112
2160
2208
aaa tgc gat aaa tgc agt gcg att aac cat atg aag aaa cct aat gtg 2256 Lys Cys Asp Lys Cys Ser Ala Ile Asn His Met Lys Lys Pro Asn Val 740 745 750 gaa cac ttg cct tct act ttt aaa gga atg aaa gct ata gtt gtt gat
Glu His Leu Pro Ser Thr Phe Lys Gly Met Lys Ala Ile Val Val Asp
755 760 765
gct aag cct gtt aga gct gct gtg act aga tac cat atg aaa aga ctc
Ala Lys Pro Val Arg Ala Ala Val Thr Arg Tyr His Met Lys Arg Leu
770 775 780
gga atc aat gtt gat gtc gtg aca agt ctc aaa acc gct gtt gtt gca
Gly Ile Asn Val Asp Val Val Thr Ser Leu Lys Thr Ala Val Val Ala
785 790 795 800
gct gct gcg ttt gaa aga aac ggt tct cct ctc cca aca aaa ccg caa
Ala Ala Ala Phe Glu Arg Asn Gly Ser Pro Leu Pro Thr Lys Pro Gln
805 810 815
ctt gat atg atc tta gta gag aaa gat tca tgg att tca act gaa gat
Leu Asp Met Ile Leu Val Glu Lys Asp Ser Trp Ile Ser Thr Glu Asp
820 825 830
aat gac tca gag att cgt tta ttg aat tca aga acc aac gga aac gtt
Asn Asp Ser Glu Ile Arg Leu Leu Asn Ser Arg Thr Asn Gly Asn Val
835 840 845
cat cac aag tct ccg aaa cta gct cta ttc gca aca aac atc aca aat
His His Lys Ser Pro Lys Leu Ala Leu Phe Ala Thr Asn Ile Thr Asn
850 855 860
tcg gag ttc gac aga gct aaa tcc gca gga ttt gca gat acg gta ata
Ser Glu Phe Asp Arg Ala Lys Ser Ala Gly Phe Ala Asp Thr Val Ile
865 870 875 880
atg aaa ccg tta aga gca age atg att ggg gcg tgt ctg caa caa gtt
Met Lys Pro Leu Arg Ala Ser Met Ile Gly Ala Cys Leu Gln Gln Val
885 890 895
ctc gag ctg aga aaa aca aga caa caa cat cca gaa gga tca tca ccc
Leu Glu Leu Arg Lys Thr Arg Gln Gln His Pro Glu Gly Ser Ser Pro
900 905 910
gca act ctc aag age ttg ctt aca ggg aag aag att ctt gtg gtt gat
Ala Thr Leu Lys Ser Leu Leu Thr Gly Lys Lys Ile Leu Val Val Asp
915 920 925
2304
2352
2400
2448
2496
2544
2592
2640
2688
2736
2784
gat aat ata gtt aac agg aga gta gct gca gga gct ctc aag aaa ttt 2832 Asp Asn Ile Val Asn Arg Arg Val Ala Ala Gly Ala Leu Lys Lys Phe 930 935 940
gga gca gaa gtg gtt tgt gca gag agt ggt caa gtt gct ttg ggt ttg 2880 Gly Ala Glu Val Val Cys Ala Glu Ser Gly Gln Val Ala Leu Gly Leu 945 950 955 960
ctt cag att cca cac act ttc gat gct tgc ttc atg gat att caa atg 2928 Leu Gln Ile Pro His Thr Phe Asp Ala Cys Phe Met Asp Ile Gln Met 965 970 975
cca cag atg gac gga ttt gaa gca act cgt cag ata aga atg atg gag 297 6 Pro Gln Met Asp Gly Phe Glu Ala Thr Arg Gln Ile Arg Met Met Glu 980 985 990
aag gaa gct aaa gag aag acg aat ctc gaa tgg cat tta ccg att cta 3024 Lys Glu Ala Lys Glu Lys Thr Asn Leu Glu Trp His Leu Pro Ile Leu 995 1000 1005
gcg atg act gcg gat gtg ata cac gcg acc tac gag gaa tgt ctg aaa 3072 Ala Met Thr Ala Asp Val Ile His Ala Thr Tyr Glu Glu Cys Leu Lys 1010 1015 1020
agt ggg atg gat ggt tac gtc tcc aaa cct ttt gaa gaa gag aat ctc 3120 Ser Gly Met Asp Gly Tyr Val Ser Lys Pro Phe Glu Glu Glu Asn Leu 1025 1030 1035 1040
tat aaa tcc gtt gcc aaa tca ttc aaa cct aat cct atc tca cct tcg 3168 Tyr Lys Ser Val Ala Lys Ser Phe Lys Pro Asn Pro Ile Ser Pro Ser 1045 1050 1055
tcg taa 3174
Ser
<210> 3 <211> 24 <212> DNA
<213> Seqüência Artificial
<220>
<223> Descrição de seqüência artificial iniciador de oligonucleotídeo pro- jetado para PCR
<400> 3
tcagatatga actgggcact caac
24 <210> 4 <211> 24 <212> DNA
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Descrição de seqüência artificial iniciador de oligonucleotídeo pro- jetado para PCR
<400> 4
ctcaatgctt ttgttccttg actc 24
<210> 5
<211> 31
<212> DNA
<213> Seqüência Artificial <22 0>
<223> Descrição de seqüência artificial iniciador de oligonucleotídeo pro- jetado para PCR
<400> 5
accatgaact gggcactcaa caatcatcaa g 31
<210> 6 <211> 30 <212> DNA
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Descrição de seqüência artificial iniciador de oligonucleotídeo pro- jetado para PCR
<400> 6
ggattacgac gaaggtgaga taggattagg 30
<210> 7 <211> 33 <212> DNA
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Descrição de seqüência artificial iniciador de oligonucleotídeo pro- jetado para PCR <400> 7
cgggatccat gaactgggca ctcaacaatc atc 33
<210> 8 <211> 34 <212> DNA
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Descrição de seqüência artificial iniciador de oligonucleotídeo pro- jetado para PCR
<400> 8
gctctagatt acgacgaagg tgagatagga ttag
34

Claims (50)

1. Agente capaz de controlar o crescimento ou diferenciação de uma planta que tem uma atividade de inibir a sinalização intracelular de um receptor de citocina de uma célula derivada da planta.
2. Agente, de acordo com a reivindicação 1, em que o agente capaz de controlar o crescimento ou diferenciação de uma planta é um regu- lador de crescimento da planta.
3. Agente, de acordo com a reivindicação 1, em que o agente capaz de controlar o crescimento ou diferenciação de uma planta é um a- gente capaz de controlar o crescimento de um corpo da planta.
4. Agente, de acordo com a reivindicação 1, em que o agente capaz de controlar o crescimento ou diferenciação de uma planta um agente é capaz de controlar a diferenciação de uma célula da planta.
5. Agente, de acordo com a reivindicação 3, em que o agente capaz de controlar o crescimento de uma planta é um agente capaz de con- trolar o crescimento de um broto de uma planta.
6. Agente, de acordo com a reivindicação 5, em que controle do crescimento de um broto de uma planta é inibição do crescimento de um broto axilar.
7. Agente, de acordo com a reivindicação 5, em que controle do crescimento de um broto de uma planta é inibição do crescimento de um broto de flor.
8. Agente, de acordo com a reivindicação 3, em que o agente capaz de controlar o crescimento de um tronco da planta é um agente capaz de promover o estabelecimento de resistência de uma planta.
9. Agente, de acordo com a reivindicação 3, em que o agente capaz de controlar o crescimento de um tronco da planta é um agente capaz de promover o cultivo de uma planta.
10. Agente, de acordo com a reivindicação 3, em que o agente capaz de controlar o crescimento de um tronco da planta é um agente capaz de promover o crescimento de uma raiz de uma planta.
11. Agente, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, em que o receptor de citocina de uma célula derivada da planta é um receptor de citocinina selecionado a partir do seguinte grupo A: <Grupo A> (a) uma proteína compreendendo a seqüência de aminoácido de SEQ ID NO:1, (b) uma proteína compreendendo uma seqüência de aminoácido de SEQ ID NO:1 em que um ou mais aminoácidos são deletados, adiciona- dos ou substituídos, e tendo uma atividade de funcionamento como um re- ceptor de citocinina, (c) uma proteína compreendendo uma seqüência de aminoácido tendo uma identidade de seqüência de 45% ou mais com a seqüência de aminoácido de SEQ ID NO: 1, e tendo uma atividade de funcionamento co- mo um receptor de citocinina (d) uma proteína compreendendo uma seqüência de aminoácido codificada pela seqüência de nucleotídeo de SEQ ID NO: 2 (e) uma proteína compreendendo uma seqüência de aminoácido codificada por um polinucleotídeo que hibridiza sob uma condição rigorosa com um polinucleotídeo complementar a um polinucleotídeo tendo a se- qüência de nucleotídeo de SEQ ID NO: 2, e tendo uma atividade de fun- cionamento como um receptor de citocinina.
12. Agente, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, em que a atividade de inibir a sinalização intracelular de um receptor de citocina de uma célula derivada da planta é uma atividade de inibir a si- nalização intracelular de um receptor de citocinina selecionado a partir do seguinte grupo A em um sistema de contato de uma célula tendo o receptor de citocinina com uma substância tendo uma atividade agonística ao recep- tor de citocinina; <Grupo A> (a) uma proteína compreendendo a seqüência de aminoácido de SEQ ID NO: 1, (b) uma proteína compreendendo uma seqüência de aminoácido de SEQ ID NO: 1 em que um ou mais aminoácidos são deletados, adiciona- dos ou substituídos, e tendo uma atividade de funcionamento como um re- ceptor de citocinina, (c) uma proteína que compreende uma seqüência de ami- noácido tendo uma identidade de seqüência de 45% ou mais com a sequên- cia de aminoácido de SEQ ID NO: 1, e tendo uma atividade de funciona- mento como um receptor de citocinina (d) uma proteína compreendendo uma seqüência de aminoácido codificada pela seqüência de nucleotídeo de SEQ ID NO: 2 (e) uma proteína compreendendo uma seqüência de aminoácido codificada por um polinucleotídeo que hibridiza sob uma condição rigorosa com um polinucleotídeo complementar a um polinucleotídeo tendo a se- qüência de nucleotídeo de SEQ ID NO: 2, e tendo uma atividade de fun- cionamento como um receptor de citocinina.
13. Regulador de crescimento da planta compreendendo uma substância química capaz de inibir a sinalização intracelular de um receptor de citocina de uma célula derivada da planta, ou um sal agricolamente acei- tável do mesmo, como um ingrediente ativo.
14. Regulador de crescimento da planta, de acordo com a rei- vindicação 13, em que a substância química tem uma atividade de inibir a sinalização intracelular de um receptor de citocinina selecionado a partir do seguinte grupo A em um sistema de contato compreendendo uma célula tendo o receptor de citocinina, uma substância tendo uma atividade agonísti- ca ao receptor de citocinina, e a substância química; <Grupo A> (a) uma proteína compreendendo a seqüência de aminoácido de SEQ ID NO: 1, (b) uma proteína compreendendo uma seqüência de aminoácido de SEQ ID NO: 1 em que um ou mais aminoácidos são deletados, adiciona- dos ou substituídos, e tendo uma atividade de funcionamento como um re- ceptor de citocinina, (c) uma proteína compreendendo uma seqüência de aminoácido tendo uma identidade de seqüência de 45% ou mais com a seqüência de aminoácido de SEQ ID NO:1, e tendo uma atividade de funcionamento como um receptor de citocinina (d) uma proteína compreendendo uma seqüência de aminoácido codificada pela seqüência de nucleotídeo de SEQ ID NO: 2 (e) uma proteína compreendendo uma seqüência de aminoácido codificada por um polinucleotídeo que hibridiza sob uma condição rigorosa com um polinucleotídeo complementar a um polinucleotídeo tendo a se- qüência de nucleotídeo de SEQ ID NO: 2, e tendo uma atividade de fun- cionamento como um receptor de citocinina.
15. Regulador de crescimento da planta, de acordo com a rei- vindicação 14, em que a substância tendo uma atividade agonística ao re- ceptor de citocinina é trans-zeatina.
16. Regulador de crescimento da planta, de acordo com a rei- vindicação 13, em que a substância química tem uma atividade de inibir a sinalização intracelular de um receptor de citocinina selecionado a partir do seguinte grupo A em um sistema de contato compreendendo uma célula tendo o receptor de citocinina, 0,6 ppm de trans-zeatina e 2 ppm da sub- stância química, quando comparado com o caso onde a substância química não está presente no sistema de contato; <Grupo A> (a) uma proteína compreendendo a seqüência de aminoácido de SEQ ID NO:1, (b) uma proteína compreendendo uma seqüência de aminoácido de SEQ ID ΝΟ.Ί em que um ou mais aminoácidos são deletados, adiciona- dos ou substituídos, e tendo uma atividade de funcionamento como um re- ceptor de citocinina, (c) uma proteína compreendendo uma seqüência de aminoácido tendo uma identidade de seqüência de 45% ou mais com a seqüência de aminoácido de SEQ ID NO:1, e tendo uma atividade de funcionamento como um receptor de citocinina (d) uma proteína compreendendo uma seqüência de aminoácido codificada pela seqüência de nucleotídeo de SEQ ID NO: 2 (e) uma proteína compreendendo uma seqüência de aminoácido codificada por um polinucleotídeo que hibridiza sob uma condição rigorosa com um polinucleotídeo complementar a um polinucleotídeo tendo a se- qüência de nucleotídeo de SEQ ID NO: 2, e tendo uma atividade de fun- cionamento como um receptor de citocinina.
17. Regulador de crescimento da planta, de acordo com a rei- vindicação 13, em que a substância química tem uma atividade de inibir 90% ou mais de sinalização intracelular de um receptor de citocinina selecionado a partir do seguinte grupo A em um sistema de contato compreendendo uma célula tendo o receptor de citocinina, 0,6 ppm de trans-zeatina e 2 ppm da substância química, quando comparado com o caso onde a substância quí- mica não está presente no sistema de contato; <Grupo A> (a) uma proteína compreendendo a seqüência de aminoácido de SEQ ID NO: 1, (b) uma proteína compreendendo uma seqüência de aminoácido de SEQ ID NO: 1 em que um ou mais aminoácidos são deletados, adiciona- dos ou substituídos, e tendo uma atividade de funcionamento como um re- ceptor de citocinina, (c) uma proteína compreendendo uma seqüência de aminoácido tendo uma identidade de seqüência de 45% ou mais com a seqüência de aminoácido de SEQ ID NO: 1, e tendo uma atividade de funcionamento co- mo um receptor de citocinina (d) uma proteína compreendendo uma seqüência de aminoácido codificada pela seqüência de nucleotídeo de SEQ ID NO: 2 (e) uma proteína compreendendo uma seqüência de aminoácido codificada por um polinucleotídeo que hibridiza sob uma condição rigorosa com um polinucleotídeo complementar a um polinucleotídeo tendo a se- qüência de nucleotídeo de SEQ ID NO: 2, e tendo uma atividade de fun- cionamento como um receptor de citocinina.
18. Método por procurar uma substância química capaz de promover o crescimento de uma raiz de uma planta que compreende: (1) uma primeira etapa de medir a quantidade de sinalização in- tracelular de um receptor de citocinina selecionado a partir do seguinte grupo A em um sistema de contato compreendendo uma célula tendo o receptor de citocinina, uma substância tendo uma atividade agonística ao receptor de citocinina e uma substância de teste; e (2) uma segunda etapa de selecionar uma substância química capaz de promover o crescimento de uma raiz de uma planta com base em uma diferença obtida comparando-se a quantidade de sinalização intracelu- lar medida na primeira etapa com a quantidade de sinalização intracelular na ausência da substância química; <Grupo A> (a) uma proteína compreendendo a seqüência de aminoácido de SEQ ID NO: 1, (b) uma proteína compreendendo uma seqüência de aminoácido de SEQ ID NO: 1 em que um ou mais aminoácidos são deletados, adiciona- dos ou substituídos, e tendo uma atividade de funcionamento como um re- ceptor de citocinina, (c) uma proteína compreendendo uma seqüência de aminoácido tendo uma identidade de seqüência de 45% ou mais com a seqüência de aminoácido de SEQ ID NO:1, e tendo uma atividade de funcionamento como um receptor de citocinina (d) uma proteína compreendendo uma seqüência de aminoácido codificada pela seqüência de nucleotídeo de SEQ ID NO: 2 (e) uma proteína compreendendo uma seqüência de aminoácido codificada por um polinucleotídeo que hibridiza sob uma condição rigorosa com um polinucleotídeo complementar a um polinucleotídeo tendo a se- qüência de nucleotídeo de SEQ ID NO: 2, e tendo uma atividade de fun- cionamento como um receptor de citocinina.
19. Método de pesquisa, de acordo com a reivindicação 18, em que a célula tendo o receptor de citocinina é uma célula transformada em que um polinucleotídeo compreendendo uma seqüência de nucleotídeo codi- ficando a seqüência de aminoácido de SEQ ID NO: 1 é introduzido.
20. Método de pesquisa, de acordo com a reivindicação 18, em que a célula tendo o receptor de citocinina é uma célula de levedura trans- formada em que um polinucleotídeo compreendendo uma seqüência de nu- cleotídeo codificando a seqüência de aminoácido de SEQ ID NO: 1 é intro- duzido.
21. Método de pesquisa, de acordo com a reivindicação 18, 19 ou 20, em que a substância tendo uma atividade agonística ao receptor de citocinina é trans-zeatina.
22. Regulador de crescimento da planta compreendendo uma substância química selecionada pelo método de pesquisa como definido na reivindicação 18, 19, 20 ou 21, ou um sal agricolamente aceitável do mesmo, como um ingrediente ativo.
23. Método de regulamento de crescimento da planta, que compreende aplicar uma quantidade eficaz do regulador de crescimento da planta, como definido na reivindicação 13 14, 15, 16, 17 ou 22 a uma planta ou a um habitat da planta.
24. Método de regulamento de crescimento da planta, que compreende determinar uma substância química capaz de promover o cre- scimento de uma raiz de uma planta pelo método de pesquisa de acordo com a reivindicação 18, 19, 20 ou 21, e apresentar a substância química ca- paz de promover o crescimento de uma raiz de uma planta desse modo de- terminada em contato com uma planta.
25. Regulador de crescimento da planta compreendendo um composto representado pela fórmula geral (I): <formula>formula see original document page 135</formula> em que ReX são os mesmos ou diferentes e representam um grupo hidrocarboneto opcionalmente substituído, um grupo representado por NR1R2, um grupo representado por OR3, um grupo representado por S(O)mR4, um grupo nitro ou um átomo de halogênio, em que R1 representa um átomo de hidrogênio ou um grupo hidrocarboneto opcionalmente substi- tuído, R2 representa um átomo de hidrogênio, um grupo hidrocar- boneto opcionalmente substituído, um grupo representado por NR5R6 ( em que R5 e R6 são os mesmos ou diferentes e representam um átomo de hidrogênio ou um grupo Ci - C6 alquila opcionalmente substituído) ou um grupo representado por OR7 ( em que R7 representa um átomo de hidrogênio ou um grupo Ci-C6 alquila opcionalmente substituído), ou R1 e R2 são empregados juntos com o átomo de nitrogênio ao qual eles são ligados para formar um grupo amino cíclico opcionalmente substituído, R3 e R4 cada qual representa um grupo hidrocarboneto opcion- almente substituído, I representa um número inteiro de 0 a 1, m representa um número inteiro de 0 a 2, n representa um número inteiro de 0 a 4, quando n for 2 ou mais, cada X é o mesmo ou diferente um do outro, e Ar representa um grupo arila opcionalmente substituído ou um grupo heteroarila opcionalmente substituído; ou um sal agricolamente acei- tável do mesmo, como um ingrediente ativo.
26. Regulador de crescimento da planta, de acordo com a rei- vindicação 25, em que I é 1 e R é um grupo hidrocarboneto opcionalmente substituído.
27. Regulador de crescimento da planta, de acordo com a rei- vindicação 25, em que I é 1 e R é um grupo C1-3 alquila que é opcionalmente substituído com átomo(s) de halogênio ou grupo(s) oxo.
28. Regulador de crescimento da planta, de acordo com a rei- vindicação 26, em que o grupo hidrocarboneto opcionalmente substituído é um grupo C1.3 alquila que é opcionalmente substituído com átomo(s) de ha- logênio ou grupo(s) oxo.
29. Regulador de crescimento da planta, de acordo com a rei- vindicação 25, em que I é 1e R é um grupo representado por NR1R2.
30. Regulador de crescimento da planta, de acordo com a rei- vindicação 29, em que R1 representa um átomo de hidrogênio ou um grupo C1-3 alquila, R2 representa um átomo de hidrogênio, um grupo amino, um grupo C-i-3 alquilamino, um grupo di Ci_3 alquilamino, um grupo amidino, um grupo C1-3 alcóxi, um grupo fenila, um grupo C1-3 acila, um grupo C1^ alquila, um grupo C3.6 alquenila ou um grupo C3.6 alquinila em que o grupo fenila é opcionalmente substituído com 1 a 3 grupos C1-3 alquila iguais ou diferentes, o grupo fenila, o grupo acila, o grupo alquila, o grupo alquenila e o grupo al- quinila são opcionalmente substituídos com 1 a 3 os mesmos ou diferentes substituintes selecionados a partir de um átomo de halogênio, um grupo hi- droxila, um grupo C1.3 alcóxi, um grupo hidróxi C-1-3 alcóxi, um grupo carbox- ila, um grupo C1^ alcoxicarbonila, um grupo carbamoíla, um grupo amino, um grupo C-i_3 alquilamino, um grupo di Ci_3 alquilamino, um grupo mercapto, um grupo C^3 aciltio, um grupo ciano, um grupo furila e um grupo tetra- hidrofurila, ou R1 e R2 são empregados juntamente com o átomo de ni- trogênio ao qual eles são ligados para formar um grupo pirrolidino, um grupo piperidino ou um grupo morfolino.
31. Regulador de crescimento da planta, de acordo com a rei- vindicação 29, em que R1 representa um átomo de hidrogênio, R2 representa um átomo de hidrogênio, um grupo formila, um grupo Ci_6 alquila, um grupo C3-6 alquenila ou um grupo C3.6 alquinila em que o grupo alquila, o grupo al- quenila e o grupo alquinila são opcionalmente substituídos com (a) substi- tuinte(s) selecionado(s) a partir de um grupo hidroxila, um grupo metóxi, um grupo metoxicarbonila, um grupo etoxicarbonila, um grupo ciano e um grupo furila.
32. Regulador de crescimento da planta, de acordo com a rei- vindicação 25, em que I é 1 e R é um grupo representado por OR3.
33. Regulador de crescimento da planta, de acordo com a rei- vindicação 32, em que R3 é um grupo C1.3 alquila é opcionalmente substi- tuído com um grupo amino.
34. Regulador de crescimento da planta, de acordo com a rei- vindicação 25, em que I é 1 e R é um grupo representado por S(O)mR4.
35. Regulador de crescimento da planta, de acordo com a rei- vindicação 34, em que R4 é um grupo C1-3 alquila que é opcionalmente sub- stituído com um grupo amino ou um grupo hidroxila, e m é 0.
36. Regulador de crescimento da planta, de acordo com a rei- vindicação 25, em que I é 1 e R é um átomo de halogênio.
37. Regulador de crescimento da planta, de acordo com a rei- vindicação 36, em que o átomo de halogênio é um átomo de cloro.
38. Regulador de crescimento da planta, de acordo com qual- quer uma dentre as reivindicações 25 a 37, em que n é de 1 a 2 e X é um grupo C-|-3 alquila, um grupo C1.3 alcóxi, um grupo C1-3 haloalquila, um grupo ciano, um átomo de halogênio ou um grupo nitro.
39. Regulador de crescimento da planta, de acordo com a rei- vindicação 38, em que X é um átomo de cloro, um átomo de bromo ou um grupo nitro, e X está na posição 6 e/ou na posição 8.
40. Regulador de crescimento da planta, de acordo com qual- quer uma dentre as reivindicações 25 a 39, em que Ar é um grupo fenila que é opcionalmente substituído com (a) átomo(s) de halogênio ou (a) grupo(s) C1-3 alquila.
41. Método de regulamento de crescimento da planta, que compreende aplicar uma quantidade eficaz do regulador de crescimento de planta como definido em qualquer uma dentre as reivindicações 25 a 40 a uma planta ou a um habitat da planta.
42. Composto representado pela fórmula (XI): <formula>formula see original document page 138</formula> (XI) em que Ph representa um grupo fenila, R11 representa um áto- mo de hidrogênio, um grupo formila, um grupo Ci-6 alquila, um grupo C3-6 alquenila ou um grupo C3.6 alquinila em que o grupo alquila, o grupo alqueni- la e o grupo alquinila são opcionalmente substituídos com pelo menos um substituinte selecionado a partir de um grupo hidroxila, um grupo C^3 alcóxi, um grupo C-i_3 alcoxicarbonila, um grupo ciano, um grupo 2-furila e um grupo 2-tetra-hidrofurila, m representa um número inteiro de 0 a 3, n representa um número inteiro de 0 a 1, pelo menos um dentre m e n não é O1 Xi e X2 são os mesmos ou diferentes e representam um átomo de cloro, um átomo de bromo, um grupo trifluorometila, um grupo ciano ou um grupo nitro, quando m for 2 ou mais, cada X1 é o mesmo ou diferente um do outro; contanto que a) quando m for 1, Xi seja um átomo de 5-cloro ou um átomo de 7-cloro e R11 represente um grupo metila, n represente um número inteiro de 1, ou b) quando n for 1 e qualquer uma das condições (1) a (3) for sat- isfeita, m represente um número inteiro de 1 a 3: (1) X2 é um átomo de cloro, e R11 é um grupo selecionado a par- tir de um átomo de hidrogênio, um grupo metila, um grupo 2-hidroxietila, um grupo 3-hidroxipropila, um grupo 2,2-dimetoxietila e um grupo cianometila, (2) X2 é um átomo de bromo, e R11 é um grupo selecionado a partir de um grupo 2-hidroxietila, um grupo 3-hidroxipropila e um grupo 2- metoxietila, e (3) X2 é um grupo nitro, e R11 é um grupo 3-hidroxipropila; ou um sal agricolamente aceitável do mesmo.
43. Composto, de acordo com a reivindicação 42, em que R11 representa um átomo de hidrogênio, um grupo formila, um grupo metila, um grupo etila, um grupo 2-hidroxietila, um grupo 2-metoxietila, um grupo furfu- rila, um grupo metoxicarbonilmetila ou um grupo etoxicarbonilametila, m é 0, n é 1, e X2 é um átomo de cloro ou um grupo nitro, ou um sal agricolamente aceitável do mesmo.
44. Composto, de acordo com a reivindicação 42, em que R11 representa um átomo de hidrogênio, um grupo formila, um grupo metila, um grupo etila, um grupo 2-hidroxietila, um grupo 3-hidroxipropila, um grupo 2- metoxietila, um grupo furfurila, um grupo metoxicarbonilmetila ou um grupo etoxicarbonilametila, m é 1, n é 1, Xi é um átomo de 8-cloro, e X2 representa um átomo de cloro ou um grupo nitro, ou um sal agricolamente aceitável do mesmo.
45. Composto, de acordo com a reivindicação 42, em que m é que um número inteiro de 1 a 3 e n é 0, ou um sal agricolamente aceitável do mesmo.
46. Composto, de acordo com a reivindicação 42, em que R11 representa um grupo formila, um grupo C4-6 alquila, um grupo C3-6 alquenila ou um grupo C3.6 alquinila em que o grupo alquila, grupo alquenila e grupo alquinila são opcionalmente substituídos com (a) grupo(s) hidroxila ou (a) grupo(s) C^3 alcóxi, ou R11 representa um grupo C-i_3 alcoxicarbonilmetila, um grupo C1-3 alcóxi Ci_3 alquila ou um grupo furfurila, m é 0, n é 1, e X2 é um átomo de cloro, ou um sal agricolamente aceitável do mesmo.
47. Composto, de acordo com a reivindicação 42, em que n é 1, ou um sal agricolamente aceitável do mesmo.
48. Composto, de acordo com a reivindicação 42, em que m é 1 a 3 e n é 1, ou um sal agricolamente aceitável do mesmo.
49. Composto, de acordo com a reivindicação 42, 45, 47 ou 48, em que R11 é que um grupo C1-3 alcoxicarbonilmetila ou um grupo furfurila, ou um sal agricolamente aceitável do mesmo.
50. Composto, de acordo com a reivindicação 42, em que n é 1 e X2 é um grupo trifluorometila ou um grupo ciano.
BRPI0719111A 2006-11-22 2007-11-22 agente para inibir a sinalização de citocinina BRPI0719111A8 (pt)

Applications Claiming Priority (9)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2006-315308 2006-11-22
JP2006315308 2006-11-22
JP2006315309 2006-11-22
JP2006-315309 2006-11-22
JP2007022849 2007-02-01
JP2007-022850 2007-02-01
JP2007022850A JP5082474B2 (ja) 2006-11-22 2007-02-01 新規なキナゾリン誘導体
JP2007-022849 2007-02-01
PCT/JP2007/073126 WO2008062907A1 (en) 2006-11-22 2007-11-22 Substance capable of inhibiting cytokinin signaling

Publications (2)

Publication Number Publication Date
BRPI0719111A2 true BRPI0719111A2 (pt) 2013-12-10
BRPI0719111A8 BRPI0719111A8 (pt) 2019-01-15

Family

ID=40863157

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
BRPI0719111A BRPI0719111A8 (pt) 2006-11-22 2007-11-22 agente para inibir a sinalização de citocinina

Country Status (10)

Country Link
US (1) US8722580B2 (pt)
EP (1) EP2100507B1 (pt)
KR (2) KR20140054433A (pt)
CN (1) CN101588716B (pt)
BR (1) BRPI0719111A8 (pt)
CA (1) CA2669275C (pt)
ES (1) ES2532277T3 (pt)
PL (1) PL2100507T3 (pt)
RU (1) RU2477046C2 (pt)
WO (1) WO2008062907A1 (pt)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20230257359A1 (en) * 2020-06-10 2023-08-17 Ideaya Biosciences, Inc. 4-arylquinazoline derivatives as methionine adenosyltransferase 2a inhibitors

Family Cites Families (17)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS4020866B1 (pt) * 1963-12-18 1965-09-16
US3509141A (en) * 1966-09-15 1970-04-28 Ciba Geigy Corp 2-amino-quinazolines
JPS5323997A (en) 1976-08-16 1978-03-06 Sumitomo Chem Co Ltd Imidazoquinazoline derivatives and their preparation
JPS5398997A (en) * 1977-02-09 1978-08-29 Sumitomo Chem Co Ltd Fused pyridine derivertives and process for their preparation
US4282361A (en) * 1978-03-16 1981-08-04 Massachusetts Institute Of Technology Synthesis for 7-alkylamino-3-methylpyrazolo [4,3-d]pyrimidines
FR2514765A1 (fr) * 1981-10-21 1983-04-22 Sanofi Sa Nouveaux derives de la phenyl-4 quinazoline actifs sur le systeme nerveux central
US4502880A (en) * 1983-02-03 1985-03-05 E. I. Du Pont De Nemours And Company 4-Pyridinium quinazoline derivatives
JPS62145073A (ja) 1985-12-19 1987-06-29 Dainippon Pharmaceut Co Ltd キナゾリン査導体
JPH06192099A (ja) * 1992-10-07 1994-07-12 Sumitomo Pharmaceut Co Ltd 腫瘍壊死因子産生阻害剤
US5646154A (en) * 1992-10-07 1997-07-08 Sumitomo Pharmaceuticals Co., Ltd. Pharmaceutical compositions for inhibiting the formation of tumor necrosis factor
EP1104459A1 (en) 1998-08-12 2001-06-06 Maxygen, Inc. Dna shuffling of monooxygenase genes for production of industrial chemicals
AU2002223877A1 (en) * 2000-11-25 2002-06-03 University Of Leeds Regulation of plant growth by modifying the expression of a putative trna-isope ntenyl transferase
JP4161597B2 (ja) 2001-03-15 2008-10-08 住友化学株式会社 サイトカイニン受容体に対するアゴニスト活性の分析方法
US7741049B2 (en) * 2001-03-15 2010-06-22 Sumitomo Chemical Company, Limited Analysis of agonist-activity and antagonist-activity to cytokinin receptor
DE10154075A1 (de) 2001-11-02 2003-05-15 Bayer Cropscience Ag Substituierte Pyrimidine
NZ546042A (en) 2003-08-22 2009-09-25 Stoller Ets Methods for improving growth and crop productivity of plants using an auxin and boron
JP2007510642A (ja) * 2003-11-03 2007-04-26 ワーナー−ランバート カンパニー リミテッド ライアビリティー カンパニー 中枢神経系障害の治療のための新規ノルエピネフリン再取込み阻害薬

Also Published As

Publication number Publication date
EP2100507A4 (en) 2009-12-23
AU2007322610A1 (en) 2008-05-29
US20100056377A1 (en) 2010-03-04
PL2100507T3 (pl) 2015-07-31
RU2009123470A (ru) 2010-12-27
US8722580B2 (en) 2014-05-13
CA2669275A1 (en) 2008-05-29
KR101486090B1 (ko) 2015-01-23
EP2100507B1 (en) 2015-02-25
KR20140054433A (ko) 2014-05-08
ES2532277T3 (es) 2015-03-25
RU2477046C2 (ru) 2013-03-10
EP2100507A1 (en) 2009-09-16
CN101588716A (zh) 2009-11-25
CN101588716B (zh) 2014-03-05
BRPI0719111A8 (pt) 2019-01-15
KR20090091721A (ko) 2009-08-28
CA2669275C (en) 2015-02-24
WO2008062907A1 (en) 2008-05-29

Similar Documents

Publication Publication Date Title
AU2013240193B2 (en) Synthetic compounds for vegetative ABA responses
US10905120B2 (en) ABA receptor agonists that modulate transpiration
US20160280651A1 (en) Compounds that induce aba responses
UA121506C2 (uk) Сполуки піразолону або їх солі, спосіб їх отримання, гербіцидна композиція та їх застосування
CN101817799B (zh) 氰基丙烯酸酯类化合物及在农药和医药上的应用
US20170027172A1 (en) Use of substitute oxo tetrahydroquinoline sulfonamides or salts thereof for raising stress tolerance of plants
CN107846899A (zh) 取代的氧代四氢喹啉基次膦酰胺和‑膦酰胺或其盐及其提高植物中的胁迫耐受性的用途
CN110903279B (zh) 一种吡唑类化合物及其盐和用途
AU2016380736B2 (en) High stress resistant plant growth regulator and preparation and use thereof
US8722580B2 (en) Agent for inhibiting cytokinin signaling
US10757937B2 (en) Sulfonamides that activate ABA receptors
US20210112808A1 (en) Overpowered aba receptor agonists
CN110615781A (zh) 吡唑类衍生物及其制备方法与用途
JP5205924B2 (ja) 細胞が有する植物由来のサイトカイニン受容体からの細胞内信号伝達を阻害する活性を有する薬剤
HU189583B (en) Herbicide and growth-controlling compositions containing n-/-1-alkenyl/-chloro-acetiv-anilide derivatives as active agents and process for producing the active agents
US11641857B2 (en) Unusually potent ABA receptor pan-antagonists
CN109020841A (zh) 一种n-硝基-n-(2,4,6-三氟苯基）苯磺酰胺类化合物及其用途
WO2020054878A1 (ja) 植物の耐塩性向上剤
US4654074A (en) 2-chloro-N-(4,6-dimethoxy-5-pyrimidinyl)-N-[1,(1-pyrazolyl)ethyl]acetamide, herbicidal composition comprising said compound, and method of controlling weeds using said compound
JPS5899478A (ja) 置換フエニルヒダントイン誘導体、その製造法およびそれを有効成分として含有する除草剤
JP2001288184A (ja) 縮合環式ベンゾイル誘導体及びそれを用いた除草剤組成物

Legal Events

Date Code Title Description
B06F Objections, documents and/or translations needed after an examination request according [chapter 6.6 patent gazette]
B07D Technical examination (opinion) related to article 229 of industrial property law [chapter 7.4 patent gazette]

Free format text: DE ACORDO COM O ARTIGO 229-C DA LEI NO 10196/2001, QUE MODIFICOU A LEI NO 9279/96, A CONCESSAO DA PATENTE ESTA CONDICIONADA A ANUENCIA PREVIA DA ANVISA. CONSIDERANDO A APROVACAO DOS TERMOS DO PARECER NO 337/PGF/EA/2010, BEM COMO A PORTARIA INTERMINISTERIAL NO 1065 DE 24/05/2012, ENCAMINHA-SE O PRESENTE PEDIDO PARA AS PROVIDENCIAS CABIVEIS.

B07G Grant request does not fulfill article 229-c lpi (prior consent of anvisa) [chapter 7.7 patent gazette]
B06U Preliminary requirement: requests with searches performed by other patent offices: procedure suspended [chapter 6.21 patent gazette]
B08F Application dismissed because of non-payment of annual fees [chapter 8.6 patent gazette]

Free format text: REFERENTE A 13A ANUIDADE.

B11B Dismissal acc. art. 36, par 1 of ipl - no reply within 90 days to fullfil the necessary requirements